FI89806C - Foerfarande och produkter foer identifiering av humana metastastumoerer - Google Patents

Description

Menetelmä ja tuotteita ihmisen metastaattisten kasvainten toteamiseksi 89806 Tämä keksintö koskee menetelmiä ja tuotteita, jotka 5 ovat käyttökelpoisia ihmisen kasvainsolujen detektoinnis-sa. Tarkemmin määriteltynä keksintö koskee ihmisen 580 ki-lodaltonin kokoista glykoprcteiiniantigeeniä, ja sitä vastaan kehitettyjä vasta-aineita, jotka ovat potentiaalisesti arvokkaita immuunidiagncstisia reagensseja kasvainten 10 havaitsemiseksi.

Rintasyöpä on naisten yleisin kuolinsyy Pohjois-Amerikassa ja Pohjois-Euroopassa. Vaikka alan viimeaikaiset kehitysaskeleet ovat merkittävästi tehostaneet primaaristen rintasyöpien havaitsemista ja poistamista, suurelle 15 osalle rintasyöpäpotilaista kehittyy etäpesäkkeitä ja he kuolevat lopulta.

Kasvaimen etäpesäkkeiden muodostus tapahtuu monien peräkkäisten ja hyvin selektiivisten vaiheiden kautta. Monet näistä vaiheista vaativat joukon monimutkaisia vuoro-20 vaikutuksia kasvainsolujen ja isäntäympäristön välillä ja pääosa näistä vuorovaikutuksista näyttää olevan solujen pintakomponenttien välittämiä. Tiettyjen solun pintakompo-nenttien mahdollisen funktionaalisen roolin tutkimiseksi metastasointiprosessissa eri tutkijat ovat korreloineet 25 näiden komponenttien entsyymiaktiivisuuksien ilmenemisen kasvainsolualalinjojen tai -kloonien kykyyn muodostaa etäpesäkkeitä. Vaihtoehtoisesti on muutettu kasvainsolujen pintoja metabolisesti tai entsymaattisesti ja tutkittu muunnettujen solujen metastasointiominaisuuksia.

30 Spontaanisti etäpesäkkeitä muodostavien rotan nisä- adenokarsinoomasolujen pintakomponentteja on esimerkiksi tutkittu viime aikoina mahdollisten biokemiallisten mark-kerien löytämiseksi, jotka saattaisivat liittyä rintasyö-päetäpesäkkeiden muodostumiseen rotassa. Eräs järjestelmä, 35 jonka on havaittu olevan käyttökelpoinen malli rotan rin- ·; S’ e G 6 2 tasyövän metastasoinnin tutkimiseksi, on Neri et ai.:n [J. Natl. Cancer Inst. 68 (1982) 507 - 517] kuvaama rotan nisäadenokarsinooma 13762NF. 13762NF -järjestelmästä saaduilla eri klooneilla ja solulinjoilla on havaittu olevan 5 erilainen kyky muodostaa spontaanisti etäpesäkkeitä paikallisiin imusolmukkeisiin ja kaukana oleviin elimiin. Lisäksi niillä on eroja solujen ja kudoksen morfologisen ulkonäön, karyotyypin ja terapeuttisiin aineisiin reagoinnin suhteen.

0 Tiettyjen solun pintaglykoproteiinien ilmenemisen havaittiin korreloivan näiden solujen metastasointikyvyn kanssa. Sialoglykoproteiineja, joiden molekyylipaino on 175 000 - 250 000, esiintyy esimerkiksi etäpesäkkeistä peräisin olevissa soluissa, kun taas rotan primaarisesta 5 kasvaimesta peräisin olevien solujen tärkeimpien sialogly-koproteiinien molekyylipainot ovat 80 000 - 120 000. Sia-loglykoproteiinin, jonka molekyylipaino on noin 80 000, esiintyminen oli vähentynyt voimakkaasti metastasoivissa rotan kasvainsoluissa; erään toisen rotan kasvainsolujen iO syntetisoiman glykoproteiinin, jonka molekyylipaino on noin 580 000, esiintyminen lisääntyi voimakkaammin metastasoivissa rotan kasvainsoluissa. Etäpesäkkeisiin liittyvää 580 kilodaltonin glykoproteiinia ei kuitenkaan tähän mennessä ole tunnistettu ihmisen kasvainsoluista eikä ha-z5 vaittu liittyvän niihin.

Ihmisen kasvaimiin liittyvien antigeenisten proteiinien identifiointi ihmisen kasvainsolujen pinnoilta voisi johtaa vasta-aineiden tuottamiseen, joita voidaan käyttää ihmisen kasvainsolujen immuunidiagnosointiin. Ikävä 30 kyllä monet ihmisen kasvainsolujen pintakomponentit ovat joko heikosti tai eivät ollenkaan antigeenisiä tai ne liittyvät myös erilaisiin ihmisen normaaleihin kudoksiin. Kun solun pinta-antigeenit ovat yhteisiä sekä normaali-että kasvainsoluilLe, ovat tällaisten antigeenien vastai-35 set immuunidiagnostiset koettimet epätyydyttäviä siinä • .· '· 1 f

3 C

suhteessa, että niillä saadaan suuri määrä vääriä positiivisia reaktioina.

Imuunidiagnostiset syöpäkoettimet ovat tähän asti olleet epätarkkoja siinä mielessä, että ne joko detektoi-5 vat suuren joukon vääriä positiivisia reaktioita ja/tai vääriä negatiivisia reaktioita. Kasvaindiagnostinen koetin, joka korreloisi hyvin syöpätilan kanssa ihmisessä, olisi siten käyttökelpoinen ihmisen kasvainten varhais-diagnosoinnissa ja hoidossa. Immuunidiagnostinen koetin, 10 joka korreloi metastaattisten kasvainten kanssa, olisi lisäksi vastaavasti hyödyllinen hoitavalle onkologille tai kirurgille.

Yleisimmin ja kokonaisuutena tarkasteltuna tämä keksintö koskee metastaattisten ihmisen kasvainsolujen 15 identifioinnissa käyttökelpoisia vasta-aineita, sekä poly-klonaalisia että monoklonaalisia, jotka on valmistettu ihmisen 580 kilodaltonin glykoproteiinikasvainantigeeniä, josta käytetään merkintää hgp580, vastaan. Keksintö koskee myös oleellisesti puhdasta gp580-antigeenin ihmisen kas-20 vainlähteestä eristettyä ja karakterisoitua kasvainanti- geeniä gp580.

Niinpä eräänä kohteena on oleellisesti puhdas ihmisen kasvainantigeeni gp580, jolle on tunnusomaista se, että se on glykoproteiini, jonka SDS-PAGE:lla identifioi-25 tavissa oleva molekyylipaino on noin 550 kilodaltonia, että sitä voidaan eristää nisäkarsinoomasolujen solukalvo-fraktioista, että se on oleellisesti resistentti trypsii-ni- tai hyaluronaasikäsittelylle ja merkittävän herkkä pronaasikäsittelylle, että se sitoutuu merkittävässä mää-30 rin maapähkinäagglutiniiniin neuraminidaasikäsittelyn jäl keen, että se sisältää suunnilleen seuraavan lukumäärän kutakin esitetyistä aminohappotähteistä glykoproteiinin 1 000 aminohappotähdettä kohden: 35 ''Sjnr!6 4

Asparagiinihappo 120 Treoniini 87

Seriini 166

Glutamiinihappo 154 ö Proliini 37

Glysiini 78

Alaniini 26

Kysteiini ei havaittu Väliini 65 0 Metioniini ei havaittu

Leusiini 56

Isoleusiini 38

Tyrosiini 23

Fenyylialaniini 29 5 Histidiini 11

Lysiini 94

Arginiini 16

Glukosamiini 147

Galaktosamiini 113, .0 ja että se voidaan valmistaa menetelmällä, jossa A. (a) uutetaan liukoiset proteiinit gp580 mukaan luettuna kasvaimesta, joka sisältää gp580-antigeeniä; (b) tehdään uutteelle geeliekskluusiokromatogra- f ia; 25 (c) otetaan talteen ekskludaatti; (d) tehdään ekskludaatille anioninvaihtokromato- grafia; (e) eluoidaan fraktiot, jotka sitoutuvat anionin-vaihtohartsiin; 30 (f) tehdään eluaatille geeliekskluusiokromatogra- fia; ja (g) otetaan talteen ekskludoituneet fraktiot; tai B. (a) uutetaan liukoiset proteiinit gp580 mukaan luettuna kasvaimesta, joka sisältää gp580-antigeeniä; 35 (b) tehdään uutteelle geeliekskluusiokromatogra- f ia; 5 (c) otetaan talteen ekskludaatti; (d) tehdään ekskludaatille tiheysgradienttisentri-fugointi; (e) fraktioidaan tasapainotettu tiheysgradientti; 5 (f) tehdään gp580:tä sisältäville fraktioille gee- liekskluusiokromatografia; Ja (g) otetaan talteen ekskludoituneet fraktiot.

Termi "identifioitavissa oleva" tässä käytettynä tarkoittaa sitä, että hgp580-antigeenin molekyylipaino on 10 suunnilleen 580 kilodaltonia, kun antigeenille tehdään elektroforeesi tässä määritellyn kaltaisissa olosuhteissa. Kuten alan asiantuntijat ymmärtänevät, tällaiset kokomää-ritykset eivät ole missään nimessä täsmällisiä ja molekyylikoon mittausmenetelmien muuttamiset tai variaatiot saat-15 tavat johtaa kyseessä olevalle antigeenille saatavan molekyylikoon muuttumisiin.

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa vasta-aine on alan ammattimiehille tutuilla tavanomaisilla menetelmillä valmistettu monoklonaalinen vasta-aine. Tällaisia monoklo-20 naalisia vasta-aineita valmistetaan edullisesti fuusioimalla immunisoidun rotan pernasoluja rotan myeloomasolui-hin. On kuitenkin täysin mahdollista, että tämän keksinnön kaikki edut ovat saavutettavissa fuusioimalla muun tyyppisiä soluja, hiiren solut mukaan luettuina.

25 Tämä keksintö koskee lisäksi jatkuvaa hybridisolu- linjaa, joka tuottaa hgp580-antigeeniä vastaan reagoivia vasta-aineita ja joita saadaan menetelmällä, jossa fuusioidaan rotan pernasoluja rotan myeloomasoluihin, jolloin pernasolujen lähteenä oleva rotta on immunisoitu gp580-30 antigeeniä sisältävällä antigeenisellä seoksella; kasvatetaan soluja selektiivisessä alustassa; testataan halutun vasta-aineen läsnäolo; ja kloonataan haluttua vasta-ainetta tuottavat solut. Jatkuvia hybridisolulinjoja, jotka tuottavat ihmisen hpg580-antigeeniä vastaan reagoivia vas-35 ta-aineita, voidaan muodostaa käyttämällä pernasoluja, 6 ;? r; 6 jotka on immunisoitu joko hgp580- tai rgp580-antigeeniä vastaan, sillä tällaisten vasta-aineiden on havaittu olevan ristireaktiivisia.

Suurin piirtein puhtaita kasvain-gp580-antigeenejä, o jotka ovat käyttökelpoisia ihmisen kasvainten vastaisten vasta-aineiden tuotantoon, valmistetaan edullisesti menetelmällä, jossa uutetaan liukoisia proteiineja gp580 mukaan luettuna kasvaimesta, joka sisältää gp580-antigeeniä; tehdään eristetylle aineelle geel:.ekskluusiokromatografia; 0 otetaan talteen ekskludaatti; tehdään ekskludaatille anio-ninvaihtokromatografia; eluoidaan anioninvaihtohartseihin sitoutuvat fraktiot; tehdään eluaatille geeliekskluusio-kromatografia; ja otetaan talteen ekskludoituneet fraktiot. Alan ammattimiehet ymmärtänevät, että proteiinin 5 eristysmenetelmistä on olemassa monia variaatioita.

Siten suurin piirtein puhdasta gp580-antigeeniä, joka on käyttökelpoista ihmisen kasvainten vastaisten vasta-aineiden tuotantoon, voidaan edullisesti lisäksi valmistaa menetelmällä, jossa eristetään liukoisiksi tehtyjä .0 proteiineja, gp580 mukaan luettuna, rotan tai ihmisen kasvaimesta, joka sisältää tätä antigeeniä; tehdään eristetylle aineelle geeliekskluusiokromatografia; otetaan talteen ekskludaatti; tehdään ekskludaatille tiheysgradient-tisentrifugointi; fraktioidaan tasapainotettu tiheysgradi-35 entti; tehdään gp580:tä sisältäville fraktioille geelieks kluusiokromatografia; ja otetaan talteen ekskludoituneet fraktiot. Tämä menestelmä sisältää lisävaiheena tiheysgra-dienttisentrifugoinnin, joka ei määritysten mukaan ole ratkaiseva suurin piirtein puhtaan gp580-antigeenin val-30 mistamiseksi.

Keksintö koskee lisäksi diagnostista in vitro -menetelmää ihmisen metastaattisten kasvainsolujen läsnäolon havaitsemiseksi näytteestä, jossa menetelmässä näyte saatetaan kosketukseen vasta-aineen kanssa, joka spesifinen 35 hgp580-antigeenille ja detektoidaan vasta-aineen sitomat . -, · r\ * 1 If- 7 ' - materiaalit. Teistä menetelmästä on saatavissa täysi hyöty sekoittamalla näyte vasta-aineen kanssa olosuhteissa, jotka edistävät spesifisiä antigeeni-vasta-ainevuorovaikutuk-sia, ja detektoidaan antigeeniin ja vasta-aineen välinen 5 vuorovaikutus. Keksinnön hengen mukaisesti tällaiset diagnostiset menetelmät ovat yleisesti sovellettavissa näytteisiin, jotka ovat peräisin lukuisista biologisista lähteistä, joihin kuuluvat veri, plasma, maito, rintaerit-teet, virtsa, sylki, hiki, seerumi ja kudosnäytteet, näi-10 hin rajoittumasta.

Kuvio 1. Kaaviokuva ::gp580:n eristyksessä käytetyistä menettelyistä.

Kuvio 2. MTLn-3-solujen syntetisoimien radionukli-15 dileimattujen makromolekyylien geelisuodatus hajottavan

CsCl-tiheysgradienttiultrasentrifugoinin jälkeen.

A) [3H] glukosamiinilla (-) ja [35S] sulfaatilla (...); ja B) [3H]seriinillä leimatuille, eri tiheysgradienttifrakti-oista peräisin oleville solu-uutteille tehtiin Sepharose 20 CL-2B -kolonnikromatografia 4 M guanidiinihydrokloridissa (GdnHCl), joka sisälsi 0,1 mol/1 natriumasetaattia (pH 5,8). Kuviossa annetaan fraktioiden keskimääräinen tiheys (p-arvot) ja nuolet osoittavat kolonnien välisijatilavuu-desta (V0) ja kokonaistilavuudesta (VT) eluoituneita frak-25 tioita.

Kuvio 3. Sepharose CL-2B -eluoinnista saatujen yhdistettyjen, metabolisesti radioleimattujen välisijatila-vuusfraktioiden ioninvaihtokromatografia DEAE-Sephacel -kolonneilla. Kuviossa annetaan A) [3H]glukosamiinilla, B) 30 [3H] fukoosilla ja C) [14C]seriinillä leimattujen, viljel lyistä MTLn-3--soluista saatujen näytteiden eluoitumiskäy-rät. Kiinteä viiva edustaa natriumkloridin konsentraatiota eluentissa. Fraktiot I, II, III ja IV yhdistettiin omiksi ryhmikseen analysoitaviksi edelleen. Radioaktiiviset pii- 35 kit merkittiin käyttämällä niiden eluoimiskohtaa [*H]glu- kosamiininäytteeseen verrattuna.

e

Kuvio 4. Rotan kasvainuutteen tiheysgradienttifraktioiden dietyyliaminoetyyli-(DEAE)-Sephacel -eluointikäyrä (A). Kiinteä viiva edustaa natriumkloridipitoisuutta elu-entissa. Eri piikit (I - IV) yhdistettiin omiksi ryhmik-5 seen jatkoanalyysiä varten ja niistä saaduille näytteille tehtiin SDS-PAGE. Osakuva B: autogrammi 125I-leimatun maa-pähkinäagglutiniinin (PNA) sitou1:umisesta yhdistettyihin, puhdistettuihin DEAE -piikkeihin SDS-PAGE:n jälkeen (7,5-%:inen akryyliamidigeeli). Kaisteit A - D vastaavat DEAE 0 -kolonnista saatuja piikkejä I - IV. Vertailugeeli, jossa inkuboinnissa oli mukana laktoosia, osoitti, että PNA:n sitoutuminen oli spesifistä. Proteiinistandardeina olivat myosiini, β-galakto.sidaasi, fosforylaasi, naudan seerumi-albumiini ja ovalbumiini, joiden Mr(x 103) oli 200, 130, 5 92, 68 ja 45, vastaavasti.

Kuvio 5. MAb GP21:56:n s-toutuminen glutaraldehy-dillä kiinnitettyihin ja kiinnittämättömiin eläviin 13762NF -adenokarsinoomasoluihin. 125I-leimattua MAb GB21:56:tta inkuboitiin 1 tunti ja soluihin sitoutunut G aktiivisuus määritettiin suoraar. solujen hajotuksen jälkeen. Kiinnitetyt solut (varjostetut pylväät); kiinnittä-mättömät solut (avoimet pylväät).

Kuvio 6. Radioleimattujen ja puhdistettujen fraktioiden SDS-PAGE. Osakuva A: [3H]glukosamiinilla leimatut i5 Sephacel-DEAE -selluloosafraktiot I - IV, jotka vastaavat kaistoja A - D. Osakuva B: [14C]seriinillä leimattu puhdistettu gp580 (kaista A) ja trifluorimetyylisulfonihapolla käsitelty gp580 (kaista B). Elektroforeesi tehtiin 2 - 17,5-%:isella DATD -akryyliamidigeelillä ja sitä seurasi 30 fluorografia. Proteiinistandardeina olivat myosiini, fos forylaasi A, naudan seerumialbumiini ja ovalbumiini, joiden Mr(x 103) on 200, 94, 68 ja 45, vastaavasti.

Yleisimmin ja kokonaisuutena käsiteltynä keksintö koskee immuunidiagnostisia reagensseja ihmisen kasvainten 35 toteamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia syövän identifi- , · 'Λ Γ* C \ / 9 - ' ·f 6 ointiin ja diagnosointiin, ja tarkemmin määriteltynä meta-staattisen syövän diagnosointiin ihmisessä. On määritetty, että monoklonaaliset vasta-aineet, joita on valmistettu rotan kasvainsolun pintaglykoproteiinia, josta käytetään 5 merkintää rpg530, tai ihmisen kasvainsolun pintaglykoproteiinia, josta käytetään merkintää hgp580, vastaan, ovat käyttökelpoisia reagensseja ihmisen kasvainten diagnosointiin.

Vaikka rotan rgp580-proteiinia on aikaisemmin osoi-10 tettu esiintyvän erilaisten rotan kasvainten solupinnoil-la, ei sen ole osoitettu olevan antigeeninen. Ihmisen kas-vainsoluihin liittyvää 580 kilodaltonin glykoproteiinia ei vastaavasti ole milloinkaan havaittu. Siten tässä keksinnössä julkistetaan se ainutlaatuinen havainto, että rotan 15 kasvainantigeenin rgp580 vastaisia vasta-aineita voidaan menestyksellisesti käyttää ihmisen kasvainten immuunidiag-nosointiin. Lisäksi tässä keksinnössä julkistetaan vasta-aineita tähän asti kuvaamattomalle ihmisen 580 kilodaltonin glykoproteiiniantigeenille, joka on samalla tavalla 20 käyttökelpoinen ihmisen syövän immuunidiagnosointiin.

Osoittautuu, €;ttä molemmat kuvatut vasta-ainetyypit reagoivat voimakkaasti ihmisen metastaattisten rintasyöpien kanssa.

Tässä keksinnössä julkistetaan menetelmiä, jotka 25 keksijöiden tekemien määritysten mukaan ovat erityisen käyttökelpoisia 1) rgp-antigeenin eristämisessä ja osittaisessa puhdistuksessa; 2) rgp580-antigeenille spesifisten monoklonaalisten vasta- 30 aineiden valmistuksessa; 3) hgp-antigeenin eristämisessä ja osittaisessa puhdistuksessa; ja 4) hgp580-antigeenille spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistuksessa.

35 Antigeenin puhdistusvaiheet on suunniteltu sellai- 10 siksi, että niissä käytetään hyväksi antigeenin suhteellisen suurta molekyy1.L painoa, niiden pientä tiheyttä muihin proteiineihin verrattuna ja niiden elektrostaattisia varauksia muihin proteiineihin nähden.

5 Monoklonaalisia vasta-aineita valmistettiin käyttä mällä sekä rotta-rotta- että hiiri-hiiri -fuusioita, joista rotta-rotta -hybridit ovat edullisia.

Tämän keksinnön tekijöiden suorittamat kokeet ovat osoittaneet anti-gp580-vasta-aineiden potentiaalisen käyt--0 tökelpoisuuden sekä syövän osoittamisessa että immuunitut-kimusvasta-aineena. Tässä esitettävät immuuniosoitusmene-telmät ovat ainutlaatuisia siinä suhteessa, että niissä käytetään ainutlaatuisia vasta-aineita, jotka ovat ainutlaatuisella tavalla spesifisiä proteiineille, joiden ei -5 aiemmin ole tiedetty olevan antigeenisiä ja ihmisen kasvaimiin liittyviä, immuunitutkimuksen perusmenetelmät ovat kuitenkin alan ammattimiesten tuntemia.

Immuunitutkimuksen yleisimmässä suoritusmuodossa saatetaan gp580-vasta-aine kosketukseen näytteen kanssa, i0 jonka epäillään sisältävän joko kasvainsoluja tai kasvain-solutuotteita (ts. kasvainantigeenejä). Positiivinen immuunireaktio tutkittavan näytteen ja gp580-vasta-aineen välillä osoittaisi siten syöpäsolujen läsnäolon organismissa, josta näyte on peräisin. Alalla tunnetaan lukuisia 3o menetelmiä positiivisen immuunireaktion osoittamiseksi, mukaan luettuina radioaktiiviset merkkiaineet, joko antigeeniin tai vasta-aineeseen kytkettyjen entsyymien (esimerkiksi peroksidaasin) vaikutuksesta aktivoituvat väriä muodostavat substraatit, radioimmuunimääritykset (RIA:t), 30 entsyymiin kytketty immuunisorbentti -määritykset (ELISA:t) ja muut antigeeniin tai vasta-aineeseen sidotut ligandit, kuten ferritiini tai avidiini/biotiini.

On myös mahdollista, että tämän keksinnön mukaiset gp580-antigeenit voivat itsessään osoittautua käyttökel-35 poisiksi syövän tutkimisreagensseina. Tällaisia antigeene- ; ί o r\ s 11 ' ' ' t jä voidaan esimerkiksi sisällyttää sopiviin ELISA -menetelmiin, joilla osoitetaan anti-gp580-vasta-aineiden esiintyminen potilaan seerumissa, joka on osoituksena syövästä. Menetelmät, joissa käytetään antigeenejä verenkier-5 rossa olevien vasta-aineiden detektointiin, ovat alalla yleisesti tunnettuja.

Tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet voidaan saattaa syövän tutkimusvälineistön muotoon. Keksinnön mukaisesti tällaiset välineistöt sisältävät asianmukaista 10 hgp580-antigeeniä tai sille spesifistä vasta-ainetta yhdessä immuunireaktion detektointireagenssin kanssa. Tässä käytettynä ilmaisulla "immuunireagenssin detektointirea-genssi" tarkoitetaan reagenssia, jolla on kyky indikoida tai detektoida vasta-aineen ja gp580-antigeenin välinen 15 spesifinen immuunireaktio. Esimerkkejä tällaisista rea- gensseista ovat peroksidaasiin liitetyt tai radioleimatut antigeenit tai vasta-aineet. Tällaiset reagenssit ja niiden käyttö ovat alan ammattimiehelle tunnettuja.

Esimerkki I

20 Rotan rgp580:n eristäminen ja karakterisointi

Rotan 580 kilodaltonin glykoproteiinia rgp580 voidaan eristää lukuisista rotan kasvaimista tai rotan kas-vainsolulinjoista. Itse asiassa mikä tahansa rotan kasvain, jonka on havaittu ristireagoivan rotan anti-rgp580-25 vasta-aineen kanssa, toimii lähteenä tämän rotan kasvain-antigeenin eristämiseksi. Tämän keksinnön tekijät ovat kuitenkin tode.nneet, että edullinen rgp580 -lähde ovat rotan nisäkarsinoomasolut, sillä on ilmennyt, että nämä solut sisältävät membraaneihinsa liittyneenä suuren määrän 30 rgp580:tä. Edullisena lähteenä käytetään erityisesti erästä solulinjaa, rotan 13762NF -kasvainsolukloonia MLTn3. Nämä solut kloonattiin spontaaneista keuhkometastaaseista Neri et al.:n [J. Natl. Cancer Inst. 68 (1982) 507 - 517] kuvaamalla tavalla. Alan ammattimiehet ymmärtänevät kui-35 tenkin, että rulevaisuudessa saatetaan identifioida muita 'i 9 Π Π 6 12 ' υ solulinjoja, jotka osoittautuvat paremmiksi rgp580 -lähteiksi .

Kuvio 1 on kaaviokuva jäljempänä yksityiskohtaisemmin kuvatuista rgp530:n eristämiseen käytetyistä menette-6 lyistä. Lyhyesti sanottuna: Kun liukoiset proteiinit on uutettu asianmukaisesta kasvainsolusta, uute johdetaan Sephadez G-50 -kolonnin läpi ja otetaan talteen välisija-tilavuusfraktiot. Yhdistetyt välisijatilavuusfraktiot sentrifugoidaan sitten CsCl-tiheysgradientissa, minkä jäl-0 keen tehdään Sepharose CL-2B -kromatografia. Sepharose CL-2B -fraktiot syötetään sitten DEAE-Sephacel -kolonniin, eluoidaan NaClrlla ja analysoidaan fraktioista rgp580:n läsnäolo.

a. Kemikaalit .5 Seuraavat kemikaalit edustavat osittaista luetteloa esimerkinomaisista reagensseista, joita käytettiin sekä rgp580:n eristämiseen että sen karakterisointiin. Alan ammattimiehet ymmärtänevät kuitenkin, että voidaan käyttää lukuisia soveltuvia korvaavia reagensseja poikkeamatta .0 keksinnön piiristä.

D-[6-3H]glukosamiin:L (20 - 30 Ci/mmol); D-l-3H]galaktoosi (1-5 Ci/mmol); L-[6-3H]fukoosi (20 - 35 Ci/mmol); L-[4,5-3H]leusiini (30 - 50 Ci/mmol); jd L-(U-14C]seriini (135 - 165 mCi/mmol); ja [35S]-Na2S04, ostettiin ICN Pharmaceuticals ’ ista (Irvine, CA); D-[2-3H]mannoosin (10 - 20 Ci/mmol) toimitti New England Nuclear (Boston, MA); 30 Streptomyces -hyaluronaasin ja kondrioitinaasi ABC:n toi mitti Miles Laboratories (Elkhart, IN); kollagenaasi, tyyppi III, oli Sigma Chemical Co.:n (St. Louis, MO) valmistama; trypsiinin (kolmesti kiteytetty) toimitti Worthington j5 (Freehold, NJ ); '< n n s 13 ' : : 6 pronaasi ostettiin Calbiochem'ista (San Diego, CA); alfa-muunnettu Eaglen alusta (AMEM) ostettiin GIBCO'sta (Grand Island, NY); naudan seerumialbumiinin (FBS) toimitti Sterile Systems 5 (Logan, UT); ja cesiumkloridin Bethesda Research Laboratories (Rockville, MD).

b. Solut

Rotan 13762NF -kasvainsoluklooni MTLn3, jolla on 10 voimakas metas’:asointikyky, sisältää suurina pitoisuuksina rgp580:tä ja on siten edullinen lähde tämän antigeenin eristämiseksi. Eristämisessä käytetyt solut kloonattiin spontaaneista keuhkoetäpesäkkeistä Neri et al.:n [J. Natl. Cancer Inst, f>8 (1982) 507 - 517] kuvaamalla tavalla ja 15 säilytettiin pakastettuina. MTLn3-soluja kasvatettiin läm pötilassa 37 °C: kostutetussa ilmassa, joka sisälsi 5 % C02, 100 mm:n kudosviljelymaljoilla (Corning Glass, Corning, NY.) AMEM -alustassa, joka sisälsi 10 % FBS, mutta ei antibiootteja. Tässä esimerkissä käytetyt solut olivat eks-20 ponentiaalisen kasvun vaiheessa ja ne saatiin in vitro -siirrostuksista T14 - T20. Soluille tehtiin rutiinitutkimukset ja niiden todettiin Chenin menetelmällä [In Vitro 3 (1976) 229 - 232] olevan vapaita mykoplasma- ja viruskont-aminaatioista.

25 Nisäkasvaimia saatiin injektoimalla ihonalaisesti noin 1 x 106 elävää MTLn3-solua kevyesti nukutettujen syn-geenisten Fishier 344 -naarasrottien (Charles River Breeding Laboratories, Portage, MI) nivusnisärasvatyynyyn. Tällä menettelyllä saatiin aikaan kasvain, jonka läpimitta 30 oli 11,7 ±4,6 mm 30 vuorokauden kuluttua kasvainsolujen injektoinnista. 100 %:lla ja 50 %:lla eläimistä, joilla on kasvain, oli imusolmuke- ja vastaavasti keuhkoetäpesäkkei-tä. Koska kasvaimen keskusta oli kuoliossa 30 vuorokauden kuluttua, pääosa käytetyistä kasvaimista otettiin talteen 35 14 vuorokauden kuluttua. Kasvainten ottamiseksi talteen 14 · ') Ο Π 6 rotat tapettiin inhaloimalla Metofanea (Pitman-Moore Inc., Washington, NH). Kasvaimet poistettiin huolellisesti ympäröivistä kudoksista, huuhdottiin fosfaattipuskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (PBS) ja hienonnettiin.

5 Kasvainpalat uutettiin sitten jäljempänä kuvattavalla tavalla .

c. KasvainsoLujen radionuklidileimaus rgp580-antigeenin radioleimaukseen käytettiin in vitro kasvatettujen solujen metabolista radioleimausta.

0 Yleisesti ilmaistuna tämä oli helppo tehdä kasvattamalla soluja täydellisessä alustassa (AMEM + 10 % FBS; 5 ml 100 mm:n kasvatusmaljassa), joka sisälsi 10 pCi/ml [3H]glukos-amiinia, [3H]galaktoosia tai [3H]fukoosia, 24 tuntia, jolloin hiilihydraatti ryhmät leimautuivat. Kokeissa, joissa 5 solut leimattiin [3H]mannoosilla, havaittiin 200 pCi/ml riittäväksi lisättynä täydelliseen alustaan, jossa AMEM sisälsi puolet normaalipitoisuudesta dekstroosia (1 g/1). [3H] leusiinilla, [14C] seriinillä tai [3H] seriinillä leimattujen solujen valmistamiseksi alusta sisälsi 10 pCi/ml ra-.0 dioaktiivista esiastetta ja kymmenesosan tavanomaisesta aminohappopitoisuudesta (5,25 ja vastaavasti 2,5 mg/1). MTLn3-solut leimattiin Na2 [35S]04:11a (50 pCi/ml) AMEM:ssä, jossa MgS04 (80,9 mol) oli korvattu MgCl2:lla. 24 tuntia kestäneen leimauksen jälkeen alusta voidaan ottaa talteen, -5 sentrifugoida lämpötilassa 4 °C 10 minuuttia kiihtyvyydellä 2 000 x g solujätteiden poistamiseksi ja pakastaa lämpötilassa -80 °C. Kasvatusmaljät pestiin kahdesti PBS:llä ja rgp580 uutettiin soluista jäljempänä kuvattavalla tavalla.

d. rgp580:n eristäminen metabolisesti leimatuista ;>0 kasvainsoluista

Soluja, jotka on leimattu metabolisesti radioiso-toopeilla, voidaan käyttää rgp580:n eristämisessä, eristämisen ja puhtauden seuraamiseksi edellä kuvatulla tavalla. Leimattu proteiini liikkuu lähellä Sepharose CL-4B -kolon-35 nien välisijatilavuutta. Lisäksi rgp580 sitoo 125I-leimattua 15 '· π n ^ määpähkinäagglutiinia desialyloinnin jälkeen ja tämä de-sialyloitu rgp580 voidaan identifioida SDS-polyakryyliami-digeelielektroforeesin (SDS-PAGE) jälkeen suurimolekyyli-senä, PNA:ta sitovana glykoproteiinina. Näitä kahta mene-5 telmää, joita kuvataan tarkemmin jäljempänä, käytettiin seurattaessa rgp580:n puhdistusta sekä viljellyistä MTLn3-soluista että MTLn3-kasvaimista.

rgp580 uutetaan liuottamalla ensin solut (0,5 x 10” solua maljaa kohden) uuttamispuskuriin (1 ml/5 maljaa 10 liuosta, joka sisältää 4 % Zwittergent 3 - 12, 4 mol/1 guanidiinihydrokloridia, 0,1 mol/1 6-aminoheksaanihappoa, 10 mmol/1 Na2EE>TA, 5 mmol/1 fenyylimetyylisulfonyyliklori-dia, 5 mmol/1 bentsamidiinihydrokloridia, 10 milliyksik-köä/ml aprotii.nia ja 0,1 mol/1 natriumasetaattia; pH 6,0). 15 Maljat kaavittiin, uutteet yhdistettiin ja liuotusta jat kettiin lämpötilassa 4 °C 18 tuntia sekoittaen. Ei havaittu lisääntynyttä suurimolekyylisen [3H]glukosamiinilla tai [3H]seriinillä leimatun materiaalin vapautumista soluista, jos ne uutettiin peräkkäin 8-%:isella Zwittergentillä, 20 minkä jälkeen lisättiin 8 M guanidiinihydrokloridia (GcnHCl) (molemmat sisälsivät proteaasin inhibiittoreita). Uutteet, jotke. on edullista suodattaa Whatman 1 -paperin läpi, siirretään Sephadex G-50 -kolonneihin pienimolekyylisten aineiden poistamiseksi ja yhdistetään välisijatila-25 vuusfraktiot.

Sephadeix G-50 -kolonneista ekskludoituneet yhdistetyt fraktiot valmistettiin isopyknistä hajottavaa tiheys-gradienttisentrifugointia varten sekoittamalla joukkoon 0,55 g cesiumkloridia (CsCl)/g liuosta ja sentrifugoitiin 30 lämpötilassa 9 °C 48 - 72 tuntia kierrosnopeudella 35 000 min'1 joko Beckman SW 50.1 tai TI 50.2 -roottorissa. Gradi-entit jaettiin 8:ksi yhtä suureksi fraktioksi ja kunkin fraktion tiheys ja mahdollinen radioaktiivisuus määritettiin. Sitten gradientit yhdistettiin 4:ksi tilavuudeltaan 35 yhtä suureksi fraktioksi, joista käytetään merkintöjä Dl - 16 , *'» r> r\ / : : : : 6 D4, ja kukin fraktio analysoitiin sitten geelisuodatuskro-matografiällä. Tietyille radioleimatuille näytteille puhdistetusta rgp580:stä tehtiin isopykninen sentrifugointi sekoittamalla [14C]seriinillä leimattu rgp580 (1 x 104 6 pulssia/min) liuokseen, joka sisälsi 4 mol/1 GdnHCl ja 4,3 mol/1 CsCl (tai 0,5 mol/1 GdnHCl ja 6,5 mol/1 CsCl) 10 mM Tris-liuoksessa; seoksen pH oli 7,2. Näytteitä sentrifu-goitiin lämpötilassa 4 °C 60 tuntia kierrosnopeudella 35 000 min'1 Beckman SW 50.1 -roottorissa ja jaettiin sit-0 ten 20:ksi yhtä suureksi fraktioksi.

Neljässä tilavuudeltaan yhtä suuressa cesiumklori-difraktiossa Dl - D4 havaittiin cesiumkloridipitoisuuden laskevan arvosta 1,58 g/ml (Dl) arvoon 1,37 g/ml (D4). Näytteet eri tiheyksisistä fraktioista dialysoitiin ja .5 kylmäkuivattiin ja niille tehtiin SDS-PAGE kunkin fraktion sisältämien tärkeimpien proteiinien identifioimiseksi. Geeleissä olevat glykoproteiinit voidaan desialyloida tekemällä mieto happokäsittely K. Burrigden menetelmällä [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1976) 4 457 - 4 481] ja i0 geelit värjättiin 125I-leimatulla PNA:lla. rgp580 on pääasiassa fraktiossa D2 (P = 1,48 ± 0,03 g/ml); pieniä määriä oli myös fraktioissa Dl ja D3. Noin 50 % [3H]glukos-amiinilla, mutta alle 8 % [3H]seriinillä leimatuista makromolekyyleistä löydettiin fraktioista Dl - D3.

2d Annokset fraktioista Dl - D4 laitettiin kalibroi tuun Sepharose CL-2B -kolonniin (115 x 0,8 cm), joka oli tasapainotettu liuoksella, joka sisälsi 4 mol/1 GdnHCl:a 0,1 M natriumasetaöttiliuoksessa (pH 5,8). Kunkin fraktion radioaktiivisuus mitattiin lisäämällä 200 μΐ etanolia 100 30 μ1:η annoksiin fraktioita, joka seos lisättiin sitten 3

ml:aan LiquidScint -liuosta (National Diagnostics, Somerville, NJ). Fraktiot yhdistettiin, dialysoitiin perusteellisesti vettä vastaan ja kylmäkuivattiin sitten. Tietyt yhdistetyt fraktiot liuotettiin liuokseen, joka sisälsi 8 35 mol/1 ureaa ja 0,3 % CHAPS 50 mM Tris-HCl-liuoksessa (pH

17 -1 ? r':6 7,2) ja laitettiin DEAE-Sephacel -kolonniin (5 x 1 cm), joka oli tehty samaan puskuriin. Kolonni huuhdottiin ja eluoitiin lineaarisella natriumkloridigradientilla 0 -* 1 mol/1. Kun gradienttieluointi oli saatettu loppuun, kolon-5 ni pestiin 8 M urealiuoksella, joka sisälsi 3 mol/1 nat-riumkloridia. Radioaktiivisuussaanto oli yli 90 %. Fraktiot yhdistettiin niiden radioaktiivisuuden mukaan, dialy-soitiin vettä vastaan ja kylmäkuivattiin. Fraktiot analysoitiin jäljempänä kuvattavalla tavalla. Jotkut fraktiot 10 fraktioitiin edelleen Sepharose CL-2B -kolonneilla (115 x 0,8 cm), jotka oli tasapainotettu ja eluoitiin liuoksella, joka sisälsi 1 % SDS ja 5 mmol/1 B-merkaptoetanolia 10 mM Tris-HCl:ssa.

Sepharose CL-2B -kolonnit standardoitiin käyttämäl-15 lä dekstraanej a (Mr = 2 x 106, 5 x 105, 1,5 x 105 ja 7 x 104, vastaavasti ). Hiilihydraattianalyysiin käytetyt näytteet laitettiin samankokoiseen (115 x 0,8 cm) BioGel PG -kolonniin, joka oli tasapainotettu 50 mM pyridiniumase-taattiliuoksella (pH 5,3). Kolonnit standardoitiin fetuii-20 nista Spiron ja Bhoyroon menetelmällä [J. Biol. Chem. 249 (1974) 5 709 - 5 717] valmistetuilla oligosakkarideilla.

Kuvio 2 esittää MTLn3-solujen syntetisoimien, radioi sotooppileiraattujen makromolekyylien eluoitumista Sepharose CL-2B -kolonnista hajottavan CsCl-tiheysgradi-25 enttisentrifugoinnin jälkeen. Solut, jotka oli leimattu [3H]galaktoosilla, [3H]glukosamiinilla tai [3H]seriinillä, muodostivat eluoitumiskäyriä, jotka sisälsivät kaksi radioaktiivista piikkiä (Kav = 0,22 ja 0,60). Ensimmäisenä eluoituva piikki sisälsi 18,6 % makromolekyylimateriaaliin 30 sisällytetystä [3H]glukosamiinista, 0,45 % [3H[galaktoosis-ta ja 0,1 % [3H]seriinistä. [3H]leusiinilla, [3H]mannoosilla tai [3H] f lukoosilla metabolisesti leimatuista MTLn3-soluis-ta saatiin samanlainen kaksipiikkinen käyrä, mutta välisi-jatilavuusfraktiot sisälsivät alle 0,05 - 0,002 % sisälly-35 tetystä radioaktiivisuudesta. Kun soluja inkuboitiin 18 / r ;< N235S04:n kanssa, saatiin vain 1 radioaktiivisuuspiikki (Kav = 0,60). D2-piikkien analysointi osoitti, että välisijati-lavuusfraktiot sisälsivät pääosan ( >90 %) rgp580:stä, joka todettiin 125I-leimatun PNA:n sitoutumisella desialyloinnin j ja SDS-PAGE:n jälkeen.

Kuvio 3 esittää eluoimiskäyriä, jotka saatiin ti-heysfraktioiden D12 - D3 Sepharose CL-2B -välisijatila-vuusfraktioista, jotka yhdistettiin, desialyloitiin ja joille tehtiin sitten ioninvaihtokromatografia Sephacel-0 DEAE -selluloosakolonneilla käyttämällä eluointiin NaCl- gradienttia. [3H]glukosamiinilla tai [3H]galaktoosilla leimatuista soluista saatiin 4 piikkiä sisältäviä eluoitumis-käyriä (kuvio 3A, piikit I - IV). Piikkeihin I - IV liittyvä radioaktiivisuus vastasi 2,0, 7,8, 8,1 ja vastaavasti 5 0,9 % sisällytetystä [3H]glukosamiinista. Sitä vastoin ha vaittiin vain 3 radioaktiivisuuspiikkiä, kun MTLn3-solut leimattiin [3H]mannoosilla tai [3H]fukoosilla (kuvio 3B, piikit I, III ja IV).[14C]seriinillä leimatulla materiaalilla saatiin vain 2 jälkimmäistä piikkiä (kuvio 3C, pii-.0 kit III ja IV).

e. rgp580:n eristäminen kiinteistä kasvaimista MTLn3-kasvaimet, joita käytettiin rgp580:n eristämiseen, otettiin talteen, pestiin ja homogenisoitiin sitten 5-kertaisessa tilavuudessa uuttamispuskuria/g kudosta '-3 (märkäpaino). Uutteet pakastettiin -80 °C:ssa tai käytet tiin välittömästi suodatettuina Whatman 1 -paperin läpi. Suodokselle tehtiin sitten geelisuodatus Sephadex G-50 -kolonneilla (joko 10 x 1 cm tai 50 x 4 cm), jotka oli tasapainotettu Zwittergentiä sisältämättömällä uuttamisia puskurilla. Välisijatilavuusfraktiot yhdistettiin jatko- analyysiä varten.

Uutteille te:htiin hajottava tiheysgradienttisentri-fugointi edellä kuvatulla tavalla ja yhdistettiin tiheys-fraktiot, jotka vastasivat arvoa p = 1,48 ± 0,07 g/1. So-35 pivia annoksia laitettiin kalibroituun Sepharose CL-2B

19 • 'v n ° f, . - ' 'w' -kolonniin ja yhdistettiin välisijatilavuusfraktiot. Kuten aiemmin määritettiin in vitro kasvatetuille soluille, pääosa suurimolekyylisestä glykoproteiinista, joka sitoi 125I-leimattua PNArta desialyloinnin jälkeen ja liikkui hitaas-5 ti 7,5-%:isissä SDS-PAGE -geeleissä, oli tiheysgradientti-fraktioiden D2 Sepharose CL-2B -välisijatilavuusfraktiois-sa. Annokset yhdistettyjä, dialysoituja ja kylmäkuivattuja välisijatilavuasfraktioita leimattiin 125I:llä käyttämällä Hunterin ja Greenwoodin [Nature 194 (1962) 495 - 496] klo-10 ramiini-T -menetelmää proteiinimateriaalille tai perjo-daatti-[3H]boorihydridiä siaalihapporyhmille Mashborn et al.:n kuvaamalla tavalla [Biochem. Biophys. Acta 362 (1974) 366 - 374]. Annoksia leimaamattomista ja leimatuista uutteista yhdistettiin ja laitettiin sitten DEAE-Sepha-15 cel -kolonniin. 3H-leimattu materiaali eluoitui neljässä radioaktiivisessa piikissä samalla tavalla kuin [3H]glukos-amiinilla leimattu uute, paitsi että toinen piikki sisälsi vähemmän radioaktiivisuutta. 125I-leimatun uutteen eluoitu-miskäyrä vastasi parhaiten [3H]seriinillä leimatun materi-20 aalin käyrää (vrt. kuviot 2 ja 3A).

f. rgp580:n karakterisointi SDS-PAGE:11a SDS-PAG:E tehtiin Laemmlin menetelmällä [Nature 227 (1973) 680 - 685] käyttämällä 7,5-%:ista akryyliamidiajo-geeliä ja 3-%:ista akryyliamidikeräysgeeliä. Glykoproteii-25 nien detektoimiseksi geelit käsiteltiin 125I-leimatulla PNA:lla Burricfden menetelmällä [Proc. Natl. Acad. Sei. 77 (1976) 4 457 - 4 461] ja niille tehtiin sitten mieto hap-pokäsittely siaalihapporyhmien poistamiseksi Steck et ai.:n kuvaamalla tavalla [Exp. Cell. Res. 147 (1983) 255 -30 267]. SDS-PAGE toteutettiin vaihtoehtoisesti käyttämällä samaa järjestelmää, jossa käytettiin kuitenkin geeliä, joka sisälsi lineaarisen akryyliamidigradientin 2,0 -» 17,5 % ja jossa käytettiin DATD:ta (diallyyliviinihappodi-amidia) BIS:n (bisakryyliamidin) sijasta silloitusaineena 35 ja keräysgeelinä 2-%:ista DATD-akryyliamidigeeliä. Geeli

- *’ .° r\ A

20 ' ' ~ muodostettiin 37,6 % akryyliamidia ja 1,6 % DATD sisältävästä varastoliuoksasta, mikä lisäsi geelin huokoisuutta ja mahdollisesti rgp580:n siirtymisen ajogeelimatriisiin. 125I-leimattua materiaalia sisältävät geelit pestiin ja kui-6 vattiin, minkä jälkeen niille tehtiin autoradiografia, jossa käytettiin Kodak X-Omat AR -filmiä ja kuvanvahvis-tuslevyjä. 3H-leimattuja tai 14C-leimattuja näytteitä sisältävien geelien ollessa kyseessä geelit, joista oli poistettu värjäysaine, preparoitiin fluorografiaa varten kä-0 sittelemällä ne Enhancella (New England Nuclear, Boston, MA), minkä jälkeen tehtiin kuivaus ja röntgenfilmin sätei-lytys geelillä. Säteilytetyn röntgenfilmin densitometriset pyyhkäisymittaukset tehtiin käyttämällä geelinmittauslisä-laitteella varustettua Beckman DU-8 -spektrofotometriä.

.6 Isoelektrinen fokusointi sakkaroositiheysgradientissa tehtiin muuten Behnta et ai.:n menetelmällä [Anal. Biochem. 69 (1975) 1-9], mutta käytettiin seosta, joka sisälsi yhtä suuret tilavuudet amfoliineja (pH 2,5 - 5,0 ja 3,0 -10,0; Pharmacia, Uppsala, Ruotsi).

-G Näytteitä DEAE-Sephacel’istä eluoituneista eri pii keistä laitettiin 7,5- tai 5-%lisiin polyakryyliamidigee-leihin, desialyloitiin ja käsiteltiin 125I-leimatulla PNA:lla. Vain piikit III ja IV sitoivat 125I-leimattua PNArta (kuvio 4B, kaistat C ja D). Koska rgp580 vain juuri ja juuri pääsee sisään 5-%:iseen polyakryyliamidigeeliin, tehtiin elektroforeesi gradienttigeeleillä, joissa käytettiin DATDrtä silloitusaineena BIS-akryyliamidin sijasta. DATD-akryyliamidigradientin 2,0 -» 17,5 % käyttö mahdollisti leimattujen materiaalien pääsyn geeliin. Kun tutkittiin 13 neljää DEAE-Sephacel -kromatografiästä saatua, [3H]glukoo-silla leimattua piikkiä elektroforeesin ja fluorografiän jälkeen, havaittiin, että piikki I sisälsi vain pienimolekyylistä materiaalia. Piikkien II - IV havaittiin sisältävän vain suurimoletyylistä materiaalia, joka liikkui dif-35 fuuseina, mutta homogeenisina vyöhykkeinä (molekyylipainot i • ^ r* r\ s 21 '· ‘ ·' 6 noin 350 000 - 800 000; kuvio 6A). Muita pienimolekyylisiä vyöhykkeitä ei havaittu metabolisesti eikä kemiallisesti leimatuissa fraktioissa röntgenfilmien ylivalotuksenkaan jälkeen, mikä viittaa siihen, että suurin piirtein kaikki 5 komponentit tulivat detektoiduiksi näillä menetelmillä.

Analysoitaessa [3H]seriini- tai 125I-leimattuja piikkejä saatiin muuten samankaltaisia tuloksia, mutta piikkiä II vastaava materiaali oli leimaamatonta. Arvioitaessa rgp580:n keskimääräinen molekyylipaino analysoimalla fluo-10 rogrammi densitometrisesti ja vertaamalla proteiinistan-dardeihin, saatiin tulokseksi suunnilleen 550 000 (kuvio 6B). rgp580:n puhdistuminen voitiin osoittaa SDS-PAGE:lla käyttämällä [4C ] seriinillä leimattuja MTLn3-solulysaatteja lähtöaineena. Puhdistuksen jälkeen havaittiin, että rgp580 15 oli homogeenista SDS-PAGE -analyysin mukaan ja sisälsi noin 0,08 % kokonais-[14C]seriinistä hapoilla seostettavissa olevaan radioaktiivisuuteen sisällytettynä.

Eri DEAE-Sephacel -piikkien koostumuksen määrittämiseksi näytteitä inkuboitiin erilaisten hajottavien ent-20 syymien kanssa ja tehtiin sitten SDS-PAGE -analyysi. Havaittiin, että piikin II sisältämä [3H]glukosamiinilla leimattu materiaali näytti olevan epäherkkä pronaasille ja trypsiinille, mutta Streptomyces -hyaluronidaasi pystyi hajottamaan sitä (taulukko I), mikä viittaa siihen, että 25 tämä komponentti on hyaluronihappo. Piikeistä III ja IV

peräisin olevi.en komponenttien herkkyys eri entsyymeille oli samanlainen ja vain pronaasi hajotti niitä (taulukko I). Lisäksi piikkien III ja IV alueella olevat materiaalit sitoivat 125I-leimattua PNA:ta suurimolekyylisiksi komponen-30 teiksi lievän happokäsittelyn jälkeen, mikä viittaa siihen, että nämä piikit sisälsivät rgp580:tä. Kemiallisesti leimatusta MTLn3-kasvainkudoksesta peräisin olevien DEAE-Sephacel -fraktioiden analyysissä havaittiin identtisiä ominaispiirteitä.

35 Γ 22 * : '· f ¢.

Taulukko 1 DEAE-SephaceL -fraktioiden analysointi SDS-PAGE:lla

Käsittely*" Piikki I Piikki II Piikki III Piikki IV

o Molekyylipaino <1C 000 >350 000 >350 000 >350 000 PNA:n sitoutuminen -Herkkyys:

Trypsiinille -

Pronaasille + + C Hyaloronidaasille ____+________-__-

Taulukon I selitys: a) Molekyylipaino on [3H]glukosamiinil-la tai perjodaatti-[3H]boorihydraatilla leimattujen fraktioiden suhteellinen liikkuminen DATD:lla silloitetuilla SDS-polyakryyliamidigradienttigeeleillä.

.5 g. rgp580:n kemiallinen karakterisointi

Entsyymikäsittelyt: rgp580:n herkkyys erilaisille hajottaville entsyymeille määritettiin inkuboimalla 1 tunti lämpötilassa 37 °C [3H]glykosamiinilla tai [3H]seriinillä, tai kemiallisesti .G leimattua rgp580:tä 100 ml:ssa Dulbeccon PBS:ää, joka sisälsi puhdistettua trypsiiniä, pronaasia, papaiinia, alfa-kymotrypsiiniä, subtilopeptidaasi A:ta (1 tai 10 mg/ml), tyypin VI kollagenaasia (1 000 yksikköä/ml), kondroitinaa-si ABC:tä (1 yksikkö/ml), Streptomyces -hyaluronidaasia j (100 sameudenalentamisyksikköä/ml), Vibrio cholerae -neur-aminidaasia (100 yksikköä/ml) tai β-galaktosidaasia (1 000 yksikköä/ml). Näytteet ja käsittelemättömät vertailunäyt-teet analysoitiin 8DS-PAGE:11a DATD-akryyliamidigradient-tigeelillä (2,0 -> :.7,5 %), minkä jälkeen tehtiin säteilyjä tetyn fluorogrammin kvantitatiivinen densitometrinen mittaus .

Ydinproteiinin määritys:

Leimattua rcjp580:tä tai [14C] seriinillä metabolises-ti leimattua rgp580:tä lisättiin 100 mg:aan kantajapro-35 teiinina käytettyä naudan seerumialbumiinia; seosta käsi- ·', n n £ 23 · c teltiin trifluorimetyylisulfonihapolla anisolissa (paino-suhde 2:1) typellä huuhdotussa Reacti -pullossa 10 tai 30 minuuttia 4 °C:ssa Edge et ai.:n kuvaamalla menetelmällä [Anal. Biochem. 118 (1981) 131 - 137]. Näytteet uutettiin 5 dietyylieetterillä, dialysoitiin ja kylmäkuivattiin. Lei-maamaton käsitelty materiaali leimattiin kemiallisesti 125I:llä käyttämällä kloramiini-T -menetelmää. Näytteet analysoitiin SDS-PAGE:11a käyttämällä DATD-akryyliamidigeele-jä (2,0 - 17,5 %).

10 Aminohappoanalyysi: rgp580 -näytteet kylmäkuivattiin hapolla pestyissä putkissa ja hydrolysoitiin 6 N tai 4 N suolahapolla 4, 10 tai 24 tuntia lämpötilassa 110 °C. Analyysi tehtiin käyttämällä LKB model 401 -aminohappoanalysaattoria, jossa käy-15 tettiin norleusiinia lisättynä sisäisenä standardina. Käsittely emäksisellä boorihydridillä: Kylmäkuivattuja näytteitä rgp580:stä, jonka hiili-hydraattiosa oli radioleimattu, käsiteltiin liuoksella, joka sisälsi 50 mmol/1 NaOH ja 1,0 mol/1 NaBH4, lämpötilas-20 sa 45 °C 24 tuntia. Näytteet neutraloitiin etikkahapolla, johdettiin Dowex 50 (H*) -kolonnin läpi, eluoitiin tislatulla vedellä ja fraktiot kuivattuun useaan kertaan meta-nolin läsnäollessa. Oligosakkaridinäytteet liuotettiin 5 mM Tris-hydrokloridiliuokseen (pH 7,5) ja laitettiin samaa 25 puskuria sisältävään QAE Sephadex -kolonniin (5x1 cm). Kolonnin huuhdottiin 25 ml:11a 5 mM Tris-HCl-liuosta, minkä jälkeen eluoitiin lineaarisella Tris-HCl-gradientilla (lopuksi 120 ml 0,2 M -liuosta; pH 7,5). Radioaktiiviset piikit yhdistettiin ja laitettiin sitten BioGel P6 -kolon-30 niin Carlsonin kuvaamalla tavalla [J. Biol. Chem. 243 (1968) 616 - 622].

rgp580:n kemiallinen koostumus:

Puhdistetun rgp580:n aminohappokoostumus esitetään taulukossa II Kuten alan ammattimiehet havainnevat, ovat 35 taulukossa II annetut arvot, jotka saatiin viljellyistä 24 <: '· ' ...» v _/ MTLn3 -soluista ja MTLn3 -kasvaimesta eristetylle gp580:lle, mittausmenetelmän virherajojen sisällä. Tällaisissa aminohappoana.Lyyseissä on syytä odottaa noin ± 10 %:n virhettä. Taulukossa II esitetyt arvot ovat neljän eri 5 mittauksen keskiarvoja.

Glutamaatti, aspartaatti ja seriini olivat läsnäolevat pääaminohapot, ja myös treoniinia, glysiiniä ja lysiiniä esiintyi huomattavia määriä. Nämä aminohapot muodostivat yli puolet koko rgp580:n koostumuksesta. Aminoso-0 kereiden, glukosamiinin ja galaktosamiinin, osuus rgp580:ssä oli noin 20 % (taulukko II).

Taulukko II

Rotan nisäadenokarsinoomasolujen syntetisoiman rgp580:n aminohappoanalyysi . 5

Viljellyt MTLn3 -solut

Aminohappo_rytmiä/1 000 aminohappoa MTLn3 -kasvain

Asparagiinihappo 105 103

Treoniini 92 95 :C Seriini 143 148

Glutamiinihappo 139 137

Proliini 29 33

Glysiini 101 98

Alaniini 33 31

Kysteiini 5 6 Väliini 65 59

Metioniini 7 8

Leusiini 62 60

Isoleusiini 37 38 00 Tyrosiini 26 24

Fenyylialaniini 37 35

Histidiini 13 16

Lysiini 84 82

Arginiini 22 25 05 Glukosamiini 114 125

Galaktosamiini 90 102 . (' o / 25 ι.ι . 6

Arvot ovat keskiarvoja, jotka saatiin viljellyistä MTLn3 -soluista ja kasvainkudoksista puhdistetun rgp580:n rin-nakkaismäärityksistä. Hiilihydraattiarvot määritettiin ekstrapoloimalla eri hydrolysointiaikoina mitatut arvot 5 ajanhetkeen nolla. Tryptofaania ei detektoitu.

rgp580 deglykosyloitiin trifluorimetyylisulfoniha-polla, jolloin saatiin proteiiniydin. [4C]seriinillä lei mattu rgp580 käsiteltiin hapolla ja analysoitiin sitten 10 SDS-PAGE:11a. Proteiiniydin liikkui yhtenä vyöhykkeenä, joka vastasi suunnilleen molekyylipainoa 150 000 kilodal-tonia. Muita leimautuneita vyöhykkeitä ei havaittu. Kasvainkudoksesta eristetyn ja 125I:llä radioleimatun rgp580:n proteiiniydin oli SDS-PAGE:n mukaan saman kokoinen.

15 Puhdistatusta [ 14C]seriinillä leimatusta rgp580:stä otetuille näytteille tehtiin isopykninen sentrifugointi aineen näennäisen tiheyden määrittämiseksi. Sentrifugointi 4 M GdnHCl -liuoksen läsnäollessa antoi tiheydeksi noin 1,432 g/ml (>90 % aluella 1,475 - 1,398 g/ml). Yhteenliit-20 tävän GdnHCl -pitoisuuden (0,5 mol/1) läsnäollessa näen-näistiheys oli kuitenkin 1,615 g/ml (>90 % alueella 1,671 - 1,563 g/ml). Tämä näennäistiheyden kasvu heikommin denaturoituvissa olosuhteissa on havaittu myös hyaluronihapol-la ja muilla voimakkaasti happamilla molekyyleillä.

25 rgp580:n happaman luonteen vahvisti sen koostumus, jossa oli runsaasti anionisia aminohappoja ja suuria määriä siaalihappoa. rgp580:n siaalihappopitoisuus arvioitiin käsittelemällä [3H]glukosamiinilla leimattu rgp580 laimealla hapolla (50 mM H2S04, 1 tunti, 80 °C), minkä jälkeen teh-30 tiin kromatogiafia BioGel P4 - kolonnilla. Noin 25,5 % rgp580:een sisällytetystä radioaktiivisuudesta vapautui tässä käsittelyssä, mikä viittaa siihen, että siaalihappo on rgp580:n tärkeä komponentti. Lisäksi rgp580 liikkui diffuusina vyöhykkeenä sakkaroositiheysgradientilla teh-35 dyssä isoelektrisessä fokusoinnissa, joka antoi isoelekt- 26 "7^6 riseksi pisteeksi 3,2 ± 0,3 ja vahvisti siten materiaalin happaman koostumuksen.

Tulokset viittasivat siihen, että rgp580:llä oli sialomusiinin kaltaisia ominaispiirteitä ja tämä havainto 3 vahvistettiin inkuboimalla [3H]seriinillä leimattua rgp580:tä erilaisten hajottavien entsyymien kanssa. Herkkyys määritettiin tekemällä käsitellylle rgp580:lle SDS-PAGE ja saatujen vyöhykkeiden densitometrinen analyysi. Puhdistettu rgp580 kesti erilaisia proteaaseja, kondroiti-naasi ABS:tä ja hyaluronidaasia (taulukko III). Pilkkoutumista havaittiin vain pronaasin, subtilopeptidaasi A:n ja neuraminidaasin ja E-galaktosidaasin yhteydessä. Samanlaisia tuloksia saatiin käsiteltäessä 125I-leimattua MTLn3-kas-vain-rgp580:tä hajottavilla entsyymeillä. Nämä tulokset 3 viittasivat siihen, että rgp580 on sialomusiini ja sen pitäisi siten sisältää erilaisia O-kytkeytyneitä oligosakkarideja.

. w 27 . r» n ^

J : · i G

Taulukko 111 rgp580:n herkkyys hajottaville entsyymeille mg/ml tai Mr (a Suhteellinen tiheys 5 Entsyymi yksikköä (x 103) tiheys (pinta-ala)(b

Vertailu - >400 1

Trypsiini 1 >400 1 10 >400 1 10 Pronaasi 1 30 - 200 0,35 10 n.d.(c 0

Subtilopepti- 1 50 - 300 0,43 daasi A 10 n.d. 0

Papaiini 1 >400 1 15 10 >400 1

Pepsiini 1 >400 1 10 >400 1 a-kymotrypsino- 1 >400 1 geeni 10 >400 1 20 Kollagenaasi 1 >400 1 10 >400 1

Kondroitinaasi ABC 1 >400 1

Hyaluronidaasi 100 >400 1 25 Neuraminidaasi 100 >400 1 B-galaktosidaasi 100 >400 1

Neuraminidaasi + β-galaktosidaasi 100 + 100 >350 0,9 30 a) Entsyymi-inkuboinnin jälkeen eri näytteille tehtiin PAGE 2 - 17-%:isillä DATD -silloitetuilla geeleillä ja fluoro-grafia.

b) Suhteellinen tiheys normalisoitiin SDS-PAGE -geelien fluorogrammeista densitometrillä saatujen käyrien alle 35 jäävän pinta-alan suhteen merkitsemällä käsittelemättömän 28 ι'ΡΓ·06 näytteen kaistaa l:llä. Pinta-alat saatiin Beckman DU-8 -spektrofotometrillä käyttämällä "syvin laakso" -ohjelmaa.

c) Ei detektoitu.

rgp580:n oligosakkaridien vapauttaminen boorihydri- dillä:

Joukko oligosakkarideja vapautettiin käsittelemällä [3H]glukosamiinilla, [3H]galaktoosilla ja [3H]fukoosilla ra-ä dioaktiivisesti leimattu rgp580 emäksisellä boorihydridil-lä. [3H]glukosamiinilla leimatut oligosakkaridit laitettiin QAE Sephadex -kolonniin ja erotettiin neutraaliksi (eluoi-tuneet fraktiot, jotka edustavat 22,5 %:a kokonaisradioak-tiivisuudesta) ja happamaksi (pylvääseen jääneet fraktiot: c, 76,5 % radioaktiivisuudesta) komponentiksi. Happamat fraktiot eluoitiin olosuhteissa, joissa saadaan mono- ja di-sialyloituja oligosakkaritoleja (10 - 40 mM Tris-HCl; pH

7,5). Fraktiointia jatkettiin tekemällä geelisuodatuskro-matografia BioGel P6 -kolonneilla. Happamille oligosakka-o ritoleille saatiin muutamia suhteellisen suuria radioaktiivisia piikkejä. Pääosan neutraaleista oligosakkarideista havaittiin liittyvän yhteen radioaktiiviseen piikkiin. Oligosakkarideilla, jotka oli vapautettu rgp580:stä, joka oli eristetty kasvainkudoksesta ja jonka siaalihapporyhmät oli leimattu kemiallisesti, saatiin samanlainen käyrä.

Esimerkki II

rgp580:tä vastaan valmistetun monoklonaalisen vasta-aineen kehittäminen ja karakterisointi

On kehitetty rotan hybridoma, joka tuottaa mono-klonaalista vasta-ainetta (GP21:56), joka on spesifinen rgp580-antigeenille, jota esiintyy suurina määrinä rotan voimakkaasti metastaattisissa 13762NF -nisäkarsinoomaso-luissa. Hybridoma valmistettiin fuusioimalla rotan Y3 Agl.2.3 -myeloomasoluja puhdistetulla rgp580:llä immuni-jjj soidun rotan pernasoluihin. rgp580:n immunogeenisyyden 29 • :> c o 6 havaittiin olevan heikko syngeenisissä F344 -rotissa, koska tarvittiin kaikkiaan 27 fuusiota tälle glykoproteiinil-le spesifisen yhden hybridoman tuottamiseksi. Yritettäessä suurentaa rgp580:lle spesifisiä vasta-aineita erittävien 5 hybridomien esiintymistiheyttä käytettiin joukkoa erilaisia immunisointiohjelmia, kuten antigeenin antamista i.d. ja i.p., immunisointia in vitro ja sekä pernan että imusolmukkeiden käyttöä B-solujen emosolujen lähteinä.

Entsyymiin sidottu immuuniabsorbentti -määritykset 10 (ELISA:t) ja suorat sitoutumismääritykset osoittivat, että keksinnön mukaisesti tuotetut hybridomat muodostivat mono-klonaalisia vasta-aineita, jotka sitoutuivat spesifisesti rotan 13762NF -adenokarsinooman kloonattuihin kohdesolu-linjoihin suhteessa näiden kykyyn metastasoida spontaanis-15 ti. Voimakkaasti metastaattisiin MTLn3 -soluihin sitoutui kolminkertainen määrä GP21:56 -vasta-ainemolekyylejä heikosti metastaattisiin MTC -soluihin nähden, mutta GP21:56 reagoi heikosti tai ei reagoinut ollenkaan muiden jyrsijä-tai ihmisperäisten solulinjojen kanssa. Suorat vasta-aine-20 sitoutumismääritykset, joissa käytettiin mikrotiitterile-vyihin sidottua puhdistettua rgp580:tä, ja immunoblottaus-määritykset, joissa käytettiin eri 13762NF -solualakloo-nien lysaatteja, vahvistavat, että GP21:56 sitoutui spesifisesti rgp580:een.

25 Kineettiset tutkimukset osoittivat, että GP21:56:11a ei ole voimakasta affiniteettia rgp580:n suhteen, mutta sillä on suuri aviditeetti tähän glykoproteii-niin. Sidoututtuaan MTLn3 -soluihin in vitro GP21:56 -molekyylit poistuivat sellaisella nopeudella, että puoliin-30 tumisaika oli 24 tuntia. Kohdistumistutkimukset, joissa käytettiin pakastettuja 13762NF -kasvainkudosleikkeitä, osoittivat, että GB21:56 reagoi in vivo kasvaneiden kas-vainsolujen kanssa samalla tavalla kuin in vitro kasvatettujen solujen kanssa. Yli 50 % voimakkaasti metastaat-35 tisista MTLn3 -kasvainsoluista, noin 20 % keskinkertaises- ,-, n o s 30 .·’ ·.! ·' 6 ti metastaattisista MTF7- ja MTLn2 -soluista ja alle 10 % heikosti metastaattisista MTC- ja MTPa -soluista olivat positiivisia rgp580:n suhteen immuuniperoksidaasimenetel-mää käytettäessä. rgp580:n esiintyminen oli heterogeenistä 5 solujen kesken ja liittyi pääasiassa kasvainsolun pintaan.

a. Materiaalit ja menetelmät

Seuraavat materiaalit ja menetelmät edustavat menetelmiä, jotka tämän keksinnön tekijät ovat havainneet soveltuviksi rgp580:n vastaisten monoklonaalisten vasta-ai-0 neiden valmistukseen. Vaikka seuraavissa suoritusmuodoissa käytetään rotan perna/rotan myelooma -hybridejä hybrido-mien tuotantoon, ovat tämän keksinnön tekijät määrittäneet, että muut hybridomamenetelmät, kuten sellaiset, joissa käytetään hiiri-hiiri -hybridejä, toimivat yhtä .5 hyvin.

Eläimet:

Umpisiittoiset 8 viikon ikäiset Fischer (F344/CDL) -rotat (RT11) toimitti Charles River Breeding Laboratories. Eläimiä pidettiin karanteenissa 7 vuorokautta ennen käyttö töä ja niille annettiin tavanomaista jyrsijöiden ravintoa ja klooraamatonta kaivovettä rajattomasti. Niiden hoidossa noudatettiin ohjeita, jotka ovat antaneet The University of Texas System Cancer Center ja The Institute of Laboratory Animal Resources; National Research Council.

35 Solut ja solulinjat:

Rotan myeloomasolulinjan Y3 Agl.2.3 (RT11) toimitti C. Milstein, MRC Laboratories, Cambridge, Englanti, ja sitä pidettiin yllä pyöritysviljelmänä antibiootittomassa DMEM:ssä, joka sisälsi 20 mmol/1 Hepesrä (runsaasti glu-30 koosia) ja 10 % FBS:ä (Hyclone, Logan, UT).

Rotan nisäadenokarsinooman 13762NF kloonatut ala-linjat (MTLn3, MTF7 ja MTC) ja kloonaamattomat kantalinjat MLTY (imusolmuke -etäpesäkkeestä) ja MTPa (alkuperäisestä kasvaimesta) saatiin ja kasvatettiin Neri et ai.:n kuvaa-35 maila menetelmällä [J. Natl. Cancer Inst. 68 (1982) 507].

·'. '5 r? Π f 31

Kaikille solulinjoille ja klooneille tehtiin rutiinitutkimukset ja niiden havaittiin olevan vapaita Mycoplasma- ja jyrsijäviruskontaminaatioista. Solulinjat MTLn3, MTF7, MTC, MTLY ja MTPa käytettiin in vitro -siirrosten 10 - 18 5 välissä ja MTLn2 -solut siirrostusten 38 - 40 kohdalla.

Lisää solulinjoja saatiin rotan nisäadenokarsinoo-mien R32 - 40Ac (RT11) CSE ja MNU-F344 kasvainkudosviljel-mistä (Mason Research Institute, Worchester, MA). Kasvain-paloja istutettiin ihonalaisesti syngeenisteen isäntään ja 10 siirrostettiin kahdesti in vivo ennen kasvainten poistamista. Kasvainkudosviljelmiä entsyymikäsiteltiin 1 tunti huoneen lämpötilassa liuoksella, joka sisälsi 0,25 % tryp-siiniä (GIBCO, Grand Island, NY) ja 1 % kollagenaasia (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) solulinjojen vakiin-15 nuttamiseksi. Normaalin aikuisen rotan fibroplastien lyhytaikaisia viljelmiä tehtiin 8 viikon ikäisten F344 -rottien miekkalisäkkeistä käyttämällä samaa entsyymikäsitte-lyä. Sikiön keuhkofibroplasteja eristettiin 14 - 16 vuorokauden ikäisistä F344 -rotan sikiöistä ilman entsyymikä-20 sittelyä. Keuhkot paloiteltiin ja laitettiin viljelmään fibroplastien kasvun mahdollistamiseksi. Näitä solulinjoja pidettiin yllä käyttäen pientä sarjasiirrostusten määrää (alle 7) AMEM -alustassa, joka sisälsi 10 % FBS:ä, ja ellei toisin mainita, niitä viljeltiin tavanomaisesti 100 25 mm:n kudosviljelymaljoilla (Corning Glass, Corning, NY).

Melanoomasolulinjat SK-MEL-19, SK-MEL-75, DX1 ja HS929 toimitti J. Fogh (Memorial Sloane-Kettering Cancer Center, New York, NY). Solulinjat MDA286 ja MDA436 toimitti R. Cailleau (U.T. M.D. Anderson Hospital and Tumor Ins-30 titute at Houston, Houston, TX). Hiiren nisäkasvainsolut 66, 67, 168.1 ja 4526 saatiin G. Heppner'ilta (Michigan Cancer Foundation, Detroit, MI).

Immuni sointiohjelmat (i) In vivo: 35 8 viikon ikäiset F344 -rotat immunisoitiin i.d.

. · ' r- η /· 32 ’ : emulsiolla, joka sisälsi tilavuussuhteessa 1:1 edellä kuvattua fraktiota D2 ja Freund's Complete Adjuvant'ia. Kullekin rotalle annettiin kaikkiaan 0,4 ml emulsiota neljään kohtaan i.d. (0,1 ml/kohta). Immunisoinnit toistettiin 2 5 viikon välein injektoimalla 0,1 ml antigeenin ja Freund's Incomplete Adjuvant'in seosta mahdollisesti muodostuneisiin granuloomiin, Viimeinen immunisointi i.d. tehtiin 4 -5 vuorokautta ennen pernan tai kaulaimusolmukkeen poistamista fuusiota varten. Vaihtoehtoisesti rotat immunisoi-0 tiin injektoimalla i.p. antigeeniä samanlaisia menettelyjä noudattaen.

(ii) In vitro: Käytetty menetelmä oli muunnos Lubenin ja Mohlerin [Mol. Immunol. 17 (1980) 935] kuvaamasta menetelmästä. Ty-5 mosyyttien tuotteita sisältävä alusta saatiin viljelemällä 10 vuorokauden ikäisen rotan tymosyyttejä 48 tuntia DMEM -alustassa, joka sisälsi 2 % kaniinin seerumia (Quadroma Inc., Escondido, CA) pitoisuutena 2 x 106 solua/ml. Käytetty alusta säilytettiin sentrifugoinnin jälkeen -70 °C:ssa. .0 Immunisointia varten valmistettiin yksittäisolususpensio käsittelemättömän F344 -rotan pernasta. Splenosyyttejä inkuboitiin 5 vuorokautta 10 ml:ssa antigeenipitoista ty-mosyyttien kasvualustaa (DMEM; 2 % kaniinin seerumia). Muodostuneet esisolut fuusioitiin 5 vuorokauden kuluttua -5 myeloomasolujen Y3 Agl.2.3 kanssa tavanomaisin menetelmin.

Hybridomien tuottaminen:

Perna- tai imusolmukesolut preparoitiin johtamalla ne pienireikäisen verkon läpi 5 ml:aan alustaa. Solut pestiin kahdesti seerumittomalla alustalla ja solujen elinky-30 ky määritettiin trypaanisini -ekskluusiolla. Pernasolut (2 x 108) sekoitettiin ΙΟ8 Y3 Agl.2.3 -solun kanssa ja so-luseos pelletoitiin sentrifugoimalla varovasti uudelleen sekoittamalla 1 minuutti 2 ml:ssa liuosta, joka sisälsi 50 % polyetyleeniglykoli 1450:tä (J. T. Baker Chemical 35 Co., Phillipsburg, NJ) DMEM:ssä, jonka pH oli säädetty ar- i 33 ,; ·"> r·, r\ / )-) ;:ip voon 7,2. Fuusioseosta käänneltiin vielä 1 minuutti, laimennettiin 8 ml:lla DMEMra ja sentrifugoitiin 5 minuuttia kiihtyvyydellä 500 x g. Solut suspendoitiin uudelleen 200 mitään DMEM -alustaa, joka sisälsi 20 % FBSta, 10‘4mol/l 5 hypoksantiinia (Sigma, St. Louis, MO), 4 x 10‘7 mol/1 ami-nopteriiniä (Sigma) ja 1,6 x 10‘5 mol/1 tymidiiniä (HAT -alusta; Sigma). Annoksia (1 ml) jaettiin 24 -syvennyksi-sille Costar -levyille (Costar, Cambrigde, MA), joihin oli siirrostettu 24 tuntia aikaisemmin 2 x 104 säteilytettyä 10 (30 Gy, gammasäteilytys) rotan fibroplastia/syvennys. Kun oli inkuboitu 24 tuntia 37 °C:ssa tavanomaisissa viljely-olosuhteissa, lisättiin HAT -alustaa (1 ml). Solufuusioita inkuboitiin 7-14 vuorokautta ennen hybridien läsnäolon tutkimista.

15 Spesifisen vasta-aineen läsnäolon tutkiminen:

Hybridomaviljelmistä tutkittiin spesifisen vasta-aineen tuotanto käyttämällä ELISA -menetelmää. Kohdesolut kasvatettiin yhtenäisiksi yksisolukerroksiksi 96 -syven-nyksisillä mikrotiitterilevyillä, kiinnitettiin 0,5-20 %:isella glutaraldehydillä ja säilytettiin lämpötilassa -20 °CPBS:ssä, joka sisälsi 1,0 % naudan seerumialbumiinia (BSA). Näytteitä hybridomaviljelmien supernatanteista (50 μΐ/syvennys) inkuboitiin kohdesolujen kanssa 1 tunti huoneen lämpötilassa. Kohdesolut pestiin kolmesti PBStllä, 25 joka sisälsi 0,05 % BSA:ta. Lisättiin biotinyloitua vuohi-/kaniini-IgG:tä (Vector Labs., Burlingame, CA), joka oli laimennettu suhteessa 1:1 000 PBS:llä, joka sisälsi 1 % BSA:ta (50 μΐ/syvennys) ja inkuboitiin 1 tunti huoneen lämpötilassa. Solut pestiin kolmesti, minkä jälkeen lisät-30 tiin streptavidiinisilloitusreagenssia (Bethesda Research

Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) laimennettuna suhteessa 1:1 000 BSA:ta (1 %) sisältävällä PBS:llä (5 μΐ/sy-vennys) ja inkuboitiin vielä 45 minuuttia huoneen lämpötilassa .

35 34 . '> r\ Γ\ / i , ' i r>

Levyt pestiin kuudesti PBSrllä, joka sisälsi 0,05 % BSA:ta. Sitoutunut vasta-aine määritettiin kvantitatiivisesti käyttämällä o-fenyleenidiamiinireagenssia (1 mg/ml, 100 μΐ/syvennys), joka oli liuotettu 0,1 M sitraattipusku-5 riin (pH 4,5), joka sisälsi 0,012 % vetyperoksidia. Kun oli inkuboitu 15 minuuttia pimeässä, määritettiin absor-banssi käyttämällä Titertek Multiscanner -laitetta (Flow Laboratories, McLean, VA). Kaikissa määrityksissä käytettiin Y3 Agl.2.3 -viljelmän supernatanttia negatiivisena 0 vertailunäytteenä. Supernantantit katsottiin positiivisi- si gp580:lle spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen (MAb) suhteen, jos niiden absorbanssi oli vähintään kaksi kertaa standardipoikkeaman verran taustan yläpuolella. Positiivisista syvennyksistä saadut hybridomat kloonattiin kahdesti 5 rajalaimennusmenetelmällä käyttämällä säteilytettyjä rotan fibroplasteja syöttösoluina.

Muissa MAb -sitoutumismäärityksissä käytettiin 125I-leimattuja, affiniteettipuhdistettuja vasta-aineita rotan F(ab’)2:lle (tri C. J. Dean, Chester Beatty Research Insti-:0 tute, Sutton, Surrey, Englanti). Näytteitä viljelmäsuper-natanteista tai puhdistetusta MAbrsta inkuboitiin 1 tunti lämpötilassa 4 °C elävien solujen yhtenäisten yksisoluker-rosten kanssa tai huoneen lämpötilassa 96 -syvennyksisissä mikrotiitterilevyissä kasvatettujen kiinnitettyjen solujen ^5 kanssa. Sitoutunut MAb määritettiin inkuboimalla 1 tunti lämpötilassa 4 °C (elävät solut) tai huoneen lämpötilassa (kiinnitetyt solut) 125I-leimatun lammas/rotta-F( ab' )2: n (5 x 105 pulssia/min syvennystä kohden) kanssa. Solut pestiin PBSrllä ja hajotettiin 200 plrlla 2 N NaOHrä. Radioaktii-30 visuus määritettiin tekemällä laskenta Beckman Model 8000 -gammalaskurissa.

MAb:n eliminoimisnopeus MTLn3 -soluista in vitro: 96 -syvennyksisissä maljoissa olevat eksponentiaalisesti kasvavat MTLn3 -solukloonit pestiin kerran 35 AMEMrllä, joka sisälsi 5% FBS:ä ja inkuboitiin jäähautees- .·. O <' O /

35 ’ - ·! O

sa 1 tunti viljelmäsupernatantin kanssa (50 μ/syvennys; 10 pg/ml vasta-ainetta). Levyt pestiin kolmesti AMEM:llä ja kukin levy jaettiin neljään osaan. Alunperin sitoutuneen MAb:n määrittämiseksi kvantitatiivisesti yhtä osaa inku-5 boitiin 1 tunti lämpötilassa 4 °C 30 μ1:η kanssa 125I-lei-mattua lammas/rotta-F(ab' )2:ta. Muita osia inkuboitiin lämpötilassa 37 °C atmosfäärissä, joka sisälsi 95 % ilmaa ja 5 % C02:a, 0-32 tuntici. Säännöllisin väliajoin käsiteltiin 1 osa edellä kuvatulla tavalla. Solut hajotettiin pe-10 rusteellisesti pesun jälkeen ja määritettiin radioaktiivisuus edellä kuvatulla tavalla.

Levyt MAb GP21:5(5:n sitomiseksi rgp580:een:

Puhdistettu rgp580 immobilisoitiin yön yli Immuno-tech I -levyille (A/S Nunc, Kamstrap, Tanska) seuraavalla 15 menetelmällä: rgp580 -liuos (1 pg/ml) ultraäänikäsiteltiin ensin ja pipetoitiin siitä annoksia (50 μΐ/syvennys) mik-rotiitterilevyille. Levyt pestiin kolmesti PBSrllä ja inkuboitiin sitten PBS:n kanssa, joka sisälsi 1 % BSA:ta, 1 tunti huoneen lämpötilassa. Levyjä säilytettiin lämpöti-20 lassa -20 °C PBS:ssä, joka sisälsi 1 % BSA:ta.

Kineettiset tutkimukset:

Kloonatut MTLn3 -solut pestiin kerran PBS:llä, joka sisälsi 1 % BSA:ta, ja inkuboitiin 125I-leimatun GP21:56:n kanssa (1 Ci/mg) lämpötilassa 4 °C. Kyllästyspistesitoutu-25 misen määrittämiseksi MTLn3 -soluja (8 x 104) inkuboitiin 125I-leimatun GP21:56:n kanssa (4,2 x 104 pulssia/min) ja otettiin näytteitä säännöllisin väliajoin 1 % tunnin aikana. Näytteet pestiin kolmesti PBS/BSA -puskuriliuoksella ja radioaktiivisuus määritettiin edellä kuvatulla tavalla. 30 Epäspesifinen sitoutuminen arvioitiin mittaamalla radioaktiivisuus, joka sitoutui, kun näytteitä inkuboitiin 1 000-kertaisen ylimäärän leimaamatonta vasta-ainetta läsnäollessa. Hajoamisnopeus määritettiin inkuboimalla MTLn3 -soluja 1 tunti 12i>I-leimatun GP21:56:n kanssa edellä kuvatulla 35 tavalla, lisäämällä sitten 1 000-kertainen ylimäärä kylmää •s · r> Γ' s 36 ·’ ^ vasta-ainetta ja ottamalla näytteitä 1 ½ tunnin aikana. Solut pestiin kolmesti PBS/BSA -puskuriliuoksella ja määritettiin soluihin liittyvä radioaktiivisuus tavanomaisesti .

o MAb:n puhdistus: MAb:t eristettiin viljelmäsupernatanteista tekemällä affiniteettikromatografia, sen jälkeen kun oli tehty konsentrointi saostamalla ammoniumsulfaatilla (40 % kyl-lästyspitoisuudesta). Immuunisorbenttikolonni valmistet-0 tiin sitomalla anti(rotan K-ketju)MAb (Mark 1; H. Bazin, Bryssel, Belgia) AffiGel 10:een (10 mg proteiinia/ml helmiä). MAb GP21:56 eluoitiin immuunisorbenttikolonnista 3 M kaliumtiosyanaattiliuoksella ja kerättiin 1 ml:n fraktioita, jotka neutraloitiin välittömästä 0,1 M Hepes -puskuri-. b liuoksella (pH 8,0). Proteiinipitoisuudet määritettiin

Bradfordin menetelmällä [Anal. Biochem. 72 (1976) 248] ja MAb:n puhtausaste määritettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE). Vasta-aineen isotyyppi määritettiin pehmytagarissa tehtävällä .0 kaksoisdiffuusioanalyysillä käyttämällä antiseerumeja ro tan IgG^lle, IgG2a:lle, IgG2b:lle, IgG2c:lle ja IgM:lle (Miles Laboratories Inc., Naperville, IL). Puhdistetut vasta-aineet leimattiin 125I:llä (ICN Pharmaceuticals, Irvine, CA) siten, että ominaisaktiivisuudeksi tuli 2 Ci/mg, käyttäjä mällä kloramiini-T -menetelmää.

Immuuniperoksidaasimenettelyt: 13762NF -adenokarsinooma-alakloonikudosnäytteitä saatiin kasvaimista, jotka olivat kasvaneet ihonalaisesti F322 -rottien nisärasvatyynyssä, 23 vuorokauden kuluttua 30 kasvainsolujen injektoinnista (106/rotta). Kudos jäähdytet tiin nopeasti nestetypessä ja säilytettiin lämpötilassa -20 °C käyttöön asti. Immuuniperoksidaasivärjäykseen käytettiin kryostaatti -leikkeitä (paksuus 4 pm). Menettelyssä käytettiin Vectastain ABC anti-rat IgG -välineistöä 35 (Vector Laboratories, San Francisco, CA), jossa käytettiin 37 'ϊ " Γ·r '· * diaminobentsidiiniä (DAB) (1 mg/ml Tris-HCl-puskurissa; pH 7,2) substraattina. Leikkeet vastavärjättiin Meyer’in he-matoksyliinillä ja tutkittiin Leitz -fotomikroskoopilla.

Immunoblottausmääritys: 5 Westernblott -määritykset tehtiin suurin piirtein

Towbin et al.:n mukaisesti [P.N.A.S., 76 /1979) 4 350]. Proteiineja siirrettiin elektroforeettisesti DATD:llä silloitetuista, denaturoivista polyakryyliamidigradienttigee-leistä (2 -> 17,5 %) nitroselluloosapaperiin käsittelemällä 10 yön yli 50 V:n jännitteellä ja 0,29 A:n virralla. Antigeeni detektoitiin inkuboimalla blottia 125I-leimatun vasta-aineen kanssa 3 tuntia ja tekemällä sitten autografia käyttämällä Kodak X-OMAT AR -filmiä.

b. MAb GP21:56:n muodostaminen ja spesifisyys 15 Käytettiin joukkoa erilaisia in vivo- ja in vitro -immunisointimenettelyjä MAb:iden tuottamiseksi rgp580:tä vastaan (taulukko IV).

Käsittelemättömiin rottiin ruiskutettiin joko ihonsisäisesti (i.d.) tai vatsaontelonsisäisesti (i.p.) 20 rgp580:tä ja käytettiin sekä pernaa että kaulaimusolmuk-keita Y3 Agl.2.3 -myeloomasolujen kanssa fuusoitavien B -esisolujen lähteinä. Lisäksi käytettiin in vitro -im-munisaatiomenettelyjä, jotta saataisiin todennäköisemmin tuotetuksi hybridomia, joilla on haluttu spesifisyys.

25 Kaikkiaan 27 fuusiosta, joissa käytettiin näitä immunisointimenetelmiä, saatiin vain yksi MAb (GP21:56), joka reagoi ELISA:ssa spesifisesti MTLn3 -solujen kanssa ensimmäisessä määrityksessä. Hybridien muodostumistiheys fuusiota kohden oli alhainen. Keskimäärin vain 20 - 25 %:ssa 30 syvennyksistä esiintyi kasvua, vaikka tämä riippui jossakin määrin immunisointiohjelmasta ja B -esisolujen lähteestä. Joissakin fuusioissa oli detektoitavissa vain muutamia, tai ei ollenkaan hybridejä.

35 38 - .·' ν. -.·

I I

•H P

I P CD

•hi tn p •PC </>

C Id id -P

ίϋ Ί—Ι o

P CU

CP id

H C C

Ή *H p O · p o a) > λ: x w cu -p p a> -p > > pc :id C -rt C P C p

Inir-’u ·—l Ο Ο Ο Ό ι-Ί Ο 'PE Μ Ή <N

p4-ia):n) m P E QJ

O nl w ·ρ :¾ C -P g :<d id

P οι -H c E -p CU · -P -H C

ST -Sop OP^:mCP

-Ο ·Ρ Μ η 1Λ (Λ H H Q) P

-P O ·· (U <1) <U

0 ^ c x h cn > p rP m ~E I oncorgoovo P ίί P P rd :n> >. P Ο ^ ~ n ' ' ~ ^ B r· Zj r· i> r. <fl C M cn 10 o in 10 C 5 Ä *- -Hew γνι m n >w 00.-1 -P <0 -P TO id

<d cnm-Hd'—' ^ ^ -r-i-p g C

Ό > <1 i) CP:OCd) :nj >. C υ E (DCCPnJg Τι P-PPPP -.-1 Z. 0)P>^rP oo cn o oo *r oo . . !P t. . gj *-· T3COCCO locnaoioooiors) -P *P > :id P id •P -H « J! C ·Η :td P C g (1) >

id u ··-< 41 eg \ \\ \\ \\ gC-n<U AC W

1 Λ > C > C ΟΙΙΝ-ΙΙΟΟΡΟΓΜ S m TP ^P id

^ >·. :a> ai O vo^r-oo in^ -p§^m C X

, , sc u ι-i to a; m in ίο »-i A «. lii I-· A- m C P -P ·

ω C C-nmp-POC

<d φ -.ίο a; τί - -p p p -p > "3 ·« *£ Έ) w P P -p

Ο ;S ·' c :<d <U -P P

P-PE ooiNinoorrcotN C U) 3 M C>P

QJi/jd -p-tucai

ί) Ό P C id C P

« PCIp-P-PW

’H "C :n! d -p 0) -p 1-1 § > <U <U P M :id 0 <v C H PPPrP-PQi 03 o d p a) ¢) o a p "J “> OPPEdJid £ o -S g J g g g g · g -p p g -p £ & £

^cnjd p ρ ρ ρ p μ -P CU O O M *P (U

0':ιβ αι αιαιαιαίφ > Μ υ CU (1) Ρ CU

C m m P· a. a. o. o. a. CU C C

O c E h id · rd id id c 0) O (Λ :nj u) τι OUCuiPaiC· p ·ρ .c p -P · i *p *p 'id 3 e Id c -p o · o -p υ c

^ -H <0 ... . ϋΡΟ -no ·π P · P

“log τ> ό a υ -Ptnoopuia)

tn M ... < *c OOH un isi CU

<0 ·ρ <u --1--1-1 Inz ooCdCidCUidc/JC

P P ‘g1 in i—I g ·ι—ι Cd ·η-Ρ ·Ρ C

3 s 5 >icuc<ua)<ijp-pid

5 1 PCdgPOPPP

** ip .ccu-PCPcm-Po -n) ai c »n ·ρ p ·ρ -r-ι o p

p ‘E P -P -P O O -p O P

"S 3 -p^Hw>u)idj«;c S <u „ -p p o id -p -P c ω ;id “ “ ,.,ι,'λ ® p λ; cc cp -n g

^ o & SL $1 -Ψ y) Il QJidOC-PCQJCO

CU C o to o -O t> γί ai/ ^ —, p p o. -p ij

Cdg oo co co oo oo c Λ fiCCO pmP p E in in in in in r^ c Sc!U g 5 g _ "g g o. o, a n, o. t-ι o <3 d -n 1 -P M -PC (d :id pm cntjicntTiDiSz :idl Id) -n g M “(D^-PCPCO) _ -P I—I liö r—1 O O P f-H i—(

o (D H H ·γ| *H Vh ·Η O <D

^ aj'H^ncPPPwtnp p E p a> -p p p i p

P C'PC(U>0>Cn-P

gj <u :id <u tn m -p c tn 3 ' X! rP φ -p C 3 C P O :<d 53 >,P tJ>P sH E —M P Eh ^5 c-1 P σί\ P\ td 0Λ

uV

3 9 Γ· Π <

Spesifisesti rgp580:n vastaisten hybridien esiintymistiheys oli merkittävästi pienempi kuin muilla antigeeneillä. Vertailunäytteenä käytettiin käsittelemättömän rotan pernaa ja havaittiin, että syvennysten, joissa esiin-5 tyi hybridomien kasvua, osuus oli tavallisesti noin 16 -20 %, mutta muiden antigeenien kuin rgp580:n ollessa kyseessä syvennyksien, joissa esiintyi hybridomien kasvua, osuus oli jopa 100 %. rgp580:tä vastaan muodostuneiden hybridien pieni esiintymistiheys viittaa siihen, että tä-10 män antigeenin immunogeenisyys on pieni syngeenisessä isännässä. Rajoittavien rgp580 -määrien takia hybridit valittiin alunperin sen perusteella, miten voimakkaasti ne reagoivat MTLn3 -solujen kanssa. Näissä olosuhteissa vain MAb GP21:56 oli reaktiivinen.

15 MAb GP21:56.n sitoutuminen puhdistettuun rgp580:een: ELISA, joka kuvattiin aiemmin, viittasi siihen, että MAb GP21:56 tunnistaa rgp580:llä esiintyvän epitoo-pin. Tämän varmistamiseksi määritettiin MAb GP21:56:n kyky 20 tunnistaa puhdistettua rgp580:tä vasta-aineen kiinteäfaa-sisitoutumismäärityksellä, jossa käytettiin immobilisoitua rgp580:tä antigeeninä. Affiniteettipuhdistetun MAb GP21:56:n (100 pg/ml) sitoutuminen määritettiin kolmesta rinnakkaisnäytteestä. MAb GP21:56 sitoutui spesifisesti 25 rgp580:een, kun taas MAb:t, jotka olivat spesifisiä muille 13762NF -adenokarsinoomasolujen pinta-antigeeneille, eivät sitoutuneet rgp580:een.

MAb GP21:56:n sitoutuminen kloonaamattomiin ja kloonattuihin 13762NF -solulinjoihin: 30 Edellinen määritys osoitti, että MAb GP21:56 reagoi puhdistetun rgp580:n kanssa. Käyttämällä 13762NF -nisäade-nokarsinooman erilaisia alalinjoja saatiin kvantitatiivisia tietoja MAb GP21:56:n reaktiivisuudesta näiden kloonattujen solulinjojen kanssa. Määritettiin suoraan sitou-35 tuminen glutaraldehydillä kiinnitettyihin MTLn3-, MTF7-, 40 ’ ' " ' ^ MTC- ja MTPa -soluihin ja sitoutunut MAb detektoitiin käyttämällä 125I-leimattua lammas/rotta-F(ab’ )2:ta.

Kuviosta 5 on nähtävissä, että MAb -pitoisuuksien ollessa suuria MAb GP21:56:n sitoutuminen 13762NF -soluihin on verrannollinen näiden solukloonien metastasointiky-kyyn ja rgp580:n määriin soluissa. Tulokset osoittavat, että MTLn3 -soluihin sitoutui kolme kertaa niin paljon MAb GP21:56:tta kuin MTF7- tai MTC -soluihin ja MTPa -kantasoluihin sitoutuminen oli vähäistä. Vaihtoehtoisena selityksenä näille tuloksille on se. että rgp580 -epitoopin saatavuus GP21:56:n sitoutumista varten oli pienentynyt kiin-nitysprosessin seurauksena, tai se, että muiden "naamioivien" proteoglykaanien esiintyminen solun pinnalla esti MAb: n sitoutumista. Kiinnittämättömien 13762NF -solujen NP40 -uutteet reagoivat kuitenkin GP21:56:n kanssa samalla tavalla kuin käsittelemättömät solut ja eri 13762NF -solu-klooneista uuttuneet rgp580 -määrät sopivat yhteen MAb -sitoutumistietojen kanssa.

MAb GP21:56:n sitoutuminen oli samanlaista eläviin, kiinnittämättömiin ja kiinnitettyihin soluihin. Tutkittiin myös edellä kuvattujen soluiinjojen ja kantalinjan MTLy (kloonaamaton imusolmuke-etäpesäkkeestä eristetty solulin-ja) käyttöä. MTLy on voimakkaasti metastasoiva. MAb GP21:56 reagoi suurin piirtein samalla tavalla erilaisten kiinnitettyjen ja elävien 13762NF -solukloonien kanssa, vaikkakin MAb GP21:56:n todellinen sitoutuminen eläviin soluihin oli suurin piirtein 40 % vähäisempää kuin kiinnitettyihin MTLn3- tai MTLy -soluihin.

MAb GP21:56:n antigeenin identifiointi: , Todisteita, jotka vahvistavat GP21:56:n spesifisyy den rgp580:lle, saatiin analysoimalla 125I-leimattua, affi-niteettipuhdistettua GP21:56:tta immunoblottaus -menetelmällä SDS-polyakryyliamidigeeleissä, jotka sisälsivät 13762NF -kloonien solulysaatteja ja puhdistettua j rgp580:tä. GP21:56 sitoutui näissä kokeissa suurimolekyy-

,-, w ') f: A

·κ ✓ ν.· „· s»/ liseen komponenttiin, joka identifioitiin rgp580:ksi.

MAb GP21:56:n sitoutumisen in vitro kasvatettuihin solulinjoihin spesifisyys: MAb GP21:56:n spesifisyyden toteamiseksi tämän 5 MAb:n sitoutumista tutkittiin joitakin vakiinnutettuja solulinjoja käyttämällä ELISA:a. Käytettiin rotta-, hiiri-ja ihmisperäisiä solulinjoja ja tulokset osoittivat, että GP21:56 oli spesifinen rotan 13762NF -nisäadenokarsinooman kloonattuja solulinjoja vastaan. Hyvin vähäinen reaktiivi-10 suus havaittiin muiden viljeltyjen rotan kasvainsolujen tai normaalien fibroplastien suhteen ja GP21:56 sitoutui mitättömän vähän hiiren tai ihmisen rintakasvainsoluihin tai ihmisen melanoomasolulinjoihin. On kuitenkin havaittu erittäin hyvä reaktiivisuus GP21:56:n ja ihmisen kasvain-15 kudosnäyteleikkeiden välillä, erityisesti rintasyöpäpe- räisten ihmisen kasvainten ollessa kyseessä. Lisäksi havaittiin ristireaktiivisuutta rotan sikiön keuhko- ja maksa fibroplastien kanssa.

MAb GP21:56:n kyllästyssitoutuminen MTLn3 -solui-20 hin: GP21:56:n affiniteetti MTLn3 - soluilla esiintyvän rgp580 -antigeenin suhteen määritettiin mittaamalla 125I-leimatun GP21:56:n assosiaatio- ja dissosiaatiokinetiik-kaa. MAb GP21:56 liittyi suhteellisen hitaasti MTLn3 -so-25 luihin; sitoutumisen kyllästyspisteen saavuttaminen kesti noin 1 tunnin. MTLn3 -soluihin sitoutuneen GP21:56:n dis-sosioitumisen alkunopeus oli pieni; vapautumista tapahtui hyvin vähän 1 % tunnin määritysaikana. Nämä tulokset osoittavat, että GP21:56:11a ei ole voimakasta affiniteet-30 tia soluantigeeniin, mutta aviditeetti on suuri sitoutumisen tapahduttua.

Soluun sitoutuneen MAb GP21:56:n modulaatio: MAb GP21:56:n poistumisnopeus viljeltyjen MTLn3 -solujen pinnalta määritettiin seuraamalla pintaan sitoutu-35 neen MAb:n vaiheita. Viljelmäsupernatanttia (10 pg/ml ' ’ 1 O f'· c 4 2 ·' - ' - MAb:ta) inkuboitiin MTLn3 -solujen kanssa 1 tunti ja määritettiin sitten kvantitatiivisesti solun pinnalla jäljellä oleva MAb 125I-leimatun lammas/rotta-F( ab' )2:n avulla eri ajanhetkinä 32 tuntiin asti. MTLn3 -solujen pintaan sitoutuneen GP21:56:n puoliintumisajaksi in vitro arvioitiin noin 24 tuntia.

MAb GP21:56:n reaktiivisuus 13762NF -kasvaimen kanssa kudosleikkeissä:

Jotta saataisiin määritetyksi rgp580:n jakautuminen in situ kasvaviin kasvaimiin ja MAb GP21:56:n reaktiivisuus syngeenisistä F344 -rotista peräisin olevien kasvain-kudosten kanssa, tutkittiin sitoutuneen MAb:n jakautumista. Kasvaimet, jotka muodostettiin injektoimalla s.c. 106 MTLn3-, MTF7-, MTLn2- tai MTPa -solua, poistettiin 23 vuorokauden kuluttua ja pakastettiin. MAb:n reaktiivisuus määritettiin käyttämällä immuuniperoksidaasi -värjäysme-nettelyjä. MAb Gp21:56 sitoutui laajasti, mutta heterogeenisesta MTLn3 -soluihin. Kaikki MTLn3 -solut eivät olleet reaktiivisia, mutta yleensä yli 50 % soluista reagoi MAb:n kanssa. Suurimman osan reaktiivisuudesta havaittiin liittyvän solun pintaan ja ekstrasellulaariseen matriisiin. MTF7-, MTLn2- ja MTPa -kasvaimet sisälsivät paljon vähemmän GP21:56:n kanssa reagoivia soluja. Noin 20 % MTF7 - ja MTLn2 -kasvainten soluista reagoi GP21:56:n kanssa, kun taas MTPa -kasvaimissa oli hyvin vähän GP21:56:n kanssa reagoivia soluja. Kaikissa tutkituissa tapauksissa GP21:56:n sijoittuminen oli heterogeenistä ja liittyi pääasiassa solun pintaan.

Esimerkki III

) hgp580:n eristäminen ja karakterisointi Käyttämällä samanlaisia menetelmiä kuin rgp580:n eristämisessä on identifioitu ja eristetty ihmissoluläh-teestä proteiini, josta käytetään merkintää hgp580 ja jolla on samankaltaiset ominaisuudet kuin rgp580:llä. Tämä 3 glykoproteiini on biokemiallisesti erotettavissa 43 /f'06 rgp580:stä; on kuitenkin määritetty, että hgp580 on kasvaimeen liittyvä "markkeri" ja toimii samalla tavalla kehitettäessä immuunidiagnostisia reagensseja ihmisen kasvainten toteamiseksi. On määritetty, että hgp580:tä vas-5 taan valmistetut tuotteet ovat yleensä edullisempia kuin rgp580:tä vastaan valmistetut ihmisen kasvainten immuuni-diagnosoinnissa. Alan ammattimiehet ymmärtänevät, että pienet erot hgp580:lle käytettyjen ja rgp580:n yhteydessä kuvattujen menetelmien välillä eivät yleensä ole miten-10 kään ratkaisevia, ellei toisin mainita, a. hgp580:n eristäminen Kudokset ja solut:

Rotan 13762NF -solulinjoja ja -klooneja kasvatettiin antibiootittomassa AMEM -alustassa, joka sisälsi 10 % 15 naudan sikiöseerumia, kostutetussa atmosfäärissä lämpötilassa 37 °C esimerkissä I kuvatulla tavalla. Ihmisen rinta-karsinoomakasvaimet toimitti The Department of Pathology, M. D. Anderson Hospital and Tumor Institute, kirurgisen poiston tai ruumiinavauksen jälkeen.

20 hgp580:n eristäminen:

Eräs menetelmä, jota on käytetty hgp580:n puhdistamiseen, noudattaa periaatteessa rgp580:n eristämisen yhteydessä kuvattua menetelmää. Lyhyesti kuvattuna kasvaimet paloiteltiin ja uutettiin viisinkertaisella tilavuudella 25 (kudoksen märkäpainoon nähden) liuosta, joka sisälsi 4 mol/1 guanidiinihydrokloridia ja 4 % Zwittergent 3-12 0,1 M natriumasetaattipuskurissa (pH 6,0), joka sisälsi lisäksi proteaasi-inhibiittoreita (5 mmol/1 EDTA, 2 mmol/1 L-tosyyliamidi-2-fenyylietyylikloorimetyylialkaliinia, 50 30 mmol/1 6-aminoheksaanihappoa, 5 mmol/1 fenyylimetyylisul-fonyylifluoridia, 5 mmol/1 bentsamidiinihydrokloridia ja 10 yksikköä/ml aprotiniinia), 12 tuntia lämpötilassa 4 °C. Uutteet suodatettiin Whatman 1 -paperin läpi ja niille tehtiin sitten geelisuodatus Sephadex G-50 -kolonnilla 35 (50 x 4 cm), joka oli tasapainotettu uuttamispuskurilla.

o n r-, s

44 ' '·; ·· C

joka ei sisältänyt Zwittergentiä. Välisijatilavuusfraktiot yhdistettiin ja lisättiin cesiumkloridia (0,55 g CsCl/g liuosta). Näytteitä sentrifugoitiin 48 - 60 tuntia kier-rosnopeudella 35 000 min'1 Beckman TI 50.2 -roottorissa lämpötilassa 9 °C. Gradientit fraktioitiin 8:ksi yhtä suureksi fraktioksi ja määritettiin niiden tiheys. Fraktiot, joiden tiheys oli 1,55 - 1,45 g/ml, yhdistettiin ja laitettiin kalibroituun Sepharose CL-2B -kolonniin (100 x 2 cm), joka oli tasapainotettu liuoksella, joka sisälsi 4 mol/1 guanidiinihydrokloridia 0,1 M natriumasetaatissa (pH 5,8). Välisijatilavuusfraktiot yhdistettiin, dialysoitiin ja kylmäkuivattiin. Näytteet fraktioista leimattiin sitten kemiallisesti 125I:llä ja kloramiini T:llä (proteiini) tai perjodaatti-[3H]boorihydridillä (siaalihappo).

Jatkopuhdistus tehtiin ioninvaihtokromatografiällä Sephacel-DEAE -kolonnilla (5x1 cm), joka oli tasapainotettu liuoksella, joka sisälsi 8 mol/1 ureaa, 0,2 % Triton X-100:aa ja 50 mmol Tris-HCl:a (pH 6,8). Eluointi tehtiin natriumkloridigradientilla (0 -> 1 mol/1), minkä jälkeen pylväs huuhdottiin suurella suolapitoisuudella (3 mol/1). Asianmukaiset fraktiot, jotka määritettiin radioaktiivi-suuskäyristä, yhdistettiin, dialysoitiin ja kylmäkuivattiin.

Parennettu menetelmä hgp580:n eristämiseksi , Parannetussa menetelmässä hgp580:n eristämiseksi kasvainkudos pestiin PBSrssä, hienonnettiin ja uutettiin liuoksella, joka sisälsi 4 mol/1 guanidiinihydrokloridia, 1 % Zwittergent 3 - 12:ta, 0,1 mol/1 natriumasetaattia (pH 6,2) sekä proteaasi-inhibiittoreita. Kun oli uutettu yön J yli (noin 18 tuntia), liuos suodatettiin sitten prepara-tiiviseen Sephadex G-50 -kolonniin (4 x 50 cm), joka oli tasapainotettu liuoksella, joka sisälsi 8 mol/1 ureaa, 5 mmol/1 natriumkloridia ja natriumasetaattia (pH 7,0). Otettiin talteen välisijatilavuusfraktiot ja laitettiin ne 5 sitten DEAE-Sephadex -kolonniin, jossa oli samaa puskuri- I ') I't r\ /"

45 ' · C

liuosta, joka lisäksi sisälsi 0,2 % CHAPS:a. Kolonni huuhdottiin tasapainotuspuskurilla ja eluoitiin sitten lineaarisesti nousevalla natriumkloridigradientilla. Eri piikkejä vastaavat fraktiot yhdistettiin, laimennettiin kolmin-5 kertaiseen tilavuuteen 8 M urealla ja laitettiin DEAE-Sep-hacel -kolonniin (1 ml). Materiaali eluoitiin pienellä tilavuudella 4 M guanidiinihydrokloridiliuosta. Eluentille tehtiin sitten geelisuodatuskromatografia kalibroidulla Sepharose CL-2B -kolonnilla (2 x 100 cm), jossa liuos si-10 sälsi 4 mol/1 guanidiinihydrokloridia, 0,2 % CHAPS:a ja 0,1 M natriumasetaattia (pH 5,8). Välisijatilavuusfraktiot yhdistettiin ja ne edustivat puhdistettua hgp580:ta; puh-tausasta määritettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektrofo-reesilla, jonka jälkeen tehtiin hopeavärjäys.

15 b. hgp580:n kemiallinen karakterisointi hgp580:n analysointi natriumdodekyylisulfaattipoly-akryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) tehtiin kahdella menetelmällä. Glykoproteiinin detektoimiseksi SDS-PAGE toteutettiin käyttämällä 7 % akryyliamidia sisältävää 20 ajogeeliä ja 3 % akryyliamidia sisältävää keräysgeeliä.

Geelit kiinnitettiin, käsiteltiin 50 mM H2S04:lla tunnin ajan lämpötilassa 80 °C glykoproteiinin desialyloimiseksi, peitettiin sitten 125I-leimatulla maapähkinäagglutiinilla, pestiin ja kuivattiin. Jotta saataisiin aikaan glykoprote-25 iinien siirtyminen polyakryyliamidigeeliin, käytettiin lineaarisen gradientin sisältävää geeliä, jossa oli silloi-tusaineena N,N-diallyyliviinihappoamidi (DATD) N,N-mety-leenibisakryyliamidin sijasta. Keräysgeeli koostui 2-%:isesta DATD-akryyliamidigeelistä. 125I-leimattua mate-30 riaalia sisältäville geeleille tehtiin autoradiagrafia, jossa käytettiin Kodak X-Omat AR -filmiä ja kuvanvahvis-tuslevyjä. 3H-leimattuja näytteitä sisältävien geelien ollessa kyseessä, käsiteltiin geelit, joista väri oli poistettu, Enchasella (New England Nuclear, Boston, MA) ennen 35 kuivausta ja tehtiin sitten röntgenfilmin säteilytys.

- ')< n c 46

Erilaisten hajottavien entsyymien vaikutus rgp580:een ja hgp580:een määritettiin inkuboimalla 125I-lei-mattua glykoproteiinia 100 ml:ssa DPBSra 1 tunti lämpötilassa 37 °C. Tutkitut entsyymit olivat trypsiini, pepsiini, pronaasi, papaiini (aktivoitu 1 mM β-merkaptoetanolilla), α-kymotrypsiini, subtilopeptidaasi A (1 ja 10 mg/ml), kondroitinaasi ABC (1 yksikkö/ml), Streptomyces -hyaluro-nidaasi (100 sameudenalentamisyksikköä/ml), Vibrio cholera -neuraminidaasi (100 yksikköä/ml) ja B-galaktosidaasi (10 yksikköä/ml). Näytteille ja käsittelemättömälle ver-tailunäytteelle tehtiin sitten SDS-PAGE -analyysi DATD-akryyliamidigeelillä (2 -* 17,5 %), kuivattiin ja kuvattiin röntgenfilmille. Tuloksena olevalle filmille tehtiin den-sitometripyyhkäisymittaus Beckman DU-8 -laitteella, jossa käytettiin geelinmittauslisä.Laitetta.

Siaalihapporyhmät leimattiin kemiallisesti perjo-daatti-[3H]boorihydridillä ja 0-kytkeytyneet (hiilihydraatti sitoutunut seriiniin tai treoniiniin) oligosakkaridit vapautettiin käsittelemällä liuoksella, joka sisälsi 50 mmol/1 NaOH:ä ja 1 mol/1 NaBH4:ä, lämpötilassa 45 °C 24 tuntia typpiatmosfäärissä. Reaktio pysäytettiin lisäämällä etikkahappoa ja näyte johdettiin Dowex 50 (H*) -kolonnin läpi. Siaalihappoa sisältävät oligosakkaridit analysoitiin BioGel P6 -kolonnissa, joka oli tasapainotettu 50 mM pyri-diniumasetaattiliuoksella (pH 5,3).

rgp580:n ja hgp580:n aminohappoanalyysi tehtiin LKB model 401 -aminohappoanalysaattorilla, jossa käytettiin norleusiinia sisäisenä standardina. Näytteet kylmäkuivat-tiin hapolla pestyissä putkissa ja hydrolysoitiin sitten Gdn-HCl:lla 24 tuntia lämpötilassa 100 °C.

hgp580:n vertailevan karakterisoinnin tulokset annetaan taulukossa V. Kuten siitä ilmenee, hgp580:llä on monia yhteisiä biokemiallisia ominaisuuksia rgp580:n kanssa. Nämä kaksi ovat kuitenkin erotettavissa toisistaan aminohappoanalyysin perusteella. Taulukossa V esitetyt aminohappoanalyysien tulokset edustavat neljän kokeen kes kiarvoja, ja niiden tarkkuutena pidetään ± 10 %.

47 .:- 7 υ . c

Taulukko V

5 Rotan ja ihmisen puhdistetun sialogalaktoproteiinin gp580 ominaisuudet

Ominaisuus Rotan Ihmisen _ _gp580 gp580 10 1. Molekyylipaino a) geelielektroforeesi 580 000 580 000 b) geelikromatografia 550 000 550 000 2. Tiheys a) 4 M guanidiini-HCl 1,4 g/ml 1,4 g/ml 15 b) 0,5 M guanidiini-HCl 1,6 g/ml 3. Maapähkinäagglutiinin sitoutuminen a) käsittelemätön b) desialylaatio + + 4. Hajottavan entsyymin kestävyys 20 a) trypsiini + + b) papaiini + + c) pepsiini + + d) kondroitinaasi ABC + + e) hyaluronidaasi + + 25 f) pronaasi g) subtilopeptidaasi A - 5. Oligosakkaridit a) sitoutuu lektiineihin + + b) vapautuu NaOH/NaBH4:11a + + 30 c) siaalihappo + + 6. Aminohapot ja aminosokerit (ryhmää/1 000 aminohappoa) a) asparagiinihappo 103 120 b) treoniini 95 87 35 (jatkuu.. . ) 48 '5? 06

Ominaisuus Rotan Ihmisen _ __gp58Q gp580_ c) seriini 148 166 d) glutamiinihappo 137 154 e) proliini 33 37 f) glysiini 98 78 g) alaniini 31 26 h) kysteiini 6 N.D.

i) väliini 59 65 j) metioniini 8 N.D.

k) leusiini 60 56 l) isoleusiini 38 38 m) tyrosiini 24 23 n) fenyylialaniini 35 29 o) histidiini 16 11 p) lysiini 82 94 q) arginiini 25 16 r) glukosamiini 125 147 s) galaktosamiini 102 113

N.D. = ei havaittu Esimerkki IV

Monoklonaalisten vasta-aineiden kehittäminen > hgp580:lle

Ihmisen kasvainsoluille spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita on kehitetty käyttämällä hgp580-antigeeni-valmistetta hyvin samankaltaisella tavalla kuin edellä kuvattiin rgp580:n kohdalla. Eräässä edullisessa suoritus-j muodossa, jota kuvataan seuraavassa, kehitettiin hybrido-mia käyttämällä hgp580:tä sisältävällä valmisteella immunisoitujen rottien pernasoluja ja fuusioimalla nämä perna-solut rotan myeloomasolulinjaan. Muitakin solujärjestel-miä, esimerkiksi hiiri-hiiri -hybridejä voidaan kuitenkin 5 menestyksellisesti käyttää hybridomien muodostamiseen.

°».? 8 0 6 49

Mahdolliset erot seuraavien menettelyjen, jotka on tarkoitettu hgp580:n vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseen, ja rgp580:n yhteydessä aiemmin kuvattujen menettelyjen välillä, eivät ole ratkaisevia vaan edustavat 5 ennemminkin hiuksenhienoja eroja.

a. Materiaalit ja menetelmät Eläimet:

Umpisiittoiset 8 viikon ikäiset Fischer (F344/CDL) -rotat (RT11) toimitti Harland Sprague Dawley, Houston, 10 Texas. Rotille annettiin tavanomaista jyrsijöiden ruokaa ja klooraamatonta kaivovettä rajoittamattomasti ja niitä hoidettiin noudattaen ohjeita, joita ovat antaneet The University of Texas System Cancer Center ja Institute of Laboratory Animal Resources, National Reasearch Council. 15 Solut ja solulinjat:

Rotan myelooman Y3 Agl.2.3 (RT1V) toimitti C. Mil-stein, MRC Laboratories, Cambridge, Englanti, ja sitä pidettiin yllä pyöritysviljelmänä antibiootittomassa Dulbec-co's Modified Eagles -alustassa (DMEM), joka sisälsi 20 20 mmol/1 runsasglukoosista Hepes:iä ja 10 % naudan sikiösee-rumia (FBS) (Hyclone, Logan, UT).

Rotan nisäadenokarsinooman 13762NF kloonatut ala-linjat (MTLn3, MTLn2, MTF7, MTC) ja kloonaamaton MTPa saatiin ja kasvatettiin edellä kuvatulla tavalla. Kaikille 25 solulinjoille tehtiin rutiinitutkimukset ja niiden havaittiin olevan vapaita mykoplasma- ja viruskontaminaatioista.

Lisää solulinjoja eristettiin rotan nisäadenokarsi-noomista R32-30Av (RT11), DMBA-1 (RT11) ja MNU-F344 (RT11) ja rotan fibrosarkoomasta CSE (RT11). Täysikasvuisen rotan 30 ja rotan sikiön fibroplasteista tehtiin lyhytaikaisia viljelmiä edellä kuvatulla tavalla. Ihmisen melanoomalinjat toimitti J. Fogh (Sloane Kettering Cancer Center, NY, NY), MDA-436 saatiin R. Cailleau'lta ja ihmisen rintasyövän aivoetäpesäkkeet toimitti The Department of Neuro-oncolo-35 gy, M. D. Anderson Hospital, Houston, Texas).

) } Π '1 A 50

Hybridomien tuotanto:

Hybridomat muodostettiin käyttämällä pernasoluja rotista, jotka on immunisoitu i.d. hgp580:llä edellä rgp580:n yhteydessä kuvattua ohjelmaa noudattaen. Pernaso-5 lut preparoitiin johtamalla ne hienojakoisen verkon läpi 5 ml:aan alustaa. Solut pestiin kahdesti seerumittomalla alustalla ja niiden elinkyky määritettiin trypaanisini -ekskluusiolla. Pernasolut (2 x 108) sekoitettiin rotan Y3 Agl.2.3 -myeloomasolujen (108) kanssa ja soluseos pelletoi-10 tiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 500 x g 5 minuuttia. Pelletti suspendoitiin varovasti uudelleen ravistellen sitä minuutin ajan 2 ml:ssa liuosta, joka sisälsi 50 % polyetyleeniglykoli 1450:tä (J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ) DMEM:ssä (pH 7,2).

15 Fuusioseosta sekoitettiin vielä 1 minuutti, laimen nettiin 8 ml :11a DMEM:ä ja sentrifugoitiin 5 minuuttia kiihtyvyydellä 500 x g. Solut suspendoitiin uudelleen 200 ml: aan DMEM:ä, joka sisälsi 20 % FBS:ä, 10'4 mol/1 hypo-ksantiinia (Sigma), 4 x 10'7 mol/1 aminopteriiniä (Sigma) 2C ja 1,6 x 10~5 mol/1 tymidiiniä (HA-alusta; Sigma). Annoksia (1 ml) suspensiosta laitettiin 24-syvennyksisiin Costar -maljoihin (Costar, Gambridge, MA), joihin oli siirrostet-tu 24 tuntia aikaisemmin 2 x 104 säteilytettyä (39 Gy; gammasäteily) rotan fibroplastia syvennystä kohden. Kun mal-21 joja oli inkuboitu lämpötilassa 37 °C tavanomaisissa viljelyolosuhteissa 24 tuntia, lisättiin 1 ml HAT-alustaa. Fuusioita inkuboitiin 7-14 vuorokautta edellä mainituissa olosuhteissa ennen hybridien läsnäolon testaamista.

Spesifisen vasta-aineen läsnäolon tutkiminen: 3C Hybridomista tutkittiin spesifisen vasta-aineen tuotanto seuraavasti käyttämällä ELlSA:a. hgp580:n vastaisten vasta-aineiden testaamiseksi ultraäänikäsiteltiin puhdistettu antigeeni ja immobilisoitiin se sitten Immuno-tech-1 -levyille (50 μΐ/syvennys; A/S Nunc, Kamstrap, 3) Tanska) yön yli. Levyt pestiin kolmesti Dulbecco'n fos- i :ί n r· r'· s 51 ; · 6 faattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (DPBS) ja kerran tunnin ajan PBS:llä, joka sisälsi 1 % naudan seerumialbumiinia (BSA). Levyjä säilytettiin lämpötilassa -20 °C BSA:ta sisältävässä puskurissa käyttöön asti. Hybri-5 domaviljelmäsupernatanttinäytteitä (50 μΐ/syvennys) inku-boitiin hgp580:n kanssa 1 tunti huoneen lämpötilassa.

Levyt pestiin kolmesti PBS:llä, joka sisälsi 0,05 % BSArta. Lisättiin biotinyloitua vuohi/rotta-IgG:tä (Vector Labs., Burlingame, CA), joka oli laimennettu suhteessa 10 1:1 000 PBS:llä, joka sisälsi 1 % BSA:ta (Bethesda Re search Laboratories Inc., Gathersburg, MD), kuhunkin syvennykseen ja inkuboitiin 45 minuuttia lämpötilassa 25 °C. Levyt pestiin kuudesti PBS:llä, joka sisälsi 0,05 % BSA:ta ja sitoutunut vasta-aine määritettiin kvantitatiivisesti 15 käyttämällä liuosta, joka sisälsi lmg/ml o-fenyleenidi- amiinia 0,1 M sitraattipuskurissa (pH 4,5) ja johon lisättiin 0,012 % vetyperoksidia (100 μΐ/syvennys). Kun levyjä oli inkuboitu 15 minuuttia pimeässä, määritettiin absor-banssi aallonpituudella 450 nm käyttämällä Titertek Multi-20 scanner -laitetta (Flow Laboratories). Kaikissa määrityksissä käytettiin Y3 Agl.2.3 -viljelmäsupernatanttia negatiivisena vertailunäytteenä. Supernatanttien katsottiin olevan positiivisia, jos niiden absorbanssi oli vähintään kaksi kertaa standardipoikkeaman yläpuolella. Positiivi-25 sista syvennyksistä saadut hybridomat kloonattiin kahdesti rajalaimennusmenetelmällä käyttämällä säteilytettyjä rotan fibroplasteja syöttösoluina.

Muissa immuunimäärityksissä käytettiin 125I-leimat-tuja, affiniteettipuhdistettuja vasta-aineita rotan 30 F(ab' )2:lle (tri C. J. Dean, Chester Beatty Research Institute, Sutton, Surrey, Englanti). 50 μ1:η annoksia laimennettuja monoklonaalisia vasta-aineita inkuboitiin 1 tunti lämpötilassa 4 °C elävistä soluista koostuvien yksisoluker-rosten kanssa tai 25 °C:ssa kiinnitettyjen solujen kanssa, 35 jotka oli kasvatettu yhtenäisiksi viljelmiksi 96-syvennyk- '} r Γ: £ 52 sisillä mikrotiitterilevyillä. Sitoutunut monoklonaalinen vasta-aine määritettiin kvantitatiivisesti perusteellisen pesun jälkeen inkuboimalla 1 tunti 125I-leimatun lammas/rot-ta-F(ab')2:n kanssa (5 x 105 pulssia/min syvennystä kohden) 5 joko 4 °C:ssa (elävät solut) tai 25 °C:ssa (kiinnitetyt solut). Solut pestiin alustalla ja hajotettiin 200 pl:lla 2 N NaOH:ä. Radiaktiivisuus määritettiin tekemällä laskenta Beckman model 8000 -gammalaskurissa.

Monoklonaalisten vasta-aineiden puhdistus ja radio-10 nuklidileimaus:

Monoklonaaliset vasta-aineet puhdistettiin viljel- mäsupernatanteista affiniteettikromatografiällä, sen jälkeen kun ne oli konsentroitu saostamalla ammoniumsulfaatilla (40 % kyllästyspitoisuudesta). Anti(rotan K-ketju)-15 MAb, Mark 1 (H. Bazin, Bryssel, Belgia) kytkettiin Affigel 10:een (10 mg proteiinia/ml helmiä) valmistajan ohjeiden mukaisesti, ja tätä hartsia käytettiin positiivisten monoklonaalisten vasta-aineiden puhdistukseen. Monoklonaaliset vasta-aineet eluoitiin absorbenttikolonnista 3 M kalium- 20 tiosyanaattiliuoksella keräten 1 ml:n fraktioita, jotka neutraloitiin välittömästi 0,1 M Hepes -puskurilla (pH 8,0). Monoklonaalisten vasta-aineiden puhtaus tutkittiin natriumdodekyylisulf aa ttipoly akryyli amidi geelielektrofo-reesilla (SDS-PAGE) ja ne leimattiin tarvittaessa 125I:llä 25 (ICN Pharmaceutical Inc., Irvine, CA) käyttämällä klora miini T -menetelmää (ominaisaktiviteetti noin 2 pCI/pg).

Immunoblottaus -määritykset:

Immunoblottaus -määritykset tehtiin suurin piirtein Towbin et al.:n menetelmällä [P.N.A.S. 76 (1979) 4 350], 30 jota muunnettiin edellä kuvatulla tavalla. Proteiineja siirrettiin elektroforeettisesti yön yli DATD:llä silloitetuista, denaturoivista polyakryyliamidigradienttigee-leistä (2 -* 17,5 %) nitroselluloosapaperiin 50 V:n jännitteellä ja 0,29 A:n virralla. Antigeeni detektoitiin Vecta-35 stain -menettelyllä, jossa käytettiin alkalista fosfataa- Γ π f- 53 ' " ' ' ~ siä, valmistajan (Vector Labs, San Francisco, CA) ohjeiden mukaisesti.

Immuuniperoksidaasimenettely:

Kudosnäytteet (ihminen ja rotta) jäähdytettiin no-5 peasti nestetypessä ja säilytettiin sitten lämpötilassa -20 °C käyttöön asti. Immuuniperoksidaasivärjäysmenette-lyissä käytettiin 4 pm:n kryostaattileikkeitä. Käytetty määritysohjelma oli Vectastair ABC -antirotta-IgG -menettely (Vector Laboratories, San Francisco, CA), jossa käy- 10 tettiin substraattina diaminobentsidiiniä (1 mg/ml Tris-HCl:ssa; pH 7,2) laimennettuna suhteessa 1:1 0,02-%:isella vetyperoksidiliuoksella.

b. Esimerkkejä monoklonaalisistä anti-ihmis-gp580- vasta-aineista 15 Taulukossa VI esitetään positiivisia hybrodomakloo- neja, jotka on kehitetty joko rgp580:tä tai hgp580:tä vastaan ja ovat immuunireaktiivisia hgp580-antigeenin kanssa. Klooni HGR1:69 valittiin hyvän vasta-ainetuotantonsa perusteella vasta-aineen karakterisointitutkimuksiin.

20 Hybridomakloonit HGR1.69 (ATCC -talletusnumero HB9041) ja GP21:56 (ATCC -talletusnumero HB9042) talletettiin The American Typer Culture Collection'iin 20. maaliskuuta 1985 Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti.

25 Taulukko VI

Hybr i domaklooni t

Monoklonaalinen

Immunoqeeni vasta-aine_Spesifisyys_ 30 rotan gp580 rotan GP21:56 rotan ja ihmisen gp580 ihmisen gp580 rotan HGR1:69 rotan ja ihmisen gp580 ihmisen gp580 rotan HGR1:70 ihmisen gp580 ihmisen gp580 hiiren HGM1:4 ihmisen gp580 ihmisen gp580 hiiren HGM1:9 ihmisen gp580 35 (jatkuu... ) 54 " JV'>t

Monoklonaalinen

Immunogeeni vasta-aine_Spesifisyys_ ihmisen gp580 hiiren HGM1:34 ihmisen gp590 ihmisen gp580 hiiren HGM1:39 ihmisen gp580 5 ihmisen gp580 hiiren HGM1:43 ihmisen gp580 ihmisen gp580 hiiren HGM1:47 ihmisen gp580 ihmisen gp580 hiiren HGM1:54 ihmisen gp580 ihmisen gp580 hiiren HGM1:60 ihmisen gp580 ihmisen gp580 hiiren HGM1:77 ihmisen gp580 1G ihmisen gp580 hiiren HGM1:78 ihmisen gp580 ihmisen gp580 hiiren HGM1:84 ihmisen gp580

Esimerkki V

15 Ihmisen kasvainten detektointi

Edellä kuvatuilla menettelyillä tuotettuja monoklo-naalisia vasta-aineita voidaan käyttää menestyksellisesti määritysohjelmissa ihmisellä epäiltyjen kasvainten identifioimiseksi ja osoittamiseksi. Näitä tämän keksinnön mu-2C kaisia monoklonaalisiin vasta-aineisiin perustuvia immuu-nidetektointijärjestelmiä voidaan kätevästi soveltaa kas-vainsolujen detektointiin erityyppisistä näytteistä. Kas-vainantigeenin hgp580 läsnäolo voidaan osoittaa esimerkiksi vesipohjaisista näytteistä, kuten verestä, virtsasta, 2t hiestä, seerumista, plasmasta ja keuhko- tai vesivatsanes-teestä, ja määritys voidaan tehdä millä tahansa lukuisista alalla yleisesti tunnetuista immuunidetektointimenetelmis-tä, esimerkiksi radioimmuunimäärityksillä (RIA) ja entsyymiin kytketty immuunisorbentti -määrityksillä (ELISA).

3v> Vaihtoehtoisesti voidaan detektoida kiinteissä kudoksissa, kuten ihmiskudosnäytteissä olevat kasvainsolut käyttämällä tunnettuja immuunihistologisia määrityksiä.

a. Ehdotettu kiinteäfaasiradioimmuunimääritys gp580:n osoittamiseksi ja määrittämiseksi kvantita-3j tiivisesti vesipohjaisista näytteistä '< Γ r\t 55 hgp580:n läsnäolo verenkierrossa saattaa osoittautua arvokkaaksi diagnostiseksi indikaattoriksi kasvaimen läsnäolosta jossakin potilaan elimistössä tai vaihtoehtoisesti diagnostiseksi keinoksi seurata kemoterapian etene-5 mistä tai taudin uusimista. Seuraava ohjelma on ehdotettu lähestymistapa tämän keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden käyttämiseksi verenkierrossa olevien hgp580-antigeenien detektoimiseksi ja määrittämiseksi kvantitatiivisesti vesipohjaisista näytteistä.

10 Eräässä edullisesisa suoritusmuodossa vesipohjaisten näytteiden tutkimiseksi käytetään tavanomaista RIA -lähestymistapaa hgp580-antigeenin määrittämiseksi kvantitatiivisesti. Lyhyesti kuvattuna valmistetaan immuunihelmiä liittämällä affiniteettipuhdistettuja monoklonaalisia vas-15 ta-aineita Affi-Gel 10:een (1 ml Affi-Gel 10, 20 mg proteiinia) valmistajan ohjeita noudattaen. Tällä tavalla valmistettuja immuunihelmiä käytetään sitomaan alussa kaikki kyseessä olevassa näytteessä oleva hgp580.

hgp580:n sitomiseksi aluksi näytteestä sekoitetaan 20 keskenään immuunihelmet (pakkaustilavuus 10 μΐ), 100 ml RIA -puskuria (0,5 % naudan seerumialbumiinia, 0,19 % Triton X-100:aa ja 0,02 % atsidia DPBS:ssä; pH 7,4), standardiani igeenilaimennokset (tai vesipohjaiset näytteet, kuten potilaiden seeruminäytteet), 100 pl normaalia ihmisseeru-25 mia ja proteaasi-inhibiittoreita 1,5 ml:n polustyreeniput-kissa. Sitoutuminen saatetaan loppuun pyörittämällä putkia yön yli lämpötilassa 4 °C, minkä jälkeen antigeenillä kuormitetut immuunihelmet pestään kuudesti RIA -puskurilla.

Immuunihelmien sitoma hgp580 voidaan sitten määrit-30 tää kvantitatiivisesti käyttämällä esimerkiksi biotinyloi-tua monoklonaalista vasta-ainetta sisältävää valmistetta ja radioleimattua streptavidiinia, jolloin käytetään hyväksi avidiini/biotiinireaktiota. Lyhyesti kuvattuna bio-tinyloituja monoklonaalisia vasta-aineita valmistetaan 35 saattamalla monoklonaalinen vasta-aine (1 mg/ml 0,1 M He- 56 'J.VG06 pes -puskurissa; pH 8,0) reagoimaan liuoksen kanssa, joka sisältää 1 mg/ml D-biotiini-N-hydroksyylisukkinimidieste-riä ("NHS-biotiinia") vedettömässä DMS0:ssa, 4 tuntia lämpötilassa 0 °C NHS-biotiinin ja monoklonaalisen vasta-ai-5 neen välisen tilavuussuhteen ollessa 1:8. Kun biotinyloin-ti on saatettu loppuun, biotinyloituneet vasta-aineet voidaan vapauttaa NHS:stä ja sitoutumattomasta biotiinista ultrasuodattamalla Centrifree Micropartition Unit -laitteella käyttäen YM-30 -kalvoja. Eräs käyttökelpoinen pesu-10 puskuri on 100 mM Hepes, joka sisältää 0,05 % atsidia; pH 8,0.

10 pg biotinyloituja vasta-aineita lisätään antigeenillä kuormitettuihin ja pestyihin immuunihelmiin ja inkuboidaan 4 tuntia huoneen lämpötilassa. Immuunihelmet 15 pestään sitten kuudesti RIA -puskurilla ja inkuboidaan vielä 4 tuntia 5 pg:n kanssa 125I-streptavidiinia, pestään kuudesti RIA -puskurilla ja määritetään sitoutunut radioaktiivisuus automaattisella gammalaskurilla. Streptavidii-nin jodaus on kätevää tehdä kloramiini T -menetelmällä.

2C Potilasnäytteessä olevan hgp580:n pitoisuus voidaan määrittää vertaamalla tunnetuilla antigeenipitoisuuksilla saatuja standardikäyriä potilaan näytteillä saatuihin käyriin.

b. hgp580:n osoittaminen ihmiskudosnäytteistä 2i Tämän keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-ai neita voidaan käyttää menestyksellisesti myös osoittamaan kasvainsolujen läsnäolo ihmiskudosnäytteissä. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa ihmiskudosnäytteet jäähdytetään nestetypessä ja säilytetään ilmatiiviissä säiliöissä 3o lämpötilassa -20 °C käyttöön asti. Kaikissa immuunihistolo-gisissa määrityksissä käytetään edullisesti noin 4 pm:n paksuisia kryostaattileikkeitä. On edullista käyttää mää-ritysohjelmana Vectastain ABS antirotta-IgG- tai antihii-ri-IgG -menettelyä, jotka molemmat ovat alan ammattimies-ten tuntemia, käyttäen joko piparjuuriperoksidaasia tai 57 :rr6 alkalista fosfataasia entsyymimarkkerina.

Lyhyesti kuvattuna kudosleikkeet kiinnitetään asetonissa ja endogeeninen entsyymiaktiivisuus inhiboidaan käyttämällä joko liuosta, joka sisältää 0,3 % H202:a meta-5 nolissa (peroksidaasivärjäys) tai 20-%:ista etikkahappoa ( fosfataasivär jäys ). Vas;ta-aine (supernatantti, vesivatsa-neste tai affiniteettipuhdistettu tuote) levitetään levylle, inkuboidaan 1 tunti, pestään ja inkuboidaan kudoksia 30 minuuttia biotinyloidun antirotta-IgG:n (tai antihiiri-10 IgG:n) kanssa valmistajan ohjeiden mukaisesti. Avidiini-entsyymikompleksi levitetään sitten levylle perusteellisen puskuripesun jälkeen ja inkuboidaan kudoksen kanssa 1 tunti. Tänä aikana valmistetaan asianmukaiset entsyymien substraatit. Kudokset pestään ja niitä inkuboidaan entsyymin 15 kanssa 35 - 50 minuuttia, pestään ja vastavärjätään

Mayer'in hematoksyliinillä. Osoituksena kasvainsolujen läsnäolosta kudosnäytteessä on positiivinen entsyymireak-tio, joka on havaittavissa tarkastelemalla levyä mikroskoopin alla.

20 Taulukossa VII esitetään tulokset, joita on saatu tutkittaessa erilaisia kudosnäytteitä edellä kuvatulla tavalla käyttämällä joko rgp580:tä (GP21:56) tai hgp580:tä (HGR1:69) vastaan kehitettyä monoklonaalista vasta-ainetta. Rotan tai ihmisen antigeeniä vastaan kehitetyt vasta-25 aineet näyttävät toimivan yhtä hyvin ihmisen kasvaimen identifioinnissa. Alan asiantuntijat havainnevat lisäksi, että nämä monoklonaaliset vasta-aineet suosivat rintape-räisiä kasvaimia ja erityisesti rintakudosperäisiä meta-staattisia kasvaimia.

30 35 58 i >'':·· 6

Taulukko VII

Eri kudosten immuunitutkimus

Monoklonaalinen vasta-aine 5 positiivisten lukumäärä/tes-

Kasvain tattujen kokonaislukumäärä __HGRl: 69_GP21:56

Infiltroituva rintatiehytkarsinooma 4/8 3/8 1C Normaali rinta 0/5 0/5

Imusolmuke-etäpesäke (rintasyöpä) 2/2 2/2

Keuhkoetäpesäke (rintasyöpä) 2/2 2/2

Aivoetäpesäke (rintasyöpä) 1/2 1/2 15 Paksusuolikarsinooma 0/3 0/3

Normaali paksusuoli 0/1 0/1

Maksaetäpesäke (paksusuolisyöpä) 0/1 0/1

Hyvänlaatuinen paksusuolikasvain 0/1 0/1

Melanooma 0/1 0/1 2C____________

Vaikka tätä keksintöä kuvataan erityissuoritusmuo-tojen avulla, alan asiantuntijat ymmärtänevät, että käytetyt menetelmät ovat yleisesti tunnettuja menetelmiä, jois-2l. ta on lukuisia variaatioita ja suoritusmuotoja. Soveltuvat variaatiot lienevät ilmeisiä alan ammattimiehille. Esimerkkinä mainittakoon, että vaikka keksinnön mukaisia mo-noklonaalisia vasta-aineita kuvataan pääasiassa rotta-rotta -hybridien avulla, ovat hiiri-hiiri -hybridit yhtä hy-3i. vin soveltuvia, kuten taulukossa VI valaistaan. Alaa hallitsevat molekyylibiologit ja proteiinibiokemistit ymmärtänevät, että kuvattujen proteiinineristysmenetelmien lukuisia variaatioita voidaan menestyksellisesti käyttää gp580:n eristämiseen. Kaikkien tällaisten variaatioiden 3, katsotaan kuuluvan tämän keksinnön ja liitteenä olevien patenttivaatimusten piiriin.

Claims (9)

1. Oleellisesti puhdas ihmisen kasvainantigeeni gp580, tunnettu siitä, että se on glykoproteii-5 ni, jonka SDS-PAGE:lla identifioitavissa oleva molekyyli-paino on noin 550 kilodaltonia, että sitä voidaan eristää nisäkarsinoomasolujen solukalvofraktioista, että se on oleellisesti resistentti trypsiini- tai hyaluronaasikäsit-telylle ja merkittävän herkkä pronaasikäsittelylle, että 10 se sitoutuu merkittävässä määrin maapähkinäagglutiniiniin neuraminidaasikäsittelyn jälkeen, että se sisältää suunnilleen seuraavan lukumäärän kutakin esitetyistä aminohappotähteistä glykoproteiinin 1 000 aminohappotähdettä kohden:

15 Asparagiinihappo 120 Treoniini 87 Seriini 166 Glutamiinihappo 154 Proliini 37

20 Glysiini 78 Alaniini 26 Kysteiini ei havaittu Väliini 65 Metioniini ei havaittu 25 Leusiini 56 Isoleusiini 38 Tyrosiini 23 Fenyylialaniini 29 Histidiini 11

30 Lysiini 94 Arginiini 16 Glukosamiini 147 Galaktosamiini 113, ja että se voidaan valmistaa menetelmällä, jossa 35 A. (a) uutetaan liukoiset proteiinit gp580 mukaan luettuna kasvaimesta, joka sisältää gp5R0-antigeeniä; 0 7 ' £ 60 ^ (b) tehdään uutteelle geeliekskluusiokromatogra- fia; (c) otetaan talteen ekskludaatti; (d) tehdään ekskludaatille anioninvaihtokromato- 5 grafia; (e) eluoidaan fraktiot, jotka sitoutuvat anionin-vaihtohartsiin; (f) tehdään eluaatille geeliekskluusiokromatogra- fia; ja 10 (g) otetaan talteen ekskludoituneet fraktiot; tai B, (a) uutetaan liukoiset proteiinit gp580 mukaan luettuna kasvaimesta, joka sisältää gp580-antigeeniä; (b) tehdään uutteelle geeliekskluusiokromatogra- f ia; 15 (c) otetaan talteen ekskludaatti; (d) tehdään ekskludaatille tiheysgradienttisentri-fugointi; (e) fraktioidaan tasapainotettu tiheysgradientti; (f) tehdään gp580:tä sisältäville fraktioille gee- 20 liekskluusiokromatografia; ja (g) otetaan talteen ekskludoituneet fraktiot,

2. Vasta-aine, tunnettu siitä, että se on vasta-aine patenttivaatimuksen 1 mukaiselle antigeenille.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen vasta-aine, 25 tunnettu siitä, että se on monoklonaalinen vasta-aine.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen vasta-aine, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine on GP21:56 tai HGR1:69 (saatavana ATCC-talletusnumerolla

30 HB9042 ja vastaavasti HB9041).

5. Jatkuva hybridisolulinja, tunnettu siitä, että se tuottaa vasta-ainetta patenttivaatimuksen 1 mukaiselle antigeenille ja että se saadaan menetelmällä, jossa 35 i ··> ip.r.A . .✓ ·.' (a) fuusioidaan rotan pernasoluja rotan myelooma-solujen kanssa, jolloin pernasolujen lähteenä oleva rotta on Immunisoitu antigeeniseoksella, joka sisältää gp580-antigeeniä; 5 (b) viljellään soluja selektiivisessä alustassa; (c) testataan halutun vasta-aineen läsnäolo; ja (d) kloonataan haluttua vasta-ainetta tuottavat solut.

6. Menetelmä ihmisen kasvainten vastaisten vasta-10 aineiden tuotannossa käyttökelpoisen, oleellisesti puhtaan ihmisen gp580-antigeenin tuottamiseksi, tunnet-t u siitä, että A. (a) uutetaan liukoiset proteiinit gp580 mukaan luettuna kasvaimesta, joka sisältää gp580-antigeeniä; 15 (b) tehdään uutteelle geeliekskluusiokromatogra- fia; (c) otetaan talteen ekskludaatti; (d) tehdään ekskludaatille anioninvaihtokromato- grafia; 20 (e) eluoidaan fraktiot, jotka sitoutuvat anionin vaihtohartsiin; (f) tehdään eluaatille geeliekskluusiokromatogra- fia; ja (g) otetaan talteen ekskludoituneet fraktiot; tai

25 B. (a) uutetaan liukoiset proteiinit gp580 mukaan luettuna kasvaimesta, joka sisältää gp580-antigeeniä; (b) tehdään uutteelle geeliekskluusiokromatogra- fia; (c) otetaan talteen ekskludaatti; 30 (d) tehdään ekskludaatille tiheysgradienttisentri- fugointi; (e) fraktioidaan tasapainotettu tiheysgradientti; (f) tehdään gp580:tä sisältäville fraktioille geo-liekskluusiokromatografia; ja 35 (g) otetaan talteen ekskludoituneet fraktiot. IΊ > ;\ " Λ / 62 :-.^0 j6

7. Diagnostinen in vitro -menetelmä ihmisen meta-staattisten kasvainsolujen esiintymisen osoittamiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että saatetaan näyte kosketukseen vasta-aineen kanssa, joka on spesifinen pa- 5 tenttivaatimuksen 1 mukaiselle antigeenille, ja detektoi- daan vasta-aineen sitomat materiaalit.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näyte on vesipohjainen näyte ja menetelmässä 1C (a) sekoitetaan näyte vasta-aineen kanssa, joka on spesifinen patenttivaatimuksen 1 mukaiselle antigeenille, olosuhteissa, jotka edistävät spesifisiä antigeenin ja vasta-aineen välisiä vuorovaikutuksia; ja (b) detektoidaan antigeenin ja vasta-aineen väli- 1C nen vuorovaikutus; tai siitä, että näyte ei ole vesipohjainen näyte ja menetelmässä (a) peitetään näyte vasta-aineella, joka on spesifinen patenttivaatimuksen 1 mukaiselle antigeenille; 2C (b) inkuboidaan peitettyä näytettä olosuhteissa, jotka edistävät spesifisiä antigeenin ja vasta-aineen välisiä vuorovaikutuksia; ja (c) detektoidaan antigeenin ja vasta-aineen välinen vuorovaikutus. 2C

9. Välineistö ihmisen syövän detektoimiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää: (a) patenttivaatimuksen 1 mukaista antigeeniä tai sille spesifistä vasta-ainetta; ja (b) immuunidetektointireagenssia. Γ s