JPS6296500A - 抗−ヒト乳癌モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、免疫学並びに癌の診断及び治療の分野に属
する。さらに詳しくは、この発明はネズミモノクローナ
ル抗−ヒト乳癌抗体、これらの抗体を生産するハイブリ
ドーマ、これらの抗体から製造される免疫化学物質、並
びにこれらの免疫化学物質を使用する診断及び治療方法
に関する。

〔従来の技術〕

１９７０年代の中ごろから、ヒト乳癌関連抗原と相互作
用するネズミモノクローナル抗体の多くの報告が存在す
る。これらの報告された研究においては、マうスがヒト
乳脂肪球蛋白質、乳癌セルライン又は乳癌膜抽出物によ
り免疫感作されそして追加免疫された。免疫肺細胞がマ
ウス骨髄腫細胞と融合され、そしてハイブリドーマが乳
房又は乳癌抗原に対する培地の幾らかの特異性に基いて
選択された。Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏ
ｕ、　Ｊ、等、Ｉｎｔ、Ｊ。

Ｃ，ａｎｐｅｒ　（１９８１）−２旦州７−２］　；　
Ｙｕａｎ、Ｄ、等、ｊＮ（：Ｉ（１９８２）６８　：　
７１９−７２８　；　Ｃ１ｏｃｃａ、　Ｄ、Ｒ，等、Ｃ
ａｎｃ、ｅｒ　ｔ？ｅｓ。

（１９８２）す：　４２５６−４２５８゜これらの従来
技術の抗体の正常組織反応性はこの発明の抗体の正常組
織反応性と異る。

〔発明の概要〕

この発明の主たる観点は、ネズミモノクローナル抗体で
あって、 （ａ）血液細胞に結合せず； （ｂ）　０．２５以上の乳癌結合範囲を有するか、又は
０．２５以上の乳癌セルライン範囲を有し；（ｃ）　０
．０９以下の選択性を有し；（ｄ）　Ｇ又はＭアイソタ
イプを有し；そして（ｅ）イメージング成分に接合され
た場合に、乳癌をイメージングするのに十分なシグナル
を生じさせる； ことを特徴とするモノクローナル抗体に関する。

これらの抗体の好ましい具体例は、 ２Ｇ３．９Ｃ６，３２ＡＩ、３３Ｆ８．３５Ｅ１０，４
１１Ｍ、８７１１７．１０６八１０゜１１３Ｆ１．１２
０Ｆ１７．１４ＯＡ７．２００Ｆ９．２０３＋！２，２
１９Ｆ３、２４５Ｅ７゜２５４Ｈ９，２６０Ｆ９．２６
６Ｂ２　、３１７Ｇ５　、３６９ＦＩＯ，３８７＋１９
　、４２１Ｅ８　。

４５１Ｃ３、４５２８１２，４５２Ｆ２，４５４八１２
，４５４ＣＩ−１，，４５７Ｄ７、５２０Ｇ９゜６５０
Ｅ２，６９７Ｅ３、７４１ＦＢ、　７５９Ｅ３．７８８
Ｇ６と称されるもの、及びこれらと機能的に同等なもの
である。

上記の抗体を生産するネズミ×ネズミーハイブリドーマ
、及びそれらの子孫が、この発明の他の観点である。

この発明の他の観点は、 （Ａ）上記のモノクローナル抗体、及び（Ｂ）検出可能
なイメージング成分、 の接合体であるイムノイメージング剤に関する。

この発明の他の観点は、イメージングに有効な量のイム
ノイメージング剤を投与し、そして患者中のイムノイメ
ージング剤を適当な検出装置により検出することによる
、乳癌のイメージングを必要とする患者において乳癌を
イメージングする方法に関する。

〔具体的な説明〕

この明細書において使用する場合、′モノクローナル抗
体”なる語は均一な抗体集団を有する抗体組成物を意味
する。抗体の由来又はそれが作られた方法に関して限定
されない。

この発明のモノクローナル抗体生産性ハイブリドーマに
関してこの明細書において使用する場合、“子孫”なる
語は、世代又は核型の同一性に関係なく、親により生産
されるものと同じモノクローナル抗体−ヒト乳癌抗体を
生産する、親ハイブリドーマのすべの派生体、子孫、及
び結果物を包含することが意図される。

例示的なネズミモノクローナル抗−ヒト乳癌抗体に関し
てこの明細書で使用する場合、“機能的に同等”なる語
は、（ａ）例示されたモノクローナル抗体と同じ抗原又
はエピ１−−プに結合し、（ｂ）０．２５以上の乳癌結
合範囲を有するか又は０．２５以上の乳癌セルライン範
囲を有し、（Ｃ）０．０９以下の選択性を有し、（ｄ、
）Ｇ又はＭアイソタイプを有し；そして（ｅ）イメージ
ング成分と接合された場合、乳癌をイメージングするの
に十分なシグナルを生じさせるモノクローナル抗体を意
味する。

上記のように、この明細書において使用される“機能的
に同等”なる語は５つの規準を含む。これらの規準の第
１、すなわち例示されるモノクロ−ナル抗体上同一の抗
原又はエピトープへの結合は、機能的に同等なモノクロ
ーナル抗体による例示されたモノクローナル抗体の交差
ブロックを示す実験により証明することができる。交差
ブロックは、例示された抗体の１つにより結合されるそ
れと同しエピート（抗原上の）に抗体が結合する結果と
して、又は１つのエピトープへの抗体の結合が第２のエ
ピトープへの抗体の結合をブロックする程接近して同じ
抗原上に位置する異るエピトープに抗体が結合する結果
として生ずる。従って、交差ブロックは、機能的に同等
なモノクローナル抗体が例示されたモノクローナル抗体
と同じ抗原又はエピト−プに結合することを決定し得る
規準の１つである。

いわゆる“サンドインチ”アッセイは、抗体が同し抗原
又はエピ１−−プと結合するか否かを決定するだめの他
の方法である。これらのアッセイにおいては、第１のモ
ノクローナル抗体が支持体、例えばタイタープレートウ
ェルの表面に結合される。非特異的結合を回避するため
の処理の後、非常に可溶化された抗原調製物が結合して
いる抗体に玲加される。次に、検出可能なラベル、例え
ば蛍光色素を有する第２抗体が添加される。第２抗体が
抗原に結合すれば、異るエピトープ特異性、又は同じ抗
原上同じエピトープの多数のコピーが示される。第２抗
体が結合に失敗すれば、同じエピトープ特異性又は異る
抗原特異性が示される。

交差ブロック及びサンドイソヂアソセイの両者の結果は
、第２シリーズの試験、例えば両抗体により結合された
抗原が同じ分子量を有することを示すウェスタンブロッ
ティング又は免疫沈澱によりさらに確認される。

モノクローナル　ＪｕＬ所 この発明のハイブリドーマを作るために使用される抗体
生産性融合パートナ−は、マウスを化ヒト乳癌細胞又は
それから調製された膜抽出物により免疫感作することに
より得られる。マウスに免疫原量の細胞又は抽出物を腹
腔内接種し、そして次に類似の量の免疫原により追加免
疫感作する。

最終追加免疫の数日後に、免疫感作されたマウスから肺
臓を集め、そして肺臓から融合において使用するための
細胞懸濁液を調製する。

ハイブリドーマを肺細胞及びネズミ腫瘍パートナ−から
、Ｂｕｃｋ、Ｄ、Ｗ等、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ（１９８２Ｈ
Ｅし３７７−３８１により改変されたＫｏｈｌｅｒ、　
Ｂ、及びＭｉｌｓｔｅｉｎ。

Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）　２５６　：　　４９
５　４９７の一般的体細胞ハイブリダイゼーション技法
を用いて調製する。

このハイブリダイゼーションにおいて、入手可能なネズ
ミ骨髄肺セルライン、例えばサルク研究所、細胞分配セ
ンター、ザンジエゴ、カリホルニア、米国から得られる
それを使用することができる。

基本的には、この技法は、ポリエチレングリコールのご
とき融合剤を用いて腫瘍細胞と肺細胞を融合せしめるこ
とを含む。融合の後、細胞を融合媒体から分離し、そし
てＨＡ　Ｔ培地のごとき選択増殖培地中で増殖せしめて
ハイブリダイズしなかった親細胞を除去する。所望によ
り、ハイブリドーマを拡張し、そして上清を抗−ヒト乳
癌活性について、常用のイムノアッセイ法（例えば、ラ
ジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアンセイ、又（
Ｉ３） はフルオレッセンスイムノアッセイ）により、抗原とし
て免疫剤（乳癌細胞又は膜抽出物）を用いてアッセイす
る。陽性クローンをさらに特徴付けて、それらがこの発
明の抗体の規準に合致するか否かを決定する。

このような抗体を生産するハイブリドーマは既知の方法
を用いてインビトロ又はインビボで増殖せしめることが
できる。モノクローナル抗体は、事情に応じて培地又は
体液から、常用の免疫グロブリン精製法、例えば硫酸ア
ンモニウム沈澱、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフ
ィー、及び限外濾過により、所望により単離することが
できる。

モノクロ−ル　　の゛　　　　　土ナ モノクローナル抗体の重要な特徴は、（１）それらの免
疫グロブリンクラス、（２）ヒト乳癌細胞に対するそれ
らの選択性、（３）それらが結合するヒト乳癌腫瘍細胞
の範囲、（４）それらが結合するヒト乳癌腫瘍凍結切片
の範囲、及び（５）効果的な抗−ヒト乳癌イムノイメー
ジング剤の製造におけるそれらの有用性である。

与えられた抗体の選択性及び範囲は、（１）ヒト乳癌腫
ｗｊ組織、（２）ヒト乳癌セルライン、及び（３）正常
ヒト組織又は乳房もしくは他の由来の細胞、のパネルに
対してその抗体を試験することにより決定される。特許
請求の範囲に記載されている抗体の選択においては、約
２２，０００の増殖するハイブリドーマ培養物をまず免
疫感作用乳癌膜又はセルライン、７種の正常組織膜のパ
ネル、線維芽細胞セルライン及び乳癌凍結切片に対して
スクリーニングした。新生物材料と反応するが正常月料
とは反応しないクローンをこの最初のスクリーニングに
おいて同定し、そしてアイソタイプの決定並びに選択性
及び範囲の追加のスクリーニングのために選択した。追
加のスクリーニングは、１６挿類の正常ＳＪｔ織切片切
片種類の正常血液細胞タイプ、１１種類の非乳房新生物
切片、２１種類の乳癌切片、及び１４種類の乳癌セルラ
インを用いた。

この発明の目的のため、選択性及び特異性は相互交換的
に使用され、そして１６の正常組換凍結切片中東色され
たサブストラクチュアー（ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）
の数と結合された血液細胞タイプの数の合計を、それに
対してモノクローナル抗体が試験された全組織中モノク
ローナル抗体のいずれかにより結合されたサブストラク
チュアー（ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の全数と試験さ
れた５種類の血液細胞タイプの合計で除したものとして
定義される。

“癌範囲”（ｔｕｍｏｒ　ｒａｎｇｅ）なる語は、染色
された乳癌凍結切片の数を試験された乳癌凍結切断の数
で除したものとして定義される。抗体は、それらが０．
０９以下の選択性、及び０．２５以上の乳癌結合範囲又
は０．２５以上の乳癌セルライン結合範囲を有する場合
に、乳癌イムノイメージング目的のために適当であるも
のと認められた。

許容される選択性及び結合範囲を示す抗体を、種々のイ
メージング成分、例えば放射性同位元素、又は核磁気共
鳴イメージングにより検出可能な材料に接合せしめるこ
とができる。幾つかの場合には、カップリング剤、例え
ばキレート剤を用いてイメージング剤を抗体に連結する
ことができる。

３３の寄託されたハイブリドーマの内５種類の抗体が同
じ２００にダルトンの抗原を認識することが見出された
。３３の内４種類の担体が２３０にダルトンの細胞内抗
原に結合した。３種類が１又は複数の高分子量ムチン（
ｍｕｃｉｎ）　（）ＩＭＷ）に結合し、そして２種類が
９７にダルトン抗原の形のトランスフェリンリセプター
に結合した。ここに記載するすべての抗原の分子量は既
知の方法を用いる還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルにより決定された
。

これらの抗体の特徴付けのこれ以上の詳細は例において
後記する。

屍１８した１貫 最も重要なこの発明のモノクローナル抗体の免疫化学誘
導体は、イメージング成分、例えば放射性同位元素、放
射線不透過基質、又は核磁気共鳴により検出可能な材料
によりラベルされる。このような免疫化学誘導体（イメ
ージング成分が、ラベルされた抗体を含む免疫複合体を
同定するだめの手段を提供する）を、乳癌腫瘍のインビ
ボでのイメージングに用いることができる。

０．２５以上の乳癌腫瘍結合範囲又は０．２５以上の乳
癌セルライン結合範囲のいずれかを示し、そしてさらに
０．０９以上の選択性を示しそしてＩｒＩＩ液細胞に結
合しない抗体が、乳癌イムノイメージング目的のために
選択的であると考えられた。そして、これらを検出可能
なイメージング成分と接合せしめることができる。これ
らのイメージング成分はモノクローナル抗体に直接結合
せしめることができ、又はリンク剤又はキレート剤によ
りモノクローナル抗体に結合せしめることができる。イ
メージング成分によってラベルされたモノクローナル抗
体の誘導体は当業界において知られている種々の方法に
より作すことができる。このようなラベルされた誘導体
もまた、イムノイメージング剤として好ましい。

固相酸化側、１．３．４．６−テトラクロロ３α、６α
−ジフェニルグリコウリル（商標１ｏｄ。

−ｇｅｎのもとに販売されている）、又はＮ−クロロ−
ｐ−トルエンスルホンアミド（クロラミンＴ）を用いて
、ヨウ素の放射性同位元素によりモノクローナル抗体を
ヨード化することができる。

この明細書において使用するリンカ−なる詔は、イメー
ジング成分に結合することができ、そしてさらにモノク
ローナル抗体に結合することができる化学物質を包含す
ることが意図される。適当なリンカ−は、モノクローナ
ル抗体に結合し、そして放射性核種をキレートするリン
カ−を包含するであろう。他のリンカ−１例えば、モノ
クローナル抗体の炭水化物担持領域に選択的に結合する
ことができるもの、又はモノクローナル抗体の蛋白質領
域の遊離アミノ側基に結合することができるもの（例え
ばアミジン化剤又はイミジン化剤）であって、イメージ
ング成分に共有結合することができるものもこの明細書
で使用するリンカ−なる語の範囲に含まれる。

適当なリンカ−は３つの特徴を有するであろう。

第１に、これらはイメージングのため読め取られるため
に望ましい特徴を有するイメージング成分を結合するこ
とができなければならない。第２に、リンカ−（よモノ
クローナル抗体の結合選択性に有意な影響を与えてはな
らず、又は結合されるべき抗原に対する親和性を実質的
に低下せしめてはならない。最後に、リンカ−は、イメ
ージング剤と抗体が他方から分離しないように、イメー
ジング剤とモノクローナル抗体との安定な結合を形成し
なければならない。

この発明のイムノイメージング剤の製造のために使用さ
れる特定のリンカ−及びイメージング成分は、特定のイ
メージング成分又はイメージング成分とリンカ−が標的
抗原に対するモノクローナル抗体の結合特性に対して有
する効果に依存して、抗体ごとに異るであろう。すなわ
ち、１つのモノクローナル抗体はヨウ素の放射性同位元
素を用いてモノクローナル抗体内のチロシン残基におい
て、モノクローナル抗体の親和性又は選択性に有意な影
響を与えることなくヨード化することができるであろう
が、この発明の第２のモノクローナル抗体の同じ処理が
他のモノクローナル抗体の親和性又は結合特異性を有意
に低下せしめるであろう。

異るラベル又はリンカ−３例えば、異るアミノ酸残基に
おいて抗体に結合するものを、第２の抗体の選択性又は
親和性に影響を与えることなく使用することができる。

すなわち、ヨウ素放射性同位元素を第２の抗体に、例え
ば−ｏｏｄ、　Ｆ、Ｔ、等、ハ旦ム」■非堕、匝：　３
３９（１９７５）の方法及びリンカ−であるメチル−ｐ
−ヒドロキシベンズイミデートを用いて、又はＢｏｌｔ
ｏｎ−１１ｕｎｔｅｒの方法、ＢｏｌＬｏｎ、八、Ｅ、
及びＨｕｎｔｅｒＩＩＩｌ、Ｍ、＋Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ
、　１３３　：５２９−５３９　（１９７３）及びリン
カ−であるＮ−サクシンイミジルー３−（４−ヒドロキ
シフェニル）プロピオネートを用いて連結することがで
きる。キレート剤、例えば、抗体のりジン残基に結合す
る無水ジメチレントリアミンペンタ酢酸、又はエチレン
トリアミン四酢酸を用いて抗体を１１１−ペンタうム（
１１１−Ｉｎ）でラベルすることができ、そしてさらに
抗体をイメージング成分に連結せしめるための他の手段
として使用され得る。例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ等、Ｃｈ
ｅｌａｔｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ八ｎｔｉｂｏｄｉｅへ　　ｆｏｒ　　Ｉｎａ
ｇｉｎｇ　　Ｌｙｍｐｈｉｄ　　５ｔｒｕｓｔｕｒｅｓ
　　１ｎｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ”、Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ
、２６（５）：　　４９３−５０２（１９８５）　　、
及びＭｅａｒｅｓ等、”Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｏｆ
　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｗｉｔｈ　　Ｂｉｏｆｕｎｃｔ
ｉｏｎａｌ　　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　　ＡＢｅｎｔｓ　
　ＩｌｅａｒｉｎｇＩｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　ｏ
ｒ　Ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｍｉｄｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　　
ａｎｄＳｕｂｓｅｑｕｅｎｔ　Ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ
　Ｍｅｔａｌ　　Ｉｏｎｓ”、　Ｎｐｂ−。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４２　：　６Ｂ−７８（１９８４
）を参照のこと。

イメージングのために適当な種々の成分が知られている
。例えば、モノクローナル抗体がイメージングのために
適当な多数の放射性核種、例えば１３１−ヨウ素（Ｉ−
１３１）及びｌ−１２３により放射性ラベルされている
。Ｌｅｖｉｎ等、”Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆ　ｌ
−１３１Ｌａｂｅｌｅｄ　Ｔｕｍｏｒ　Ｂｅａｒｉｎｇ
　　Ｂａ１ｂ／ｃＭｏｕｓｅ”、　Ｊ、Ｎｕｃｌｅａｒ
　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２１　　：　　５７０　５７２（
１９８０）　；　Ｆａｒｒａｎｄｓ等、“Ｒａｄｉｏｉ
ｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＨｕｍａｎ　　Ｃ
ｏ１ｏｒｅｃｔａｌ　　Ｃａｎｃｅｒｓ　　ｂｙ　　ａ
ｎ　　Ａｎｔｉ−ＴｕｍａｒＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａ
ｎｔｔｂｏｂｙ”、　Ｌａｎｃｅｔ’３９７−３９９（
１９８２）；Ｚｉｍｍｅｒ等、”Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎ
ｏｉｍａＨｉｎｇ　ｏｆ　ｌｌｕｍａｎ　ＳｍａｌｌＣ
ｅｌｌ　Ｌｕｎｇ　Ｃａｒｏｉｎｏｍａ　ｗｉｔｈ　Ｔ
−１３１Ｔｕｍｏｒ　ＳｐｅｃｉｆｉｃＭｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ”＋　敗屁ｕ卵ｈ４（１）　
　１．−１１（１９８５）。ヨウ素の放射性同位元素に
よるモノクロ−ナル抗体の直接ラヘル化は、Ｃｏｎｔｒ
ｅｒａｓ等、Ｍｅｔヤ坦」ｎ、　ｊＥｎ、７７ｍｏｊｇ
ｙ　（１９７３）９７　：　２７７に記載されている方
法に従って行うことができる。テクネチウム−９９をイ
メージング成分として使用すること力（できる。Ｋｈａ
ｕ等、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ八ｎｔｉｂｏｄｙＬへ　
Ｃａｒｄｉａｃ　Ｍｙｏｓｉｎ　　：　Ｉｍｏｇｉｎｇ
ｏｆ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｙｏｃａｒｄｉａｌ
　Ｉｎｆｃｃｔｉｏｎ”、　ｌｌｙｂｒｉｄｏｍａ　３
　：　１１　２３（１９８４）。１１１−Ｉｎが抗体の
ラベルとして適用されている。Ｋｒｅｊａｃｋ等、”Ｃ
ｏｖａｌｅｎｔ　Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｏｆＣｈｅｌ
ａｔｉｒ＋Ｂ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｔｏ　Ｍａｃｒｏｍｏｌ
ｅｃｕｌｅｓ”、Ｒｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉ」坤ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、、７７　：　　５
８１−５８５　（１９７７）　；１１ｎａｔｏｗｉｃｈ
等、ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅＬａｂｅｌｉｎｇ　ｏｆ八
へｔｉｂｏｄｙ　　Ａ　　Ｓｉｍｐｌｅ　　ａｎｄ　　
Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　　Ｍｅｔｈｏｄ”　　。

と−ゆ−μｅ、、、　２２０　：　　６１３−６１５（
１９８３）　　；及びＳｃｈｉｅｎｂｃｒｇ＋　Ｄ、Ａ
、等、”Ｔｕｍｏｒ　Ｉｍａｇｉｎｇ　ｗｉｔｈＲａｄ
ｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｍｅｔａｌ　Ｃｈｅｌａｔｅｓ　Ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｔ。

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ″、　５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　２１５　：　１５１１−１５］３　（＋
９８２）。

イメージングのために適切な抗体に最初に接近するため
に、抗体を、蛍光色素のごとき直接検出可能な成分によ
り、及び検出されるために反応し又は誘導体化されなけ
ればならない酵素のごとき成分によりラベルすることが
できる。このようなラベルの例はフルオレッセイン及び
その誘２Ｎ＝体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル
（ｄａｎｇｙｌ）群、ウムベリフェロン、ルシュフエリ
ン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ホースラディ
ツシュ・パーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ
、リゾチーム、及びグルコース−６−ホスフニートテヒ
ドロケ゛ナーゼである。抗体をこのようなラベルにより
既知の方法により標識することができる。例えば、カッ
プリング剤、例えばアルデヒド、カルボジイミド、シマ
レイミド、イミデート、サクシンイミド、ビス−ジアゾ
化ベンジジン等を用いて、上記の蛍光ラベル、化学発光
ラベル、及び酵素ラベルにより抗体を標識することがで
きる。

抗体及びラベルされた抗体を種々のイムノイメージング
又はイムノアッセイ法において用いて、患者における乳
癌の存在を検出することができ、又はそれを有すること
がすでに診断されている患者においてその癌の状態をモ
ニターすることができる。患者の体内での腫瘍の存在、
その位置及び拡散並びに腫瘍負荷の改善のための治療の
進展を検査するためにインビボ・イムノイメージングで
使用される場合、イメージング成分によりラベルされた
モノクローナル抗体は非経口的に、好ましくは静脈内に
又は皮下に、腫瘍部位に蓄積しそして選択された検出手
段によって検出されるのに十分な量で投与されるであろ
う。典型的には、イメージング成分でラベルされたモノ
クローナル抗体は、当業者によりよく知られているタイ
プの適当な医薬として許容されるキャリヤーと共に投与
されるであろう。このようなキャリヤーは患者に影響を
与えないものである。投与されるべきモノクローナル抗
体の量は、モノクローナル抗体に付加された検出可能な
イメージング成分の量、イメージング剤によりラベルし
た後のモノクローナル抗体の残留結合効率に依存するで
あろう。

イメージング成分によりラベルされたモノクローナル抗
体の残留結合効率は腫瘍細胞結合アソセを用いてインビ
トロで決定される。一般に、放射性同位元素でラベルさ
れたモノクローナル抗体の残留結合効率を測定する放射
免疫反応性は、既知の免疫反応性腫瘍セルライン、例え
ば５ＫＢＲ−３、ＭＣＦ−７、及びＭＸ−１の固定され
た組織培養物への放射性同位元素でラベルされたモノク
ローナ、ル抗体の特異的結合を、モノクローナル抗体を
特異的に結合しない固定されたセルラインへの非特異的
結合と比較することにより決定される。

ラベルされたモノクローナル抗体の最適放射免疫反応性
は、この系において、モノクローナル抗体の濃度を一定
に維持しながら、モノクローナル抗体に結合するために
利用可能なイメージング剤の濃度を変えることによって
決定される。次に、ラベルされたモノクローナル抗体は
、上記の固定細胞イムノアッセイにおいて、抗原過剰の
条件において固定された細胞にラベルされたモノクロー
ナル抗体を添加することにより試験される。最高の検出
可能な結合を与えるラベルされたモノクローナル抗体が
決定され、そしてまずインビボでのラジオイムノイメー
ジングのために使用され得る。

インビトロでのイムノアッセイを使用して癌患者の状態
をモニターする場合、定量的イムノアッセイ法を使用し
なければならない。このようなモニターにおいては、定
期的にモニターを行い、そして結果を比較して患者の腫
瘍負荷が増加しているか又は減少しているかを決定する
。使用することができる一般的アソセイ法には直接アッ
セイ及び間接アッセイが含まれる。直接アッセイは、患
者からの組織サンプル又は細胞をラベルされた抗体と共
にインキュベートすることを含む。サンプルが乳癌細胞
を含有すれば、ラベルされた抗体がそれらの細胞に結合
するであろう。組織又は細胞を洗浄して未結合のラベル
化抗体を除去した後、組織サンプルをラベルされた免疫
複合体の存在について読み取る。間接アッセイにおいて
は、組織又は細胞サンプルを未うベルのモノクローナル
抗体と共にインキュベートする。次に、サンプルを、モ
ノクローナル抗体に対するラベルされた抗体（例えばラ
ベルされた抗ネズミ抗体）で処理し、洗浄し、そしてラ
ベルされた３成分複合体の存在について読み取る。

インビトロでの診断的使用のため、抗体は典型的にはキ
ットとして分配されるであろう。これらのキットは典型
的には、適当な容器中ラベルされた形又はラベルされて
いない形の抗体、インキュベーション及び洗浄のための
試薬類、キットが間接アッセイのためのものであればラ
ベルされた抗ネズミ抗体、並びにラベルの種類に依存し
て基質又は誘導体化剤を含んで成るであ７）う。インビ
ボ・イメージング用のため、抗体はやはりキットの形で
分配され、そして典型的には」二記と同じタイプの構成
要素を包含するであろう。抗体は、使用されるべき放射
性同位元素にすでに結合しているか又はそれとキレ−１
・化している薬剤により誘導体化されて供給され、ある
いはモノクローナル抗体は結合剤又はキレート剤のみに
より誘導体化されて供給され、そして使用されるべき放
射性同位元素は別々に供給され得る。使用されるべき放
射性同位元素は使用直前に加えて、患者にラジオイムノ
イメージング剤を投与する時点においてイメージングの
ための最適放射能ラベルが達成され得るようにすること
ができる。試験のために適当であれば、ヒト乳癌抗原対
照及び指示書もまた包めることができる。

次の例は、この発明の代表的なモノクローナル抗体の調
製、特徴付は及び使用についての詳細な記載を提供する
。これらの例は、この発明の範囲をなんら限定するもの
ではない。

免韮濯りＹ ヒトの手術後の新鮮な乳癌組織及び種々の正常組織を用
いて、ホモシネ−ジョン及び非連続シュークロースグラ
ジェント遠心により、膜抽出物を調製した。ヒト乳癌セ
ルラインは、プレスト・キャンサー・タスク・フォース
（Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔａ５ｋＦ　ｏ　ｒ　
ｃ、ｅ　）、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレク
ション（ＡＴＣＣ）　、及びメモリアル・スローン・ケ
ソタリング（Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｓ］ｏａｎ　Ｋｅｔｔ
ｅｒｉｎｇ）のＪｏｒｇｅｎＰｏｇｈ博士から人手した
。プレスト・キャンサー・タスク・フォース、ＡＴＣＣ
，及びＦｏｇｈ博士により推奨されるようにして細胞を
維持し、そして継代した。免疫感作のため、１００μｇ
の蛋白質（Ｌｏｗｒｙアッセイ）を含有する膜抽出物又
は１子方個の生乳癌細胞を、５週令のＢａ１ｂ／ｃマウ
スに腹腔的接種した。最終追加免疫の３日後、細胞融合
のために肺臓を摘出した。

バイブ１　ドーマ法 体細胞バイブリドを、ネズミ骨髄腫セルラインＳｐ　−
２１０／Ａｇ　１４を用いてＢｕｃｋ、　Ｄ、Ｗ、等、
前掲の方法により調製した。すべてのハイブリドーマセ
ルラインは限界稀釈法によりクローン化した。

融合の半分は乳癌膜抽出物により免疫感作されたマウス
からの肺細胞を用い、半分は生乳癌セルラインにより免
疫感作されたマウスからの肺細胞を用いた。これらの融
合から、８３４２４ウエルが得られ、その内２２　、４
５９がハイブリドーマの増殖を示した。

スフ」：ゴー乙外汰 ハイブリドーマ上清を、免疫用乳癌膜抽出物を用いる固
相エンザイムーリンクドイムノソルベンｌ・アッセイ（
Ｅｌ、ｌ５Ａ）により、又は免疫用乳癌セルラインを用
いる間接イｌ、ノフルオレソセンスアソセイによりアッ
セイした。固相膜Ｅ１．ＴｓＡのため、４　Ｑ　ｐ　１
の０．１　ｍＦ、、／　ｍρ乳癌膜蛋白質をポリ塩化ビ
ニル（ＰＶＣ）　　ミクロタイターウェル中に４℃にて
１２時間装いた。抽出物を吸引除去し、そしてウェルを
１％ウシ血゛ン青アルフ′ミン（ＢＳΔ）を含有するリ
ン酸緩衝化塩溶液（Ｐｒ３Ｓ）で洗浄した。次に、ウェ
ルをハイブリドーマ」上清の１：１０梼釈物４５μａと
共Ｇこインキュベートした。稀釈剤は、２０ｍＭの緩衝
剤、１０％ウシ血清、及び０、１％ナトリウムアジドを
含有する媒体であった。

室温にて３０分間の後、ウェルを再度洗浄し、そして３
７°Ｃにて、４５分間、バーオギシダーゼ接合ヤギ抗−
マウスＩｇＧのｌ　：　２００４０釈物で洗浄した。

稀釈剤はＰ　Ｂ　Ｓであった。次にウェルをＰＢＳで洗
浄し、そして０．１Ｍクエン酸す１−リウム緩衝液（ｐ
ｌ＋　４．２　）中２００μｌの１．２−アジノージ（
３−エチル−、ンズチアヅリンスルホン酸）と室温にて
３０分間反応せしめた。光学流度を４０５ｎｍにてミク
ロエリサ・リーダー（Ｍｉｃｒｏ旧ｉｓａ　Ｒｅａｄｅ
ｒ）１で測定した。各実験のため、陽性対照としての５
μｇ／ｍｌの抗−β２ミクログロブリンを正常なヒト腎
膜と反応せしめた。これば、０．１±０．１（標準偏差
）の光学濃度を与えた。バンクグラウンドは、マウスモ
ノクローナル抗体を含まない媒体を用いて０±０．１光
学濃度（０，Ｄ、）であった。乳癌膜抽出物に対して０
．７０．０．より大きな反応をもたらすウェルを貯蔵し
た。

間接イムノフルオレッセンス・セルライン・アッセイの
ため、免疫用セルラインの１００，０００個の乳癌細胞
を一夜、適当な媒体と共に、８個のチャンバーを有する
１セソＩ〜のスライドの各チャンバー中に置いた。同様
に、セルラインＣＣ９５からの１００．０００個の線維
芽細胞をチャンバーを有するスライドウェル中で一夜イ
ンキュへ一トシた。細胞を１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ
により洗浄した。

乳癌及び線維芽細胞の両者のウェルを、４℃にて３０分
間、ハイブリドーマ上清のｌ　：　１．０＋０釈物と共
にインキュベートした。細胞を再び洗浄し、そして４℃
にて３０分間、フルオレッセイン・イソチオシアネート
（ＦｒＴＣ）−接合ヤギＦ　（ａｂ’）ｚ抗−マウスＴ
ｇの１：５０稀釈物と共にインキュベートシた。細胞を
３回洗浄し、ＰＢＳ中１゜５％ホルムア：　　　　　　
　　　ルデヒドの中で５分間固定し、チャンバーを取り
１　　　　　　　　　出し、そしてＰＢＳ中ですすいた
。次に、スライ：　　　　　　　　　ドを、ポリビニル
アルコール、グリセリン、緩衝□ 剤及び防腐剤を含有する組成物中に配置し、そして蛍光
顕微鏡で試験した。乳癌細胞に対して強い蛍光結合を示
すが線維芽細胞に対して蛍光結合を示さないハイブリド
ーマウェルを貯蔵した。５１５Ｇ個のバイブリドウェル
が、最初のスクリーニングにおいて乳癌反応性を示した
。

次に、５１５６個の陽性ウェルからの上清を、７種類の
正常組織膜抽出物（肝臓、肺、結腸、胃、腎、扁ｅｌｋ
腺及び肺臓）を用いる固相ＦＬＩＳＡにおいて試験した
６０．３より大きいＥＬＩＳＡ　０．０を与えるすべて
のウェル上清を廃棄した。１１１０１個の」上清が正常
組織抽出物と反応しないことが見出された。

１１０１のハイブリドーマ上清をヒト乳癌組織の凍結切
片上で試験した。６ミク１コンの切片をスライドに付着
せしめ、アセトン中で４℃にて１０分間固定し、室温に
て１０分間乾燥し、ＰＢｓで洗浄し、ウマ血清によりブ
ロックし、そして室温にて２０分間１００μβのそのま
まのハイブリドーマ上清と共にインキュベートした。ス
ライドをＰＢＳで洗浄し、そして最後に３７℃にて２０
分間、パーオキシダーゼ接合ラビット抗−マウスＴ［の
１：５０稀釈物と共にインキュベートシ、Ｐ　Ｂ　Ｓで
再度洗浄し、そして最後に３７℃にて７、５分間、０．
０１％過酸化水素を含有する０、０５Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝
液（１１１７、２）　中０．５ｍｇ／ｍｆｆジ了ミノヘ
ンジジンと共にインキュベートした。スライドをヘマト
キシリンで染色し、脱水し、そして３５．９％メチル／
ｎ−ブチルメタクリレートコポリマー、７．１％ブチル
ベンジルフタレート及び０．３％２．６−ジＬｅｒ　Ｌ
ブチル−ｐ−クレゾールを含有する媒体中に置いた。

１２４個のウェルが乳癌選択的結合をもたらし、そして
、これらをクローン化した。

以下余白 精製、及−αノーラノ痕生決一定 モツク１コーナル乳癌選択的抗体の免疫グロブリンクラ
ス及びサブクラスを、ＭｃＤｏｕｇａ　１等１、（−■
−１隻！！Ｑｌ、助−肋１部：　　２８１−２９０（＋
９８３）に記載されているのと実質的に同しイムノトソ
トアソセイにより決定した。抗体はまた、２〜３Ｘ１０
’個のハイブリド−マ細胞をメチオニン不含有培地に０
．２１ＪＣｉの３５３メチオニンを加えた培地中で増殖
せしめることにより内的にラベルされた。３５Ｓ−ラベ
ル化抗体を固定されたスタフィロコッカス（ｓ　ｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）　Ａ細胞と井に、又はラビット
抗−マウス免疫グロブリンによりプレコートされた固定
されたスタフィロコッカスＡ細胞と共に、免疫沈澱せし
め、そして免疫沈澱物をＳＤＳ　−ＰＡＧＥにより分析
して抗体ライト鎖及びヘビー鎖移動度、余分の鎖の欠落
、及びスタフィロコッカス・プロティンＡに結合する各
抗体の能力を決定した。

抗体をインビボで拡張した。Ｂａ１ｂ／ｃ又はＦｌ（Ｃ
５７Ｂ　／　６　ＸＢａ１ｂ／　ｃ　）マウスをＱ、５
ｍｊ＋のプリスタンにより腹腔内（ｉ　ｐ）プライムし
、そしく３５） て１０−１４日後にＰＢＳ中１００万個の対数期のバイ
ブリド−細胞を接種した。、腹水を−１（Ｐｃにて貯蔵
し、解凍し、そして０．８ミクロンのフィルターユニッ
トを通して濾過した後、さらに精製した。

スタフィロコッカス・プロティンＡに結合する幾つかの
ＴｇＧ抗体を、アガロース、デキストラン及び／又はア
クリルアミドのいずれかを含有するプロティンＡ−クロ
マトグラフ樹脂上でのｐＨ段階グラジェント溶出を用い
るアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。

プロティンＡに結合しなかったＩｇＧ抗体は０℃にて４
０％飽和への硫酸アンモニウムの添加により、又はＤＥ
ＡＥもしくはアフィゲル（ＡｆｆｉｇｅＪ）　（ビオラ
ド、リソチモンド、カリホルニア）への結合により沈澱
せしめた。別の方法として、ＴｇＧ抗体を記載されてい
るようにして、セファクリルＳ−２００カラム及びこれ
に続＜　ＤＥＡＥセルロースを用いるクロマトグラフィ
ーにより精製する。沈澱物をＰＢＳに再溶解し、２０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７、２）に透析し、そしてジエチル
アミノエチルセルセルロース カラム上で、４℃、１ｍ１／分の流速で１，５Ｉの０〜
６００　ｍ　Ｍ　ＮａＣ　１グラジエントを用いて溶出
することによりクロマトグラフ処理した。各場合におい
て、カラム画分をＳＯＳ　−　ＰＡＧＥによりモニター
し、そして最も純粋な抗体画分をプールし、１〜２ｍｇ
／ｍ７＋に部槽し、Ｐ　Ｂ　Ｓ　１０．０２％ＮａＮ３
に透析し、そして４℃にて貯蔵した。

ＴｇＭ抗体は、七フアクリルＳ−３００の２．６×４０
ｃｍカラム上でのゲル濾過又は他のゲル濾過により、あ
るいはアガロース、テキストリン及び／又はアクリルア
ミドを含有する樹脂により、室温、１ｍ７！／分の流速
にてＰ　Ｂ　Ｓ　１０．０１％ナトリウムアジドで溶出
しながら精製した。

這仮咀■夾定 乳癌に対するそれらの選択性を評価するため、精製され
た抗体を１６種類の正常組織の切片上でのイムノパーオ
キシダーゼ切片染色により、及び４種類の血液細胞タイ
プ上での免疫蛍光セル−ソーティングにより試験した。

イムノパーオキシダーゼ染色は」上記のようにして行っ
たが、但しハイブリドーマ上清ではなく　ＰＢＳ中精中
杭製抗体知の稀釈物を１〜４０μｇ　／　ｍ　ＩＩの範
囲で使用した。

まず、純粋な抗体をタイトレージョンして乳癌切片上で
強いイムノパーオキシダーゼ染色を与える最小濃度を見
出し、そして正常組織試験のためにその濃度で使用した
。末梢血細胞（血小板、リンパ球、赤血球、顆粒球、及
び単球）を、多形核白血球から単球を分離する媒体を用
いて遠心分離により調製した。細胞を上に決定した最適
濃度において４℃にて３０分間抗体と反応せしめ、洗浄
し、フルオレソセイン・イソチオシアネート−接合ヤギ
抗ーマウスＩｇの１：５０稀釈物と４℃にて３０分間反
応せしめ、再度洗浄し、そしてセルソーター中で試験し
た。洗浄緩衝液及び稀釈剤は１％ゼラチン及び０．０２
％ナトリウムアジドを含むＰＢＳであった。セルソータ
ーは、７６ミクロンのノズル及び４８８ｎｍの１ワット
アルゴンイオンレーザ−を装置していた。８０ｍｍの共
焦点レンズを焦点を合わせるための光学レール装置上で
使用した。使用された他のフィルターは５１５ｎｍ干渉
フィルター及び５１５ｎｍ吸収フィルター（散乱レーザ
ー光のため）及び前方角光散乱のための中性法度１．５
フィルターであった。フルオレソセイン蛍光の対数対前
方角光散乱の輪郭線プロットをサンプル分析のために用
いた。検出可能な結合を示す血液細胞タイプは存在しな
かった。

特許請求の範囲に記載した抗体の結合挙動を下記の第１
表に示す。抗体により結合される構造を示すために次の
略号を使用する。へＣ−腺房（ａｃｉｎｉ）　　；　Ｇ
　＝腺；Ｔ＝細管（むｕｂｕｌｅｓ）　　；　Ｄ−脈管
（ｄｕｃｔ）　；　Ｌ　＝管腔（ｌｕｍｅｎ）　　；　
Ｗ　＝汗腺（ｓｗｅａｔｇｌａｎｄ）　；　Ｅ−上皮（
ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）　；　Ｓ−皮脂腺（ｓｅｂａｃ
ｅｏｕｓ　Ｈｌａｎｄ）　　；　Ｇｒ　＝顆粒球（ｇｒ
ａｎｕｌｏｃｙｔｅ）　；Ｍｋ　−巨核球＜ｍｅＢａｋ
ａｒｙｏｃｙｔｅ＞　　：　Ｍ−マクｌコファージ（ｍ
ａｃｒｏｐｈａｇｅ）　；　Ｉ＋ｙ　＝リンパ球（Ｉ　
ｙｍｐｈｏｃｙ　ｔｅ）　；Ｂｌ−基底層（Ｂａｓａｌ
　１ａｙｅｒ）　　；　Ｆｅ−病巣上皮（ｆｏｃａｌ　
ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）　；　Ａ−肺胞内膜細胞（ａｌ
ｖｅｏｌａｒｌｉｎｉｎｇ　ｃｅｌｌ）　；　Ｂ−ボー
マンのう　（Ｂｏｗｍａｎ’５ｃａｐｓｕｌｅ）　；　
Ｍｕ−筋（ｍｕｓｃｌｅ）　；　Ｊ−小島（ｉｓｌｅｔ
）；■（−毛のう　（ｈａｉｒ　ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ）
　　；　Ｕ−系球体（ｇｌｏｍｅｒｕｌｉ）　　；及び
Ｖ−脈管／内皮（ｖｅｓｓｅｌｓ／■」輔瀦治１朋Ｉη
九定 各抗体によっていかに広い範囲の乳癌が認識され得るか
を決定するため、乳癌選択性抗体を、２７種類の異る乳
癌腫瘍の凍結切片に対するイムノパーオキシダーゼ染色
により試験した。切片染色のために使用された乳癌はす
べて浸潤腺管内癌であり、抗体結合と乳癌の組織学的タ
イプとの相関は行われ得なかった。さらに、抗体結合と
結節状態又はエストロゲンリセプクー状態との間の相互
関係も、提供者の情報が入手可能であった１２の腫瘍に
ついて見出されなかった。抗体は転移癌及び−次乳癌と
同様に良好に反応した。特許請求の範囲に記載された抗
体についてのこれらの結果を次の第２表に記載する。

以下余白 ■」」α沿仁Ｙ桔沿Ｉ訓勿扶淀 １４種類の乳癌セルラインに対するイムノフルオレッセ
ンスアッセイにより乳癌セルライン認識の範囲について
抗体をさらに評価した。下記の第３表に、特許請求の範
囲に記載された抗体についてのこれらの結果を示す。

’ｉＦ余白 イメージングモノクロ−ル　Ｍｌユ１慕土最後に、１１
種類の非−乳癌に対するイムノパーオキシダーゼ染色に
より試験した。特許請求の範囲に記載された抗体につい
ての結果を下記の第４表に示す。

以下金白 この発明のモノクローナル抗体の乳癌腫瘍範囲、乳癌細
胞結合範囲、血液細胞結合特性及び選択性特性を第５表
に要約する。

一シ丁余白 第一」Ｌ−表 イメージングＭＡＢ候補 紐廟Ｊ旧引反グ事ｌ旧１度− 特許請求の範囲に記載された抗体の幾つかをヨード化し
、そしてＭＣＦ−７、ＣＡＭ八１へＫＢＲ３又はＺＲ７
５３０細胞への結合について試験した。抗体を、１２５
ＩによりクロラミンＴを用いて約１０μＣｉ／μｇの比
活性にラベルした。イムノラジオケミカル純度を決定す
るため、０．５ｍ７！のウシ胎児血清中１００．０００
ｃｐｍの２つのラベル化抗体を標的細胞の５つのアリコ
ート（一般にアリコート当り４．０００，０００細胞）
で順次０°Ｃにて１５分間吸収し、そして各吸収後の」
上清中の残留放射能を決定した。

会合定数の測定のため、既知濃度のラベルされたモノク
ローナル抗体及び未うベルのモノクローナル抗体をウシ
胎児血清中で標的細胞と共に水中で１５分間インキユヘ
ートした。次に、細胞／抗体混合物のアリコートをγ−
カウンター中で計数し、又はミクロフォルト（旧ｃｒｏ
ｆｏｌｄ）フィルタープレート　（Ｖ＆Ｐサイエンティ
フィック）を通して濾過し、そしてそのフィルターを計
数した。フィルター上の液体中に残留する未結合の抗体
を考慮するため、同じ濃度の抗体を含むが細胞を含まな
い対照を平行して行った。会合定数、及び標的当りの抗
原コピー数を、親和性試験結果からａ１算し、そして下
記の第６表に示す。

１奴下余白 第一」し−表 イメージングＭＡＢの親和性及び抗原コピー数ＭＡＢ　
　　　土　　　ユ　　　　ｙユ　　　　セルラインこの
発明のモノクローナル抗体により認識される抗原を同定
するため、次の方法に従って抗原の免疫沈澱を行った。

直径８關のポリスチレンボール（プレシジョン・プラス
千ツク・ボール社）を氷酢酸中１０％発煙硝酸で覆い、
そして５０℃の水浴中で３時間インキュベートした。こ
の酸処理の後、ボールを蒸留水で３回すすぎ、０．１　
Ｍ　ＮａＯＨ［１１１％のナトリウムジチオニ１−で覆
い、そして５０℃の水浴中で３時間インキュベートした
。ボールを蒸留水で再び３回洗浄し、０．１％の１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−力ルポジ
イミド（ＥＤＡＣ）　、０．２％ススへン酸（ジメチル
ボルムアミドに熔解したスヘリン酸）で覆い、そして室
温にて一夜インキユベートした。ボールを３回蒸留水で
すすぎ、そして同定のために標識を付した。

精製されたモノクローナル抗体を２−（Ｎ−干ルボリノ
）エタンスルホン酸緩衝液中０．２　ｍ　ｇ　／ｍ１．
に稀釈し、そしてあらかじめ処理されそして標識を付さ
れたボールを個々のチューブに入れ、そして４５０μｌ
の稀釈された抗体及び５０μｌの新鮮な１％ＩＥＤＡＣ
で覆った。デユープにキャップを付し、そして２５°Ｃ
にて２４時間イン＝ｌｔユベートした。このインキュベ
ーションの後、ボールをＰＢＳで２回すすぎ、そして新
鮮なままで使用し、又は４℃にて数日間貯蔵した後に使
用した。

新しくラベルされた標的細胞抽出物を、Ｍａｒｃｈａ−
１ｏｎｉｓ、　　Ｊ、　　　”　八ｎ　　Ｅｎｚｙｍｉ
ｃ　　Ｍｅｔｈｏｄ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　Ｔｒａｃ
ｅｌｏｄｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｍｍｕｎｏｇｌｏｂ
ｕｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　Ｐｒｏ−ｔｅｉｎ
ｓ　”　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１１３：２９９
−３０５（１９６９）のラクトパーオキシダーゼ法によ
り１２５１で、又は３５−Ｓメチオニン中での増殖によ
り３５−３でラベルされたヒト乳癌セルラインから調製
した。

ラベルされた細胞を可溶化緩衝液−Ｖ／Ｖ％トリ　ト　
ンＸ　　−１００、１５０ｍＭ　　Ｎａｃ７！　、　　
５　　ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　。

２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃｊ！　、　ｐＨ７、５）
中に溶解した。ラヘル化抽出物４部を容器中で、５３ｍ
ｇ／ｍｆｆのウシ血清アルブミンを含有する可溶化緩衝
液１部と混合し、ｌ０ｍｇ／ｒｒｌＢｓＡの最終濃度を
与えた。モノクローナル抗体でコートされたボールを容
器に加え、そして振とうしながら氷上で４時間インキュ
ベーションた。ラベルされた抗原を容器がらピペットで
除去し、そしてボールを可溶化緩衝液で４回すすいだ。

次に、ボールを取り出し、１００１！のレムリ−（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ）　Ｓ　Ｄ　Ｓゲルサンプル緩衝液を含む個
々のチューブに入れ、そして沸騰水中で３分間インキユ
ヘートした。ボールを取り出し、そしてサンプルを適当
な標準と共にＳＤＳゲル上で泳動せしめた。

抗体に対する免疫沈澱試験は、これらの内５種類（ｌ１
５４ｃ１１．４５２Ｆ２　．５２０Ｃ９，７４１Ｆ８　
　、及び７５９Ｅ３）のすべてが癌性乳房組織中に見出
される約２００にダルトンの千ツマー蛋白質を結合する
ことを示した。５種類の内の２種類（５２０Ｃ９及び７
４１Ｆ８）は２００にダルトン蛋白質」二の同しエピト
ープを認識するものと信じられる。４５４Ｃ１１及び７
５９Ｅ３は同じ抗原」二の第２のエピトープを結合し、
そして４５２Ｆ２は同じ抗原上の第３のエピト−プを結
合する。抗体の内４種類（４１Ｂ４　、８７１１７　、
　４５２Ｅ１２　、４５７Ｄ７）は２３０．０００ダル
トンの細胞内抗原に結合した。７種類の抗体（２Ｇ３　
　、　２００Ｆ９　、２０３１′！２　、２４５Ｅ１　
、３６９ＦＩ０　　、　６９７Ｂ３　、　　及び７８８
Ｇ６）は高分子量（ＷＷＷ）ムチンに結合した。２種類
の抗体（５１Ｃ３及び４５４Ａ１２）は９７、０００ダ
ル１〜ン抗原の形のトランスフェリンリセプターに結合
した。４５１．Ｃ３及び４５４Ａ１２のいずれもリセプ
ターへのトランスフェリンの結合をブロックしなかった
。この発明のモノクローナル抗体の抗原結合特性を第７
表に要約する。

以下余白 第一ノし一人 （ａ）　＝　２６０Ｆ９及び２６６Ｂ２により結合され
るエピトープと異るエピトープ。

（ｂ）　−１０６Ａ１０により結合されるエピトープと
異るエピトープ；　　２６０Ｆ９及び２６６Ｂ２の両者
は同じエピトープに結合するようである。

（Ｃ）＝相互に交差ブロック。

のアイソ　イブ 抗体のアイソタイプを次のようにして決定した。

ニトロセルロースシート上に鉛筆で５Ｈ四方の格子を軽
く描き、そして１ｍｆｆの抗アイソタイプ血清（リソト
ンバイオネティクス、ケンシントン、メリーランド、マ
ウスに、λ、α、７１．ｒ２ａ。

γ２ｂ、γ３．及び７１鎖に対するラビット抗血清を、
四角形の各横列が１スポツトの各ヘビー及びライト鎖試
薬を受理するように適用する。シートを温室中室温にて
１時間インキユヘートし、ＩＷ／■％を含有するＰＢＳ
　−ＢＳｒｌ中で迅速にずずぎ、そしてＰＢＳ　−ＢＳ
Ａ中で４℃にて一装置いた。ストリップをはさみで切り
離す。これを０．０２％ナトリウムアジドを含有するＰ
ＢＳ　−ｌｌ５Ａ中で４℃にて貯蔵することができる。

他の方法として、ス１−リップを空気乾燥し、そして４
℃にて乾燥貯蔵することができる。３ｍ７！のハイブリ
ドーマ培養上清又はＰＢＳ　−ＢＳＡで稀釈された旧情
を収容する一連の小チューブを用意する。１：１０稀釈
が一般に好結果をもたらし、そして幾つかの上清は］：
２００という大幅に稀釈することができる。ニトロセル
ロースのス１−リップを各チューブ中で室温にて１時間
インキュへ−１・する。ストリップをＰＢＳ　−ＢＳＡ
中で３回すすぎ、そして稀釈されたうビット抗−マウス
ーホースラディツシュパーオキシダーゼ中で室温にて１
時間インキュヘートする。ストリップをＰＩＩＳ　−Ｂ
ＳＡ中で２回すすぎ、そしてＴｒｉｓ緩衝液中で２回す
すく。抗−アイソタイプスボソ１〜上に十分発色が行わ
れるまで（ｉＪ１常３〜４分間）、ジアミノヘンジジン
及び過酸化水素を含有するＴｒｉｓ緩衝液中に置く。抗
体のアイソタイプを第８表に示す。

以下余白 芽−」し−表 イメージングＭＡＳのアイソタイプ 特許請求の範囲に記載されたモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマのサンプルはザ・コレクション・オ
プ・インビトロ・インターナショナル（ｔｈｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎ−ａ＋）　、７８８５　　ジャクソンロー
ド、スイト４、アン・アルポール、ミシガン４８１０３
、米国に寄託されている。

炎上 この例は、この発明の抗体をヨウ素の放射性同位元素、
すなわち１２５−■又は１３１−１のいずれかで、チロ
シン残基をヨード化するための既知の方法を用いてラベ
ルするだめの１つの方法を示す。

この発明のモノクローナル抗体は次のミクロ法によりラ
ベルすることができる。０．１　ｍ　ｇの精製したモノ
クローナル抗体を１０ミリキユリー量の１２５−１によ
り次のようにしてラベルする。１インチの２１ゲージ針
を３ｍ４のバイアルのセプタムを通して部分的に挿入し
、そしてガラス綿を詰めた３、０ｍ６のディスポーサブ
ル注射器筒をその針に取り付ける。０．　ｌ　Ｎ　Ｎａ
Ｃ１１中の抗体を、好ましくは０．２　ｍ　ｌを超えな
い容量で、あらかじめ硼酸緩衝液ですすいでおいた２０
ゲージ針を装着したツヘルクリン注射器で加える。好ま
しくは０．２〜Ｑ、３ｍｊ！を超えない容量のナトリウ
ム１２５−ヨウ素溶液を、緩衝液によりあらかじめずず
がれた１８ゲージ針に取り付けられた注射器で加える。

混合物を短時間攪拌して蛋白質と１２５−ヨウ素溶液を
混合する。モル当り１０ミリキユリーの比活性を有する
約１．２５Ｘ　１０−５モル（Ｍ）の塩化１２５−ヨウ
素Ｑ、２ｍｊ！を混合することにより塩化ヨウ素（ｉｏ
ｄｉｎｅ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ）の最終稀釈を行う。約１
分間の後、ヒト血清アルブミン又は動物アルブミン、例
えばウシ血清アルブミンの６．２５％溶液の過剰量を前
記の溶液に加える。ラベルされた抗体を適当なカラムに
通して未結合の放射性ヨウ素を除去する。イオン交換樹
脂又はゲル濾過媒体、例えばセファデックスＧ−２５を
使用することができる。

セファデックスカラム精製のため、ラベルされた抗体を
約１ｍ１ｌ１分の速度で樹脂に通した後、樹脂を追加の
１〜１．５ｍｊ＋の上記のヒトアルブミン？容量でずす
ぐ。

炭久 この発明のモノクローナル抗体はまた、リンキング剤を
用いてヨード化することもできる。この例はヨード化さ
れたイミジン化剤によるモノクローナル抗体の放射性ラ
ベル化を記載する。イミドエステル、メチルバラヒドロ
キシヘンズイミデート１１ｃＮ　（ＭＰＩＩＢＴＭ）は
、Ｗｏｏｄ等、“Ｔｈｅ　Ｒａｄｉｏ　ａｃｔｉｖｅＬ
ａｂｅｌｉｎｇｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｗｉｔｈ　ａｎ
　Ｉｏｄｉｎａｔｅｄ　ｌｍ１ｄｉ−ｎａｔｉｏｎ　Ｒ
ｅａｇｅｎｔ”、　Ａｎａｌ　ｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　　６９　：３３９−３４９　（１９７５）によ
り記載されている方法に従って合成される。ＭＰＩＩＢ
ＴＭを次のようにしてヨード化する。３．７ｍｊ！のＭ
ＰＨ旧Ｎを５０ｍＭ硼酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，５
）　１　ｒｙｌに熔解して２０ｍＭＭＰＩＩＢＩＭスト
ック溶液を得る。１ｍｌの４０ｍＭナトリウムヨウ素（
ｓｏｄｉｕｍ　１ｏｄｉｎｅ）及びこれに続き約２ミリ
キュリー１モルの比活性を有するヨウ化ナトリウム（１
２５−■）溶液１０ｐ１．を１ｍｊ２の門円ＩＢＩＭス
トック溶液に添加する。１ｍβの４０ｍＭクロラミンＴ
を急速に攪拌しながら加える。

混合物を約１５分間２０〜２２℃に保持し、そして次に
０．１ｍｌの１，０μｅ−メルカプトエタノールを加え
てクロラミンＴ及び残留ヨウ素を添加する。

次に、溶液のｐｕを、２０　／Ｊ　Ｒの１．０Ｍ酢酸を
添加することにより中性まで低下せしめ、凝集した白色
沈澱を形成せしめる。未反応のＭｐＨｌ’ｌ１Ｍヨウ化
物及びクロラミンＴは溶解したまま残る。ヨード化アミ
ノエステルの沈澱を１０．００Ｏｒｐｍにて５分間の遠
心により集め、２ｍｆｆ１の５０ｍＭｇ１Ｉｌ酸ナトリ
うム緩衝液（ｐＨ８，５）に３７℃にて溶解する。抗体
のヨード化を次のようにして行う。２０ｗの精製された
抗体を１ｍｌ！の４ｍＭヨード化リンカ−１５０ｍＭ硼
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）に懸濁する。所望量
の結合を達成するのに十分な時間１　　　　　　　３７
℃にて反応を行う。これらの条件下で放射性ラベルが抗
体上に約１〜２％／時の速度で導入さ：　　　　　　　
　ゎ、１２５−１−７　＜７１／（７）約、。、。最大
導入が達成１゜ １　　　　　　　　　される。５ｍＭリン酸すトリウム
（ｐｌ＋　７．４　）を含有する０、１５Ｍ塩化ナトリ
ウムに対して透析することにより未反応リンカ−を除去
する。

’　　　　　　　　　　　　　（６５）倒↓ １１ｎａｔｏｗｉｃｈ等、５ｃｉｅｎｃｅ　　２２０　
：　６１３　６１５（１９８３）の方法（この記載を引
用によりこの明細書に組み入れる）に従ってキレート剤
ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰ＾）を用いて
１１．１−Ｉｎによりモノクローナル抗体をラベルする
ことができる。抗体１１３Ｆ１を１１　ｗ　／　ｍ　Ａ
で調製しＮａ１ｌＣＯｚ　（ｐＨ？）に透析する。１■
のＰＴＰＡ環状無水物を］０ｍ７！のＣｌＩＣＩ！３に
ン容解した。４０μｌのこの？容量を５ｍ／ガラス試験
管に入れ、そしてＮ２の流れによりＣ１（Ｃｌ、を蒸発
せしめた。１００μＰの１１３Ｆ１（蛋白質１．１μｇ
）を４μｇの無水物を含有するチューブに加え、そして
チューブを短時間渦動混合した。

１分間後、０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，８）中１
１１−Ｉｎ（約３．２８ＸＩＱ”ｃｐｍ　／ｍρの比活
性を有する）５μｅを加えた。２本のＰＤＩＯ（ファル
マシア）カラムを２０ｍ＃のリン酸緩衝化塩１％ウシ血
清アルブミン溶液を用いて用意した。サンプルを、２．
２ｍ＃のボイドボリウムを有するＰＰ１Ｏカラムに通し
た。２．２ｍｌの蛋白質ピーク及び２．５ｒｒｌの小分
子ピークがＰＢＳＩ％ＢＳＡにより溶出することが見出
された。対照は４μｐの１ｐｇ／μｊｌ！　ＤＴＰ八を
伴う１１３１’ｌのザンブル１００μｐ、及び５μｌの
１１１−　Ｉ　ｎであり無水物を伴わなかった。ＤＴＰ
Ａ無水物でラベルされた１１３Ｐ１蛋白質ピークは７５
％のカウントを含有し、そして小分子ピーク画分は約２
５％のカウントを含んでいた。対照においては、約９２
％のカウントが小分子画分に残った。

前の実験からのモノクローナル抗体１１３Ｆ１を５０　
ｍ　Ｍ　ＮａＨＣＯｚ（ｐＨ７）に、１００　、１０及
びｌｐｇ／１００μｌの濃度に稀釈した。１１３Ｆ１の
各稀釈物１００μｐを、例３におけるようにガラスチュ
ーブ中４μｇのＤＴＰＡ無水物に加えた。１１１−　Ｉ
　ｎを０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｌ＋　５．８　）に
１００マイクロキユリー／１０μｌに稀釈した。１０マ
イク１コリヅターの溶液中１００マイクロキユリーの１
１１−Ｉｎを、抗体を収容するチューブに加えた。混合
物を、例３におけるようにして処理した。７６％のカウ
ントが１７７　ｇ／　１００μｌ稀釈の蛋白質画分中に
見出され、そして８６％のカウントが１００μｇ／１０
０μｐ稀釈中に見出された。

この例は１１１−１　ｎによるこの発明の他の抗体のラ
ベル化を示す。

１、　ＤＴＰＡ環状無水物を１０ｒｒｌの乾燥ＣｌＩＣ
ｆｆ　３に溶解した。４０μｅの溶解したＤＴＰＡ無水
物を５ｒｒ＋２ガラスチユーブ中に入れ、そしてＮ２で
蒸発せしめて、チューブの内側にコートされた約４μｇ
のＤＴＰＡ環状無水物を得た。

５０　ｍ　Ｍ　Ｎａ１ＩＣＯｚ（ｐＨ７）中１５ｍｇ／
ｍ７！の濃度の抗体２４５Ｅ７を１００μｆｆ　ＤＴＰ
＾環状無水物に加えた。

チューブを短時間渦動し、そして約１分間放置してＤＴ
ＰＡ　−２４５Ｆ７複合体を形成せしめた。

５個の試験サンプルを次のように調製した。

（１）９０μｊ！のＮａ１ｌＣＯ３中１０ｐ（ｌのＤＴ
ＰＡ　−２４５Ｆ７複合体 （２）９０μｊ！のＮａ１ｌＣＯ＊中１０ｔｔｌのＩ）
ＴＰＡ−２４５Ｆ４７複合体 （３）９０．ｃ＋ＡのＮａＨＣ（１＋中１０ｐ’ｌの２
４５［！７（４）９０．ｃ＋ＡのＮａ１ｌＣＯｚ’ｌＪ
１０　／”の２４５Ｆ、７（５）９０μ＃のＮａ１ｌＣ
Ｏ３及び０．４　ｐ　ｇＤＴＰ＾（無水物形でない）中
１０μｌの２．１５８７゜１１１−Ｉｎを０．５Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５，８）中１１００ｃｐ／　ｐ　１２
の比活性に稀釈した。ｌＱｍＪのこの１１１−　Ｉ　ｎ
溶液を各チューブに加えた。非無水物形のＤＴＰＡを１
０μｇチューブ２及び４に加えた。各チューブの内容物
を、例３の場合のように、Ｎａ１（Ｃ（Ｌ＋で平衡化さ
れたＰＤＩＯカラムに通した。サンプルを集め、そして
蛋白質ピーク及び小分子ピークを常法による液体シンチ
レーションカウンター中でカウントした。結果を第９表
に示す。

以下弦白 邦□」し□衷 Ｐ　　　　　　　　２６７　　　　　　　４２５Ｍ　　
　　　　　　３６４　　　　　　　５８Ｐ　　　　　　
　　３９１　　　　　　　２４５Ｍ　　　　　　　２８
９７　　　　　　　７６Ｐ　　　　　　　　７７８　　
　　　　　１９５Ｍ　　　　　　　３２９５　　　　　
　　８１＊蛋白質　　＋小分子 結果は、７７％の１１１−Ｉ　ｎがＤＴＰＡでラベフレ
された２４５Ｅ７に結合したことを示した。これに続く
過剰の遊離ＤＴＰＡの付加はＤＴＰＡ’　−２４５Ｆ７
抗体複合体からインジウムを除去しない。サンプル３は
、インジウムが感知できる量において非特異的に抗体に
結合しないことを示す。しかしながら、インジウムは小
分子画分と共に溶出するのではなくカラムに保持される
ようである。インジウムの前又は後に加えられたＤＴＰ
Ａは、インジウムを小分子ピーり中に溶出せしめる。

この例は、ｌ１ｌｌｎでラベルされたモノクローナル抗
体がヒト乳癌組織により効果的に結合されることを示す
。

６種類の抗−乳癌腫瘍モノクローナル抗体１１３Ｆ１　
。

２４５Ｂ７　　、　２６０Ｆ９．　２８００１１　　、
　２Ｇ３　、２６６Ｒ２，及び陰性対照ＭＯＰＣ２１を
、例３において前記した方法により無水ＤＴＰＡに共有
結合せしめた。抗体−１１Ｔｒ’ｌｌ複合体を１１１−
１　ｎとのキレート化により約１μＣｉ／μｇの比活性
で放射性ラベルした。必要により、１１１−１　ｎでラ
ベルされた抗体をセファデックスＧ５０の０．４Ｘ１７
ｃｍカラムー１−で約９０％のラジオケミカル純度に精
製した。２種類の非−乳房特異的抗体、すなわちメジ−
フィジックス（Ｍｅｄｉ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）、エメリー
ビル、カリホルニアから得られる抗−癌胎児性（ｃａｒ
ｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｒ、）抗原モノクローナル抗
体、及びニューイングランドニュクレアコーポレーショ
ン、ボストン、マサツーセソッから得られる抗−前立腺
酸性ホスファターゼ抗体（抗−ＰＡＰ）を抗−乳癌腫瘍
抗体と同様にしてラベルし、そして陽性結合対照として
役立てた。

ヒト乳癌組織及び直腸結腸癌組織を手術の直後に得、そ
して１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、グルタミン
、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充された新鮮
なイーグル最少必須培地（ＭＥＭ）中に入れて輸送した
。新鮮な組織は受領後３時間以内に使用し、他方深冷貯
蔵された組織は一７０℃にてＭＥＭ中に保持した。ＭＬ
織を手術用メスで１．０±０．２１１ｍの立方体に切断
し、そして視覚マイクロメーターを用いてサイズの正確
さについてチェックした。無菌技法を用いて組織立方体
を、２００μｌのＭＥＭ、及び１．０μｇ又は１０μｇ
のいずれかの１１１１ｎラベル化抗体を収容する９６−
ウェルミクロタイタープレートに移した。組織を１〜２
４時間３７℃にて、５％ＣＯ□−水ジャケソト付インキ
ュベーター中でインキユベートシた。インキュベーショ
ンの後、組織の分散を最少にしながら、自動ピペッタ−
により培地を注意深く除去し、そして新鮮な培地を加え
た。さらに２０分間インキュベートした後、培地を再び
除去し、そして組織をさらに２０分間インキュベートし
た。この最後の洗浄の後、培地を除去し、そして組織を
乾燥した風袋を秤った秤量用紙に移した。組織を７０℃
にて２０分間乾燥し、そして次に秤量し、そして試験管
に入れ、Ｎａｌウェルカウンター中でカウントした。結
果を、乾燥した組織の単位重量当り、組織中の適用され
た放射能に対する％として示す。各組織立方体のサイズ
の小さな相違は補正した。

精立夏片異性 腫瘍組織中での放射性ラベルされた抗体の蓄積が非特異
的吸着によるのではなく特異的結合によることを確立す
るため、対照として放射性ラベル化抗−ＣＥＡ抗体及び
抗−ＰＡＰ抗体を、ＣＥＡを発現する新鮮な及び深冷貯
蔵されたヒト直腸結腸腫瘍組織と共にインキュベートし
た。第１図は放射能の取り込み（％）対インキュベーシ
ョン時間を、両抗体について３７℃にて、それぞれ１μ
ｇ及び１０μｇ／ウェルにて、１つの腫瘍組織について
示す。

１μｇ／ウェルの濃度において、抗−ＰＡＰ抗体はいず
れの時間においてもほとんど取り込みを示さない。これ
に対して抗−ＣＥＡ抗体は約２０倍の増加した蓄積を示
す。１０μｇ／ウェルにおいて、特異抗体及び非特異抗
体についての放射能の蓄積の相異は非常に少なく、抗原
部位の飽和が示された。

抗−ＣＥＡ対照抗体の特異的結合を競争的結合研究によ
りさらに証明した。腫瘍組織を飽和レベル（２５μｇ）
の非うベル抗−ＣＥＡ抗体と共に１７時間ブレインキュ
ベートした後に１μｇのラベル化抗−ＣＥＡ抗体を用い
る通常のアッセイを行った。対照ウェルには非ラベル化
抗体を入れなかった。第１０表に示すように、非特異抗
体の場合、ブレインキュベーションによる放射能の組織
蓄積の変化は実質的に存在せず、他方、特異抗体の場合
、非うベル化抗−ＣＥＡ抗体と共にプレインキュベ−１
・された組織において蓄積の大きな滅少が生じた。

第一１１−鷹− 非ラベル化抗−ＣＥＡ抗体と共にブレインキュベーショ
ンされた又はされなかった直腸結腸腫瘍組織への放射性
ラベルされた抗−ＣＥＡ及び抗−ＰＡＰの結合 （＊）平均値（ｎ　＝　３）。

猪企■逍択件 ラベル化抗−ＣＥＡ及び抗−ＰＡＰ並びに６種類の抗−
乳癌腫瘍モノクローナル抗体から成るパネルを２種類の
ヒト腫瘍組織を用いて試験した。

同じサンプルにおける同じ抗体の結合の反復測定はわず
かな相違のみを示し、他方異る組織における同じ抗体又
は同じ組織における異る抗体の結合の相違は、第１図に
示すごとく非常に大きかった。

抗体１１３Ｆ１は腫瘍Ｍｌ織の１つにおいて中程度の結
合を示したが、他方において最大の結合を示した。予想
通り、抗−ＣＥＡ抗体は乳癌腫瘍Ｍｉ織の１つにおいて
抗−ＰＡＰ抗体と同じ程度の結合を示したが、試験した
他方の腫瘍組織において、前者は後者に比べて増加した
結合を示した。

さらに、第１図（左パネル）中には、最初に分析された
（直線の棒）及び３１」後に分析された（斜線を有する
棒）同し抗体及び同じ組織の反復測定の結果が示されて
いる。個々の抗体の取り込みのラベルにわずかな相違が
存在するが、抗体の蓄積に従ってランクされる順序は変
化しない。

例１ １９匹の８週令の雌性ヌードマウスにＭＸ−１腫瘍を右
背脇に皮下移植した。マウスには餌及び水を自由に摂ら
せた。移植から１４日後、皮下腫瘍は約０．５　ｃａに
達した時、水を０．１％に１を含有する水で置き換えた
。

モノクローナル抗体２６０Ｆ９を１２５−１１．３゜４
．６−チトラクロロー３α、６α−ジフェニルグリコウ
リル（ヨードゲン）により、次のようにしてラベルした
。１０μｌのヨードゲンを無菌ガラス試験管に入れ、そ
して約１７Ｃｉ／ｍｇ比活性を有するＮａｌ塩としての
ＩＵＣｉの１２５−１にューイングランドニュークレア
）をヨードゲンに加えた。アジドを含まないリン酸緩衝
化塩溶液中のモノクローナル抗体２６０Ｆ９をヨードゲ
ン１２５１に加えて抗体を５μＣｉ／μｇ抗体の比活性
でラベルした。

モノクローナル抗体ＭＯＰＣ２１を同様にしてラベルし
て対照として使用した。約１０μＣ１ｒ−１２５を含有
する約２μｇのラベル化抗体を各マウスに投与した。ラ
ベル化抗体は１％ＢＳＡを含有する約０．１ｍｌ１のＰ
ＢＳの容量で、マウスの尾静脈を介して投与した。ラベ
ル化抗体を投与して４日後、眼穿刺により瀉血した。血
液をヘパリン処理し、遠心し、そして血漿を保持した。

組織を摘出し、約１鶴３の片に切断し、そして塩水で洗
浄して過剰のカウントを除去した。切断された組織を秤
量し、そしてＬＫＢ−ｒ−カウンター中で放射能を測定
した。

ヨード化ＭＯＰＣ２１で処理された６匹のマウスの組織
を対照として使用した。ｌ−１２５ラベル化２６０Ｆ９
で処理された１３匹のマウスの組織を試験組織として使
用した。カウント７分／　ｇ　（ｃｐｍ／　ｇ　）組織
又は腫瘍を決定し、そして取り込みの指標をｃｐｍ／ｇ
Ｈ瘍とｃｐｍ／　ｇ器官との比率（Ｔ１０比率）により
決定した。

第１１表は、試験された各動物における、ＭＸ−１腫瘍
についての１０μＣ１ｌ−１２５の２６０Ｆ９のＴ１０
比率を示す。第１２表は、試験された各動物における。

ＭＸ−１腫瘍についての１０μＣ１１−１２５のＭＯＰ
Ｃ２１のＴ１０比率を示す。第１３表試験されたすべて
の動物についての平均及び標準第−１２−表 ＭＸ−１腫瘍を有するマウスにおける１０μＣｉラベル
化ＭＯＰｃ２１についてのＴ１０比率＃２７０　　＃３
１２　　＃３９４　　＃３７５　　＃３７６　　並娃ト
血漿　　　、３６　　．３０　　．１７　　．１４　　
．１５　　．２６肋骨　　４．８５　　５．７２　　１
．８６　　２．２０　　２．００　　２．８９肺　　　
　２．７０　　３．３７　　２．９０　　１．７０　　
１．００　　１．１８肝臓　　３．７１　　２．７５　
　１．８８　　１．５０　　１．４０　　１．８６牌臓
　　５．４６　　７．６６　　２．４３　　１．７０　
　２．００　　２．８９腎臓　　３．９６　　２．３０
　　２．１６　　２．００　　１．２０　　１．８６心
！　　　３．１５　　２．４２　　１．３０　　１．８
０　　１．００　　２．００Ｇｌ　　　１３．２５　　
８．９９　　３．７０　　３．９０　　４．７０　　８
．６７第一１３−表 Ｔ１０比率の要約 ２６０Ｆ９　　　　　　　　　ＭＯＰＣ２１平均　　標
準偏差　　　平均　　標準偏差血漿　２．７０　　　１
．８９　　　　．２３　　　．０９肋骨　２Ｂ、９２　
　１４．２９　　　　３．２５　　　１．６４肺１０．
１８　５．６０　　２．１４　．９８肝臓　１２．２２
　　１０．１５　　　　２．１８　　　．８９牌臓　８
．７９　　　３．６０　　　　３．６９　　　２．３６
腎臓　１３．４７　　　９．．３９　　　　２゜２５　
　　．９２心ＷＩＡ１９．３０　　１３．２３　　　　
１．９５　　　．７８Ｇｌ　　４１．２６　　２５．３
４　　　　７．２０　　　３．７８死体　２３．４０　
　１９．５６　　　　３．０７　　　．８０瀉血に先立
ち、例７の方法に従ってラベル化２６０Ｆ９により処理
された２匹のマウス及びラベル化Ｍ（ｌＰｃ２１により
処理された１匹のマウスを、ピンホールコリメーターを
有するサール・フォーガンマ（Ｓｅａｒｌｅ　Ｐｈｏ−
ｇａｍｍａ）カメラを用いてイメージソゲした。なまデ
ータを集めそしてコンピューター増強した。処理された
マウス及び対照マウスのイメージを第３図に示す。

第３図の第１ラインにおいて、左から右に、腫瘍の外科
除去前、１２５−１ラベル化２６０Ｆ９により処理され
た担癌マウスのイメージ、なまデータ；同じマウスのコ
ンピューター増強データ；外科処置後、マウスのイメー
ジのなまデータ；及び外科処置後、同じマウスのコンピ
ューター増強イメージを示す。検出可能な放射の局在の
顕著な領域は１２５−Ｉラベル化２６０Ｆ９で処理され
たマウスの背右脇上のＭＸ−１１１ｆｆｌ瘍に対応する
位置に見出される。

第３図の第２ラインにおいて、左から右に、１２５−１
ラベル化ＭＯＰＣ２１（対照として使用された腫瘍に特
異的でない抗体）で処理された担癌マウスのイメージ、
なまデータ；及び同じマウスのコンピューター増強イメ
ージを示す。１２５−１ラベル化２６０Ｆ９で処理され
たマウスにおけるような背右脇上の検出可能な放射の局
在の対応する領域は存在しない。さらに、対照マウスに
おけるラベルの分布は１２５−１ラヘル化２６０Ｆ９で
処理された術後マウスにおけるラベルの分布に対応する
ようである。

第３図の第３ラインには、左から右に、１２５−■ラベ
ル化２６０Ｐ９で処理された担癌マウスの術前のイメー
ジのなまデータ；及び同じマウスのコンピューター増強
イメージである。検出可能な放射の局在の顕著な領域は
マウスの右背脇」二ＭＸ−１腫瘍に対応する位置中に見
出される。

第３図の第４ラインにおいて、左から右に、第３ライン
からの担癌マウスの術後イメージ、なまデータ；術後の
、同じマウスのコンピューター増強イメージ；同しマウ
スから摘出された腫瘍のイメージのなまデータ；及び同
じ摘出された腫瘍のコンピューター増強イメージである
。有意な量のラベル化腫瘍特異抗体が腫瘍中に局在した
ことが示される。術後に残留する検出可能な腫瘍特異抗
体の量は、この限定されたサンプル中第２ライン中の対
照マウスにおける検出可能な抗体の量より少ない。

この発明のモノクローナル抗体は、ラベル化成分により
誘導体化された後、多数の用途を有する。

このイムノイメージングモノクローナル抗体は、−次悪
性乳腫瘍の診断のために使用され得る。悪性乳腫瘍の可
能性を示す固まりを有する患者は現在日常的に一連の乳
房造影試験を受ける。乳房造影法に加えて、この発明の
イムノイメージング抗体を皮下又は静脈内に投与するこ
とにより、薗まりがこの発明のラベル化抗体の取り込み
について陽性であるか否かを決定することができる。ラ
ベル化抗体の蓄積は、生検又は一層広範な外科的試験の
必要性を示唆する追加の指標として役立つであろう。

この発明のラベル化モノクローナル抗体はまた、悪性乳
腫瘍の除去のための乳房切除術又は腫瘍切除術を受けた
ことのある患者の臨床予後を検査するために明瞭に使用
される。従来から、このような患者の腋リンパ節が、癌
の播種範囲を決定するために切り出される。今日の実際
においては、陽性のリンパ節を有する患者は補助的な化
学療法を受ける。腋リンパ節のザンプリングは全身麻酔
を必要とする侵害的方法である。これは、感染及び麻酔
に対する反応を包含するあらゆる多くの外科的方法のす
べての危険を伴い、そして痛み、回復及び治癒の実質的
な術後期間が必要である。

この発明のモノクローナル抗体は、乳癌のリンパ節関与
を決定するだめの非侵害的方法として使用することがで
き、そして常用の節摘出に対する補助的方法として、又
はそれに代る方法として役立つことができる。

放射性ラベルされたモノクローナル抗体の利用が多くの
臨床的研究において、少なくとも予備的な態様で示され
ている。Ｍｃｋｅｎｚｉｅ等“Ｔｍｍｕｎｏｓｃｉ−ｎ
ｔｉｇｒａｐｈｙ　ｆｏｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ
　Ｌｙｍｐｈ　Ｎｏｄｅ　Ｍｅｔａｓｔａ−ｓｅｓ　Ｆ
ｒｏｍ　Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ″、　　Ｌａｎｃ
ｅｔ　Ｎｏ、　８４１４　：１２．１５（１９８４）が
示したところによれば、ヒト悪性乳腫瘍に対して特異的
なＴ−１３１ラベル化モノクローナル抗体の皮下指間（
ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ
）注射を用いて、腋リンパ節をまき込む腫瘍を有するこ
とがずでに疑われている患者において転移の存在を確認
することができ、そして腫瘍の存在が疑われていない場
合にはリンパ節中の腫瘍を検出するために使用すること
ができる。東芝ＧＣＡ４０２ガンマーカウンターカメラ
、及びインホーマチック・シメス（ｒｆｏｒｍａｔｅｋ
　Ｓｉｍｅｓ）　４コンピユーターを用いる高エネルギ
ー平行ホールコリメーター−コンピューター平衡化を用
いて、注射の２４時間後、イムノシンチグラフィーは、
取り出された節中の転移の検出のための常用の臨床実験
よりも鋭敏であった。

この発明のモノクローナル抗体のラベル化誘導体を用い
る静脈内投与による乳癌の位置決定はまた、皮下投与経
路に対する明瞭な代替法である。

この方法においては、放射性ラベルされたモノクローナ
ル抗体が静脈内投与のために適当な溶液、例えば１％ヒ
ト血清アルブミンを含む０．１５Ｍ　Ｎａｃｊ！中溶液
として患者に導入される。放射性ラベルされたモノクロ
ーナル抗体は、好ましくは静脈カテーテルを用いて一定
量の塩溶液として約３０分間にわたって注入される。

皮下注射法及び静脈内注射法の両者において、患者は、
モノクローナル抗体生産性バイプリドーマの調製のため
に使用された動物の正常抗体に対するアレルギーについ
て試、験される。一般に、モノクローナル抗体がコラ素
の放射性同位元素により誘導体化される場合、患者は１
．３１−ｒの甲状腺取り込みをブロックするためにルゴ
ルス（Ｌｕｇｏｌｓ）ヨウ素溶液で前処置され、そして
イムノイメージングモノクローナル抗体の投与の前にプ
ロメタシン（ｐｒｏｍｅｔｈａｚｉｎｅ）及びプレドニ
ソロン（ｐｒｏｄｏｎ−ｉｓｏｌｏｎｅ）により前調停
される。イムノイメージングモノクローナル抗体が投与
された後、数時間〜数日間にわたり、５．＠はスキャン
ニングされる。

非特異的抗体を用いるザブトラクション分析のごとき適
当な対照法を含む放射性同位元素イメージングのための
スキャンニング方法は、核医学の分野における当業者に
より知られており、そしてコンピューターを用いるフォ
ートスキャンニング及びコンピューターを用いる断面シ
ンチグラフィーを包含する。

この発明のラベルされたモノクローナル抗体の他の臨床
的用途は乳癌患者の管理の分野における当業者に明らか
である。このような用途は、化学療法剤、イムノトキシ
ン、免疫剤又はリンホカインを包含する種々の療法剤を
用いる療法において転移腫瘍の存在をモニターするため
のラベル化モノクローナル抗体の使用が含まれる。

この発明のラベルされたモノクローナル抗体にまた、命
を危険にさらす転移の存在を、それらの発症に先立って
、予防的又は改善的放射線療法を可能にするのに十分な
早期に使用することもできる。この発明の最も高度に選
択的な抗体はまた、患者の正常組織中のモノクローナル
抗体の分布もしくは局在又はその不存在を決定するため
にラベルすることができ、そうして悪性乳腫瘍の治療の
ためのイムノトキシン又は免疫薬剤のごとき抗体を基礎
とした療法剤のための成分として有利に使用されるであ
ろう乳癌特異的モノクローナル抗体を同定するための基
礎を与える。

この発明のこれらのそして他の観点は、この発明が属す
る分野における当業者にとって明らかであろう。

下記のモノクローナル抗体生産性バイブリドは、アメリ
カン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）
、又はインヒ゛トロ・インターナショナル社（ＩＶＩ）
に、特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関す
るブタベスト条約、及びその規則（ブタベスト条約）の
ちとに寄託された。これは、寄託の日から３０年間の生
存培養物の維持を保証する。これらのハイブリドーマは
ＡＴＣＣから又はＩＶＴから、ブタベスト条約の規定の
もとに、そして関連する米国特許が与えられた後無制限
の入手可能性を保証する出願人とＡＴＣＣ又はＩＶＩと
の間の合意により入手可能にされるであろう。寄託され
た株の入手可能性は、いずれかの政府の権威のもとてそ
の国の特許法に従って認められた権利に反してこの発明
を実施する許諾であると解してはならない。

左欄に記載される各ハイブリドーマの名称はそのハイブ
リドーマが生産するモノクローナル抗体の名称と対応す
る。

４下余白 セル５４７９名ＪＩ　　　　　ＩＶＩ浸Ｕし際号

【図面の簡単な説明】

第１図は、各種モノクローナル抗体の腫瘍組織への結合
を示す。 第２図は、ＭＸ−１腫瘍を有するマウスに投与されたモ
ノクローナル抗体の各種の臓器への分布を示す。 第３図は、マウスのラジオイメージングを示し、生物の
形態を表わす図面に代る写真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、乳癌のイメージングのために適当なネズミモノクロ
   ーナル抗体であって、 （ａ）血液細胞に結合せず； （ｂ）０．２５以上の乳癌結合範囲を有するか、又は０
   ．２５以上の乳癌セルライン範囲を有し； （ｃ）０．０９以下の選択性を有し； （ｄ）Ｇ又はＭアイソタイプを有し；そして （ｅ）イメージング成分に接合された場合に、乳癌をイ
   メージングするのに十分なシグナルを生じさせる； ことを特徴とするモノクローナル抗体。 ２、２Ｇ３、９Ｃ６、３２Ａ１、３３ＦＢ、３５Ｅ１０
   、４１Ｂ４、８７Ｈ７、１０６Ａ１０、１１３Ｆ１、１
   ２０Ｈ７、０４０Ａ７、２００Ｆ９、２０３Ｅ２、２１
   ９Ｆ３、２４５Ｅ７、２５４Ｈ９、２６０Ｆ９、２６６
   Ｂ２、３１７Ｇ５、３６９Ｆ１０、３８７Ｈ９、４２１
   Ｅ８、４５１Ｃ３、４５２Ｅ１２、４５２Ｆ２、４５４
   Ａ１２、４５４Ｃ１１、４５７Ｄ７、５２０Ｃ９、６５
   ０Ｅ２、６９７Ｂ３、７４１Ｆ８、７５９Ｅ３、７８８
   Ｇ６、並びにこの群の構成員と機能的に同等なモノクロ
   ーナル抗体から成るリストから選択される特許請求の範
   囲第１項記載のモノクローナル抗体。 ３、前記抗体が癌性乳房組織中に見出される約２００Ｋ
   ダルトンの分子量を有する抗原に結合するものである、
   特許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。 ４、前記抗体が約２３０Ｋダルトンの分子量を有する抗
   原に結合するものである、特許請求の範囲第１項に記載
   のモノクローナル抗体。 ５、前記抗体が高分子量ムチン（ｍｕｃｉｎ）である抗
   原に結合するものである、特許請求の範囲第１項に記載
   のモノクローナル抗体。 ６、（Ａ）次の性質： （ａ）血液細胞に結合せず； （ｂ）０．２５以上の乳癌結合範囲を有するか、又は０
   ．２５以上の乳癌セルライン範囲を有し；（ｃ）０．０
   ９以下の選択性を有し； （ｄ）Ｇ又はＭアイソタイブを有し；そして（ｅ）イメ
   ージング成分に接合された場合に、乳癌をイメージング
   するのに十分なシグナルを生じさせる； を有する、乳癌のイメージングに適するネズミモノクロ
   ーナル抗体；及び （Ｂ）検出可能なラベル； を含んで成るイムノイメージング剤。 ７、前記検出可能なラベルが前記モノクローナル抗体に
   接合している、特許請求の範囲第６項に記載のイムノイ
   メージング剤。 ８、前記検出可能なラベルが共有結合により前記モノク
   ローナル抗体に結合している特許請求の範囲第７項に記
   載のイムノイメージング剤。 ９、前記検出可能なラベルが、Ｎ−クロロ−ｐ−トルエ
   ンスルホンアミド又はテトラクロロ−３α，６α−ジフ
   ェニルグリコウリルを用いて前記モノクローナル抗体に
   結合されている、特許請求の範囲第８項に記載のイムノ
   イメージング剤。 １０、前記検出可能なラベルが、モノクローナル抗体に
   結合しているリンカーに結合している、特許請求の範囲
   第７項に記載のイムノイメージング剤。 １１、前記リンカーがメチル−ｐ−ヒドロキシベンズイ
   ミデート又はＮ−サクシンイミジル−３−（４−ヒドロ
   キシフェニル）プロピオネートである、特許請求の範囲
   第１０項に記載のイムノイノージング剤。 １２、前記検出可能なラベルがキレート剤により前記モ
   ノクローナル抗体に接合されている、特許請求の範囲第
   ７項に記載のイムノイメージング剤。 １３、前記キレート剤が無水ジエチレントリアミンペン
   タ酢酸又はエチレントリアミンテトラ酢酸である、特許
   請求の範囲第１２項に記載のイムノイメージング剤。 １４、前記検出可能なラベルが、 （ａ）蛍光色素、 （ｂ）放射性同位元素、 （ｃ）放射線不透過基質、及び （ｄ）ＮＭＲで検出可能な物質、 から成る群から選択される、特許請求の範囲第６項に記
   載のイムノイメージング剤。 １５、前記放射性同位元素が、１２３−ヨウ素、１３１
   −ヨウ素、１１１−インジウム及び９９−テクネチウム
   から成る群から選択される、特許請求の範囲第１４項に
   記載のイムノイメージング剤。 １６、非経口的投与のために適当なキャリヤーをさらに
   含んで成る、特許請求の範囲第６項に記載のイムノイメ
   ージング剤。 １７、乳癌のイメージングを必要とする、患者における
   乳癌イメージング方法であって、特許請求の範囲第６項
   のイムノイメージング剤を投与し、そして前記患者中の
   該イメージング剤を適当な検出装置により検出すること
   を含んで成る。 １８、次の性質： （ａ）血液細胞に結合せず； （ｂ）０．２５以上の乳癌結合範囲を有するか、又は０
   ．２５以上の乳癌セルライン範囲を有し； （ｃ）０．０９以下の選択性を有し； （ｄ）Ｇ又はＭアイソタイプを有し；そして （ｅ）イメージング成分に接合された場合に、乳癌をイ
   メージングするのに十分なシグナルを生じさせる； を有し乳癌のイメージングに適するネズミモノクローナ
   ル抗体を生産するハイブリドーマ。 １９、２Ｇ３、９Ｃ６、３２Ａ１、３３ＦＢ、３５Ｅ１
   ０、４１Ｂ４、８７Ｈ７、１０６Ａ１０、１１３Ｆ１、
   １２０Ｈ７、１４０Ａ７、２００Ｆ９、２０３Ｅ２、２
   １９Ｆ３、２４５Ｅ７、２５４Ｈ９、２６０Ｆ９、２６
   ６Ｂ２、３１７Ｇ５、３６９Ｆ１０、３８７Ｈ９、４２
   １Ｅ８、４５１Ｃ３、４５２Ｅ１２、４５２Ｆ２、４５
   ４Ａ１２、４５４Ｃ１１、４５７Ｄ７、５２０Ｃ９、６
   ５０Ｅ２、６９７Ｂ３、７４１Ｆ８、７５９Ｅ３、７８
   ８Ｇ６、又はこの群の構成員と機能的に同等なモノクロ
   ーナル抗体を生産する、特許請求の範囲第１７項に記載
   のハイブリドーマ。 ２０、前記抗体が約５５Ｋの分子量を有する抗原に結合
   する、特許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗
   体。 ２１、相互に交差ブロックする特許請求の範囲第２０項
   に記載のモノクローナル抗体。