KR920002166B1 - 방사성원소로 레이블된 단일클론항체의 제조방법 - Google Patents

방사성원소로 레이블된 단일클론항체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

방사선원소로 레이블된 단일클론항체의 제조방법
제1a, b 및 c도는 각각131I-단일클론항체(HMC-48)를 사용하여 실용 실시예에서 얻은 개의 심실근 경색부위의 전면, 좌측사시 및 측면의 평면상 사진.
제2a, b, c 및 d도는 각각131I-단일클론항체(HMC-48)를 사용하여 실용 실시예에서 얻은 개의 심실근경색부위의 단광자 방사컴퓨터 단층촬영사진.
제3도는 실험 실시예에서 심근경색부위에 축적하는 방사성원소로 레이블된 항-미오신중쇄 단일클론항체단편을 나타내는 사진.
본 발명은 심근경색 및 심근중질환과 같은 심장질환을 영상화(imaging)에 의하여 진단하는데 유용한 진단제(diagnostic agent)와, 이 진단색을 사용하여 심장질환을 진단한는 방법에 관한 것이다.
근래에는 심근경색과 같은 심장질환을 진단함에 있어서 영상화에 의한 진단이 가속화되어 발전되고 있는바, 이 영상화에 의한 진단은 방사성원소로 레이블된 (radiolabled)추적자(追跡子)를 신체에 투여하고, 방사성동위원소에 의하여 방출되는 γ-선을 검출하여 이를 심상(心像)으로 전환시키고 이 심상을 컴퓨터로 처리하여 2-차원 또는 3-차원의 심상을 얻고, 이와 같이 얻은 심상을 근거로 하여 심근경색의 부위와 크기를 진단하는 것이다. 그러나 심장 핵 의약에 있어서 영상화에 의한 진단에 현재까지 사용된 추적시약이 항상 심근경색의 부위를 특이적으로 검출할 수 있는 것은 아니었다.
예컨대 탈륨-201(201Tl)을 이용하는 심근에 대한 신티그라피는 Tl이 생체내에서 칼륨이온과 유사한 작용을 하여, 전환속도가 비교적 신속한 심장, 간, 신장, 내분기관, 종양등의 세포에 흡수되며, 이에따라 정상심근의 윤곽이 묘사되는 반면에 Tl은 경색부위에서 괴사되거나 허혈성의 심장근에는 흡수되지 않아서 이 부위가 결손부위로서 나타난다는 원리를 이용한 것이다. 따라서 Tl이 특이적으로 심장근을 항상 묘사하는 것은 아니며, 이 방법에 의하여서는 경색이 근래에 발생된 것인지 또는 과거에 발생된 것인지를 측정하기도 역시 곤란하였다.
한편 심근의 피로인산염 신티그라피는 경색부위에 테크네룸-99m-(99mTc)-레이블의 피로인산염이 축적되고 이 부위가 양성 신티그램으로서 묘사되는 현상을 이용하는 것이다. 그러나 이 추적자는 경색부위의 주변영역에서도 역시 축적되며 따라서 경색부위를 과대평가하기 쉽게된다.
종래의 추적자에 수반되는 상기한 문제점들을 극복하려는 방법으로서는 심장미오신에 대하여 방사성원소로 레이블된 항체를 사용하는 방법이 근래에 상당한 관심을 끌고 있다.
이 방법에 있어서는 항-혈청을 정제하여 얻은 항체를 이용하게 되며, 이 항-혈청은 항체를 펩신으로 처리하여 얻은 (Fab')2단편과 같은 정제된 심장미오신이나 그의 단편으로 동물을 면역시켜 제조하고, 상기 항체와 그의 활성단편은 방사성원소로 레이블된 것으로 경색부위에 농후하게 축적되는 것으로 보고 되었다(U.S.patent No.4,036,945와 비교).
그러나 미오신분자는 두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄(사람의 심근일 경우에는 2개의 종)로 구성되는 소단위(sub-unit)구조를 가지며, 따라서 미오신으로 면역시켜 얻은 항-혈청은 친화성 크로마토그라피를 이용하여 정재한 경우에도 역시 경쇄에 특이적인 항체분자를 갖는다. 심근경색에 있어서 괴사영역내의 심근세포막은 파괴되고, 따라서 심장미오신경쇄는 크레아틴 포스포키나제(CPK)와 락테이트 탈수소효소와 같은 폴리펩티드와 함께 혈액내로 방출된다. 따라서 미오신경쇄와 그의 활성단편에 특이성을 갖는 항체는 혈액내로 방출된 경쇄와 면역복합체를 형성하여 경색부위로의 도중에 소모된다. 그러나 한편 앨러지반응과 기타 여러 가지 생물반응을 유도하는 면역복합체의 가능성이 있다. 그외의 문제점은 제한된 양으로만 제조될 수 있기 때문에 임상목적에 다량으로 공급할 수 없다는 점이다.
본 발명자들은 심근경색부위에 특이적으로 축적되어 영상화에 의한 정확한 진단을 보장하는 추적시약을 개발하고자 많은 연구를 수행하였다. 그 결과 본 발명을 착상, 개발하게 된 것이다. 더욱 상세히 말하면 본 발명은 인간 심근미오신중쇄나 또는 그의 단편에 대한 특이성을 갖는 방사성원소로 레이블된 단일클론(monoclonal)항체를 포함하는, 심근경색과 심근증등과 같은 심장질환의 진단에 유용한 진단제를 제공한다.
본 발명은 그 한가지 양상으로서 인간 심장미오신중쇄 또는 그의 활성단편의 이소자임에 대하여 특이성을 갖는 방사성원소로 레이블된 단일클론항체를 포함하는 심장질환용 진단제를 제공한다. 이 경우 사용되는 단일클론 항체로서는 인간 심장미오신중쇄 α타입 또는 β타입에 대하여 특이성을 갖는 단일클론의 항체가 이용된다. 또 다른 양상으로서, 본 발명은 진단시약을 사용하여 심장질환을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
심근경색에 있어서 심장미오신경쇄는 혈액내로 방출되고, 한편 심장미오신중쇄와 같은 큰 분자는 죽은 세포에 머문다. 영상화제로서 심장미오신중쇄에 특이성을 갖는 항체를 사용함으로써 경색부위로 향한 도중의 혈액내 항체의 소모에 관련되는 문제점을 해결할 수 있으며, 이에 의하여 방사성동위원소를 특히 경색부위에 고수율로 축적될 수 있다. 따라서 저용량수준으로도 경색부위의 예민한 상(像)을 얻을 수 있게 되었다. 또한 항-혈청으로부터 유도된 종래의 항체에 비하여 이 항치는 혈액내 심장미오신경쇄와의 면역복합체 형성에 기인하는 앨러지반응과 기타 여러 생물반응이 유도되는 것과 같은 바람직하지 못한 부작용이 적다는 이로운 특징을 갖는다.
더욱이, 심근에 관하여는 하나는 높은 ATP아제(ATPase)활성을 갖는 α형이고, 다른 하나는 낮은 ATP아제활성을 갖는 β형인 2종의 이소자임이 존재한다고 알려져 있으며, 대체로 말하면 사람에게 있어서는 심방근은 주로 α형을 함유하는 반면에 심실근은 실질적으로 β형을 함유한다. 따라서 심장미오신중쇄의 이소자임에 특이적인 단일클론항체는 상기한 이점에 부가하여 심근경색의 위치측정에 사용가능하다는 이점을 갖는다. 더욱 상세히 말하면 심장미오신중쇄 α형에 대하여 특이성을 갖는 단일클론항체의 현재까지 지극히 곤란하던 심방심근경색의 진단을 용이하게 하였다. 이와 대조적으로 심장미오신중쇄 β형에 특이성을 갖는 단일클론항체의 이용은 영상화에 의한 심실심근경색의 국소진단을 가능하게 한다. 이들 단일클론항체는 특이성이 높은 유용한 항체로서, 공지된 방법으로 안정하게 다량으로 공급될 수 있다.
본 발명은 진단체는 인간 심장미오신중쇄 또는 인감 심장미오신중쇄 α형 또는 β형 또는 그의 활성단편에 대하여 특이성을 갖는 단일클론항체(이후 필요에 따라서는 대체로 ＂단일클론항체＂로 표시한다)를 방사성동위원소로 레이블링 (labeling)함으로써 얻어진다. 이들 단일클론항체나 그의 활성단편은 제조방법과 방사성동위원소와의 레이블링과정에 특별한 제한을 받지 않으며, 본 발명의 진단제로 또한 제제형태에 제한을 받지 않고, 목적에 따라 적당히 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 단일클론항체와 그의 활성단편은 일반적으로 실용되는 세포융합법(G.Kohler,G.Milstein,Eur.J.Immunol.6 511-519(1976) 및 M.Shulman et al., Nature 276 269-270(1987)과 비교)을 이용하여 항체를 생성하는 하이브리도마를 얻고, 이 하이브리도마로부터 단일클론항체를 유도하고, 이와 같이 유도된 단일클론항체를 가수분해시켜 그의 활성단편을 얻음으로써 각각 제조할 수 있다. 이들 과정을 대체로 기술하면 다음과 같다.
[항체생성세포의 제조]
항체생성세포의 제조는 생쥐, 쥐, 토끼, 양, 말, 보우바인(소)등과 같은 이종 개체동물을 인간 심장미오신중쇄, 인간 심방미오신(α형), 인간 심실미오신(β형), 또는 바우바인이나 말 또는 호그돼지부터 제조된 인감 심장미오신중쇄나 인간 심장미오신 α형 또는 β형과 면역학적으로 동등한 심장미오신으로 면역시키고, 비장세포, 흉선세포, 임파선세포 그리고 또는 말초혈액림파구로부터 항체-생성세포를 취함으로써 수행된다.
[골수종세포의 제조]
골수종세포로서는 생쥐, 쥐, 토끼 및 인간과 같은 여러 가지 동물로부터 유래된 셀라인을 사용할 수 있다. 이 셀라인을 내약제성이고, 선택적 배지내에서는 생존 불가능하지만 융합후에는 생존 가능한 것이 바람직하다. 가장 일반적으로 사용되는 셀라인은 8-아자구아닌 내성 셀라인으로 이것은 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제가 결핍되어 있으며, 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 배지내에서는 생장시킬 수 없다. 셀라인은 또한 ＂비분비선＂형인 것이 바람직하다.
이와 같은 셀라인의 전형적인 실예는 생쥐 골수종 MOPG-21 셀라인으로부터 유도된 P3/x63-Ag8(Nature 256,495-497(1975)), P3/x63-Ag 8 U1(P3U1)(ATCC CRL-1579)(Current Topics in Microbiology 및 Immunology,81,1-7(1978)),P3/x63-Ag 8·6·5·3(x63·6·5·3)(ATCC CRL-1580)(J.Immunology,123,1548-1550(1979)), P3/NSI-1-Ag 4-1(NS-1)(European J.Immunology,6,292-295(1976)), Sp210-Ag 14(SP2)(ATCC CRL-1581)(Nature,276,269-270)(1978))이다. 쥐골수종 210 RCY 3Kg 1·2·3(Y3 Ag 1·2·3)(Natyre,277,131-133(1979))와 인간 골수종 U-266-AR1(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,1158(1980)과 GM 1500(Nature 228,448(1980))도 역시 사용할 수 있다.
상기한 셀라인중 몇몇은 시판되고 있다.
[세포융합]
세포융합은 107내지 108골수종세포를 항체생성세포와 함께 1 : 4 내지 1 : 10의 혼합비율로 이글(Eagl)의 초소필수배지(MEM)와 RPMI 1640과 같은 동물세포배양용 배지내에서 혼합함으로써 수행된다. 융합보조제로서는 평균분자량이 1000 내지 6000인 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알코올, 바이러스등이 사용된다.
[선택배지내에서의 하이브리도마의 선택]
세포융합과정후 세포로부터 하이브리도마의 선택은 선택적 배지내에서의 선택적 생장에 의하여 수행된다. 예컨대 세포를 예를 들면 105-106세포/웰까지 마이크로타이터 플레이트에 넣은 15%의 우태아(牛胎兒)혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지로 적당히 희석하고 각개 웰에 선택배지(즉 HAT 배지)를 가하고, 이 단계후에는 선택배지를 적당히 교환한다. 예컨대 8-아자구아닌 내성셀라인을 골수종세포를 사용하고 HAT 배지를 선택배지로서 사용하는 경우, 미융합 골수종세포는 배양한지 약 10일후에 치사되고 정상세포인 항체생성세포는 시험관내에서 장기간 생장할 수 없다. 따라서 10 내지 14일째에 생장한 세포는 모두가 하이브리도마이다.
[항체생성 하이브리도마에 대한 스크리닝]
하이브리도마 생성 항-심장미오신중쇄 항체, 항-심장미오신중쇄 α항체 또는 항-심장미오신중쇄 β항체에 대한 스크리닝은 ＂효소 결합된 면역 흡수체 분석＂(이후부터는 ＂ELISA＂로 명명한다)에 따라 수행할 수 있다. 더욱 상세히 말하면, 보우바인 심방미오신과 같은 심장미오신중쇄 α형이나 또는 인간 심실미오신과 같은 심장미오신중쇄 β형을 인산염 완충액수(PBS)나 또는 탄산수소나트륨(pH 8.0)과 같은 완충액에 미리 10-100㎍/ml로 용해시키고, 각각 50㎕인 일정량을 ELISA용 폴리염화비닐(PVC)판과 같은 연성판(96웰)에 가하고, 이판을 4℃에 하룻밤 방치한다. 다음에 항원을 버리고, PBS로 세척한 후 1% 보우바인 혈청알부민(BSA)을 함유하는 PBS를 가한다. 다음에 혼합물을 1시간동안 실온에 방치하여 항원이 결합되지 않은 부위를 BSA로 차단하게 한다. 각개 웰의 상징액으로부터 50㎕ 정량을 가하고 실온에 1시간동안 방치하고 PBS로 3회 세척한다. 다음에 비오티닐 항-생쥐 이뮤노글로블린 항-혈청(제2항체)을 가하고, 이 혼합물을 1시간동안 실온에 방치한다. PBS로 3회 세척한 다음 아비딘 D-효소 복합체를 가하고, 이 혼합물을 실온에 15분간 방치한다. PBS로 4회 세척한 다음 효소에 대한 기질을 가하여 광밀도를 측정한다.
항원에 특이한 단일클론항체를 함유하는 웰은 상기한 과정에 따라 용이하게 판별할 수 있으며, 이에 의하여 하이브리도마에 대한 스크리닝을 수행할 수 있다.
[클로닝]
둘 이상 종의 하이브리도마가 각개 웰에 함유될 가능성이 있으며, 따라서 클로닝을 예컨대 제한 희석법에 따라 수행하여 단일클론항체-생성 하이브리도마를 얻는다.
[항체의 생성]
가장 순수한 단일클론항체는 10 내지 15%의 우태아 혈청을 함유하는 RPIM 1640 배지와 같은 동물세포 배양용 배지 또는 무혈청배지에서 단일클론항체를 생성하는 하이브리도마를 배양하고, 상징액으로부터 항체를 수집함으로써 얻을 수 있다. 세포배양방법과 조건에 대하여는 동물세포 배양방법에서 종래 사용되는 것을 적당히 응용할 수 있다.
한편 항체를 보다 과량으로 생성하는 방법으로서는 프리스탄(2,6,10,14-테트라메틸렌마데칸)과 같은 광유를 하이브리도마의 선대골수종이 발생되는 친연성동물에 복강내 투여한 다음 이 하이브리도마를 그 내부에서 다량으로 증식되도록 복강내에 주사한다. 하이브리도마는 10-18일내에 복수종양으로서 성장하여 혈청과 복수액내에서 높은 농도(약 1 내지 20㎎/ml)로 항체를 생성한다. 정제가 필요한 경우에는 DEAE 셀룰로오스 이온교환 컬럼크로마토그라피나 또는 그에 결합된 심장미오신을 갖는 세파로스 4B를 사용하는 친화성 컬럼크로마토그라피등이나 또는 겔여과 컬럼크로마토그라피와 같은 방법에 의하여 황산암모늄분획후에 정제를 수행할 수 있다.
[활성단편의 제조]
활성단편으로서는 본 발명에서 사용되는 단일클론항체의 면역성을 보유하는 (Fab')2단편, (Fab')단편, Fab단편등 어느 단편도 사용할 수 있다. 이들 활성단편은 파파인, 펩신 및 트립신으로의 처리와 같은 공지된 과정(＂Medicochemical Experiment Method Series Vol.4,Immunochemistry＂,Kabushiki Kaisha Nakayama Shoten(August 20,1972),pp91-119 Method in Immunoligy 및 Immunochemistry Vol.1＂,pp.422-423,Academic Press,1967 참조)에 따라 제조할 수 있다.
이와 같이 제조된 단일클론항체와 단편도 역시 여러 가지 공지방법에 의하여 방사성동위원소와 레이블될 수 있다.
방사성동위원소의 핵종의 실예로는 요오드-125, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 테크네튬 99m, 갈륨-67, 납-203, 루테늄-97, 수은-197, 탈륨-201 및 비스무트-212가 있다. 방사성동위원소와의 레이블방법은 그의 종에 따라서 선택할 수 있다. 방사성요오드에 대하여는 예컨대 클로라민 T방법, 염화요오드방법 또는 락토퍼옥시 디아제방법을 이용할 수 있다.(＂Radioisotope Drug Metabolism Experimental Method＂,Maruzen K.K.(January 30,1981),pp95-101,＂Methods in Enzymology Vol.70 Immunochemical Techniques Part A＂,pp210-265,Academic Press, 1980)참조).
기타 방사성동위원소에 관하여는 항체나 그의 활성단편과 2관능성 킬레이트제가 공유결합되고, 이와 같이 얻은 생성물을 방사성동위원소와 레이블하는 방법이 이용된다.
전형적인 2관능성 킬레이트제의 실예로는 1-아미노-6,17-디히드록시-7,10,28,21-테트라옥소-27-(N-아세틸히드록시이미노)-6,11,17,22-테트라아자헵타에이코잔(데스페리옥사민), 8-히드록시퀴놀린, 에틸렌디아민테트라아세트산, 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 디아미노시클로헥실테트라아세트산, 3-아미노메틸렌-2,4-펜타디오네비스(티오세미카르바존) 및 그의 N-알킬 또는 N-페닐 유도체, 아세틸 아세톤과 같은 시트르산이 있다. 항체나 그의 활성단편과 2-관능성 킬레이트제와의 결합은 카르보디이미드, 무수산 또는 글루타르알데히드법과 같은 종래방법에 따라 수행될 수 있다.
특히 바람직한 2관능성 킬레이트제는 테크네튬-99m과 갈륨-67 레이블용의 데스페리옥사민과 디티오세미카르바존 유도체이며, 한편 인듐-111과 비스무트-212에 대하여는 DTPA가 바람직하다. 테크네튬-99m을 레이블에 사용하는 경우에는 퍼테크네튜메이트를 환원제(즉,염화 제1주석,요오드화 제1주석 또는 불화 제1주석)와 접촉시켜 테크네튬을 그의 3산화물, 4산화물 또는 5산화물로 환원시킨다.
본 발명의 진단제는 그의 구체예로서 항체나 그의 단편과 2관능성 킬레이트제와의 결합화합물과 방사성동위원소 용액을 포함하는 ＂키트＂(kit)를 포함한다. 이 키트에는 핵종을 정제하기 위한 크로마토그라피용 컬럼이 제공될 수 있다. 본 발명의 진단제는 인체의 정맥내에 투여한다. 이 진단제는 주사에 의한 투여에 적당한 형태로 제공되며, 예컨대 담체로의 염화나트륨이나 글루코오스의 수용액을 사용하여 제조할 수 있다.
사용량은 레이블링에 사용한 특수 방사성핵종에 따라 다양하지만, 일반적으로 100μCi 내지 30mCi, 바람직하게는 500μCi 내지 3mCi이다.
본 발명 진단제를 투여한 지 1 내지 48시간후에 환자의 심장영역을 신틸레이션(schintilation)계수기나 카메라로 주사(走査)하여 의약으로부터 나오는 방사능을 검출하여 심상을 얻고, 이에 의하여 영상화에 의한 진단이 가능하게 되는 것이다.
이하에 본 발명의약의 실시예와 실용 실시예 및 실험 실시예와 더불어, 본 발명에서 사용되는 단일클론항체의 제조를 설명하는 참고 실시예를 기준으로 본 발명을 더욱 상세히 기술할 것인바, 이들 실시예는 설명만을 목적으로 제시한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고저 하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
[참고 실시예]
[하이브리도마의 제조]
보우바인 심방미오신(1mg/ml) 또는 인간 심실미오신(1mg/ml)을 생리염수 용액에 용해시키고 1 : 1의 비율로 완전 프로인트 보조약(Freund's adjuvant)과 혼합하여 유제를 제조하였다. 이 유제를 수회 매 2주마다(50㎍/두) BALB/C 생쥐(암쥐,6주된것)에게 복강내 투여하고, 마지막으로 30㎍의 보우바인 심방미오신이나 인간 심실미오신을 정맥내에 투여하였다. 최종면역 3일후에 비장세포를 생쥐로부터 취하여 MEM으로 세척하였다. 생쥐 골수종 P3U1을 MEM으로 세척하고 비장세포와 10 : 1의 비율로 혼합하였다. 원심분리후에 1ml의 50% PEG 1000 MEM 용액을 상기와 같이 얻은 펠릿 또는 케이크에 서서히 가아여 세포융합을 수행하였다. 또한 MEM 용액을 서서히 가하여 최종량이 10ml되게 하였다. 다시 원심분리를 수행하고, P3U1으로서 15%의 우태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에 1×105세포/0.1ml까지 펠릿을 현탁시켜서 96-웰 마이크로플레이트에 0.1ml/웰로 도말하였다. 1일후에 각각 0.1ml씩 일정량의 HAT배지를 가하고, 그후 3-4일마다 배지의 반을 새로운 HAT배지로 대치하였다. 약 7일째 하이브리도마의 생장이 몇 개의 웰에서 인지되었다.
하이브리도마가 생장한 상징액 0.05ml를 분리하여 상징액 각각 50μl씩의 일정량을 보우바인 심방미오신(α형)이나 인간 심실미오신(β형)으로 미리 피복시킨 96-웰의 마이크로플레이트에 가하였다.
상기한 ELISA 방법에 따라 아비딘 D-효소배합체로서 아비딘 D-퍼옥시다제(Vector Co.제조)를 사용하고, 질과 발색제로서 과산화수소, 4-아미노안티피린 및 페놀을 사용하여, 심방 및 심실미오신 양자와 반응하는 심장미오신중쇄에 대한 단일클론항체를 함유하는 상징액과, 보우바인 심방미오신과는 반응하나 인간의 심실미오신과는 반응하지 않는 상징액(심장미오신중쇄 α형에 대한 특이성을 갖는 단일클론항체는 이 상정액에 함유되어 있다)과, 인간 심실미오신과는 반응하나 보우바인 심방미오신과는 반응하지 않는 상징액(심장미오신중쇄 β형에 대하여 특이성을 갖는 단일클론항체는 이 상징액에 함유되어 있다)을 선택하고, 하이브리도마를 제한 희석법으로 클론화하였다.
그 결과, 심장미오신중쇄에 대하여 특이성을 갖는 항체를 생성하는 하이브리도마 CMA-25 셀라인 및 CMA-34 셀라인과 심장미오신중쇄 α형에 대하여 특이성을 갖는 항체를 생성하는 CMA-19 셀라인과, 심장미오신중쇄 β형에 대하여 특이성을 갖는 항체를 생성하는 HMC-14 셀라인, HMC-48 셀라인 및 HMC-50 셀라인이 얻어졌다.
[단일클론항체의 제조]
상기한 각개의 하이브리도마를 96-웰 마이크로플레이트에서 15% 우태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지내에서 배양한 다음 25cm2플래스크와 75cm2플래스크에 스케일-업하고, 배양 상징액을 수집하였다. 이들 상징액내 단일클론항체의 역가(力價)는 ELISA법에 의하여 결정하였다. 역가는 100%로서 취한 흡착성 50%를 나타내는 최초용액으로부터 항체시료를 취하여 그의 희석량으로서 표시하고, 이 값은 피복된 항체에 대하여 충분한 양의 항체가 존재하는 시료에 대하여 ELISA법으로 얻는다. 또한 각개 항체의 서브클래스는 MONOABID EIA KIT(ZYMED Co. 제공)에 의하여 결정하였다.
얻어진 결돠는 표 1에 요약되어 있다.
[표 1]
Figure kpo00002
[실시예 1]
(131I-레이블된 항-인간 심실미오신중쇄 β형 단일클론 항체의 제조)
프리스탄을 미리 쥐에게 투여하여 복수종양을 유발한 후 5×106세포/두의 하이브리도마 HMC-48 셀라인을 투여하였다. 투여한지 10 내지 20일후에 쥐로부터 복수를 수집하여 50% 포화 황산암모늄분획을 얻었다. 이 분획을 DE 52 컬럼크로마토그라피를 수행하여 그로부터 정제 단일클론항체(HMC-48)를 용리시켰다. 3mCi의131I에 이와 같이 얻은 정제 항체(8.7mg/ml)200μl와, 150μl의 클로라민 T(1mg/ml)와, 600μl의 메타아황산나트륨(1mg/ml)과, 150μl의 요오드화칼륨(50mg/ml)과, 150μl의 0.5M 인산염 완충액(pH 7.5)을 가하였다. 이 혼합물을 실온에서 1분간 반응시킨 후 0.5% 보우바인 혈청 알부민-인산염 완충액으로 미리 평형시킨 세파덱스 G-50을 사용하는 컬럼크로마토그라피를 행하여 유리131I를 분리시켜서131I-단일클론항체(HMG-48)를 얻었다.
[실시예 2]
(111In-레이블된 항-인간 심실미오신중쇄 β형 단일클론항체(Fab')2단편의 제조)
실시예 1에서 생성된 정제 단일클론항체(HMG-48)26mg을 아세트산나트륨-염산염 완충액(pH 4.5)에 대하여 투석시켜서, 완충액과 더불어 2.6ml을 항체 용액(10mg/ml)를 형성시켰다. 이 용액에 0.5mg의 펩신(2948U/mg,Millipore Co.제공)을 가하여 이 혼합물이 37℃에서 18시간동안 반응되게 하였다. 반응 후 반응혼합물을 1ℓ의 붕산염 완충액(pH 8.0)에 대하여 투석시키고, 이 완충액은 투석중 2회 새것으로 교체하였다. 마지막으로 이 혼합물은 50mM 인산염 완충액으로 평형시킨 Ultrogel AcA 34(Bio-Rad Co.제공)를 이용하는 겔여과 컬럼크로마토그라피를 행하고, 분자량 피크값이 약 100,000인 분획은 (Fab')2단편으로서 수집하였다.
이와 같이 얻은 단편을 Amicon B-15를 통하여 5mg/ml까지 농축시키고, 이 농축물은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DIPA)의 무수카르복시카르본산 혼합물과 함께 크레즈카레크씨등의 방법(Krejcarek et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun., Vol.77,pp.581-587,1977)으로 혼합시키고, 이 혼합물을 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 다음에 반응용액을 0.1M 아세트산염 완충액(pH 5.0)에 대하여 투석시키고, (Fab')2-DTPA 분획은 세파댁스 G-25를 통하여 수집하고, 이 분획을 0.1M 글리신-염산염 완충액(pH 3.5)에 대하여 투석시켰다.
이와 같이 얻은 HMC-48(Fab')2-DTPA를 완충액내에서 염화인등111In과 혼합시키고, 이 혼합물을 30분간 반응시켰다. 그 결과 HMC-48(Fab')2-DTPA-111In의 1.5mCi/mg 단백질을 얻었다.
[실시예 3]
(111In-레이블된 항-인간 심장미오신중쇄 단일클론항체(Fab')2단편의 제조)
단일클론항체(GMA-34)를 실시예 2에서와 유사하게 처리하여 (Fab')2단편을 얻었다. 다음에 얻어진 단편에 실시예 2의 과정으로 DIPA를 결합시키고111In과 반응시켰다. 그 결과 1.1mCi/mg 단백질의 비(比)방사능을 갖는 CMA-34(Fab')2-DTPA-111In이 얻어졌다.
[실시예 4]
(111In-레이블된 항-인간 심장미오신중쇄 α단일클론항체 Fab단편의 제조)
단일클론항체(GMA-19)는 실시예 2에서와 같이 정제하고 냉동-건조시켰다. 이와 같이 정제된 항체 30mg을 2.5ml의 인산염 완충액(pH 7.0)에 가하고, 얻어진 혼합물에 0.3mg의 펩신(Sigma Co.제공)을 가하였다. 생성혼합물을 2시간동안 37℃에서 반응시켰다.
반응용액은 인산염 완충액(pH 7.4)으로 미리 평형시킨 단백질 A 세파로스 CL-4B(Pharmacia Fine Chemicals 공급)로 충전시킨 컬럼을 사용하여 친화성 컬럼크로마토그라피를 행하여 Fc단편과 미단편의 항체를 흡착하도록 하였다. 비흡착된 분획을 수집하여 Amicon B-15를 통하여 5mg/ml까지 농축시겼다. 이와 같이 얻은 Fab단편에 DIPA를 실시예 2의 과정으로 결합시켜서 1.3mCi/mg 단백의 비방사능을 갖는 CMA-19Fab-DTPA-111In을 생성시켰다.
[실시예 5]
(111In-레이블된 항-인간 심장미오신중쇄 β형 단일클론항체 Fab단편의 제조)
실시예 1에서와 유사하게 하이브리도마 HMC-48 셀라인에 의하여 유도된 복수에 인산염으로 완충된 염수(PBS)(pH 7.0)의 동일용적과 2배용적의 포화 황산암모늄을 가하였다. 이와 같이 형성된 침전을 원심분리한 다음 복수를 50% 포화 황산암모늄으로 분획하였다. 생성되는 침전을 0.1M 트리스-염산염 완충액(pH 7.2)에 대하여 투석하고, 0.1M 트리스-염산염 완충액(pH 7.2)을 사용하여 DE 52 컬럼크로마토그라피를 행하였다. 통과된 분획을 농축시켜서 PBS를 사용하는 Ultrogel AcA 44(LKB Co.제공) 컬럼크로마토그라피를 행하여 분자량 150,000인 Ig 분획을 정제 항체로서 얻었다.
정제된 항체(5mg/ml)의 용액(30mM PBS 플러스 5mM EDTA)에 동일용적의 0.025% 파파인용액(Cooper Biochemical Co.,30mM PBS(pH 7.0), 5mM 씨스테인 플러스 2mM EDTA)을 가하고, 이 혼합물을 30분간 37℃에서 반응시켰다. 이 단계에서 10mM 요도아세트아미드 용액을 반응혼합물에 가하여 반응을 중시시켰다. 이 반응용액을 0.1M 트리스-염산염 완충액(pH 8.0)으로 평형시킨 단백질 A-세파로스 CL-4B 컬럼에 가하였다. 통과된 분획을 농축시켜서 PBS(pH 7.0)로 평형시킨 Ultrogel AcA 54(LKB Co.제공)에 더 가하여 분자량이 50,000인 Fab 분획을 얻었다.
상기한 방법으로 얻어진 Fab단편에 실시예 2의 방법으로 DTPA를 결합시키고 이와 같이 얻어진 HMC-48 Fab-DTPA를 0.1M 글리신-염산염 완충액(pH 3.5)내에서 염화인듐111In과 혼합시켰다. 이 혼합물을 30분간 반응시켜111In-레이블된 HMC-48 Fab-DTPA의 1.5mCi/mg 단백질을 얻었다.
[실용 실시예]
(131I-단일클론항체(HMC-48)에 의한 진단)
실시예 1에서 얻은131I-단일클론항체(HMC-48)2mCi를 관상동맥을 결찰시킴으로써 인공적으로 유도한 심근경색을 갖는 개에게 정맥내 투여하였다. 투여한지 36시간후에 감마 신틸레이션 카메라(Maxicamera 400 AT,General Electric Co,제공)에 의하여 평면심상과 단일광자방출산정의 단층사진(SPECT)을 얻었다. 평면심상에 있어서131I-단일클론항체는 캐닌(Canine)심실근내 경색부위에 축적되었다.
이 항체는 또한 갑상선관에만 약간 축적되나,99mTc 피로인산염과는 반대로 뼈나 그외의 부위에는 축적되지 않는 것으로 나타났다. 한편 산정된 단층사진에 있어서, 경색부위는 명확히 묘사되었고,131I-단일클론항체는 격막의 정부(頂部)와 그 일부에 축적되었다.
[실험 실시예]
실시예 5에서 얻은111In-레이블된 HMC-48 Fab-DTPA(1.5mCi/mg) 1mg을, 관상동맥을 결찰시킴으로써 인공적으로 유도된 심근경색을 갖는 개에게 정맥내 투여하였다. 투여한지 48시간후에 개로부터 심장을 절제해 내었다. 절제된 심장으로부터 크기가 각각 약 3×3mm인 시험표본을 제조하고 경색부위에서의 방사능과 비-경색부위의 방사능을 각각 측정하였다.
방사능은 경색부위에서는 2879.8cpm/mg이고, 그의 주변에서는 563.5cpm/mg이고, 정상영역에서는 77.2cpm/mg 및 67.2cpm/mg으로서, 경색부위에서는 정상영역에 비하여 약 40배의 방사능이 축적되었다.

Claims (6)

  1. 이하의 단계로 이루어진 인간 심근미오신중쇄 아이소자임에 특이성을 갖고 방사성동위원소로 표지된 단일클론항체의 제조방법.
    a) 인간의 심근미오신중쇄 아이소자임 또는 이것과 면역학적으로 동등한 인간이외의 미오신중쇄 아이소자임으로 된 항원을 동물에 면역시켜, 면역을 획득한 동물로부터 항체 생성세포를 얻는 단계, b) 이 항체 생성세포와 골수종세포를 융합하여 항체를 생산할 수 있고 증식 가능한 하이브리도마를 얻는 단계, c) 이 하이브리도마를 생체내 또는 생체외 배양하여 인간 심근미오신중쇄의 아이소자임에 특이성을 가지는 단일클론항체를 얻는 단계, d) 이 단일클론항체에 방사성동위원소를 결합시켜서 방사성동위원소로 표지된 단일클론항체를 얻는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 단일클론항체가 인간 심근미오신중쇄 α형에 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단일클론항체가 인간 심근미오신중쇄 β형에 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 방사성동위원소가 요오드-135, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 테크네튬 99m, 갈륨-67, 납-203, 루테늄-97, 수은-197 탈륨-201 및 비스무트-212로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, (c)단계에서 얻어진 단일클론항체를 효소처리하여 활성단편을 얻고, 이 활성단편에 방사성동위원소를 결합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제5항에 있어서, (c)단계에서 얻어진 단일클론항체 또는 그 활성단편에 2관능성 킬레이트제를 통하여 방사선동위원소를 결합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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