JPH0912600A - ヒアルロン酸ナトリウムに対するモノクローナル抗体及びその製造方法 - Google Patents
ヒアルロン酸ナトリウムに対するモノクローナル抗体及びその製造方法Info
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- JPH0912600A JPH0912600A JP7180698A JP18069895A JPH0912600A JP H0912600 A JPH0912600 A JP H0912600A JP 7180698 A JP7180698 A JP 7180698A JP 18069895 A JP18069895 A JP 18069895A JP H0912600 A JPH0912600 A JP H0912600A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 低分子化したヒアルロン酸ナトリウムにタン
パク質ないしリン脂質を導入して共有結合体を形成し、
これを抗原としてマウス等を免疫して得られる抗体産生
細胞とマウスミエローマ細胞との融合細胞が産生し、ヒ
アルロン酸ナトリウムを認識することを特徴とするモノ
クローナル抗体及びその製造方法。 【効果】 本発明によれば、ヒアルロン酸ナトリウムを
低分子化し、これと脂溶性成分の共有結合体を形成し、
該共有結合体をリボソームに導入し、これを抗原として
マウス等を免疫することにより、ヒアルロン酸ナトリウ
ムに対するモノクローナル抗体を得ることが可能であ
る。
パク質ないしリン脂質を導入して共有結合体を形成し、
これを抗原としてマウス等を免疫して得られる抗体産生
細胞とマウスミエローマ細胞との融合細胞が産生し、ヒ
アルロン酸ナトリウムを認識することを特徴とするモノ
クローナル抗体及びその製造方法。 【効果】 本発明によれば、ヒアルロン酸ナトリウムを
低分子化し、これと脂溶性成分の共有結合体を形成し、
該共有結合体をリボソームに導入し、これを抗原として
マウス等を免疫することにより、ヒアルロン酸ナトリウ
ムに対するモノクローナル抗体を得ることが可能であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はモノクローナル抗体及び
その製造方法、特にヒアルロン酸ナトリウムに対するモ
ノクローナル抗体及びその製造方法に関する。
その製造方法、特にヒアルロン酸ナトリウムに対するモ
ノクローナル抗体及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、糖脂質等の生体成分に対するモノ
クローナル抗体が作製され、免疫組織化学的手法を用い
てその生理学的役割が調べられるようになってきた。ま
た、グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）に対する抗体も
コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸等については、モノ
クローナル抗体が調製され、モノクローナル抗体を利用
して、これらのＧＡＧｓの生理科学的意義が調べられつ
つある。
クローナル抗体が作製され、免疫組織化学的手法を用い
てその生理学的役割が調べられるようになってきた。ま
た、グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）に対する抗体も
コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸等については、モノ
クローナル抗体が調製され、モノクローナル抗体を利用
して、これらのＧＡＧｓの生理科学的意義が調べられつ
つある。
【０００３】最近、糖脂質等の生体成分で抗原性をほと
んど有さない成分に対する抗体作製のためには、糖脂質
等の生体成分をリポソーム化してモノクローナル抗体を
調製する方法が用いられるようになってきた。生体成分
をリポソーム化するには、生体成分が脂溶成分を持つこ
とが必要である。
んど有さない成分に対する抗体作製のためには、糖脂質
等の生体成分をリポソーム化してモノクローナル抗体を
調製する方法が用いられるようになってきた。生体成分
をリポソーム化するには、生体成分が脂溶成分を持つこ
とが必要である。
【０００４】しかしながら、コンドロイチン硫酸及びヘ
パラン硫酸はプロテオグリカンの構成成分であり、タン
パク質との共有結合体として存在するためにヒアルロン
酸と異なり抗原性が強いため、モノクローナル抗体の作
製が容易に行い得たと考えられる。
パラン硫酸はプロテオグリカンの構成成分であり、タン
パク質との共有結合体として存在するためにヒアルロン
酸と異なり抗原性が強いため、モノクローナル抗体の作
製が容易に行い得たと考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、生体内
においてヒアルロン酸ナトリウムは、硝子体、関節液及
び皮膚等の広範囲に分布するものの、通常タンパク質と
の共有結合体として存在しないため、従来法によって
は、未だモノクローナル抗体は得られていない。
においてヒアルロン酸ナトリウムは、硝子体、関節液及
び皮膚等の広範囲に分布するものの、通常タンパク質と
の共有結合体として存在しないため、従来法によって
は、未だモノクローナル抗体は得られていない。
【０００６】そのため、ヒアルロン酸に関する生理的役
割には未知の部分が多い。本発明は前記従来技術の課題
に鑑み、ヒアルロン酸ナトリウムに対するモノクローナ
ル抗体を得ることを目的とする。
割には未知の部分が多い。本発明は前記従来技術の課題
に鑑み、ヒアルロン酸ナトリウムに対するモノクローナ
ル抗体を得ることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】前記従来技術の課題に鑑
み本発明者らが鋭意検討を行った結果、免疫原として低
分子化したヒアルロン酸ナトリウムにホスファチジルエ
タノールアミン等のリン脂質あるいはタンパク質を共有
結合させて、共有結合体を形成したものを用い、これを
抗原としてマウスに抗体産生細胞を形成させ、これとマ
ウスミエローマ細胞と融合細胞がヒアルロン酸ナトリウ
ムを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するこ
とを見出し本発明の完成に至った。
み本発明者らが鋭意検討を行った結果、免疫原として低
分子化したヒアルロン酸ナトリウムにホスファチジルエ
タノールアミン等のリン脂質あるいはタンパク質を共有
結合させて、共有結合体を形成したものを用い、これを
抗原としてマウスに抗体産生細胞を形成させ、これとマ
ウスミエローマ細胞と融合細胞がヒアルロン酸ナトリウ
ムを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するこ
とを見出し本発明の完成に至った。
【０００８】すなわち、本発明のモノクローナル抗体
は、低分子化されたヒアルロン酸ナトリウムにタンパク
質ないしリン脂質を導入して共有結合体を形成し、これ
を抗原としてマウスを免疫して得られる抗体産生細胞と
マウスミエローマ細胞との融合細胞が産生し、ヒアルロ
ン酸ナトリウムを認識することを特徴とする。
は、低分子化されたヒアルロン酸ナトリウムにタンパク
質ないしリン脂質を導入して共有結合体を形成し、これ
を抗原としてマウスを免疫して得られる抗体産生細胞と
マウスミエローマ細胞との融合細胞が産生し、ヒアルロ
ン酸ナトリウムを認識することを特徴とする。
【０００９】また、本発明のモノクローナル抗体の製造
方法は、低分子化されたヒアルロン酸ナトリウムにタン
パク質ないしリン脂質を導入して共有結合体を形成し、
これを抗原としてマウスを免疫して得られる抗体産生細
胞とマウスミエローマ細胞との融合細胞が産生し、ヒア
ルロン酸ナトリウムを認識することを特徴とする。
方法は、低分子化されたヒアルロン酸ナトリウムにタン
パク質ないしリン脂質を導入して共有結合体を形成し、
これを抗原としてマウスを免疫して得られる抗体産生細
胞とマウスミエローマ細胞との融合細胞が産生し、ヒア
ルロン酸ナトリウムを認識することを特徴とする。
【００１０】なお、モノクローナル抗体の製造にあた
り、共有結合体として導入されるリン脂質としては、ホ
スファチジルエタノールアミン又はホスファチジルセリ
ンのいずれかであることが好ましい。また、共有結合体
として導入されるタンパク質としては、ヘモシアニンで
あることが好ましい。
り、共有結合体として導入されるリン脂質としては、ホ
スファチジルエタノールアミン又はホスファチジルセリ
ンのいずれかであることが好ましい。また、共有結合体
として導入されるタンパク質としては、ヘモシアニンで
あることが好ましい。
【００１１】以下、本発明の構成についてさらに詳細に
説明する。本発明のモノクローナル抗体は、ヒアルロン
酸ナトリウムを低分子化し、これにリン脂質又はタンパ
ク質を導入した共有結合体を抗原としてほ乳動物を免疫
し、得られた抗体産生細胞を継代培養可能なミエローマ
細胞と融合してハイブリドーマを形成させ、このハイブ
リドーマの中から目的のモノクローナル抗体のみを産生
する細胞を選抜し、この細胞を抗体を産生する条件下
で、大量に培養することにより製造される。
説明する。本発明のモノクローナル抗体は、ヒアルロン
酸ナトリウムを低分子化し、これにリン脂質又はタンパ
ク質を導入した共有結合体を抗原としてほ乳動物を免疫
し、得られた抗体産生細胞を継代培養可能なミエローマ
細胞と融合してハイブリドーマを形成させ、このハイブ
リドーマの中から目的のモノクローナル抗体のみを産生
する細胞を選抜し、この細胞を抗体を産生する条件下
で、大量に培養することにより製造される。
【００１２】本発明で免疫原としては、低分子化したヒ
アルロン酸ナトリウムとリン脂質又はタンパク質を共有
結合し、当該共有結合体をリポソームに導入したものを
用いる。本発明においてヒアルロン酸ナトリウムを低分
子化する方法としては、以下の方法が挙げられる。すな
わち、高分子ヒアルロン酸ナトリウムを酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、これに牛睾丸由来のヒ
アルロニダーゼを加え、３７℃にて一晩消化させる。こ
れに終濃度が１％（ｗ／ｖ）となる様に酢酸ナトリウム
を添加後、アセトン沈澱法により低分子ヒアルロン酸ナ
トリウムを沈澱析出することにより得ることが可能であ
る。
アルロン酸ナトリウムとリン脂質又はタンパク質を共有
結合し、当該共有結合体をリポソームに導入したものを
用いる。本発明においてヒアルロン酸ナトリウムを低分
子化する方法としては、以下の方法が挙げられる。すな
わち、高分子ヒアルロン酸ナトリウムを酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、これに牛睾丸由来のヒ
アルロニダーゼを加え、３７℃にて一晩消化させる。こ
れに終濃度が１％（ｗ／ｖ）となる様に酢酸ナトリウム
を添加後、アセトン沈澱法により低分子ヒアルロン酸ナ
トリウムを沈澱析出することにより得ることが可能であ
る。
【００１３】本発明においてヒアルロン酸ナトリウムと
リン脂質又はタンパク質の共有結合体を形成する方法と
しては、まず、ヒアルロン酸ナトリウムをアルデヒド化
し、これとリン脂質又はタンパク質を共有結合させる方
法が挙げられる。ここで共有結合させるリン脂質として
は、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジ
ルセリンが好ましい。また、共有結合させるタンパク質
としては、やや脂溶性を示すヘモシアニンが好ましい。
リン脂質又はタンパク質の共有結合体を形成する方法と
しては、まず、ヒアルロン酸ナトリウムをアルデヒド化
し、これとリン脂質又はタンパク質を共有結合させる方
法が挙げられる。ここで共有結合させるリン脂質として
は、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジ
ルセリンが好ましい。また、共有結合させるタンパク質
としては、やや脂溶性を示すヘモシアニンが好ましい。
【００１４】ヒアルロン酸ナトリウムとリン脂質又はタ
ンパク質を共有結合させる具体的方法としては、すなわ
ち、低分子化したヒアルロン酸ナトリウムを５０ｍＭホ
ウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解後、水素化
ホウ素ナトリウムを加えて室温で反応させることによ
り、還元末端のＧｌｃＮＡｃを糖アルコールとした。ア
セトンを加えることにより過剰の水素化ホウ素ナトリウ
ムを分解させると同時に、ヒアルロン酸糖アルコールを
沈澱させる。得られたヒアルロン酸糖アルコールをイミ
ダゾール緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解後、過ヨウ素酸ナ
トリウムを加え０℃で反応させることにより、ヒアルロ
ン酸ナトリウムに安定にアルデヒド基を導入することが
可能である。
ンパク質を共有結合させる具体的方法としては、すなわ
ち、低分子化したヒアルロン酸ナトリウムを５０ｍＭホ
ウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解後、水素化
ホウ素ナトリウムを加えて室温で反応させることによ
り、還元末端のＧｌｃＮＡｃを糖アルコールとした。ア
セトンを加えることにより過剰の水素化ホウ素ナトリウ
ムを分解させると同時に、ヒアルロン酸糖アルコールを
沈澱させる。得られたヒアルロン酸糖アルコールをイミ
ダゾール緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解後、過ヨウ素酸ナ
トリウムを加え０℃で反応させることにより、ヒアルロ
ン酸ナトリウムに安定にアルデヒド基を導入することが
可能である。
【００１５】さらに、アルデヒド基を導入したヒアルロ
ン酸ナトリウムとリン脂質又はタンパク質を共有結合さ
せ、共有結合体を形成する。当該共有結合体は以下の方
法により製造することが可能である。すなわち、アルデ
ヒド基を導入したヒアルロン酸ナトリウムを蒸留水に溶
解させ、ホスファチジルエタノールアミンを溶解させた
エタノールと混和し、３０分間攪拌することにより、ア
ルデヒド基とアミノ基の間でシッフ塩基を生成させる。
続いて、これにシアノ水素化ホウ素化ナトリウムを加え
て７時間攪拌後、水素化ホウ素化ナトリウムを加え、一
晩攪拌することにより、シッフ塩基を還元し、安定な共
有結合体を得た。結合体は、エタノール沈澱することに
より析出することができる。ホスファチジルエタノール
アミンのヒアルロン酸ナトリウムへの導入は、リンモリ
ブデン試薬（Ｐ．Ｒ．Ｇｅｎｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ，２０６，２００（１９８
１））を用いスポット法にて確認可能である。
ン酸ナトリウムとリン脂質又はタンパク質を共有結合さ
せ、共有結合体を形成する。当該共有結合体は以下の方
法により製造することが可能である。すなわち、アルデ
ヒド基を導入したヒアルロン酸ナトリウムを蒸留水に溶
解させ、ホスファチジルエタノールアミンを溶解させた
エタノールと混和し、３０分間攪拌することにより、ア
ルデヒド基とアミノ基の間でシッフ塩基を生成させる。
続いて、これにシアノ水素化ホウ素化ナトリウムを加え
て７時間攪拌後、水素化ホウ素化ナトリウムを加え、一
晩攪拌することにより、シッフ塩基を還元し、安定な共
有結合体を得た。結合体は、エタノール沈澱することに
より析出することができる。ホスファチジルエタノール
アミンのヒアルロン酸ナトリウムへの導入は、リンモリ
ブデン試薬（Ｐ．Ｒ．Ｇｅｎｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ，２０６，２００（１９８
１））を用いスポット法にて確認可能である。
【００１６】本発明においては、前記方法により得られ
たヒアルロン酸ナトリウム・ホスファチジルエタノール
アミン共有結合体をリポソーム化してほ乳動物に免疫し
て抗体産生細胞を得る。
たヒアルロン酸ナトリウム・ホスファチジルエタノール
アミン共有結合体をリポソーム化してほ乳動物に免疫し
て抗体産生細胞を得る。
【００１７】通常免疫原をリポソーム化するには、Ｗａ
ｔａｒａｉ等の方法に従い、免疫原をクロロホルム／メ
タノール＝２／１（Ｖ／Ｖ）に溶解する。しかしなが
ら、本発明の免疫原であるヒアルロン酸・リン脂質ない
しタンパク質共有結合体は、クロロホルム／メタノール
＝２／１、１／１、１／２及びクロロホルムのみ、メタ
ノールのみのいずれの溶媒にも熔解せず通常の方法によ
りリポソーム化することができず、リン酸緩衝液にのみ
溶解したので具体的には以下の方法により、リポソーム
化を行った。
ｔａｒａｉ等の方法に従い、免疫原をクロロホルム／メ
タノール＝２／１（Ｖ／Ｖ）に溶解する。しかしなが
ら、本発明の免疫原であるヒアルロン酸・リン脂質ない
しタンパク質共有結合体は、クロロホルム／メタノール
＝２／１、１／１、１／２及びクロロホルムのみ、メタ
ノールのみのいずれの溶媒にも熔解せず通常の方法によ
りリポソーム化することができず、リン酸緩衝液にのみ
溶解したので具体的には以下の方法により、リポソーム
化を行った。
【００１８】すなわち、コレステロール、レシチン、Ｌ
ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅをクロロホルム／
メタノール＝２／１（Ｖ／Ｖ）に溶解したものをなし型
フラスコにとり、よく混和した後、ロータリーエバボレ
ーターを用いて溶媒を留去する。さらに、クロロホルム
で均一にした後、同様に溶媒を留去し、フラスコ内にフ
ィルムを形成させる。真空ポンプで吸引して完全に溶媒
を取り除いた後で、リン酸緩衝液に溶解したヒアルロン
酸ナトリウム・ホスファチジルエタノールアミン共有結
合体を添加し、室温で超音波処理することによりヒアル
ロン酸ナトリウム・ホスファチジルエタノールアミン・
リポソーム溶液を作製する。
ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅをクロロホルム／
メタノール＝２／１（Ｖ／Ｖ）に溶解したものをなし型
フラスコにとり、よく混和した後、ロータリーエバボレ
ーターを用いて溶媒を留去する。さらに、クロロホルム
で均一にした後、同様に溶媒を留去し、フラスコ内にフ
ィルムを形成させる。真空ポンプで吸引して完全に溶媒
を取り除いた後で、リン酸緩衝液に溶解したヒアルロン
酸ナトリウム・ホスファチジルエタノールアミン共有結
合体を添加し、室温で超音波処理することによりヒアル
ロン酸ナトリウム・ホスファチジルエタノールアミン・
リポソーム溶液を作製する。
【００１９】本発明で免疫される動物は豚、牛、マウ
ス、ラット等、人以外の動物であればなんでも良いが、
抗体産生細胞の相手となるミエローマ細胞がマウス由来
のものであるため、特にマウスがよい。上記方法により
調整したヒアルロン酸ナトリウム・ホスファチジルエタ
ノールアミン・リポソーム溶液等をほ乳動物に腹腔内注
射することにより免疫を行う。注射方法はこれに限ら
ず、皮下注射、静脈注射でも良い。ほ乳動物は必要に応
じて追加免疫される。
ス、ラット等、人以外の動物であればなんでも良いが、
抗体産生細胞の相手となるミエローマ細胞がマウス由来
のものであるため、特にマウスがよい。上記方法により
調整したヒアルロン酸ナトリウム・ホスファチジルエタ
ノールアミン・リポソーム溶液等をほ乳動物に腹腔内注
射することにより免疫を行う。注射方法はこれに限ら
ず、皮下注射、静脈注射でも良い。ほ乳動物は必要に応
じて追加免疫される。
【００２０】最終免疫の３日後に免疫されたほ乳動物か
ら抗体を生産するリンパ球を含む脾臓を摘出する。摘出
する組織はリンパ節などの抹消リンパ系組織ならどこで
もよい。得られた組織から例えば免疫実験操作方法Ｂ
（１９７４年日本免疫学会発酵２５３頁）に記載されて
いる方法によりリンパ球が単細胞として分離される。
ら抗体を生産するリンパ球を含む脾臓を摘出する。摘出
する組織はリンパ節などの抹消リンパ系組織ならどこで
もよい。得られた組織から例えば免疫実験操作方法Ｂ
（１９７４年日本免疫学会発酵２５３頁）に記載されて
いる方法によりリンパ球が単細胞として分離される。
【００２１】次にこのリンパ球が半永久的に継代し得る
ように増殖能を与える。方法としては、Ｅ．Ｂ．−ｖｉ
ｒｕｓやＡｂｅｌｓｏｍ−ｖｉｒｕｓ等のウイルスにリ
ンパ球を感染させ、形質転換させる方法、仙台ウイルス
やポリエチレングリコール存在下、ある種の癌細胞と細
胞融合させる方法等がある。
ように増殖能を与える。方法としては、Ｅ．Ｂ．−ｖｉ
ｒｕｓやＡｂｅｌｓｏｍ−ｖｉｒｕｓ等のウイルスにリ
ンパ球を感染させ、形質転換させる方法、仙台ウイルス
やポリエチレングリコール存在下、ある種の癌細胞と細
胞融合させる方法等がある。
【００２２】安定した抗体を続けて産生させるために、
同じマウスでも同種のマウス由来の癌細胞、例えばマウ
スミエローマ細胞がリンパ球の相手として用いられる。
実際の細胞融合の手法は、一般的にＪ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，３９，２８５〜３０８（１９８０）
に記載された方法に準ずる。すなわち上記二種の細胞の
融合は、ポリエチレングリコール存在下で行い、ハイブ
リドーマのみ成育可能なＨＡＴ培地（ここではヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）で成育さ
れる。ハイブリドーマのコロニーが確認できるようにな
ったらその培養液中の抗体をスクリーニングする。スク
リーニングの方法としては例えばＥＬＩＳＡ法が挙げら
れる。
同じマウスでも同種のマウス由来の癌細胞、例えばマウ
スミエローマ細胞がリンパ球の相手として用いられる。
実際の細胞融合の手法は、一般的にＪ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，３９，２８５〜３０８（１９８０）
に記載された方法に準ずる。すなわち上記二種の細胞の
融合は、ポリエチレングリコール存在下で行い、ハイブ
リドーマのみ成育可能なＨＡＴ培地（ここではヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）で成育さ
れる。ハイブリドーマのコロニーが確認できるようにな
ったらその培養液中の抗体をスクリーニングする。スク
リーニングの方法としては例えばＥＬＩＳＡ法が挙げら
れる。
【００２３】目的の抗体を産生するハイブリドーマは、
制限希釈法を繰り返すことにより最終的に単一のハイブ
リドーマ（クローンと呼ぶ）からなるコロニーを得るこ
とができる。クローンを作るモノクローナル抗体は細胞
培養液から分離精製することができる。これらは抗体に
さらに塩析、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティーク
ロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的一般的手法を
適宜組み合わせて精製することができる。
制限希釈法を繰り返すことにより最終的に単一のハイブ
リドーマ（クローンと呼ぶ）からなるコロニーを得るこ
とができる。クローンを作るモノクローナル抗体は細胞
培養液から分離精製することができる。これらは抗体に
さらに塩析、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティーク
ロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的一般的手法を
適宜組み合わせて精製することができる。
【００２４】
【実施例】以下、本発明に好適な実施例をさらに詳細に
説明する。なお、本発明は本実施例に限定されるもので
はない。
説明する。なお、本発明は本実施例に限定されるもので
はない。
【００２５】実施例１ ａ）ヒアルロン酸ナトリウム抗原の作製 低分子ヒアルロン酸ナトリウムの調製 高分子ヒアルロン酸ナトリウム（分子量１２０万（１２
００ｋＤａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐ
ｉｄｅｍｉｃｕｓ（（株）資生堂製）を用い発酵法によ
り調製）１ｇを１００ｍｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．０）に溶解した。続いて終濃度が６０Ｕ／ｍｌとな
るように牛睾丸由来のヒアルロニダーゼ（シグマ社製）
を加えて、３７℃で一晩消化させた。１００℃で、１０
分間加熱して酵素を失活させた後、遠心分離により沈澱
を除去した。次に１％（ｗ／ｖ）の濃度に酢酸ナトリウ
ムを加えた後、アセトン沈澱法によりヒアルロン酸ナト
リウムを分別沈澱させた。すなわち、ヒアルロン酸ナト
リウム溶液を攪拌しながら、アセトンを徐々に適下し、
沈澱が生じたところで、沈澱を遠心分離し画分１とし
た。上清には沈澱が生成しなくなるまでさらにアセトン
を徐々に適下し、沈澱を遠心分離し画分２とした。沈澱
はアセトン洗浄後、真空乾燥して白色粉末を得た。収量
は、画分１が約６５０ｍｇ、画分２が３００ｍｇであっ
た。Ｌａｕｒｅｎｔ等の式（Ｌａｕｒｅｎｔ ｅｔ ａ
ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．４
２、４７６−４８５（１９６０））から求めた粘度平均
分子量は画分１が１３．５ｋＤａ、画分２が５．５ｋＤ
ａであった。
００ｋＤａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐ
ｉｄｅｍｉｃｕｓ（（株）資生堂製）を用い発酵法によ
り調製）１ｇを１００ｍｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．０）に溶解した。続いて終濃度が６０Ｕ／ｍｌとな
るように牛睾丸由来のヒアルロニダーゼ（シグマ社製）
を加えて、３７℃で一晩消化させた。１００℃で、１０
分間加熱して酵素を失活させた後、遠心分離により沈澱
を除去した。次に１％（ｗ／ｖ）の濃度に酢酸ナトリウ
ムを加えた後、アセトン沈澱法によりヒアルロン酸ナト
リウムを分別沈澱させた。すなわち、ヒアルロン酸ナト
リウム溶液を攪拌しながら、アセトンを徐々に適下し、
沈澱が生じたところで、沈澱を遠心分離し画分１とし
た。上清には沈澱が生成しなくなるまでさらにアセトン
を徐々に適下し、沈澱を遠心分離し画分２とした。沈澱
はアセトン洗浄後、真空乾燥して白色粉末を得た。収量
は、画分１が約６５０ｍｇ、画分２が３００ｍｇであっ
た。Ｌａｕｒｅｎｔ等の式（Ｌａｕｒｅｎｔ ｅｔ ａ
ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．４
２、４７６−４８５（１９６０））から求めた粘度平均
分子量は画分１が１３．５ｋＤａ、画分２が５．５ｋＤ
ａであった。
【００２６】ヒアルロン酸アルデヒドの調製 上記方法により得られた分子量５．５ｋＤａのヒアルロ
ン酸ナトリウム（画分２）１５０ｍｇを５ｍｌの５０ｍ
Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解後、１
０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを加えて室温で６時間
させることにより、還元末端のＧｌｃＮＡｃを糖アルコ
ールとした。５０ｍｌのアセトンを加えることにより過
剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解させると同時に、ヒ
アルロン酸糖アルコールを沈澱させた。ヒアルロン酸糖
アルコールは、アセトン沈澱法により白色粉末として得
られた。収量は１５０ｍｇであった。
ン酸ナトリウム（画分２）１５０ｍｇを５ｍｌの５０ｍ
Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解後、１
０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを加えて室温で６時間
させることにより、還元末端のＧｌｃＮＡｃを糖アルコ
ールとした。５０ｍｌのアセトンを加えることにより過
剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解させると同時に、ヒ
アルロン酸糖アルコールを沈澱させた。ヒアルロン酸糖
アルコールは、アセトン沈澱法により白色粉末として得
られた。収量は１５０ｍｇであった。
【００２７】得られたヒアルロン酸糖アルコール１００
ｍｇを５ｍｌのイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．５）に溶
解後、３０ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを加え０℃で１
時間反応させることにより、安定なヒアルロン酸ナトリ
ウムを得た。ヒアルロン酸アルデヒドは、エタノール沈
澱法により白色粉末とした後、窒素気流下で保存した。
収量は９５ｍｇであった。
ｍｇを５ｍｌのイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．５）に溶
解後、３０ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを加え０℃で１
時間反応させることにより、安定なヒアルロン酸ナトリ
ウムを得た。ヒアルロン酸アルデヒドは、エタノール沈
澱法により白色粉末とした後、窒素気流下で保存した。
収量は９５ｍｇであった。
【００２８】ヒアルロン酸・ホスファチジルエタノー
ルアミン共有結合体の合成 上記方法により得られたヒアルロン酸アルデヒド１０ｍ
ｇを４ｍｌの蒸留水に溶解させ、１５ｍｇのホスファチ
ジルエタノールアミンを溶解させたエタノール２ｍｌと
混和し、３０分間攪拌することにより、アルデヒド基と
アミノ基の間でシッフ塩基を生成させた。続いて、２０
０ｍｇのシアノ水素化ホウ素化ナトリウムを加えて７時
間攪拌後、５０ｍｇの水素化ホウ素化ナトリウムを加
え、一晩攪拌することにより、シッフ塩基を還元し、安
定な共有結合体を得た。結合体は、エタノール沈澱する
ことにより微黄色の粉末とした（収量約９．５ｍｇ）。
ホスファチジルエタノールアミンのヒアルロン酸への導
入は、リンモリブデン試薬（Ｐ．Ｒ．Ｇｅｎｔｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ，２０６，２０
０（１９８１））を用いスポット法にて確認した。
ルアミン共有結合体の合成 上記方法により得られたヒアルロン酸アルデヒド１０ｍ
ｇを４ｍｌの蒸留水に溶解させ、１５ｍｇのホスファチ
ジルエタノールアミンを溶解させたエタノール２ｍｌと
混和し、３０分間攪拌することにより、アルデヒド基と
アミノ基の間でシッフ塩基を生成させた。続いて、２０
０ｍｇのシアノ水素化ホウ素化ナトリウムを加えて７時
間攪拌後、５０ｍｇの水素化ホウ素化ナトリウムを加
え、一晩攪拌することにより、シッフ塩基を還元し、安
定な共有結合体を得た。結合体は、エタノール沈澱する
ことにより微黄色の粉末とした（収量約９．５ｍｇ）。
ホスファチジルエタノールアミンのヒアルロン酸への導
入は、リンモリブデン試薬（Ｐ．Ｒ．Ｇｅｎｔｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ，２０６，２０
０（１９８１））を用いスポット法にて確認した。
【００２９】ヒアルロン酸・ヘモシアニン共有結合体
の合成 ヒアルロン酸アルデヒド１０ｍｇ及びヘモシアニン１０
０ｍｇ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔｓ由来、シグマ
社製）を４ｍｌの蒸留水に溶解させ、室温で３０分間攪
拌させることによりシッフ塩基を形成させた。以下、ヒ
アルロン酸・ホスファチジルエタノールアミン共有結合
体の場合と同様の方法によりヒアルロン酸・ヘモシアニ
ン共有結合体を合成した。結合はアセトン沈澱法によ
り、淡赤色の粉末とした（収量１２ｍｇ）。なお、遊離
のヘモシアニンは、本アセトン沈澱法の条件下で除去さ
れることは確認済みである。
の合成 ヒアルロン酸アルデヒド１０ｍｇ及びヘモシアニン１０
０ｍｇ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔｓ由来、シグマ
社製）を４ｍｌの蒸留水に溶解させ、室温で３０分間攪
拌させることによりシッフ塩基を形成させた。以下、ヒ
アルロン酸・ホスファチジルエタノールアミン共有結合
体の場合と同様の方法によりヒアルロン酸・ヘモシアニ
ン共有結合体を合成した。結合はアセトン沈澱法によ
り、淡赤色の粉末とした（収量１２ｍｇ）。なお、遊離
のヘモシアニンは、本アセトン沈澱法の条件下で除去さ
れることは確認済みである。
【００３０】ｂ）モノクローナル抗体の作製 ヒアルロン酸−ホスファチジルエタノールアミン（以
下、ＨＡ−ＰＥという）を免疫するにあたり、ＨＡ−Ｐ
Ｅをリポソーム化してマウスの腹腔内に投与する方法を
用いた。
下、ＨＡ−ＰＥという）を免疫するにあたり、ＨＡ−Ｐ
Ｅをリポソーム化してマウスの腹腔内に投与する方法を
用いた。
【００３１】免疫方法 通常免疫原リポソームを作製する場合、Ｗａｔａｒａｉ
等の方法に従い、免疫原などをクロロホルム／メタノー
ル＝２／１（Ｖ／Ｖ）に溶解する。しかし今回の免疫原
であるＨＡ−ＰＥはクロロホルム／メタノール＝２／
１、１／１、１／２、及びクロロホルムのみ、メタノー
ルのみ、のいずれの溶媒にも溶解せず、リン酸緩衝液
（以下、ＰＢＳという）にのみ溶解したので以下の方法
により免疫を行った。
等の方法に従い、免疫原などをクロロホルム／メタノー
ル＝２／１（Ｖ／Ｖ）に溶解する。しかし今回の免疫原
であるＨＡ−ＰＥはクロロホルム／メタノール＝２／
１、１／１、１／２、及びクロロホルムのみ、メタノー
ルのみ、のいずれの溶媒にも溶解せず、リン酸緩衝液
（以下、ＰＢＳという）にのみ溶解したので以下の方法
により免疫を行った。
【００３２】コレステロール０．５μＭ、レシチン０．
５μＭ、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（以
下、ＬＰＳという）１０．０μｇを５００μｌのクロロ
ホルム／メタノール＝２／１（Ｖ／Ｖ）に溶解したもの
を５０ｍｌのナシ型フラスコにとりよく混和した後、３
７℃でロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し
た。さらにもう一度クロロホルム１ｍｌで均一にした
後、同様に溶媒を留去し、フラスコ内部にフィルムを形
成させた。真空ポンプで、３時間吸引して完全に溶媒を
除いた後、ＰＢＳに溶解したＨＡ−ＰＥを２５ｎＭ加
え、室温で５分間超音波処理することにより、ＨＡ−Ｐ
Ｅリポソーム液（免疫１回、１匹分）を作製した。この
リポソーム液をＢＡＬＢ／Ｃマウス（リタイヤ、メス）
に腹腔内注射して、免疫を行った。初回免疫から３日後
に２度目の免疫、さらにその３日後に３度目の免疫を
し、その３日後にマウスから脾臓を抽出してマウスミエ
ローマ細胞と融合を行った。
５μＭ、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（以
下、ＬＰＳという）１０．０μｇを５００μｌのクロロ
ホルム／メタノール＝２／１（Ｖ／Ｖ）に溶解したもの
を５０ｍｌのナシ型フラスコにとりよく混和した後、３
７℃でロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し
た。さらにもう一度クロロホルム１ｍｌで均一にした
後、同様に溶媒を留去し、フラスコ内部にフィルムを形
成させた。真空ポンプで、３時間吸引して完全に溶媒を
除いた後、ＰＢＳに溶解したＨＡ−ＰＥを２５ｎＭ加
え、室温で５分間超音波処理することにより、ＨＡ−Ｐ
Ｅリポソーム液（免疫１回、１匹分）を作製した。この
リポソーム液をＢＡＬＢ／Ｃマウス（リタイヤ、メス）
に腹腔内注射して、免疫を行った。初回免疫から３日後
に２度目の免疫、さらにその３日後に３度目の免疫を
し、その３日後にマウスから脾臓を抽出してマウスミエ
ローマ細胞と融合を行った。
【００３３】免疫結果 ＢＡＬＢ／Ｃマウスについて、第２回目の免疫日である
３日目と、第３回目の免疫日である６日目に眼底採血を
して血清中のポリクローナル抗体の力価をＥＬＩＳＡ法
（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂ
ｅｎｔ Ａｓｓａｙ）で測定した。ＥＬＩＳＡは、Ｈｉ
ｇａｓｈｉ等の方法を基本にして行った。Ｌｉｎｂｒｏ
９６ ウェルマイクロタイトレーションプレート（Ｆ
ｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ．）の各ウェ
ルに抗原液（ＨＡ−ＰＥを蒸留水に溶解したもの）５０
μｌ加えた。
３日目と、第３回目の免疫日である６日目に眼底採血を
して血清中のポリクローナル抗体の力価をＥＬＩＳＡ法
（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂ
ｅｎｔ Ａｓｓａｙ）で測定した。ＥＬＩＳＡは、Ｈｉ
ｇａｓｈｉ等の方法を基本にして行った。Ｌｉｎｂｒｏ
９６ ウェルマイクロタイトレーションプレート（Ｆ
ｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ．）の各ウェ
ルに抗原液（ＨＡ−ＰＥを蒸留水に溶解したもの）５０
μｌ加えた。
【００３４】細胞融合には、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを用い
た。ＥＬＩＳＡ法による力価測定では、免疫したマウス
はコントロールとして用いた免疫前に採血した血清と血
清中のポリクローナル抗体の力価との間に比較的大きな
差異が見られた。 スクリーニング
た。ＥＬＩＳＡ法による力価測定では、免疫したマウス
はコントロールとして用いた免疫前に採血した血清と血
清中のポリクローナル抗体の力価との間に比較的大きな
差異が見られた。 スクリーニング
【００３５】細胞融合後、８日目から顕微鏡によるコロ
ニー形成ウェルの検鏡を行い、９日目に９６ウェルカル
チャープレート中で維持されている各融合細胞から産生
される抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた。抗原
溶液は、ＨＡ−ＰＥ ２ｎＭを蒸留水に溶解したものを
用いた。コントロールとしては、リポソーム＋ヒアルロ
ン酸、コレステロールを用いた。結果を図１に示す。
ニー形成ウェルの検鏡を行い、９日目に９６ウェルカル
チャープレート中で維持されている各融合細胞から産生
される抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法により調べた。抗原
溶液は、ＨＡ−ＰＥ ２ｎＭを蒸留水に溶解したものを
用いた。コントロールとしては、リポソーム＋ヒアルロ
ン酸、コレステロールを用いた。結果を図１に示す。
【００３６】図に示したとおり、コロニーＮｏ２は、ヒ
アルロン酸ナトリウムに強く反応するものの、コントロ
ールとして用いたコレステロールやリポソーム＋ヒアル
ロン酸にも反応しており、これら全てを認識するポリク
ローナル抗体が得られたものと思われる。一方。コロニ
ーＮｏ７では、コレステロールに反応を示さず、ヒアル
ロン酸ナトリウムに比較的高い反応を示すおそらくモノ
クローナル抗体と思われる抗体が得られた。従って、本
方法によればヒアルロン酸に対するモノクローナル抗体
が作製可能である。
アルロン酸ナトリウムに強く反応するものの、コントロ
ールとして用いたコレステロールやリポソーム＋ヒアル
ロン酸にも反応しており、これら全てを認識するポリク
ローナル抗体が得られたものと思われる。一方。コロニ
ーＮｏ７では、コレステロールに反応を示さず、ヒアル
ロン酸ナトリウムに比較的高い反応を示すおそらくモノ
クローナル抗体と思われる抗体が得られた。従って、本
方法によればヒアルロン酸に対するモノクローナル抗体
が作製可能である。
【００３７】
【発明の効果】以上説明したように、本発明のモノクロ
ーナル抗体は、ヒアルロン酸を良好に認識することが可
能である。また、本発明のモノクローナル抗体の製造方
法によれば、ヒアルロン酸を低分子化し、これと脂溶性
成分の共有結合体を形成し、当該共有結合体のリポソー
ムへの導入を可能とし、これを抗原としてマウスを免疫
することにより、ヒアルロン酸ナトリウムに対するモノ
クローナル抗体を製造することが可能である。
ーナル抗体は、ヒアルロン酸を良好に認識することが可
能である。また、本発明のモノクローナル抗体の製造方
法によれば、ヒアルロン酸を低分子化し、これと脂溶性
成分の共有結合体を形成し、当該共有結合体のリポソー
ムへの導入を可能とし、これを抗原としてマウスを免疫
することにより、ヒアルロン酸ナトリウムに対するモノ
クローナル抗体を製造することが可能である。
【図１】本発明により得られた抗体を用いたスクリーニ
ングの説明図である。
ングの説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (6)
- 【請求項１】 低分子化させたヒアルロン酸ナトリウム
にタンパク質ないしリン脂質を導入して共有結合体を形
成し、これを抗原としてマウスを免疫して得られる抗体
産生細胞とマウスミエローマ細胞との融合細胞が産生
し、ヒアルロン酸ナトリウムを認識することを特徴とす
るモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 請求項１記載のモノクローナル抗体にお
いて、共有結合体として導入されるリン脂質がホスファ
チジルエタノールアミン又はホスファチジルセリンのい
ずれかであることを特徴とするモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 請求項１記載のモノクローナル抗体にお
いて、共有結合体として導入されるタンパク質がヘモシ
アニンであることを特徴とするモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 低分子化させたヒアルロン酸ナトリウム
にタンパク質ないしリン脂質を導入して共有結合体を形
成し、これを抗原としてマウスを免疫して得られる抗体
産生細胞とマウスミエローマ細胞との融合細胞が産生
し、ヒアルロン酸ナトリウムを認識することを特徴とす
るモノクローナル抗体の製造方法。 - 【請求項５】 請求項４記載のモノクローナル抗体にお
いて、共有結合体として導入されるリン脂質がホスファ
チジルエタノールアミン又はホスファチジルセリンのい
ずれかであることを特徴とするモノクローナル抗体の製
造方法。 - 【請求項６】 請求項４記載のモノクローナル抗体にお
いて、共有結合体として導入されるタンパク質がヘモシ
アニンであることを特徴とするモノクローナル抗体の製
造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7180698A JPH0912600A (ja) | 1995-06-22 | 1995-06-22 | ヒアルロン酸ナトリウムに対するモノクローナル抗体及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7180698A JPH0912600A (ja) | 1995-06-22 | 1995-06-22 | ヒアルロン酸ナトリウムに対するモノクローナル抗体及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0912600A true JPH0912600A (ja) | 1997-01-14 |
Family
ID=16087754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7180698A Pending JPH0912600A (ja) | 1995-06-22 | 1995-06-22 | ヒアルロン酸ナトリウムに対するモノクローナル抗体及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0912600A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000012122A3 (de) * | 1998-08-27 | 2000-06-22 | Universitaetsklinikum Freiburg | Niedermolekulare fragmente der hyaluronsäure zur herstellung von impfstoffen |
| WO2002092131A3 (en) * | 2001-05-11 | 2003-03-20 | Baxter Int | Immunogenic conjugates of low molecular weight hyaluronic acid with polypeptide toxins |
| EP1707578A3 (en) * | 2005-02-15 | 2006-10-18 | Collagen Nutraceuticals, Inc. | Preparation of low molecular weight hyaluronic acid as a food supplement |
| WO2008018519A1 (en) | 2006-08-08 | 2008-02-14 | Seikagaku Corporation | Method for determination of molecular weight of hyaluronic acid |
| WO2015152280A1 (ja) * | 2014-03-31 | 2015-10-08 | 生化学工業株式会社 | 抗コンドロイチン硫酸ｅ抗体 |
| CN106290614A (zh) * | 2016-07-27 | 2017-01-04 | 浙江景嘉医疗科技有限公司 | 一种医用透明质酸钠凝胶分子量和分子量分布系数的检测方法 |
-
1995
- 1995-06-22 JP JP7180698A patent/JPH0912600A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000012122A3 (de) * | 1998-08-27 | 2000-06-22 | Universitaetsklinikum Freiburg | Niedermolekulare fragmente der hyaluronsäure zur herstellung von impfstoffen |
| US6838086B1 (en) | 1998-08-27 | 2005-01-04 | Universitaetsklinikum Freiburg | Composition comprising low molecular weight hyaluronic acid fragments |
| WO2002092131A3 (en) * | 2001-05-11 | 2003-03-20 | Baxter Int | Immunogenic conjugates of low molecular weight hyaluronic acid with polypeptide toxins |
| EP1707578A3 (en) * | 2005-02-15 | 2006-10-18 | Collagen Nutraceuticals, Inc. | Preparation of low molecular weight hyaluronic acid as a food supplement |
| WO2008018519A1 (en) | 2006-08-08 | 2008-02-14 | Seikagaku Corporation | Method for determination of molecular weight of hyaluronic acid |
| WO2015152280A1 (ja) * | 2014-03-31 | 2015-10-08 | 生化学工業株式会社 | 抗コンドロイチン硫酸ｅ抗体 |
| US9745386B2 (en) | 2014-03-31 | 2017-08-29 | Seikagaku Corporation | Anti-chondroitin-sulfate-E antibody |
| CN106290614A (zh) * | 2016-07-27 | 2017-01-04 | 浙江景嘉医疗科技有限公司 | 一种医用透明质酸钠凝胶分子量和分子量分布系数的检测方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20021008 |