KR910000903B1

KR910000903B1 - 인체의 비-소 세포 폐암치료용 단클론의 항체 및 항원

Info

Publication number: KR910000903B1
Application number: KR1019860700419A
Authority: KR
Inventors: 헬스트롬 인개게르드; 피. 브라운 조셉; 에릭 헬스트롬 칼; 호른 다이안; 린슬리 피터
Original assignee: 온코겐 (합자회자); 브래들리 더블유. 시몬스
Priority date: 1984-11-02
Filing date: 1985-10-30
Publication date: 1991-02-12
Also published as: IE852681L; IE58590B1; FI85814B; EP0207090A4; GB2182949B; NZ214055A; ES548421A0; YU46386B; NO862690D0; WO1986002735A1; JPH0733400B2; PT81418B; EP0207090A1; GR852622B; PT81418A; GB2182949A; KR880700268A; DE3587976D1; FI862821A; JPH06340699A

Abstract

내용 없음.

Description

인체의 비-소 세포 폐암치료용 단클론의 항체 및 항원

본 출원은 미국출원 제667,521호의 계속출원의 일부이다(1984년 11월 2일 출원). 그 출원에 있는 사항중 본 발명에 없는 사항은 참고로 인용한다.

레네의 폐암은 남자의 암에 의한 사망의 주원인이 되며, 부인의 암에 의한 사망의 가장 빈번한 원인이 되는 유방암이 유발되는 과정이 된다(Cancer Facts and Figures, 1983). 이 질병은 예로서 유표피종(30

), 선암(35

) 대-세포 퇴행변화(15

) 및 소-세포퇴행변화(20

)와 같이 4개의 커다란 조직학적 형태로 분류된다. 폐암의 대부분의 경우는 화학요법이나 방사선요법으로 치유가 불가능하다. 소세포폐암은 그 크기의 축소에 의하여 화학요법이나 방사선요법으로 차도가 생기지만 완전히 치유되지는 않는다. 종양을 수술로 완전히 제거하는 것만이 유일한 효과적 요법으로 판명되었다. 그러나 불행이도 폐암환중 진단시 완전하게 진단되는 종양을 가지는 환자는 30

이하괴 되며, 이중에서 3분의 1이하가 모든 종양을 수술로 완전히 제거한 뒤 5년 생존하였다. 이로 인하여 폐암을 조기진단하여, 암의 확대된 정보를 정확하게 결정하고 보다 효과적인 요법을 취할 수 있게하는 방법이 절실히 요구된다.

이러한 모든 목적에 단클론(monoclonal)의 항체를 사용할 수 있다. 그러나, 정상성인의 조직에 보다는 폐암조직에 보다 강력하게 표현하는 하원에 대한 항체를 발견하는 일이 선행조건이 된다. 종양세포군의 공지된 이성체, 동일한 항원분자에 대한 여러가지 결점인자의 존재, 진단의 표시물로서의 적합성에 관련되는 항원을 치료학적표적에 비교할 때의 예상되는 차잇점 및 동일한 항원에 대한 다른 항체의 생물학적 차잇점의 견지에서 볼때, 다수의 상이한 항체가 필요하게 된다.

폐암항원에 대한 인체 단클론의 항체에 대하여 Sikora et al., Br. J. Cancer(1981) 43 : 696-700 ; Cuttitta et al., Proc. Hatl. Acad. Sic. U.S.A(1981) 78:459-4995 ; Varki et al., Cancer Research(1984) 44 : 681-687 ; Moody, T. W. et al., Science, (1981) 214. 1246-1248 ; Minna, J. D. ea al., In Vitro 17(12) : 1058-1070(12-1981) ; Kennel, A. J. et al., Cancer Research, 41(9, PT1) : 346-3470. Chem. Abst. 95(15) ; 1308502 ; Baylin, A.B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79-4650-4654(8-1982) ; Carney, D. N. et al., Pathobiology Annual 1982, 12 : 115-136(1982) : Gazdar, A. F. et al., Seminars in Oncology, 10 : 3-19(3-1983) ; Hollinshead, A. C. et al., Cancer Detec. Prevent., 6 : 185-191(1983) ; Mulshine, J. T. et., J. Immunol., 131(1) : 497-502(1983) ; Huang, L. C. et al., Arch. Bioch. Biophys., 220(1) : 318-320(1983) ; Saji, S. et al., Hybridoma, 3(2) : 119-130(1984), Bio. Abst. 79005569 ; Bosslet, K. et al., Behring Inst. Mitt., 74 : 27-34(1984), Chem. Abst. Ca101(9) : 70668 b ; Rosen, A. T. et al., Cancer Research, 44(5) : 2052-2061(1984), Bio. Abst. 79014658 ; Van Muijen, G. N. P. et al., Amer. J. Pathol., 116(3) : 363-369(1984), Bio. Abst. 79023605 ; Princler, G. J. et al., Cancer Research, 42 : 843-848(3-1982) ; Mazauric, T. et al., Cancer Research, 42 : 150-154(1-1982) ; Braatz, J. A. et al., Cancer Research, 42 : 849-855(3-1982) ; 및 Sobol, R.E. et al., Fed. Proc., 41(3) : 409 Abst, 816(4-1982)에 기술되어 있다.

사전에 정해진 특이성이 있는 항체를 분비하는 유합된 세포의 계속적인 배양에 관하여는 K

hler et al., Nature(1975) 265 : 495-497에 기술되어 있다. 종양의 항체를 생성하는 방법은 미국특허 제4,172,124호에 기술되어 있다.

본 발명의 인체의 비-소(非-小)세포 폐암(non-small cell lung carcinoma)(NSCLC)세포의 항원이 결정인자 위치를 정하는 신규의 항원 조성물과 단클론의 항체에 관한 것이다. "NSCLC 세포"란 용어는 유표피 암종세포, 신암세포 및 대세포의 퇴행변화된 암종세포를 포함한다. 또한 결정인자의 위치는 예로서 어떤 유방암과 같은 다른 암의 항원에서 발견되어 본 발명의 항체가 이러한 다른 암세포에도 결합한다. 단클론의 항체는 종양세포 보다는 정상성세포에 적은 정도로 결합된다. 이 "적은 정도로 결합한다"는 용어는 면역조직학적 기술로는 검출이 안되거나 면역조직학적으로 결정할 때 NSCLC 보다 4-5배나 적게 결합한다는 것을 의미한다. 단클론의 항체는 주의 하이부리도마에 의해서 분리된다.

본 발명은 또한 본 발명의 단클론의 항체나 항원 조성물을 이용하는 특정의 진단방법과 관련된다. 이 방법중 하나의 이러한 세포를 포함하는 것으로 의심이 가는 피검출속에 있는 NSCLC 세포의 존재의 결정인자를 포함한다. 피검출물을 단클론의 항체에 결합시키며, 이 항체는 피검물속의 이러한 세포와 다른 세포를 분별할 수 있게 된다. 이 결합은 이러한 세포에 항체를 결합시키는 조건하에서 실시된다. 결합후에, 피검물속에 세포에 항체에 결합유무가 결정된다. 이 결합은 피검물속에 있는 NSCLC 세포의 존재 유무와 관련된다. 일반적으로, 피검물은 단클론의 항체에 대해서 라벨이 붙은 특정의 결합대상물과 접촉시킨다. 이 라벨은 검출신호를 발생시킬 수 있다.

본 발명은 정제된 형태의 신규의 항원, 인체의 NSCLC의 항원에 특별히 결합되는 항체, 이러한 항체이 단편 및 면역복합체와 결합하는 등가증 및 이러한 항체를 이용하는 전단학 및 치료학적 방법에 관한 것이다. 예로서, 본 발명의 단클론의 항체는 Kohler 및 Milstein의 표준기술에 의하여 제조할 수 있다. 예로서, 많은 삼출액(渗出液)에서 취한 인체폐암세포 또는 인체 비-소세포의 폐암에서 취한 배양된 세포, 또는 정상적인 태아의 폐에서 취한 세포를 임뮤노겐으로서 사용한다. 이러한 세포를 쥐에 주입하고 충분한 시간이 지난뒤에 쥐를 잡아서 비장세포를 취한다. 일반적으로 폴리에틸렌글리콜의 존재하에서, 비장세포의 골수종세포 또는 임파종세포를 유압시켜서, 소요의 면역 글로블린을 인코우드하는 비장면역 세포 염색체를 비과등화시킨다. 여기서 수득한 세포는 유합된 잡종집단을 포함하며, HAT-배지와 같은 선택딘 배지에서 성장시키며 살아남은 세포는 희석조건을 제한하는 용매내에서 성장시킨다. 이 세포를 예로서 미량적정 웰(well)과 같은 적합한 용기에서 성장시키고, 상층액에서 소요의 특수성을 가지는 단클론의 항체를 길러낸다.

단클론 항체의 수율을 상승시키는 기술로서는, 세포를 수용하는 포유동물 숙주의 북박등공으로 잡종집단을 주입하여 복수종의 액체를 거둬들이는 것과 같은 여러가지 기술이 있다. 복막증의 액체에 단클론의 항체를 충분히 모을 수 없는 경우에는, 숙주의 혈액에서 항체를 거둬들인다. 단클론의 항체를 분리하여 정제함으로써 다른 단백질 및 다른 오염물질로부터 단클론의 항체를 유지시키는 데는 여러가지 통상적인 방법이 있다(K

hler and Milstein, Supra 참조).

이 단클론의 항체는 예로서 악성세포인 인체의 NSCLC 세포의 SDS-파지 특성에 의한 Mr 76,000의 항체와 관련된 세포의 결정인가 위치와 NSCLC 세포(형태 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ항원)에 의해서 배양배지속으로 분비되는 단백질 항원의 결정인자위치로 정의된다. 항체는 IgG₁중복기준이다. L3 항체는 몇개의 정상세포 보다는 적게 결합한다. L3 항체는 L3 쥐의 하이부리도마에 의해서 생성된다.

형태 I의 L3항원은 소디움 도데실 설페이트-풀리아크리아마이도의 1-차원의 겔 전기영동(SDS-파지)에 의한 94,000의 Mr를 가진다. 형태 Ⅱ의 L3 항원은 SDS-파지에 의한 76,000의 Mr를 가지며 형태 Ⅲ의 L3 항원은 SDS-파지에 의한 26,000의 Mr를 가진다.

형태 Ⅰ의 L3항원은 소디움 도데실 설페이트-폴리아크리아마이도의 1-차원의 겔 전기영동(SDS-파지)에 의한 94,000의 Mr를 가진다. 형태 Ⅱ의 L3 항원은 SDS-파지에 의한 76,000의 Mr를 가지며 형태 Ⅲ의 L3항원은 SDS-파지에 의한 26,000의 Mr를 가진다.

형태 Ⅰ의 L3 항원은 친화력 크로마토그래피(표 I) 및 아크릴아마이드겔 기술에 따른 친화력 크로마토그래피에 의한 배양배지로부터 90겹으로 정제되어, 당단백질인 형태 Ⅰ의 L3 항원을 각각 70중량

및 90중량

이상씩 포함하는 조성물이 된다. 친화력 크로마토그래피 정제의 의해 수득되는 조성물은 비활성도가 배양배지의 522Unit/mg에 대해서 46,500Unit/mg가 된다.

비활성도(Specific Activity)는 포르말린으로 결합된 Calu-1 세포의 단일층을 사용하는 적응력 결합역가시험에서¹²⁵I-로 라벨을 한 L3 항체의 결합력을 50

이하로 억제하는데 소요되는 항원의 양으로 정의된다. 친화력 크로마토그래피에 의한 배양배지로부터 수득한 조성물은 70

이상의 형태 Ⅰ의 항원을 포함하며, 대부분의 경우 소부분으로서 약 10-20

의 형태 Ⅱ의 항원을 포함흔 SDS-파지에 의하여 50,000-200,000 사이의 Mr를 가지는 비특정의 단백질 물질을 30

이하로 함유한다. 또한 이 조성물속에 형태 Ⅲ의 항원이 미량 존재한다.

L3 항원의 세포형 및 기대세포형 사이의 관계를 결정짓기 위하여, 세포를³⁵S-메티오닌으로 방사성 라벨을 하고 맥박추적시험(pulse chase experiment)을 실시한다. 세포를 한시간 동안³⁵S-메티오닌으로 맥박라벨을 하고, 라벨을 하지 않은 메티오닌을 포함하는 배지속에 각 시간대로 방치하고 다음에 면역침전분석 처리를 한다. 최초에는, 모든 특정의 면역침전이 되는 세포-관련된 방사성 활성도는 Mr가 76,000인 단백질로 판명되었다. 다른 라벨이 된 단백질로 또한 항체가 제거된 것으로 생기는 시료에서 발견되었다. 추적기간중에, Mr 76,000 형태의 방사성 활성도는 감소된 반면, 배지(Mr 94,000)속에 배출된 형태에서 발견되는 방사성 활성도는 증가하였다. 세포-관련된 형태의 방사성 활성도는 방출된 형태의 방사성 활성도가 나타내는 것과 동일속도로 사라졌다 : 양 방법에 대한^t1/2는 밀도시험계(densitimetric)로서 약 1.5시간으로 결정되었다. 이 결과치는 항원의 세포-관련된 Mr 76,000 형태를 Mr 94,000형태(형태 I L3항원)의 추적자로 제시한다.

L3 항원은 당 단백질이기 때문에, 탄수화물 개조는 세포에서 배출되는 동안 관찰되는 L3 항원의 크기가 현저히 증가되게 한다. 이것은 세포형태 및 형태의 공지된 특성치가 있는 다당 효소분자를 포함하는 면역침전 처리를 하여 시험한다. L3 항원과 관련되는 세포의 크기는 엔도글리코지다아제 H(endoglycosidase H)(Endo H)로 처리하면 Mr 59,000로 감소되지만, 뉴라미니다아제(neuraminidase)에는 영향을 받지 않으며, 이것은 N-결합된 높은 만노스(mannose) 과당류를 포함하는 것을 나타낸다(Tarentio et al., 1974, J. Biol. Chem. 249 : 811-817 참조). 이 결과는 화농이 N-결합된 글리코실화의 공지 억제제인 튜니카마이신(tunicamycin)에 예민하다는 발견과 일치한다(Lehle, et al., 1976, FEBS Letters, 71 : 167-170). 반대로, 배출된 항원은 Endo H에 내성이지만, 뉴라미니다아제처리에 의해서 Mr 80,000로 크기가 감소되었으며, 말단의 시아리산(sialic acid) 잔기가 형태 I의 L3 항원에 존재함을 나타낸다. 이와 같이 L3 항원의 세포-관련형태에서 배출된 형태로 전환하는 것은 N-결합된 탄수화물의 측쇄의 완숙에 의해서 수행된다.

형태 I의 L3 항원의 아미노산 말단 결합서열을 친화력 크로마토그래피와 아크릴아마이도 겔 분리기술의 조합으로 정제된 조성물에 대해 통상적인 기술로서 결정한다. 이 결합서열(α)는 다음과 같다 :

또한 다음과 같이 확대 정의된다.

아미노산에 대한 상기의 문자는 그들의 통상적인 의미를 가진다 : 즉 V는 발린(Valine), M은 아스파라긴(asparagine), D는 아스파르틴 산(aspartic acid), G는 글리신, N는 메티오닌, R은 아르기닌, L는 로이신, A는 알라닌, T는 트레오닌, Q는 글루타민, E는 글루타민산, I는 이소로이신, F는 페닐알라닌, Y는 티로신, 및 W는 트립토판이다.

상기 신들은 형태 Ⅱ의 L3 항원이 존재하든 않든 간에 형태 Ⅰ의 L3 항원을 포함하는 조성물에 대해서 단일의 결합서열로서 수득된다.

상기의 L3 항원의 30N-말단의 아미노산을 National Biomedical Research Foundation(1985년 3월 발간)의 단백질 은행에 존재하는 단백질 결합서열과 비교하면 중요한 동족체를 나타내지는 않는다. 형태 Ⅰ의 L3 항원의 결합서열은 또한 인체 C1-에스테라제 억제제 및 인체 알파-2-티오단백질효과 억제제를 포함하면서 이 데이타에는 나열되지 않은 몇가지 혈청 단백질과도 비교된다. 이들 결합서열의 어느것도 형태 Ⅰ의 L3 항원의 N-말단결합서열을 가지는 중요한 동족체를 나타내지 않는다.

본인들은 형태 Ⅰ의 L3 항원이 정상인체의 혈청에 존재하는 것으로 판단하고 혈청에서 형태 Ⅰ의 L3 항원을 정제하였다. 혈청에서 정제한 L3 항원의 성질은 표 III에 요약된다. 형태 Ⅰ의 L3 항원은 정상인체의 혈청에서 3,000배 이상으로 39

의 수율로 정제되었다(표 III). 정제된 물질을 SDS-파지로 분석한 결과 주성분이 배양배지에서 정제한 형태 Ⅰ 및 형태 Ⅱ 성분으로 공동-이동한 단백질로 나타났으며, 최최의 혈청시료의 주성분의 형태는 없었다. 혈청에서 정제한 형태 Ⅰ 및 형태 Ⅱ의 L3 항원이 원래의 겔의 2가지 분양한 성분속으로 녹아들어가며 이로서 글리코실화의 차이에 따른 미세-이성분을 나타낸다는 것은 주목할 가치가 있다.

양 형태는 면역오염(immanoblotting) 시험과 그후의 방사성 요오드화 및 면역침전에도 반응성이 있었다. 배양배지에 정제한 항원과 같이, 또다른 형태인 Mr 26,000(형태 Ⅲ L3 항원)도 면역침전 후에 검출되었다. 면역친화성 크로마토그래피에 의해서 수득된 조성물은 형태 Ⅰ의 L3 항원을 50중량

이상 포함하며 나머지 물질은 SDS-파지에 의해서 약 50,000-20,000Mr의 전이 및 비특정의 단백질이 형태 Ⅱ의 L3 항원이었다. 이 조성물은 정상인체 혈청의 13.3Unit/mg에 대해서 45,500Unit/mg의 비활성도를 나타내었다.

이 결과로서 L3 항원의 활성도가 배양배지 혈청의 양자속에서 발견되는 2가지 성분(형태 Ⅰ 및 Ⅱ)에 대해서 표현된다. 형태 Ⅰ의 L3 항원을 생산성 있는 SDS-파지에 의하여 혈청에 더욱 정제하면 90중량

이상의 형태 Ⅰ의 L3 항원과 형태 Ⅱ의 항원을 미량으로 포함하면서 나머지는 약 50,000-200,000Mr의 전이 및 비특정의 단백질을 포함하는 조성물을 얻는다.

혈청과 배양배지 양자로부터 정제되어¹²⁵I-라벨이 된 항원과 면역침전한 항원을 2차원의 등전위로 초점 맞히는(isoelectric focusing) SDS 파지 방법으로 비교한다. 두 항원의 2차원 유동성은 매우 유사하고, 형태 Ⅰ 및 형태 Ⅱ 성분 모두가 pH 4.2-5.0의 범위에서 이성체 피검물속으로 이동하였다. 두 곳에서 얻은 형태 Ⅰ의 L3 항원은 또한 약 5.8 및 6.2의 pH 범위에서 이동하는 2가지 작은 성분도 나타내었다. 두 항원의 탄수화물 조성물은 글리코시다아제 감응도시험으로 시험하였다. 양 공급원에서 얻은 형태 Ⅰ 및 형태 Ⅱ의 l3 항원은 Endo H 내성으로 발견된 반면, 양자의 뉴라미니다아제 처리하는 신진대사식으로 라벨을 한 항원에 따라 보여지는 Mr 80,000 단면의 특성을 나타내었다. 형태 Ⅱ의 항원의 뉴라디니다아제 감응도는 L3 항원의 세포-관련된 형태의 Mr 76,000과는 상이한 것으로 나타났다.

두 분자가 구조상으로 유사하다는 것을 확인하기 위하여, 두가지 공급원에서 수득한 형태 Ⅰ의 분자들 Cleveland et al., (1977) J. Biol. Chem., 252 : 11-2-1106에 기술된 일련이 부분적 프로타아제 분열반응 처리를 한다. 배양배지와 혈청에서 정제하고 방사성 라벨을 한 형태 Ⅰ의 항원을 생산성 SDS-파지로부터 절제하고 V8 프로타아제로서 지문사진 처리를 한다. 두 가지 분자는 동일한 부분적 분열 형태를 나타내었으며, 최소한 5개의 분별되는 부분분열 생성물이 양 경우에서 수득되었다(Mr=76,000, 49,000, 31,000, 20,000 및 14,300). 이 결과로서 배양배지와 인체혈청에서 정제한 L3 항원이 고도로 관련된 것을 나타낸다.

본인들은 다음에 혈청에서 얻는 L3 항원이 3가지 분자량 형태 사이의 관계를 조사하였다. 형태 Ⅰ 및 Ⅱ에 대한 전체적인 지문사전은 극히유사하였고, 한편 형태 Ⅱ의 분자는 형태 Ⅰ 분자에서 유도되는 Mr 31,000 및 Mr 14,300 단편이 수득되지 않았다. 이 형태로서 형태 Ⅰ 및 Ⅱ에 밀접한 관계가 있음을 제시한다. 형태 Ⅱ의 항원은 혈청에서 발견되는 보다 큰 항원형태를 가진 Mr 14,300의 부분 분열 생성물을 가지며, 이로서 형태 Ⅲ 항원도 또한 형태 항원과 구조적으로 관계가 있음을 나타낸다. 각종 형태사이에 구조상 밀접한 유사성이 있음으로 형태 Ⅱ 및 Ⅲ의 분자가 형태 Ⅰ의 항원에서 유발되었음을 제시한다. L3 항원이 폐암이 아닌 다른 종양형태의 항원성분으로서 이전에 기술되어 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 항원과 관련되어 흘러 나왔거나 분비된 종양에 대해서 컴퓨터를 이용한 문헌조사를 실시하였다. L3 항원과 크기가 유사하고 탄수화물 조성물도 유사한 멜라노마-분비된 단백질 항원에 대한 몇가지 보고서가 발견되었다. Natali et al., (1982) Cancer Res. 42 : 583-589 ; Bumol et al., (1982) Hybridoma 1 : 283-292 ; and Wilson et al., (1981) Int. J. Cancer 28 : 293-300.

본인들이 제1회 국제 멜라노마 관련된 항원 워크샵에 참석하여 상기한 것중 하나인 단클론의 항체(465.12 S ; Natali et al., supra)의 소량을 입수하였다. 본인들은 이 항체로서 항체 465.12S로서 인식되는 항원과 L3 항원사이의 동일성을 시험하기 위하여 결합서열식 면역침전시험에 사용하였다. 두가지 항체는³⁸S-메티오닌으로서 신진대사식으로 라벨을 한 세포의 배양배지에서 얻은 Mr 94,000 단백질서편에 특별히 침전되었다. 면역침전으로 L3 또는 465.12S 항원에 대한 배양배지를 제거하여 다른 항원의 항원활성도가 부수적으로 제거되었다. 이로서 이들 두 항체에 의해서 인식되는 항원결정인자가 동일한 분자에서 실시됨을 나타낸다(표 III). 그러나, 이 두 항체에 의해서 인식되는 에피토프(epitope)가 분명히 상이하며, 이는¹²⁵I-L3 항체의 결합을 위한 항체 465.12S에 의한 적응성이 탐지되지 않았기 때문이다.

본 발명에 따라 또 다른 단클론의 항체인 L5는 인체 NSCLC 세포의 특성이 있는 세포표면 단백질 항원이 결정인자 위치를 정한다. 상기한 방법과¹²⁵I 라벨하는 방법에 의하여 결정되는 것 같이 한, 단백질의 분자량은 약 135,000달톤이 된다. 이 항체는 IgM 유의 항체이다. L5 항체는 주 장기(major organ)에 있는 파이브로 블라스트(fibroblast), 엔도테리 세포(endothelial cell) 및 에피테리 세포(epithelial cell)과 같은 정상세포에는 검출된 정도로 결합하지 않는다. L5 항체는 L5 쥐이 하이브리도마에 이해서 생성된다. L5 항원은 Cleveland et al., (1977) J. Biol. Chem. 252 : 1102-1106에 기술된 기술에 표시된 것 같이 Mr 24,000 및 16,000의 2가지이 VB 프로테아제 단편을 가진다. 이와 같이, L5 항원은 유사한 분자량을 가진 다른 항원과는 구분된다.

본 발명의 또다른 단클론의 항체는 L18로 지칭되고 인체의 NSCLC 세포의 특성을 가진 또 다른 세포표면 단백질 항원의 결정인자 위치를 정한다. 상기한 2가지 방법으로 결정되는 것이, 단백질이 분자량은 약 72,000 달톤이 된다. 이 항체는 IgG₁중복기준이다. L18 항체는 몇가지 정상세포, 특별히 비장세포에 대해서는 보다 적은 정도로 결합한다. 또한, 본 발명에서는 Fab, F(ab')₂, FV 단편등과 같은 상기의 딘클론의 항체의 유용한 결합 단편은 파파인(papain)이나 펩신(pepsin)을 사용하여 항체의 펩티타아제 흡수로서 생성된다. 유용한 결합단편이란 용어는 단편이 동적항원의 결합위치에 대해서 항체와 적응한다는 것을 의미한다.

본 발명의 신규의 항체의 상기한 특정한 예는 각 항원의 특정한 결정인자 위치에 결합하고 쥐의 공급원에서의 특정한 유이고 중복기준인 항체를 의도하지만, 이것을 본 발명의 제한을 뜻하지는 않는다. 상기한 항체 및 쥐의 공급원, 인체나 다른 것을 포함하는 포유동물의 공급원 또는 이들의 혼합에서 되는, 상기한 항체와 관능기의 등가성을 가지는 항체는 본 발명의 범위에 포함되며, 또한 IgM, IgA, IgE 및 그 유사체와 같은 다른 류 및 이 전류에 속하는 중복기준도 본 발명에 속한다. 용어 "관능기의 등가성"은 항체가 상기한 결정인 자 위치에 결합될 수 있고 이러한 위치에서 본 발명의 특별한 항체에 적응될 수 있음을 의미한다. 즉, 이러한 항체는, 이러한 결정인자 위치를 가지는 세포나 세포단편을 포함하는 피검물과 결합될 때, 이러한 결정인 자 위치에 결합하고 본 발명의 항체가 이러한 위치에 결합되는 것을 막는다.

본 발명의 한가지 방법에는 폐의 조직속에 악성조건이 유무를 결정하는 것도 포함된다. "악성조건"이란 용어는 종양성월결곤란, 악성, 또는 종양세포 또는 그 유사조건의 위치에 암을 포함하는 형성이상의 위치의 존재를 뜻한다. 피검물을 본 발명의 단클론이 항체와 접촉시키거나 결합시킨다. 접촉은 악성세포에 항체를 결합시키는 조건하에서 실시한다. 접촉시킨 후에는 피검물의 악성세포에 항체의 결합 유무의 관찰한다. 즉, 피검물을 항체의 면역복합물 및 항원위치에 대해서 시험한다. 이 면역복합물 형성은 피검물속이 악성조건의 유무와 관련된다.

본 발명에 따른 방법의 특별한 실시예는, 여기된 조직의 종양세포를 검출하는 방법이다. 상기한 방법은 종양을 제거한 후 수득한 종양 부위의 피검물에 적용된다. 여기된 종양은 일부분을 얻도록 처리하고, 이 처리는 통상적으로 절제 후 즉시 냉동시켜서, 조직이나 종양을 냉동시키는 것을 포함한다. 조직의 동결된 층은 예로서 트리오스타트를 사용하여 절편으로 절단한다.

상기 방법으로 얻은 종양의 일부를 본 발명의 단클론의 항체와 접촉시키고 다음에 상기 단클론의 항체에 역행하는 제2 항체를 접촉시키며, 이 제2 항체는 검출가능한 라벨로 표시한다.

예로서 종양의 절편과 같은 여기된 피검물은 악성세포에 항체를 결합시키는조건하에서 제1의 단클론의 항체와 접촉시킨다. 배양은 예로서 유리 페트리 접시와 같은 적당한 용기속에서, 약 20-30℃로 약 15-30분간, 소량의 소디움아지도를 포함하는 인산염으로 완충시킨 식염과 같은 배지수용액에서 일반적으로 실시된다. 사용된 항체의 양은 예로서 문제의 결정인자 위치나 항원위치와 항체간에 검출가능한 면역복합체 수를 제공할 정도의 검출가능한 결합을 제공하는데 충분한다.

배양후에는, 절편을 씻어서 비-특성적 결합된 항체를 감소시키거나 제거되고 다음에 항원위치를 따라 피검물의 세포에 단클론의 항체를 결합시켜서 얻는 상기한 복합체를 관찰하는 시험을 한다.

이 결합은 절편속에 악성세포의 유무와 관련된다. 따라서, 예로서 피검물의 라벨을 한 특징의 결합상대물과 접촉시켜서 단클론의 항체에 대한 결합을 결정한다. 라벨로서 검출가능한 신호가 발생되고, 방사성 라벨, 형광과 같은 염색체 효소 또는 그 유사체일 수 있다.

상기 시도에 사용되는 기술의 예로서는 면역형광염색이 있다. 이 기술에서는 종양의 동결된 절편을 아세톤을 바른 유리슬라이드에 고정시키고 예로서 페트리접시 속에서 단클론의 항체로 배양시킨다. 예로서 인산염-완충된 식염수와 같은 적절한 완충액으로 세척하고, 절편을 페트리접시에 놓은 후 단클론의 항체에 대한 라벨을 한 특정의 결합 상대물과 접촉시키며, 이 상대물은 예로서 특별히 단클론의 항체에 대해 라벨을 한 항체일 수 있다. 대부분의 경우, 단클론의 항체는 쥐의 공급원에서 유발되기 때문에, 특히 단클론의 항체에 대한 라벨을 한 항-쥐 면역글로블린을 사용할 수 있다. 이러한 면역글로블린은 표준기술에 따라 쥐의 항체를 가진 적당한 숙주에 주사하고, 적당한 시간동안 방치하고 주사한 숙주의 피에서 항-쥐 면역글로블린을 수거하여 상승시킨다.

본 발명은 다음의 실시예에 의해 다시 설명된다. 먼저 사용된 다수의 절차를 설명하기로 한다.

배양배지는 지브코(Gibco)로부터, 그리고 태아의 소과혈청은 지브코 또는 하이클로운(Hyclone)으로부터, 그리고 테프론 코팅된 멀치웰 마이크로스코프 슬라이드(12웰)는 멜로이(Meloy)로부터 택하여 진다. 플라스틱 배양접시는 코팅 또는 코스타르로부터, 프로티즈 및 보빈 혈청 엘보민은 시그마로부터, 신경 아미다이즈 및 펜소빈(Pansorbin)(프로말린 고정의 S.aureus)은 켈바이오 캠으로부터, 엔도글리코시다이즈(Endoglycosidase)는 마일즈(Miles)로부터, 니트로 셀롤로이즈(BA85,045u)는 켈라이쳐(Schleicher) 및 쿠엘(Schuell)으로부터, 프로틴 A-세퍼로우즈(Sepharose), CNBr-활성화된 세퍼로우즈 4B, 세퍼텍스(Sephadex) G-10, DEAE 세퍼셀(Sephacel) 및 프로틴 A 결합된 세퍼로우즈 CL4B는 파머시아(Pharmacia)로부터, NP-40은 파티클 데이타 리미티드(Particle Date Ltd.)로부터, 폴리에틸렌 글리콜, X-레이 필름 필름 및 코다부(Kodavue) 착색키트는 코닥으로부터, 아크릴라미드(Acrylamide) 및 실버착색키트는 바이오래드(BioRad)로부터, 예비 착색된 분자량 제조기는 베데스타 리서치 라보라토리, 베데스다, 메릴던드(BRC)로 부터¹⁴C 메틸레이트 분자량 제조기, 3H-글루코스아민,³⁵S-메티오닌 및¹²⁵I는 에머샴(Amersham)으로부터, FITC-결합이 염소 앤티 마우스 면역 글로블린은 타고(Tago)로부터, 페라곤 혈청 프로틴 전기영동장치는 배크민(Beckman)으로부터, 그리고 앰포라인(Ampholines)은 LKB로부터 채택된다.

냉동색션에 대한 이뮤노히스토로지컬 연구를 위해 이뮤노케미스트리에서 스턴버거의 명칭이 붙지 않은 면역체기술(John Wiley ＆ sons, New York, 1979, : 104-169, 예시 Garrigues et al. In Int.J.Cancer(1982) 29 : 511-515로 변경되었다)이 사용되었다. 이들 테스트를 위한 타켓티슈는 외과수술에서 얻어졌으며 액체 니트로겐에서 예비 냉각된 이소펜타인에서 4시간안에 냉각되었다. 다음 티슈는 사용시까지 액체 니트로겐 또는 -70℃에서 저장되었다. 레빗 앤티 마우즈 IgG(Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD)는 1/50의 희석에서 사용되었다. 마우즈 퍼악시다이즈-앤티피악시다이즈 컴플렉스(PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.)는 특별히 정제된 2mg/ml의 PAP를 포함하며 1/80의 희석에서 사용되었다. 냉동된 섹션이 준비되괴, 드라이 되며, 아세톤으로 처리드라이 된다(Garrigues et al., 1982). 조직학적인 평가를 위해 섹션은 헤마톡실린으로 착색되었다. 섹션은 또한 1/5의 희석 인체혈청과 함께 미리 배양되었다(Garrigues et al., 1982). 마우스 면역체, 염소 항-마우스 IgG, 그리고 마우스 PAP는 10

정상 인체혈청 및 3

레빗 혈청의 용액내에서 희석되었다.

착색첨차는 2.5시간동안 특정의 또는 통제 면역체와 함께 일련의 색션을 처리하고, 1/50의 희석 레빗 항-마우스 IgG와 함께 30분 동안 배양하며, 1/80의 희석 마우스 PAP 컴플렉스에 30분동안 노출시킴으로써 구성된다. 면역체의 각 처리후 슬라이드는 포스페이트 버퍼된 염류(PBS)에서 두번 닦인다. 이뮤나히스로케리컬 반응은 청결하게 준비된 0.0

의 3,3'-디아미노 벤지다인 테트라-하이드로클로라이드(Sigma, St. Louis, MD) 및 0.01

의 하이드로겐 퍼옥사이드와 함께 pH 7.6의 0.05M 트리스(Tris) 버퍼내에서 8분간 전개된다. 20분동안 증류된 물에 1

OsO₄용액에 노출시킴이 착색을 강화시켰다. 색션은 물로 틴스되었으며, 알코올에서 건조되고, 크실렌에서 깨끗히 되어 슬라이드 위에 놓였다.

슬라이드는 각각 코드하에 판독되며 코드된 샘플은 독립적인 조사자에 의해 검사되었다. 전형적인 슬라이드는 차동간섭대조 렌즈(Zeiss-Momarski)를 사용하여 사진되었으며, 면역체 착색의 정도는 0(무반응), +(양 세포(pesitive cells)가 거의 없음), ++(적어도 1/3이 양세포임), +++(대부분 양세포임), ++++(모든 세포가 매우 강한 양성을 갖음)로 평가된다. +와 0 착색사이의 차이가 ++와 +착색사이보다 불분명하기 때문에 ++ 또는 그이상 등급의 착색은 포지티브(positive)로 간주되는 것으로 했다. 네오플라스틱 및 스트로마(Stroma) 세포는 튜미 샘플에서 관찰되었으며, 스트로마 세포가 전혀 착색되지 않거나 튜미 세포보다 엷게 착색되었기 때문에 기록된 착색은 튜미 세포의 착색인 것으로 간주되었다.

안타겐의 서브렐툴러 위치결정은 비이온 청정제를 침투시키기전 또는 그 후에 세포를 결속하고 있는 면역체를 측정하므로써 결정된다. 치너 배양된 세포의 세포표면에 결속된 면역체는¹²⁵I로 명명된 면역체(Brown et al., Proc. Natl, Acad. Sci. U. S. A(1981a) 78 : 539-543)로 직접적인 결속 분석물에 의하기나(FACS) Ⅱ 세포 약간을 사용한 간접 형광물에 의해 확인된다. 인트러셀롤러 위치에 결속된 면역체는¹²⁵I 명명의 면역체를 파라포믈디하이대로 정착시키고 비이온 청정체 NP-40으로 침투시킨 후 셀에 직접 결속시키므로써 결정된다.

라디오 레벨된 면역체(Brown et al., supra)를 사용하여 수행된 바인딩 분석물을 위해 배양된 세포(10⁶)는 배양 매개물내에서 가열 반응된(56℃에서 30분동안) 태아 송아지 혈청의 100μlso¹²⁵I 명명의 면역체의 10⁶cpm와 함께 배양되었다. PBS를 5ml 첨부한 후에 세포가 259×g에 10분동안 원심분리에 의해 작은 알로 뭉치게 되었다. 표면에 떠오르는 것은 흡출기로 빨아내어 졌으며, 작은 알은¹²⁵I에 대해 계산되었다. 특정치 않은 바인딩을 측정하기 위해 같은 종류의 배양이 컴피디터(Brown et al., supra)로 명명되지 않은 면역체 10μg으로 수행되었다. 어떤 경우 바인딩 분석물이 플라스틱 배양접시에 부착된 세포 모노레이이상에서의 유사한 방법으로 수행되었다.

약간의 FACS Ⅱ 세포에서 수행된 바인딩 분석물에 대해, 세포는 5mM의 에틸렌 에디아민 테트라 아세틱산(EDTA)을 포함하는 PBS를 사용하여 이들의 서브스트라타(substrata)로부터 제거되었다. 1×10⁵세포를 포함하는 샘플은 모노클로날 면역체와 함께 1:200의 희석에서 플루이레신 결속 염소 항-마우스 면역체에 의해 뒤이은 2μg/ml의 농도로 처음 배양된다. 다음 세포는 배양 매개물에서 닦이며 다시 액체속에서 뜨게된다. FACS 분석 바로 직전 프로피디엄(propidium)이 오다이드가 1μg/ml의 최종농도에 첨가되어 볼 수 없는 세포를 착색시킨다. FACS 분석중에, 빨간 형광을 방출하는 세포가 전기적으로 인출되어 있는 세포막이 시험되어진다. 플루오레시인 형광의 중간 세기는 각 면역체에 대해 결정된다. 네가티브 제어는 모노클로날 면역체가 제외된 샘플로 구성되며, 포지티브 제어는 HLA형의 1의 히스토컴패터빌리티 앤티겐에 대한 모노클로날 면역체로 구성된다. 착색은 중간 채널 플루오레시인이 적어도 세베인때 포지티브로써 간주된다.

프로테인 엔티젠을 확인하기 위해 폐악성 종양 또는 인체의 미발달 세포는 방사성 요드화되거나³⁵S-메티오닌으로 변형된 표면을 갖는다. 에티젠은 모노클로날 면역체와 염소 항-마우스 IgG의 첨가 및 S.aureus.로의 흡수로 배양시키므로써 세포 리세이트(lysates)로부터 분리된다. 면역 침전물은 설명된 바(Brown et al., supra)와 같이 나트륨 도데실(dodecyl) 폴리 아크릴라미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)(10-20

아크릴 라미드)에 의해 분석된다.

특수 면역체를 만들어 내는 하이브리도마 세포는 25mM Hepes 버퍼, 4mM L-글루타민, 4.5gm/l 글루코스, 10mM 비 필수의 아미노산, 100유닛/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토미신 그리고 15

가열 반응되지 않은 처리 송아지 혈청(NCS)를 포함하는 메티오닌 프리(methionine free) 듈베코(Dulbecco)의 최소 필수 매개물(DMEM)내에서 마이크로티터(microtiter) 내로 잘 성숙되었다. 세포는 6시간 동안 37℃에서 0.1mCi³⁵S 메티오닌과 함께 접하게 되며, 표면에 떠오르는 물질이 세포를 제거하도록 제기되고 원심분리 되었다.

특수 하이드리도마 세포의 떠오르는 수는 2

세균 배양기 플레이트의 중심 우물내로 놓인다. 단일특정의 래빗 항-마우스 Ig 이소타입 면역체(Meloy)는 바깥쪽 우물내에 놓이며 플레이트가 상온에서는 2시간 동안 4℃에서는 밤을 지새워 배양된다.

가요의 폴리비닐 콜로라이드 96우물 플레이트(Costar)는 37°에서 2시간 동안 3

의 BSA 용액으로 카운터 코팅된다. 다음 떠 있는 하이드리도마는 37℃에서 2시간 동안 배양된다. 소과의 혈청 엘부민(BSA)으로 씻겨낸 다음 플레이트가 퍼악시다이즈(Zymed)에 결속된 단일의 특정 래빗 항-마우스 Ig와 함께 2시간 동안 37℃에서 배양된다. 씻겨낸 다음, 플레이트는 pH 4.5의 0.1 구연산염 버퍼내에서 1mg/ml의 직-페닐린 다이아민과 0.03

H₂O₂와 함께 배양된다. 630nm에서 광밀도는 다이나텍(Dynatec) ELISA 플레이트 판독기상에서 결정된다.

마이크로티터 우물은 PBS와 0.02

NaN₃내에서 5

NCS와 함께 배양되며 표면에 떠오르는 물질은 흡출기로 빨아 내린다. 떠있는 세포(2×10⁷세포/ml)중 25μl이 각 우물로 첨가되며 상온에서 1시간 동안 특별한 면역체의 25μl과 함께 배양되었다. 플레이트는 7분 동안 1200rpm으로 원심분리되었으며, 50

NCS/PBS/NaN₃로 두번 씻겨지고, 25μl의¹²⁵I-스터피로고컬(staphylococcal) 프리틴 A(약 50,000cpm/25l)가 첨가되었다. 플레이트는 25℃에서 약 1시간 동안 배양되며, 5

NCS/PBS/NaN₃로 두번 씻기고 드라이되었다. 우물의 하부는 절단되었으며 감마 계수기에서 계산되었다. Calu-l 폐 악성종양 세포는 어메리칸 형 컬츄어 콜렉션으로부터 획득되었으며, 세포는 성장 매개체(ml당 50유닛의 페니실린, ml당 50μg의 스트렙토미신, 그리고 10

태아 송아지 혈청(FCS)을 포함하는 Dulbecco의 변경된 이글 매개체(DMEM)의 단일축 배양물내에 유지되었다. 세포는 처리에 의해 0.05

트립신 및 0.02

EDTA의 용액과 함께 수집되었으며 해머시토미터로 계산되었다.

세포는 트립신화에 의해 수집되었으며 테플론으로 코팅된 멀티 우물 슬라이드(Meloy Labs)위에서 우물(6mm 직경)당 5-20×10³밀도로 플레이트되었다. 세포는 실시를 시작하기 전에 약 18시간 동안 37°에서 유지되었다. 매개물은 흡출기로 빨아들여졌으며, 접착세포는 0.5mM서 CaCl₂와 0.5mM MgCl₂를 포함하는 인산염 버퍼된 염수 0.14(PBS, 0.14M의 NaCl, 3mM의 KCl, 8mM의 Na₂HPO₄×7H₂O, 15mM의 KH₂PO₄)로 한번 씻겨진다. 다음 세포는 23℃에서 20-30분 동안 파라포말데히더 용액(PBS에서 0.5

)의 25마이크로리터 추가에 의해 상황에 따라 적절히 된다. 우물은 씻겨지고, 인트러 셀롤러 안티겐은 23℃에서 5분 동안 0.2

(v : v) NP40를 포함하는 PBS 추가에 의해 노출되었다. 과도 알데히드 그룹은 바인딩 버퍼(pH 6.8의 50mM BES(N, N-bis[2-히드록시 에틸]-2-아미노에탈 설핀산), 0.1

(w/v)의 BSA 그리고 15

FCS))를 추가하여 23℃에서 최소 15분 동안 차단되었다. 면역체는 바인딩 버퍼내에서 ml당 10μg의 농도로 희석되었으며, 우물당 총 제적이 20-50마이크로티너내에서 적용되었다. 슬라이드는 4℃에서 1시간 동안 배양되었으며 바인당 버포로 씻겨졌다. 플루오레시인 이소티오시안산염(FITC)이 활용된 제2차 면역체(염소 항-마우스 IgG 및 IgM)는 4℃에서 1시간 동안 첨가되었다. FITC 활용이 사용된 희석은 배후 비율의 선택적 신호를 낳도록 실험에 의해 결정된다. 이같은 배양에 뒤이어, 슬라이드가 바인딩 버퍼 및 물 그리고 드라이된 공기와 함게 씻겨졌다. 작은 체적의 항원이 바램(anti-fade) 용액(Genetic Systems Corporation) 및 커버슬립이 첨가되었으며 슬라이드가 Leitz Orthoplan 형광 마이크로스코프를 사용하여 시험되었다. 슬라이드는 40×오일침수 물질하에 시험되었으며 코닥 트리×팬 필름(Kodak Tri×Pan film)으로 사진되었다.

세포는 트립신화에 의해 수집되며, 트리팬 블루 인클루젠에 의해 결정되는 바와 같이 생존능력은 보토 85

이상이었다. 4×10⁶세포는 원심분리에 의해 수집되었고 아미노산 메티오닌을 제외한 성장 매개체(Growth Medium) 1ml의 체적내에 뜨게되었다. 메티오닌(800Ci/mmole)이 0.5mCi/ml의 최종 농도로 첨가되었으며 세포가 37°에서 1-6시간 동안 교대로 배양되었다. 라벨이 있는 세포는 원심분리에 의해 수집되었으며 또다른 작업이전에 씻겨졌다. 어떤 경우에 방사성 레벨이 있는 세포부유는 레벨이 붙지않은 메티오닌과 10

FCS를 포함하는 성장 매개체와 함께 10배로 희석되었으며, 100mm 리슈 배양접시에 첨가되었고 37°에서 추가로 18시간 동안 배양되었다. 다음으로 접착 세포가 사용이전에 PBS와 함께 씻겨졌다.

유사한 레벨의 프로토콜이 H 글루코사민과 함게 세포에 레벨을 붙이는 때에 사용되었다. 4-24시간 동안 10

격막분석된 FCS를 포함하는 글르코스-프리 성장 매개체내에서 배양에 의해 최초 과감되었다. 아사에 뒤이온 90

의 생존을 보이는 세포의 집단이 실험을 위해 사용되었다. 세포는 앞서 설명한 바와 같이 수집되었으며, 10

격막분석된 FCS, pH 7.4에서 0.01M HEPES(N-2-히드록시 에틸피퍼아진-N-2-히드록시 에틸피퍼아진-N-2-에탈 설펀산), 0.5M의 Ci³H 글루코사민[40Ci/m 몰]을 포함하는 글루코스-프리 성장 매개체 1ml의 체적내에서 다시 부유된다. 57°에서 3시간 동안 교대로 레벨을 붙이는 작업에 뒤이어, 세포는 원심분리에 의해 수집되며 PBS로 씻겨진다.

프로틴은 Greenwood, et al. (1963) Biochem. J. 89 : 114-123에 의해 설명된 바와 같이 클로르아민 T 절차를 사용하여¹²⁵I로 방사성 레벨이 붙여진다. 프로틴 샘플(50μg)은 1-2mmCi¹²⁵I(운반자-프리)를 포함하는 PBS에서 0.5ml로 희석되었다. 클로르아민 T(10μg을 포함하는)로 새로이 만들어진 용액의 텐 마이크로티터가 첨가되었으며, 반응은 23°에서 5분 동안 계속되었다. 반응은 20μg의 Na₂S₂O₅와 3μg의 K1를 포함하는 용액을 첨가하여 끝났다. 반응되지 않은¹²⁵I는 1mg/ml의 소과의 혈청 알부민을 포함하는 PBS는 평형상태에 도달한 한줄의 세퍼덱스(Sephadex) G-10에서 색층 분석에 이해 제거되었다. 이같은 연구에서 사용된 레벨이 붙은 모노클로날 면역체의 특수 활동은 나노몰 당 약 3×10⁹cpm이었다. 엔티겐을 포함하는 샘플은 방사성 레벨을 붙이기 이전에 한 스핀 칼럼의 세퍼덱스 G-10에서 담수화되었다.

변형적으로 레벨이 붙여진 세포는 원심분리에 의해 수집되었으며, 밀리리터당 2-4×10⁶세포의 비율로 0.15M의 NaCl, 0.05M의 Na₂HPO₄, 1

(w/v)의 나트륨 디옥시콜로라이드, 1

(w/v)의 트리톤 X-100, 그리고 0.1

(w/v)의 SDS를 포함하는 RIPA 버퍼에서 용해되어 졌다. 4°에서 10분 동안 배양함에 뒤이어, 혼합물이 원심분리(30분 동안 147,000G, Ti 70.1 회전자)에 의해 말게되었다. 부유물도 제거되었고 방사성 활동의 협동이 액체의 제기발랄에 이해 결정되었다.

[면역석출]

[전기영동]

1. SDS-폴리아크릴라미드 겔 영동.

2. 이차 이소일렉트릭 포커싱(IEF)-SDS PAGE

3. 파라곤 전기영동

이뮤노 블롯팅(lmmunoblotting).

¹²⁵I-L3 면역체의 바인딩.

)비교 바인딩 분석.

글리코시다이즈(Glycosidase) 처리.

단백질 결정.

세피로우즈 준비.

겔 착색

Edman Degradation에 의한 아미노단 시퀀싱.

[모노클론 항체의 제조]

모노클론 항체는 4개의 상이한 소오스(sources) 중 하나의 인체조직으로 3개월된 BALB/c 생쥐를 면역하여 제조된다 : 상기 소오스들은 (1) 전이 비-소 세포형 폐암(metastic non-small cell lung carcinoma)을 가진 환자로부터 추출한 : 녹막 유출액, (2) 비-소 세포형 폐암으로부터 배양된 세포, 및 (3) 3-4개월된 태아의 폐 조직이다. 상기 면역화는 약 10⁷의 세포를 3-4회에 걸쳐 생쥐의 복막내부로 주입함에 의해 실시된다. 최종 면역화되고 지라가 제거된 후 3일은 배양배지에 현탁되고 NSI 생쥐 골수종 세포(K

hler and Milstein, supra)로 합착된다. 혼합물은 단일 합착된 세포(clones)으로부터 연유한 저밀도 배양을 형성하기 위해 씨가 뿌려진다 ; 혼성화를 위해 사용된 기술은 Yeh, et al., Int.J.Gancer(1979) 29 : 269-275에 의해 이미 기술되었다.

혼성세포로부터의 부유물은 종양이 함유된 세포막을 정제하기 위해 사용된 종양으로부터 추출에 대해 ELISA시험과 오톨레이디오 간접¹²⁵I-라벨된 단백질 A분석(Brown et al., J. Immunol. Mrth. (1979) 31 : 201-209) 둘다를 사용함에 의해 걸러진다. 이들 추출물은 Colcher et al., Cancer Res., (1981)42 : 1451-1459 ; Yeh et al., supra.로부터 수정된 공정을 사용하여 준비된다 이를 위해 조직이 PBS으로 씻고 현탁되었다. 이는 완전한 종양을 위해 스테인레스 강철망을 통해 압축함에 의해 시행되었다. 이 1mM의 페닐메틸술폰일 플루오라이드(Calbiochem-Behring Corp., San Die해, CA)가 첨가된 후 이 재료는 다운스 호모제나이져(Dounce Homogenizer)의 B 약연공이의 50회 스트록으로 얼음위에서 균일화 된다. 27,000×g에서 15분 동안 원심분리한 후 부유물이 제거되고, 상기 필렛(pellet)이 PBS에 재 현탁되고 1분 동안 초음파 처리된 후-70℃에서 저장된다.

세포막 추출물에 결합하는 항체를 만드는 하이브리도마들은 글론(cloned)되고, 비트로(bitro)에서 팽창되며, 항체 특수화를 위해 시험된다. 이 시험은 상기에서 언급된 면역 조직학적 기술을 사용하여 수행되고 상기 기술에서 폐암, 다른 종양 및 정상인체조직의 냉동세포에 결합하는 항체의 능력이 시험된다. 인체 폐암에 특별한 것으로 나타난 항체를 창출하는 저들 하이브리도마들은 래클론(recloned)되고 팽창되고 프릿스탄-프라임(pristane-primed)된 3개월된 BALB/c 생쥐속으로 주입되고 거기서 이들이 복수종량(ascites tumors)로 성장한다.

복수속으로 분비된 항체는 단백질 A 세파로제(Sepharose)(Fy et al., Immunochemistry(1978)15 : 429)에서 혹은 Sephacryl S-300의 겔 여과에 이해 정제된다. 정제된 항체는 다른 특성을 위해 사용되고 이 특성은 세포표면에 결합되는 항체를 결정하는 완전한 세포상의 분석을 결합하는 면역조직학적이 분석에 이해 부가적인 특별시험을 포함했고, 방사능 면역 석출시험은 상기 설명한 바와 같이 시험되었다. 단클론 항체 L3, L5 및 L18은 상기에서 설명된 해당 하이브리도 마들로부터 제조된다.

이들 항체는 이 명세서의 전반에서 기술된 특성을 나타낸다. L3, L5 및 L18으로 표시된 세포 배양주는 1984년 10월 4일자로 A.T.CC.(American Type Culture Collection,12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852)에 기탁되었고, 각기 기탁번호 HB8626 HB8627 및 HB8628을 부여 받았으며, 세포 배양주 L3은 1984년 10월 25일 재 기탁되었다.

[실시예 2]

[혈청없는 배양배지로부터 L3 항원이 정제]

1. 혈청-없이 조절된 배지의 준비

Calu-l 세포는 성장 배양액의 존재속의 롤러 보틀(roller bottles)(850cm²)내에서 합류하도록 성장한다. 단층이 혈청 없는 성장배양액 50ml로 3번 씻는다. 두번째 씻음을 37℃에서 30분 동안 세포에 둔다. 세포는 150ml 혈청-없는 성장 성장 배양액이 존재하는 인큐베이트 속에 둔다. 3일 후에 배양액이 수집되고 원심분리되어 부유세포를 제거하고 사용할 때까지 -70℃에서 냉동 저장된다.

2. 농축액 제조

혈청 없는 배양액(790mls)가 한외여과(Amicon, PM10 membrane)에 의해 17ml의 체적으로 농축된다. 농축액은 제거되고 막은 PBS(11ml)로 한번 세척된다. 세척과 농축액이 복합되고 혼합물이 Ti70 로터(Beckman)에서 147,000×9에서 30분 동안 원심분리된다. 부유물은 L3 하원 활성도의 대부분은 함유함이 발견되었다. 이는 이후 농축액으로 기술한다.

3. 면역 친화성 착색판

응축액은 Sepharose C14B의 1칼럼(1.5ml)을 거쳐 통과되어 Sepharose에 대해 친화성을 가지는 물질을 제거한다. 칼럼은 이후 PBS 3mls로 세척된다. 세척과 관련되어 관통 흐름이 결합되고 L3 항체 접합된 Sepharose 4B(10mg L3/ml resin)의 포장된 1ml 체적에 첨가된다. 혼합물은 18시간의 주기로 회전하며, 4℃에 저장되고 이후 임이 피하주사로부터 만들어진 칼람속으로 주입된다. 관통 흐름은 수집되고 레진은 PBS(10ml)와 5M NaCl(5ml) 및 0.02M 초산암모늄(10ml)의 용액으로 세척되었다. L3 항원은 새로 만들어진 트리에틸아민의 용액(75mM)의 첨가에 의해 칼럼으로부터 용출된다. L3 항원 활성도가 높은 pH에서 불안정하기 때문에 유출물의 pH는 2M 초산암모늄의 0.1ml를 함유하는 튜브내에서 부분(0.5ml)를 수집함에 의해 조절된다. 활성도를 함유하는 플랙신(fractions)은 결합시험을 사용하여 인식되고 모이고 -20℃에서 저장된다. 결과는 표 I에서 요약되었다.

[실시예 3]

[혈청으로부터 L3 항원이 정제]

1. 혈청수지

종양환자 혹은 정상인으로부터 혈액을 채취한 후 실온에서 10-90분 동안 응혈되게 한다. 이후 샘플은 4-6℃에서 30분-5시간 동안 저장한 후 Sorvall Clinical 원심분리기에서 1600rpm으로 10분 동안 원심분리한다. 혈청이 응혈로부터 분리되고 나위어지고 또 사용할때까지 -70℃에서 냉동저장된다. L3 항원 활성도의 준위는 동일인으로부터의 혈청 혹은 혈장내에서 심각하게 다르지 않다. 해빙된 분리물(Thawed aliquote)은 항원 활성도가 반복되는 냉동-해방에 민감하기 때문에 일반적으로 냉동되지 않는다. L3 항원 활성도의 정제를 위해 새로이 냉동적 혈청 10ml의 분리물이 해빙되고 사용전에 147,000×g에서 60분 원심분리기(Ti 70.0로부터)에서 원심분리하여 정화된다.

2. DEAT Sephacel 채색판

DEAT Sephacel의 10ml 칼럼이 솥아지고 PE 완충제(0.02M 인산나트륨, pH 7.12 및 0.005M EDAT)로 평행된다. 정화된 혈청은 이온교환 칼럼에 적용하기 전에 PE 완충제로 130ml 체적에 희석된다. 샘플이 적용되고 방출되는 동안 0.5ml/min의 유속이 유지된다. 칼럼은 개개의 혈청 단백질의 전체 54

로 흐르고 감지될만한 L3 항원 활성도가 없다. 칼럼은 이때 PE 완충액 10칼럼의 체적으로 세척된다. L3 항원 활성도의 방출은 PE 완충제 속에서 0-0.5M NaCl의 50ml의 비율로 얻어진다. 1ml의 플랙션이 용출중에 수집된다. 접진적인 공급후에 칼럼은 PE에서 0.5M NaCl로, 끝으로 동일 완충액으로 1.5M NaCl로 세척된다. L3 항원 활성도를 함유하는 플랙션이 상호 억제 시험을 사용하여 인식되고 혼주된다. L3 항원 활성도는 용출된 혈청 단백질의 량 약간 이상이 된다. 일부 실험에서 L3 항원 활성도는 라디오 라벨링과 면역침적 분석전에 약간 다른 과정에 의해 부분적으로 정제된다. 혈청 단백질은 30

황산 암모니움으로 먼저 침전된다. 이 침전은 H₂O 용해되고 DEAE(Sephacel)이 칼럼에 적용하기 전에 활염된다. (Sephadex G-25)에서 L3 활성도의 용출은 NaCl 용액을 단계적으로 첨가함에 의해 얻어진다. 0.25와 0.5M NaCl 사이에서 용출하는 플렉션은 L3 항원 활성도가 풍부하다. 그리고 계속되는 라디오 라벨링(radiolabeling)을 위해 사용된다. 이런 형태로 준비된 항원은 3000fold 정제된 것보다 더 많은 시료들로부터 침전된 라벨된 항원으로붜 단백호소 지문에 이해 분별할 수 있다

3. 면역 친화 착색판

DEAE Sephacel 칼럼(14ml)으로부터 혼주된 플랙션이 Sephacel 치 4BV이 칼럼 8.4ml에 공급되고 이 칼럼이 PBS 17ml로 세척된 후 처리되어 시험된 후 그 결과가 표 II와 III에 요약되었다.

[실시예 4]

[L3 항체와 항체 465.12S의 상존결합]

라벨안된 항체 465.12S 혹은 L3 항체의 어느것이¹²⁵I-L3항체와 혼합(최종농축, 0.35μg/ml)되고 포르말린-딕스된 H125 폐암세포(50000/well)에 첨가되었다. 라베안전 항체는 하이브리도마 부유물로 사용되었다.

항체 465.12S의 용액은 충분히 함유되어 침전되게 한다.

[표 III]

건강한 일곱정상인으로부터의 평균값(± 표준편차)로 결정되었다. sera는 기준으로 배양액으로부터 면역친화성으로 정제된 L3 항원을 사용하여 적응 결합시험에서 체적으로 최종 5.7

응축에서 시험되었다. 값은 표준 제조의 정도에 대해 선택되었고 66

의 것으로 견적되었다.

[표 IV]

[실시예 5]

CACU-l 인체 폐암세포가 락토과산화 촉매된 요부화 사용하여 표면라벨되었다. 이는 Brown et al. JImmunol ; 127 : 546.1981)에 의해 기술된 바와 같다. 항체는 SLS-Page에 의해 분석되고 분석되었을 때 Mr 135,000의 단체 폴리펩타이드 사슬로 유주되었다. 세포표면 요드화된 V8 분열단편의 최종 "지문"은 L5 항체를 위한 진단 특징이 있다. 즉 Mr 24,000과 16,000의 플렉이 L5 항원의 특징이다.

[표 I]

[표 II]

1) Bradford(1976) Anal. Blochem. 72 : 248-254의 방법에 의해 결정되었다.

2) 실시예에서 기술된 결합시험에 50

로¹²⁵I-라벨된 L3 항체의 결합을 억제하는데 필요한 량.

Claims

인체 비-소 세포형 폐암세포로부터 분리되고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 이해 측정할 때 분자량이 94,000Mr을 가지는 순수한 형태의 항원.
로 구성된 아미노산 말단 결합서열을 가지는 형태의 순수화된 단백질.
제2항에 있어서, 말단 글코시드 잔기(terminal glocoside residues)를 더 포함하는 단백질.
제2항에 있어서, 말단 시알릭산 잔기(terminal sialic acid residues)를 가지는 단백질.
말단 시알릭(sialic)산 잔기를 가지며, 분자량이 약 94,000Mr에 이르고 말단 아미노산 결합서열이
인 실질적으로 순수한 당 단백질 화합물.
제5항에 있어서, 전술한 말단산 결합서열이

를 더 포함하는 글리코 단백질 화합물.
경쟁성 결합시험(competitive binding assay)에서¹²⁵I-라벨된 L3 항체의 결합이 50
로 한정될 때 필요한 항원의 총량으로 정의되는 특이성활성도(specific Activity)가 적어도 45,000Unit/mg이고, 제23항이 단백질은 70
이상 포함한 단백질 화합물.
경쟁성 결합시험(competitive binding assay)에서¹²⁵I-라벨된 L3 항체의 결합이 50
로 한정될 때 필요한 항원의 총량으로 정의되는 특이성활성도(specific Activity)가 적어도 45,000Unit/mg이고, 제23항의 단백질을 90
이상 포함한 단백질 화합물.
제7항에 있어서, 분자량이 76,000Mr인 항원을 소량 포함하는 단백질 화합물.
제2항의 단백질을 포함하는 정상인체의 혈청으로부터 정제되어 전술한 단백질에 대한 정제계수(purification factor)를 정상인체의 혈청의 적어도 3,000배로 가짐을 포함하는 단백질 화합물.
제10에 있어서, 분자량 76,000Mr인 항원을 소량 포함하는 단백질 화합물.
제2항의 단백질을 포함하는 배양된 암세포로부터 정제되어 전술한 단백질에 대한 정제계수가 전술한 배양된 암세포의 계수에 적어도 90배가 되는 정제계수를 가지는 단백질 화합물.
제12항에 있어서, 분자량이 76,000Mr인 항원을 소량 포함하는 단백질 화합물.
인체 비-소 세포형 폐암세포로부터 유도된 세포표면 항원이고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 측정되었을 때 분자량이 약 135,000Mr을 가지는 정제된 형태의 단백질 항원.
제14항에 있어서, V8 단백질 분해효소에 의해 절단되는 두단편 24,000Mr과 16,000Mr의 단백질로 구성된 것을 특징으로 하는 항원.
제14항의 항원을 포함하는 단백질 화합물.
인체 비-소 세포형 폐암세포로부터 유도되는 세포표면 항원이고, 폴리아클릴아미드 겔 전기영동법으로 측정했을 때, 분자량이 약 72,000Mr을 가지는 정제된 형태의 단백질 항원.
제17항의 항원을 포함하는 단백질 화합물.
악성세포를 함유하는 것으로 예상되는 시료내에서 악성세포를 감지하는 방법에 있어서, 제22항이 항원의 유무에 대해 시료를 검사하는 것을 포함하는 감지방법.
제19항에 있어서, 전술한 시료가 혈청인 방법.
악성세포를 함유하는 것으로 예사오디는 시료내에서 악성세포를 감지하는 방법에 있어서, 제23항의 항원의 유무에 대해 시료를 검사하는 것을 포함하는 감지방법.
제21항에 있어서, 시료가 혈청인 방법.
악성세포를 함유하는 것으로 예상되는 시료내에서 악성세포를 감지하는 방법에 있어서, 제26항의 항원의 유무에 대해 시료를 검사하는 것을 포함하는 감지방법.
a) 분자량이 72,000 달톤이며, 인체 비소세포형 폐암세포 표면 결정인자에 단백질 항원이 결합하며, 그리고 b) 분자량이 94,000 달톤이며, 인체 비소세포형 폐암세포에 의해 분비되는 단백질 항원이 항원 결합부위에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제24항에 있어서, Fv 단편이 F뮤, F(뮤')₂로 구성된 단일클론 항체.
제24항에 있어서, 검출신호를 보낼 수 있는 라벨이 공약되어 있는 단일클론 항체.
제26항에 있어서, 라벨이 형광체인 단일클론 항체.
제24항에 있어서, IgG 동형상(isotype)으로 구성된 단일클론 항체.
제24항에 있어서, 쥐의 하이브리도마(hybridoma) 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체.
인체 비소형 세포 폐암세포의 표면 결정인자이며 분자량이 135,000 달톤인 단백질 항원이 결합하는 항원 결정 분위의 단일클론 항체.
제30항에 있어서, Fv 단편이 Fab, F(ab')₂로 구성된 단일클론 항체.
제30항에 있어서, 검출신호를 보낼 수 있는 라벨이 공약되어 있는 단일클론 항체.
제32항에 있어서, 라벨이 형광체인 단일클론 항체.
제30항에 있어서, IgM 동형상(isotype)으로 구성된 단일클론 항체.
제30항에 있어서, 쥐의 하이브리도마(hybridoma) 세포주의 의해 생성되는 단일클론 항체.
인체 비-소 세포 폐암세포의 표면 결정인자이고, 분자량이 72,000 달톤인 단백질 항원이 결합되는 항원 결합부의 단일클론 항체.
제36항에 있어서, Fv 단편 Fab, F(ab')₂로 구성된 단일클론 항체.
제36항에 있어서, 검출신호를 보낼 수 있는 라벨이 공약되어 있는 단일클론 항체.
제38항에 있어서, 라벨이 형광체인 단일클론 항체.
제38항에 있어서, IgG 동형상(isotype)로 구성된 단일클론 항체.
제38항에 있어서, 쥐의 하이브리도마(hybridoma) 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체.