JPH0675514B2 - ヒト非小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体 - Google Patents

ヒト非小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体

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JPH0675514B2 JP60505034A JP50503485A JPH0675514B2 JP H0675514 B2 JPH0675514 B2 JP H0675514B2 JP 60505034 A JP60505034 A JP 60505034A JP 50503485 A JP50503485 A JP 50503485A JP H0675514 B2 JPH0675514 B2 JP H0675514B2
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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願への相互参照 本出願は、1984年11月２日に出願された同時係属出願に
係る米国出願第667,521号の一部継続出願である。この
出願に表わされていない前記出願の要旨は、参照により
ここに組み入れるものとする。
発明の背景 1.発明の分野 ヒト肺癌は男性における癌腫による多くの死亡の原因と
なるものであり、また女性における癌腫死亡の最も頻繁
な原因としての乳癌の侵襲の過程である（キャンサー
ファクツ アンド フィガーズ,1983年［Cancer Facts
and Figures,1983］）。この疾患は、４つの主な組織学
的タイプ、すなわち類表皮腫（エピデルモイド）（30
%）腺癌（35%）、未分化大細胞（15%）および小細胞（2
0%）に分けることができる。肺癌の多くの症例は、化学
療法および照射療法によって治癒不可能である。小細胞
肺癌は、大きさにおける低減によって化学療法および照
射療法に応答するが、全体的な治癒ではない。腫瘍の完
全な外科手術的除去が唯一有効な療法であると見なされ
ている。しかしながら、予期せぬことには、肺癌患者の
30％未満が、診断で完全に切除され得る腫瘍を有してお
り、また肺癌患者の1/3未満が、外科手術的完全除去の
後５年間生存している。それゆえ、肺癌のより早期の診
断、癌延展の程度のより良好な限定、およびより効果的
な療法を可能とする方法に対する大きな必要性が存在す
る。
モノクローナル抗体は、これらのすべての目的のために
用いられ得るものである。しかしながら、必須条件は、
正常成人組織においてよりもより肺癌において強く発現
される抗原に対する抗体を見出すことである。腫瘍細胞
集団の公知の不均質性、同じ抗原におけるいくつかの決
定基の存在、治療学的標的と比較した場合における診断
マーカーとしてのこれらの好適性に関する抗体間の予期
された違い、および同じ抗原に対する異なる抗体の異な
る生物学的特性の見地において、いくつかの異なる抗体
が必要とされる。
2.先行技術の記載 肺癌抗原に対するモノクローナル抗体は、シコラら［Si
kora et al.］（ブリテッシュ ジャーナル オブ キ
ャンサー（1981）年［Br.J.Cancer（1981）］第43巻第6
96〜700頁）や、カッチら［Cuttitta et al.］（プロセ
ス オブ ナショナル アカデミー サイエンス アメ
リカ合衆国（1981年）［Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（1
981）］第78巻第4591〜4595頁）や、バーキら［Varki e
t al.］（キャンサーリーチ（1984年）［Cancer Resear
ch（1984年）］第44巻第3681〜687頁）や、ティー．ダ
ブリュー．マンディーら［Mondy,T.W. et al.］（サイ
エンス（1981年）［Science（1981）］第214巻第1246〜
1248頁）や、ジェー．ディー．ミナら［Minna,J.D. et
al.］（イン ビトロ［In Vitro］第17（12）第1058〜1
070頁（12-1981年）］や、エイ．ジェー．ケンネルら
［Kennel,A.J.et al.］（キャンサー リサーチ［Cance
r Research］第14（9,PT1）第3465〜3470頁、ケミカル
アブストラクト［Chem.Abst.］第95（15）第130850
2）や、エイ．ビー．バイリンら［Baylin,A.B.et al.］
（プロセス オブナショナル アカデミー サイエンス
アメリカ合衆国［Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A］第79巻
第4650〜4654頁（8-1982年））や、ディー．エヌ．カー
ネイら［Carney,D.N.et al.］（パソバイオロジー ア
ニュアル［Pathobiology Annual］1982年第12第115〜1
36頁（1982年））や、エイ．エフ．ガズ ダーら［Gazd
ar,A.F.et al.］セミナーズ イン オンコロジー［Sem
iners in Oncology］第10巻第３〜19頁（3-1983年））
や、エイ．シー．ホリンスヘッドら［Hollinshead,A.C.
et al.］（キャンサー ディテクター プレベント［C
ancer Detec.Prevent.］第６巻第185〜191頁（1983年）
や、ジェイ．ティー．マルシャインら［Mulshine,J.T.e
t al.］（ジェイ イムノール［J.Immunol.］第131
（１）第497〜502頁（1983）年））や、エル．シー．ヒ
ュアングら［Huang,L.C.et al.］（アーキテクチャ オ
ブ バイオケミストリー アンド バイオフィジィック
ス［Arch.Bioch.Biophys.］第220（１）第318〜320頁
（1983年））や、エス．サージら［Saji,S.et al.］
（ハイブリドーマ第３（２）第119〜130頁（1984年）、
バイオ アブストラクト［Bio Abst.］第79005569）
や、ケイ．ボスレットら［Bosslet,K.et al.］（ベアリ
ング インストミット［Behring Inst.Mitt.］第74巻第
27〜34頁（1984年）、ケミストリー アブストラクト
［Chem.Abst.］CA101（９）第706686）や、エイ．ティ
ー．ローゼンら［Rosen,A.T.et al.］（キャンサー リ
サーチ［Cancer Research］第44（５）第2052〜2061頁
（1984年）、バイオ アブストラクト［Bio.Abst.］第7
9014658）や、ジー．エヌ．ピー．バン ムイ ジェン
ら［Van Muijen,G.N.P.et al.］（アマー ジェイ パ
トール［Amer J.Pathol.］第116（３）第363〜369頁（1
984年）、バイオ アブストラクト［Bio Abst.］第7902
3605）や、ジー．ジェイ．プリンクラーら［Princler,
G.J.et al.］（キャンサー リサーチ［Cancer Researc
h］第42巻第843〜848頁（3-1982年））や、ティー．マ
ザーリックら［Mazauric,T.et al.］（キャンサー リ
サーチ［Canser Research］第42巻第150〜154頁（1-198
2年））や、ジェイ．エイ．ブラーツら［Braatz,J.A.et
al.］（キャンサー リサーチ［Cancer Research］第4
2巻第849〜855頁（3-1982年））や、アール．イー．ソ
ボルら［Sobol,R.E.et al.］（フェド プロク［Fed.Pr
oc.］第41（３）第409、アブストラクト［Abst.］第816
（４−1982））によって述べられている。
あらかじめ定められた特異性の抗体を分泌する融合細胞
の連続培養が、コーラーら［Kohler et al.］（ネイチ
ャー（1975年）265:495〜497［Nature（1975）265:495-
497］）によって述べられている。腫瘍抗体の生産手段
は、米国特許第4,172,124号に述べられている。
発明の要約 本発明は、ヒト非小細胞肺癌（NSCLC）の抗原における
決定基部位を限定するモノクローナル抗体に関する。
“NSCLC細胞”なる用語は、類表皮腫癌細胞、腺癌細胞
および未分化大細胞癌細胞を含むものである。決定基部
位はまた、例えば、乳房のいくつかの癌などのいくつか
の他の癌の抗原において見い出されることができ、そし
て、これゆえ本発明の抗体は、これらの他の癌細胞に対
しても結合する。これらのモノクローナル抗体は、腫瘍
細胞に対するよりも低い度合で正常成人細胞に結合す
る。“より低い度合での結合”なる用語は、結合が免疫
組織学的技術によって検知することが不可能であろうこ
と、若しくは、結合が、免疫組織学的技術によって決定
されるようにNSCLC細胞に対して結合するよりも約４倍
から５倍程小さいであろうことを意味する。このモノク
ローナル抗体は、マウスハイブリドーマによって分泌さ
れる。
本発明はまた、本発明に係るモノクローナル抗体を用い
るいくつかの診断方法にも関係している。このような方
法のひとつは、NSCLC細胞の存在の、このような細胞を
含んでいるであろうと疑われる検体における、測定を包
含するものである。この検体は、モノクローナル抗体と
接触させられ、そしてこのことは、この検体において存
在し得る他の細胞のタイプから、このような細胞を識別
できるものである。接触は、抗体のこのような細胞への
結合のための条件下で行なわれる。接触の後、検体にお
ける抗体のこのような細胞への結合の存在あるいは不在
が測定される。この結合は、検体におけるNSCLC細胞の
存在あるいは不在に関連するものである。一般に、検体
は、モノクローナル抗体に関する標識された特異的結合
パートナーと接触させられる。この標識は、検知可能な
信号を発し得るものである。
特定の実施態様の説明 本発明は、ヒトNSCLC細胞上の抗原に特異的な抗体なら
びにこのような抗体の機能的等価体、結合フラグメント
および免疫複合体、さらにこのような抗体を用いるある
診断方法に関するものである。例えば、本発明のモノク
ローナル抗体は、ケーラーとミルスタイン（上記）の標
準的技術によって製造され得る。例えば、複数の滲出液
からのヒト肺癌細胞あるいはヒト非小細胞肺癌からの培
養細胞、または正常胎児肺からの細胞が免疫原として用
いられる。これらの細胞はマウス中へ注入され、十分な
時間の後、マウスは屠殺されそして脾細胞が得られる。
所望される免疫グロブリンに関しコード化する脾細胞染
色体は、該脾細胞を、骨髄腫細胞とあるいはリンパ腫細
胞と、通常ポリエチレングリコールの存在下において、
融合することによって不滅化される。融合されたハイブ
リドーマを含む得られた細胞は、HAT培地などのごとき
選択培地において増殖させられ、そして生存細胞がこの
ような培地において限界希釈条件を用いて増殖される。
細胞は、例えばマイクロタイターウェルなどのような適
当な容器中にて増殖され、そして上済み液が所望の特異
性を有するモノクローナル抗体に関してスクリーニング
された。
モノクローナル抗体の収率を高めるために種々の技術が
存在し、例えばハイブリドーマ細胞を受け入れる哺乳動
物宿主の腹腔内へハイブリドーマ細胞を注入し、そして
腹水を収穫するといったようなことがある。腹水中に十
分な量のモノクローナル抗体が集められない場合、該抗
体は宿主の血液から収穫される。種々の周知の方法が、
モノクローナル抗体を他のタンパク質あるいは他の不純
物から遊離するための、モノクローナル抗体の単離およ
び精製に関して存在する（ケーラーとミルスタイン、前
掲、を参照のこと）。
本発明のこのようなモノクローナル抗体の１つは、L3と
呼ばれる新規なモノクローナル抗体で例示される。この
モノクローナル抗体は、ヒトNSCLC細胞、すなわち悪性
細胞のドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（SDS-PAGE）による分子量が76,000の特性を
有する細胞関連抗原における決定基部位、およびNSCLC
細胞により培養培地中へ分泌されたタンパク質抗原（形
態I,IIおよびIII抗原）における決定基部位を限定す
る。この抗体はIgG1イソタイプである。このL3抗体は、
L3マウスハイブリドーマによって産生される。
形態ＩのL3抗原は、ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアク
リルアミド一次元ゲル電気泳動（SDS-PAGE）において、
94,000の分子量を有するものである。形態IIのL3の抗原
はSDS−PAGEにおいて76,000の分子量を有し、また形態I
IIのL3抗原はSDS−PAGEにおいて26,000の分子量を有す
る。
形態ＩのL3抗原は、培養培地からアフィニティークロマ
トグラフィーによって９倍に精製され得（第１表）、そ
してアフィニティークロマログラフィーは、糖タンパク
質の１つである形態ＩのL3抗原をそれぞれ70％および90
％より以上含む組成物を与えるためのアクリルアミドゲ
ル技術に続かれる。アフィニティークロマログラフィー
精製から得られた組成物は、培養培地についての522単
位/mgに対して46,500単位/mgの比活性を有している。こ
の比活性は、Calu−１細胞のホルマリン固定化単層を用
いる競合的結合検定において、125Ｉ標識されたL3抗体
の結合を50％まで阻止するのに必要とされる抗原の量と
して定義される。アフィニティークロマログラフィーに
より培養培地から得られた組成物は、形態Ｉの抗原を70
％以上含み、そしてSDS−PAGEで約50,000〜200,000の間
の分子量の非特異的タンパク質物質である30％未満の多
くの部分は、より少ない量である約10〜20％の形態IIの
抗原を含むものである。組成物中には、微量の形態III
の抗原がまた存在する。
L3抗原の細胞および細胞外形態の間の関係を決定するた
めに、細胞は35Ｓメチオニンで放射性標識され、そして
パルス追跡実験が行なわれた。細胞は１時間の間35Ｓメ
チオニンでパルス標識され、標識されていないメチオニ
ンを含む培地中へ種々の時間置かれ、そして免疫沈降分
析がなされた。最初に、すべての特異的免疫沈降可能細
胞結合放射能が分子量76,000タンパク質において見出さ
れた。
観察された他の標識されたタンパク質はまた、抗体が除
かれたサンプルにおいても見出された。追跡期間の間、
分子量76,000の形態における放射能は、減少し、一方、
培地中へ放出された形態（MW94,000）において見出され
た放射能は増加した。細胞結合形態における放射能は、
放出された形態において表われた放射能と同様の動力学
を有し消失し；双方のプロセスに関するt1/2が、濃度定
量的分析によって約1.5時間であると測定された。これ
らの結果は、抗原の細胞結合した分子量76,000形態が、
分子量94,000の形態の先駆体（形態ＩのL3抗原）である
ことを示唆するものである。
このL3抗原が糖タンパク質であるゆえに、炭水化物修飾
は、細胞からの放出の間の観察されたL3抗原のサイズに
おける明白な増加についての想像される説明となるであ
ろう。この可能性は、該分子の細胞形態および放出され
た形態を含む免疫沈降物を公知の特異性のグリコシダー
ゼで処理することにより調べられた。細胞結合L3抗原の
サイズは、分子量59,000に、エンドグリコシダーゼＨ
（Endo H）での処理によって低減されたが、ノイラミニ
ダーゼによっては影響されず、このことは、それがN-架
橋高マンノースオリド糖を含んでいることを示すもので
あった（タレンチノら,1974年 ジェイ．バイオル．ケ
ム.,249:811〜817［Tarentino.1974,J.Biol.Chem.249:8
11-817］を参照のこと）。この結果は、成熟が、N-架橋
グリコシル化の公知の阻止剤である、ツニカマイシンに
感応性である発見と一致する。（レホルら,1976年 エ
フイービーエス レターズ,71:167〜170［Lehle,et a
l.,1976,FEBS Letters,71:167-170］）。これに対し
て、放出された抗原は、Endo H耐性であるが、ノイラミ
ニダーゼ処理によって分子量80,000にサイズにおいて低
減され、このことは形態ＩのL3抗原における末端シアル
酸残基の存在を示すものである。これゆえ、細胞結合形
態から放出形態へのL3抗原の転化はN-架橋炭水化物側鎖
の成熟によって達成される。
形態ＩのL3抗原のアミノ酸末端配列は、アフィニティー
クロマログラフィーおよびアクリルアミドゲル分離技術
の組合せにより精製された組成物において、周知の技術
を用いて決定された。この配列の（α）は、以下の通り
であった。
そしてさらに以下のように定義された。
アミノ酸に関する上記１文字記号はＶ=バリン、Ｎ=アス
パラギン、Ｄ=アスパラギン酸、Ｇ=グリシン、Ｍ=メチ
オニン、Ｒ=アルギニン、Ｌ=ロイシン、Ａ=アラニン、
Ｔ=トレオニン、Ｑ=グルタミン、Ｅ=グルタミン酸、Ｉ=
イソロイシン、Ｆ=フェニルアラニン、Ｙ=チロシンおよ
びＷ=トリプトファンであるこれらの周知の意味を有す
る。上記は、形態IIのL3抗原が存在しようがしまいが、
形態ＩのL3抗原を含有する組成物に関する単一配列とし
て得られる。
L3抗原の上記の30のN-末端アミノ酸配列の、ザ ナショ
ナル バイオケミカル リサーチ ファウンデーション
プロテイン バンク［the National Biochemical Res
earch Foundation protein bank］（1985年３月出版）
において存在するタンパク質配列との比較は、顕著な相
同を何ら表わさなかった。形態ＩのL3抗原の配列はま
た、ヒトC1-エステラーゼインヒビターおよびヒトα‐2
-チオールプロテイナーゼインヒビターを含む、現在こ
のデータベースに列挙されていない、いくつかの血清タ
ンパク質のものと比較された。これらの配列のいずれも
形態ＩのL3抗原のN-末端配列と何ら顕著な相同を表わす
ものではなかった。
我々は、形態ＩのL3抗原が正常ヒト血清中に存在し、そ
して血清から形態ＩのL3抗原が精製されることを確定し
た。血清からの該L3抗原の特性が第３表に概要される。
形態ＩのL3抗原は、39％の収率を有して正常ヒト血清か
ら3000倍容以上で精製され得る（第２表）。SDS−PAGE
による精製物質の分析は、主要成分が、培養培地から精
製された形態Ｉおよび形態II成分（いずれの形態も最初
の血清サンプルの主要成分ではない）と共泳動したタン
パク質であることを明らかにした。血清からの形態Ｉお
よび形態IIのL3抗原の双方が、もとのゲルにおいて２つ
の別個な成分に分割されることは、注目すべきことであ
り、このことはおそらくグリコシル化相違に帰因するミ
クロ異質性を示す。双方の形態とも、イムノブロッティ
ング分析に続いて、また放射性ヨウ素化および免疫沈降
の後に反応的である。培養培地から精製された抗原での
場合、免疫沈降の後に、さらに別の形態である分子量2
6,000（形態IIIのL3抗原）が検知される。イムノアフィ
ニティークロマトグラフィーによって得られた組成物
は、形態ＩのL3抗原を50重量％より多く含み、残部物質
は、形態IIIのL3抗原、トランスフェリンおよびSDS−PA
GEで約50,000〜200,000の分子量の非特異的タンパク質
からなる。この組成物は、正常ヒト血清についての13.3
単位/mgに対して45,500単位/mgの比活性を有する。
これらの結果は、L3抗原活性が、培養培地および血清の
双方において見出された２つの成分（形態Ｉおよび形態
II）において発現されることを示している。適当なSDS
−PAGEによる血清からの形態ＩのL3抗原の更なる精製
は、90重量％より多いレベルで形態ＩのL3抗原を卓越し
て含有し、不定微量の形態II抗原と、トランスフェリン
および約50,000〜200,000の分子量の非特異的タンパク
質である残余物質を含むものである。
二次元等電点電気泳動‐SDS−PAGEにより血清および培
養培地の双方から精製される、125Ｉ標識され免疫沈降
された抗原が比較された。双方の抗原の二次元移動度は
きわめて類似しており、4.2〜5.0のpH範囲で異質種とし
て泳動する形態Ｉおよび形態II成分を有していた。双方
の源からの形態ＩのL3抗原はまた、5.9および6.2の概算
pH値で泳動する２つのより小さい成分を示す。双方の抗
原の炭水化物組成は、またグリコシダーゼ感応性に関し
て試験することによって調べられた。双方の源からの形
態Ｉおよび形態IIのL3抗原は、Endo H耐性であり、一方
双方のノイラミニダーゼ処理は、代射的標識された抗原
の処理に続き見られる特徴的な分子量80,000のフラグメ
ントの出現をもたらすものであることが見出された。形
態II抗原のノイラミニダーゼ感受性は、これがL3抗原の
分子量76,000の細胞結合形態とは異なるものであること
を示すものである。
双方の分子が構造的に同様であることを確認するため
に、我々は、双方の形態からの形態Ｉ分子をクレベラン
ドら，（1977年）ジェイ．バイオル．ケム.,252:1102〜
1106［Cleveland et al.,（1977）,J,Biol.Chem.252:11
02-1106］によって述べられるような一連の部分プロテ
アーゼ開裂反応にかけた。培養培地および血清の双方か
ら精製された、放射標識化形態Ｉ抗原が、調製用SDS−P
AGEゲルから切り取られ、そしてV8プロテアーゼでフィ
ンガープリントされた。双方の分子は同一の部分開裂パ
ターンを生じ、少なくとも５つの制限的部分開裂生成物
が、双方の場合において観察される（分子量=76,000,4
9,000,31,000,20,000および14,300）。これらの結果
は、培養培地およびヒト血清から精製されたL3抗原がか
なり関連あるものであることを示すものである。
我々は次に、血清からのL3抗原の３つの形態の間の関係
を研究した。形態Ｉおよび形態IIに関するすべてのフィ
ンガープリントは、形態II分子が形態Ｉ分子から誘導さ
れる分子量31,000および分子量14,300のフラグメントを
生じないものであるが、極めて類似しているものであ
る。このパターンは形態Ｉおよび形態IIの分子が極めて
関連のあるものであることを暗示するものである。形態
III抗原は、血清中に見られるより大きな抗原性形態と
分子量14,300の部分開裂生成物を共有し、このことは、
形態III抗原も、形態Ｉ抗原に構造的に関連することを
示すものである。種々の形態の間の構造において極めて
類似することは、形態IIおよびIII分子が形態Ｉから誘
導されることを暗示するものである。
L3抗原が、肺癌以外の腫瘍タイプの抗原性成分として過
去に述べられたかどうかを決めるために、放出あるいは
分泌された腫瘍関連抗原に関するコンピュータに援助さ
れた文献サーチが行なわれた。
我々は、L3抗原と同様のサイズでかつ炭水化物組成であ
る、黒色腫分泌タンパク質抗原のいくつかの報告（ナタ
リら（1982年），キャンサー レス.42:583〜589;ブモ
ールら，（1982年）ハイブリドーマ1:283〜292;および
ウィルソンら，（1981年），イント．ジェイ．キャンサ
ー 28:293〜300［Natali et al.（1982）Cancer Res.4
2:583-589;Bumol et al.,（1982）Hybridoma 1:283-29
2;and Wilson et al.,（1981）Int.J.Cancer 28:293-30
0］）を発見した。
少量の以前に記載されたモノクローナル抗体の１つ［46
5.12S;前記ナタリら（Natali et al.）］は、黒色腫関
連抗体に関する第１回国際会議（First International
Workshop on Melanoma Associated Antigens）の出席者
を通じて入手できた。本発明者らは、この抗体を遂次免
疫沈降実験に使用してL3抗原と抗体465.12Sにより認識
された抗原との同一性について試験を行なった。両抗体
は、35S-メチオニンで代謝的に標識された細胞の培養培
地からMr94,000タンパク質を特異的に沈降させる。免疫
沈降法によりL3または465.12S抗原のいずれかについて
の培養培地の枯渇は、他方の抗原の抗原活性の随伴枯渇
を生起する。これは、両抗体により認識される抗原決定
基が同一分子上で運搬されることを示す（第３表）。し
かしながら、この二つの抗体により認識されたエピトー
プは、125I-L3抗体の結合に関する抗体465.12Sの競合を
検出できなかったので、明らかに異なる。
L5と命名されている本発明の他の抗体は、ヒトNSCLC細
胞に特有な細胞表面タンパク質抗原上の決定基部位を決
定する。上記方法および125Ｉ標識法により決定された
ように、該タンパク質の分子量は、約135,000ダルトン
である。この抗体はIgMクラスのものである。該L5抗体
は、主要器官の線維芽細胞類、内皮細胞類および上皮細
胞類のような正常な細胞とは検出可能に結合しない。該
L5抗体は、L5ネズミハイブリドーマから産生される。L5
抗原は、クリーブランドらがジャーナル，オブ，バイオ
ロジカル，ケミストリー第225号第1102〜1106号［Cleve
land et al.（1977）J.Biol.Chem.252 :1102-1106］に
記載している方法に示されているように、Mr24,000およ
び16,000の二つの特徴的なV8プロテアーゼフラグメント
を有している。したがって、L5抗原は、同様な分子量の
他の抗原からは区別される。
本発明の他のモノクローナル抗体は、L18と命名され、
かつヒトNSCLC細胞に特有な他の細胞表面タンパク質抗
原上の決定基部位を決定する。このタンパク質の分子量
は、前記両方法とで決定して約72,000ダルトンである。
該抗体は、IgG1アイソタイプのものである。このL18の
抗体は、若干の正常細胞、特に脾臓の細胞に弱い程度に
結合する。また、本発明の範囲内には、Fab、F(a
b′)2、Fvフラグメント等の前記モノクローナル抗体の
有用な結合フラグメントも含まれる。この抗体フラグメ
ントは、常法により得られる。例えば、有用な結合フラ
グメントは、パパインまたはペプシンを用いる抗体のペ
プチダーゼ分解により産生される。有用な結合フラグメ
ントという用語は、該フラグメントがその同一起源抗原
上の結合部位について抗体と競合することを意味する。
本発明の新規な抗体の上記の特定の例は、それぞれの抗
原上の特異的決定基部位に結合しかつマウス源からの特
異なクラスおよびイソタイプのものである抗体を目的と
するものであるが、これは何ら限定を意味するものでは
ない。上記抗体類、ならびにマウス源、ヒトを含むその
他の哺乳動物源もしくは他の源またはこれらの組合せの
いずれかからの上記抗体類を機能的等価性を有する抗体
類が、本発明において、このようなクラス内のイソタイ
プを含めてIgM、IgA、IgE等のごとき他のクラスのもの
も同様に用いられ得る。“機能的等価性”なる用語は、
抗体が上記に述べた決定基部位に結合することができ、
そしてこのような部位に関して本発明の特定の抗体と競
合し得ることを意味する。すなわち、このような抗体
は、このような決定基部位を有する細胞もしくは細胞フ
ラグメントまたは分泌された抗原を含有する検体と組合
せられた場合に、このような決定基部位に結合し、そし
てこのような部位への結合から本発明の抗体を阻害する
ものであろう。
本発明の一方法は、肺組織において悪性状態の存在を測
定することを含むものである。「悪性状態」なる用語
は、がん（腫）（carcinoma）を同時に含む形成異常（d
ysplasti）の、新生物形成（neoplastic）の悪性のまた
は腫瘍性の細胞等の存在を表わす。この検体は、本発明
のモノクローナル抗体と接触されるかあるいは組み合わ
される。接触は抗体の悪性細胞への結合のための条件下
で行なわれる。接触の後、検体における悪性細胞への抗
体の結合の存在が観察される。すなわち、検体は、抗体
と抗原部位との免疫複合体に関して調べられる。この免
疫複合体形成は、検体における悪性細胞の存在に関する
ものである。
本発明による方法の特定の例（説明のために挙げられる
もので本発明を限定するものではない）は、切除組織に
おける腫瘍細胞の検知方法である。上記方法は、腫瘍の
除去の後に得られた腫瘍の一切片である検体に対して適
用される。切除された腫瘍は、切片を得るために処理さ
れ、この処理は、最初に、腫瘍もしくは組織を冷凍する
こと、通常は切除直後の冷凍を含むものである。組織の
冷凍層は、次に、例えば低温槽を用いて、切片へと切断
される。
上記のようにして得られた腫瘍の切片は、本発明のモノ
クローナル抗体と接触させられ、そして次に検知可能な
標識で標識された、上記モノクローナル抗体に対して向
けられた第２の抗体と接触させられる。
切除された検体、例えば腫瘍の切片は、第１のモノクロ
ーナル抗体と、該抗体の悪性細胞への結合のための条件
下で接触させられる。インキュベーションは、例えばガ
ラス製ペトリ皿のような適当な容器において、約20〜30
℃の温度で約15〜30分間の間、例えば少量のアジ化ナト
リウムを含有するリン酸緩衝食塩水などのような水性媒
体中で通常行なわれる。用いられる抗体の量は、通常検
知可能な結合を提供する、すなわち抗体と問題の決定基
ないしは抗原部位との間の免疫複合体の検知可能な数を
提供するのに十分なものである。
インキュベーションに続き、切片は、非特異的に結合し
た抗体を低減ないし消去するために洗浄され、そして次
に、抗原部位を保持する検体の細胞へのモノクローナル
抗体の結合によるものである上記の複合体を観察するた
めに調べられる。結合は、切片における悪性細胞の存在
と関係している。従って、結合は、例えば、検体を該モ
ノクローナル抗体に関する標識された特異的結合パート
ナーと接触させることによって測定される。標識は検知
可能な信号を発し得るものであり、放射性標識、例えば
蛍光体などのような発色団、酵素などであり得る。
上記のアプローチを用いる技術の一例は、免疫蛍光染色
法である。この技術において、腫瘍の冷凍切片は、アセ
トンを用いてガラス製スライド上に固定され、そして例
えばペトリ皿にて、モノクローナル抗体とインキュベー
トされる。例えばリン酸緩衝食塩水などのような適当な
緩衝液で洗浄の後、この切片は、ペトリ皿上に移され、
そして例えば、用いられたモノクローナル抗体に関して
特異的な標識化抗体であり得る、モノクローナル抗体に
関する標識された特異的結合パートナーと接触させられ
る。ほとんどの場合において、モノクローナル抗体はマ
ウス源由来のものであるので、モノクローナル抗体に関
し特異的な標識された抗マウス免疫グロブリンが用いら
れ得る。このような免疫グロブリンは、適当な宿主をマ
ウス抗体で注射し、十分な時間をおき、そして注射され
た宿主の血液から抗マウス免疫グロブリンを収穫するこ
とによる標準的技術により産生され得る。
該スライドの、例えば水性緩衝液を用いての二度目の洗
浄の後に、切片は、蛍光抗体含有流体およびカバーグラ
スで覆われ、そして次に該切片に対するモノクローナル
抗体の結合を測定するために蛍光顕微鏡で調べられた。
結合の測定はまた、検体中でこのような結合の位置の識
別をも含むものである。
検体へのモノクローナル抗体の結合または、放射性物
質、染料および蛍光体を含む発色団、あるいは酵素など
のような検知可能な信号を発し得る標識に共有結合され
たモノクローナル抗体を用いることによって測定され得
る。抗体当りの用いられた標識の数は、標識された抗体
が用いられる診断方法の必要条件および抗体へ標識を結
合するための部位の有効性によって通常決定される。
抗体および抗体フラグメントへ標識を結合させるための
方法は当分野において周知のものである。このような方
法は、米国特許4,220,450号、第4,235,869号、第3,935,
074号および第3,996,345号中に見い出される。
本発明のモノクローナル抗体が用いられる技術のさらに
別の例は、イムノペルオキシダーゼ標識化（ガリギュー
スら，インターナショナル ジャーナル オブ キャン
サー（1982年）29:511〜515により変更されたようなス
テロンベーガー，イムノサイトケミストリー，ジョン
ウィリー アンド サンズ，ニューヨーク,1979年，第1
04〜109頁［Sternberger,Immunocytochemistry,John Wi
ley＆Sons,New York,1979,pp104-169 as modified by G
arrigues et al.,Int.J.Cancer（1982）29:511-515］）
である。試験されるべき組織は、ガラス製スライドなど
のような支持体上にアセトンなどのような適当な溶媒を
用いて固定される。次に、組織は、モノクローナル抗体
とインキュベートされ、そして洗浄されて結合していな
い抗体が除かれる。次に組織はウナギ抗マウスIgGとイ
ンキュベートされ、結合していない抗体を除去するため
に洗浄され、マウスペルオキシダーゼ‐抗ペルオキシダ
ーゼ複合体と組合わされ、結合していない結合体を除去
するために洗浄し、そして次に酵素に関する基質で処理
された。この処理に続き、該スライドは、検知可能な信
号に関して調べられた。
本発明の抗体は、痰のような肺からの剥脱性細胞検体に
おける悪性状態の存在を測定する方法に用いられて得
る。“剥脱性”なる用語は、検体が、組織の表面をこす
るあるいは洗浄することによって得られた単離細胞ある
いは細胞の凝集物（それらの細胞は個々に、あるいは鱗
屑ないしは板状において除去される）からなるものであ
ることを意味するものである。剥脱性細胞検体は、生検
によって得られたもののような、切除された組織と区別
されるべきである。検体と抗体との間の接触は、抗原部
位への抗体の結合のための条件下で行なわれる。接触の
後、抗原部位への抗体の結合の存在あるいは不在が測定
され、そしてこれは肺における悪性状態の存在に関する
ものである。
肺における悪性の存在を測定するために、痰試料は、こ
の方法において使用される剥脱性細胞検体を与える。こ
の方法は、気管支、あるいは咽頭口部、口を含む胃腸路
などからの剥脱性細胞検体における悪性状態の検知にお
いて利用性を見出すものである。
剥脱性細胞検体は次に、抗原‐抗体複合体を形成するた
めに、検体の特異的抗原部位への抗体の結合のための条
件下で前述の抗体と接触させられた。この抗原部位は、
検体における細胞あるいは細胞フラグメント上に存在さ
れ得る。一般に、検体は例えば通常ガラスあるいはその
他の適当な材料からなるスライドのような適当な支持体
上へ載置される。剥脱性細胞検体は、通常、スライドの
表面上に検体の薄層を与えるようにスライド上に塗抹さ
れる。抗体と検体との間の接触は、通常、水性緩衝化媒
体中にて行なわれる。用いられる緩衝液は、リン酸塩、
トリス、重炭酸塩などを含む。pHは、検体および抗体の
性質に関係し、通常５〜８の範囲内にある。水性媒体
は、約０〜40％の量の有機極性溶媒をさらに含んでいて
もよい。有機極性溶媒は水溶性であり、通常約１〜10個
の炭素原子と約１〜４個の酸素原子を有している。抗体
は、水性媒体中に約１〜100μg/ml、好ましくは約10〜2
0μg/mlの濃度で存在する。検体と抗体との接触の間の
温度は、約４〜40℃、好ましくは10〜30℃である。接触
の期間は、通常約15〜20分、好ましくは約30〜60分間で
ある。
検体と抗体との間の接触の後、支持体は通常未反応抗体
を除去するために処理される。通常、これは支持体を水
性の、通常緩衝化された、媒体で洗浄することによりな
される。
次に、検体における抗原部位へ結合した抗体（ここでこ
の結合は、該位置での悪性状態の存在に関係する）の存
在が観察される。すなわち、検体は、形成された抗原‐
抗体（免疫）複合体の数を測定するために調べられる。
いくつかの例においては、問題の抗原部位の極めて少な
い数が、剥脱性細胞検体において見い出され得ることに
注意すべきである。しかしながら、悪性状態において
は、多数の抗原部位が存在し、この後者の状態は、多数
の抗原‐抗体複合体が、悪性状態より存在している場合
には計測可能であるゆえに、この方法により、非悪性状
態から容易に識別できる。結合の存在の測定を行なうた
めに、検知可能な信号を発する手段が、検定系に組み入
れられる。例えば、検定において用いられた抗体を検知
可能な信号を発し得る標識へ結合させることができる。
標識は、放射性物質、染料および蛍光体を含む発色団、
酵素あるいは同様のものであり得る。抗体に対して用い
られる標識の数は、方法の必要条件および抗体へ標識を
結合させるための部位の有効性によって通常決定され
る。
あるいはまた、洗浄されたスライドを、例えば用いられ
た抗体に対して特異的な標識された抗体であり得る、抗
体に対する標識された特異的結合パートナーと接触させ
ることも可能である。モノクローナル抗体がマウス源由
来のものである場合には、該方法において用いられた抗
体に対して特異性の標識された抗マウス免疫グロブリン
が用いられ得る。このような免疫グロブリンは、適当な
宿主にモノクローナル抗体を注射し、適当な時間をお
き、そして注射された宿主の血液から抗マウス免疫グロ
ブリンを収穫することによる標準的技術によって産生さ
れ得る。抗体に対する標識された特異的結合パートナー
が用いられる場合、スライドは、該スライドを蛍光に関
して調べる前に再度、水性媒体で洗浄されなければなら
ない。
蛍光体標識が用いられる場合において抗体と細胞検体と
の間の結合の存在を測定するために、スライドは、通常
は蛍光顕微鏡を用いて、蛍光に関して調べられる。蛍光
体以外の標識が用いられる場合には、スライドないし検
体は、沈澱物、色彩等の形成に関して調べられる。
上記の説明は、免疫蛍光検査技術における本発明の抗体
使用に主として注がれたものである。しかしながら本発
明の抗体は、抗原‐抗体反応を含むほとんどの検定法に
おいて用いられることができるものである。該検定法群
は、均質性［homogeneous］でも不均質性［heterogeneo
us］でもよい。均質性検定方法においては、検体は、血
清、尿および同様なもののごとき生物学的流体であり
得、または、検体は溶解されそして屑を除去するために
清澄化され得る。例えば、抗体L3が、がん患者からの血
清中の同起源抗原（cognate antigen）、すなわちＩ
型、II型またはIII型のL3抗原の濃度を測定するために
本発明者らにより用いられ、あるがん患者は、通常の対
照と比較してこの抗原をより高いレベルで持つことが見
い出された。免疫学的反応は、通常特異的抗体、標識さ
れた被分析物および関心の試料を含むものである。標識
から生じる信号が、抗体の標識された被分析物への結合
において直接的にあるいは間接的に変化される。免疫学
的反応およびその程度の検知の双方が、均質溶液におい
て行なわれる。用いられ得る免疫化学標識は、フリーラ
ジカル類、蛍光染料類、酵素類、バクテリオファージ
類、補酵素類などが含まれる。
不均質性検定方法においては、試薬は、通常、検体、特
異性抗体、および検知可能な信号を発するための手段で
ある。検体はプレートあるいはスライドなどのような支
持体上に通常載置され、そして液相中で抗体と接触させ
られる。支持体は次に液相から分離され、支持体相ある
いは液相のいずれかが、検知可能な信号に関して、この
ような信号を発する手段を用いて調べられる。この信号
は、検体における被分析物の存在に関するものである。
検知可能な信号を発する手段は、放射性標識類、蛍光体
類、酵素類などの使用を含むものである。不均質性免疫
検定法の例としては、放射性標識免疫検定法（ラジオイ
ムノアッセイ）、免疫蛍光検査方法、酵素結合免疫学的
検定法などが含まれる。
上記の免疫学的検定技術の詳細な論議に関しては、エド
ワードティー マギオ［Edward T.Maggio］（シーアー
ル シー プレス インコーポレーテッド，ボカ ラト
ン，フロリダ,1980年［CRC Press Inc.,Boca Raton,Flo
rida,1980］）による“エンザイム‐イムノアッセイ［E
nzyme-Immunoassay］”を参照のこと。例えば、米国特
許第3,690,834号、第3,791,932号、第3,817,837号、第
3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、第3,90
1,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,996,345
号および第4,098,876号（この列挙は、余す所なく掲げ
ることを意図するものではない）もまた参照のこと。
本発明の抗体はまた、ジェイ．ナクル．メド．（1983
年）24:123〜129［J.Nucl.Med.（1983）24:123-129］中
におよびジャーナル オブ クリニカル インベスティ
ゲーション（1983年）72:2101〜2114［J.Clin.Invest.
（1983）72:2101-2114］中に悪性骨髄腫に関して述べら
れたものと同様な方法において、NSCLCを保持するヒト
患者での転移性沈積物を画像とするために用いられ得
る。抗体またはそのフラグメントは、放射性標識され、
そして患者へ静脈内投与され、その後該患者は例えばガ
ンマ線カメラなどを用いて画像とされる。
本発明はまた、上記に述べた方法を実施するための診断
キットを含むものである。１つの実施態様においては、
診断キットは、パッケージされた組合せで（ａ）上記に
より詳細に定義されたモノクローナル抗体および（ｂ）
上記モノクローナル抗体に対する特異的結合パートナー
と検知可能な信号を発し得る標識との結合体からなる。
この試薬はまた、このような方法を行なうのに必要なよ
うに緩衝剤、および例えば、ポリサッカライド類のよう
なタンパク質安定化剤などのごとき補助的作用物質をも
含み得る。この診断キットはさらにまた、必要に応じ
て、該標識が一構成成分である信号発生系の他の構成成
分、試験におけるバックグランド干渉を低減するための
作用物質、対照試薬、試験を行なうための装置などを含
み得るものである。他の実施態様においては、診断キッ
トは、本発明のモノクローナル抗体と検知可能な信号を
発し得る標識との結合体からなるものである。上記した
ような補助的作用物質はまた存在し得る。
本発明の抗体は、治療学的に用いられ得る。固有の生物
学的特性を有する抗体は、直接治療剤として有用であ
る。また、抗体は、免疫毒素を形成するために毒素へ、
また放射線製薬的または製薬的に形成するために放射性
物質または薬剤へ結合され得る。抗体の免疫毒素あるい
は放射線製薬品を製造する方法は、周知である（例えば
キャンサー トリートメント レポーツ（1984年）68:3
17〜328［CancerTreatment Reports（1984）68:317-32
8］を参照のこと）。
本発明のモノクローナル抗体の他の治療的用途は、免疫
源として本発明のモノクローナル抗体の１つを使用する
ことにより産生される抗インディオタイプ抗体での患者
免疫処理である。このような免疫処置は、能動的抗腫瘍
活性をもたらし得る（例えば、ネポムら，プロシーディ
ング オブザ ナショナル アカデミー オド サイエ
ンシズ オブザ ユナイテッド ステート オブ アメ
リカ（1984年）81:2864〜2867［Nepom et al.,Proc.Nat
l.Sci.U.S.A.（1984）81:2864-2867］を参照のこと）。
同様のアプローチにおいて、患者は、精製形態の抗原、
該抗原のペプチドフラグメント、あるいは該抗原の修飾
形態で免疫化され得る。
特に、本発明の興味ある観点は、本発明のL3抗体は、他
の抗体と組み合わせて使用され得る。この組合せは、少
なくとも、前記肺癌のタイプ、特に未分化細胞肺癌を検
出することにおいて有効である。例えば、（1984年11月
２日に出願された米国特許出願番号667,521に開示され
ている）モノクローナル抗体L3およびL18は、有効量、
すなわち前記肺癌の全てを検出し得る組合せを与える量
で組み合わされる。
本発明のモノクローナル抗体のいくつかはまた、乳癌お
よび陰門の表皮細胞癌のようなその他の癌に関連する抗
原における決定部位を限定する。従って、本発明の抗体
は、このような癌に対して向けられた診断的あるいは治
療的製品における使用を見い出し得るものである。
実施例 本発明は以下に例示される実施例によってさらに説明さ
れる。使用される多数の方法がまず最初に述べられる。
材料 培養培地はジブコ［Gibco］のものを使用した。ウシ胎
児の血清はジブコまたはハイクロン［Hyclone］にもの
を使用した。テフロンで被覆された多数のウェルの顕微
鏡用のスライド（12ウェル）はメロイ［Meloy］のもの
を使用した。プラスチック製の培養皿はコーニング［Co
rning］またはコスター［Costar］のものを使用した。V
8プロテアーゼおよびウシ血清アルブミンはシグマ［Sig
ma］のものを使用した。ノイラミニダーゼおよびパンソ
ルビン［Pansorbin］（フォルマリン固定したスタフィ
ロコッカス・アウレウス（S.aureus）はカルバイオケム
［Calbiochem］のものを使用した。エンドグリコシダー
ゼＨはマイルズ［Miles］のものを使用した。ニトロセ
ルロース（BA85,0.45μ）はシュライヒャー［Schleiche
r］およびシュウェル［Schuell］のものを使用した。プ
ロテインA-セファロース［Sepharose］、CNBr活性化さ
れたセファロース4B、セファデックス［Sephadex］G-1
0、DEAEセファセル［Sephacel］およびプロテインＡ結
合したセファロースCL4Bはファーマシア［Phamacia］の
ものを使用した。NP-40はパーティクル データ リミ
テッド［Particle Date Ltd.］のものを使用した。ポリ
エチレングリコール、Ｘ線フィルムおよびコダブー［Ko
davue］‐染色キットはコダック［Kodak］のものを使用
した。アクリルアミドおよび銀染色キットはバイオ ラ
ッド［BioRad］のものを使用した。予め染色された分子
量マーカーはベセスダ リサーチ ラボラトリーズ，ベ
セスダ，メリーランド州（BRL）［Bethesda Research L
aboratories,Bethesda,Meryland（BRL）］のものを使用
した。14C-メチル化分子量マーカー、3H-グルコサミ
ン、35S-メチオニンおよび125Ｉはアマーシャム［Amers
ham］のものを使用した。FITC接合されたヒツジ抗マウ
スイムノグロブリンがタゴ［Tago］のものを使用した。
パラゴン［Paragon］血清タンパク質の電気泳動装置は
ベックマン［Beckman］のものを使用した。アンフォリ
ンはエルケイビー［LKB］のものを使用した。
免疫組織学的技法 凍結した切片に関する免疫組織学的研究としては、イム
ノケミストリー，ジョン ウィリーとサンズ，ニューヨ
ーク州,1979年,104-169頁（Immunochemistry,John Wile
y ＆ Sons,New York,1979.pp104-169）、ガリギュース
ら（Garrigues et al.）による修正としてイント．ジェ
イ．キャンサー（1982年）29:511-515頁［Int.J.Cancer
（1982）29:511-515］が用いられた。これらの試験につ
いての標的組織は、外科術的に得られ、液体窒素の中で
あらかじめ冷やされたイソペンタンに４時間入れて凍結
された。組織はその後、使用されるまで液体窒素の中ま
たは−70℃で保存された。ウサギ抗マウスIgG［スター
ンバーガー‐メイヤー イムノケミカルズ，インコーポ
レーテッド.,ジャレッツヴィレ，メリーランド州（Ster
nberger-Meyer Immunochemicals,Inc.,Jarettsville,M
D）］は50分の１の希釈で用いられた。マウスペルオキ
シダーゼ‐抗ペルオキシダーゼ複合体［PAP,スターンバ
ーガー‐メイヤー イムノケミカルズ，インコーポレー
テッド（PAP.Sternberger-Meyer Immunochemicals,In
c）］は、特別に精製されたPAPを2mg/ml含有しており、
80分の１の希釈で用いられた。凍結された切片は調製さ
れ、乾燥されアセトンで処理されそして乾燥された［ガ
リギュースら,1982年（Garrigues et al,1982）］。組
織学的評価のために用いられる切片はヘマトキシリンで
染色された。非特異的なバックグランドを減少させるた
めに、切片は５分の１に希釈された正常ヒト血清であら
かじめインキュベートされた［ガリギュースら,1982年
（Garrigues et al.,1982）］。マウス抗体、ヒツジ抗
マウスIgGそしてマウスPAPは10％正常ヒト血清および３
％ウサギ血清の溶液で希釈された。
染色方法は、特異的または対照抗体で連続している切片
を2.5時間処理し、50分の１で希釈されたウサギ抗マウ
スIgGと30分間インキュベートし、さらに80分の１に希
釈されたマウスPAP複合体に20分間さらすことによるも
のであった。抗体を用いたそれぞれの処理の後、スライ
ドはリン酸緩衝溶液（PBS）で２度洗浄された。免疫組
織化学的反応は、新鮮に調製された0.05%3,3′‐ジアミ
ノベンジジンテトラヒドロクロライド［シグマ，セント
ルイス，ミズーリー州（Siguma,St,Louis,MO）］および
0.01%過酸化水素で0.05Mトリス緩衝液においてpH7.6で
８分間進められた。さらに蒸留水中で１％OsO4溶液への
20分間の暴露は染色を強めた。
スライドはそれぞれコード付けされ、そしてコード付け
されたサンプルは独立して研究所によってチェックされ
た。典型的なスライドは差次干渉対比光学器［ツァイス
‐モナルスキ（Zeiss-Monarski）］を使用して撮影され
た。抗体の染色の程度は０（反応なし）、+（ほとんど
の細胞が陽性ではない）、++（少なくとも細胞の３分の
１が陽性）、+++（ほとんどの細胞が陽性）、++++（ほ
とんど全部の細胞が強い陽性を示す）というように評価
された。+と０の染色の差は++と+の染色の差ほど明確に
区別されないので、染色の階級においては++、またはそ
れ以上を「陽性」として数えることにした。腫瘍細胞お
よび支質細胞は腫瘍サンプルにおいて観察された；支質
細胞は全く染色されないかまたは腫瘍細胞よりもさらに
弱く染色されるので染色は腫瘍細胞に関するものが記録
された。
抗原位置の決定 抗原の細胞下局在は、非イオン性界面活性剤での透過化
の前あるいは後の細胞に対して結合する抗体を計測する
ことによって測定された。完全な培養細胞の細胞表面へ
結合する抗体は、125Ｉ標識された抗体を用いての直接
結合検定法（ブラウンら，プロシーディング オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ
ザ ユナイテッド ステート オブ アメリカ（1981
年）78:539〜543［Brown et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.（1981）78:539-543］）によってあるいは、（FA
CS）細胞識別器を用いる間接蛍光によって同定された。
細胞内位置に結合する抗体は、125Ｉ標識された抗体を
細胞に直接結合させ、続いて、パラホルムアルデヒドで
固定化し、さらに続いて非イオン性界面活性剤NP-40で
透過化することによって測定された。
結合検定法 ａ）放射性標識された抗体を用いることによって行なわ
れる結合検定法（ブラウンら，上記）のために、培養細
胞（106）は、培養培地中で熱活性化（56℃で30分間）
胎児ウシ血清100μｌ中の125Ｉ標識された抗体106cpmと
４℃で30分間インキュベートされた。PBS 5mlの添加の
後、細胞は250×ｇで10分間遠心分離することによって
ペレット化された。上澄み液は吸い出され、そしてペレ
ットは125Ｉに関して計数された。非特異的結合を計測
するために、並行的インキュベーションが競合物として
標識されていない抗体10μｇを用いて行なわれた（ブラ
ウンら，上記）。いくつかの例においては、結合検定法
は、類似の様式においてプラスチック製培養皿へ付着し
た細胞単一層上で行なわれた。
ｂ）FACSIIセルソーターにおいて行なわれる結合検定法
のために、細胞は、５ mMエチレンジアミン四酢酸（ED
TA）を含むPBSを用いて、それらの基層から除去され
た。１×105細胞を含有する試料は最初に２μg/mlの濃
度でモノクローナル抗体とインキュベートされ、続いて
1:200の希釈でフルオレセイン結合ヤギ抗マウス抗体と
インキュベートされた。細胞は次に洗浄されそして培養
培地中に再懸濁された。FACS分析の直前に、ヨウ化プロ
ピジウムが非生存細胞を染色するために１μg/mlの最終
濃度へと添加された。FACS分析の間、赤色蛍光を発する
細胞が、生存細胞のみを調べるために、電子的に追出さ
れた。フルオレセイン蛍光の平均強度が、次にそれぞれ
の抗体に関して測定された。陰性の比較対照はモノクロ
ーナル抗体のない試料から構成されており、一方陽性の
比較対照は、HLAタイプ１組織適合性抗原に対するモノ
クローナル抗体からなるものであった。平均チャンネル
フルオレセインが少なくともバックグラウンドの３倍で
あった場合に、染色は陽性であると見なされた。
タンパク質抗原測定 タンパク質抗原を同定するために、肺癌腫またはヒト胎
児肺細胞は表面を放射性ヨウ素化され、または35S-メチ
オニンで代謝的に標識化された。抗原はモノクローナル
抗体とのインキュベーションそしてヤギ抗マウスIgGの
添加およびスタフィロコッカス・アウレウスへの吸着に
よって細胞溶解物から単離された。免疫沈澱物は洗浄さ
れ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって上述のように分析された［ブラウン
ら，上記参照（Brown et al.上記参照）］。35 S-メチオニン標識化 特定の抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、25mMヘペ
ス緩衝液、4mM L-グルタミン、4.5g/lグルコース、10m
M非必須アミノ酸、100単位/mlペニシリン、100μg/mlス
トレプトマイシンおよび15％熱失活化新生子牛血清（NC
S）を含有しているメチオニン非含有ダルベッコ最少必
須培地においてマイクロタイターウェルに播かれた。細
胞は0.1mCi35S-メチオニンと37℃で６時間接触し、そし
て細胞を分離するために上澄液は取り出され、遠心分離
された。
イソタイプ測定 ａ）オクタロニー免疫拡散法 特定のハイブリドーマの上澄液のアリコートが２％寒天
プレートの中央ウェル中へ入れられた。単特異性ウサギ
抗マウスIgイソタイプ抗体（メロイ［Meloy］）が外側
のウェル中へ入れられそしてプレートは室温で２時間、
さらに４℃で一晩インキュベートされた。
ｂ）可撓性ポリ塩化ビニル製の96ウェルプレート（コー
スター［Coster］）が37℃で２時間0.1mg/mlヤギ抗マウ
スIg抗体で被覆され、そして37℃で２時間３％BSA溶液
で対向被覆された。ハイブリドーマ上澄液が次に37℃で
２時間インキュベートされた。PBSで洗浄した後、ウシ
血清アルブミン（BSA）プレートは、37℃で２時間ペル
オキシターゼに結合した単特異性ウサギ抗マウスIgイソ
タイプ抗体（ザイムド［Zymed］）とインキュベートさ
れた。洗浄の後、プレートは0.1Mクエン酸緩衝液pH4.5
中の1mg/mlオルソフェニレンジアミンおよび0.03％H2O2
とインキュベートされた。630nmでの光学密度がダイナ
テックELISAプレート読取器［Dynatec ELISA plate rea
der］において測定された。
黄色ブドウ球菌性プロテインＡ結合検定法 マイクロタイターウェルを、PBS中の５％NCSおよび0.02
％のNaN3と共にインキュベートし、上澄液を吸出した。
25μｌの表皮細孔の懸濁液（２×107細胞/ml）を各ウェ
ルに加え、室温で１時間25μｌの特定の抗体とインキュ
ベートした。プレートを７分間1200rpmで遠心分離にか
け、50％NCS/PBS/NaN3で２度洗浄し、25μｌの125I-黄
色ブドウ球菌性プロテインＡ（約50,000cpm/25l）を加
えた。そのプレートを25℃で１時間インキュベートし、
50％NCS/PBS/NaN3で２度洗浄し、乾燥した。ウェルの底
を切り離し、ガンマカウンターで計測した。
細胞培養 カル‐１肺癌（Calu-1 lung carcinoma）細胞を、アメ
リカンタイプ カルチャー コレクションから得た。増
殖培地〔1ml当り50ユニットのペニシリン、1ml当り10μ
ｇのストレプトマイシンおよび10％（v:v）のウシ胎児
血清（FCS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DME
M）〕中単層培養株として細胞を維持した。細胞を0.05%
トリプシンおよび0.02%EDTA溶液で処理して集め、血球
形で計測した。
間接免疫蛍光検査法 細胞をトリプシン処理で集め、ウェル（直径6mm）当り
５〜20×103の密度でテフロン被覆多ウェルスライド
（メロイ ラボ（Meloy Labs））上に置いた。実験開始
前に細胞を37℃で約18時間保持した。培地を除去し、付
着細胞を0.5mM CaCl2および0.5mM MgCl2を含むリン酸緩
衝溶液（PBS,NaCl,0.14M;KCl,3mM;Na2HPO4×７H2O,8mM;
およびKH2PO4,15mM）で１度洗浄した。その後、細胞を2
3℃で20〜30分間で25マイクロリッターのパラホルムア
ルデヒド溶液（PBS中0.5%）を加え、その場で固定し
た。細胞を洗浄し、細胞内抗原を23℃で５分間0.2％
（v:v）NP40を含むPBSを加えることにより露出させた。
その後、過剰のアルデヒド基を、23℃で少なくとも15分
間結合用バッファー［pH6.8の50mM BES（N,N-ビス［2-
ヒドロキシエチル］‐2-アミノエタンスルホン酸）,0.1
%（w:v）BSAおよび15%FCSを含むDMEM］を加えてブロッ
クした。抗体を結合用バッファー中で10μg/mlに希釈
し、各ウェル当り20〜25マイクロリッターの全容量で加
えた。スライドを４℃で１時間インキュベートし、結合
用バッファーで洗浄した。フルオレセインイソチオシア
ネート結合（FITC）第２抗体（ヤギ抗マウスIgGおよびI
gM）を４℃で１時間加えた。使用したFITC結合体の希釈
率は任意のシグナル対バックグラウンド比をもたらすよ
うに実験的に決定した。インキュベーション後、スライ
ドを結合用バッファーおよび水で洗浄し、空気乾燥し
た。小容量の非退色（anti-fade）溶液［ゼネチィック
システンズ コーポレーション（Genetic Systens Co
rporation］およびカバーガラスを加え、スライドをロ
イツ オルソプラン蛍光分光顕微鏡（Leitz Orthoplan
fluorescence microscope）を使用して測定した。スラ
イドを40×油浸対物レンズのもとで調べ、コダック ト
ライ Ｘ パン フィルムで写真にとった。
代謝性標識化 A.35S-メチオニン 細胞をトリプシン処理により集めた。トリパンブルー排
除により測定した生存能は通常95%より大きかった。４
×106細胞を遠心分離による集め、アミノ酸メチオニン
を除いた1mlの増殖培地中に懸濁された。35S-メチオニ
ン（800Ci/ミリモル）を最終濃度0.5mCi/mlまで加え、3
7℃で１〜６時間回転しながらインキュベートした。そ
の後、標識化細胞を遠心分離によって集め、次の操作前
に洗浄した。ある場合は、放射性標識化細胞懸濁液を標
識化されていないメチオニンおよび10％FCSを含む増殖
培地で10倍に希釈し、100mmの組織培養皿に加え、37℃
でさらに18時間インキュベートした。その後、使用前に
付着細胞をPBSで洗浄した。
B.3H‐グルコサミン3 H‐グルコサミンで細胞を標識する場合には類似の標識
化プロトコールを使用した。最初に、内部グルコースプ
ールを10％透析化FCSを含むがグルコースを含まない増
殖培地中で４〜24時間インキュベートすることで枯渇さ
せた。飢餓後に＞90％生存能を示す細胞母集団を次の実
験に使用した。細胞を上記の如く集め、pH7.4で10％透
析化FCS、0.01M HEPES（N-2-ヒドロキシエチルピペラ
ジン‐N-2-エタンスルホン酸）および0.5MCi3H‐グルコ
サミン［40Ci/ミリモル］を含む1mlの無グルコース増殖
培地中に再懸濁させた。37℃で３時間回転して標識化
後、細胞を遠心分離で集め、PBSで洗浄した。
ヨウ素化 グリーンウッド等（1963）バイオケミカル ジャーナル
89:114〜123（Greenwood,et al,（1963）Biochem,J.
89：114-123）によって記載された方法でクロラミン
Ｔ法を使用して、タンパク質を125Ｉで放射性標識化し
た。タンパク質サンプル（50μｇ）を１〜2mCi125Ｉ
（キャリヤーなし）を含むPBS中へ0.5mlに希釈した。10
μｌの新たに作られたクロラミンＴ溶液（10μｇを含
む）を加え、23℃で５分間反応した。反応を20μｇのNa
2S2O5および３μｇのKIを含む溶液を加えて終了させ
た。未反応125Ｉを1mg/mlのウシ血清アルブミンを含むP
BSで平衡にしたセファデックスG-10（Sephadex G-10）
カラムにおけるクロマトグラフィーで除去した。この研
究で使用された標識化モノクローナル抗体の比活性はナ
ノモル当り約３×109cpmであった。放射性標識化する前
にL3抗原を含むサンプルをセファデックスG-10（Sephad
ex G-10）スピンカラムで脱塩した。
免疫沈降分析 1.抽出物の調製 代謝性標識化細胞を遠心分離で集め、ml当り２〜４×10
6細胞の比率でNaCl、0.15M;Na2HPO4、0.05M;デオキシコ
ール酸ナトリウム１％（w:v）；トリトンＸ−100（Trit
on X−100）,1％（w:v）およびSDS0.1％（w:v）を含むP
IPAバッファー中で可溶化した。４℃で10分間のインキ
ュベーション後、その混合物を遠心分離機（147,000xg,
30分間Ti 70.1ローター）で清澄化した。上澄液を除
き、放射活性の取込みを液体シンチレーションカウンタ
ーにより測定した。
2.免疫沈降35 S-メチオニンおよび125Ｉに対して１〜２×107cpm
（酸沈降性）または3H‐グルコサミンに対して４×106c
pm（酸沈降性）を含む細胞溶解産物のアリコートを４℃
で0.5〜１時間、１μｇの抗体とインキュベートした。
標識化培養培地を分析した時に、分析した全細胞抽出物
の割合に等価なアリコートを使用した。アフィニティー
精製ヤギ抗マウス免疫グロブリン（１〜２μg;ヤギをマ
ウス免疫グロブリンで免疫化して調製した）を含む溶液
を加え、４℃でのインキュベーションをさらに10〜60分
間続けた。50μｌのホルマリン固定化スタフィロコッカ
ス・アウレウス（パンソルビン）の10％溶液を加え、４
℃で５分間インキュベート後、免疫沈降物を遠心分離で
集めた（使用前に、パンソルビンを0.5%（v:v）NP40溶
液で１度、0.05%（viv）NP40溶液で１度洗浄し、1mg/ml
オバルブミンを含む後者のバッファー中に再懸濁させ
た）。沈降物をTNENバッファー（トリスヒドロキシメチ
ルアミノメタン,pH8.0,0.02M:NaCl,0.1M;EDTA,0.01M;お
よびNP−40,0.5%（w;v））で３〜４回洗浄し、使用まで
−20℃で凍結して貯蔵した。
電気泳動 1.SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS PAGE）： 上記ラエムリ（Laemmli）に従ってSDS PAGEを実施し
た。最も頻繁に使用された分離ゲルは10〜20％の直線的
アクリルアミド勾配であり、そしてスタッキングゲルは
５％のアクリルアミドを含んでいた。サンプルを５％の
2-メルカプトエタノールを含むサンプルバッファー中で
沸騰させ、電気泳動前に免疫吸着体（immunoabsorben
t）を遠心分離で除いた。分子量標準は、14Ｃメチル化
タンパク質混合物（Amersham）または予備染色標品（BR
L）のいずれであった。使用された標準タンパクの分子
量は、ミオシン（200,000）、ホスホリラーゼｂ（92,40
0）、ウシ血清アルブミン（BSA）（69,000）、オバルブ
ミン（46,000）、キモトリプシノゲン（26,000）、ベー
タラクトグロブリン（18,400）、リソチーム（14,300）
およびシンクロムｃ（12,300）であった。電気泳動後、
ゲルを真空下で乾燥し、放射標識タンパク質の位置をコ
ダックX-線フィルムを用いるオートラジオグラフィーで
決定した。
2.二次元等電点電気泳動（IEF）‐SDS PAGE125 I-標識化L3抗原を含む免疫沈降物を記載のごとく調
製し、５％（v:v）の2-メルカプトエタノールおよび１
％（v:v）NP40を含む50μｌの溶液に再懸濁させた。サ
ンプルを95℃で５分間加熱し、免疫吸着体（immunoabso
rbent）を遠心分離で除去した。サンプルにアンホリン
（ampholines）（pH3.5〜10;最終濃度４%）を混合し、
固体尿素を飽和まで加えた。オファレル（1975）ジャー
ナル バイオロジー ケミカル 250;407〜4021［Ｏ′F
arrell（1975）J.Biol.Chem.250;4007-4021］の方法に
従って等電点電気泳動およびSDS PAGEを実施した。標
準タンパク質マーカー（バイオラッド Bio Rad）をIEF
次元で分離を追跡するために使用した。得られるpH勾配
を平行に実施したブランクゲルから決定した。ゲルを0.
5cmにスライスし、このスライスを1mlの蒸留したH2Oに
１時間浸し、得られる溶液のpHを決定した。
3.パラゴン電気泳動： 血清タンパク質電気泳動法を製造者の指示に従ってパラ
ゴン（Paragon）装置（ベックマン）であらかじめ形成
されたアガロースゲルを使用して行った。
イムノブロッティング： 分析されるタンパク質をSDS PAGEまたはパラゴン（Para
gon）のいずれかで分離した。SDS PAGEにより分離した
サンプルをバーネット（1981）アナル バイオケミスト
リー 112;195〜203［Burnette（1981）Anal.Biochem11
2;195-203］の記載のごとく5V/cmで４℃において約18時
間電気泳動的にニトロセルロースに移した。パラゴンに
より分離したサンプルは一枚のニトロセルロースペーパ
ーをエレクトロホレトグラム（electrophoretogram）の
上に置くことによってニトロセルロースに移した。ニト
ロセルロースを、使用前に、SDSを含まない上記バーネ
ットのトランスファーバッファー（transfer buffer）
中で水和した。厚さ約１インチの紙タオルの層をニトロ
セルロース上に置き、ガラスプレートおよび試薬びんで
押えた。トランスファー後ゲルの染色により判定して、
トランスファーは１時間以内で完了した。ニトロセルロ
ースブロットをブロットー（Blotto）つまりミルクをベ
ースとしたカクテル（ジョンソン等 ジーン アナリテ
ィカル テクノロジー（1984）１:3-8（Johnson et a
l.，Gene Anal.Technol（1984）１:3-8））（１%（w:
v）カーネーション（Carnation）脱脂粉乳および0.2％
（v:v）のNP−40を含むPBS）中で１時間インキュベート
して、ブロックした。L3抗原は23℃で１時間ブロットー
（Blotto）中の１〜４×106cpm/mlの125Ｉ−L3抗体とブ
ロットとのインキュベーションにより明らかにした。ブ
ロットをブロットー（Blotto）で十分に洗浄し、オート
ラジオ暴露前に乾燥した。125 Ｉ−L3抗体の結合 カル‐１（Calu-1）細胞（４〜10×104）を実験開始の1
8時間前に48ウェル細胞培養皿にまいた。細胞をPBSで洗
浄し、23℃で20分間PBS中の0.5％パラホルムアルデヒド
溶液で固定した。単層をPBSで洗浄し、23℃で５分間0.2
％NP−40含有PBSで処理して透過性を与えた。各種濃度
の125Ｉ標識化抗体を23℃、60分間で0.1mlの最終容量で
加えた、その後、単層を結合用バッファーで十分に洗浄
し、0.5M NaOHの添加により可溶化した。細胞に結合し
た放射性活性をガンマカウンターで測定した。サンプル
を２通り検定した:2通りのサンプルは一般に20％以下で
変動した。非‐特異的抗体結合を測定するため、125Ｉ
−標識化抗体結合を通常90％以上減少させる50〜100倍
過剰の標識化してないL3抗体で同一ウェルをインキュベ
ートした。結合データをスカッチャード（1949）アン．
エヌ．ワイ．アカデミーサイエンス51:660-672［Scatch
ard（1949）Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660-672］に従って分
析すると、125Ｉ−L3抗体についての親和定数が（Ka）
が約１×108M-1と測定された。125Ｉ−L3抗体の添加前
に細胞単層をNP40で処理しないと抗体の結合は10倍以上
に減少した。
競合的結合検定法 L3抗原活性は、カル‐１細胞のホルマリン固定化単層に
対する125I-標識化L3抗体の結合を抑制する抗原の能力
を決定することにより測定した。細胞単層を上記のごと
く調製した。125Ｉ−L3抗体をL3抗原活性を含む溶液0.4
μg/mlの濃度の存在下または不存在下で細胞に加えた。
最終検定容量は0.1mlであった。これらの条件のもと
で、結合に対して競合する標識化してないL3抗体の能力
により判定すると、125Ｉ−L3抗体の結合は95％以上特
異的であった。各種希釈の試験溶液を加え、125I-標識
化抗体の結合を上記のように測定した。培養培地中およ
び正常ヒト血清中で見い出されたL3抗原の精製の各種段
階に関する典型的な抑制曲線は、第１図（追加書類）に
示してある。L3抗原活性の１単位は、0.4μg/mlで加え
られた125Ｉ−L3抗体の結合を50％抑制するために必要
な量として定義される。
グリコシダーゼ処理35 S-メチオニンまたは125I-標識化L3抗原の免疫沈降物
を上記のように調製した。ペレット化した免疫吸着体
（immunoabsorbant）を25μｌの消化バッファーに再懸
濁させ、５ミリユニットの適当な酵素を含む５μｌの容
積物を加え、サンプルを37℃で18時間インキュベートし
た。濃縮したSDS PAGE サンプル バッファーを加
え、サンプルを電気泳動にかけた。ノイラミニダーゼ処
理のため消化バッファーは次のものを含んでいた:NaC1
0.15M;酢酸ナトリウムpH5.3,0.05M;CaCl2,0.1％（w:
v）；およびフェニルメチルスルホニルフルオライド,0.
1％（w:v）。エンドグリコシダーゼＨ（Endo H）処理の
ため、消化バッファーは次のものを含んでいた：トリス
‐HC1 pH6.5,0.025M;SDS,0.2％（w:v）；およびフェニ
ルメチルスルホニルフルオライド,0.1％（W:V）。
タンパク質測定 タンパク質濃度は基準としてウシ血清アルブミンを使用
するブラッドホード（1976）アナル バイオケミストリ
ー 72:248-254［Bradford（1976）Anal.Biochem.72:24
8-254］の方法で測定した。
L3セファロースの調製 凍結乾燥化CNBr-活性化‐セファロース（Sepharose）4B
を４℃で30〜60分間1mM HCLで再構成した、この樹脂を
同一溶液で１度洗浄し、遠心分離で集め、1M NaClおよ
び0.2Mの重炭酸ナトリウムの溶液（pH8.3）中の3.5mg/m
lのL3抗体と混合した。混合物を４℃で回転しながら16
時間インキュベートした。樹脂を遠心分離で集め、過剰
の活性基をpH8.3で１〜４倍容量の0.25Mグリシン溶液の
添加によりブロックした。その後、樹脂を遠心分離で集
め、使用前にPBSで数回洗浄した。カップリング効率を
カップリング前後の抗体溶液の280nmにおける吸光度を
測定することにより検定し、充填樹脂1ml当り約10mgのL
3抗体であると測定された。
ゲル染色 SDS PAGE後、タンパク質バンドの位置をクーマシーブル
ー（Coomassie blue）染色または商業的銀（バイオラッ
ド Bio Rad）またはニッケル（コダック）の基礎とする
染色キットにより決定した。
エドマン分解によるアミノ末端配列の決定 培養培地からのL3抗原を0.1M トリス−HCl、pH8.5およ
び0.1％SDS（w:v）を含む0.1mlの溶液中のジチオトレイ
トール（20mM）で50℃で２時間還元した。その後、抗原
を20℃で30分間ヨードアセトアミド（45mM）処理して、
S-カルボキサミドメチル化し、10％アクリルアミドゲル
（15mm厚み）の調製用SDS PAGEにかけた。電気泳動後、
ゲルをクーマシーブリリアントブルー（10%酢酸および3
0%イソプロパノール中で0.5重量%）で染色し、酢酸（５
%v:v）およびメタノール（17%（v:v）の溶液で脱色し
た。染色したL3抗原バンドをカミソリ刃で切り出し、直
ちにECU−040エレクトロエリューター／コンセントレー
ター（Electroelutor/Concentrator）（シー．ビー．エ
ス．サイエンティフィック コーポレーション．サンジ
エゴ．カルフォルニア（C.B.S.Scientific Co.,San Die
go,Ca））を使用して電気溶出そよび電気透析にかけ
た。サンプルがカルボキサミドメチル化されないことを
除いては、血清由来のL3抗原を同様に処理した。その方
法の全回収率は、銀染色による分析用SDS−PAGEにより
タンパク質量を概算すると、約80％であった。自動化エ
ドマン分解を約100pモルのS-カルボキサミドメチル化さ
れた馴化培地由来のL3抗原（固定されたMet-6の収量に
基づく）および38pモルの血清由来の非修飾L3抗原（同
定されたVal-1の収量に基づく）を使用して気相シーク
エンサー中で行なった（モデル470A、アプライドバイオ
システムズ，インコーポレーテッド，フォスターシテ
ィ、カルフォルニア）。フェニルチオヒダントインアミ
ノ酸を、溶出用に酢酸ナトリウムバッファー／テトラヒ
ドロフラン／アセトニトリル勾配を使用するアイビーエ
ムインスツルメンツシアノカラム（IBM Instruments′C
yano column）を用いる逆相HPLC（検出ユニット,2pモ
ル）で分析した（アプライド バイオシステムズ，タン
パク質配列ユーザーズブルティン（Bulletin）NO.2,198
4）。
実施例１ モノクローナル抗体の調製 モノクローナル抗体を３ケ月令BALB/cマウスを４つの異
なる源の１つのヒト組織で免疫化することにより製造し
た：（１）転移性非‐小細胞肺癌を有する患者からの胸
膜滲出液、（２）非‐小細胞肺癌からの培養細胞、およ
び（３）３〜４ケ月令ヒト胚からの肺組織。約107細胞
をマウス腹腔内へ３〜４回注入することにより免疫位置
を行った。最終免疫の３日後、脾臓を取り出し、培養培
地に懸濁させ、NSIマウス骨髄腫（myeloma）細胞と融合
させた（上記のケーラーおよびミルシュタイン（Kohler
およびMilstein））。混合物を単一融合細胞（クロー
ン）から生ずる低密度培養物を形成するために接種し
た；ハイブリダイゼーションに使用した技術は、イエー
等イント．ジェイ．キャンサー（1979）29:269-275［Ye
h,et al.,Int.J.Cancer（1979）29:269-275］にすでに
記載されている。
ハイブリッド細胞からの上澄み液は、ELISA検定法およ
びオートラジオグラフィー的間接125I-標識化プロテイ
ンＡ検定法［autoradiographic indirect 125I‐labell
ed prote in A assey］（ブラウンら，ジャーナル オ
ブ イムノロジー メソッズ（1979年）31:201〜209［B
rown et al.,J.Immunol.Meth.（1979）31:201-209］）
の双方を用いることによって、とりわけ細胞膜を含有す
る免疫処置に用いられた腫瘍からの抽出物に対してスク
リーニングされた。これらの抽出物は、コルカーら［Co
lcher et al.］（キャンサー リサーチ（1981年）42:1
451〜1459［Cancer Res.,（1981）42:1451-1459］）；
イェイら（上記）から修正された方法を用いて調製され
た。このために、組織はPBSで洗浄されそして懸濁さ
れ、完全な腫瘍については、ステンレス鋼製ふるいを通
して圧搾することによってなされた。この後に、1mMフ
ェニルメチルスルフォニルフルオライド（カルバイオケ
ム‐ベーリング コーポレーション カルフォルニア洲
サンディエゴ［Calbiochem-Behring Corp.,San Diego,C
A］）を含む１ mM NaHCO3が添加され、次にこの物質を
デューンス［Dounce］ホモジナイザーのＢ乳棒の50スト
ロークで、氷上においてホモジナイズした。27,000×ｇ
で15分間の遠心分離の後、上澄み液が除去され、そして
ペレットはPBS中に再懸濁され、１分間音波処理され、
−70℃で貯蔵された。
細胞膜抽出物に結合する抗体を産生したハイブリドーマ
は、クローン化され、試験管内で増殖され、そして抗体
特異性に関してさらに試験された。この試験は上記した
免疫組織学的技術を用いることによって行なわれ、肺
癌、他の腫瘍および正常ヒト組織の冷凍切片に結合する
抗体の能力が試験された。ヒト肺癌腫に対して特異性を
示す抗体を産生するこれらのハイブリドーマは再クロー
ンされ、増殖され、そしてプリスタン処理された３カ月
齢BALB/cマウス中へ注射され、そこで、これらを腹水腫
瘍として増殖させた。
腹水中へ分泌される抗体は、プロテインＡセファロース
［Sepharose］において（エイら，イムノケミストリ
ー，（1978年）15:429［Ey et al.Immunochemistry（19
78）15:429］）あるいはセファクリルＳ−300［Sephacr
yl S-300］中でのゲル濾過によって精製された。精製抗
体は、免疫組織学による付加的な特異性試験、該抗体は
細胞表面に結合したかを測定するための完全細胞での結
合検定、および上記したような放射性免疫沈降試験を含
むなお一層の特性づけのために用いられた。
モノクローナル抗体L3、L5およびL18を上記のごとく対
応するハイブリドーマから産生させた。これら抗体は、
本明細書の上記の特性を示した。
L3、L5およびL18と呼ばれる細胞系は1984年10月４日に
A.T.C.C.（アメリカン タイプ カルチャー コレクシ
ョン,12301 パークローン デーアール.,ロックヴィ
レ，マリーランド 20852（American Type Culture Col
lection,12301 Parklawn Dr.,Rockville,Maryland 2085
2）に委託され、そしてそれぞれ受託番号HB8626、HB862
7およびHB8628を指定された。細胞系L3は1984年10月25
日に再寄託された。
実施例２ 無血清馴化培地からのL3抗原の精製 1.無血清馴化培地の調製 カル‐１細胞を、増殖培地の存在下に回転ボルト（850c
m2）の中で集密まで増殖させた。単層は50mlの無血清増
殖培地を用いて３回洗浄し、２回目の洗液を37℃で30分
間細胞上に放置した。細胞はそれから150mlの無血清増
殖培地の存在下でインキュベートした。３日後に、前記
培地を集め、遠心分離機にかけて浮遊細胞を取り除き、
使用時まで−70℃で冷凍保存した。
2.濃縮物の調製 無血清培地（790ml）は、限外濾過（アミコン PM10
膜.Amicon.PM10 membrane）によって17mlの容積にまで
濃縮された。この濃縮物は移され、前記膜はPBS（11m
l）によって一度洗浄された。洗液と濃縮物は合わせら
れ、Ti70ローター（ベックマン.Beckman）内において30
分間、147,000×ｇで遠心分離機にかけられた。上澄み
液は大部分のL3抗原活性を含んでいると認められ、以後
これを濃縮物と言う。
3.イムノアフィニティークロマトグラフィー この濃縮物はセファロースC14Bのカラム（1.5ml）に送
られて、セファロースに対して親和性を持つ物質が取り
除かれた。カラムはそれから3mlのPBSによって洗浄され
た。この通過流は洗液に合わせられ、L3抗体を結合させ
たセファロース4B（10mg L3/ml樹脂）充填容量1mlに加
えられた。この混合物は４℃のもとで18時間回転状態に
保たれ、それから配置皮下注射器を用いて作られたカラ
ムの中に注がれた。前記通過流は集められ、樹脂はPBS
（10ml）と、5MのNaCl（5ml）及び0.02Mの酢酸アンモニ
ウム（10ml）の溶液とにより洗浄された。L3抗原は、新
たに作られたトリエチルアミン溶液（75mM）を加えるこ
とによってカラムから溶出された、L3抗原活性は上昇pH
に対して不安定なので、流出物のpHは、2Mの酢酸アンモ
ニウム0.1mlを含有するチューブ内に画分（0.5ml）を集
めることによって調整された。L3活性を含む画分は、競
合的結合検定法を用いることによって同定され、プール
され、更に−20℃の冷凍保存された。この結果は第１表
に要約して示されている。
実施例３ 血清からのL3抗原の精製 1.血清の収集 血液は腫瘍患者又は正常の個体から採血され、室温で10
〜90分間凝固された。サンプルはその後、ソーバルクリ
ニカル（Sorvall Clinical）遠心分離機により毎分1600
回転で10分間遠心分離される前に、30分から５時間４〜
６℃で保存された。血清は凝血から分離され、アリコー
トに別けられて、使用されるまで−70℃で冷凍保存され
た。L3抗原活性レベルは、同一個体からの血清又は血漿
にあっては、大きくは相違しなかった。融解されたアリ
コートは、抗原活性が冷凍と融解との繰り返しに対して
敏感であることが確認されたので、一般には再冷凍すべ
きでない。L3抗原活性の精製のために、新たに冷凍され
た血清10mlのアリコートが融解され、使用前に147,000
×ｇで60分間遠心分離（Ti 70.1 ローター）により清
澄化された。
2.DEAEセファセル（Sephacel）クロマトグラフィー 10mlカラムのDEAEセファセルを注入し、PEバッファー
（リン酸ナトリウム0.02M,pH7.12,0.005MのEDTA）によ
り平衡化した。清澄化した血清は、イオン交換カラムに
供される前に、PEバッファーによって130mlの容積に希
釈された。サンプルの供給と溶離の間、0.5ml/minの流
速が維持された。カラムの通過流は元の血清タンパク質
の54％を含み（280nmでの吸光度により判定）、検出可
能なL3抗原活性を含んでいなかった。このカラムはそれ
から10倍カラム容量のPEバッファーによって洗浄され
た。L3抗原活性の溶離は、PEバッファー中の、０〜0.5M
NaClの50ml勾配を用いて達成された。溶離の間に、1ml
の画分が集められた。この勾配の適用後、カラムはPEバ
ッファー中の0.5MのNaClにより洗浄され、最終的に同一
のバッファー中の1.5MのNaClにより洗浄された。L3抗原
活性を含む画分は、競合的阻止検定法を用いて同定さ
れ、プールされた。L3抗原活性は、大量の血清タンパク
質の溶離のあとにわずかに尾を引いた。
いくつかの実験では、L3抗原活性は放射性標識化と免疫
沈降分析の前に、僅かに異なった手順で部分精製され
た。血清タンパク質はまず30％の硫酸アンモニウムによ
って沈澱させられた。この沈澱物はH2O中に溶解され、D
EAEセファセルのカラムに供給される前に（セファデッ
クス（Sephadex）G-25で）脱塩された。L3活性の溶出は
NaCl溶液の段階的添加によって達成された。0.25Mと0.5
MのNaCl間に溶離する画分は、L3抗原活性について濃縮
され、その後のL3の放射性標識化のために用いられた。
この方式で調製された抗原は、3,000倍以上に精製され
た調製物から沈澱された放射性標識化抗原からのプロテ
アーゼフィンガープリンティングによって区別すること
ができなかった。
3.イムノアフィニティークロマトグラフィー DEAEセファセル（Sephacel）のカラム（14ml）からプー
ルされた画分は、セファセルCL4Bの8.4mlカラムに供給
され、このカラムは17mlのPBSにより洗浄された。この
洗液はそれから通過流に合わせられ、この混合物は４℃
での回転によって、抗体L3を結合させたセファロース
（10mgL3/ml樹脂）充填容量1.5mlによって18時間平衡化
された。この混合物はカラムの中に注がれ、樹脂は続い
てPBS（42ml）、0.2%（v:v）NP40を含むPBS（28ml）、P
BS（14ml）、0.02Mの酢酸アンモニウム（28ml）、5M Na
Cl（28ml）、最後に0.02Mの酢酸アンモニウム（5ml）を
用いて順次洗浄した。L3抗原は上述したように、0.075M
のトリエチルアミン8.4mlを加えることにより溶離され
た。この結果は第２表と第３表に要約して示してある。
実施例４ L3抗体及び抗体465.12Sの競合的結合 標識されていない抗体465.12S又は標識されていないL3
抗体は、125Ｉ−L3抗体（最終濃度0.35μg/ml）と共に
混合され、ホルマリン固定されたH125肺癌細胞（50,000
/ウェル）に加えられた。標識されていない抗体は、ハ
イブリドーマ上澄み液として用いられ、それぞれの抗体
は最終検定において原容量の1/2に希釈された。使用さ
れた抗体465.12Sの溶液は、35S-メチオニン標識化細胞
抽出物から、精製されたL3抗体１マイクログラムにより
沈降させられたものと同価の多くの抗原を沈降させるた
めに十分な抗体を含んでいた。第４表に示す結果は、抗
体465.12Sが、125I-L3抗体の結合に対して競合しないこ
とを示している。かくして、この二つの抗体は、別個の
エピトープを認識し、したがって相異なった抗体であ
り、機能的等価体ではない。
実施例５ L5抗原の切断フラグメント CALU−１ヒト肺癌細胞は、ブラウンら［Brown et al.］
（ジャーナル オブ イムノロジー［J.Immunol.］第12
7巻第539〜546頁（1981年））によって記載され、ラク
トペルオキシダーゼ触媒化ヨウ素化を用いて表面標識さ
れた。L5抗原（抗体L5により限定される抗原のこと）
は、細胞抽出物から沈澱せられ、還元条件下で実施した
SDS-PAGEによって分析された。これに応じて分析する
と、L5抗原は、Mr135,000の単一ポリペプチド鎖として
移動した。L5抗原を含むゲル領域は切り出され、指定量
のスタフィロコッカス・アウレウス［Staphylococcus a
ureus］V8プロテアーゼで処理され、上記のクレベラン
ドら［Cleveland et al.］によって述べられたSDS-PAGE
によって再び分析された。細胞表面のヨウ素化されたV8
切断フラグメントの結果的に生じた“フィンガープリン
ト”は、L5抗原の診断に役立つ。すなわち、Mr24,000及
び16,000の切断フラグメントはL5抗原に特徴的であり、
同様な分子量を有する他の抗原からL5抗原を見分けるこ
とになる。
第３表 正常はヒトの血清におけるL3抗原の特性 濃度 ： 5.8±2.6μg/ml1 分子量： 94,000 形態 Ｉ 76,000 形態 II 26,000 形態 III 移動度： α−２ pI ： 4.2〜5.0（形態Ｉ及び形態II） N-末端アミノ酸 Val（形態Ｉ） １）７つの正常かつ健康な固体から平均値（±標準偏
差）として決定した。血清は、標準として培養培地か
ら、イムノアフィニティー精製されたL3抗原を用いた競
合的結合検定法により、5.7容積％の最終濃度で試験さ
れた。その値は、66％であると概算された（銀染色SDS
PAGEゲルのデンシトメトリック走査による）標準調製物
の純度について補正された。
第４表 標準化されてない抗体 結合した125I-L3抗体 (cpm) なし 9524（100） 465.12S 10028（105） L3 1194（ 12） 本発明は上述した実施例を特に参照することにより詳細
に説明された。しかして、本発明の精神及び範囲内で、
種々の変更及び改変を実施することが可能であることが
理解されるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヘルストーム、カール エリツク アメリカ合衆国 ワシントン州 98121 シアトル ノ−ス イースト サーバー ドライブ 3925 (72)発明者 ホーン、ダイアン アメリカ合衆国 ワシントン州 98121 シアトル ウエスト オリンピツク プレ ース ナンバー404 202 (72)発明者 リンスレイ、ペーター アメリカ合衆国 ワシントン州 98121 シアトル ナインス ウエスト 2430

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】モノクローナル抗体の抗原結合部位が、 （ａ）約76,000ダルトンの分子量を有し、かつヒト非−
    小細胞肺癌の細胞表面決定基であるタンパク質抗原、お
    よび （ｂ）約94,000ダルトンの分子量を有し、かつヒト非−
    小細胞肺癌により分泌されるタンパク質抗原 に結合することを特徴とするモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】Fab、F(ab′)2またはFvフラグメントであ
    る、請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】検知可能な信号を発することができる標識
    に結合された、請求の範囲第１項記載のモノクローナル
    抗体。
  4. 【請求項４】前記標識が蛍光物質である、請求の範囲第
    ３項記載のモノクローナル抗体。
  5. 【請求項５】IgGイソタイプである、請求の範囲第１項
    記載のモノクローナル抗体。
  6. 【請求項６】マウスハイブリドーマ細胞系により産生さ
    れる、請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
  7. 【請求項７】前記マウスハイブリドーマがATCCに寄託さ
    れたHB8626の識別特性を有するハイブリドーマである、
    請求の範囲第６項記載のモノクローナル抗体。
  8. 【請求項８】Fab、F(ab′)2またはFvフラグメントであ
    る、請求の範囲第７項記載のモノクローナル抗体。
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