FI85814B - Foerfarande foer producering av en monoklonal antikropp foer humana icke-litencellslungcancer. - Google Patents

Description

1 85814

Menetelmä ihmisen ei-piensolukeuhkosyövän monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi - Förfarande för producering av en monoklonal antikropp för humana icke-litencellslungcancer

Syöpään sairastuneiden miesten keskuudessa suurin osa kuolemantapauksista johtuu ihmisen keuhkosyövästä, joka on myös vähitellen syrjäyttämässä rintasyövän useimmin kuolemaan johtavana syöpälajina naisten keskuudessa (Cancer Facts and Figures, 1983). Tämä sairaus voidaan jakaa neljään pääasialliseen histologiseen tyyppiin, eli epidermoidiin (30%), ade-nokarsinoomaan (35%), erikoistumattomiin suursoluihin (15%) ja piensoluihin (20%). Suurinta osaa keuhkosyövistä ei voida parantaa lääke- eikä säteilyhoidolla. Piensolutyyppiset keuhkosyövät saattavat reagoida lääke-ja säteilyhoitoon siten, että niiden koko pienenee, mutta ne eivät kuitenkaan parane täydellisesti. Tuumorin täydellinen poistaminen kirurgisesti vaikuttaa olevan ainoa tehokas hoitomuoto. Kuitenkin valitettavasti alle 30% keuhkosyöpäpotilaiden tuumoreista voidaan poistaa kokonaan diagnostoitaessa, ja näistä potilaista alle kolmannes on yhä elossa viiden vuoden kuluttua koko tuumorin näennäisesti täydellisen kirurgisen poistamisen jälkeen. Näin ollen alalla tarvittaisiin välttämättä menetelmiä, joilla keuhkosyövän varhaisempi diagnostointi sekä syövän leviämisasteen parempi määrittäminen ja tehok-. . kaampi hoito olisi mahdollista.

Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää kaikkiin näihin kolmeen tarkoitukseen. Edellytyksenä on kuitenkin se, että löydetään vasta-aineet niille antigeeneille, joita ilmentyy voimakkaammin keuhkosyövässä kuin normaalissa täysi-ikäisessä kudoksessa. Ottaen huomioon kasvainsolupopulaati-oiden tunnettu heterogeenisyys, useiden determinanttien läs-näolo samassa antigeenimolekyylissä, antigeenien väliset oletetut erot ajatellen niiden soveltuvuutta diagnostisiksi merkitsimiksi verrattuna lääkitseviin kohteisiin, sekä saman antigeenin eri vasta-aineiden erilaiset biologiset ominaisuudet, niin useita erilaisia vasta-aineita saatetaan tarvita .

2 85814

Keuhkosyövässä esiintyvien antigeenien monoklonaalisia vasta-aineita kuvataan julkaisuissa Sikora et ai., Br. J. Cancer (1981) ££:696-700; Cuttitta et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A. (1981) £8: 4591-4595; Varki et ai., Cancer Research (1984) 44^:681-687; Moody, T.W. et ai., Science, (1981) 214: 1246-1248; Minna, J.D. et ai.. In Vitro ££(12):1058-1070 (12-1981); Kennel, A.J. et ai., Cancer Research, £1(9, PTl):3465-3470. Chem. Abst. 95(15):1308502; Baylin, A.B. et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. U.S.A. £9:4650-4654 (8-1982); Carney, D.N. et ai., Pathobioloqy Annual 1982, ££:115-136 (1982); Gazdar, A.F. et ai.. Seminars in Oncology, £0:3-19(3-1903); Hollinshead, A.C. et ai., Cancer Dctee. Prevent., £:105-191 (1903); Mulshine, J.T. et al·., J. Immunol., 131(1):497-502 (1983); Huang, L.C. et ai., Arch Bioch. Biophys., 220(1):318-320 (1983); Saji, S. et ai.,Hybridoma, 3(2 ) :119-130 (1984 ), Bio.Abst. 79005569;

Bosslet, K. et ai., Behring Inst. Mitt., £4:27-34 (1984), Chem. Abst. CA101(9):70668b; Rosen, A.T. et ai., Cancer Research, 44(5):2052-2061 (1984), Bio. Abst. 79014658; Van Muijen, G.N.P. et ai., Amer. J. Pathol., 116(3):363-369 (1984), Bio. Abst. 79023605; Princler, G.J. et ai., Cancer Research, 42:843-848 (3-1982); Mazauric, T. et ai. Cancer Research, 42:150-154 (1-1982); Braatz, J.A. et ai., Cancer Research, 42:849-855 . (3-1982); sekä Sobol, R.E. et ai., Fed. Proc. 41(3):409. Abst.

] 816 (4-1982).

Vasta-ainetta, jonka spesifisyys on määrätty ennakolta, erittävien yhteensulautettujen solujen jatkuvat viljelmät kuvataan julkaisussa Köhler et ai., Nature (1975) 265:495-497. Menetel-miä tuumorin vasta-aineiden tuottamiseksi on kuvattu US-patent-tijulkaisussa 4 172 124.

Tämä keksintö kohdistuu uusiin monoklonaalisiin vasta-aineisiin, * . jotka määrittävät ihmisen ei-piensolukeuhkosyövän (NSCLC) solui-] hin liittyvissä, tällaisissa antigeeneissä olevia determinantti-kohtia. Käsite "NSCLC-solut" kattaa epidermoidikarsinooman solut, :*·.. adenokarsinooman solut sekä suurisoluisen erikoistumattoman kar- sinooman solut. Näitä determinanttikohtia on samoin ehkä löydet- 3 85814 tävissä muihinkin karsinoomiin, esimerkiksi eräisiin rintasyöpiin, liittyvistä antigeeneistä, joten tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet sitoutuvat myös näihin muihin syö-päsoluihin. Nämä monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat vähäisemmässä määrin normaaleihin täysi-ikäisiin soluihin kuin kasvainsoluihin. Käsitteellä "sitoutuu vähemmässä määrin" tarkoitetaan sitä, ettei tätä sitoutumista voida ilmaista immunohistologisilla tekniikoilla, tai että tämä sitoutuminen on neljästä viiteen kertaa heikompaa kuin NSCLC-soluihin sitoutuminen, immunohistologisilla tekniikoilla määritettynä. Näitä monoklonaalisia vasta-aineita erittävät hiirestä saadut hybridomat.

Diagnostisissa menetelmissä voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita tai antigeenivalmis-teita. Eräs tällainen menetelmä käsittää NSCLC-solujen läsnäolon määrittämisen näytteestä, jonka epäillään sisältävän tällaisia soluja. Näyte saatetaan kosketuksiin monoklonaali-sen vasta-aineen kanssa, joka vasta-aine kykenee erottamaan tällaiset solut muista, näytteessä mahdollisesti läsnäolevista solutyypeistä. Tämä kosketuksiin saattaminen toteutetaan olosuhteissa, jotka suosivat vasta-aineen sitoutumista näihin soluihin. Tämän kosketuksiin saattamisen jälkeen määritetään se, onko vasta-aine sitoutunut näytteessä oleviin soluihin vai ei. Tämä sitoutuminen on verrannollinen NSCLC-solujen läsnäoloon näytteessä tai puuttumiseen siitä. Yleensä näyte saatetaan kosketuksiin tämän monoklonaalisen vasta-aineen merkityn, spesifisen sitoutumiskumppanin kanssa. Tämä merkkiaine kykenee tuottamaan ilmaistavissa olevan signaalin.

Tämä keksintö kohdistuu tiettyihin ihmisen NSCLC-soluissa oleville antigeeneille spesifisiin vasta-aineisiin ja näiden vasta-aineiden toiminnallisiin vastineisiin, sitoutuviin ____ kappaleisiin ja immunokomplekseihin. Esimerkiksi tämän keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan tuottaa edellä mainitussa Köhler'in ja Milstein’in julkaisussa esitetyillä standarditekniikoilla. Esimerkiksi, immonogeeni- 4 85314 nä käytetään lukuisista nestepurkautumista (effuusio) saatuja, ihmisen keuhkosyövän soluja, tai ihmisen ei-piensolukeuhkosyö-västä saatuja, viljeltyjä soluja, tai sikiön normaalista keuhkosta saatuja soluja. Nämä solut injektoidaan hiireen, ja hiiri tapetaan riittävän pituisen ajan kuluttua, ja sen perna otetaan talteen. Pernasolujen toivottuja immunoglobuliineja koodaavat kromosomit tehdään kuolemattomiksi sulauttamalla nämä perna-solut yhteen myeloomasolujen kanssa tai lymfooma-solujen kanssa, yleensä polyetyleeniglykolin läsnäollessa. Tuloksena olevien solujen, joihin yhteensulautetut hybridomat sisältyvät, annetaan kasvaa selektiivisellä alustalla, kuten HAT-alustalla, ja eloonjääneitä soluja kasvatetaan tällä alustalla käyttäen rajoittavan laimennoksen olosuhteita. Soluja kasvatetaan sopivassa astiassa, esimerkiksi mikrotiitterilevyn koloissa, ja supernatantit seulotaan spesifisyydeltään toivotunlaisten mono-klonaalisten vasta-aineiden suhteen.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

Erilaisia tekniikoita voidaan käyttää monoklonaalisten vasta-aineiden saannon parantamiseksi, esimerkiksi hybridomasolut voidaan injektoida isäntänä toimivan nisäkkään, joka hyväksyy solut, vatsaonteloon, minkä jälkeen vesivatsan neste otetaan talteen. Mikäli vesivatsan nesteeseen kerääntyy riittämättömiä määriä monoklonaalista vasta-ainetta, niin vasta-aine otetaan talteen isännän verestä. Lukuisia tavanomaisia menetelmiä on olemassa monoklonaalisten vasta-aineiden eristämiseksi ja puhdistamiseksi, ja näillä menetelmillä monoklonaaliset vasta-aineet saadaan vapautetuiksi muista proteiineista ja muista kon-taminanteista (katso em. julkaisu Köhler ja Milstein).

Esimerkkinä eräästä tämän keksinnön mukaisesta monoklonaalises-ta vasta-aineesta on uusi vasta-aine, josta käytetään nimitystä L3. Tämä monoklonaalinen vasta-aine määrittää determinanttikoh- ____ dan soluun liittyvässä antigeenissä, jonka Mr on 76 000 SDS- PAGE-menetelmällä määritettynä, ja joka on tyypillinen ihmisen NSCLC-soluilie, siis pahanlaatuisille soluille, sekä determinant tikohdan proteiiniantigeeneissa, joita NSCLC-solut erit- 5 85814 tavat viljelysalustaan (muodon I, II ja III antigeeni). Vasta-aineen isotyyppi on IgG^. L3-vasta-aine sitoutuu vähemmässä määrin eräisiin normaaleihin soluihin. L3-vasta-ainetta tuottavat hiiren L3-hybridomat.

Muodon I L3-antigeenin Mr on 94 000 yksiulotteisella natriumdode-kyylisulfaattipolyakryyliamidigeeli-elektroforeesilla (SDS-PAGE) määritettynä. Muodon II L3-antigeenin Mr on 76 000 SDS-PAGE-menetelmällä määritettynä ja muodon III L.3-antiqeenin Mr on 26 000 SDS-PAGE-menetelmällä määritettynä.

Muodon I L3-antigeeni voidaan puhdistaa 90-kertaisesti viljely-alustasta affiniteettikromatografiaa käyttäen (taulukko I) sekä affiniteettikromatografiaa ja sen jälkeen akryyliamidigeelitek-niikoita käyttäen, jolloin saadaan yli 70 paino-% ja 90 paino-%, vastaavasti, muodon I L3-antigeenia, joka on glykoproteiini, sisältäviä valmisteita. Affiniteettikromatografisesti puhdistetussa valmisteessa ominaisaktiivisuus on 46 500 yksikköä/mg verrattuna viljelyalustan arvoon 522 yksikköä/mg. Ominaisaktiivisuus määritellään antigeenin siksi määräksi, joka tarvitaan 125 inhiboimaan I-merkityn L3-vasta-aineen sitoutumien 50-prosent-tisesti kilpailevan sitoutumisen kokeessa, jossa käytetään Calu-1-solujen formaliinilla kiinnitettyjä monokerroksia. Viljelys-alustasta affiniteettikromatografisesti saatu valmiste sisältää yli 70% muodon I antigeeniä ja useimmiten alle 30% määrittele-mätöntä proteiinimateriaalia, jonka Mr on noin 50 000 - 200 000 - SDS-PAGE-menetelmällä määritettynä, muodon II antigeenin pienten määrien, noin 10-20%, sisältyessä tähän määrään. Valmisteessa . . : on samoin läsnä hivenmääriä muodon III antigeeniä.

" L3-antigeenin solun sisäisten ja solun ulkopuolisten muotojen välisen suhteen määrittämiseksi solut merkittiin radioaktiivi-35 ....

sesti S-metionnnilla, ja niillä toteutettiin pulssituskoe.

·*- * . 35 *· *· Soluja merkittiin pulssittaen tunnin ajan S-metioniinilla, ·.· ‘ ne laitettiin merkitsemätöntä metioniinia sisältävään alustaan —: eri pituisiksi ajoiksi, jonka jälkeen ne analysoitiin immuno- .···. seostamalla. Alun perin kaikki spesifisesti immunosaostettavis-sa oleva, soluun liittyvä radioaktiivisuus todettiin proteiinis- 6 85814 sa, jonka Mr on 76 000. Muita merkittyjä, näkyviin saatuja proteiineja todettiin myös näytteissä, joista vasta-aine puuttuu. Jäijittämisvaiheen aikana radioaktiivisuus Mr 76 000-muodossa aleni, kun taas alustaan vapautuneessa muodossa (Mr 94 000) todettu radioaktiivisuus kasvoi. Radioaktiivisuus soluun liittyvässä muodossa katosi saman kinetiikan mukaisesti kuin millä radioaktiivisuus ilmaantui vapautuneeseen muotoon; molempien tapahtumien Väritettiin densitometrisellä analyysillä, ja sen todettiin olevan suurin piirtein 1,5 tuntea. Näiden tulosten perusteella voidaan päätellä, että soluun liittyvä antigeenimuoto, jonka Mr on 76 000, on Mr 94 000-muodon esiaste (muodon I L3-antigeeni).

Koska L3-antigeeni on glykoproteiini, niin voidaan ajatella, että L3-antigeenin koon ilmeinen suureneminen, jota havaitaan antigeenin vapautuessa solusta, johtuu ehkä hiilihydraattien muunnoksista. Tätä mahdollisuutta tutkittiin käsittelemällä molekyylin soluihin liittyvää muotoja ja vapautunutta muotoa sisältäviä immunosaosteita qlykosidaaseilla, joiden spesifisyys tunnetaan. Soluun liittyvän L3-antiqeenin koko pieneni Mr-arvoon 59 000 endoglykosidaasilla H (Endo H) käsiteltäessä, mutta koko pysyi muuttumattomana neuraminidaasilla käsiteltäessä, mikä osoittaa, että se sisälsi N-sitoutuneita, runsaasti mannoosia sisältäviä oligosakkarideja (katso julkaisu Tarentino, et ai, 1974, J. Biol. Chem., 249:811-817). Tämä tulos on yhtäpitävää sen kanssa, että kypsyminen on herkkää tunikamysiinille, joka on tunnettu N-sitoutuneen glykosylaation inhibiittori · (Lehle, et ai., 1976, FEBS Letters, Tl:167-170). Tätä vastoin vapautunut antigeeni oli vastustuskykyinen Endo H-entsyymille, *. ·: mutta sen koko pieneni arvoon Mr 80 000 neuraminidaasilla käsi- : teltäessä, mikä osoittaa päättävien sialiinihappojäännösten : : : läsnäolon muodon I L3-antigeenissä. Täten L3-antigeenin muun tumiseen soluun liittyvästä muodosta vapautuneeseen muotoon : liittyy N-sitoutuneiden, hiilihydraateista muodostuneiden sivu- ketjujen kypsymistä.

7 85814

Muodon I L3-antigeenin päättävä aminohappoketju määritettiin tavanomaisilla tekniikoilla valmisteesta, joka oli puhdistettu affiniteettikromatografiaan ja akryyliamidigeeliin perustuvien erotustekniikoiden yhdistelmällä. Tämä ketju («) on seuraava 15 10 15

V-N-D-G-D-M-R-L-A-D-G-G-A-T-N-Q

ja se määritellään edelleen seuraavasti: 20 25 30

a—G—R-V-E-I-F-Y-R-G-Q-W-G-T-V

Edellä aminohapoista käytetyllä yksikirjaimisilla symboleilla on tavanomainen merkityksensä, jossa V = väliini, N = asparagiini, D = aspartiinihappo, G = glysiini, M = metioniini, R = arginiini, L = leusiini, A = alaniini, T = treoniini, Q = glutamiini, E = glutaamihappo, I = isoleusiini, F = fenyylialaniini, Y = tyrosiini ja W = tryptofaani. Edellä esitetty saatiin yhtenä ainoana ketjuna muodon I L3-antigeenia sisältävän valmisteen tapauksessa, olipa muodon II L3-antigeenia läsnä tai ei.

L3-antigeenin edellä esitetyn 30 N-päätteen aminohapon vertaaminen proteiinipankissa National Biomedical Research Foundation protein bank (laitos, joka ilmestyi maaliskuussa 1985) oleviin proteiiniketjuihin ei paljastanut merkittäviä homologisuuksia. Muodon I L.3-antigeenin ketjua verrattiin samoin useiden seerumi-' proteiinien ketjuihin, joita ei toistaiseksi luetella tässä tie-tolähteessä, mukaan lukien ihmisen Cl-esteraasin inhibiittorin : : : ketju ja ihmisen alfa-2-tioliproteinaasin inhibiittorin ketju.

Yksikään näistä ketjuista ei paljastanut merkittävää homologi-- suutta muodon I L3-antigeenin N-päätteen ketjun kanssa.

Todettiin, että muodon I L3-antigeenia on läsnä normaalissa ih-. . misseerumissa, ja muodon I L3-antigeeni puhdistettiin seerumista. Seerumista saadun L3-antigeenin ominaisuudet esitetään yhteen-‘ vedon kaltaisesti taulukossa III. Muodon I L3-antigeeni voidaan ·:1·: puhdistaa yli 3000-kertaisesti normaalista ihmisseerumista, saan- ·/1; non ollessa 39% (taulukko II). Puhdistetun materiaalin SDS- 8 85814 PAGE-analyysi paljastaa pääasialliset komponentit proteiineiksi, jotka liikkuvat viljelyalustasta puhdistettujen muodon I ja muodon II komponenttien kanssa; kumpikaan muoto ei ole alkuperäisen seeruminäytteen pääasiallinen komponentti. On huomattavaa, että seerumista saadut sekä muodon I että II L3-antigee-nit erottuvat kahdeksi selväksi komponentiksi alkuperäisellä geelillä, mikä osoittaa mahdollisesti glykosylaatioeroista johtuvaa mikroheterogeenisyyttä. Molemmat muodot ovat reaktiivisia immunotäplityksenä toteutetun analyysin jälkeen ja radioaktiivisella iodilla merkitsemisen ja immunosaostamisen jälkeen. Viljelyalustasta puhdistetun antigeenin tapauksessa immunosaostamisen jälkeen todetaan ylimääräinen muoto, jonka Mr on 26 000 (muodon III L3-antigeeni). Immunoaffiniteettiin perustuvalla kromatografiällä saatu valmiste sisältää yli 50 paino-% muodon I L3-antigeenia, lopun materiaalin ollessa muodon II L3-anti-geenia, transferriinia ja määrittelemättömiä proteiineja, joiden Mr on noin 50 000 - 200 000 SDS-PAGE-menetelmällä määritettynä. Tämän valmisteen ominaisaktiivisuus on 45 500 yksikköä/mq verrattuna normaalin ihmisseerumin aktiivisuuteen 13,3 yksikkoä/mg.

Nämä tulokset osoittavat, että sekä viljelyalustasta että seerumista todetut kaksi komponenttia (muoto I ja II) ilmentävät L3-antigeenista aktiivisuutta. Muodon I L3-antigeenin puhdistaminen edelleen seerumista preparatiivista SDS-PAGE-menetelmää käyttäen johti valmisteisiin, jotka sisälsivät pääasiallisesti ...; muodon I L3-antigeeniä pitoisuutena, joka oli yli 90 paino-%, .·. ; sekä vaihtelevia hivermääriä muodon II antigeeniä, lopun mate-! . riaalin ollessa transferriinia ja määrittelemättömiä proteiineja,

Ijoiden Mr on noin 50 000 - 200 000. 1 li :' · 125 I-merkittyjä ja immunosaostettuja antigeenejä, jotka oli puh-. distettu sekä seerumista että viljelyalustasta kaksiulotteista isoelektristä fokusointia ja SDS-PAGE-menetelmää käyttäen, ver-rattiin toisiinsa. Molempien antigeenien kaksiulotteiset liik-kuvuudet olivat hyvin samankaltaiset, sekä muodon I että muodon

II komponenttien liikkuessa heterogeenisinä antigeeneinä pH-alueella 4,2 - 5,0. Molemmista lähteistä saadusta muodon I

9 85814 L3-antigeenista paljastui samoin kaksi vähäisempää komponenttia, jotka liikkuivat suurin piirtein pH-alueella 5,8 - 6,2. Samoin molempien antigeenien hiilihydraattikoostumus määritettiin testaamalla niiden herkkyys glykosidaaseille. Molemmista lähteistä saatujen, muodon I ja muodon II L3-antigeenien todetaan olevan vastustuskykyisiä Endo H-entsyymille, kun taas molempien käsitteleminen neuraminidaasilla johti tunnusomaisen kappaleen, jonka Mr on 80 000, ilmaantumiseen, joka kappale oli todettu aineen-vaihdunnallisesti merkityn antigeenin käsittelyn jälkeen. Muodon II antigeenin herkkyys neuraminidaasille osoittaa, että antigeeni eroaa L3-antigeenin soluun liittyvästä muodosta, jonka Mr on 76 000.

Sen varmistamiseksi, että molemmat molekyylit ovat rakenteeltaan samankaltaisia, molemmista lähteistä saaduilla muodon I molekyyleillä toteutettiin sarja osittaisia pilkkomisreaktioita proteaasia käyttäen, kuten esitetään julkaisussa Cleveland et ai., (1977) J. Biol. Chem. 252:1102-1106. Radioaktiivisesti merkityt muodon I antigeenit, jotka on puhdistettu sekä vilje-lyalustasta että seerumista, leikataan irti preparatiiviselta SDS-PAGE-geeliltä, ja niiden "sormenjäljet" määritetään V8-proteaasilla. Molemmilla molekyyleillä saadaan osittain pilkottaessa samanlaiset kuviot; kummassakin tapauksessa havaitaan ainakin viisi erillistä osittaisen pilkkomisen muodostamaa tuotetta (Mr = 76 000, 49 000, 31 000, 20 000 ja 14 300). Nämä tulokset osoittavat, että sekä viljelysalustasta että ihmis- *.: seerumista puhdistetut L3-antigeenit ovat suuressa määrin tois- tensa kaltaiset.

Tämän jälkeen tutkittiin seerumista saadun L3-antigeenin kolmen, -· molekyylipainoltaan erilaisen muodon välistä suhdetta. Ylei sesti ottaen muotojen I ja II sormenjäljet ovat melko samankaltaiset, vaikka muodon II molekyylistä ei saatukaan muodon I '· molekyylistä saatuja kappaleita, joiden Mr on 31 000 ja 14 300.

' Näiden kuvioiden perusteella voidaan todeta, että muotojen I ja ...·· II molekyylit ovat monessa suhteessa toistensa kaltaisia. Muo- . <* ίο 85 81 4 don III antigeenillä on sama, osittaisen pilkkomisen tuote, Mr 14 300, kuin suuremmilla, seerumista löydetyillä antigeenisillä muodoilla, mikä saattaa osoittaa, että muodon III antigeeni on samoin rakenteellisesti muodon I antigeenin kaltainen. Eri muotojen rakenteissa todetun läheisen samankaltaisuuden perusteella voidaan olettaa, että muotojen II ja III molekyylit ovat peräisin muodon I antigeenistä.

Jotta saataisiin määritetyksi se, onko L3-antigeeni kuvattu aikaisemmin muun kuin keuhkosyövän tyyppisen tuumori tyypin antigeeniseksi komponentiksi, keksinnön puitteissa toteutettiin tietokoneen avulla kirjallisuushaku aiheena tuumoriin liittyvät, irronneet tai erittyneet antigeenit. Tällöin todettiin useita tutkimustuloksia melanoomasta erittyneistä proteiiniantigeeneis-ta, joiden koko ja hiilihydraattikoostumus oli samankaltainen kuin L3-antigeeni1la. Natali et ai., (1982) Cancer Res. 42: 583-589; Bumol et ai., (1982) Hybridoma _l:283-292; ja Wilson et ai., (1981) Int. J. Cancer 28:293-300.

Pieniä määriä erästä edellä kuvattua monoklonaalista vasta- ainetta (465 12S; Natali et ai. edellä) oli käytettävissämme ensimmäiseen melanoomaan liittyviä antigeenejä käsittelevään kansainväliseen kongressiin First International Workshop on

Melanoma Associated Antigens osallistumisemme ansiosta. Tätä vasta-ainetta käytettiin peräkkäisissä immunosaostuskokeissa L3-antigeenin ja vasta-aineen 465 12S tunnistaman antigeenin . . välisen identtisyyden testaamiseksi. Molemmat vasta-aineet saostivat spesifisesti proteiinityypin, jonka Mr on 94 000, ja : : ' . . . 35 joka oli peräisin S-metionimilla aineenvaihdunnallisesti merkittyjen solujen viljelyalustasta. Kun kasvatusalustasta poistettiin joko L3- tai 465 12S-antigeeni immunosaostamalla, niin tämä johti siihen, että alustasta poistui samanaikaisesti vaihtoehtoisen antigeenin antigeeninen aktiivisuus. Tämä osoittaa, että molempien vasta-aineiden antigeeniset deter-minantit sijaitsevat samassa molekyylissä (taulukko III).

• . Kuitenkin näiden kahden vasta-aineen tunnistamat epitoopit ovat ilmeisesti erilaiet, sillä vasta-aineen 465.12S ei to-

“1 · 12 S

dettu kilpailevan sitoutumattomissa I-L3^vasta-aineen kanssa.

· n 85814

Toinen tämän keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine, josta käytetään lyhennettä L5, määrittää determinanttikohdan ihmisen NSCLC-soluilie tyypillisessä solupinnan proteiinianti- geenissa. Tämän proteiinin molekyylipaino on noin 135 000 dal- 125 töniä edellä kuvatulla menetelmällä ja I-merkitsemiseen perustuvalla menentelmällä määritettynä. Tämä vasta-aine kuuluu luokkaan IgM. L5-vasta-aine ei sitoudu ilmaistavasti normaaleihin soluihin, kuten fibroblasteihin, endoteelisoluihin ja epiteelisoluihin tärkeimmissä elimissä. L5-vasta-ainetta tuottavat hiiren L5-hybridomat. L5-antigeeni11a on kaksi tunnusomaista V8-proteaasilla saatua kappaletta, joiden Mr on 24 000 ja 16 000, mikä voidaan osoittaa julkaisussa Cleveland et ai.

(1977) J. Biol. Chem. 252:1102-1106 kuvatulla menetelmällä.

Täten L5-antigeeni voidaan erottaa muista, molekyylipainoltaan samanlaisista antigeeneistä.

Muu tämän keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine on Ll8-vasta-aine, ja se määrittää determinanttikohdan ihmisen NSCLC-soluille tyypillisessä toisessa solupinnan antigeenissä. Tämän proteiinin molekyylipaino on noin 72 000 daltonia molemmilla edellä kuvatuilla menetelmillä määritettäessä. Tämän vasta-aineen isotyyppi on IgG^. L18-vasta-aine sitoutuu vähäisemmässä määrin eräisiin normaaleihin soluihin, erityisesti pernaan.

V* Tämän keksinnön puitteisiin kuuluvat myös edellä mainittujen *·.: monoklonaalisten vasta-aineiden käyttökelpoiset sitoutuvat kappaleet, kuten Fab, F(ab') , Fv-kappaleet ja niin edelleen.

.·. : Nämä vasta-aineen kappaleet saadaan tavanomaisilla tekniikoil la. Esimerkiksi käyttökelpoisia sitoutuvia kappaleita voidaan .Y valmistaa pilkkomalla vasta-aine peptidaasilla, käyttäen papa- iinia tai pepsiiniä. Käsitteellä "käyttökelpoinen sitoutuva kappale" tarkoitetaan sitä, että tämä kappale kilpailee vasta-' aineen kanssa sitoutumiskohdista samaa alkuperää olevassa anti- ’. * geenissään.

12 8531 4

Vaikka tämän keksinnön mukaisten uusien vasta-aineiden edellä esitetyt erityiset esimerkit kohdistuvatkin vasta-aineisiin, jotka sitoutuvat spesifisiin determinanttikohtiin vastaavissa antigeeneissä, ja jotka kuuluvat erityisiin luokkiin ja isotyyppeihin hiirilähteestä, niin tämän tarkoituksena ei kuitenkaan ole rajoittaa keksintöä. Tämän keksinnön puitteisiin kuuluvat edellä mainitut vasta-aineet sekä edellä mainittuja vasta-aineita toiminnallisesti vastaavat vasta-aineet, olivatpa ne peräisin hiirilähteestä, nisäkäsläh-teestä, ihminen mukaan lukien tai muista lähteistä, sekä näiden yhdistelmät, ja myös muut luokat, kuten IgM, IgA, IgE ja muut vastaavat, mukaan lukien näiden luokkien sisäiset isotyypit. Käsitteellä "toiminnallisesti vastaava" tarkoitetaan sitä, että vasta-aine kykenee sitoutumaan edellä kuvattuun determinanttikohtaan, ja kilpailemaaan tämän keksinnön mukaisen erityisen vasta-aineen kanssa tällaisesta kohdasta. Täten tällainen vasta-aine, kun se yhdistetään tällaisen determinanttikohdan käsittävän solun tai solukappaleen sisältävään näytteeseen, sitoutuu tällaiseen determinanttikohtaan ja estää keksinnön mukaista vasta-ainetta sitoutumasta tähän kohtaan.

Keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää menetelmässä pahanlaatuisen tilan läsnäolon määrittämiseen keuhkokudoksesta. Käsitteellä "pahanlaatuinen tila” . . tarkoitetaan täysikasvuisten solujen epänormaalia kehitty mistä (dysplasia), käsittäen syövän in situ, neoplastisten, pahanlaatuisten, tai tuumorisolujen, tai vastaavien läsnäolon. Näyte saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, tai yhdistetään siihen. Tämä kosketuksiin saattaminen toteutetaan olosuhteissa, jotka mahdollistavat vasta-aineen sitoutumisen pahanlaatuisiin soluihin. Kosketuksiin saattamisen jälkeeen vasta-ai-• ;*. neen sitoutuminen näytteessä olleisiin pahanlaatuisiin so- • . luihin määritetään. Toisin sanoen näytteestä määritetään vasta-aineen ja antigeenisten kohtien välisten immuunikomp-leksien läsnäolo. Tämä immuunikompleksien muodostuminen on ·.. verrannollinen pahanlaatuisten solujen läsnäoloon näyttees- : sä.

i3 8581 4 Tätä keksintöä havainnollistavana, muttei millään tavalla rajoittavana, erityisenä esimerkkinä tämän keksinnön mukaisesta menetelmästä on menetelmä tuumorisolujen ilmaisemiseksi irroi-tetusta kudoksesta. Edellä mainittua menetelmää sovelletaan näytteeseen, joka on leike tuumorin poistamisen jälkeen saadusta tuumorista. Irroitettu tuumori käsitellään leikkeiden saamiseksi, johon käsittelemiseen kuuluu alunperin tuumorin tai kudoksen pakastaminen, tavallisesti pakastaminen välittömästi irroittamisen jälkeen. Tämän jälkeen pakastettu kudoskerros leikataan leikkeiksi käyttäen esimerkiksi kryostaattia.

Edellä kuvatulla tavalla saatu tuumorileike saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, ja sitten toisen vasta-aineen kanssa, joka toinen vasta-aine vaikuttaa mainittua monoklonaalista vasta-ainetta vastaan, ja joka toinen vasta-aine on merkitty ilmaistavissa olevalla merkkiaineella.

Irroitettu näyte, esimerkiksi tuumorista saatu leike, saatetaan kosketuksiin ensimmäisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa olosuhteissa, jotka mahdollistavat vasta-aineen sitoutumisen pahanlaatuisiin soluihin. Inkubointi toteutetaan yleensä vettä sisältävässä väliaineessa, kuten esimerkiksi fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisältää pienen määrän natrium-. atsidia, sopivassa astiassa, kuten esimerkiksi lasisessa petri- maljassa, noin 15-30 minuutin pituisen ajanjakson ajan, noin • '· 20-30°C:n lämpötilassa. Käytetty vasta-aineen määrä on taval- lisesti riittävä saamaan aikaan ilmaistavissa olevan sitoutu-·: misen, eli saamaan aikaan ilmaistavissa olevan lukumäärän immuu- nikomplekseja, jotka muodostuvat vasta-aineesta ja kyseessä : : : olevasta determinanttikohdasta tai antigeenisestä kohdasta.

.·. : Inkuboinnin jälkeen leike pestään epäspesifisesti sitoutuneen vasta-aineen poistamiseksi tai sen määrän vähentämiseksi, ja sitten leikettä tarkastellaan edellä mainittujen kompleksien • ' toteamiseksi, jotka kompleksit ovat seuraus monoklonaalisen :...: vasta-aineen sitoutumisesta näytteen sisältämiin, antigeenisen ;·.·. kohdan käsittäviin soluihin. Sitoutuminen on verrannollinen i4 8581 4 pahanlaatuisten solujen läsnäoloon leikkeessä. Näin ollen sitoutuminen määritetään esimerkiksi saattamalla näyte kosketuksiin monoklonaalisen vasta-aineen merkityn, spesifisen sitoutumiskumppanin kanssa. Merkkiaine kykenee tuottamaan ilmaistavan signaalin ja se voi olla radioaktiivinen merkkiaine, kromofori, kuten fluoresoiva aine, entsyymi tai muu vastaava.

Esimerkki edellä kuvattuja toimenpiteitä käyttävästä tekniikasta on immunofluoresenssivärjääminen. Tässä tekniikassa tuumorin pakastetut leikkeet kiinnitetään lasilevylle asetonilla ja niitä inkuboidaan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa esimerkiksi pet-rimaljassa. Sen jälkeen, kun leike on pesty asianmukaisella puskurilla, kuten fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella, se laitetaan petrimaljaan, ja saatetaan kosketuksiin tämän monoklonaalisen vasta-aineen merkityn, spesifisen sitoutumiskumppanin kanssa, joka sitoutumiskumppani voi olla esimerkiksi merkitty vasta-aine, joka on spesifinen käytetylle monoklonaalisel-le vasta-aineelle. Koska useimmissa tapauksissa monoklonaalinen vasta-aine on peräisin hiirilähteestä, niin menetelmässä voidaan käyttää merkittyä antihiiri-immunoglobuliinia, joka on spesifinen monoklonaaliselle vasta-aineelle. Näitä immunoglobuliineja voidaan tuottaa tavanomaisilla tekniikoilla injektoimalla sopivaan isäntään hiiren vasta-ainetta, jonka jälkeen odotetaan sopiva aika, ja antihiiri-immunoglobuliinit otetaan talteen in-. jektion saaneen isännän verestä.

• Sen jälkeen, kun levy on pesty toiseen kertaan esimerkiksi veteen tehdyllä puskurilla, leikkeet voidaan peittää fluoresoivalla : vasta-aineelle sopivalla mikroskopointinesteellä ja peitelasilla : : jonka jälkeen leikettä tarkastellaan fluresenssimikroskoopilla sen määrittämiseksi, onko monoklonaalinen vasta-aine sitoutunut leikkeeseen. Sitoutumisen määrittäminen saattaa myös käsittää .·. : tämän sitoutumisen sijainnin tunnistamisen näytteessä.

Monoklonaalisen vasta-aineen sitoutuminen näytteeseen voidaan *·**· myös määrittää käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta, joka ' / on konjugoitu kovalenttisesti ilmaistavissa olevan signaalin • · · • ♦ li is 8581 4 tuottavaan merkkiaineeseen, kuten radioaktiiviseen ryhmään, kromoforiin, mukaan lukien värit ja fluoresoivat aineet, tai entsyymiin. Vasta-ainetta kohden käytettyjen merkkiaineiden lukumäärä määräytyy tavallisesti sen diagnostisen menetelmän, jossa merkittyä vasta-ainetta käytetään, tarpeiden mukaan, sekä sen mukaan, kuinka paljon kohtia merkkiaineen kytkemiseksi vasta-aineeseen on käytettävissä.

Menetelmät merkkiaineiden konjugoimiseksi vasta-aineisiin ja vasta-aineen kappaleisiin ovat alalla hyvin tunnettuja. Näitä menetelmiä on löydettävissä US-patenttijulkaisuista 4 220 450; 4 235 869; 3 935 074 ja 3 996 345.

Toisena esimerkkinä tekniikasta, jossa tämän keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää, on merkitseminen immunoperoksidaasilla (Sternberger, Immunocytochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1979, sivut 104-169 mistä muunnos esitetään julkaisussa Garrigues et ai., Int. J. Cancer (1982) 29: 511-515). Testattava kudos kiinnitetään sopivalla liuottimena, kuten asetonilla alustaan, kuten lasilevylle. Sitten kudosta inkuboidaan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, ja pestään sitoutumattoman vasta-aineen täydelliseksi poistamiseksi. Sitten kudosta inkuboidaan kaniinin anti-hiiri-IgG:n kanssa, pes-tään sitoutumatta jääneen vasta-aineen poistamiseksi, yhdiste-. tään hiiren peroksidaasin ja antiperoksidaasin väliseen kompleksiin, pestään sitoutumatta jääneen konjugaatin poistamiseksi, •ja käsitellään sitten mainitun entsyymin substraatilla. Tämän ·..· käsittelyn jälkeen levyä tarkastellaan ilmaistavissa olevan V-: signaalin toteamiseksi.

Tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää menetelmässä pahanlaatuisen tilan läsnäolon määrittämiseksi keuhkoista .·. ; saadusta, irronneita soluja sisältävästä näytteestä, kuten ys-kösnäy tteestä. Käsitteellä "irronneita soluja sisältävä näyte" tarkoitetaan sitä, että näyte sisältää erillisiä soluja tai solu- * • · kasautumia, jotka on saatu raaputtamalla tai pesemällä kudoksen * : pinnasta, ja jotka solut ovat irronneet kudoksesta erillisinä tai hilseenä tai kerroksina. Irronneita soluja sisältävä näyte is 85814 eroaa leikatusta kudoksesta, joka on saatu ottamalla koepala.

Näyte ja vasta-aine saatetaan kosketuksiin olosuhteissa, joissa vasta-aine voi sitoutua antigeeniseen kohtaan. Tämän kosketuksiin saattamisen jälkeen vasta-aineen sitoutuminen antigeeniseen kohtaan, tai tämän sitoutumisen puuttuminen, määritetään, ja se on verrannollinen pahanlaatuisen tilan läsnäoloon keuhkoissa.

Jotta voitaisiin määrittää se, onko keuhkoissa läsnä jokin pahanlaatuinen tila, niin tässä menetelmässä yskösnäyte voi toimia irronneita soluja sisältävänä näytteenä. Menetelmää voidaan ehkä käyttää pahanlaatuisen tilan ilmaisemiseen irronneita soluja sisältävästä näytteestä, joka on saatu keuhkoputkista, ruuansulatuskanavasta, suu, nielu jne., mukaan lukien.

Irronneita soluja sisältävä näyte saatetaan ensin kosketuksiin edellä mainitun vasta-aineen kanssa olosuhteissa, joissa vasta-aine sitoutuu spesifisiin antigeenisiin kohtiin näytteessä, jolloin muodostuu antigeenin ja vasta-aineen välisiä komplekseja.

Tämä antigeeninen kohta voi olla läsnä näytteen soluissa tai solukappaleissa. Yleensä näyte laitetaan asianmukaisen alustan päälle, kuten esimerkiksi levylle, joka on tavallisesti lasia tai jotain muuta sopivaa materiaalia. Yleensä irronneita soluja sisältävä näyte levitetään levylle siten, että levyn pinnalle saadaan näytteen ohut kerros. Vasta-aineen ja näytteen välinen , kosketus toteutetaan yleensä vettä sisältävässä puskuroidussa väliaineessa. Käyttökelpoisia puskureita ovat fosfaatti, Tris, - " bikarbonaatti, jne. pH riippuu näytteen ja vasta-aineen luon-teestä, ja se on tavallisesti suurin piirtein alueella 5-8.

;.'i Vettä sisältävä väliaine voi lisäksi sisältää orgaanisia polaa- : risia liuottimia määrinä, jotka ovat noin 0-40%. Nämä orgaaniset polaariset liuottimet ovat vesiliukoisia, ja niissä on yleensä noin 1-10 hiiliatomia ja noin 1-4 happiatomia. Vasta-ainetta .·. : on läsnä vettä sisältävässä väliaineessa suurin piirtein pitoi- ... suutena l-100^ug/ml, mieluiten noin 10-20^ug/ml. Lämpötila sinä aikaan, kun näyte saatetaan kosketuksiin vasta-aineen kanssa, on tavallisesti noin 4-40°c, mieluiten noin 10-30°C. Kosketusaika on tavallisesti noin 15-120 minuuttia, mieluiten noin 30-60 j·.·. minuuttia.

li 17 8581 4

Sen jälkeen, kun näytettä ja vasta-ainetta on pidetty kosketuksissa riittävä ajanjakso, alustaa käsitellään yleensä reagoimattoman vasta-aineen poistamiseksi. Normaalisti tämä toteutetaan pesemällä alusta vettä sisältävällä, tavallisesti puskuroidulla väliaineella. Yleisesti, pesuliinksen määrän tulisi riittää reagoimattoman vasta-aineen poistamiseen.

Tämän jälkeen tarkkaillaan vasta-aineen sitoutumista näytteessä olevaan antigeeniseen kohtaan, ja tämä sitoutuminen on verrannollinen pahanlaatuisen tilan läsnäoloon tässä paikassa. Toisin sanoen näytteestä määritetään muodostuneiden, antigeenin ja vasta-aineen välisten kompleksien (immuunikompleksien) lukumäärä. Huomattakoon, että eräissä tapauksissa irronneita soluja sisältävästä näytteestä voidaan löytää erittäin vähän kyseisiä antigeenisiä kohtia. Kuitenkin pahanlaatuisen tilan tapauksessa näytteessä on läsnä erittäin paljon antigeenisiä kohtia, ja tämä viimeksi mainittu tila voidaan erottaa helposti tällä menetelmällä hyvänlaatuisesta tilasta, koska pahanlaatuisen tilan tapauksessa näytteestä voidaan mitata paljon antigeenin ja vasta-aineen välisiä komplekseja. Sitoutumisen läsnäolon määrittämiseksi koejärjestelmään sisällytetään ilmaistavissa olevan signaalin tuottavaa ainetta. Esimerkiksi kokeessa käytettävä vasta-aine voidaan konjugoida merkkiaineeseen, joka kykenee tuottamaan ilmaistavissa olevan signaalin. Tämä merkkiaine voi olla radioaktiivinen ryhmä, kromofori, mukaan lukien värit ja fluoresoivat aineet, entsyymi tai muu vastaava. Vasta-ainetta koh-den käytettyjen merkkiaineiden lukumäärä määräytyy yleensä mene-‘ · telmän tarpeiden mukaan, sekä sen mukaan, kuinka paljon kohtia ·.: merkkiaineen kytkemiseksi vasta-aineeseen on käytettävissä.

.·.·. Vaihtoehtoisesti, pesty levy voidaan saattaa kosketuksiin vasta-aineen merkityn, spesifisen sitoutumiskumppanin kanssa, joka . . sitoutumiskumppani voi olla esimerkiksi käytetylle vasta-aineelle *..* spesifinen merkitty vasta-aine. Mikäli monoklonaalinen vasta-\ aine on saatu hiiri lähteestä, niin tällöin voidaan käyttää mene- •f: telmässä käytetylle vasta-aineelle spesifistä, merkittyä anti- hiiri-immunoglobuliinia. Näitä immunoglobuliineja voidaan tuot-taa tavanomaisilla tekniikoilla, injektoimalla sopivaan isäntään ie 8581 4 monoklonaalista vasta-ainetta, jonka jälkeen odotetaan sopiva aika, ja anti-hiiri-immunoglobuliinit otetaan talteen injektion saaneen isännän verestä. Kun menetelmässä käytetään vasta-aineen merkittyä, spesifistä sitoutumiskumppania, niin levy on pestävä uudestaan vettä sisältävällä väliaineella ennen fluoresenssin määrittämistä levystä.

Jotta voitaisiin määrittää vasta-aineen ja solunäytteen, jossa käytetään fluoresoivaa merkkiainetta, välisen sitoutumisen läsnäolo, levyltä voidaan määrittää fluoresenssi käyttäen tavallisesti fluoresenssimikroskooppia. Mikäli merkkiaineena käytetään muuta kuin fluoresoivaa merkkiainetta, levyltä tai näytteestä voidaan määrittää saostuman, värin, tai muun vastaavan, muodostuminen.

Edellä esitetty kuvaus kohdistuu pääasiallisesti tämän keksinnön mukaisten vasta-aineiden käyttöön immunofluoresenssiin perustuvissa tekniikoissa. Kuitenkin keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää useimmissa kokeissa, joihin liittyy antigeenin ja vasta-aineen välisiä reaktioita. Koe voi olla homogeeninen tai heterogeeninen. Homogeenisen kokeen tapauksessa näyte voi olla biologista nestettä, kuten seerumia, virtsaa tai muuta vastaavaa, tai näyte voidaan lysoida ja kirkastaa jätteen poistamiseksi. Esimerkiksi vasta-ainetta L3 on käytetty samaa sukua olevien anti-geeniensa, eli muodon I, II tai III L3-antigeenin, pitoisuuden mittaamiseen syöpäpotilaiden seerumista, ja todettiin, että tiet-. . tyjen syöpäpotilaiden seerumissa tämän antigeenin pitoisuudet ' ovat suuremmat normaaleihin vertailuihin verrattuna. Immunolo- • ' ginen reaktio käsittää tavallisesti spesifisen vasta-aineen, mer- • kityn analyytin sekä mielenkiinnon kohteena olevan näytteen. Merkkiaineesta saatava signaali muuntuu suoraan tai epäsuorasti, kun vasta-aine sidotaan merkittyyn analyyttiin. Sekä immunologinen reaktio että reaktion voimakkuuden ilmaiseminen voidaan :*·.· toteuttaa homogeenisessa liuoksessa. Käyttökelpoisia immuno-.**·. kemiallisia merkkiaineita ovat vapaat radikaalit, fluoresoivat värit, entsyymit, bakteeriofaagit, koentsyymit ja niin edelleen.

’·...· Heterogeenisen kokeen tapauksessa reagensseina toimivat taval-lisesti näyte, spesifinen vasta-aine sekä ilmaistavissa olevan • · » · · • * · i9 8581 4 signaalin tuottava aine. Yleensä näyte laitetaan alustalle, kuten levylle tai liuskalle, ja se saatetaan kosketuksiin nestefaasissa olevan vasta-aineen kanssa. Tämän jälkeen alusta erotetaan nestefaasista ja ilmaistava signaali määritetään joko alustan muodostamasta faasista tai nestefaasista käyttäen sopivia keinoja tämän signaalin tuottamiseksi. Signaali on verrannollinen analyytin läsnäoloon näytteessä. Keinoja ilmaistavan signaalin tuottamiseksi ovat radioaktiivisten merkkiaineiden, fluoresoivien aineiden, entsyymien ja niin edelleen, käyttö. Esimerkkeinä heterogeenisista immunokokeista mainittakoon radioLnununokoe, immunofluoresenttimenetelmät, entsyymiin kytkemiseen perustuvat immunokokeet ja muut vastaavat.

Edellä mainittuihin immunokokeisiin perustuvia tekniikoita tarkastellaan yksityiskohtaisemmin julkaisussa "Enzyme-Immunoassays", jonka on laatinut Edward T. Maggio, CRC-Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Katso samoin esimerkiksi US-patenttijulkaisut 3 690 834; 3 791 932; 3 817 837; 3 850 578; 3 853 987; 3 867 517; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345 ja 4 098 876, joka luettelo ei pyri olemaan täydellinen.

Tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää samoin saamaan kuva etäispesäkkeistä ihmispotilaissa, joilla on NSCLC, * · ♦* analogisesti julkaisussa J. Nucl. Med. (1983) Z4:123-129 sekä : J. Clin. Invest. (1983) J72: 2101-2114 pahanlaatuiseen melanoomaan * · : liittyen esitetyllä tavalla. Vasta-aine tai sen kappaleet mer- : kitaan radioaktiivisesti, ja niitä annetaan suonen sisäisesti : potilaalle, josta tämän jälkeen otetaan kuva käyttäen esimerkik- .*.*. si gammakameraa tai vastaavaa.

____: Tätä keksintöä voidaan käyttää diagnostisissa kiteissä edellä esitettyjen menetelmien toteuttamiseksi. Eräässä suoritusmuodossa diagnostinen kitti käsittää pakattuna yhdistelmänä (a) mono- * * klonaalista vasta-ainetta, joka määritellään täsmällisemmin edel-* lä ja (b) edellä mainitun monoklonaalisen vasta-aineen spesifisen sitoutumiskumppanin ja ilmaistavissa olevan signaalin tuottavan .·. : merkkiaineen välisen konjugaatin. Reagensseihin voi myös kuulua

• I I

täydentäviä aineita kuten puskuroivia aineita 20 8581 4 ja proteiineja stabiloivia aineita, esimerkiksi polysakkarideja ja muita vastaavia, mikäli näiden menetelmien toteuttaminen sitä edellyttää. Tämä diagnostinen kitti voi lisäksi tarvittaessa sisältää sen signaaleja tuottavan järjestelmän, jonka jäsen merkkiaine on, muitakin jäseniä, aineita taustahäiriöiden vähentämiseksi kokeessa, vertailureagensseja, laitteen kokeen toteuttamiseksi, ja muita vastaavia. Eräässä toisessa suoritusmuodossa diagnostinen kitti käsittää tämän keksinnön mukaisen monoklonaa-lisen vasta-aineen ja ilmaistavissa olevan signaalin tuottavan merkkiaineen välisen konjugaatin. Kittiin saattaa myös kuulua täydentäviä aineita, kuten edellä esitetään.

Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää lääkinnällisesti. Vasta-aineita, joilla on sopivat biologiset ominaisuudet, voidaan käyttää suoraan lääkitsevinä aineina. Vaihtoehtoisesti vasta-aineet voidaan sitoa toksiiniin, jolloin saadaan immunotoksiini, tai radioaktiiviseen materiaaliin tai lääkeaineeseen, jolloin saadaan radioaktiivinen farmaseuttinen aine tai farmaseuttinen aine. Menetelmät vasta-aineisiin perustuvien immunotoksiinien ja radioaktiivisten farmaseuttisten aineiden valmistamiseksi ovat hyvin tunnettuja (katso esimerkiksi julkaisu Cancer Treatment Reports ( 1984) 68 : 317-328).

Tämän keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden toisena lääkinnällisenä käyttömuotona on potilaan immunointi anti-idio-•· tyypin vasta-aineella, jota on muodostettu käyttäen immunogee-! nina yhtä oheisista monoklonaalisista vasta-aineista. Tällai- ; \ nen immunointi saattaa indusoida aktiivista, tuumoria vastaan '· vaikuttavaa aktiivisuutta (katso esimerkiksi julkaisu Nepom et ai-, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1984) 81^:2864-2867). Samaa periaatetta noudattaen potilas voidaan immunoida puhdistetussa muodossa olevalla antigeenillä, antigeenin peptidikappaleella, tai antigeenin muunnetulla muodolla.

·«» Tämän keksinnön erityisen lupaava piirre on se, että L3-vasta-ainetta voidaan käyttää yhdessä muiden vasta-aineiden kanssa.

• · *···' Tämän yhdistelmän tehokkuus voi perustua siihen, että sillä voidaan vähintään ilmaista edellä mainitut keuhkosyöpätyypit, li 2i 8581 4 nimittäin suurisoluinen erikoistumaton keuhkosyöpä, adenokarsi-nooma ja epidermoidikarsinoorna. Esimerkiksi monoklonaalisia vasta-aineita L3 ja L18 (julkaistu US-patenttihakemuksessa 667 521) voidaan yhdistää tehokkaina määrinä, eli sellaisina määrinä, että yhdistelmällä voidaan ilmaista kaikki edellä mainitut keuhko-syöpätyypit .

Eräät tämän keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet määrittävät samoin determinanttikohtia antigeeneissä, jotka liittyvät muihin syöpiin, kuten rintasyöpään tai emättimen epidermoidikarsinoomiin, Näin ollen oheisia vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisissa ja lääkitsevissä tuotteissa, joiden kohteena ovat tällaiset syöpäsairaudet.

Esimerkit

Keksintöä havainnollistetaan edelleen seuraavilla selventävillä esimerkeillä. Ensin kuvataan joukko käytettyjä toimenpiteitä.

Materiaalit

Viljelyalustat saatiin yhtiöstä Gibco. Sikiöasteisen naudan seerumi oli yhtiöstä Gibco tai Hyclone. Teflonilla pinnoitetut monikoloiset (12 koloa) mikroskooppi levyt saatiin yhtiöstä Meloy. Muoviset viljelymaljät saatiin yhtiöstä Corning tai Costar. V8-proteaasi ja naudan seerumin albumiini saatiin . yhtiöstä Sigma. Neuramidaasi ja Pansorbiini (formaliinilla kiinnitetty S. aureus) saatiin yhtiöstä Calbiochem. Endogly-

• kosidaasi H oli yhtiöstä Miles. Nitroselluloosa (BA85, 0,45^u) oli yhtiöstä Schleicher ja Schuell. Proteiini A - Sepharose-geeli, CNBr-aktivoitu Sepharose 4B-geeli, Sephadex G-10, DEAE

: - Sephacel ja Proteiiniin A konjugoitu Sepharose CL4B-geeli saa tiin yhtiöstä Pharmacia. NP-40 saatiin yhtiöstä Particle Data Ltd. Polyetyleeniglykoli, röntgensädefilmi ja Kodavue-värjäys-.·. : kitti saatiin yhtiöstä Kodak. Akryyliamidi ja hopeavärjäyksen • kitti saatiin yhtiöstä BioRad. Etukäteen värjätyt molekyylipai-nojen merkitsimet saatiin yhtiöstä Bethesda Research Laborato- 14 • · ries, Bethesda, Maryland (BRL). C-metyloidut molekyylipaino- *·* . . 3 35 125 jen merkitsimet, H-glukosamiini, S-metiomini ja I saa- 22 8581 4 tiin yhtiöstä Amersham. FITC-konjugoitu vuohen anti-hiiri-immunoglobuliini oli yhtiöstä Tago. Paragon-merkkinen seerumi-proteiinin elektroforeesilaitteisto oli yhtiöstä Beckman. Amfoliinit saatiin yhtiöstä LKB.

Immunohistologiset tekniikat

Pakastettujen leikkeiden immunohistologisiin tutkimuksiin käytettiin merkitsemättömään vasta-aineeseen perustuvan tekniikan, joka esitetään julkaisussa Sternberger, Immunochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1979, sivut 104-169, muunnosta julkaisusta Garrigues et ai., Int. J. Cancer (1982) 2^:511-515. Näiden kokeiden kohdekudokset saatiin kirurgisesti, ja ne pakastettiin 4 tunnin sisällä poistamisesta isopentaaniin, joka oli jäähdytetty edeltäkäsin nestemäisessä typessä. Sitten kudoksia säilytettiin nestemäisessä typessä tai -70°C:n lämpötilassa käyttöön saakka. Kaniinin anti-hiiri-IgG:tä (Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) käytettiin laimennoksena 1/50. Hiiren peroksidaasin ja antiperoksidaasin välistä kompleksia (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.), joka sisälsi 2 mg/ml erityisesti puhdistettua PAP:ia, käytettiin laimennoksena 1/80. Pakastetut leikkeet preparoitiin, kuivattiin käsiteltiin asetonilla ja kuivattiin (Garrigues et ai. 1982). Histologiseen arviointiin käytettävät leikkeet värjättiin hema-toksyliinillä. Epäspesifisen taustan vähentämiseksi leikkeitä ____: inkuboitiin etukäteen normaalin ihmisseerumin kanssa, joka ; seerumi oli laimennettu 1/5 (Garrigues et ai., 1982). Hiiren - vasta-aineet, vuohen anti-hiiri-IgG ja hiiren PAP laimennettiin ! liuoksella, joka käsitti 10% normaalia ihmisen seerumia ja 3% kaniinin seerumia.

Värjäystoimenpide käsitti peräkkäisten leikkeiden käsittelemisen joko spesifisellä vasta-aineella tai vertailuvasta-aineella : 2,5 tunnin ajan, sitten niiden inkuboimisen 30 minuutin ajan kaniinin anti-hiiri-IgG:n kanssa, joka IgG oli laimennettu 1/50, *. jonka jälkeen hiiren PAP-kompleksin, joka oli laimennettu 1/80, annettiin vaikuttaa leikkeisiin 30 minuuttia. Joka kerran vasta- • · *♦··* aineella käsittelemisen jälkeen levyt pestiin kahdesti fosfaa-tiliä puskuroidussa suolaliuoksessa. Immunohistokemiallinen n 23 85 8 1 4 reaktio kehitettiin juuri valmistetulla 0,05% 3,3'-diaminobentsi-diinitetrahydrokloridilla (Sigma, St. Louis, MO) ja 0,01% vetyperoksidilla 0,05 M Tris-puskurissa, pH 7,6 8 minuutin ajan. Tislattuun veteen valmistetun 1% Os04~liuoksen annettiin lisäksi vaikuttaa leikkeisiin 20 minuuttia, mikä voimisti väriä. Leikkeet huuhdottiin vedellä, vesi poistettiin alkoholilla, kirkastettiin ksyleenissä ja siirrettiin levyjen päälle.

Levyt mitattiin koodattuina, ja puolueeton henkilö tarkasti koodatut näytteet. Tyypilliset levyt valokuvattiin käyttäen differentiaalisen interferenssin kontrastiin perustuvaa optiikkaa (Zeiss-Momarski ). Vasta-aineen värjäytymistaso arvioitiin seuraavasti: 0 = ei reaktiivisuuta; + = jokunen positiivinen solu; ++ = vähintään kolmannes soluista positiivisia; +++ = suurin osa soluista positiivisia; ++++ = lähes kaikki solut voimakkaasti positiivisia. Koska +- ja 0-värjaytymisen väliset erot olivat epäselvemmät kuin ++- ja +-värjäytymisen väliset erot, niin "positiivisena" päätettiin pitää värjäytymistä, jonka tasona oli ++ tai sitä suurempi. Tuumorinäytteissä havaittiin sekä neoplastisia soluja että stroomasoluja; määritetty värjäytyminen viittaa tuumorisoluihin, sillä stroomasolut eivät värjäytyneet lainkaan, tai ne värjäytyivät heikommin kuin tuumori-solut .

____; Antigeenin sijainnin määrittäminen - . Antigeenien sijainti solutasolla määritettiin mittaamalla vasta- ] aineen sitoutuminen soluihin ennen solujen tekemistä läpäisevik- ; si ei-ionisella pinta-aktiivisella aineella sekä sen jälkeen.

” Vahingoittumattomien viljeltyjen solujen solupintaan sitoutuvat vasta-aineet tunnistettiin joko suorilla sitoutumiskokeilla 125 ·.· I-merkittyä vasta-ainetta käyttäen (Brown et ai., Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A. (1981a) _7_8:539 — 543) tai epäsuoralla fluore- :*·.· senssilla käyttäen (FACS) II solulajittelijaa. Solujen sisäi- • · ...... 125 siin kohtiin sitoutuvat vasta-aineet määritettiin I-merkityn * # vasta-aineen suorana sitoutumisena soluihin paraformaldehydillä ] / kiinnittämisen jälkeen, mitä seurasi läpäiseväksi tekeminen ei- ionisella pinta-aktiivisella aineella NP-40.

»*· 24 8581 4

Si tout umiskokeet a) Radioaktiivisesti merkittyjä vasta-aineita käyttäen toteutettavia sitoutumiskokeita (Brown et ai., edellä) varten viljeltyjä soluja (10^) inkuboitiin 4°C:n lämpötilassa 30 minuut-tia 10 cpm:n suuruisen määrän kanssa 3I-merkittyä vasta-ainetta vil jelyalustassa, joka sisälsi 100^,ul lämmöllä aktivoitua (30 minuuttia 56°C:n lämpötilassa) sikiöasteisen vasikan seerumia. Soluihin lisättiin 5 ml PBS-liuosta, jonka jälkeen solut kasautettiin sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 250 x g. Supernatantti imettiin pois, ja kasaumasta määritet- 125 .... . .

tiin laskemalla I. Epäspesifisen sitoutumisen mittaamiseksi rinnakkaiset: inkuboinnit toteutettiin käyttäen kilpailijana lO^ug merkitsemätöntä vasta-ainetta (Brown et ai., edellä). Eräissä tapauksissa sitoutumiskokeet suoritettiin analogisella tavalla käyttäen solujen monokerroksia, jotka oli kiinnitetty muovisille viljelymaljoille.

b) FACS II-solulajittelijassa toteutettavia sitoutumiskokeita varten solut poistettiin substraateistaan käyttäen PBS-liuosta, joka sisälsi 5 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA).

1 x 103 soluja sisältäviä näytteitä inkuboitiin ensin mono-klonaalisen vasta-aineen kanssa, jonka vasta-aineen pitoisuus tällöin oli 2^ug/ml, mitä seurasi fluoreseiiniin konjugoitu vuohen anti-hiiri-vasta-aine 1:200-laimennoksena. Tämän jäl-keen solut pestiin ja ne suspendoitiin uudestaan viljelyalus-. . taan. Välittömästi ennen FACS-analyysia soluihin lisättiin !propidiumjodidia lopulliseksi pitoisuudeksi l^ug/ml muiden ; \ kuin elinkelpoisten solujen värjäämiseksi. FACS-analyysin *· aikana punaista fluoresenssisäteilyä lähettävät solut jätet-tiin elektronisesti huomioimatta, jolloin pelkästään elin-kelpoisia soluja tarkasteltiin. Sitten fluoreseiinin fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti määritettiin kummankin vasta-aineen tapauksessa. Negatiivisina vertailuina käytet-;*j‘. tiin näytteitä, joista puuttui monoklonaalinen vasta-aine; • . positiiviset vertailut käsittivät HLA-l-tyypin histokompatibili- teettiantigeenien monoklonaalisia vasta-aineita. Värjäyty-"··. mistä pidettiin positiivisena, mikäli kanavan keskimääräinen ·*·*; fluoreseiini oli vähintään 3 kertaa taustan suuruinen.

25 85 81 4

Proteliniäntigeenin määrittäminen

Proteiiniantigeenien tunnistamiseksi keuhkosyövän tai ihmis-sikiön keuhkoista saatujen solujen pinta merkittiin radioaktiivisella jodilla tai merkittiin aineenvaihdunnallisesti 35 S-metioniinilla. Antigeenit eristettiin soluhajoitteista inkuboimalla monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, mitä seurasi vuohen anti-hiiri-IgG:n lisääminen ja adsorptio S. aureus-bakteeriin. Immuunisakat pestiin ja ne analysoitiin elektro-foreettisesti natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidi geeliä käyttäen (SDS-PAGE) (10-20% akryyliamidia), kuvatulla tavalla (Brown et ai., edellä).

35 S-metioniinilla merkitseminen

Tiettyä vasta-ainetta tuottavia hybridomasoluja siirrostettiin mikrotiitterilevyn koloissa olevaan, metioniinia sisältämättömään Dulbecco'n olennaiseen vähimmäisalustaan (DMEM), joka sisälsi 25 mM Hepes-puskuria, 4 mM L-glutamiinia, 4,5 g/1 glukoosia, 10 mM ei-olennaisia aminohappoja, 100 yksikköä/ml penisilliiniä, 100^,ug/ml streptomysiiniä ja 15% lämmöllä in-aktivoitua, juuri syntyneen vasikan seerumia (NCS). Soluja pidettiin kosketuksissa 6 tuntia 37°C:n lämpötilassa 0,1 mCi 35 ....

S-metioniinm kanssa, supernatantti poistettiin ja sentri- fugoitiin solujen poistamiseksi.

____; Isotyypin määrittäminen . . a) Ouchterlony-immuunidiffuusio • 1 » I Näyte tiettyjen hybridomasolujen supernatantista laitettiin • 1 2% agarmaljan keskikoloon. Monospesifisiä kaniinin anti-hiiri - Ig-isotyyppien vasta-aineita (Meloy) laitettiin uloimpiin ko loihin ja maljaa inkuboitiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa .sekä yön yli 4°C:n lämpötilassa.

b) Taipuisasta polyvinyylikloridista valmistettuja 96-koloisia maljoja (Costar) pinnoitettiin 0,1 mg/ml vuohen anti-hiiri •. Ig-vasta-aineilla 2 tuntia 37°C:n lämpötilassa, ja niitä pin noitettiin uudestaan 3% BSA-liuoksella 2 tuntia 37°C:n lämpö-'··.1 tilassa. Tämän jälkeen hybridomien supernatanttia inkuboitiin ·'·1: 2 tuntia 37°c:n lämpötilassa. PBS-liuoksella ja naudan seeru- * » · · 26 8581 4 min albumiinilla (BSA) pesemisen jälkeen maljoja inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 2 tuntia peroksidaasiin (Zymed) kytkettyjen, monospesifisten kaniinin anti-hiiri Ig-isotyypin vasta-aineiden läsnäollessa. Pesun jälkeen maljoissa inkuboitiin 1 mg/ml orto-fenyleenidiamiinia ja 0,03¾ vetyperoksidia 0,1 M sitraatti- puskurissa, pH 4,5. Optinen tiheys määritettiin aallonpituudella 630 nm käyttäen Dynatec-merkkistä ELISA-maljojen mittauslaittetta.

Staphylococci-bakteerista peräisin olevan Proteiinin A sitoutu- miskoe_

Mikrotiitterilevyn koloissa inkuboitiin 5¾ NCS-seerumia PBS- liuoksessa, joka sisälsi lisäksi 0,02¾ yhdistettä NaN^ ja super- natantti imettiin pois. Kuhunkin koloon lisättiin 25,ui epi- 7 dermaalisten solujen (2 x 10 solua/ml) suspensiota, jota inkuboitiin 1 tunti huoneen lämpötilassa siten, että läsnä oli 25^ul erityistä vasta-ainetta. Levyjä sentrifugoitiin nopeudella 1200 rpm 7 minuuttia, pestiin kahdesti 50¾ NCS/PBS/NaN~-liuok-

125 J

sella ja 25^ul I-merkittyä staphylococci-bakteerista saatua proteiinia A (noin 50 000 cpm/25 1) lisättiin. Levyjä inkuboitiin 1 tunti 25°C:n lämpötilassa, pestiin kahdesti 5¾ NCS/PBS/ NaN3~liuoksella ja kuivattiin. Kolojen pohjat leikattiin irti ja laskettiin gammalaskurissa.

Soluviljelmä Λ Keuhkosyövän Calu-l-soluja saatiin kantakokoelmasta American , . Type Culture Collection. Soluja ylläpidettiin yksikerrosvil-; ** jelmänä kasvutusalustassa (Dulbecco'n muunnettu Eagle-alusta ·*·' (DMEM), joka sisältää 50 yksikköä penisilliiniä/ml, 50^ug strep-tomysiiniä/ml ja 10¾ (v/v) sikiöasteisen vasikan seerumia (FCS). Solut otettiin talteen käsittelemällä liuoksella, joka sisälsi • - 0,05¾ trypsiiniä ja 0,02¾ EDTA-puskuria, ja laskettiin hema- sytometrillä.

.·:·. Epäsuora immunofluoresenssi • Solut otettiin talteen trypsinoimalla ja ne maljattiin tihey- <:*·· .. 3 tena 5-20 x 10 solua/kolo (halkaisija 6 mm) teflonilla pinnoi-*...· tetuille monikoloisille levyille (Meloy Labs). Soluja pidet-tiin 37°C:n lämpötilassa noin 18 tuntia ennen kokeen aloitta- m · l · · I: 27 8581 4 mistä. Alusta imettiin pois ja tarttuneet solut pestiin kertaalleen fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS, NaCl, 0,14 M; KC1, 3 mM; Na2HPC>4 x 7 ^0, 8 mM; sekä KH2P04, 15 mM), joka sisälsi 0,5 mM CaCl„:ta ja 0,5 mM MgCl :ta. Sitten soluja

^ A

kiinnitettiin in situ lisäämällä 25 mikrolitraa paraformaldehy-din liuosta (0,5% PBS-liuoksessa), 20-30 minuuttia 23°C:n lämpötilassa. Solut pestiin ja solujen sisäiset antigeenit paljastettiin lisäämällä PBS-liuosta, joka sisälsi 0,2% (v/v) pinta-aktiivista ainetta NP-40, jonka annettiin vaikuttaa 5 minuuttia 23°C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen liialliset aldehydiryh-mät salvattiin lisäämällä sitomispuskuria (DMEM, joka sisältää 50 mM BES:iä (N,N-bis-/2-hydroksietyyli7-2-aminoetaani-sulfoni-happo) pH-arvossa 6,8, 0,1% (w/v) BSArta ja 15% FCS:ta), ja sen annettiin vaikuttaa vähintään 15 minuuttia 23°C:n lämpötilassa. Vasta-aineet laimennettiin pitoisuudeksi lO^ug/ml sitoutumis-puskurilla, ja niitä laitettiin kuhunkin koloon yhteensä 20 -25 mikrolitraa. Levyjä inkuboitiin 4°C:n lämpötilassa 1 tunti ja pestiin sitomispuskurilla. Tämän jälkeen levyille lisättiin fluoreseiini-isotiosyanaattiin konjugoitua (FITC) sekundääristä vasta-ainetta (vuohen anti-hiiri IgG ja IgM), ja sen annettiin vaikuttaa 1 tunti 4°C:n lämpötilassa. FITC-konjugaatin käytetty laimennos määritettiin kokeellisesti sillä perusteella, että laimennoksella saatiin paras mahdollinen signaalin ja taustan välinen suhde. Tämän inkuboinnin jälkeen levyt pestiin sitou-tumispuskurilla ja vedellä, ja ne kuivattiin. Levyille lisät- . . tiin pieni määrä haalistumista estävää liuosta (Genetic Systems ; Corporation) ja niiden päälle laitettiin peitelasit, ja le- • ' vyjä tarkasteltiin Leitz Orthoplan-merkkisellä fluoresenssimik- • roskoopilla. Levyjen tarkastelemiseen käytettiin 40 x suuren- tavaa, Öljyyn upotettavaa objektiivia, ja ne valokuvattiin Kodak Tri X Pan-f ilmille .

1. : Metabolinen merkitseminen • 1 35 A. S-metioniini _ Solut otettiin talteen trypsinoimalla. Elinkelpoisuus, joka määritettiin trypaanisinisen tunketumisena soluun, oli tavallisesti yli 95%. 4 x 10° solua otettiin talteen sentrifugoimalla, ja suspendoitiin 1 millilitran suuruiseen tilavuuteen kasvualustaa.

28 8581 4 35 josta puuttui aminohappo-metioniini. S-metioniinia (800 Ci/ mmol) lisättiin lopulliseksi pitoisuudeksi 0,5 mCi/ml ja soluja inkuboitiin pyörittäen 37°c:n lämpötilassa 1-6 tuntia. Tämän jälkeen merkityt solut otettiin talteen sentrifugoimalla ja ne pestiin ennen muuta manipulointia. Eräissä tapauksissa radio-aktiivisesti merkittyjen solujen suspensio laimennettiin 10-ker-taisesti kasvatusalustalla, joka sisälsi merkitsemätöntä metio-niinia ja 10% FCSria, lisättiin 100 millimetrin kudosviljely-maljaan ja inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa edelleen 18 tuntia. Tarttuneet solut pestiin sitten PBS-liuoksella ennen käyttöä.

3 B. H-glukosamuni

Samankaltaista merkitsemismenetelmää käytettiin merkittäessä so-3 luja H-glukosamunilla. Sisäisten glukoosilähteiden annettiin ensin ehtyä inkuboimalla soluja glukoosia sisältämättömässä kasvatusalustassa, joka sisälsi 10% dialysoitua FCS:ta, 4-24 tunnin ajan. Seuraavissa kokeissa käytettiin vain niitä solupopulaatioita, joissa elinkelpoisuus oli yli 90% glukoosi lähteen ehtymisen jälkeen. Solut otettiin talteen edellä kuvatusti ja ne suspendoitiin uudestaan 1 millilitraan glukoosia sisältämätöntä kasvatusalustaa, joka sisälsi 10% dialysoitua FCS:ta, 0,01 M HEPES-puskuria (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N-2-etaanisulfoni-happo) pH-arvossa 7,4 sekä 0,5 M Ci 3H-glukosamiinia (40 Ci/mmol). Soluja merkittiin 37°C:n lämpötilassa pyörittämällä 3 tunnin ajan, jonka jälkeen solut otettiin talteen sentrifugoimalla, ja ne pestiin PBS-liuoksella.

- Jodaaminen ·'·'· 125

Proteiinit merkittiin radioaktuvisesti jodilla käyttäen klo- r.'-: ramiini-T-toimenpidettä, joka kuvataan julkaisussa Greenwood, : I : et ai. (1963) Biochem. J. 8_9:114-123. Proteiininäytteet (50yUg) : : : laimennettiin 0,5 millilitraksi PBS-liuoksella, joka sisälsi 12 5 1-2 mCi jodia (ilman kantajaa). Laimennokseen lisättiin .·.: 10 yul juuri valmistettua kloramiini-T-liuosta (sisältää lO^ug yhdistettä), ja reaktion annettiin edetä 5 minuutin pituisen ajan 23°C:n lämpötilassa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä liuos- ’ ' ta, joka sisältää 20/ug yhdistettä Na„S„0_ ja 3.ug yhdistettä .***. . 125^ ·...· KI. Reagoimaton χ poistettiin kromatograf isesti käyttäen • · • · · 1 « 29 8581 4

Sephadex G-10-kolonnia, joka oli tasapainotettu 1 mg/ml naudan seerumin albumiinia sisältävällä PBS-liuoksella. Tässä tutkimuksessa käytettyjen merkittyjen monoklonaalisten vasta-ainei- 9 den spesifinen aktiivisuus oli noin 3 x 10 cpm/nanomooli. L3-antigeenia sisältävät näytteet tehtiin suolattomaksi Sephadex G-10-kolonnilla, joka oli sopivassa muodossa, ennen radioaktiivista merkitsemistä.

Immunosaostukseen perustuva analyysi 1. Uutteen valmistaminen

Aineenvaihdunnatlisesti merkityt solut otettiin talteen sentri-fugoimalla, ja tehtiin liukoisiksi RIPA-puskurilla, joka sisälsi: NaCl, 0,15 M; Na2HP0^, 0,05 M; natriumdeoksikolaattia, 1 % (w/v); Triton X-100, 1 % (w/v); ja SDS, 0,1 % (w/v), käyttäen soluja 2-4 x 10^/ml. Soluja inkuboitiin 10 minuuttia 4°C:n lämpötilassa, jonka jälkeen seos kirkastettiin sentrifugoimalla (147 000 x g 30 minuuttia, Ti 70.1-roottori). Supernatantti poistettiin ja radioaktiivisuuden sisältyminen määritettiin nestefaasin tuike-laskurilla .

2. Immunosaostaminen: 7

Solulysaatin näytteitä, jotka sisälsivät 1-2 x 10 cpm (hapolla 35 125 6 saostuvaa) ö-metioniinia ja jodia tai 4 x 10 cpm (hapolla 3 saostuvaa) H-glukosamiinia, inkuboitiin vasta-aineen 1 mikro-gramman läsnäollessa 0,5-1 tuntia 4°C:n lämpötilassa. Analysoi-: · taessa merkittyä viljelyalustaa käytettiin näytettä, joka vastasi koko analysoidun solu-uutteen prosenttista pitoisuutta. Affini-: : : teettiin perustuen puhdistettua vuohen antihiiri immunoglobuliinia (1-2 .ug; valmistettu immunoimalla vuohi hiiren immunoglobulii-. .·. nilla) sisältävää liuosta lisättiin, ja inkubointia 4 C:n lämpo-tilassa jatkettiin edelleen 10-60 minuuttia. 50 ^ul formaliinilla kiinnitetyn Staphylococcus aureus-bakteerin (Pansorbiini) . . 10 % liuosta lisättiin, ja inkubointia jatkettiin 5 minuuttia *· 4°C:n lämpötilassa, jonka jälkeen immunosaostumat otettiin tal- "* ’ teen sentrifugoimalla. (Pansorbiini pestiin ennen käyttöä ....: kerran 0,5 % (v/v) NP-40-liuoksella, kerran 0,05 % (v/v) NP-40- liuoksella, ja suspendoitiin jälkimmäiseen puskuriin, joka sisälsi 30 8 5 8 1 4 1 mg/ml ovalbumiinia). Sakat pestiin 3-4 kertaa TNEN-puskurilla (Tris-hydroksimetyyliaminometaani, pH 8,0, 0,02 M; NaCl, 0,1 M; EDTA, 0,01 M; ja NP-40, 0,5 % (w/v)) ja säilytettiin pakastettuna ennen käyttöä.

Elektroforeesi 1. SDS-polyakryyliamidigeelillä toteutettu elektroforeesi (SDS-PAGE) :___ SDS-PAGE toteutettiin edellä mainitussa Laemmli'n julkaisussa esitetystä. Useimmin käytetty erottava geeli (0,75 mm) oli 10-20 % lineaarinen akryyliamidigradientti ja pinoava geeli sisälsi 5 % akryyliamidia. Näytteet keitettiin näytepuskurissa, joka sisälsi 5 % 2-merkaptoetanolia, ja immunoabsorbentti poistettiin sentri-fugoimalla ennen elektroforeesia. Molekyylipainon standardeina käytettiin joko ^C-metyloitujen proteiinien seosta (Amersham) tai edeltäkäsin värjättyjä standardeja (BRL). Standardeina käytettyjen proteiinien molekyylipainot olivat 200 OOO (myosiini), 92 400 (fosforylaasi b), 69 000 (naudan seerumin albumiini (BSA), 46 000 (ovalbumiini), 26 OOO (kymotrypsinogeeni), 18 400 (beeta-laktoglobuliini), 14 300 (lysotsyymi) ja 12 300 (sytokromi c). Elektroforeesin jälkeen geelit kuivattiin vakuumissa, ja radio-aktiivisesti merkittyjen proteiinien asemat määritettiin auto-radiografoimalla Kodak-merkkiselle röntgensädefilmille.

2. Kaksiulotteinen isoelektrinen fokusointi-(IEF)-SDS-PAGE: 125 .·. ; I-merkittyä L3-antigeenia sisältävät immunosakat valmistettiin * . kuvatulla tavalla, ja suspendoitiin uudestaan 50 mikrolitraan ; liuosta, joka sisälsi 5 % (v/v) 2-merkaptoetanolia ja 1 % (v/v) ‘ / pinta-aktiivista ainetta NP-40. Näytteitä kuumennettiin 95°C:n lämpötilassa 5 minuuttia ja immunoabsorbentti poistettiin sentrifugoimalla. Näytteisiin sekoitettiin amfoliineja (pH-alueella 3,5-10; lopullinen pitoisuus 4 %) ja kiinteätä ureaa : lisättiin kyllästymiseen saakka. Isoelektrinen fokusointi ja SDS-PAGE toteutettiin 0'Farrell'in menetelmän mukaisesti 0'Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250:4007-4021. Tavanomaisia proteiinimerkitsimiä (BioRad) käytettiin erottumisen seuraamiseen 31 8581 4 IEF-ulottuvuudessa. Tuloksena oleva pH-gradientti määritettiin rinnakkain ajetulla tyhjällä geelillä. Geeli leikattiin 0,5 senttimetrin liuskoiksi, liuskat upotettiin 1 millilitraan tislattua vettä 1 tunniksi, ja tuloksena olevan liuoksen pH määritettiin .

3 . Paragon-elektroforeesi

Seerumiproteiinien elektroforeesi toteutettiin Paragon-laittees-da (Beckman) edeltä käsin muodostettuja agaroosigeeleja käyttäen, valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Immunotäpliitäminen

Analysoitavat proteiinit erotettiin joko SDS-PAGE- tai Paragon-elektroforeettisesti. SDS-PAGE:lla erotetut näytteet siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosalle julkaisussa Burnette (1981) Anal. Biochem. 112:195-203 kuvatulla tavalla teholla 5 V/cm, suurin piirtein 18 tunnin aikana 4°C:n lämpötilassa. Paragonilla erotetut näytteet siirrettiin nitroselluloosalle laittamalla elektroforetogrammin päälle liuska nitrosellu-loosapaperia. Nitroselluloosa kasteltiin ennen käyttöä Burnette'n (edellä) siirtopuskurissa, joka ei sisällä SDS-yhdis-tettä. Nitroselluloosan päälle laitettiin noin 2,54 cm:n paksuinen pino paperipyyhkeitä, ja niiden päälle painoksi laitettiin lasilevy ja reagenssipullo. Siirtyminen oli täydellistä 1 tunnissa, mikä voitiin päätellä värjäämällä geeli siirtämisen jälkeen. Nitroselluloosalla olevien täplien salpaamiseen käytet-V-: tiin 1 tunnin inkuboimista Blotto-liuoksessa, joka on maitoon : : : perustuva seos (Johnson et ai., Gene Anal. Technol. (1984) l_:3-8) (PBS, joka sisältää 1 % (w/v) rasvatonta maitojauhetta (Carnation) ja 0,2 % (v/v) pinta-aktiivista ainetta NP-40) . L3-antigeeni paljastettiin inkuboimalla täpliä Blotto-liuoksessa, joka sisäl-', ’,' g X 2 5 tää 1-4 x 10° cpm/ml 3I-L3-vasta-ainetta, 1 tunnin ajan 23°C:n . lämpötilassa. Täplät pestiin huolellisesti Blotto-liuoksella, ja kuivattiin ennen autoradiografista valottamista.

125 „ . . ^ .

- I-L3-vasta-aineen sitominen --2- : : Calu-l-solut (4-10 x 10 ) maljattiin 48 koloa käsittäville solu- viljelymaljoille 18 tuntia ennen kokeen aloittamista. Solut 32 8581 4 pestiin PBS-liuoksella ja kiinnitettiin PBS-liuoksella, joka sisälsi 0,5 % paraformaldehydiä 20 minuutin ajan 23°C:n lämpötilassa. Monokerrokset pestiin PBS-liuoksella ja tehtiin läpäiseviksi käsittelemällä niitä PBS-liuoksella, joka sisältää 0,2 % pinta-aktiivista ainetta NP-40, 5 minuuttia 23°C:n lämpötilassa.

125 . · I-merkittyä vasta-ainetta lisättiin en pitoisuuksina 0,1 millilitran kokonaistilavuudessa, ja annettiin vaikuttaa 60 minuutin pituisen ajan 23°C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen mono-kerrokset pestiin huolellisesti sitomispuskurilla, ja tehtiin liukoisiksi lisäämällä 0,5 M NaOH-liuosta. Soluihin sitoutunut radioaktiivisuus määritettiin gammalaskurilla. Näytteet analysoitiin kaksinkertaisina; rinnakkaisnäytteet vaihtelivat yleensä vähemmän kuin 20 %. Epäspesifisen vasta-aineen sitoutumisen mittaamiseksi identtisissä koloissa inkuboitiin merkitsemättömän L3-vasta-aineen 50-100-kertaista ylimäärää, joka tavallisesti 125 vähensi I-merkityn vasta-aineen sitoutumista yli 90 prosenttisesti. Kun sitoutumiseen liittyvät tiedot analysoitiin julkaisun Scatchard (1949) Ann. N.Y. Acad. Sei. 51:660-672 mukaisesti, 12 5 niin I-L3-vasta-aineen affiniteettivakioksi (K ) saatiin 8—1 ® suurin piirtein 1 x 10 M . Vasta-aineen sitoutuminen aleni yli 10-kertaisesti, mikäli solujen monokerroksia ei käsitelty 125 NP-40:llä ennen I-L3-vasta-aineen lisäämistä.

Kilpailevan sitoutumisen koe L3-antigeeninen aktiivisuus mitattiin määrittämällä antigeenin *:*·’ 125 kyky inhiboida I-merkityn L3-vasta-aineen sitoutumista Calu-.·: 1-solujen formaliinilla kiinnitettyihin monokerroksiin. Solujen monokerrokset valmistettiin edellä esitetysti. Soluihin lisättiin • - 125 - I-L3-vasta-ainetta pitoisuutena 0,4 ^ug/ml L3-antigeenista : aktiivisuutta sisältävän liuoksen läsnäollessa tai sen puuttues- sa. Lopullinen koetilavuus oli 0,1 ml. Näissä olosuhteissa • - 125 I-L3-vasta-aineen sitoutuminen oli yli 95-prosenttisesti • : spesifistä, mikä pääteltiin merkitsemättömän L3-vasta-aineen kykynä kilpailla sitoutumisesta. Koeliuosten erilaisia lai- - ; : . 125 mennoksia lisättiin ja I-merkityn vasta-aineen sitoutuminen '·“· mitattiin edellä kuvatusti. Liitteenä olevassa kuvassa 1 : : esitetään viljelyalustasta sekä normaalista ihmisen seerumista « · · 33 8581 4 saadun L3-antigeenin puhdistuksen eri vaiheisiin liittyviä inhibitiokäyriä. L3-antigeenisen aktiivisuuden yksi yksikkö määritellään siksi määräksi, joka tarvitaan inhiboimaan pitoi- 125 suutena 0,4/ug/ml lisätyn i-L3-vasta-aineen sitoutuminen 50-prosenttisesti.

Glykosidaasilla käsittelyt 35S-metioniinilla tai 125I-merkityn L3-antigeenin immunosakat valmistettiin kuvatulla tavalla. Kasautettu immunoabsorbentti suspendoitiin uudestaan 25 mikrolitran tilavuuteen pilkkomis-puskuria, tähän lisättiin 5 mikrolitraa liuosta, joka sisälsi 5 mi 11iyksikköä asianmukaista entsyymiä ja näytteitä inkuboi-tiin 37°C:n lämpötilassa 18 tuntia. Väkevää SDS-PAGE-näyte-puskuria lisättiin ja näytteet käsiteltiin elektroforeettisesti. Neuraminidaasilla käsittelyn tapauksessa pilkkomispuskuri sisälsi: NaCl 0,15 M; natriumasetaatti, pH 5,3, 0,05M; CaC^ 0,1% (w/v); ja fenyylimetyylisulfonyylifluoridi 0,1% (w/v). Endo-glykosidaasilla H (Endo H) käsittelyn tapauksessa pilkkomis-puskuri sisälsi: Tris HCl, pH 6,5, 0,025 M; SDS 0,2% (w/v); ja fenyylimetyylisulfonyylifluoridi 0,1% (w/v).

Proteiinimääritykset

Proteiinipitoisuudet määritettiin menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Bradford (1976) Anal. Biochem. 72:248-254 käyttäen standardina naudan seerumin albumiinia.

.·. : L3-Sepharose-hartsin valmistaminen • · Lyofilisoitu, CNBr-aktivoitu Sepharose 4B-hartsi palautettiin märäksi 1 mM HCl-liuoksessa 4°C:n lämpötilassa 30-60 minuutin ajan. Hartsi pestiin kerran samalla liuoksella, kerättiin ·· sentrifugoimalla, siihen sekoitettiin L3-vasta-ainetta pitoi suutena 3,5 mg/ml liuoksessa, joka käsitti IM NaCl ja 0,2 M natriumbikarbonaattia, pH 8,3. Seosta inkuboitiin 4°C:n lämpö-t tilassa pyörittäen 16 tuntia. Hartsi otettiin talteen sentri- fugoimalla ja liialliset aktiiviset ryhmät salvattiin lisäämällä 1-4 tilavuutta 0,25 M glysiiniliuosta, pH 8,3. Tämän jälkeen hartsi otettiin talteen sentrifugoimalla ja se pestiin useaan kertaan PBS-liuoksella ennen käyttöä. Kytkeytymistehok- 34 8581 4 kuus määritettiin mittaamalla vasta-aineliuoksen absorbanssi aallonpituudella 280 nm ennen kytkemistä ja sen jälkeen, ja sen todettiin olevan suurin piirtein 10 mg L3-vasta-ainetta pakatun hartsin millilitraa kohden.

Geelin värjääminen SDS-PAGE-käsittelyn jälkeen proteiinivyöhykkeiden asemat määritettiin Coomassie-sinisellä värjäämällä, tai käyttämällä kaupallisia, hopeaan (BioRad) tai nikkeliin (Kodak) perustuvia värjäyskittejä.

Järjestyksen määrittäminen aminopäätteessä Edman-hajotuksella Viljelyalustasta saatua L3-antigeenia pelkistettiin ditiotrei-tolilla (20 mM) 0,1 millilitran tilavuudessa liuosta, joka käsitti 0,1 M Tris-HCl-puskuria, pH 8,3 ja 0,1% SDS (w/v) 2 tuntia 50°C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen antigeeni S-karboksami-dometyloitiin käsittelemällä sitä jodiasetamidilla (45 mM) 30 minuuttia 20°C:n lämpötilassa, ja käsiteltiin preparatiivisella SDS-PAGE-elektroforeesilla 10% akryyliamidigeelia (paksuus 1,5 mm) käyttäen. Elektroforeesin jälkeen geeli värjättiin Coomassie-kirkkaan sinisellä (0,5 paino-% 10-prosenttisessa etikkahapossa ja 30-prosenttisessa isopropanolissa) ja väri poistettiin etikkahappoa (5% v/v) ja metanolia (17% v/v) sisältävällä liuoksella. Värjäytynyt L3-antigeenin vyöhyke leikattiin irti partakoneen terällä ja se alistettiin välittömästi sähköiseen eluutioon ja sähköiseen dialyysiin käyttäen sähköi-. . sesti eluoivaa ja väkevöivää ECU-040-laitetta (C.B.S. Scientific ; Co., San Diego, Ca). Seerumista saatu L3-antigeeni käsiteltiin samalla tavalla, paitsi ettei näytettä karboksamidometyloitu. Toimenpiteen kokonaissaanto oli noin 80%, perustuen proteiini-määrän arvioimiseen analyyttisellä SDS-PAGE-käsittelyllä käyt-: : : täen hopealla värjäämistä. Automaattinen Edman-hajoitus toteu tettiin kaasufaasiin perustuvalla, järjestyksen määrittävällä laitteella (Malli 470A, Applied Biosystemsj Inc., Foster City, Ca) käyttäen suurin piirtein 100 pikomoolia kunnostetusta alustasta saatua S-karboksamidometyloitua L3-antigeenia (perustuen tunnistetun Met-6:n saantoon) sekä 38 pikomoolia seerumista saa-:·..1 tua muuntamatonta L3-antigeenia (perustuen tunnistetun Val-l:n li » 35 8581 4 saantoon). Fenyylitiohydantoiini-aninohapot analysoitiin HPLC-kromatografisesti käänteisfaasia käyttäen (ilmaistu yksikkö 2 pikomoolia), IBM Instruments-yhtiön Cyano-kolonnilla, käyttäen eluoimiseen gradienttia, joka muodostettiin natriumasetaatti-puskurista, tetrahydrofuraanista ja asetonitriilistä (katso: Applied Biosystems, Protein Sequence Users Bulletin N:o 2, 1984).

Esimerkki 1

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistaminen

Monoklonaalisia vasta-aineita valmistettiin immunoimalla 3 kuukauden ikäisiä BALB/c-hiiriä ihmiskudoksilla, jotka oli saatu jostakin neljästä erilaisesta lähteestä: (1) keuhkopussiin pur kautuneesta nesteestä, potilaista, joilla on etäispesäkkeitä muodostava ei-piensolukeuhkosyöpä, (2) ei-piensolukeuhkosyövästä saatujen solujen viljelmästä, ja (3) 3-4 kuukauden ikäisen ihmis- sikiön keuhkokudoksesta. Immunoinnit toteutettiin injektoimalla 7 hiiriin vatsaontelon sisäisesti 3-4 kertaa suurin piirtein 10 solua. Sen jälkeen, kun viimeisestä immunoinnista oli kulunut kolme vuorokautta, eläinten pernat poistettiin, suspendoitiin viljelyalustaan ja sulautettiin yhteen NSl-hiiren myeloomasolu-jen kanssa (Köhler ja Milstein, edellä). Seoksia käytettiin siirrostamiseen siten, että saatiin yhdestä ainoasta yhteensu-lautetusta solusta (kloonista) peräisin olevia viljelmiä, joissa tiheys oli alhainen; hybridisointiin käytetty tekniikka on kuvattu aikaisemmin julkaisussa Yeh et ai., Int. J. Cancer (1979) 29:269-275.

Hybridisoluista saadut supernatantit seulottiin käyttäen sekä 125 ·.· ELISA-koetta että autoradigrafiaan perustuvaa, epäsuoraa I-merkityn proteiinin A koetta (Brown et ai., J. Immunol. Meth.

: : : (1979) £1:201-209) uutteita vastaan, jotka uutteet oli saatu immunointiin käytetyistä tuumoreista, jotka sisälsivät, i.a., solumembraaneja. Nämä uutteet valmistettiin käyttäen toimen-; pidettä, joka oli muunnos menetelmästä Colcher et ai., Cancer

Res. (1981) £2:1451-1459; Yeh et ai., edellä. Tätä tarkoitusta varten kudokset pestiin PBS-liuoksella ja suspendoitiin, mikä ·’" kokonaisen tuumorin tapauksessa toteutettiin puristamalla ruos-tumatonta terästä olevan seulan läpi. Tämän jälkeen kudoksiin 36 85 81 4 lisättiin 1 mM NaHCO^-liuosta, joka sisälsi 1 mM fenyylimetyyli-sulfonyylifluoridia (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA), jonka jälkeen materiaali homogenoitiin jäissä Dounce-homogeni-saattorin B-surbimen 50 iskulla. Materiaalia sentrifugoitiin 15 minuuttia nopeudella 27 000 x g, jonka jälkeen supernatantti poistettiin, ja kasauma suspendoitiin uudestaan PBS-liuokseen, sitä sonikoidaan L minuutti, ja säilytetään -70°C:n lämpötilassa.

Solukalvouutteisiin sitoutuvia vasta-aineita tuottavat hybrido-mat kloonattiin, paisutettiin in vitro ja niistä määritettiin edelleen vasta-aineen spesifisyys. Tämä määrittäminen toteutettiin käyttäen edellä kuvattua immunohistologista tekniikkaa, jossa testattiin vasta-aineiden kyky sitoutua keuhkosyövistä, muista tuumoreista ja normaalista ihmiskudoksesta saatuihin pakastettuihin leikkeisiin. Ne hybridomat, joiden tuottamalla vasta-aineella oli ilmeistä spesifisyyttä ihmisen keuhkosyövälle, kloonattiin uudestaan, paisutettiin ja injektoitiin pristaanilla etukäteen käsiteltyihin 3 kuukauden ikäisiin BALB/c-hiiriin, jossa ne kasvoivat vesivatsan tuumoreina.

Vesivatsaan erittyneet vasta-aineet puhdistettiin proteiinia A sisältävällä Sepharose-hartsilla (Ey et ai., Immunochemistry (1978) 15^:429) tai geelisuodatuksella Sephacryl S-300-geeliä käyttäen. Puhdistettuja vasta-aineita käytettiin muiden ominaisuuksien selvittämiseen, mukaan lukien muut immunohistologi- ____; set spesifisyyskokeet, kokeet, joilla selvitettiin sitoutuminen . . kokonaisiin soluihin sen määrittämiseksi, mitkä vasta-aineet ;/ sitoutuivat solun pintaan, sekä edellä kuvatut, radioaktiivi- • ·_ suuteen perustuvat immunosaostuskokeet.

Monoklonaaliset vasta-aineet L3, L5 ja L18 saatiin vastaavista hybridomeista, kuten edellä kuvataan. Näillä vasta-aineilla on edellä tässä julkaisussa esitetyt ominaisuudet.

Solulinjat, joista käytetään nimityksiä L3, L5 ja L18, talle-tettiin kantakokoelmaan American Type Culture Collection (ATTC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852, lokakuun 4. päi-vänä 1984, ja näille solulirijoille annettiin taltiointinumeroik-si HB8626, HB8627 ja HB8628, vastaavasti. Solulinja L3 tallen-.·. : nettiin uudestaan lokakuun 25. päivänä 1984.

37 8581 4

Esimerkki 2 L3-antigeenin puhdistaminen seerumia sisältämättömästä viljely-alustasta_ 1. Seerumia sisältämättömän kunnostetun alustan valmistaminen Calu-l-solut kasvatettiin yhteen pyöritettävissä pulloissa (850 cm ) kasvatusalustan läsnäollessa. Monokerrokset pestiin kolmasti 50 millilitralla seerumia sisältämätöntä kasvatusalustaa siten, että toinen pesuliuos jätettiin solujen päälle 30 minuutiksi 37°C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin siten, että läsnä oli 150 ml seerumia sisältämätöntä kasvatus-alustaa. Alusta otettiin talteen 3 vuorokauden kuluttua, se sentrifugoitiin kelluvien solujen poistamiseksi ja säilytettiin pakastettuna -70°C:n lämpötilassa käyttöön saakka.

2. Tiivisteen valmistaminen

Seerumia sisältämätöntä alustaa (790 ml) tiivistettiin 17 milli-litran tilavuuteen ultrasuodattamalla (Amicon, PMlO-kalvo). Tiiviste poistettiin ja kalvo pestiin kerran PBS-liuoksella (11 ml). Pesuliuos ja tiiviste yhdistettiin ja seos sentri-fugoitiin nopeudella 147 000 x g 30 minuuttia Ti70-roottorissa (Beckman). Supernatantin todettiin sisältävän suurimman osan L3-antigeenisesta aktiivisuudesta, ja sitä kutsutaan seuraavassa tiivisteeksi.

3. Immunoaffiniteettikromatografia ____; Tiivisteen annettiin kulkea Sepharose C14B-kolonnin (1,5 ml) . . läpi niiden aineiden poistamiseksi, joilla aineilla on ; Sepharose-hartsiin kohdistuvaa affiniteettia. Sitten kolonni pestiin 3 millilitralla PBS-liuosta. Läpivirtaama yhdistettiin pesuliuokseen ja lisättiin 1 millilitran pakattuun tila-vuuteen L3-vasta-aineeseen konjugoitua Sepharose-hartsia 4B (10 mg L3/ml hartsia). Seosta pidettiin 4°C:n lämpötilassa pyörittäen 18 tunnin ajan, jonka jälkeen se kaadettiin kolon-niin, joka oli tehty kertakäyttöiseen, ihonalaisiin injektioi-hin soveltuvaan ruiskuun. Läpivirtaama otettiin talteen ja * _ hartsi pestiin PBS-liuoksella (10 ml), sekä 5 M NaCl-liuok-sella (5 ml) ja 0,02 M ammoniumasetaattiliuoksella (10 ml).

38 8581 4 L3-antigeeni eluoitiin kolonnista lisäämällä siihen juuri valmistettua trietyyliamiiniliuosta (75 mM). Koska L3-antigeeninen aktiivisuus on labiili korkeissa pH-arvoissa, niin eluoituneen nesteen pH säädettiin keräämällä fraktiot (0,5 ml) putkiin, jotka sisältävät 0,1 ml 2 M ammoniumasetaattia. L3-aktiivisuut-ta sisältävät fraktiot tunnistettiin käyttäen kilpailevan sitoutumisen koetta, nämä fraktiot yhdistettiin, ja niitä säilytettiin pakastettuina -20°C:n lämpötilassa. Tulokset esitetään taulukossa 1.

Esimerkki 3 L3-antigeenin puhdistaminen seerumista 1. Seerumin kerääminen

Tuumoripotilailta tai normaaleilta henkilöiltä otettiin verta ja sen annettiin hyytyä 10-90 minuuttia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen näytteitä pidettiin 4-6°C:n lämpötilassa 30 minuutista 5 tuntiin ennen sentrifugointia nopeudella 1600 rpm 10 minuuttia Sorvall-merkkisellä kliinisellä sentrifugilla. Seerumi erottui hyytyneestä verestä, se jaettiin osiin ja sitä säilytettiin pakastettuna -70°C:n lämpötilassa ennen käyttöä. L3-anti-geenisen aktiivisuuden tasot eivät poikenneet merkittävästi samasta henkilöstä saadussa seerumissa tai plasmassa. Sulatettuja näytteitä ei tavallisesti pakastettu toistamiseen, sillä antigeeninen aktiivisuus todettiin herkäksi toistuvalle pakastamiselle ja sulattamiselle. L3-antigeenisen aktiivisuuden puhdistamiseksi 10 millilitran suuruinen erä juuri pakastettua ‘ seerumia sulatettiin ja kirkastettiin sentrifugoimalla se : ‘ : ennen käyttöä nopeudella 147 000 x g 60 minuuttia (Ti 70.1- roottori) .

2. DEAE-Sephacel-kromatograf ia lO millilitran DEAE-Sephacel-kolonni valmistettiin ja tasapaino-. . tettiin PE-puskurilla (0,02 M natriumfosfaattia, pH 7,12 ja 0,005 M EDTA). Kirkastettu seerumi laimennettiin 130 millilit-'·' ' ran tilavuuteen PE-puskurilla ennen sen siirtämistä ioninvaih-*:·: tokolonniin. Virtausnopeus pidettiin arvossa 0,5 ml/min sinä aikana, kun näyte laitettiin kolonniin, sekä eluoimisen aikana.

39 8581 4

Kolonnin läpivirtaama sisälsi 54 % seerumin alunperin sisältäneistä proteiineista (aallonpituudella 280 nm mitatun absor-banssin perusteella) eikä lainkaan ilmaistavissa olevaa L3-antigeenista aktiivisuutta. Tämän jälkeen kolonni pestiin 10 kolonnin tilavuudella PE-puskuria. L3-antigeeninen aktiivisuus saatiin eluoitumaan käyttäen 50 ml PE-puskuriin valmistettua NaCl-gradienttia 0-0,5 M. Eluution aikana kerättiin 1 millilitran suuruisia fraktioita. Gradienttiajon jälkeen kolonni pestiin 0,5 M NaCl-liuoksella PE-puskurissa, ja lopuksi 1,5 M NaCl-1iuoksella tässä samassa puskurissa. L3-antigeenista aktiivisuutta sisältävät fraktiot tunnistettiin käyttäen kilpailevan inhibition koetta, ja ne yhdistettiin. L3-antigeenista aktiivisuutta saatiin jonkin verran kaikkien eluoituneiden see-rumiproteiinien jälkeen.

Eräissä kokeissa L3-antigeeninen aktiivisuus puhdistettiin osittain ennen radioaktiivista merkitsemistä ja ennen immunosaostumi-seen perustuvaa analyysiä käyttäen hieman erilaista toimenpidettä. Seerumin proteiinit saostettiin ensin 30 % ammoniumsulfaatilla. Sakka liuotettiin veteen ja siitä poistettiin suolat (Sephadex G-25-geelillä) ennen sen laittamista DEAE-Sephacel-kolonniin. L3-aktiivisuus saatiin eluoitumaan lisäämällä NaCl-liuoksia annoksittain. NaClrn pitoisuusalueella 0,25-0,5 M eluoitunut fraktio sisälsi runsaasti L3-antigeenista aktiivisuutta, ja sitä käytettiin tämän jälkeen L3:n merkitsemiseen radioaktiivisesti. Tällä tavalla valmistettua antigeeniä ei * voida erottaa proteaaseilla toteutetulla sormenjälkimenetelmällä sellaisesta radioaktiivisesti merkitystä antigeenistä, joka ’ · on saostettu yli 3000 kertaisesti puhdistetuista valmisteista.

3. Immunoaf f initeettikromatograf ia DEAE-Sephacel-kolonnista (14 ml) saadut yhdistetyt fraktiot . , laitettiin 8,4 millilitran tilavuiseen Sephacel CL 4B-kolonniin '· ’ ja kolonni pestiin 17 millilitralla PBS-liuosta. Tämän jälkeen pesuliuos yhdistettiin läpivirtaamaan ja seosta tasapainotet-tiin 18 tuntia L3-vasta-aineeseen konjugoidun Sepharose-hartsin . *. (10 mg L3/ml hartsia) 1,5 millilitran pakatun tilavuuden kanssa 4o 8581 4 pyörittäen 4°C:n lämpötilassa. Seos kaadettiin kolonniin, ja hartsia pestiin peräkkäin PBS-liuoksella (42 ml), PBS-liuoksella, joka sisälsi 0,2 % (v/v) NP-40 (28 ml) PBS (14 ml), 0,02 M ammoniumasetaattia (28 ml), 5 M NaCl (28 ml) ja lopuksi 0,02 M ammoniumasetaattia (5 ml). L3-antigeeni eluoitiin lisäämällä 8,4 ml 0,075 M trietyyliamiinia, kuten edellä esitetään. Tulokset esitetään taulukoissa II ja III.

Esimerkki 4 L3-vasta-aineen ja vasta-aineen 465.12S kilpaileva sitoutuminen

Joko merkitsemätöntä vasta-ainetta 465.12S tai merkitsemätöntä 125 L3-vasta-ainetta sekoitettiin I-L3-vasta-aineeseen (lopullinen pitoisuus 0,35 ^,ug/ml) ja lisättiin formaliinilla kiinnitettyihin Hl25-keuhkosyöpäsoluihin (500 OOO/kolo). Merkitsemättömiä vasta-aineita käytettiin hybridomien supernatantteina; kukin laimennettiin puoleen lopullisen kokeen alkuperäisestä tilavuudesta. Käytetty vasta-aineen 465.12S liuos sisälsi ....... . 35 riittävästi vasta-ainetta saostaakseen S-metionimilla merkityistä solu-uutteista sellaisen antigeenimäärän, joka oli yhtä suuri kuin se määrä, jonka puhdistetun L3-vasta-aineen yksi mikro-gramma saosti. Taulukossa IV esitetyt tulokset osoittavat, ettei 465.12S kilpaillut sitoutumisessa L3-vasta-aineen kanssa. Näin ollen nämä kaksi vasta-ainetta tunnistavat eri epitoopit ja ne ovat täten erilaisia vasta-aineita eivätkä toiminnallisia vastineita.

‘j Esimerkki 5 : : : L5-antigeenin pilkotut kappaleet

Ihmisen keuhkosyöpäsolujen Calu-1 pinta merkittiin käyttäen , laktoperoksidaasilla katalysoitua jodaamista Brown’in et ai.

mukaisesti (J. Immunol. 127: 539-546, 1981). L5-antigeeni (eli vasta-aineen L5 määrittämä antigeeni) saostettiin solu-uutteis-. ta ja analysoitiin SDS-PAGE-ajolla pelkistävissä olosuhteissa.

Vastaavasti analysoituna L5-antigeeni liikkui yhtenä poly-’ peptidiket juna, jonka Mr on 135 000. L5-antigeenin sisältävä ·;··· alue geelissä leikattiin irti, käsiteltiin esitetyllä määrällä 4i 85 81 4

Staphylococcus aureus-bakteerin V8-proteaasia ja analysoitiin uudestaan SDS-PAGE-menetelmällä Cleveland'in et ai., edellä, mukaisesti. Tuloksena olevat "sormenjäljet" solupinnan jodilla merkityistä V8-entsyymillä pilkotuista kappaleista ovat diagnostisia [,5-an t i geeni 1 le , toisin sanoen kappaleet, joiden Mr on 24 OOO ja 16 000, ovat tunnusomaisia L5-antigeenille ja ne erottavat L5-antigeenin muista sellaisista antigeeneistä, joilla on sama molekyylipaino.

42 8581 4 • Ή τ}< m tn . CM 0) i co

I I CO -H

01 0) ·** 44 •H -H CM 4-1

(O E E ·· C

p p 3 σ cm| ai 01 4-1 00 4-> ~ Γ-1 t/3

fO c/i :<0 o f-H co :ro >—I lo O

4-> -H -n > - (TJ ·Η -Γ-Ί O · l-i 01 Ό -H r-l CM OI P Ό Ή (N EQ: 3 x: id oo oi x; id ^ qii

Ή 3 0) -H 3 0) CO Xl O

ra CU 4-1 EOj4-> u LO

>i P o Ή 3 -H 3 φ φ m φ o oi ai oi c

I—I 3 0) 3 · -H

HP 3 I—I E

> i oi c i oi ra 3 01 -r-K- ai 01 -H —' ro C 4-> 3 -H > t? cm o O 01-H>D1' < 3 oi ra -h e cm σι o -h ra -h e ro en o o •O C r-T'-v LTIO LO E 3 ·Η ^ P t~~ O —' 4-*

3 -H PD r—I CD £ -H+I υ tn CD -H

H E ΛΝ- M· -H E id —· I 01 0 O ra ora tn σ 01 ra ^ i—i e i p — ai .-H oi ai i -h Ό e

3 '—I 3 *H

h ra ora ra ra 04 i u o E o ό ra ra 4-io o m 3 p—' o σι σι ra 4-> co e 3¾¾ o ro O 3¾¾ o Γ' ro u oi oi ai ra^ ή 3 ra^ i—i tn ra ai 3 ra ra > ai •h to e en ra i id E ai oi m o ra 3 03 _1 id P -H 3 01 E 01 3 3 H CM M ra CM -H >. ai H Ό 01 1—lp 01 ra 44 0)

Xd 3 0] 3 id ή ή

033 O ·Η 3 p id E

id O- oi id ό οι — o o o 333 .V -h^oo o id x: p d o 't n n ai p 3 3 > D o o Γ" 33 > —- ooo un E3

H 0) -rl^ to tn <3· 1-lQj-H CIO

3 Ό -rt ' 3 -H P CTi M- :raH44 ra 3 4j co cm ud ra 3 p i—i :ra tn -h E"· 3 id r-f r-l E~l 01 id 44 CM 01

01 < Ό < ai |H

•H 3 44 3 > 3 -H 3 ra •h oi oi ra > •h -h ai ra ai

44 1—I t> j—I Ei—I

yi ra ή ra ra ή *h ra -h ·η ·η id o ra 3 443 p o Xl a 3 -h ro id ·Η ^ ' ·ι ι ·η ι-Η - - αι-Η'—ιησ r-ι ra ·η σ> 000 ο χ: -η 01 OJ CT ~ aiE 0D Η ' 3 id

· *Η 44 E LO r-Η o 3 Ρ ^ to H :ra-H

3 o >—· ro ih ai o r-ι ra 01 3 01 3 r-4 3 01 ai Qj -h Dj :ra ra οι (3 3 e ra 3 •H 0) 1—I 44 44 44 ai ai -h ra e O1 44 > > - ra oi .ho) ai 3 3 13 00 CM 44 3— 3 ra id ro 3 — - - 3 3 Ή 0144 -j > p o r- ^ ra > e E:ra ra e h cm 1 ra o ^ o raoi •H'-' σ CO 1—1 1—I *H r-l >1 id 0]

•H 33 -H POP

d E-ι E-i 0) 44 -m ai . : 44 ai id

Il 01 I I 44 » 3 - · ai -ho ai -h -h o -h :ra ai

P 01 3 id 44 Ό 3 id 3 3 E

>j 44 -h >, -h x: -h :ra :ra -h :ra ra 03 p -h -.ra e >1 p p ;ra :ra 03 Z P P P P P Z 3 I P P P ssai 01 > ra p 3 3 ω ra p 3 3 -h 1 ai 3 ai < 1 ai 3 ρ ρ m ai o ai w m ai o ^

< E-< -J Ρ P C/l Q J Ρ P 1—I CM

43 8581 4

Taulukko III

Normaalista ihmisseerumista saadun L3-antigeenin tunnusomai-set piirteet_______

Pitoisuus: 5,8 + 2,6 ^ug/ml''·

Molekyylipaino: 94 000 Muoto I

76 000 Muoto II

26 000 Muoto III

Liikkuvuus: alfa-2 pi: 4,2-5,0 (Muodot I ja II) N-päätteen aminohappo Vai (Muoto I).

^Määritetty keskiarvona ( + standardipoikkeama) seitsemästä normaalista terveestä henkilöstä. Seerumit testattiin 5,7 tilavuuskin lopullisessa pitoisuudessa kilpailevan sitoutumisen kokeella, käyttäen standardina viljelyalustasta saatua immunoaffiniteetin avulla puhdistettua L3-antigeenia. Arvot korjattiin standardi-valmisteen puhtauden suhteen, jonka puhtauden arvioitiin olevan 66 % (skannaamalla densitometrisesti hopealla värjätty SDS-PAGE-geeli).

Taulukko IV

125

Merkitsemätön vasta-aine Sitoutunut I-L3-vasta-ame _ _(cpm)_

Puuttuu 9524 (100) 465.12S 10028 (105) L3 1194 (12)

Keksintö on täten kuvattu yksityiskohtaisesti erityisesti edellä esitettyjen suoritusmuotojen avulla. Tulee kuitenkin ymmärtää, että keksintöön voidaan tehdä muutoksia ja muunnoksia sen hengestä ja tavoitteista poikkeamatta.

Claims (4)

44 8581 4

1. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää (a) hiiren hybridomasoluIinjän viljelemisen, joka on talletettu numerolla HB8626 ATCCshen ja joka tuottaa IgG-isotyyp-piä olevaa monoklonaalista vasta-ainetta, jonka antigeenin sitoutumiskohta sitoo: (i) proteiiniantigeenin, jonka molekyylipaino on noin 80 000 daltonia ja joka on ihmisen ei-piensolukeuhkosyövän solupinnan determinantti; ja (ii) proteiiniantigeenin, jonka molekyylipaino on noin 100 000 daltonia ja jota erittyy ihmisen ei-piensolukeuhko-syövässä; tai viljellään hiiren hybridomasolulinjaa, joka on talletettu numerolla HB8627 ATCCshen ja joka tuottaa IgG-tyyppiä olevaa monoklonaalista vasta-ainetta, jonka antigeenin sitoutumiskohta sitoutuu proteiiniin, jonka molekyylipaino on noin 140 000 daltonia ja joka on ihmisen ei-piensolukeuhkosyövän solupintadeterminantti, tai viljellään hiiren hybridomasolulinjaa, joka on talletettu numerolla HB8628 ATCCshen ja joka tuottaa IgG-tyyppiä olevaa monoklonaalista vasta-ainetta, jonka antigeenin sitoutumiskohta sitoutuu proteiiniin, jonka molekyylipaino on noin 72 000 daltonia ja joka on ihmisen ei-piensolukeuhkosyövän solupintadeterminantti, ja (b) eristetään monoklonaalinen vasta-aine viljelmästä.

2. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä saadun monoklonaalisen vasta-aineen Pab-, F(ab')2- tai Fv-fragmentin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä saatua monoklonaalista vasta-ainetta käsitellään pepsiinillä tai papaiinilla.

3. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin, tunnettu sii- -V-- tä, että patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vas- .··. ta-aine sidotaan kemiallisesti merkkiaineeseen, joka kykenee tuottamaan havaittavan signaalin. 45 85 81 4

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että merkkiaine on fluoresoiva aine.