FR2596062A1 - Anticorps monoclonaux et antigene du carcinome pulmonaire humain a cellules non petites et de certains autres carcinomes humains - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE DE NOUVEAUX ANTICORPS MONOCLONAUX SE LIANT SPECIFIQUEMENT A UN ANTIGENE PROTEIQUE ASSOCIE AUX CARCINOMES PULMONAIRES A CELLULES NON PETITES ("CPCNP") HUMAINS ET A CERTAINS AUTRES CARCINOMES HUMAINS. L'ANTIGENE PROTEIQUE NOUVEAU EST UNE GLYCO-PROTEINE DONT LA SEQUENCE AMINO TERMINALE D'AMINO-ACIDES EST: (CF DESSIN DANS BOPI) DANS LAQUELLE X REPRESENTE UN AMINO-ACIDE NON IDENTIFIE. DOMAINE D'APPLICATION: DIAGNOSTIC, TEL QUE LA DETECTION DE CELLULES MALIGNES ASSOCIEES AUX CPCNP.

Description

La présente invention a pour objet un nouvel anticorps monoclonal, et des

procédés pour la production et l'utilisation de ce nouvel anticorps monoclonal spécifique des antigènes de carcinomes. Plus précisément, 5 l'anticorps monoclonal de la présente invention est immunospécifique pour et/ou immunoréactif avec un antigène protéique associé au carcinome pulmonaire humain à cellules non petites (CPCNP) et à certains autres carcinomes humains comprenant certains carcinomes du 10 sein, du colon, etc. l'anticorps monoclonal de la présente invention est réactif avec un déterminant d'un antigène glycoprotéique associé aux cellules du CPCNP et également avec d'autres carcinomes comprenant des carcinomes du 15 sein, du colon et le carcinome pulmonaire à petites cellules. L'anticorps monoclonal de la présente invention possède des caractéristiques et aptitudes distinctives qui rendent cet anticorps convenable à des fins de diagnostic clinique in vivo et in vitro. En outre, 20 l'anticorps de la présente invention convient pour des utilisations thérapeutiques. Par exemple, le nouvel anticorps peut être utilisé comme support à sélectivité pour une cible de divers agents qui possèdent des effets anti- tumoraux comprenant, mais à titre non limitatif: 25 des médicaments de chimiothérapie, des toxines, des agents modificateurs de réponse immunologique et des radio-isotopes. De plus, les hybridomes qui produisent cet anticorps peuvent être modifiés en utilisant la technologie de l'ADN recombinant afin que les anticorps 30 résultants puissent effectuer une médiation de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps ou puissent être cytolytiques vis-à-vis des cellules tumorales en

présence des constituants du complément.

1.1. CARCINOME PULMONAIRE HUMAIN ILes carcinomes pulmonaires sont responsables

de la majorité des décès dus au cancer chez l'homme et surpassent les carcinomes du sein comme cause la 5 plus fréquente de décès dus au cancer chez la femme.

Cette maladie peut être divisée en quatre types histologiques principaux: (1) épidermoide ou squameux (30 %), (2) adénocarcinome (35 %), (3) indifférencié à grandes cellules (15 %) et (4) à petites cellules (20%). 10 L'expression "carcinome pulmonaire à cellules non petites" ("CPCNP") comprend les types cellulaires suivants: les cellules de carcinome épidermoide, les cellules d'adénocarcinome et les cellules de carcinome indifférencié

à grandes cellules.

La plupart des cas de carcinomes pulmonaires ne peuvent être guéris par chimiothérapie et radiothérapie. Les carcinomes pulmonaires à petites cellules peuvent répondre à la chimiothérapie et à la radiothérapie par une diminution de volume, mais cela ne permet pas 20 une guérison totale. L'ablation chirurgicale totale

de la tumeur se révèle la seule thérapeutique efficace.

Cependant, malheureusement, moins de 30 % des patients atteints de cancer du poumon présentent des tumeurs qui peuvent être totalement réséquées après diagnostic. 25 Parmi ceux-ci, moins d'un tiers survit 5 ans après l'ablation chirurgicale apparemment totale de la tumeur. Par conséquent, il existe un grand besoin de procédés rendant possibles un diagnostic précoce du cancer du poumon, une meilleure définition du degré de propagation du 30 cancer et une thérapeutique plus efficace.

1.2. ANTICORPS MONOCLONAUX

Les anticorps monoclonaux représentant des molécules d'anticorps homogènes qui se lient à un seul site moléculaire (à savoir un épitope) sur un antigène 35 avec une constante de liaison ou d'affinité spécifique

sont préparés par trois procédés connus dans la pratique.

Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés par des techniques de production d'hybridomes 5 conçus par Kohler et Milstein (1975, Nature 256: 495; 1976, Eur. J. Immunol. 6:511). En fusionnant des cellules productrices d'anticorps (lymphocytes spl.éniques) et des cellules de myélomes, Kolher et Milstein ont créé des cellules hybrides donnant naissance à des lignées 10 cellulaires immortelles possédant l'aptitude à produire

un anticorps et l'aptitude à croître de manière permanente en culture cellulaire. Les hybridomes sécrètent un seul type d'immunoglobuline de spécificité antigénique prédéfinie dépendant de l'antigène auquel les lymphocytes 15 ont été préalablement exposés.

En variante, les anticorps monoclonaux peuvent être produits par transformation in vitro de lymphocytes B de sang périphérique de mammifère, par exemple avec le virus d'Epstein-Barr (VEB). Le virus rend les 20 lymphocytes producteurs d'anticorps immortels. Des techniques permettant cette transformation sont connues dans la pratique (voir, par. exemple, Steinmetz et collaborateurs, 1977, Nature 269: 420; Crawford et collaborateurs, 1983, The Lancet, i: 386).

Enfin, les anticorps monoclonaux peuvent être produits en utilisant des techniques qui associent l'immortalisation par le VEB et la fusion cellulaire ou la technologie de production d'hybridomes. Cole et collaborateurs (1985, in Monoclonal Antibodies and 30 Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., pages 77-96) décrivent des techniques pour la fusion d'un plasmocytome humain ou d'un membre de fusion de lignées cellulaires de lymphoblastoide humain avec des lymphocytes donneurs transformés avec le VEB qui ont été préalablement établis 35 comme une lignée cellulaire. Dans un tel système, les

deux lignées cellulaires parentales sont immortelles.

Par conséquent, le membre de fusion doit posséder des marqueurs médicamenteux appropriés pour s'opposer aux lignées parentales lorsque l'hybridome obtenu par fusiQn 5 est cultivé. Les hybridomes-VEB résultants produisent

des anticorps ayant la spécificité de la lignée cellulaire de lymphocyteVEB utilisée.

Les anticorps monoclonaux peuvent être produits en grandes quantités par culture cellulaire in 10 vitro d'hybridomes particul.iers ou de lignées cellulaires transformées. En outre, l'inoculation d'une lignée cellulaire d'hybridome dans la cavité péritonéale de mammifères présentant une compatibilité, tels que des souris, a pour résultat une tumeur qui sécrète des concentrations 15 élevées (1 à 20 mg/ml) d'anticorps monoclonal dans le liquide d'ascite de la tumeur. En prélevant le liquide d'ascite et en purifiant l'anticorps monoclonal, une

seule souris peut donner une quantité suffisante d'anticorps pour l'utilisation dans des milliers d'analyses 20 de diagnostic.

1.3. ANTICORPS MONOCLONAUX ET ANTIGENES ASSOCIES AU CANCER DU POUMON

Les anticorps monoclonaux contre les antigènes du cancer pulmonaire humain ont été décrits par 25 Sikora et collaborateurs, 1981, Brit. J. Cancer 43: 696; Cuttita et collaborateurs, 1981, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:4591; Moody et collaborateurs, 1981, Science 214:1246 Minna et collaborateurs, 1981, In Vitro 17: 1058; Kennel et collaborateurs, 1981, Cancer Res. 41: 30 3465; Chem. Abst. 95(15):1308502; Baylin et collaborateurs, 1982, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:4650; Carney et collaborateurs, 1982, Pathobiology Annual 12:115: Gazdar et collaborateurs, 1983, Seminars in Oncology 10:3; Hollinshead et collaborateurs, 1983, Cancer Detect. 35 Prevent 6:185; Mulshine et collaborateurs, 1983, J.

Immuno]. 131:497: Huang. et collaborateurs, 1983, Arch.

Biochem. Biophys. 220:318; Saji et collaborateurs, 1984, Hybridoma 3:119; Bio. Abst. 79005569; Bosslet et collaborateurs, Behring. Inst. Mitt. 74:27; Chem. 5 Abst. AC101(9):706686; Roset et collaborateurs, 1984, Cancer Res. 44:2052; Bio. Ast. 79023605; Princler et collaborateurs, 1982, Cancer Res. 42:843; Mazauric et collaborateurs, 1982, Cancer Res. 42:150; Braatz et collaborateurs, 1982, Cancer Res. 42:849; Sobel 10 et collaborateurs, 1982, Fed. Proc. 41:409; Cole et collaborateurs, 1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., pages 77-96; et Varki et collaborateurs, 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer

Therapy, Alan Liss, Inc., page 207.

Les demandes de brevets des Etats-Unis d'Amérique N 667 521 déposée le 2 Novembre 1984 et N 785/177 déposée le 7 Octobre.1985, et les demandes N 684 759 déposée le 21 Décembre 1984 et N 776 321 déposée le 18 Octobre 1985, et la demande N 738 612 déposée le 20 28 Mai 1985 font connaître certains anticorps monoclonaux contre le carcinome pulmonaire humain à cellules non petites. Les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés pour des procédés qui rendent possiblesun diagnos25 tic précoce du cancer du poumon, une meilleure définition

de l'étendue du cancer, et des procédés plus efficaces de thérapie du cancer du poumon. Cependant, une condition préalable est la découverte d'anticorps contre des antigènes qui sont plus fortement exprimés dans 30 le cancer du poumon que dans les tissus adultes normaux.

Eu égard à l'hétérogénéité connue des populations de cellules tumorales, la présence de plusieurs déterminants sur la même molécule d'antigène, les différences prévues entre des antigènes en ce qui concerne leur stabilité 35 comme marqueurs de diagnostic et cibles thérapeutiques, et les caractéristiques biologiques différentes des différents anticorps contre le même antigène, un certain nombre d'anticorps différents contre un certain nombre

d'antigènes différents peut être nécessaire.

La présente invention a pour objet une nou5 velle classe d'anticorps monoclonaux, illustrée par le L20, qui est spécifique pour un site de déterminant sur un antigène glycoprotéique associé aux- cellules du carcinome pulmonaire humain à cellules non petites (CPCNP). L'expression "cellules de CPCNP" comprend les 10 cellules de carcinome épidermoide, les cellules d'adénocarcinome et les cellules de carcinome indifférencié à grandes cellules. Le site de déterminant peut également être trouvé sur des antigènes de quelques autres carcinomes, par exemple, quelques carcinomes du sein

et du colon et le carcinome pulmonaire à petites cellules.

Ainsi, l'anticorps de la présente invention se lie également à des cellules d'autres carcinomes et est utile pour le diagnostic et la thérapie de toutes les autres tumeurs effectuant l'expression de l'antigène identifié 20 par l'anticorps L20. L'anticorps monoclonal de l'invention se lie beaucoup moins aux cellules adultes normales qu'aux cellules tumorales. L'expression "se lie beaucoup moins" signifie que la liaison n'est pas du tout détectable, ou bien est détectable seulement sous forme d'une 25 coloration très faible lorsque des techniques immunohistologiques sont utilisées. Ainsi, l'anticorps possède un degré élevé de spécificité pour un antigène caractéristique du CPCNP et de certains autres carcinomes.

La présente invention comprend également 30 le nouvel antigène L20 identifié par l'anticorps L20

et la classe des anticorps qui se lient à, sont immunospécifiques pour ou immunoréactifs avec cet antigène. Elle comprend en outre les procédés d'utilisation de l'antigène L20 purifié ou cloné comme vaccin pour l'immunisa35 tion contre certains carcinomes.

La présente invention concerne également certains procédés de diagnostic utilisant l'anticorps monoclonal de l'invention. Par exemple, l'anticorps peut être utilisé dans des procédés destinés à déterminer 5 la présence de l'état malin dans le tissu pulmonaire humain et d'autres tissus humains. Les procédés consistent à examiner le tissu pour mettre en évidence un antigène ayant les caractéristiques d'une glycoprotéine de 110 000, ce qui définit l'anticorps L20. Par exemple, le tissu peut être mis en contact avec un anticorps oui définit un site de déterminant sur un antigène cellulaire associé ayant les caractéristiques de l'antigène défini par].'anticorps L20, un équivalent fonctionnel ou un fragment de cet anticorps, et toutes les inter15 actions dudit anticorps et des déterminants antigéniques sont détectées. Un tel procédé comprend la détermination de la présence de cellules de CPCNP chez un sujet suspecté de contenir ces cellules. Le sujet est mis en contact avec l'anticorps monoclonal, qui est capable 20 de distinguer ces cellules des autres types cellulaires qui peuvent être présents chez le sujet. Le contact est effectué dans des conditions permettant la liaison de l'anticorps à ces cellules. Après le contact, la présence ou l'absence de liaison de l'anticorps aux 25 cellules chez le sujet est déterminée. Cette liaison

dépend de la présence ou de l'absence des cellules de CPCNP chez le sujet. Généralement, le sujet est mis en contact avec un membre de liaison spécifique marqué de l'anticorps monoclonal. Ce marqueur est capable de 30 produire un signal détectable.

Un autre procédé de diagnostic comprend la localisation in vivo d'une tumeur par administration à un patient d'un anticorps purifié ou fragment d'anticorps de la présente invention marqué avec un agent 35 oui donne un signal détectable. La localisation est

alors détectée en utilisant la scintigraphie externe, la tomographie d'émission ou la radiographie nucléaire.

Ce procédé peut également offrir de meilleurs moyens pour déterminer l'état de patients atteints de cancer 5 en ce qui concerne l'étendue dé la maladie et pour contrôler les variations de réponse à une thérapeutique.

La présente invention possède également des applications thérapeutiques, puisque l'anticorps L20 et les anticorps similaires peuvent réagir avec 10 l'antigène L20 qui est exprimé à de fortes concentrations

à la surface des cellules tumorales. Par conséquent, les anticorps peuvent être utilisés comme supports de divers agents qui possèdent un effet anti-tumoral, comprenant, mais à titre non limitatif, des médicaments 15 chimiothérapeutiques, des toxines, des agents modificateurs de réponse immunologique et des radio-isotopes.

En outre, l'anticorps L20 peut être modifié afin qu'il puisse servir de médiateur dans la cytotoxicité cellulaire dépendant des anticorps (CCDA), c'est20 à-dire qu'il puisse tuer les cellules de CPCNP en présence de lymphocytes ou macrophages humains ou bien qu'il devienne cytolytique visà-vis des cellules tumorales en présence de complément humain. Cette modification peut être obtenue, par exemple, par des techni25 ques récemment mises au point pour la production "d'anticorps chimères". En conséquence, des gènes codant pour la région variable de la molécule d'anticorps L20 sont épissés avec des gènes humains codant pour la région Fc d'un anticorps d'activité biologique appropriée (telle 30 que l'aptitude à activer le complément humain et à effectuer la médiation de la CCDA). De nouveaux anticorps d'origine humaine ou provenant de la souris peuvent également être produits contre l'antigène L20,

possédant les fonctions biologiques appropriées.

La présente invention a pour objet un nouvel anticorps monoclonal, appelé L20, qui est immunospécifique pour et/ou immunoréactif avec un antigène présent sur les cellules de CPCNP humain et des cellules prove5 nant de plusieurs autres carcinomes humains, comprenant

le carcinome du colon, le carcinome du sein et le carcinome pulmonaire à petites cellules, des procédés de production de ce nouvel anticorps monoclonal et certains procédés de diagnostic et procédés thérapeutiques utili10 sant l'anticorps.

La présente invention a en outre pour objet

un nouvel antigène cellulaire de surface caractéristique du CPCNP humain et de certains autres carcinomes humains du sein, du colon et du poumon, et des procédés 15 d'utilisation de ce nouvel antigène.

2.1. PROCEDES DE PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAL CONTRE LE CPCNP

Des anticorps monoclonaux contre le CPCNP humain et certains autres carcinomes humains peuvent 20 être préparés par des techniques de fusion d'hybridomes,

par transformation par VEB de lymphocytes humains producteurs d'anticorps, ou par des techniques qui associent la fusion cellulaire et des technologies d'immortalisation par VEB.

2.1.1. TECHNIQUES DE FUSION

Conformément à une forme de réa]lisation de la présente invention, des anticorps monoclonaux contre le CPCNP sont préparés en utilisant des techniques de production d'hybridomes par fusion cellulaire. 30 Par exemple, des cellules de carcinome pulmonaire humain provenant d'épanchements pleuraux, des cellules cultivées provenant de tumeurs de CPCNP humain obtenues par explantation, ou des cellules provenant d'un poumon foetal normal, ou bien des lysats de ces cellules, sont utilisés 35 comme agent immunogène. Dans un exemple illustratif,

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des cellules explantées provenant d'un CPCNP, l'adénocarcinome pulmonaire humain N 3082, ont été utilisées comme agent immunogène (voir section 3. 1). Par exemple, les cellules sont injectées à une souris et, au bout 5 d'une durée suffisante, la souris est sacrifiée et dés lymphocytes somatiques producteurs d'anticorps sont obtenus. Les cellules productrices d'anticorps peuvent être obtenues à partir des ganglions lymphatiques, de la rate et du sang périphérique d'animaux induits. Les 10 cellules de la rate sont préférées. Les lymphocytes

de souris donnent un pourcentage supérieur de fusions stables, avec les myélomes de souris décrits ci-dessous.

L'utilisation de cellules somatiques de rats, de lapins et de grenouilles est également possible. Le-s chromosomes 15 de cellules de la rate codant pour les immunoglobulines désirées sont immortalisés par fusion des cellules -de rate et de cellules de myélome, généralement en présence de polyethylène-glycol. Plusieurs lignées cellulaires de myélome peuvent être utilisées pour]la production 20 d'hybrides cellulaires fusionnés, comprenant NSI-Ag4/1,

X63-Ag8, MPC11-45.6TG1.7, X63-Ag.653, Sp2/O-Ag14, Fo et S194/5XXO.Bu.1, obtenus chez la souris, et 210.RCY3.

Agl.2.3, U-226AR et GM1500GTGAL2 obtenus chez le rat, (Hammerling et collaborateurs, 1981, "Monoclonal Antibo25 dies and T-cell hybridomas" in Research Monographs in Immunology, volume 3, J.L. Turk, ed; Elsevier/North Holland Biomedical Press. New York). Dans un autre exemple illustratif, des cellules de NS1 ont été utilisées (voir section 3.1). On laisse les cellules résultantes, 30 qui comprennent les hybridomes obtenus par fusion, croître dans un milieu sélectif, tel que le milieu HAT, et on cultive les cellules survivantes dans un tel milieu

en utilisant des conditions limitantes de dilution.

On cultive les cellules dans un récipient convenable, 35 par exemple des cuvettes de microtitrimétrie, et le l1 surnageant est examiné en ce qui concerne la présence

d'anticorps monoclonaux ayant la spécificité désirée.

Divers procédés classiques existent pour l'isolement et- la purification des anticorps monoclonaux, de manière à les débarrasser des autres protéines et

d'autres impuretés.

2.1.2. TECHNIQUES DE TRANSFORMATION PAR VEB

Conformément à une autre forme de réalisation de la présente invention, des anticorps monoclonaux 10 contre le CPCNP sont préparés en utilisant des techniques de transformation par VEB. Par exemple, des lymphocytes provenant de sang périphérique, de ganglions lymphatiques drainant la tumeur, de ponctions de moelle osseuse, de tumeurs ou d'épanchements pleuraux provenant 15 de patients atteints d'un CPCNP sont immortalisés en utilisant le VEB suivant des procédés conçus par Cole et collaborateurs, 1984, Cancer *Res. 44:2750. Comme l'indiquent Cole et collaborateurs, les lymphocytes B spécifiques des antigènes tumoraux sont rares chez 20 les patients atteints de cancer du poumon. Il est donc particulièrement important d'augmenter le nombre de lymphocytes producteurs d'anticorps par une présélection des lymphocytes produisant l'anticorps contre l'antigène concerné. Ainsi, les techniques de transformation par 25 VEB comprennent deux étapes: (1) enrichissement des cellules en récepteurs pour l'antigène concerné, à savoir l'antigène L20 décrit dans le paragraphe 4.2, et (2) immortalisation de ces cellules par infection avec le VEB.

2.1.3. TECHNIQUES DE PRODUCTION D'HYBRIDOMES

EN UTILISANT LE VEB

Conformément à une autre forme de réalisation de la présente invention, des anticorps monoclonaux contre le CPCNP sont préparés en utilisant une associa35 tion des techniques de transformation par VEB et de

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production d'hybridomes par fusion, telle que décrite par Cole et collaborateurs, 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.; pages 77-96. Par exemple, une lignée cellulaire de myélome est fusionnée avec des lymphocytes donneurs provenant

de patients atteints de CPCNP qui ont été préalablement transformés par le VEB et fixés comme une lignée cellulaire capable de croître et de se développer en culture.

Afin de pouvoir sélectionner les lignées cellulaires 10 obtenues par fusion de VEB et d'hybridomes, il est nécessaire que le membre de fusion possède des marqueurs médicamenteux appropriés dominants pouvant être choisis tels que

la résistance à l'ouabaúne ou à la néomycine afin que les cellules parentales ne se développent pas lors de 15 la culture des lignées cellulaires d'hybridomes fusionnés.

Une lignée convenable est la lignée cellulaire lymphoblastoide résistante à l'ouabaine, GM-150 résistante à la thioguamine, appelée KR-4, décrite par Cole et collaborateurs, ci-dessus. Les hybridomes obtenus sont 20 clones au moyen de techniques classiques.

2.1.4. MULTIPLICATION CELLULAIRE ET PRODUCTION D'ANTICORPS

Une fois les hybrides cellulaires fusionnés désirés ou les lignées cellulaires transformées sélec25 tionnés et clones dans des lignées cellulaires productrices d'anticorps particulières, la multiplication de chaque lignée cellulaire peut être effectuée suivant l'une de deux manières classiques. La multiplication de la lignée cellulaire particulière peut être effectuée 30 in vitro, par exemple dans des récipients de culture de laboratoire, et le milieu de culture contenant des concentrations élevées d'un seul anticorps monoclonal spécifique peut être recueilli par décantation, filtration ou centrifugation. En variante, le rendement en 35 anticorps monoclonai peut être accru en injectant un échantillon de l'hybridome dans un animal présentant une histocompatibilité, du type utilisé pour obtenir les cellules somatiques et les cellules de myélome pour la fusion initiale. Des tumeurs sécrétant l'anticorps 5 monoclonal spécifique produit par l'hybride cellulaire obtenu par fusion se développent chez l'animal ayant subi l'injection. Les liquides corporels de l'animal, tels que le liquide d'ascite ou le sérum, donnent des anticorps monoclonaux en des concentrations élevées. 10 Tel qu'examiné par Cole et collaborateurs ci-dessus, lorsque des hybridomes humains ou des hybridomes-VEB sont utilisés, il est nécessaire d'éviter le rejet de la xénogreffe injectée dans des animaux tels que des souris. On peut utiliser des souris immunodéficientes 15 ou nues, oubien on peut faire passer l'hybridome tout d'abord dans des souris nues irradiées comme une tumeur sous-cutanée solide, le cultiver in vitro, puis l'injecter par voieintrapéritonéale dans des souris nues irradiées, conditionnées au pristane, qui développent des tumeurs 20 ascitiques sécrétant de grandes quantités d'anticorps

monoclonaux humains spécifiques (voir Cole et collaborateurs, ci-dessus).

2.2. ANTICORPS MONOCLONAUX

L'anticorps de la présente invention se 25 lie à un nouvel antigène glycoprotéique de surface cellulaire, appelé antigène L20, caractéristique des cellules de CPCNP humain et des cellules de certains autres carcinomes humains (voir paragraphe 2.2.1). L'antigène glycoprotéique possède un poids moléculaire d'environ 30 110 000 daltons lorsqu'il est soumis à une immunoprécipitation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (voir paragraphe 3.3). La digestion de l'antigène L20 avec de la glycanase a montré qu'il contient des chaînes

oligosaccharidiques liées par l'azote.

Comme exemple illustratif de la présente invention, l'anticorps L20 est produit par l'hybridome murin L20 décrit dans le paragraphe 5.1. L'anticorps L20 présente l'isotype IgG1 et (voir paragraphe 3.2.2.) 5 possède une avidité d'approximativement 3 x 10. Il ne se

lie pas de manière détectable à des cellules normales, telles que les fibroblastes, les cellules endothéliales ou les cellules épithéliales dans les organes principaux.

L'expression "ne se lie pas de manière détectable" signi10 fie que seule une coloration très faible ou bien pas

la moindre coloration n'est détectée par immunohistologie.

Des fragments de liaison utiles de l'anticorps monoclonal ci-dessus, tel que les fragments Fab, F(ab')2, Fv, etc., entrent également dans le cadre de 15 la présente invention. Les fragments d'anticorps sont obtenus par des techniques classiques. Par exemple, des fragments de liaison utiles peuvent être préparés en effectuant la digestion de l'anticorps au moyen d'une

peptidase, comme la papaine ou la pepsine.

Des anticorps similaires, comprenant des anticorps d'isotypes différents, d'affinités différentes et ayant des fonctions biologiques nouvelles, telles que l'aptitude à tuer des cellules tumorales en présence de complément ou de cellules effectrices telles que les 25 lymphocytes ou les macrophages, entrent également dans le cadre de la présente invention. Bien que l'exemple particulier ci-dessus du nouvel anticorps de la présente invention concerne un anticorps se liant à un site de déterminant spécifique sur l'antigène respectif et appar30 tenant à la sous-classe IgG1 d'origine murine, cela n'est pas limitatif. L'anticorps ci-dessus et].es anticorps fonctionnellement équivalents à l'anticorps cidessus, qu'ils soient d'origine murine ou proviennent d'un autre mammifère, y compris l'homme, ou d'autres 35 sources, ou de leurs associations, entrent dans le cadre de la présente invention, de même que des anticorps d'autres isotypes. L'expression "fonctionnellement équivalent" signifie que l'anticorps est capable de se lier au site de déterminant décrit ci-dessus et est capable d'entrer en compétition pour un tel site avec un anticorps particulier de la présente invention. C'est- àdire que cet anticorps, lorsqu'il est associé à un échantillon contenant une cellule ou un fragment cellulaire possédant un tel site de déterminant, se lie à ce site 10 de déterminant et bloque la liaison d'un anticorps de la présente invention à un tel site. En outre, puisque l'antigène de la présente invention peut posséder plus d'un site de déterminant, la présente invention comprend des anticorps monoclonaux qui définissent des sites 15 de déterminants autres que les sites de déterminants

définis par l'anticorps monoclonal mentionné ci-dessus et qui peuvent être identifiés par des analyses d'immunoprécipitation séquentielle, connues dans la pratique.

LIa présente invention comprend également 20 des anticorps préparés en réponse à des sites de liaison d'antigènes, ou des idiotypes de l'anticorps L20, puisque ces anticorps anti-idiotypiques peuvent être utilisés pour analyser la réponse immunitaire à des antigènes tumoraux à des fins de diagnostic et pour induire des 25 réponses immunitaires à des fins thérapeutiques ou prophylactiques (Nepom et collaborateurs, 1984, Proc. Nat'l

Acad. Sci. 81:2664).

2.2.1 ANTIGENE L20 RECONNU PAR LES ANTICORPS MONOCLONAUX

L'antigène reconnu par les anticorps monoclonaux de la présente invention comprend un nouvel antigène glycoprotéique. de surface cellulaire caractéristique des cellules de CPCNP, et de certains autres carcinomes, comprenant le carcinome du sein, le carcinome 35 du colon et Jle carcinomepulmonaire à petites cellules.

L'antigène possède un poids moléculaire d'environ

000 daltons.

La séquence amino terminale des amino-acides du nouvel antigène glycoprotéique est la suivante:

1 5 10 15 20

L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-I.-V-G-T-D-A-X-L

séquence dans laquelle X représente un amino-acide qui n'a pas été identifié jusqu'à présent, et le reste des lettres représente les abréviations classiques utilisant 10 une seule lettre, pour les aminoacides. Une comparaison de cette séquence à celles accumulées dans la base de données concernant les protéines courantes (PIR Release

6,0, Novembre 1985) ne révèle aucune homologie significative de séquence avec toutes les autres séquences 15 connues.

2.3. UTILISATIONS DES ANTICORPS MONOCLONAUX ET DE L'ANTIGENE L20

2.3.1. APPLICATIONS DE DIAGNOSTIC

Les anticorps monoclonaux de la présente 20 invention peuvent être utilisés comme sondes dans la détection d'antigènes discrets dans le CPCNP humain et d'autres tumeurs humaines. Un procédé de la présente invention comprend la détermination de la présence d'un état malin dans le tissu pulmonaire et d'autres tissus 25 humains par examen du tissu en ce qui concerne l'expression ou]'absence d'expression d'un antigène glycoprotéiaue ayant les caractéristiques de l'antigène L20. L'expression "ayant les caractéristiques de" signifie que l'antigène est réactif avec un anticorps qui reconnaît 30 l'antigène L20. L'expression ou l'absence d'expression de cet antigène peut donner une information cliniquement exploitable qui ne peut être obtenue avec des techniques

histopathologiques classiques.

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Les anticorps monoclonaux de la présente invention peuvent être utilisés, par exemple, pour détecter des cellules de carcinome pulmonaire à cellules non petites dans des échantillons histologiques et cyto]o5 giques. Par exemple, en utilisant la technique de coloration à l'immunoperoxydase décrite dans le paragraphe 3.4., des échantillons tissulaires excisés de carcinome du poumon du type adénocarcinome, carcinome épidermoide et carcinome à petites cellules ont présenté une colora10 tion positive intense. Des échantillons normaux de poumon, de rate, de sein, de colon, de rein, de foie, de

cerveau, de coeur, de peau, de thyroïde, de testicule, de vagin, et des lymphocytes normaux étaient négatifs.

Une autre application importante de diagnostic in vitro des anticorps monoclonaux de la présente invention est l'évaluation de carcinomes autres que le CPCNP. L'anticorps a été utilisé pour détecter l'épitope dans des carcinomes du sein, du colon et dans le 20 carcinome pulmonaire à petites cellules. Des échantillons normaux de ces tissus n'ont pas effectué l'expression du déterminant. Ainsi, l'anticorps monoclonal est utile pour détecter dans ces carcinomes un déterminant antigénique qui est associé à la tumeur. L'anticorps mono25 clonal peut donc être un réactif de diagnostic utile pour le carcinome du sein, le carcinome du colon et

le carcinome pulmonaire à petites cellules.

En variante, des techniques d'immunofluorescence peuvent être utilisées pour examiner des échantil30 lons de tissus humains avec les anticorps monoclonaux

de la présente invention. Dans un protocole classique, des lames portant des coupes effectuées en cryostat d'échantillons de biopsie tissulaire congelés, non fixés, des échantillons de tumeurs ''excisés ou des frottis cyto35 logiques sont séchés à l'air et mis à incuber avec l'anti-

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corps monoclonal dans une chambre humide à température ambiante. Les frottis cytologiques comprennent des échantillons de cellules exfo] iatives. Le terme "exfoliative" signifie que l'échantillon comprend des cellules isolées 5 ou des agrégats cellulaires obtenus par raclage ou lavage de la surface du tissu, cellules qui sont prélevées isolément ou sous forme de squames ou de lames. L'échantillon de cellules exfoliatives doit être différencié du tissu excisé tel qu'obtenu à la biopsie. Le procédé 10 peut être utile dans la détection d'un état malin chez des échantillons de cellules exfoliatives provenant du poumon tels qu'un échantillon d'expectoration, provenant des bronches, du tractus gastrointestinal, comprenant la région orale du pharynx, la bouche, un frottis cervical, etc. Après séchage, les lames sont recouvertes d'une préparation d'anticorps contre l'anticorps monoclonal, habituellement un type quelconque d'anti-immunoglobuline de souris si l'anticorps monoclona] l utilisé provient de la fusion d'un lymphocyte de rate de souris 20 et d'une lignée de myélome de souris. Cette anti-immunoglobuline de souris est conjuguée en utilisant des techniques connues avec un composé tel que l'isothiocyanate de fluorescéine ou de rhodamine qui émet une fluorescence à une longueur d'onde particulière. Le profil de colora25 tion et les intensités concernant l'échantillon sont

alors déterminés par microscopie en lumière fluorescente et éventuellement photographiés.

La description ci-dessus concerne essentiellement l'utilisation des anticorps de la présente inven30 tion dans des techniques d'immunofluorescence. Cependant, les anticorps de la présente invention peuvent

être utilisés dans la plupart des analyses faisant intervenir des réactions antigène-anticorps. Les analyses peuvent être homogènes ou hétérogènes. Dans une analyse 35 homogène, l'échantillon peut être un tissu lysé et clari-

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fié pour éliminer les débris. La réaction immunologique comprend habituellement l'anticorps spécifique, un analyte servant de marqueur et l'échantillon intéressant.

Le signal provenant du marqueur est modifié, directement 5 ou indirectement, par la liaison de l'anticorps à l'analyte marqué. La réaction immunologique et la détection de l'importance de cette réaction sont conduites en solution homogène. Les marqueurs immunochimiques qui peuvent être utilisés comprennent des radicaux libres, 10 des colorants fluorescents, des enzymes, des bactériophages, des co-enzymes, etc. Dans une méthode d'analyse hétérogène, les réactifs sont habituellement l'échantillon, l'anticorps spécifique et un système destiné à produire un signal 15 détectable. Un support solide ou une phase solide sont habituellement revêtus de l'anticorps monoclonal. L'échantillon en phase liquide est alors mis en contact avec l'anticorps en phase solide. Le support en phase solide est alors séparé de la phase liquide, et la phase solide 20 ou la phase liquide est examinée en ce qui concerne un signal détectable en utilisant des systèmes destinés à produire ce signal. Le signal est lié à la présence de l'analyte dans l'échantillon. Les systèmes de production d'un signal détectable comprennent l'utilisation 25 de marqueurs radio-actifs, de substances fluorescentes, d'enzymes, etc. Des exemples d'analyses immunologiques hétérogènes sont l'analyse radioimmunologique, les méthodes d'immunofluorescence, les analyses immunologiques par liaison enzymatique, etc. Pour une discussion plus en détail des techniaues d'analyse immunologique ci-dessus, voir "EnzymeImmunoassay", par Edward T. Maggio, 1980, CRC Press, Jnc., Boca Raton, Floride. Voir également, par exemple, les brevets des Etats-Unis d'Amérique N 3 690 834; 35 N 3 791 932; N 3 817 837; N 3 850 578; N 3 853 987;

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N 3 867 517; N 3 901 654; N 3 935 074; N 3 984 533; N 3 996 345 et N 4 098 876 dont l'énumération n'est

pas destinée à être exhaustive.

Les anticorps de la présente invention peu5 vent également être utilisés pour des applications de diagnostic in vivo. Par exemple, des anticorps ou des fragments préparés à partir des anticorps, par exemple les fragments Fab et F(ab')2, peuvent être utilisés pour visualiser des tumeurs, comprenant des dépôts méta10 statiques chez des patients humains présentant un CPCNP,

d'une manière analogue à celle décrite pour le mélanome malin dans Larson et collaborateurs, 1983, J. Nucl.

Med. 24:123 et dans Larson et collaborateurs, 1983, J. Clin. Invest. 72:2101. L'anticorps purifié ou ses fragments sont marqués avec un agent donnant un signal 131 détectable, par exemple un radio-isotope tel aue 3I, et est administré à un patient dans un véhicule convenable, par exemple par voie intraveineuse. La localisation de l'anticorps lié à la tumeur est détectée par scinti20 graphie externe, tomographie d'émission ou radiologie

nucléaire, en utilisant, par exemple, une caméra gamma.

2.3.2. APPLICATIONS THERAPEUTIQUES

Les anticorps de la présente invention peuvent également être utilisés en thérapeutique. Les anti25 corps monoclonaux peuvent être utilisés en association avec un large spectre de médicaments ou d'agents cytotoxiques. Par exemple, un anticorps peut être lié à une toxine afin de former une immunotoxine (Jansen et collaborateurs, 1982, Immunol. Rev. 62:185) ou à une matière 30 radio-active, par exemple 125I, 1-1I, etc. (Order, 1984, Compr. Ther. 10:9; Larson et collaborateurs, 1983, J. Clin. Invest. 72:2101; Carrasquillo et collaborateurs, 1984, Cancer Treatment Reports, 68:317), ou bien à un médicament (Rowland et collaborateurs, 1985, Cancer 35 Immunol. Immunother. 19:1) afin de former une substance

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radiopharmaceutique ou pharmaceutique. Des anticorps conjugués peuvent être administrés à des patients afin d'obtenir des effets anti-tumoraux accrus par l'action cytotoxique de l'agent chimiothérapeutique délivré à 5 la tumeur, sur la base de l'affinité de liaison de la portion anticorps.

Des molécules, appelées "anticorps chimère", peuvent être préparées à partir de l'anticorps de la présente invention, molécules contenant un domaine de 10 liaison à l'antigène de souris avec des domaines constants chez l'homme (Morrison et collaborateurs, 1984, Proc. Nat']. Acad. Sci. U. S.A. 81:6851; Takeda et collaborateurs, 1985, Nature, 314:452) et cette voie peut être utilisée pour élaborer de nouvelles molécules d'anticorps ayant des fonctions d'effecteur avantageuses telles que l'aptitude à activer le complément humain et à effectuer la médiation de la CCDA (Neuberger et

collaborateurs, 1984, Nature 312:604).

Une autre utilisation thérapeutique des 20 anticorps monoclonaux de la présente invention est la préparation d'anticorps anti-idiotypique en utilisant l'anticorps L20 comme agent immunogène (voir, par exemple, Nepom et collaborateurs, 1984, Proc. Nat'l Acad. Sci.

U.S.A., 81:2864; Lee et collaborateurs, 1985, Proc. 25 Nat'l Acad. Sci. 82:6286).

Un aspect intéressant de la présente invention est la possibilité d'associer les anticorps de l'invention à d'autres anticorps contre le CPCNP ou d'autres tumeurs, telles que celles décrites dans les 30 demandes de brevets des Etats-Unis d'Amérique N 667 521, déposée le 2 Novembre 1984, N 684 759, déposée le

21 Décembre 1984 et N 738 612, déposée le 28 Mai 1985.

L'association est efficace pour détecter les types de carcinomes pulmonaires à cellules non petites mentionnés 35 ci-dessus, à savoir le carcinome pulmonaire indifférencié à grandes cellules, l'adénocarcinome et le carcinome épidermoúde. Les anticorps monoclonaux de la présente invention définissent également des sites de détermi5 nants sur un antigène associé à d'autres carcinomes

tels que les carcinomes du sein, les carcinomes du colon et le carcinome pulmonaire à petites cellules (voir paragraphe 3. tableau I). En conséquence, les anticorps de l'invention peuvent trouver une application dans 10 des procédés thérapeutiques et des produits thérapeutiques destinés à ces carcinomes.

Le nouvel antigène de la présente invention, appelé antigène L20, peut également être utilisé pour des applications thérapeutiques. L'antigène peut être 15 purifié à partir de tumeurs ou produit par la technologie de l'ADN recombinant (Brown et collaborateurs, demande de brevet des E.U.A N 827 313 déposée conjointement le 7 Février 19P6, citée en référence dans le présent mémoire. Le gène codant pour l'antigène L20 peut être cloné par des procé20 dés qui comprennent tout d'abord l'enrichissement de l'ARNm de l'antigène L20. Par un tel procédé, des polysomes (consistant en ARNm, ribosomes et chaînes polypeptidiques naissantes) peuvent être purifiés par chromatographie d'immuno-affinité avec un anticorps qui recon25 naît le déterminant antigénique L20 sur la chaînenaissante. L'ARNm est isolé par immunoprécipitation avec, par exemple, l'anticorps L20 et l'ADNc est cloné dans un vecteur d'expression approprié. En variante, l'anticorps L20 ou un anti-sérum contre l'antigène L20 peut 30 être utilisé pour sélectionner une banque d'ADNc en

utilisant un vecteur d'expression. L'antigène L20 purifié ou cloné peut être administré seul comme agent immunogène ou associé à un adjuvant immunologique convenable.

En variante, le gène codant pour l'antigène peut être inséré dans le gène codant pour un virus, tel que le virus vaccinal, pour produire un ADN recombinant destiné à être utilisé comme agent immunogène (Brown et collaborateurs, demande de brevet des E.U.A. N 827 313 déposée conjointement le 7 février 1986).

*2.4. KITS DE DIAGNOSTIC

La présente invention comprend également des kits de diagnostic destinés à mettre en oeuvre les procédés décrits ci-dessus. Dans une forme de réalisation, 10 le kit de diagnostic comprend (a) un anticorps monoclonal défini plus précisément ci-dessus et (b) un conjugué d'un membre de liaison spécifique pour l'anticorps monoclonal et un marqueur capable de produire un signal détectable. Les réactifs peuvent également comprendre 15 des agents auxiliaires tels que des agents tampons et des agents stabilisant les protéines, par exemple des polysaccharides, etc. Le kit de diagnostic peut comprendre en outre, lorsque -cela est nécessaire, d'autres constituants du système producteur de signal, comprenant 20 des agents destinés à diminuer l'interférence due au bruit de fond, des réactifs témoins, un appareil destiné à effectuer un essai, etc. Dans une autre forme de réalisation, le kit de diagnostic comprend un conjugué d'un anticorps monoclonal de la présente invention et un 25 marqueur capable de produire un signal détectable. Des

agents auxiliaires, tels que mentionnés ci-dessus, peuvent également être présents.

3. EXEMPLES

ILa présente invention est en outre démontrée 30 par les exemples illustratifs non limitatifs suivants.

2.1. PREPARATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX

Des anticorps monoclonaux ont été produits en utilisant des techniques de fusion d'hybridomes décrites précédemment par Yeh et collaborateurs, 1979, Int. J. Cancer 29:299. Une souris Balb/c âgée de trois mois a été immunisée en utilisant des cellules cultivées obtenues par explantation à partir d'un adénocarcinome pulmonaire humain appelé 3082, comme agent immunogène. 5 Les souris ont reçu quatre injections intrapéritonéales d'environ 107 cellules. Trois jours après la dernière immunisation, la rate a été prélevée, mise en suspension dans un milieu de culture et les cellules ont été fusionnées à des cellules de myélome NS1 de souris (Koh10 ler et Milstein, ci-dessus). Le mélange a été ensemencé pour former des cultures de faible densité provenant

des seules cellules fusionnées (clones).

Les surnageants provenant des cellules hybrides ont été examinés en ce qui concerne l'activité de 15 liaison directe sur des lignées cellulaires de cancer du poumon en utilisant une analyse par immunosorbant lié à un enzyme ("ELISA") et une analyse autoradiographique indirecte de protéine A marquée par 125I (Brown et collaborateurs, 1979, J. Immunol. Meth., 31:201). Des 20 extraits de membranes cellulaires provenant de la tumeur utilisée pour l'immunisation ont été préparés en utilisant un procédé modifié d'après Colcher et collaborateurs, 1981, Cancer Res. 42:1451; Yeh et collaborateurs, ci-dessus. Les tissus ont été lavés avec du tampon physio25 logique phosphaté et les cellules provenant de tumeurs intactes ont été mises en suspension par pression à travers un tamis en acier inoxydable. Ensuite, 1 mM de NaHCO2 contenant 1 mM de fluorure de phénylméthyl sulfonyle (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, Cali30 fornie) a été ajouté, et la matière a été alors homogénéisée sur de la glace, avec 50 oscillations du pilon B d'un homogénéiseur Dounce. Après centrifugation pendant 15 minutes à 27 000 x g, le surnageant a été éliminé, et la pastille a été remiseen suspension dans du tampon 35 physiologique phosphaté, a été traitée par sonication

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pendant 1 minute et a été entreposéeA -70 C.

Les hybridomes qui ont produit des anticorps se liant aux extraits de membranes cellulaires ont été clones, développés in vitro et essayés de nouveau en ce qui concerne la spécificité de l'anticorps. Les hybridomes qui ont produit un anticorps ayant une réelle spécificité pour le cancer pulmonaire humain ont été reclonés, développés et injectés dans des souris BalbJc

- gées de trois mois, conditionnées au pristane, o ils 10 se sont développés sous forme de tumeurs ascitiques.

En suivant ce procédé, une lignée cellulaire d'hybridome L20 a été obtenue, clonée et injectée dans des souris afin qu'elles se développent sous forme de tumeurs ascitiques. L'anticorps sécrété dans l'ascite 15 a été purifié sur du protéine A-Separose (Ey et collaborateurs, 1978, Immunochemistry, 15:429) ou par filtration sur gel dans du Sephacryl S300. L'anticorps purifié

a été utilisé pour une caractérisation ultérieure.

3.2. CARACTERISATION DE L'ANTICORPS MONOCLONAL L20 20 3.2.1. DETECTION ET LIAISON DE L'ANTICORPS L20

A DES CELLULES EN CULTURE

La localisation subcellulaire de l'antigène a été déterminée en mesurant la liaison de l'anticorps à des cellules avant ou après perméabilisation avec 25 un détergent non ionique. Les anticorps se liant à la surface de cellules intactes en culture ont été identifiés par des analyses de liaison directe avec un anti125 corps marqué par I (Brown et collaborateurs, 1981, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 78:539) ou bien par fluo30 rescence indirecte en utilisant le trieur de cellules activées par fluorescence (TCAF) II. Les anticorps se liant à des emplacements intracellulaires ont été déter125 minés par liaison directe d'anticorps marqué par 25I à des cellules après fixation au para-formaldéhyde et 35 perméabilisation ultérieure avec le détergent non ionique

NP-40.

Pour les analyses de liaison effectuées en utilisant des anticorps radiomarqués (Brown et collaborateurs, ci-dessus), des cellules en culture (10) ont été incubées sur de la glace pendant 30 minutes avec 5 106 cpm d'anticorps marqué par 125I dans 100 pl de tampon de liaison. La suspension a été étalée sur 0,2 ml de dinonylphtalate: dibutylphtalate (dans le rapport 1:1 en volume/volume) et a été centrifugée. Un comptage du I a été effectué sur la pastilleetla phase aqueuse. 10 Pour mesurer la liaison non spécifique, des incubations

ont été effectuées en parallèle avec un anticorps non marqué comme compétiteur (Brown et collaborateurs, cidessus).

TABLEAU I

LIAISON D'ANTICORPS L20 RADIOMARQUE A L'IODE

A DES CELLULES EN CULTURE

CELLULES LIAISON SPECIFIQUE

Adénocarcinome pulmonaire Calu-1 45 400 Adénocarcinome pulmonaire H3082 50 100 Adénocarcinome pulmonaire H2981 64 100 Adénocarcinome pulmonaire H2984 119 300 Carcinome du sein MCF7 78 800 Mélanome 3017 2200 Cellules T normales 200 Leucémie T de Jurkat 200 Lymphome B de Daudi 200

3.2.2. DETERMINATION DE L'ISOTYPE DE L'ANTICORPS L20

Afin de déterminer la classe d'immunoglobulines produites par la lignée cellulaire d'hybridomes 30 L20, les techniques suivantes ont été utilisées: (a) Immunodiffusion d'Ouchterlony Une portion aliquote de surnageant de cellules d'hybridomes particulières a été placée dans le godet central d'une plaque de gélose à 25 %. Des isotypes 35 d'anticorps monospécifiques de lapin anti-Ig de souris

(Southern Biotechnology, Birmingham, AL) ont été placés dans l.es godets extérieurs et la plaque a été mise à incuber pendant 2 heures à température ambiante et pendant une nuit à 4 C.

(b) Détermination de l'isotype par ELISA Des plaques à 96 godets Dynatech Immuolon ont été recouvertes avec chaque anti-sérum à une concentration de 1 ig/ml, 50 pl par godet dans du PBS et ont été laissées recouvertes pendant une nuit à 4 C. 10 Les plaques ont été lavées avec un mélange PBS/Tween , 0,05 %, et ont été remplies avec 100 il de milieu par godet pendant 1 heure à température ambiante. Après lavage des plaques, les surnageants provenant de l'hybridome L20 ont été ajoutés et l'incubation a été effectuée 15 à température ambiante pendant 1 heure. Après lavage avec du PBS, des plaques contenant de la sérum-albumine bovine (SAB) ont été mises à incuber à 37 C pendant 2 heures avec des isotypes d'anticorps monospécifiques de lapin anti-Ig de souris couplés à de la peroxydase 20 (Zymed). Après lavage, les plaques ont été incubées avec 1 mg/ml d'orthophénylènediamine et 0,03 % de H202 dans 0,1 M de tampon au citrate à pH 4, 5. La densité optique à 630 nm a été déterminée sur un lecteur de

plaque ELISA Dynatec.

L'anticorps monoclonal L20 présente

l'isotype IgG1.

3.3. ANTIGENE RECONNU PAR L'ANTICORPS L20

Afin d'identifier des antigènes protéiques, des cellules de carcinome pulmonaire ont été radiomar30 quées en surface à l'iode ou marquées métaboliquement avec de la 35S-méthionine. Les antigènes ont été isolés à partir de lysats cellulaires par incubation avec un anticorps monoclonal, addition d'anticorps de chèvre anti-IgG de souris et adsorption sur Staphylococcus 35 aureus. Les immuns précipités ont été lavés et soumis à une électrophorèse préparative sur gel de polyacryl-amide au dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) sur du gel d'acrylamide à 10-20 %. Après électrophorèse, le gel a été coloré avec du bleu brillant de Coomassie 5 (0,5 % en poids pour 10 % d'acide acétique et 30 % d'isopropanol) et a été décoloré dans une solution d'acide acétique (5 % en volume/volume) et de méthanol (17 % en volume/volume). La bande d'antigène L20 coloré a été prélevée avec une lame de rasoir et a été immédiate10 ment soumise à une électro-élution avec un électroéluteur/concentrateur ECU-040 (C.B.S. Scientific Co., San Diego, Californie) suivant des procédés décrits par Hunkapiller et collaborateurs, 1983, Methods in

Enzymol. 91:227-236.

Une dégradation automatique d'Edman a été effectuée avec approximativement 23 pmoles d'antigène L20 (sur la base du rendement en L- 1 identifié) datns un séquenceur en phase gazeuse (modèle 470A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, Californie). Les dérivés 20 d'amino-acides formés avec la phénylthiohydantoine ont été réalisés par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) avec inversion de phase en utilisant un appareil de CLHP en ligne modèle 120A (Applied Biosystems, Inc.) avec une colonne PTH-C18 25 (2,1 x 220 mm, Applied Biosystems, Inc.) et un gradient acétate de sodium/tétrahydrofuranne/acétonitrile pour l'élution. La séquence amino terminale des amino-acides est la suivante:

1 5 10 15 20

L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L

dans laquelle X représente un amino-acide qui n'a pas

été identifié.

La comparaison de cette séquence avec celles 35 conservées dans la base de données sur les protéines classiques (PIR Release, 6,0, Novembre 1985) n'a révélé aucune homologie significative de séquence avec n'importe

quelle autre séquence connue.

L'antigène reconnu par l'anticorps L20 est 5 un antigène glycoprotéique ayant un poids moléculaire d'environ 110 000 daltons.

3.4. APPLICATION IMMUNOHISTOLOGIQUE IN VITRO

La technique utilisant un anticorps non marqué de Sternberger, 1979, in Immunochemistry, John 10 Wiley & Sons, New York, pages 104-169, telle que modifiée par Garrigues et collaborateurs, 1982, Int. J. Cancer 29:511, a été utilisée pour des études immunohistologiques sur des coupes congelées. Les tissus servant de cibles pour ces essais ont été obtenus par chirurgie et congelés dans les 4 heures suivant le prélèvement dans de l'isopentane, refroidi préalablement dans de l'azote liquide. Les tissus ont été alors entreposés dans de l'azote liquide ou bien à -70 C jusqu'à utilisation. Une anti-(IgG de souris) de lapin (Sternberger20 Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) a été utilisée à une dilution de 1/50. Des complexes peroxydase de souris-anti-peroxydase (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.) contenant 2 mg/ml de PAP purifié soigneusement ont été utilisés à une dilution de 1/80. Des 25 coupes congelées ont été préparées, séchées, traitées avec de l'acétone et déshydratées (Garrigues et collaborateurs, ci-dessus). Les coupes devant être utilisées pour un essai histologique ont été colorées avec de l'hématoxyline. Pour diminuer les bruits de fond non 30 spécifiques, la pré-incubation des coupes a été effectuée avec du sérum humain normal dilué au 1/5 (Garrigues et collaborateurs, ci-dessus). Les anticorps de souris, l'anti-(IgG de souris) de chèvreetle PAP de souris ont été dilués dans une solution de sérum humain normal

à 10 % et de sérum de lapin à 3 %.

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Le procédé de coloration consistait à traiter des coupes sériées avec un anticorps spécifiaue ou un anticorps témoin pendant 2,5 heures, à effectuer l'incubation pendant 30 minutes avec de l'anti-(IgG souris) de lapin diluée au 1/50 et à effectuer la mise en contact avec du complexe PAP de souris dilué au 1/80 pendant 30 minutes. Après chaque traitement avec un anticorps, les lames ont été lavées à deux reprises dans du PBS. La réaction immunohistochimique a été développée avec du tétrachlor10 hydrate de 3,3'-diaminobenzidine fraîchement préparé à 0,5 % (Sigma, St. Louis, MO) et H202 à 0,01 % dans du tampon tris 0,05 M, à pH 7,6, pendant 8 minutes. En outre, l'exposition à une solution de 0s04 à 1 % dans de l'eau distillée pendant 20 minutes a permis d'intensifier 15 la coloration. Les coupes ont été rincées à l'eau, déshydratées dans l'alcool, éclaircies au xylène et montées

sur lames.

Les lames ont été chacune évaluées après numérotation et les échantillons numérotés ont été con20 trôlés par un chercheur indépendant. Les lames caractéristiques ont été photographiées en utilisant une optique à contraste interférentiel différentiel (Zeiss-Nomarski). Le degré de coloration de l'anticorps a été évalué comme étant égal à 0 (aucune réactivité), 25 + (quelques cellules légèrement positives), ++ (au moins un tiers de cellules positives), +++ (la plupart des cellules positives), ++++ (approximativement toutes les cellules fortement positives). Puisque les différences entre la coloration + et la coloration 0 étaient 30 moins tranchées qu'entre la coloration + et la coloration ++, une coloration classée comme étant égale ou supérieure à ++ a été considérée comme "positive". Des cellules néoplastiques et des cellules de stroma ont été observées dans des échantillons de tumeurs. La coloration 35 observée est celle des cellules tumorales, puisque les

cellules de stroma n'étaient pas colorées du tout, ou bien étaient colorées beaucoup plus faiblement que les cellules tumorales.

TABLEAU II COLORATION PAR IMMUNOPEROXYDASE D'ECHANTILLONS DE

TUMEURS ET DE TISSU NORMAL AVEC L'ANTICORPS MONOCLONAL L20

TYPE DE TISSU Carcinome pulmonaire: 10 adénocarcinome épidermoúde bronchique à petites

cellules Carcinome pulmonaire: 15 lignées cellulaires Carcinome du sein Carcinome du colon Mélanome Carcinome rénal 20 liposarcome Poumon normal

NOMBRE POSITIF/NOMBRE ESSAYE*

18/20

3/3 0/1 4/4

3/3 4/7 5/8 5/8

1/1 0/1

coloration légère de 1 des 3 échantillons essayés Rate normale négatif Sein normal négatif Colon normal négatif Rein normal négatif Foie normal négatif Cerveau normal négatif Coeur normal négatif Peau normale négatif Thyroide normale négatif Testicule normal négatif Vagin normal négatif Culot de lymphocytes normaux négatif

* Tous les échantillons examinés étaient des coupes congelées de tissus obtenus après chirurgie. Voir le texte pour la description en détail des procédés immunohistologiques. Une coloration de 2 + 'représentant au 40 moins un tiers de cellules positives) a été considérée

comme positive.

Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y

être apportées sans sortir de son cadre.

Une]Lgne cellulaire L20, telle que décrite

dans le présent mémoire, a été déposée à l'American Type Tissue Culture Collection, Rockville, Maryland, et il lui a été attribué le numéro de dépôt ATCC HB8913..

Le cadre de l.'invention décrite et revendiquée dans 10 le présent mémoire n'est pas limité par la lignée cellulaire déposée puisque la forme de réalisation déposée est simplement proposée comme illustration d'un aspect de l'invention et n'importe quelle lignée cellulaire équivalente qui produit un anticorps monoclonal fonction15 nellement équivalent entre dans le cadre de la présente invention. En fait, diverses modifications de l'invention, outre celles présentées et décrites dans le présent mémoire, seront évidentes pour l'homme de l'art d'après

la description précédente.

Claims (34)

REVENDICATIONS

1. Anticorps monoclonal produit par une lignée cellulaire continue ayant les caractéristiques identifiées sous le N de l'American Type Culture Collec5 tion HB8913, caractérisé en ce qu'il se lie à un site de déterminant sur un antigène glycoprotéique de surface de cellules de carcinome pulmonaire humain à cellules non petites, et équivalents fonctionnels, fragments

de liaison et immuns complexes dudit anticorps.

2. Anticorps monoclonal suivant].a revendication 1, caractérisé en ce qu'il est conjugué à un marqueur capable de produire un signal détectable, de

préférence une substance fluorescente ou un chromophore.

3. Anticorps monoclonal produit par une 15 lignée cellulaire continue ayant les caractéristiques identifiées sous le N de l'American Type Culture Collection HB8913, caractérisé en ce qu'il se].ie à un site de déterminant cellulaire sur un antigène glycoprotéique de surface de cellules de carcinome pulmonaire humain 20 à cellules non petites, ledit antigène étant caractérisé par un poids moléculaire d'environ 110 000 da] tons, tel aue déterminé par électrophorèse sur gel de po].yacrylamide, et ayant la séquence amino terminale d'aminoacides suivante:

1 5 10 15 20

L.-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L

dans laquelle X représente un amino-acide non identifié, et les équivalents fonctionnels, fragments de liaison

et immunocomplexes dudit anticorps.

4. Anticorps monoclonal produit par une lignée cellulaire d'hybridome formée par fusion d'une cellule de myélome et d'une ce]lule capable de produire un anticorps, caractérisé en ce qu'il se lie à un déterminant sur un antigène glycoprotéique de surface de 35 cellules de carcinomes pulmonaires humains à cellules non petites, ledit antigâne ayant un poids molé.culaire d'environ 110 000 daltons, tel que déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, et ayant la séquence amino terminale d'amino-acides suivante! l 5 10 15 20

L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L

dans laquelle X représente un amino-acide non identifié, et les équivalents fonctionnels, fragments de liaison

et les immunb complexes dudit anticorps.

5. Anticorps monoclonal produit par la lignée cellulaire d'hybridome L20, identifiée sous le N de l'American Type Culture Collection HB8913, caractérisé en ce qu'il se lie à un déterminant d'un antigène glycoprotéique de surface de cellules de carcinome pulmonaire 15 humain à cellules non petites, ledit antigène ayant un poids moléculaire d'environ 110 000 daltons, tel que déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, et ayant la séquence amino terminale d'amino-acides suivante:

1 5 10 15 20

L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L

dans laquelle X représente un amino-acide non identifié, et les équivalents fonctionnels, fragments de liaison

et immuns complexes dudit anticorps.

6. Anticorps monoclonal suivant la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce au'il appartient à la classe des IgG, de préférence à la sous-classe IgG1.

7. Procédé de détection d'un carcinome pulmonaire à cellules non petites, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact l'anticorps monoclonal 30 suivant la revendication 1, 3, 4 ou 5 avec un échantillon

de tissu humain, et à détecter l'interaction dans l'échantillon dudit anticorps avec n'importe quelle cellule de carcinome d'antigénicité correspondante ou tout déterminant antigénique de cette cellule.

8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que le tissu humain est le tissu pulmonaire, l'interaction étant détectée de préférence

par coloration.immunohistologique.

9. Procédé de détection du carcinome pulmonaire à petites cellules, du carcinome de sein ou du carcinome du colon, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact l'anticorps monoclonal suivant la revendication 1, 3, 4 ou 5 avec un échantillon de tissu 10 humain, et à détecter l'interaction dans l'échantillon dudit anticorps avec n'importe quelle cellule de carcinome d'antigénicité correspondante ou tout déterminant

antigénique de cette cellule.

10. Antigène glycoprotéique sous une forme 15 fortement purifiée, caractérisé en ce qu'il est obtenu notamment à partir de cellules de carcinome pulmonaire humain à cellules non petites et possède un poids moléculaire d'environ 110 000 da]tons, tel que déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, et la séquence 20 amino terminale d'amino-acides suivante:

1 5 10 15 20

L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L

dans laquelle X représente un amino-acide non identifié,

et les immuns complexes de cet antigène.

11. Lignée cellulaire continue qui produit un anticorps monoclonal caractérisé par la capacité de se lier à un site de déterminant sur un antigène glycoprotéique de surface de cellules de carcinome pulmonaire humain à cellules non petites, caractérisée en ce qu'elle comprend un hybridome d'un lymphocyte 30 obtenu chez une sourie immunisée avec des cellules de

carcinome pulmonaire ou un de leurs déterminants antigéniaues et d'une cellule de myélome de souris.

12. Lignée cellulaire continue qui produit un anticorps monoclonal caractérisé par la capacité 35 de se lier à un site de déterminant sur un antigène glycoprotéique de surface de cellules de carcinome pulmonaire humain à cellules non petites, caractérisée en ce qu'elle comprend un hybridome d'un lymphocyte obtenu chez un sujet humain ayant un carcinome pulmonaire et d'une cellule de myélome.

13. Lignée cellulaire continue qui produit un anticorps monoclona] caractérisé par la capacité de se lier à un site de déterminant sur un anti.gène glycoDrotéique de surface de cellules de carcinome pulmonaire humain 10 à petites cellules, caractérisée en ce qu'elle comprend un hybridome d'un lymphocyte obtenu chez un sujet humain

ayant un carcinome pulmonaire et d'une cellule de myélome.

14. Lignée cellulaire continue qui produit 15 un anticorps monoclonal caractérisé par la capacité

de se lier à un site de déterminant sur un antigène glycoprotéique de surface de cellules de carcinome humain du sein, caractérisée en ce Qu'elle comprend un hybridome d'un lymphocyte obtenu chez un sujet humain ayant un 20 carcinome pulmonaire et d'une cellule de myélome.

15. Lignée cellulaire continue qui produit un anticorps monoclonal caractérisé par la capacité de se lier à un site de déterminant sur un antigène glycoprotéiaue de surface de cel]ules de carcinome humain 25 du colon, caractérisée en ce qu'elle comprend un hybridome d'un lymphocyte obtenu chez un sujet humain atteint

d'un carcinome pulmonaire et d'une cellule de myélome.

16. Lignée cellulaire d'hybridome L20, identifiée sous le numéro de l'American Type Culture Collec30 tion HB8913, formée par fusion d'une cellule de myélome de souris NS1 avec un splénocyte de souris obtenu chez une souris Ba]b/c immunisée avec des cellules de carcinome pulmonaire humain 3082, caractérisée en ce qu'elle produit un anticorps monoclonal qui se lie à un détermi35 nant d'un antigène glycoprotéique de surface de cellules de carcinome pulmonaire humain à cellules non petites, ayant un poids moléculaire d'environ 110 000 daltons et la séquence amino terminale d'amino-acides suivante:

1 5 10 15 20

IL-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L

dans laquelle X représente un amino-acide non identifié, tel que déterminé par électrophorése sur gel de polyacrylamide.

17. Lignée cellulaire continue qui produit 10 un anticorps monoclonal caractérisé par la capacité de se lier à un site de déterminant sur un antigène glycoprotéiaue de surface de cellules d'un carcinome pulmonaire humain à cellules non petites, ledit antigène ayant un poids moléculaire d'environ 110 000 dal15 tons et la séquence amino terminale d'aminoacides suivante:

1 5 10 15 20

L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L

dans laquelle X représente un amino-acide non identifié, 20 caractérisée en ce qu'elle comprend un hybridome d'un lymphocyte capable de produire un anticorps contre ledit

antigène et d'une cellule de myélome.

18. Procédé de production d'un anticorps monoclonal aui se lie à un site de déterminant sur 25 un antigène glycoprotéique à la surface de cellules de carcinome pulmonaire humain à cellules non petites, caractérisé en ce qu'il consiste: a) à faire se multiplier un hybridome ayant les caractéristiques identifiées sous le N de l'Ameri30 can Type Culture Collection HB 8913, obtenu par fusion (i) d'une cellule productrice d'anticorps obtenue à partir de la rate d'un animal immunisé présentant des épanchements pleuraux, de cellules cultivées ou de tissu pulmonaire d'un patient présentant un carcinome 35 pulmonaire à cellules non petites, avec (ii) une cellule de myélome; et

38 2596062

b) à recueillir les anticorps monoclonaux

produits par l'hybridome.

19. Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que la multiplication de l'hybridome 5 est effectuée in vivo et, de préférence, par injection à une souris BALB/c conditionnée au pristane et développement d'une tumeur d'ascite, et les anticorps monoclonaux sécrétés dans l'ascite sont purifiés par adsorption sur protéine A- sépharose ou filtration sur gel. 10

20. Procédé de production d'un anticorps monoclonal qui se lie à un site de déterminant sur un antigène glycoprotéique à la surface de cellules de carcinome pulmonaire humain à cellules non petites, caractérisé en ce qu'il consiste: a) à faire se multiplier unelignée cellulaire B transformée obtenue en immortalisant une cellule productrice d'anticorps obtenue à partir d'un patient présentant un carcinome pulmonaire à cellules non petites; et b) à recueillir les anticorps monoclonaux

produits par la lignée cellulaire B transformée.

21. Procédé de production d'un anticorps monoclonal qui se lie à un site de déterminant sur un antigène glycoprotéique à la surface de cellules 25 de carcinome pulmonaire humain à cellules non petites, caractérisé en ce qu'il consiste: a) à faire se multiplier un hybridome obtenu par fusion (i) d'une lignée cellulaire B transformée obtenue en immortalisant une cellule productrice d'anti30 corps obtenue à partir d'un patient présentant un carcinome pulmonaire à cellules non petites, avec (ii) une cellule de myélome; et

b) à recueillir l.es anticorps monoclonaux produits par l'hybridome.

39 2596062

22. Procédé suivant la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce que l'immortalisation est

effectuée par infection par le VEB.

23. Procédé suivant l'une quelconque des 5 revendications 18, 20 ou 21, caractérisé en ce que

l'anticorps monoclonal produit se lie à un site de déterminant sur un antigène glycoprotéique à la surface de cellules de carcinome pulmonaire humain à cellules non petites, l'antigène ayant un poids moléculaire 10 d'environ 110 000 daltons, tel que déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, et ayant la séquence amino-terminale d'amino-acides suivante:

1 5 10 15 20

L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L

dans laquelle X représente un amino-acide non identifié. 15

24. Procédé suivant la revendication 18 associée à la revendication 20, caractérisé en ce que J'hybridome consiste en la lignée cellulaire d'hybridome L20, identifiée sous le N de l'American Type Culture

Collection HB 8913.

25. Procédé suivant la revendication 23 ou 24, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal produit appartient à *la classe des IgG et notamment

à la sous-classe IgG1.

26. Procédé de production d'anticorps mono25 clonal qui se lie à un site de déterminant sur un antigène glycoprotéique à la surface de cellules de carcinome pulmonaire humain à cellules non petites, possédant un poids moléculaire d'environ 110 000 daltons, tel que déterminé par électrophorèse sur gel de poly30 acrylamide, et la séquence aminoterminale suivante:

1 5 10 15 20

L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L

dans laquelle X représente un amino-acide non identifié, caractérisé en ce qu'il consiste: a) à faire se multiplier la lignée cellulaire d'hybridome L20, identifiée sous le N de l'American Type Culture Collection HB 8913, obtenue par fusion (i) d'une cellule productrice d'anticorps obtenue à 5 partir de la rate d'une souris BABL/c immunisée avec des cellules de carcinome pulmonaire humain 3082, avec (ii) une cellule de myélome de souris NS1; et b) à recueillir les anticorps monoclonaux

produits par l'hybridome.

27. Procédé suivant l'une quelconque des

revendications 18, 20 ou 21, caractérisé en ce que

l'anticorps monoclonal se lie à un site de déterminant sur un antigène glycoprotéique à la surface de cellules de carcinome humain du sein ou de cellules-de carcinome 15 humain du colon.

28. Procédé de production d'un anticorps monoclonal aui se lie à un site de déterminant sur un antigène glycoprotéique à la surface de cellules de carcinome humain du sein ou de cellules de carcinome 20 humain du colon, caractérisé en ce qu'il consiste: a) à faire se multiplier un hybridome ayant les caractéristiques identifiées sous le N de l'American Type Culture Collection HB 8913, obtenu par fusion (i) d'une cellule productrice d'anticorps obtenue à 25 partir de la rate d'un animal immunisé présentant des épanchements pleuraux, de cellules cultivées ou de tissu pulmonaire d'un patient présentant un carcinome pulmonaire à cellules non petites, avec (ii) une cellule de myélome; et b) à recueillir les anticorps monoclonaux

produits par l'hybridome.

29. Procédé de détection de cellules malignes dans un échantillon suspecté de contenir lesdites cellules, caractérisé en ce qu'il consiste: a) à mettre en contact l'échantillon avec un anticorps monoclonal produit par le procédé suivant la revendication 18, 20, 21, 23 ou 24, dans des conditions réactionnelles choisies de manière à permettre 5 à l'anticorps monoclonal de se lier au site du déterminant; b) à éliminer de l'échantillon toutes les molécules d'anticorps monoclonal non liées; et c) à examiner l'échantillon pour détecter 10 la présence d'anticorps monoclonal lié, la liaison de l'anticorps monoclonal indiquant la présence de

cellules malignes dans l'échantillon.

30. Procédé suivant la revendication 29, caractérisé en ce que les cellules malignes comprennent 15 les cellules de carcinome pulmonaire à cellules non

petites, les cellules de carcinome du sein et les cellules de carcinome du colon, ou bien en ce que l'échantillon consiste en tissu pulmonaire.

31. Procédé suivant la revendication 29 20 ou 30, caractérisé en ce que la liaison est détectée

par coloration immunohistologique.

32. Médicament destiné à être administré à un patient humain dans un véhicule convenable, pour localiser in vivo des carcinomes pulmonaires humains 25 à cellules non petites par scintigraphie externe, tomographie d'émission ou exploration par balayage radionucléaire, caractérisé en ce qu'il est obtenu par purification de l'anticorps monoclonal produit par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 18, 30 20, 21, 23 ou 24, et radiomarquage de l'anticorps monoclonal.

33. Médicament utile en immunothérapie pour le traitement du carcinome pulmonaire à cellules non petites et destiné à être administré dans un véhi35 cule convenable à un patient humain présentant un carci-

42 2596062

nome pulmonaire, caractérisé en ce qu'il est obtenu par purification de l'anticorps monoclonal produit par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 18, 20, 21, 23 ou 24, et conjugaison de l'anti5 corps monoclonal avec un agent cytotoxique, une toxine

ou une substance pharmaceutique radioactive.

34. Médicament utile en immunothérapie, destiné au traitement de tumeurs effectuant --l].'expression de l'antigène défini par l'anticorps L20 et destiné 10 à être administré dans un véhicule convenable à un

patient humain présentant un carcinome pulmonaire, caractérisé en ce qu'il est obtenu par purification de l'anticorps monoclonal produit par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 18, 20, 21, 23 15 ou 24, et préparation d'anticorps anti-idiotypes contre

l'anticorps monoclonal.