FR2747387A1 - Moyens pour la detection de bacteries du genre taylorella et applications biologiques - Google Patents
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Abstract
L'invention se rapporte à des anticorps monoclonaux et à leurs applications biologiques. Ces anticorps monoclonaux sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope d'une bactérie de l'espèce T,equigenitalis.
Description
Moyens pour la détection de bactéries du genre Taylorella et applications biologiques.
L'invention a pour objet des moyens pour la détection de bactéries du genre Taylorella et leurs applications biologiques.
Elle vise en particulier la détection de T. equigenitalis et le traitement ou la prévention d'infections provoquées par des bactéries de cette espèce.
La première souche de T. equigenitalis a été isolée par Crowhurst, 1977, Vet. Rec. 100, 476 et caractérisée par Taylor et ai., 1978, Equine Vet. J. 10, 136-134.
Cette bactérie est l'agent d'une maladie vénérienne des équidés dénommée métrite contagieuse équine (désignée ciaprès par MCE).
Depuis le déclenchement de cette maladie en 1977 à
Newmarket (Grande-Bretagne), la MCE s'est répandue parmi la population équine dans le monde (Europe, USA, Japon).
Newmarket (Grande-Bretagne), la MCE s'est répandue parmi la population équine dans le monde (Europe, USA, Japon).
La MCE a été initialement caractérisée par l'apparition d'écoulements vaginaux purulents causés par une endométrite aiguë. L'épidémiologie et les manifestations cliniques de la maladie ont maintenant changé. I1 ne subsiste que quelques rares foyers présentant une forme aiguë de la MCE ; il s'agit alors de contaminations de plusieurs juments faisant partie d'un même harem. Les formes cliniques de métrite sont, en effet, devenues rares et T. equigenitalis est principalement trouvée chez des porteurs asymptomatiques ou au stade pré-clinique. La maladie est transmise par les étalons qui ne manifestent aucun symptôme clinique.
Un dépistage systématique des étalons et des juments est devenu obligatoire préalablement à chaque saison de monte.
Pour des raisons à la fois économiques et d'organisation, ce dépistage systématique ne peut se faire qu'à partir d'un ou de deux prélèvement(s) par animal et par saison. La fiabilité du dépistage en est donc d'autant plus cruciale.
Le test de dépistage d'une infection par T.
equigenitalis actuellement pratiqué en France repose principalement sur l'isolement de la bactérie par culture sur milieux nutritifs et/ou sélectifs et sur l'identification de cet agent selon des critères morphologiques et biochimiques. Or, T. equigenitalis est une bactérie très fragile et à très lente croissance (le délai d'observation des boites d'ensemencement est d'au moins 6 jours). Elle est, de plus, susceptible d'être inhibée par d'autres bactéries de la flore examinée. Les critères d'identification des différentes souches de equigenitalis sont eux-mêmes soit trop succincts et sujets à variations (mise en évidence d'absence d'activité pour les trois activités enzymatiques classiques que T. equigenitalis présente), soit trop lourds à gérer dans les délais requis. Le dépistage par la seule technique de bactériologie est donc devenu une méthode hasardeuse de diagnostic. Un pourcentage non déterminé de porteurs sains est ainsi chaque saison considéré comme non infecté.
Un second test de dépistage d'une infection par T.
equigenitalis a été retenu en France. Ce test est basé sur l'identification de la bactérie par immunofluorescence indirecte à l'aide d'antisérum fabriqué sur lapin et d'anticorps fluorescents antilapin. Ce test de dépistage présente l'avantage de livrer ses résultats beaucoup plus rapidement (24 à 48 heures) qu'un test par culture bactériologique.
L'utilisation de cette technique peut toutefois conduire à des erreurs par excès (faux positifs), les antisera utilisés donnant lieu, dans de nombreux cas, à des réactions avec des espèces autres que T.
equigenitalis
La portee de ces résultats est ainsi très restreinte: si le test d'immunofluorescence est négatif, le laboratoire agréé peut communiquer une conclusion négative, mais, si le resultat est positif, ce résultat doit être confirmé ou infirmé par la bactériologie.
La portee de ces résultats est ainsi très restreinte: si le test d'immunofluorescence est négatif, le laboratoire agréé peut communiquer une conclusion négative, mais, si le resultat est positif, ce résultat doit être confirmé ou infirmé par la bactériologie.
Les inventeurs ont recherché à remédier à ces difficultés de dépistage d'une infection par T.
equigenitalis, en élaborant de nouveaux moyens permettant d'identifier une bactérie de l'espèce T. equigenitalis sans risque ni de faux positifs, ni de faux négatifs. La présente invention présente également les avantages de la rapiditG et de la facilité d'exécution.
L'invention vise donc à fournir des moyens pour une détection spécifique, de grande fiabilité, de T.
equigenitalis, basés sur les reconnaissances de type antigène-anticorps défini.
Elle vise également l'utilisation de ces moyens pour le diagnostic, le traitement et la prophylaxie des maladies causées par T. equigenitalis.
Selon un premier aspect, les moyens de l'invention sont des anticorps monoclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope d'une bactérie de l'espèce T.
equigenitalis.
De manière avantageuse, ces anticorps ne présentent pas de réactions croisées avec un ou des épitopes d'une bactérie Taylorella d'une espèce différente ou d'une bactérie d'un genre différent. Ils permettent donc de détecter T. equigenitalis avec sûreté et, selon un aspect de grand intérêt, à l'aide d'un seul test
Les anticorps monoclonaux de l'invention (désignés ci-après par AcM en abrégé) sont également tels qu'obtenus à partir d'hybrides, par fusion de cellules de myélome murin non secrétrices avec des cellules spléniques issues de souris immunisées à l'aide d'une souche de l'espèce T. equlgenitalis inactivée ou d'extrait(s) d'une telle souche, clonage et sélection selon la propriété de leur surnageant de culture à reconnaître un ou des épitope(s) d'une bactérie de l'espèce T. equigenitalis, et récupération des anticorps recherchés, suivie le cas échéant de leur purification.
Les anticorps monoclonaux de l'invention (désignés ci-après par AcM en abrégé) sont également tels qu'obtenus à partir d'hybrides, par fusion de cellules de myélome murin non secrétrices avec des cellules spléniques issues de souris immunisées à l'aide d'une souche de l'espèce T. equlgenitalis inactivée ou d'extrait(s) d'une telle souche, clonage et sélection selon la propriété de leur surnageant de culture à reconnaître un ou des épitope(s) d'une bactérie de l'espèce T. equigenitalis, et récupération des anticorps recherchés, suivie le cas échéant de leur purification.
L'invention vise également les fragments des AcM définis ci-dessus, plus particulièrement leurs fragments
Fv, Fab, F(ab')2.
Fv, Fab, F(ab')2.
Les AcM de l'invention et, le cas échéant, leurs fragments, sont encore caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître des protéines de T. equigenitails du groupe comprenant des protéines telles que les protéines de 150, 120, 52,7 ou 22 (LPS) kDa.
Selon un deuxième aspect, les moyens de l'invention sont des protéines immunogènes caractérisées en ce qu'elles sont capables d'interagir avec lesdits AcM ou leurs fragments.
Ces protéines sont obtenues, grâce aux dits AcM ou à leurs fragments, à partir de T. equigenitalis . ou par voie de synthèse.
Selon un troisième aspect, les moyens de l'invention sont des anti-anticorps (désignés ci-après par anti-AcM en abrégé) et les fragments de ces anti-anticorps, ces anti-AcM et leurs fragments étant caractérisés en ce qu'ils sont capables d'interagir avec les AcM ou leurs fragments définis plus haut.
L'invention vise également des procédés d'obtention des moyens définis ci-dessus.
Pour produire les AcM de l'invention, ou les anti
AcM, on a avantageusement recours à la technique d'obtention d'hybridomes telle que décrite par Kohler et
Milstein dans Nature 1975, 256, 495-497.
AcM, on a avantageusement recours à la technique d'obtention d'hybridomes telle que décrite par Kohler et
Milstein dans Nature 1975, 256, 495-497.
L'invention vise donc un procédé d'obtention et de sélection des AcM définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend
- la fusion de cellules de myélome murin non sécrétrices avec des cellules spléniques issues de souris immunisées à l'aide d'une souche de l'espèce T.
- la fusion de cellules de myélome murin non sécrétrices avec des cellules spléniques issues de souris immunisées à l'aide d'une souche de l'espèce T.
equigenitalis ou d'extrait(s) d'une telle souche,
- le criblage à l'aide d'une technique de révélation, telle que, notamment, l'immunofluorescence indirecte, des hybridomes dont les surnageants de culture présentent une réaction positive avec une bactérie de l'espèce T. equigenitalis ou un fragment de celle-ci,
- le clonage de tels hybridomes, au regard de leur réactivité par rapport à T equigenitalis, et
- la récupération des AcM recherchés, suivie le cas échéant de leur purification.
- le criblage à l'aide d'une technique de révélation, telle que, notamment, l'immunofluorescence indirecte, des hybridomes dont les surnageants de culture présentent une réaction positive avec une bactérie de l'espèce T. equigenitalis ou un fragment de celle-ci,
- le clonage de tels hybridomes, au regard de leur réactivité par rapport à T equigenitalis, et
- la récupération des AcM recherchés, suivie le cas échéant de leur purification.
L'invention vise également l'application de la technique ci-dessus pour la production d'anticorps anti
AcM.
AcM.
On utilise dans ce cas des cellules spléniques de souris immunisées au préalable à l'aide des AcM déjà définis. Les souches clonées peuvent être conservées dans de l'azote liquide et leurs surnageants de culture à 20il. Ces souches qui sont caractérisées par le fait qu'elles sont capables de produire des AcM ou respectivement des anti-AcM, tels que définis ci-dessus, entrent également dans le cadre de l'invention. De manière générale, l'invention vise les souches d'hybridomes telles qu'obtenues selon les procédés définis plus haut.
Les fragments des AcM et les anti-AcM peuvent être aisément obtenus à l'aide des techniques enzymatiques conventionnelles.
Avec les trois aspects définis ci-dessus, à savoir les AcM ou leurs fragments, les protéines immunogenes, et les anti-AcM ou leurs fragments, l'invention fournit les moyens pour établir, soit directement, soit indirectement, une contamination éventuelle d'un échantillon ou d'une culture avec une bactérie de l'espèce de T. equigenitalis.
Dans le cadre d'une telle détermination, l'invention vise une méthode d'identification d'une bactérie de l'espèce T. equigenitalis ou d'un ou plusieurs épitopes d'une telle bactérie dans un échantillon ou dans une culture, caractérisée en ce qu'elle comprend
- la mise en contact de l'échantillon ou de la culture à analyser, susceptible de renfermer T.
- la mise en contact de l'échantillon ou de la culture à analyser, susceptible de renfermer T.
equigenitalis, avec une quantité efficace d'au moins un
AcM ou un fragment d'AcM, ou en variante, pour mettre en évidence la présence d'anticorps dirigés contre T.
AcM ou un fragment d'AcM, ou en variante, pour mettre en évidence la présence d'anticorps dirigés contre T.
equigenitalis, une quantité efficace d'une protéine immunogène ou d'anticorps anti-AcM, ou de fragments de ce dernier, tels que définis ci-dessus,
- la révélation du produit de réaction de type antigène-anticorps éventuellement formé.
- la révélation du produit de réaction de type antigène-anticorps éventuellement formé.
L'étape de mise en contact est réalisée dans des conditions notamment de durée, température, tampon, permettant l'établissement d'une réaction de type antigène-anticorps. Pour la révélation, on utilise des marqueurs, par exemple des marqueurs fluorescents, enzymatiques, radioactifs ou luminescents.
On remarquera que le choix judicieux d'un AcM particulier, ou d'un fragment de cet AcM, permet d'identifier directement un épitope donné de T.
equigenitalis dans un échantillon ou une culture à analyser. En utilisant une protéine immunogène ou un anticorps anti-AcM ou un fragment de ce dernier, on mettra en évidence un contact préalable de l'échantillon ou de la culture avec la bactérie.
L'absence de réactions croisées des AcM de l'invention et de leurs fragments avec des épitopes de bactéries du genre Taylorella autres que T.
equigenitalis, et de bactéries d'un genre différent, est avantageusement mise à profit pour le diagnostic de pathologies liées à T. equigenitalis.
L'invention vise donc également l'utilisation desdits AcM et de leurs fragments pour le diagnostic d'une infection par T. equigenitalis, plus particulièrement de la métrite equine contagieuse, caractérisée en ce qu'elle comprend
- la mise en contact d'un ou plusieurs AcM de l'invention, ou de leurs fragments, avec un prélèvement biologique, et
- la révélation de la réaction du type antigene- anticorps produite dans le cas de la présence de T.
- la mise en contact d'un ou plusieurs AcM de l'invention, ou de leurs fragments, avec un prélèvement biologique, et
- la révélation de la réaction du type antigene- anticorps produite dans le cas de la présence de T.
equigenitalis dans le prélèvement.
Les étapes de mise en contact et de révélation sont avantageusement mises en oeuvre comme indiqué pour la méthode précédente.
L'invention fournit également des kits pour la mise en oeuvre des méthodes d'identification et des méthodes de diagnostic décrites ci-dessus.
Ces kits sont caractérisés en ce qu'ils renferment
- un ou plusieurs Ac ou leurs fragments ou au moins une protéine immunogène, ou un ou plusieurs anti-AcM ou leurs fragments,
- les réactifs, notamment les marqueurs ou tampons, permettant la révélation de la réaction immunologique visée, avec une notice d'utilisation.
- un ou plusieurs Ac ou leurs fragments ou au moins une protéine immunogène, ou un ou plusieurs anti-AcM ou leurs fragments,
- les réactifs, notamment les marqueurs ou tampons, permettant la révélation de la réaction immunologique visée, avec une notice d'utilisation.
Selon une autre disposition avantageuse de l'invention, les AcM et leurs fragments définis ci-dessus sont utilisables en thérapeutique pour lutter contre une infection par T. equigenitalis, et plus particulièrement contre la métrite équine contagieuse.
L'invention vise ainsi également des compositions pharmaceutiques renfermant un ou plusieurs
AcM, ou leurs fragments, définis ci-dessus, comme vecteurs de médicaments ou comme agents d'immunothérapie passive, en association avec des véhicules pharmaceutiquement inertes. Elle vise également leur utilisation pour l'élaboration de biocapteurs.
AcM, ou leurs fragments, définis ci-dessus, comme vecteurs de médicaments ou comme agents d'immunothérapie passive, en association avec des véhicules pharmaceutiquement inertes. Elle vise également leur utilisation pour l'élaboration de biocapteurs.
Selon encore une autre disposition, l'invention vise l'utilisation des protéines immunogènes et des anti-AcM ou leurs fragments pour l'élaboration de compositions vaccinales préventives d'une infection par T.
equigenitalis.
Les compositions vaccinales de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles renferment au moins une protéine immunogène ou un anti-AcM ou leurs fragments, tels que définis ci-dessus, en quantité suffisante pour susciter une réponse immunitaire, en association avec des excipients physiologiquement acceptables.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent.
Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 3, qui représentent respectivement - la figure 1 représente une photo d'un test IIF (immunofluorescence indirecte) sur T. equigenitalis en présence d'AcM selon l'invention, - la figure 2, une photo d'un immunoblot après réaction de protéines de T. equigenitalis avec des AcM de l'invention et du sérum de souris immunisée (sérum positif), - la figure 3, une photo d'un dot blot réalisé sur les protéines non dénaturées d'une souche de T. equigenitalis de référence et mises à incuber avec les AcM selon l'invention, un sérum positif de souris(@@)ou un sérum négatif de Souris(Wsouris non immunisée).
Exemple 1 : Obtention et selection d'hybridomes capables de produire des anticorps monoclonaux anti-T.
equigeni Lai is - souches de T. equigenitalis utilisées pour 1'immunisation
On rapporte les résultats obtenus avec les neuf souches suivantes
- deux souches de références (R1-16 et R2-19), provenant du Centre National d'Etudes Vétérinaires et
Alimentaires - Laboratoire Central de Recherches
Vétérinaires CNEVA-LCRV, Maisons-Alfort, France,
- sept souches dites souches sauvages isoles dans quatre régions différentes du
Nord-Ouest de la France (Indre et Loire,
Calvados, Côtes d'Armor et Orne).
On rapporte les résultats obtenus avec les neuf souches suivantes
- deux souches de références (R1-16 et R2-19), provenant du Centre National d'Etudes Vétérinaires et
Alimentaires - Laboratoire Central de Recherches
Vétérinaires CNEVA-LCRV, Maisons-Alfort, France,
- sept souches dites souches sauvages isoles dans quatre régions différentes du
Nord-Ouest de la France (Indre et Loire,
Calvados, Côtes d'Armor et Orne).
Ces souches sont identifiées dans le tableau I ciaprès
TABLEAU I
Désignation de Sources Résistance à la la souche streptomycine
Rl-16/16 CNEVA S
R2-19/19 CNEVA R 1/ 129S LVD37 R 2/ 1 LVD14 R 3/ 12.397 LDA22 R 4/ 26.658 LDA22 R 5/ 7001-01 LDA22 R 6/ 250 LVD61 R 7/ 715 LVD61 R
S = sensible
R = résistante
Toutes ces souches sont cultivées sur des géloses d'agar chocolat avec ou sans addition d'actidione et de streptomycine. Elles sont incubées sous atmosphère humide à 7 % de CO2.
TABLEAU I
Désignation de Sources Résistance à la la souche streptomycine
Rl-16/16 CNEVA S
R2-19/19 CNEVA R 1/ 129S LVD37 R 2/ 1 LVD14 R 3/ 12.397 LDA22 R 4/ 26.658 LDA22 R 5/ 7001-01 LDA22 R 6/ 250 LVD61 R 7/ 715 LVD61 R
S = sensible
R = résistante
Toutes ces souches sont cultivées sur des géloses d'agar chocolat avec ou sans addition d'actidione et de streptomycine. Elles sont incubées sous atmosphère humide à 7 % de CO2.
Les analyses de réaction enzymatique et de fermentation de sucre sont effectuees à l'aide du système
API-NH (BioMérieux, Marcy-l'Etoile, France).
API-NH (BioMérieux, Marcy-l'Etoile, France).
En outre, ces souches sont testées pour leur activité catalase, cytochrome-oxydase et par le test d'agglutination du sérum (SAT), en utilisant un antisérum polyclonal de lapin.
La plupart d'entre elles presentent
- une forme cocobacillaire à Gram négatif,
- une activité catalase et cytochrome oxydase, et
- elles répondent positivement au test d'agglutination SAT.
- une forme cocobacillaire à Gram négatif,
- une activité catalase et cytochrome oxydase, et
- elles répondent positivement au test d'agglutination SAT.
On constate qu'elles présentent toutes
- une activité phosphatase alcaline et gamma glutamyl transférase positives (excepte la souche de terrain 5 qui présente une activité gamma glutamyl transférase négative),
- des activités pénicillinase, ornithinedécarboxylase, uréase, lipase, bêtagalactosidase et proline-amylase négatives. On constate également qu'elles ne métabolisent pas les sucres (glucose, fructose, maltose, saccharose).
- une activité phosphatase alcaline et gamma glutamyl transférase positives (excepte la souche de terrain 5 qui présente une activité gamma glutamyl transférase négative),
- des activités pénicillinase, ornithinedécarboxylase, uréase, lipase, bêtagalactosidase et proline-amylase négatives. On constate également qu'elles ne métabolisent pas les sucres (glucose, fructose, maltose, saccharose).
En outre, elles présentent des profils polypeptidiques et lipopolysaccharidiques très similaires.
Les deux souches de référence Rl-16 et R2-19 présentent donc les propriétés généralement observées pour l'ensemble des souches de T. equigenitalis étudiees dans l'art antérieur et sont donc utilisées pour l'immunisation de souris.
- immunisation de souris
Les souches de référence R1-16 et R2-19 sont lavées deux fois dans du tampon PBS 0,1 X, pH 7,4 et inactivées par chauffage à 56iC pendant 75 min. Les cellules sont alors diluées dans le PBS, jusqu'à l'obtention de suspensions bactériennes de densité optique 0,77 à 380 nm. Elles sont ensuite réparties en portions aliquotes et stockees à -80iC jusqu'à utilisation.
Les souches de référence R1-16 et R2-19 sont lavées deux fois dans du tampon PBS 0,1 X, pH 7,4 et inactivées par chauffage à 56iC pendant 75 min. Les cellules sont alors diluées dans le PBS, jusqu'à l'obtention de suspensions bactériennes de densité optique 0,77 à 380 nm. Elles sont ensuite réparties en portions aliquotes et stockees à -80iC jusqu'à utilisation.
On injecte par voie intra-péritonéale, à des souris adultes BALB/C 0,5 ml de suspension bactérienne R1-16 et
R2-19 émulsifiées avec l'adjuvant complet de Freund (2 souris par souche). Une injection de rappel est effectuee au 14ème jour avec la même préparation. Au 21ème jour, les souris sont immunisées avec 0,2 ml de suspension sans adjuvant par voie intra-veineuse et les cellules spléniques sont recueillies 2 jours plus tard.
R2-19 émulsifiées avec l'adjuvant complet de Freund (2 souris par souche). Une injection de rappel est effectuee au 14ème jour avec la même préparation. Au 21ème jour, les souris sont immunisées avec 0,2 ml de suspension sans adjuvant par voie intra-veineuse et les cellules spléniques sont recueillies 2 jours plus tard.
- production d'hybridomes
Les hybridomes sont produits selon la procédure standard décrite par Kohler et Milstein (voir référence ci-dessus).
Les hybridomes sont produits selon la procédure standard décrite par Kohler et Milstein (voir référence ci-dessus).
Des cellules de myelomes de souris SP2-0-Agl4 et des cellules spléniques immunes sont fusionnées dans un rapport 1/5 en utilisant du PEG 1500 (Sigma, l'Isle d'Abeau, France) et maintenues dans des plaques de cultures cellulaires à 96 puits contenant des macrophages de souris ou des cellules nourricières de rate ou un supplément OPI (Sigma) dans un milieu selectif HAT-DMEM.
Une croissance d'hybridome est observée dans 820 des 1020 puits utilisés (81,37 %). On réalise les tests IIF sur 60 de ces 820 puits pour detecter les hybridomes producteurs des anticorps monoclonaux recherchés.
- criblage des hybridomes et des anticorps monoclonaux produits
Les hybridomes sont testés par immunofluorescence indirecte (IIF) pour la capacite de leurs surnageants à reconnaître les deux souches de référence de T.
Les hybridomes sont testés par immunofluorescence indirecte (IIF) pour la capacite de leurs surnageants à reconnaître les deux souches de référence de T.
equigenitalis. On utilise la procédure standard décrite par Vaissaire et al. (1992), Bull. Acad. Vet. Fr. 65, 161-170.
Après deux lavages dans PBS 0,1 M, pH 7,4, les souches bactériennes sont remises en suspension dans le tampon PBS contenant, de plus, 1 % de formaldehyde afin d'obtenir une suspension ayant une turbidité de 1 dans l'échelle de Mac Farland.
On applique 10 Nil de cette suspension sur chaque spot de lamelles fluorescentes.
Après séchage 15 min à 37-C, les lamelles sont fixées dans de l'acétone pur pendant 15 min à température ambiante.
Après séchage, les lamelles sont mises à incuber avec 40 Nil de surnageants d'hybridomes, pendant 30 min à 37-C.
Les lamelles sont ensuite lavées dans un bain de PBS sous agitation pendant 15 min. Après rinçage dans de l'eau distillée et séchage, les lamelles sont incubees 30 min à 37*C avec 40 Nil d'une solution d'isothiocyanate de fluorescéine conjugué à la fraction F (ab) 2 de lapin anti souris (Eurobio Les Ulis, France), dilué à 1/40 dans
PBS contenant du bleu Evans (1/10000).
PBS contenant du bleu Evans (1/10000).
Les lamelles sont enfin lavées dans du PBS, rincées dans de l'eau distillée, séchées comme indiqué ci-dessus, montées dans du PBS renfermant 1 % de glycérine et examinées à l'aide d'un microscope à fluorescence.
On utilise un sérum de souris non immunisée comme témoin négatif. Le conjugué d'anti-sérum de souris FITC est incubé avec chaque souche bactérienne pour servir de témoin de conjugué.
Les clones positifs au test IIF sont transférés pour expansion avant clonage dans des plaques à 24 puits contenant le milieu HAT-DMEM.
On rapporte sur la figure 1 un test IIF sur T.
equigenitalis en présence d'AcM selon l'invention. Cette figure montre une forte fluorescence de la paroi bactérienne.
4 à 7 jours plus tard, les hybridomes de ces puits sont clonés par la méthode de dilution limite afin d'obtenir une cellule unique par puits dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits en utilisant le milieu HT
DMEM et des cellules nourricières. Les puits contenant un seul clone sont criblés par IIF et les cellules positives sont congelées dans de l'azote liquide.
DMEM et des cellules nourricières. Les puits contenant un seul clone sont criblés par IIF et les cellules positives sont congelées dans de l'azote liquide.
Parmi l'ensemble des clones positifs 14 d'entre eux sont utilisés pour la production d'anticorps monoclonaux et la caractérisation de ces anticorps.
Les surnageants de cultures tissulaires d'hybridomes sont tamponnes par addition de Tris 1M, pH 8,0 (vol.
1/20) et de l'azide de sodium (0,02 %). Des préparations aliquotes sont effectuées et stockées à -20*C.
Exemple 2 : Caractérisation des anticorps monoclonaux anti-T. equigenitalis - spécificité des anticorps monoclonaux
Afin de vérifier la spécificité des anticorps monoclonaux, les surnageants des 14 clones d'hybridomes obtenus selon l'exemple 1 sont testés par IIF selon la capacite de leurs surnageants à reconnaître d'autres souches bactériennes que les deux souches de référence R16 et R-19 utilises pour l'immunisation, à savoir
- les 7 souches sauvages de T. equigenitalis décrites dans l'exemple 1, et
- des souches bactériennes décrites dans l'art antérieur comme donnant lieu à des réactions croisées avec les anti-sérums de T. equigenitails ou couramment présentes dans la flore génitale : Actinobacillus equuli,
Pseudomonas aeruginosa, Pasteurella multocida,
Pasteurella haemolytica, Streptococcus equi,
Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas fluorescens et Klebsiella pneumoniae. Ces bactéries sont cultivées sur un milieu sang-agar base Columbia.
Afin de vérifier la spécificité des anticorps monoclonaux, les surnageants des 14 clones d'hybridomes obtenus selon l'exemple 1 sont testés par IIF selon la capacite de leurs surnageants à reconnaître d'autres souches bactériennes que les deux souches de référence R16 et R-19 utilises pour l'immunisation, à savoir
- les 7 souches sauvages de T. equigenitalis décrites dans l'exemple 1, et
- des souches bactériennes décrites dans l'art antérieur comme donnant lieu à des réactions croisées avec les anti-sérums de T. equigenitails ou couramment présentes dans la flore génitale : Actinobacillus equuli,
Pseudomonas aeruginosa, Pasteurella multocida,
Pasteurella haemolytica, Streptococcus equi,
Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas fluorescens et Klebsiella pneumoniae. Ces bactéries sont cultivées sur un milieu sang-agar base Columbia.
Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau II ci-après.
TABLEAU @I
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Les 14 anticorps monoclonaux testés reconnaissent les sept souches sauvages de T. equigenitalis. 3 d'entre eux donnent une réponse plus faiblement positive, à savoir 7B7.1 ; 7B7.10 et 10C9.6.
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Aucun des 14 anticorps monoclonaux testés ne reconnaît une des 8 souches bactériennes qui n'appartiennent pas à l'espèce T. equigenitails.
Ces résultats démontrent la spécificité des 14 anticorps monoclonaux testés envers les souches de T.
equigenitails et l'abscence de réactivité croisée entre
T. equigenitalis et d'autres bactéries, n'appartenant pas à l'espèce T. equigenîtails, et, soit ayant été décrites avec les outils de l'art antérieur comme présentant une réactivité croisée avec cette espèce (Actinobacillus equuii, Pasteurella multocida, Pasteurella haemoiytica,
Straphylococcus aureus, Pseudomonas fluorescens) soit faisant partie de la flore génitale courante (Streptococcus equi, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa).
T. equigenitalis et d'autres bactéries, n'appartenant pas à l'espèce T. equigenîtails, et, soit ayant été décrites avec les outils de l'art antérieur comme présentant une réactivité croisée avec cette espèce (Actinobacillus equuii, Pasteurella multocida, Pasteurella haemoiytica,
Straphylococcus aureus, Pseudomonas fluorescens) soit faisant partie de la flore génitale courante (Streptococcus equi, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa).
Les réactions positives de l'antisérum polyclonal de lapin observées en IIF avec Staphylococcus aureus et
Pseudomonas fluorescens n'ont donc pas été observées avec les anticorps monoclonaux de l'invention.
Pseudomonas fluorescens n'ont donc pas été observées avec les anticorps monoclonaux de l'invention.
Les anticorps monoclonaux objet de la présente demande ne détectent pas de différence antigénique entre les différentes souches de T. equigenitalis testées.
- SAT (Serum Agglutination Test)
Pour tester la réactivité des anticorps monoclonaux au SAT, seule la souche R-19 a été utilisée.
Pour tester la réactivité des anticorps monoclonaux au SAT, seule la souche R-19 a été utilisée.
Les résultats obtenus sont donnés dans la colonne 4 du tableau III ci-après.
13 des 14 anticorps monoclonaux donnent une réponse positive.
TABLEAU III
Désignation <SEP> @@F <SEP> SAT <SEP> Immunoblot <SEP> Dot <SEP> blot <SEP> Dot <SEP> blot <SEP> Spécificité <SEP> Isotype
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<tb> 10 <SEP> 10C4.17 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> IgG3
<tb> 11 <SEP> 10C9.6 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> IgG2b
<tb> 12 <SEP> 11C9.1 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 120 <SEP> IgG2b
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<tb> 14 <SEP> 11C9.5 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 22 <SEP> (LPS) <SEP> IgG2b
<tb> - localisation d'épitopes specifiques
préparation des extraits protéiques et
lipopolysaccharidiques de la souche R-19 de T.
<tb> N <SEP> avec <SEP> sans <SEP> monoclonale
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<tb> 1 <SEP> 3B6.1 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 150 <SEP> IgM
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<tb> - localisation d'épitopes specifiques
préparation des extraits protéiques et
lipopolysaccharidiques de la souche R-19 de T.
equigenitalis
- Extrait en conditions non dénaturantes (EN) de T.
- Extrait en conditions non dénaturantes (EN) de T.
equigenitalis
Les cellules de T. equigenitalis ont été récoltées par centrifugation (6000 g, 10 min) et lavées trois fois dans une solution de PBS 0,1 M à pH 7,4. Les culots ont été remis en suspension dans un petit volume de tampon
SDS (sodiumdodécylsulfate à 2 %, PBS pH = 7,4) et mis à incuber à 37iC pendant 30 min. A la suite de ce procédé, les protéines conservent leur activité biologique. Après extraction dans le tampon SDS, l'intégrité des cellules a été contrôlée par observations en microscopie à contraste de phases. Après centrifugation (10000 g, 10 min), les surnageants contenant EN ont été complètement dialysés contre de l'eau distillée à 4-C pendant 48 h, répartis en aliquotes et conservés à l'état congelé (-80iC) jusqu'à utilisation. La concentration en protéines de EN a été déterminée à l'aide du test protéique BioRad (BioRad,
Ivry-sur-Seine, France).
Les cellules de T. equigenitalis ont été récoltées par centrifugation (6000 g, 10 min) et lavées trois fois dans une solution de PBS 0,1 M à pH 7,4. Les culots ont été remis en suspension dans un petit volume de tampon
SDS (sodiumdodécylsulfate à 2 %, PBS pH = 7,4) et mis à incuber à 37iC pendant 30 min. A la suite de ce procédé, les protéines conservent leur activité biologique. Après extraction dans le tampon SDS, l'intégrité des cellules a été contrôlée par observations en microscopie à contraste de phases. Après centrifugation (10000 g, 10 min), les surnageants contenant EN ont été complètement dialysés contre de l'eau distillée à 4-C pendant 48 h, répartis en aliquotes et conservés à l'état congelé (-80iC) jusqu'à utilisation. La concentration en protéines de EN a été déterminée à l'aide du test protéique BioRad (BioRad,
Ivry-sur-Seine, France).
- Extrait en conditions dénaturantes ED
Les extraits EN des souches de T. equigenitalis ont été dissouts dans un solvant échantillon (Tris.HCl 0,1 M pH 6,8 ; glycérol 10 % @ SDS 2 % ; -mercaptoethanol 2 mM et bleu de bromophénol 0,01 %) afin d'obtenir une concentration en protéines de 1 mg/ml, puis ont été portés à ébullition à l00C pendant 5 min (extrait en conditions dénaturantes de T. equigenitails, ED).
Les extraits EN des souches de T. equigenitalis ont été dissouts dans un solvant échantillon (Tris.HCl 0,1 M pH 6,8 ; glycérol 10 % @ SDS 2 % ; -mercaptoethanol 2 mM et bleu de bromophénol 0,01 %) afin d'obtenir une concentration en protéines de 1 mg/ml, puis ont été portés à ébullition à l00C pendant 5 min (extrait en conditions dénaturantes de T. equigenitails, ED).
- Extrait lipopolysaccharidique (LPS)
Des extraits EN digérés par la protéinase K ont été utilisés comme extraits LPS (Hanner et al., 1991 Am. J.
Des extraits EN digérés par la protéinase K ont été utilisés comme extraits LPS (Hanner et al., 1991 Am. J.
Vet. Res. 52,1065-1068). 10 l de EN ont été dilués dans 35 Ni1 du tampon de digestion pour LPS. Ce tampon de digestion pour LPS est constitué de 0,0625 M Tris.HCl pH 6,8 ; 0,1 SDS ; 10 % glycérol et de 5 ug de protéinase-K (Sigma). Ces préparations ont été incubées à 57*C pendant 1 heure et chauffées à 100 C pendant 5 min avant électrophorèse.
- électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodecylsulfate de sodium (SDS - PAGE)
Pour la séparation des protéines bactériennes, une électrophorèse discontinue SDS-PAGE a été utilisée (Laemmli, 1970, Nature, 227, 680-685). Le gel de séparation contenait 12 % d'acrylamide et le gel de staking 4 % d'acrylamide. 20 Nil de chaque échantillon ED ont été déposés au fond des puits à une concentration équivalente à 5 ,ug de protéines par piste.
Pour la séparation des protéines bactériennes, une électrophorèse discontinue SDS-PAGE a été utilisée (Laemmli, 1970, Nature, 227, 680-685). Le gel de séparation contenait 12 % d'acrylamide et le gel de staking 4 % d'acrylamide. 20 Nil de chaque échantillon ED ont été déposés au fond des puits à une concentration équivalente à 5 ,ug de protéines par piste.
L'électrophorèse a été réalise à 100 V, 50 mA (courant continu) pendant 10 h dans une unité verticale de plaques pour gel (Hoefer Scientific Instr., San Francisco, CA).
Pour les déterminations de poids moléculaire, un kit destiné à la calibration des faibles poids moléculaires (Pharmacia-Biotech, Saint-Quentin en Yvelines, France) a été utilisé. Pour visualiser les bandes sur la matrice de polyacrylamide, on a utilise la coloration au Coomasie
R350 (Pharmacia-Biotech, France) et pour la visualisation des composants LPS, la coloration argentique (Tsai et
Frasch, 1982 Anal. Biochem. 199, 115-119).
R350 (Pharmacia-Biotech, France) et pour la visualisation des composants LPS, la coloration argentique (Tsai et
Frasch, 1982 Anal. Biochem. 199, 115-119).
- immunoblotting
Les bandes de protéines ont été transferrées du gel sur une membrane Immobilon PVDF (Millipore Corp., St
Quentin en Yvelines, France) par électroblotting à l'aide d'une cellule de transfert électrophorétique MiniTrans
Blot (BioRad) avec une solution tampon de transfert (Tris 25 mM ; glycine 192 mM ; méthanol 20 % v/v ; pH = 8,3) à 100 V, 250 mA pendant 1 heure. Pour vérifier les conditions de transfert électrophorétique et pour identifier les bandes protéiques sur les membranes, on a utilisé la coloration des protéines totales par l'or colloïdal (BioRad, Colloidal Gold Total Protein Stain).
Les bandes de protéines ont été transferrées du gel sur une membrane Immobilon PVDF (Millipore Corp., St
Quentin en Yvelines, France) par électroblotting à l'aide d'une cellule de transfert électrophorétique MiniTrans
Blot (BioRad) avec une solution tampon de transfert (Tris 25 mM ; glycine 192 mM ; méthanol 20 % v/v ; pH = 8,3) à 100 V, 250 mA pendant 1 heure. Pour vérifier les conditions de transfert électrophorétique et pour identifier les bandes protéiques sur les membranes, on a utilisé la coloration des protéines totales par l'or colloïdal (BioRad, Colloidal Gold Total Protein Stain).
Après transfert, les membranes ont été immergées pendant 30 min dans une solution bloquante (gélatine 3 % dans
Tris 20 mM et NaCl 0,5 M) et rincées sous douce agitation dans une solution de lavage (Tris 20 mM ; NaCl, 0,5 M
TweenR 20 0,05 ).
Tris 20 mM et NaCl 0,5 M) et rincées sous douce agitation dans une solution de lavage (Tris 20 mM ; NaCl, 0,5 M
TweenR 20 0,05 ).
Les membranes ont alors été mises en contact avec des solutions d'anticorps monoclonaux diluées de 1/100 à 1/1000 dans le tampon pour anticorps (Tris 20 mM ; NaCl 0,5 M, Tween 20 0,05 R gélatine 1 %) pendant 180 min à 25C.
La fixation des anticorps monoclonaux aux bandes peptidiques a été visualisée à l'aide de phosphatases alcalines (PA) conjuguées à des immunoglobulines IgG de chèvre (chaînes lourdes et légères) anti-souris (BioRad, dilution à 1/2000) et à l'aide d'une solution substrat pour PA (BioRad).
Un sérum positif provenant de souris immunisées avec une souche de référence de T. equigenitalis et un sérum négatif issu de souris non immunisées ont été utilisés comme témoins expérimentaux. La figure 2 illustre un immunoblot entre les protéines bactériennes et les AcM selon l'invention d'une part et le sérum positif de souris d'autre part.
Le sérum positif collecté de souris immunisées réagit avec 5 protéines de la souche R-19 : 120 kDA 52,7 kDA ; 33, 4 kDA ; 17,5 kDA et 22 (LPS) kDA.
8 des 14 anticorps monoclonaux testés réagissent positivement et 6 d'entre eux négativement. Les épitopes spécifiques reconnus par ces 8 anticorps monoclonaux réagissant positivement sont
150 kDa (LPS) pour l'anticorps monoclonal 3B6.1,
120 kDa (LPS) pour l'anticorps monoclonal llC9.1,
52,7 kDa (LPS) pour les anticorps monoclonaux 7B8.1 et 7C4.10,
22 kDa (LPS) pour les anticorps monoclonaux 7B7.10, 7D7.3, llC9.4 et llC9.5
Ces résultats sont également rassemblés dans le tableau III, colonnes 5 et 8.
150 kDa (LPS) pour l'anticorps monoclonal 3B6.1,
120 kDa (LPS) pour l'anticorps monoclonal llC9.1,
52,7 kDa (LPS) pour les anticorps monoclonaux 7B8.1 et 7C4.10,
22 kDa (LPS) pour les anticorps monoclonaux 7B7.10, 7D7.3, llC9.4 et llC9.5
Ces résultats sont également rassemblés dans le tableau III, colonnes 5 et 8.
- dot-blotting
Des membranes Immobilon PVDF (Sigma) ont été préhumidifiées avec une solution de méthanol à 100 % pendant 1 à 3s, immergées dans de l'eau distillée pendant 1-2 min afin diluer le méthanol et équilibrées dans une solution de lavage (Tris 20 mM ; NaCI 500 mM ; Tween 20 0,05 % pH = 7,5). Les extraits EN et ED ont été fixés aux membranes par incubation pendant 1 heure à température ambiante. Les membranes dot ont été lavées deux fois pendant 10 min dans la solution de lavage puis immergées dans la solution bloquante (gélatine 3 g dans Tris 20 mM et NaCl 500 mM) pendant 1 heure. Les membranes ont été lavées deux fois comme précédemment et incubees avec les anticorps monoclonaux sélectionnés dans les mêmes conditions que pour l'immunoblotting.
Des membranes Immobilon PVDF (Sigma) ont été préhumidifiées avec une solution de méthanol à 100 % pendant 1 à 3s, immergées dans de l'eau distillée pendant 1-2 min afin diluer le méthanol et équilibrées dans une solution de lavage (Tris 20 mM ; NaCI 500 mM ; Tween 20 0,05 % pH = 7,5). Les extraits EN et ED ont été fixés aux membranes par incubation pendant 1 heure à température ambiante. Les membranes dot ont été lavées deux fois pendant 10 min dans la solution de lavage puis immergées dans la solution bloquante (gélatine 3 g dans Tris 20 mM et NaCl 500 mM) pendant 1 heure. Les membranes ont été lavées deux fois comme précédemment et incubees avec les anticorps monoclonaux sélectionnés dans les mêmes conditions que pour l'immunoblotting.
La fixation des anticorps monoclonaux aux membranes de dot blot a été révélée à l'aide de PA conjuguées à des immunoglobines IgG de chèvre (chaînes lourdes et légères) anti-souris et à l'aide d'une solution substrat pour PA (BioRad).
Les mêmes sérums, témoins positifs et négatifs, ont été utilisés tout comme pour l'immunoblotting.
Pour déterminer si les résultats négatifs observés sur l'immunoblotting sont dus au fait que les épitopes ont été endommagés par les réactifs dénaturants utilisés pour preparer les extraits, les 14 anticorps monoclonaux sont confrontés en dot-blot aux extraits EN et ED de la souche R-19.
Sur la figure 3, on rapporte en dot blot les protéines de R19 ayant réagi sur les pistes 1 à 14 avec les AcM du tableau III, sur la piste SP avec le sérum positif de souris et sur la piste SN avec le sérum négatif de souris. Les résultats obtenus sont également rassemblés dans le tableau III, colonnes 6 et 7.
Les 6 anticorps qui présentent un immunoblot négatif presentent également un dot-blot négatif avec les extraits dénatures de la souche R-19 (Tableau III, colonnes 5 et 6). Ils présentent cependant un dot-blot positif avec les extraits non dénatures (Tableau III, colonne 7).
En conditions non dénaturantes (traitement au SDS seulement), la conformation et l'activité des protéines restent intactes mais, sous des conditions réductrices (traitement au -mercaptoethanol et hautes températures), la conformation de certaines protéines change et les épitopes sont détruits. L'abscence de réactivité des 6 anticorps monoclonaux testés en immunoblot avec la souche
R-19 est donc très vraisemblablement due à de tels changements de conformation et destruction d'épitopes.
R-19 est donc très vraisemblablement due à de tels changements de conformation et destruction d'épitopes.
8 anticorps monoclonaux qui conservent leur réactivité sur les extraits bactériens ED ont donc été produits.
Ces 8 anticorps monoclonaux peuvent donc constituer des réactifs appropriés à la détection des antigènes de
T. equigenitalis et, plus particulièrement, au diagnostic de la MCE. De tels anticorps peuvent servir à caractériser des bactéries du genre Taylorella dans toute préparation biologique utilisant des conditions dénaturantes.
T. equigenitalis et, plus particulièrement, au diagnostic de la MCE. De tels anticorps peuvent servir à caractériser des bactéries du genre Taylorella dans toute préparation biologique utilisant des conditions dénaturantes.
- Détermination de 1'isotype
Pour la détermination de l'isotype des anticorps monoclonaux, on a utilisé le kit immunotype de chez Sigma qui est constitué de bandelettes de nitrocellulose prérecouvertes d'anticorps anti-isotype d'immunoglobulines de souris. Après incubations supplémentaires, l'identité de l'isotype des immunoglobulines est révélée à l'aide d'un système de détection biotine-avidine-enzyme.
Pour la détermination de l'isotype des anticorps monoclonaux, on a utilisé le kit immunotype de chez Sigma qui est constitué de bandelettes de nitrocellulose prérecouvertes d'anticorps anti-isotype d'immunoglobulines de souris. Après incubations supplémentaires, l'identité de l'isotype des immunoglobulines est révélée à l'aide d'un système de détection biotine-avidine-enzyme.
Les résultats obtenus figurent dans la colonne 9 du tableau III.
Les 14 anticorps monoclonaux produits font partie des IgM pour 5 d'entre eux, des IgG2b pour 4 d'entre eux, des IgG3 pour 3 d'entre eux et des IgG1 pour 2 d'entre eux.
Exemple 3 :
Essai comparatif des différents tests de diagnostic de la
MCE
a) culture biologique de la flore bactérienne
b) détection par polyclonaux et IIF
c) détection par l'invention objet de la présente demande : monoclonaux et IIF.
Essai comparatif des différents tests de diagnostic de la
MCE
a) culture biologique de la flore bactérienne
b) détection par polyclonaux et IIF
c) détection par l'invention objet de la présente demande : monoclonaux et IIF.
Pendant 1 mois, 368 écouvillons de juments (fosse clitoridienne, de col utérin) et d'étalons (liquide liquide pre-éjaculatoire,fosse uréthrale) ont été étudiés par les deux techniques d'immunofluorescences, la technique au sens de la note de service du Ministère de l'agriculture et de la pêche (DGAL/SDSPA/N95/Ne8037) avec anticorps polyclonaux et la tecnnique selon l'invention.
Les positifs par l'une des deux techniques ont subi un isolement par culture sur milieux gélosés. 64 prélèvements ont été trouvés positifs avec les anticorps polyclonaux et 17 avec les anticorps monoclonaux ; aucune mise en culture n'a permis d'isoler de bactérie
T.equigenitalis.
T.equigenitalis.
Ces résultats mettent bien en évidence la plus forte spécificité apportée par l'invention dans cette étude.
Exemple 4 :Production d'anti-anticorps anti-Taylorella equigenitalis 1. Production des anticorps monoclonaux anti-T.
equigenitalis (AcMl)
On opère comme indiqué ci-dessus.
On opère comme indiqué ci-dessus.
2. Purification des AcM1
Les AcMl sont précipités par addition de sulfate d'ammonium saturé à la concentration finale de 50%. Après centrifugation, le précipité est remis en suspension dans du PBS, puis filtré sur gel de Séphadext G75 (Pharmacia) et enfin purifié par chromatographie d'affinité sur une colonne de protéine A- SépharoseE CL-4B.
Les AcMl sont précipités par addition de sulfate d'ammonium saturé à la concentration finale de 50%. Après centrifugation, le précipité est remis en suspension dans du PBS, puis filtré sur gel de Séphadext G75 (Pharmacia) et enfin purifié par chromatographie d'affinité sur une colonne de protéine A- SépharoseE CL-4B.
3. Préparation de l'immunogène
Les AcMl purifiés sont homopolymérisés en présence de glutaraldehyde à 0,25% pendant heures à 4 C. La réaction est stoppée par adjonction d'un tampon glycine 0,2M et les polymères sont dialysés contre du PBS.
Les AcMl purifiés sont homopolymérisés en présence de glutaraldehyde à 0,25% pendant heures à 4 C. La réaction est stoppée par adjonction d'un tampon glycine 0,2M et les polymères sont dialysés contre du PBS.
4. Immunisation de souris
Des souris BALB/C sont immunisées par 1 injection SC d'un mélange à partie égale de SOug d'AcM1 polymérisés et d'adjuvant de Freund complet. 2 injections ultérieures sont pratiquées à 2 semaines d'intervalle , l'une avec de l'adjuvant de Freund incomplet, et l'autre sans aucun adjuvant et par voie péritonéale.
Des souris BALB/C sont immunisées par 1 injection SC d'un mélange à partie égale de SOug d'AcM1 polymérisés et d'adjuvant de Freund complet. 2 injections ultérieures sont pratiquées à 2 semaines d'intervalle , l'une avec de l'adjuvant de Freund incomplet, et l'autre sans aucun adjuvant et par voie péritonéale.
5. Obtention des anticorps monoclonaux anti-anticorps contre T. equigenitails. (AcM2)
On procède comme décrit plus haut.
On procède comme décrit plus haut.
6. Purification des fragments Fab des AcM1
Des fragments Fab des anticorps AcM1 sont purifiés après digestion des AcM1 par de la papaïne (incubation 45 min à 37 C des AcM1 dans une solution de papaïne, de 2-ss- mercaptoéthanol, d'EDTA 1,5M à pH8. le rapport est de îOug de papaïne par mg d'AcM1. La digestion est stoppée par l'addition de N-méthylmaléimide lOmM (Sigma). Les anticorps non digérés et les fragments Fc sont éliminés par chromatographie d'affinité sur une colonne de protéine A-Sépharose CL-4B# (Pharmacia). La pureté des fragments Fab est vérifiée par SDS-PAGE.
Des fragments Fab des anticorps AcM1 sont purifiés après digestion des AcM1 par de la papaïne (incubation 45 min à 37 C des AcM1 dans une solution de papaïne, de 2-ss- mercaptoéthanol, d'EDTA 1,5M à pH8. le rapport est de îOug de papaïne par mg d'AcM1. La digestion est stoppée par l'addition de N-méthylmaléimide lOmM (Sigma). Les anticorps non digérés et les fragments Fc sont éliminés par chromatographie d'affinité sur une colonne de protéine A-Sépharose CL-4B# (Pharmacia). La pureté des fragments Fab est vérifiée par SDS-PAGE.
7. Criblage des hybridcmes producteurs d'AcM2 par un test
ELISA
Les microplaques (Maxisorb, Nunc) sont incubées 16h à 4iC avec 100 Nil/puit d'une suspension de 0,2 g/ml de Fab dans du tampon carbonate pH8. Les microplaques sont lavées 3 fois avec du PBS-Tween 20S (0,05%), pH 7,2, puis les sites non spécifiques sont bloqués par une solution de BSA 2% dans le PBS-Tween 2àQ pendant 30 min à 37-C. Après 3 lavages par du PBS- Tween 20Q, les surnageants de culture des hybridomes sont incubés 1H à 37il. Après 3 lavages par du PBS-Tween 20X, la réaction est révélée par un conjugué anti-souris marqué à la peroxydase et son substrat.
ELISA
Les microplaques (Maxisorb, Nunc) sont incubées 16h à 4iC avec 100 Nil/puit d'une suspension de 0,2 g/ml de Fab dans du tampon carbonate pH8. Les microplaques sont lavées 3 fois avec du PBS-Tween 20S (0,05%), pH 7,2, puis les sites non spécifiques sont bloqués par une solution de BSA 2% dans le PBS-Tween 2àQ pendant 30 min à 37-C. Après 3 lavages par du PBS- Tween 20Q, les surnageants de culture des hybridomes sont incubés 1H à 37il. Après 3 lavages par du PBS-Tween 20X, la réaction est révélée par un conjugué anti-souris marqué à la peroxydase et son substrat.
Les hybridomes positifs par le test ELISA sont sélectionnés et les surnageants sont utilisés pour la préparation du vaccin.
8. Préparation du vaccin
Les anticorps AcM2 des hybridomes sélectionnés , puis leurs fragments Fab correspondants sont purifiés selon les méthodes décrites ci-dessus.
Les anticorps AcM2 des hybridomes sélectionnés , puis leurs fragments Fab correspondants sont purifiés selon les méthodes décrites ci-dessus.
Les fragments Fab sont couplés à la keyhole limpet hemocyanin (KLH, Sigma) par incubation pendant 16h à 4iC dans une solution 0,05% de glutaraldéhyde (Sigma), dans un rapport de 1/1. La réaction est stoppée par une solution de glycine 0,02M et les conjugués sont dialysés contre du PBS.
La protéine est dosée à 25-l0Oug par dose de vaccin et le vaccin est additionné d'hydroxyde d'alumine à titre d'adjuvant.
Claims (16)
1/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments, plus particulièrement, leurs fragments Fv, Fab, F(ab')2, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope d'une bactérie de l'espèce T. equigenitalis.
2/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments, plus particulièrement leurs fragments Fv, Fab, F(ab')2, selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils ne présentent pas de réaction croisée avec un ou des épitope(s) d'une bactérie d'une espèce Taylorella différente ou d'une bactérie d'un genre différent.
3/ Anticorps monoclonaux ou leurs fragments, selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître des protéines de T.
equigenitalis du groupe comprenant des protéines telles que les protéines de 150 kDa, 120 kDa, 52,7 kDa ou 22 (LPS) kDa.
4/ Anticorps monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils peuvent être obtenus à partir d'hybrides
- par fusion de cellules de myélome murin non secrétrices avec des cellules spléniques issues de souris immunisées à l'aide d'une souche de l'espèce T.
- récupération des anticorps monoclonaux recherchés, suivie le cas échéant d'une purification.
- clonage et sélection selon la propriété de leur surnageant de culture à reconnaître un ou des épitope(s) d'une bactérie de l'espèce T. equigenitalis,
equigenitalis inactivée ou d'extrait(s) d'une telle souche, et
5/ Protéines immunogènes, caractérisées en ce qu'elles sont capables d'interagir avec des anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
6/ Anticorps monoclonaux, et leurs fragments, particulièrement leurs fragments Fv, Fab, F(ab' )2, caractérisés en ce qu'il s'agit d'anti-anticorps, à savoir d'anticorps capables d'interagir avec les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
7/ Procédé d'obtention d'anticorps monoclonaux kDa selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend
- la fusion de cellules de myélome murin non sécrétrices avec des cellules spléniques issues de souris immunisées à l'aide d'une souche de l'espèce T.
- la récupération des anticorps monoclonaux, suivie le cas échéant de leur purification.
- la sélection par clonage de tels hybridomes au regard de leur réactivité, par rapport à T equlgenitalis, et
- le criblage à l'aide d'une technique de révélation, telle que notamment l'immunofluorescence indirecte, des hybridomes dont les surnageants de culture présentent une réaction positive avec une bactérie de l'espèce T. equigenitalis ou un fragment de celle-ci,
equigenitalis ou d'extrait(s) d'une telle souche,
8/ Procédé d'obtention d'anticorps monoclonaux selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend
- la fusion de cellules de myélome murin non sécrétrices avec des cellules spléniques issues de souris immunisées à l'aide d'anticorps monoclonaux ou de leurs fragments tels que défini(s) dans l'une des revendications 1 à 4,
- le criblage à l'aide d'une technique de révélation, telle que notamment l'immunofluorescence indirecte, des hybridomes dont les surnageants de culture présentent une réaction positive avec l'un desdits anticorps monoclonaux ou leurs fragments,
- la sélection par clonage de tels hybridomes, et
- la récupération des anti-anticorps recherchés.
9/ Souches d'hybridomes caractérisées en ce qu'elles sont capables de secréter des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
10/ Souches d'hybridomes caractérisées en ce qu'elles sont capables de secréter des anticorps monoclonaux selon la revendication 6.
11/ Méthode d'identification d'une bactérie de l'espèce T equigenitalis dans un échantillon ou dans une culture, comprenant
- la mise en contact de l'échantillon ou de la culture à analyser, susceptible de renfermer T equigenitalis, avec une quantité efficace d'au moins un anticorps monoclonal ou un fragment d'un tel anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou, en variante, pour mettre en évidence la présence d'anticorps dirigés contre T equigenitails avec une protéine immunogène selon la revendication 5 ou un anticorps selon la revendication 6, dans des conditions permettant une réaction du type antigène-anticorps et
- la révélation du produit de réaction de type antigène-anticorps éventuellement formé.
12/ Méthode de diagnostic d'une infection par T equigenitalis, plus particulièrement de la métrite contagieuse équine dans un échantillon ou une culture, comprenant
- la mise en contact d'un ou plusieurs anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou de leurs fragments, avec un prélèvement biologique, et
- la révélation de la réaction du type antigène-anticorps produite dans le cas de la présence de
T equigenitalis dans le prélèvement.
13/ Kits pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisés en ce qu'ils comportent
- un ou plusieurs anticorps monoclonaux, ou leurs fragments, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou au moins une protéine immunogène selon la revendication 5, ou un ou plusieurs anticorps monoclonaux, ou leurs fragments, selon la revendication 6, et
- les réactifs, notamment les marqueurs ou tampons, permettant la réalisation de la réaction immunologique visée, ainsi qu'une notice d'utilisation.
14/ Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment un ou plusieurs anticorps monoclonaux, ou leurs fragments, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comme vecteurs de médicaments ou comme agents d'immunothérapie passive, seuls ou en association avec des véhicules pharmaceutiquement inertes.
15/ Compositions vaccinales, caractérisées en ce qu'elles renferment, en association avec des excipients physiologiquement acceptables, au moins une protéine immunogène telle que définie selon la revendication 6, ou un anticorps selon la revendication 6, ou un fragment d'un tel anticorps, en quantité suffisante pour susciter une réaction immunitaire.
16/ Utilisation des anticorps monoclonaux selon l'une des revendications 1 à 4 pour l'élaboration de biocapteurs.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9604623A FR2747387B1 (fr) | 1996-04-12 | 1996-04-12 | Moyens pour la detection de bacteries du genre taylorella et applications biologiques |
| PCT/FR1997/000649 WO1997039034A1 (fr) | 1996-04-12 | 1997-04-11 | Moyens pour la detection de bacteries de l'espece taylorella equigenitalis et applications biologiques |
| US09/155,982 US6858209B2 (en) | 1996-04-12 | 1997-04-11 | Means for detecting bacteria of the taylorella equigenitalis species and their biological applications |
| AU26416/97A AU708879B2 (en) | 1996-04-12 | 1997-04-11 | Means for detection of bacteria of the species Taylorella equigenitalis and their biological applications |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9604623A FR2747387B1 (fr) | 1996-04-12 | 1996-04-12 | Moyens pour la detection de bacteries du genre taylorella et applications biologiques |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2747387A1 true FR2747387A1 (fr) | 1997-10-17 |
| FR2747387B1 FR2747387B1 (fr) | 1998-07-03 |
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|---|---|---|---|
| FR9604623A Expired - Fee Related FR2747387B1 (fr) | 1996-04-12 | 1996-04-12 | Moyens pour la detection de bacteries du genre taylorella et applications biologiques |
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| AU (1) | AU708879B2 (fr) |
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| WO (1) | WO1997039034A1 (fr) |
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1997
- 1997-04-11 US US09/155,982 patent/US6858209B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-04-11 AU AU26416/97A patent/AU708879B2/en not_active Ceased
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986002360A1 (fr) * | 1984-10-19 | 1986-04-24 | Technology Licence Company Limited | Anticorps monoclonaux et leur utilisation |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A. MACMILLAN ET AL.: "Antibodies reactive with Taylorella equigenitalis in equine sera.", THE VETERINARY RECORD, vol. 118, no. 20, 17 May 1986 (1986-05-17), LONDRES, GRANDE BRETAGNE, pages 562, XP000615390 * |
| M. EGUCHI ET AL.: "Passive hemagglutination test for detection of antibodies against Taylorella (Haemophilus) equigenitalis in sera of mares.", VETERINARY MICROBIOLOGY, vol. 18, no. 2, October 1988 (1988-10-01), AMSTERDAM, PAYS-BAS, pages 155 - 161, XP000615355 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| FR2747387B1 (fr) | 1998-07-03 |
| AU708879B2 (en) | 1999-08-12 |
| WO1997039034A1 (fr) | 1997-10-23 |
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