JPH11507014A

JPH11507014A - 標識として用いる酵素の反応生成物に向けられた抗体を使用する免疫学的検定

Info

Publication number: JPH11507014A
Application number: JP8527838A
Authority: JP
Inventors: アーランガー、バーナード・エフ; チェン、ビー−シン
Original assignee: Columbia University of New York
Current assignee: Columbia University of New York
Priority date: 1995-03-14
Filing date: 1996-03-14
Publication date: 1999-06-22
Also published as: EP0811015A4; EP0811015A1; AU5312096A; WO1996028474A1; US5650284A; CA2215357A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、標識された物質と基質との間の反応生成物に対して特異的に結合する抗体を提供する。本発明はまた、本発明の抗体を製造するために用いる免疫原を作成する方法を提供する。本発明は更に、本発明の抗体を使用する方法であって、サンプル中において問題の抗原を検出するための方法、例えば、問題のアミノ酸配列を有するタンパク質を検出する方法、および問題の核酸配列を有する核酸分子を検出する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】標識として用いる酵素の反応生成物に向けられた抗体を使用する免疫学的検定ここに記述される発明は、米国エネルギー省からの認可番号ＤＥＦＧ０２− ８８ＥＲ６０７４２号により援助された研究の過程を通して成された。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。本出願は、１９９５年３月１４日に提出された米国特許出願第０８／４０３，６４９号の一部継続出願である。〔発明の背景〕標識された抗体は、通常、ＥＬＩＳＡのような免疫学的検定において使用されたり、免疫組織化学において使用されたり、またウエスタンブロットにおける酵素標識抗体の使用のように、ゲル電気泳動後の細胞構成要素の同定のために使用されたりする。最も普通の方法は、ペルオキシダーゼで標識した特異的抗体を用いて抗原を検出するもの、または初めに非標識特異的抗体を用い、続いてペルオキシダーゼ標識抗抗体を用いて抗原を検出する方法である。例えば、３，３’− ジアミノベンジジンなどの基質を添加すれば、着色されたシグナルが得られる。免疫組織化学的実験およびウエスタンブロット実験において、該着色生成物は該抗原の位置に沈着する。該抗原が低レベルで存在する場合、不確実で誤ったネガティブな結果が含まれる可能性がある。従って、顕著なバックグラウンド「ノイズ」を伴うことなく、該シグナルを増幅する方法が、探求されている。従来の免疫学的検定では、標識酵素としてのペルオキシダーゼ（セイヨウワサビペルオキシダーゼの形が多い）を、抗体を検出する基質としてのクロモゲン− 過酸化水素混合物と組み合わせて使用する。更に、通常のＥＬＩＳＡまたはＥＩＡの変法は、スターンバーガー(Ｓternberger,Ｌ.Ａ.，（１９８６）Ｉmmunocyt ochemistry :Ｔhird edition ，(Ｗiley and Ｓons))並びにポラックおよびヴァン・ノールデン（Ｐolak,Ｊ.Ｋ．and Ｖon Ｎoorden,Ｓ.,(1983)Ｉmmunocytoche mistry:Ｐractical Ａpplications in Ｐathologyand biology ,Ｗright,pp214-2 15）により公表されている。ここでは、問題となる分子に結合したペルオキシダーゼ標識抗体を検出するために、ペルオキシダーゼに対する抗体が使用される。この方法は、ＥＬＩＳＡの特異性および感度を増加させる。スターンバーガー（１９８６）は、３，３’−ジアミノベンジジンが、その高い感度と高い不溶解性のために、好ましいクロモゲンであるが、その一方で、発癌性を有し、試料を突然変異させるということを明らかにした。更に、マッキンブレスキン（ＭcＫimmＢreschkin,Ｊ.Ｌ.,(1990)Ｊ.Ｉmmunol.Ｍethods，Ｖol.1 35,p277-280）は、好ましい代替物は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）であり、この化合物は同様な性質を有する非変異原性化合物であるが、試薬瓶中で過酸化水素と混合したときに時期尚早に発色しながら分解することを開示している。他の研究者等は、バシトラシン、ペニシリンおよびＮ−メチルピロリジンを用いて該混合物を安定化することにより、この時期尚早な反応を克服出来ることを開示している。米国特許第５，２０６，１５０号(Ｔai等)、米国特許第４,８９１,３１４号(Ｐauly等)、および米国特許第４,５９６,７７０号(Ｐarham等)を参照されたい。これら特許の内容は、この参照文献によって本願明細書中に組み込まれる。最も広く使用されている増幅方法は、ペルオキシダーゼ標識抗ペルオキシダーゼ抗体を使用した方法であり、これは「ＰＡＰ」増幅と呼ばれる。スターンバーガー（Ｓternberger,Ｌ.Ａ,et al.(1970)Ｊ.Ｈistochem.Ｃytochem.,Ｖol.18,p3 15-333）の報告を参照されたい。スターンバーガー(1970)は、該ＰＡＰ法による可能な最大増幅は、約１２倍であることを開示した。更なる増幅は、立体干渉により妨害される。しかしながら、ＰＡＰ増幅とは異なり、本件における発明は、指数関数的な増幅の可能性を提供する。これは、標識−基質反応の生成物に対して特異的な抗体を使用することにより達成される。酵素は基質分子を生成物へと連続的に「変換」させるので、一つの酵素分子により生成した複数の生成物分子との反応は、ＰＡＰ増幅や他の公知の技術で見られる増幅をはるかに越えて、該シグナルの著しい増幅を導く。この方法による感度の増強により、本発明は、低レベルでの検出と、全ての型の免疫組織化学的検出における誤ったネガティブな結果の発生を減少を提供する。本発明は更に、用いる抗体が供給不足であったり、ひどく高価な抗体であったりするときに、標的となる抗原に対する抗体の使用を少量にすることを可能とする。本発明は更に、核酸のＰＣＲ検出に対する代替法を提供する。これらの使用およびそれ以外の使用は、以下で更に十分に説明する。この説明に基づいて、当業者に明白であるような本発明の更なる使用は、本発明の範囲に含まれるものである。〔発明の概要〕本発明は、標識された物質と基質との間の反応生成物に対して特異的に結合する抗体を提供する。本発明はまた、試料中における問題の抗原を検出する方法であって：（ａ）該抗原を含有することが疑われる試料を、適切な条件下において、該抗原に特異的に結合する第一の標識抗体と接触させ、該抗原に結合している第一の標識抗体を含んでなる複合体を形成することと；（ｂ）形成された複合体中に結合していない何れの標識抗体をも除去することと；（ｃ）上記（ｂ）で生じた複合体と基質とを適切な条件下で接触させて、（ｂ）の複合体に含まれる第一の標識抗体の標識物質と前記基質との間の反応生成物を生成させることと；（ｄ）上記（ｃ）で生成した生成物とこれと特異的に結合する第二の標識抗体とを適切な条件下で接触させて、該第二の標識抗体を該生成物に結合することと；（ｅ）上記（ｄ）における該生成物に結合していない第二の標識抗体を何れも除去することと；（ｆ）結合している第二の標識抗体を検出することによって、目的とする抗原を検出こととを具備してなる方法を提供する。ステップ（ｂ）で得た該複合体としての前サイクルの生成物を使用しながら、生成物（ｃ）から（ｆ）のステップを繰り返すことにより、本方法における感度を更に増強することが出来ることに注目すべきである。該サイクルは、理論的には無限に何度も繰り返すことが可能であるが、その増強は各サイクルで指数関数的に強くなることから、抗原の十分な検出のためには、ほんの数サイクルが必要とされるにすぎないと思われる。加えて、本発明では、次のような別方法をも考慮していること留意すべきである。この方法では、該第一の抗体は標識されていないが、次のステップ（ｂ）において該第一の（非標識）抗体は標識された抗動物種(anti-species)抗体（第一の抗体に特異的に結合する）と適切な条件下で接触されて、前記抗原に結合している該第一の抗体と結合して成る複合体を形成する。次に、該複合体に結合していない標識抗動物種抗体の何れをも除去し、該複合体を、上記のステップ（ｂ）の複合体と同様な方法で処理する。本発明はまた、試料中における問題のアミノ酸配列を含有するタンパク質を検出する方法であって；（ａ）問題のアミノ酸配列を含有するタンパク質が含まれることが疑われる試料を、適切な条件下において、該アミノ酸配列に特異的に結合する第一の標識抗体を含んでなる複合体を形成することと；（ｂ）上記（ａ）のステップで形成された複合体中に、結合していない何れの標識抗体をも除去することと；（ｃ）上記（ｂ）で生じた複合体と基質とを、適切な条件下で接触させて、（ｂ）の複合体に含まれる第一の標識抗体の標識物質と前記基質との間の反応生成物を生成させることと；（ｄ）上記（ｃ）で生成した生成物とこれと特異的に結合する第二の標識抗体とを、適切な条件で接触させて、該第二の標識抗体を該生成物に結合することと；（ｅ）上記（ｄ）における生成物に結合していない第二の標識抗体を何れも除去することと；（ｆ）結合している第二の標識抗体を検出することによって、前記問題のタンパク質を検出することとを具備してなる方法を提供する。本発明は更に、基質と標識物質との間の反応生成物に対する抗体を作成するために使用される免疫原の製造方法であって：（ａ）標識した物質と基質とを適切な条件下において結合させ、該標識物質と該基質の間の反応を引き起こすことと；（ｂ）ステップ（ａ）の反応を、該反応の中間体が形成される時点で停止させることと；（ｃ）該中間体を単離することと；（ｄ）該中間体と担体分子とを、適切な条件下において結合させ、該中間体を該担体分子に結合させることによって、前記免疫原を作成することとを具備してなる方法を提供する。本発明は更に、この方法により作成した免疫原を提供する。本発明は、基質と標識物質との間の反応生成物と特異的に結合する抗体を製造する方法であって、該免疫原を用いて動物を免役感作することと、該動物が産生した該抗体を回収することとを具備する方法を提供する。本発明は、基質と標識物質との間の反応生成物に対するモノクローナル抗体を製造する方法であって、本発明の免疫原を用いてマウスを免役感作することと、該抗体産生リンパ球を該マウスの脾臓から抽出することと、該リンパ球を不死細胞株に融合させてハイブリドーマ細胞を形成させることと、前記抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択することと、該ハイブリドーマ細胞から前記抗体を得ることとを具備する方法を提供する。最後に、本発明は、試料中に存在する核酸配列から成る核酸分子を検出する方法であって、（ａ）問題となる該核酸配列を含有する核酸分子が含まれることが疑われる試料を、適切な条件下において、標識プローブ（問題となる該核酸配列に対して相補的である核酸配列を有する核酸分子より成る）と接触させ、試料中の問題となる核酸配列を含有する核酸分子の何れかと結合した前記標識プローブを含む複合体を形成することと；（ｂ）上記（ａ）の複合体中に結合していない何れの標識プローブをも除去することと；（ｃ）上記（ｂ）で得た複合体を、適切な条件下において基質と接触させ、該基質と、上記（ｂ）で得た複合体に結合している該標識プローブの該標識物質との間の反応生成物を生成させることと；（ｄ）上記（ｃ）で生成された生成物を、適切な条件下において、該生成物に対して特異的に結合する標識抗体に接触させて、該抗体を該生成物に結合させることと；（ｅ）該標識抗体を検出することによって、前記問題の抗原を検出することとを具備してなる方法を提供する。〔図面の簡単な説明〕図１Ａ−１Ｄ：ニトロセルロースの点ブロットは、５００ｎｇ、１００ｎｇ、２０ｎｇ、４ｎｇ（左から右へ）の量でニトロセルロース膜に適用された、シクロスポリンＡ−４−ベンゾイル二安息香酸−ＢＳＡ結合体（ＣｓＡ−ＢＢＡ− ＢＳＡ）の検出を示している。図１Ａは、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体および３，３’−ジアミノベンジジンによるＣｓＡ−ＢＢＡ−ＢＳＡ結合体の検出を示している。図１Ｂは、ＰＡＰ増幅技術によって１Ａを増幅した方法による検出を示す。図１Ｃおよび１Ｄは、精製した抗体（図１Ｃ）および非精製血清（図１Ｄ）を用いて本発明で権利請求している増幅技術を使用した１Ａの検出方法を示している。図２Ａおよび２Ｂ：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動させたマウスイムノグロブリンＧタンパク質のウエスタンブロット。標準的なペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体および３，３’−ジアミノベンジジン（図２Ａ）を使用した展開像と、本発明で権利請求している増幅技術を使用した展開像（図２Ｂ）。図３Ａおよび３Ｂ：点ブロットによるＤＮＡ分子の検出。標準的なペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体および３，３’−ジアミノベンジジン（図３Ａ）を使用した展開像と、本発明で権利請求している増幅技術を使用した展開像（図３Ｂ）。〔詳細な説明〕本発明は、ラベル用物質と基質との反応生成物を特異的に結合する抗体を提供する。本明細書において「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両者を意味する。さらに、本用語は、モノクローナル抗体の抗原結合断片のみならずモノクローナル抗体全体をも含む。このような断片の例は、通常の技術を有する当業者に周知であり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）₂抗体断片と称されている。１つの好適な実施態様において、前記モノクローナル抗体断片は、Ｆａｂ’断片である。他の好適な実施態様において、前記モノクローナル抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）₂断片である。抗体断片を作成する方法も通常の技術を有する当業者には公知である。例としては、上記により開示されたＦａｂ’ モノクローナル抗体断片は、モノクローナル抗体のパパインによる消化によって作成される。同様に、Ｆ（ａｂ’）₂断片は、モノクローナル抗体のペプシンによる消化によって作成される。請求の範囲に記載した抗体（モノクローナルおよびポリクローナルの両者）の作成法について、以下に詳述する。本発明のポリクローナル抗体は、未精製ポリクローナル抗血清または精製ポリクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体の精製法は、通常の技術を有する当業者周知であり、ヒドロキシアパタイト、ゲル濾過、硫安／ＤＥＡＥ、カプリル酸／硫安、タンパクＡ粒子、抗原アフィニティーカラム、抗Ｉｇアフィニティーカラムを利用する技術が含まれるが、これらに限定されない。これらの技術の使用法は、ハーローとレーン（Ｈarlow ＆Ｌa ne）の「抗体:実験室マニュアル（Ａntibodies:ＡＬaboratory Ｍanual）」(Ｃ old Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratories,Ｃold Ｓpring Ｈarbor,ＮＹ:1988)で議論されており、その内容を参照文献として本明細書に含める。本明細書において「ラベル用物質」とは、抗体やプローブのような問題の組成物をラベルするために使用される物質であり、問題の組成物の検出を可能にする全ての物質をいう。ラベル用物質の例は、通常の技術を有する当業者に周知であり、酵素、色素、蛍光マーカー、放射性同位体またはビオチンを含むが、これらに限定されない。本明細書において「基質」とは、ラベル用物質を解像するために使用される全ての物質を指す。例えば、標準的免疫定量法においては、標的の検出は、基質との反応により確認されるラベル用物質の検出によってなされる。ここで用いられる「反応」は、検出可能な生成物を形成するために、ラベル用物質と基質を混合するときに起こる。検出は、視覚的にも機器的にもなし得る。視覚的検出には、通常、反応液を変色させる沈殿物またはその他の生成物の検出が含まれる。機器的検出には、例えば、反応液の変色の検出のように、反応によって生じた何らかの生成物を検出したり、熱放射、光または放射波のような他の「生成物」を検出するものがあり得る。それ故、本発明では、動物に投与し得る反応生成物を生じ、かつその動物に当該生成物に対する抗体を産生せしめることができるのであれば、どのようなラベル用物質および基質も使用できると考えられる。本発明の抗体は、生成物に特異的に結合する抗体であり、それ故、アッセイ中のラベル用物質と基質との反応の結果、アッセイ中に生成物が生じれば、その生成物を検出することができる。それ故、上記の抗体は、標的に結合したラベル用物質とアッセイ中に添加された基質との反応生成物を直接検出することで、ラベルされた標的を間接的に検出するため、通常のアッセイ技術を指数的に増幅することができる。本発明の抗体は、ラベルと基質との反応の進行により、結合したラベルよりも数が多くなった生成物の方を検出するのである。本発明の好適な実施態様において、ラベル用物質は、酵素である。本発明を実施するにあたって有用な酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ、またはアルカリフォスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼのような他の酵素が含まれる。ラベル用物質が酵素である場合、基質の好適な態様は、ベンジジンまたはベンジジン誘導体である。ベンジジン誘導体には、１以上のアルキル、アリル、アミノ、臭素、塩素、フッ素またはヨウ素置換基を有する被置換誘導体が含まれる。例として、３，３’−ジアミノベンジジン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンが含まれるが、これらに限定されない。本発明は、ベンジジンまたはその誘導体を基質として用いる場合には、反応生成物の生成を増強するために、コバルトまたはニッケルのような金属塩を添加することも想定している。本発明を実施する際に有用な他の基質には、１以上のアルキル、アリル、アミノ、臭素、塩素、フッ素またはヨウ素置換基を有する、カルバゾール複合体およびナフトール複合体の誘導体が含まれる。例として、３−アミノ−９−エチルカルバゾールおよび４−クロロ−１−ナフトールが含まれるが、これらに限定されない。本発明では、ニトロフェニルリン酸、ブロモクロロインドリルニトロブルー・テトラゾリウム、ナフトール−ＡＳ−ＢＩ−リン酸／新フクシンおよびブロモクロロインドリル−β−ガラクトピラノシドなどの、通常の技術を有する当業者に公知の基質を用いることも想定している。アルカリフォスファターゼを酵素として使用する場合、適切な基質の実例としては、ニトロブルー・テトラゾリウムクロライド（正式名称：（２，２’−ジ−ｐ−ニトロフェニル−５，５’−ジフェニル −３，３’−［３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジフェニレン］）−ジテトラゾリウムクロライド）がある。アルカリフォスファターゼとニトロブルーテトラゾリウムクロライドの生成物は、フォルマザン（formazan）であり、我々は、これに対する抗体を作成した。他の関連テトラゾリウム誘導体も、同様の反応によりフォルマザン類を生じると予想される。それ故、上記の反応生成物を産する類似の酵素と基質の組み合わせは、本発明の実施に有用である。本発明の抗体を検出することにより、標準アッセイの増幅を達成することができる。この種の検出は、標準的技術によってなし得る。例えば、本発明の抗体は、ポリクローナルであれモノクローナルであれ、検出用ラベルでラベルすることができる。本発明を実施するために、有用なラベルとして、酵素、色素、蛍光マーカー、着色した粒子、放射性同位体、またはビオチンなどがある。好適な実施態様において、本発明の抗体は、ビオチン化の手法によりビオチンのような補酵素でラベルすることができる。ビオチンをラベルとして用いる場合、抗体の検出は、アビジンまたは細菌における同種タンパクであるストレプトアビジンのようなタンパクを添加することによりなされ、前記アビジンまたは前記ストレプトアビジンには、前述の色素、フルオレセインのような蛍光マーカー、着色された粒子、放射同位体、またはペルオキシダーゼのような酵素などの検出用マーカーを結合させることができる。本発明の抗体は、本発明の抗体に特異的に結合する別の抗体を使用して検出することもできる。さらに、上記の既知の方法によりこの抗体をラベルし、検出することができる。上述したハーローとレーンの「抗体：実験室マニュアル」に開示されているように、このような抗−抗体の作成方法は通常の技術を有する当業者に公知なものである。また、本発明は、サンプル中の調べたい抗原を検出する方法であって：ａ）適切な条件下で、抗原を含有すると推定されるサンプルと、抗原を特異的に結合するラベルされた第一の抗体とを接触（contact）させ、抗原とラベルされた第一の抗体との複合体を形成させることと；ｂ）（ａ）で形成された複合体に結合しなかった、ラベルされた抗体を全て除去することと；ｃ）適切な条件下で、（ｂ）で得られた複合体を基質と接触させ、（ｂ）の複合体中のラベル用物質（第一の抗体上の）と基質との反応生成物を生じさせることと；ｄ）上記（ｃ）で生じた生成物と結合させるために、適切な条件下で、生成物と特異的に結合する第二の抗体を生成物に接触させる。ｅ）上記（ｄ）において生成物に結合しなかった、ラベルした第二の抗体を全て除去することと；ｆ）結合したラベルされた第二の抗体を検出することにより、前記調べたい抗原の検出を行うこととを具備してなる方法を提供する。この方法を実施するにあたり、ラベルされた第一の抗体と抗原との複合体を生じせしめる段階であるステップ（ａ）における「接触」では、抗体と、調べたい抗原を含有すると予測されるサンプルの培養液をインキュベートする。インキュベーションは、３０分から３時間の間で、４〜３７℃の温度範囲の下で行う。好適な実施態様において、インキュベーションは、３７℃で、１時間行う。ステップ（ｂ）とステップ（ｅ）における、未結合抗体と結合抗体との分離は、通常の技術を有する当業者に公知の方法によりなされる。例えば、抗マウスグロブリンを用いて、複合体を沈殿させる方法がある。ラベルされた第一の抗体のラベル用物質と基質との反応生成物を産生する段階であるステップ（ｃ）における「接触」では、ラベルされた結合した第一の抗体を含む培養液に基質を添加し、室温付近で、１５分から１時間程度、基質をラベルされた抗体と反応させる。ラベル用物質と基質との反応により生じた生成物と、ラベルされた第二の抗体との複合体を産生する段階であるステップ（ｄ）における「接触」では、ステップ（ｃ）で得られた複合体をさらにインキュベートする。インキュベーションは、３０分から３時間の間で、４〜３７℃の温度範囲の下で行う。好適な実施態様において、インキュベーションは、３７℃で、１時間行う。上記方法の好適な実施態様においては、ラベルされた第一の抗体は、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、またはβ−ガラクトシダーゼのような酵素でラベルされる。ラベルされた抗体が酵素でラベルされる場合の好適な実施態様においては、好適な基質は、先に詳述したように、ベンジジンまたはベンジジンの誘導体である。上記方法の最適な実施態様においては、ベンジジンの誘導体には、３，３’− ジアミノベンジジンまたは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンが含まれる。発明の実施にあたり、ラベルされた第二の抗体は、酵素、色素、蛍光マーカー、着色した粒子、または放射性同位体によりラベルし得る。上述のように、ラベルされた第二の抗体は、通常の技術を有する当業者に公知の技術を用いて検出することができる。本発明の好適な実施態様においては、上述の方法は、細胞および／または組織に含まれる抗原を検出するのに使用される。細胞および組織に含まれる抗原に対する抗体産生を詳述した参照文献が多数存在することは、通常の技術を有する当業者には、公知であろう。例えば、１９９４年１０月１１日に発行された、リウら（Ｌiuetal.）の、ヒト腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体に関する米国特許第５，３５４，８４７号、および１９９４年９月２０日に発行された、ハンナ・ジュニアら（Ｈanna Ｊr.et al.）の、ヒトＢ細胞腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体に関する米国特許第５，３４８，８８０号などの特許を参照されたい。より一般的には、Ｒ．Ｊ．コートら（Ｒ.Ｊ.Ｃote et al.）の、“細胞の抗原と反応するヒトモノクローナル抗体の作成”（Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Sci.,80巻，(1 983 ４月)、2026-2030頁）を参照されたい。ここで引用した公報および参照文献は、その全体が、本明細書の一部として本出願中に含められる。これらの抗体は、抗原を伴った組織または細胞の異常をスクリーニングし、治療するのに有用である。本発明の実施にあたって、このような、調べたい抗原を検出するために用いる既知の抗体を“第一の抗体”と称する。本発明による抗体は、“第二の抗体 ”と称し、上述の方法において“第一の抗体”を検出するために用いられる。本発明による方法は、任意“第一の抗体”の検出を増幅することにより、調べたい抗原を検出するための道を開く。ここで、前記第一の抗体は、上述の基質と反応させると検出可能な生成物を形成する物質でラベルされている。それ故、通常の技術を有する当業者に公知の、または将来公知となるべき、組織および細胞に含まれ且つ検出用マーカーでラベルし得る抗原は、本発明を実施する上で有用であり、本発明の範囲に含まれるものと考えられる。この方法を実施するにあたり、標的抗原は、細胞または組織に含まれる任意の抗原である。細胞に含まれる抗原の例には、動物および植物の細胞が含まれる。本発明の適用が有用であると思われる抗原をもつ動物細胞の例として、血液細胞、腫瘍細胞、および脂肪細胞があるが、これらに限定されるわけではない。最適な実施態様においては、本方法は、白血病細胞のような悪性腫瘍に伴う抗原に対して有用であるが、これらに限定されるわけではない。本発明が有用であると思われる組織の例として、骨、皮膚、筋肉などの動物組織並びに脳、心臓、肺、胃、肝臓、膵臓および腸を含む（ただし、これらに限定されない）内臓がある。好適な実施態様において、組織に含まれる抗原としては、腫瘍を含む組織中の、腫瘍に含まれる抗原がある。ここで、“腫瘍”という用語は、既存の組織から生じる全ての異常な組織群を意味する。このような腫瘍には、良性のものまたは癌性腫瘍などの悪性腫瘍と呼ばれるものがある。例として、脳、中枢神経系、口、喉、肺、胸、卵巣、精巣、大腸、胃、骨、皮膚、膵臓、膀胱、甲状腺または前立腺の腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。上述の方法は、リンパ腫に伴う抗原に対しても有用である。本発明は、調べたいアミノ酸配列を含むサンプル中のタンパクを検出するための方法であって、下記のステップａ）〜ｆ）を具備した方法を提供する。：ａ）適切な条件下で、調べたいアミノ酸配列を有するタンパクを含んでいると思われるサンプルをラベルされた第一の抗体と接触させる。ここで、前記ラベルされた第一の抗体は、調べたいアミノ酸配列を有するタンパクに特異的に結合する抗体であり、調べたいアミノ酸配列を有する任意のタンパクと複合体を生成する；ｂ）（ａ）で形成された複合体に結合しなかった、ラベルされた抗体を全て除去する；ｃ）適切な条件下で、基質と（ｂ）の複合体を接触させ、基質と（ｂ）の複合体中のラベルされた第一の抗体上のラベル用物質との反応生成物を得る；ｄ）適切な条件下で、（ｃ）で得られた生成物と当該生成物に特異的に結合するラベルされた第二の抗体とを接触させ、ラベルされた第二の抗体を生成物に結合させる；ｅ）上記（ｄ）の生成物に結合しなかった、ラベルされた第二の抗体を全て除去する。ｆ）結合した、ラベルされた第二の抗体を検出することにより、タンパクの検出を行う。本法の実施にあたり、サンプル中の調べたいタンパクとラベルされた第一の抗体との複合体を形成する段階であるステップ（ａ）における「接触」では、抗体と、調べたいタンパタを含有すると予測されるサンプルの培養液をインキュベートする。インキュベーションは、３０分から３時間の間で、４〜３７℃の温度範囲の下で行う。好適な実施態様において、インキュベーションは、３７℃で、１時間行う。ステップ（ｂ）とステップ（ｅ）における、未結合抗体と結合抗体との分離は、通常の技術を有する当業者に周知の方法によってなし得る。例としては、抗マウスグロブリンを用いて、複合体を沈殿させる方法がある。基質とラベルされた第一の抗体上のラベル用物質との反応生成物を産生する段階であるステップ（ｃ）における「接触」では、結合した、ラベルされた第一の抗体を含む培養液に基質を添加し、室温付近で、１５分から１時間程度、基質をラベルされた抗体と反応させる。ラベル用物質と基質との反応により生じた生成物と、ラベルされた第二の抗体との複合体を産生する段階であるステップ（ｄ）における接触では、ステップ（ｃ）で得られた複合体をさらにインキュベートする。インキュベーションは、３０分から３時間の間で、４〜３７℃の温度範囲の下で行う。好適な実施態様において、インキュベーションは、３７℃で、１時間行う。上記方法の好適な実施態様においては、ラベルされた第一の抗体は、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、またはβ−ガラクトシダーゼのような酵素でラベルされる。ラベルされた抗体が酵素でラベルされる場合の好適な実施態様においては、好適な基質は、先に詳述したように、ベンジジンまたはベンジジンの誘導体である。上記方法の最適な実施態様においては、ベンジジンの誘導体には、３，３’− ジアミノベンジジンまたは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンが含まれる。発明の実施にあたり、ラベルされた第二の抗体は、酵素、色素、蛍光マーカー、着色した粒子、または放射性同位体によりラベルし得る。上述のように、ラベルされた第二の抗体は、通常の技術を有する当業者に周知の技術を用いて検出することができる。別の実施態様おいて、上述のタンパク検出法は、多糖の検出にも用いることができる。これらの実施態様においては、ラベルされた第一の抗体は、多糖に含まれる任意の糖分子に特異的に結合する抗体である。さらに本発明は、基質とラベル用物質との反応生成物に対する抗体産生用の免疫原を作成する方法であって、ａ）適切な条件下でラベル用物質と基質を混合し、ラベル用物質と基質を反応させることと；ｂ）反応生成物の中間体が形成される時点で、ステップ（ａ）の反応を停止させることと；ｃ）中間体を単離することと；ｄ）適切な条件下で、中間体と担体分子を混合し、中間体を担体分子と結合させ、免疫原を形成することとを具備してなる方法を提供する。上述の方法を実施するにあたり、混合によって、検出用の生成物が生じるのであれば、どのようなラベル用物質および基質を用いてもよい。混合（Ｃombining ）は、２つの反応生成物の溶液を作ることからなる。例えば、ペルオキシダーゼとベンジジンまたはその誘導体とを混合することにより、生成物を作ることができる。溶液は、ベンジジンまたはその誘導体をリン酸緩衝液を含む生理的食塩水（ＰＢＳ）に溶かし、その後蒸留水に溶かしたペルオキシダーゼを添加して作成する。ラベル用物質と基質は、モル比が１：２０〜１：５０になるような割合で混合する。反応は、４〜３６℃温度で、２〜８時間行う。あるいは、４℃で、一晩行ってもよい。溶液の呈色または変色により検出される中間体の生成開始時点で、反応の進行を分析する。ベンジジンとペルオキシダーゼを用いると、即座に色が生じ、鮮やかな赤色を呈する。この時点で、スパーテル１匙のパラジウムブラックを添加して、反応を停止させる。通常の技術を有する当業者には、他の反応停止法も周知である。これらも、上記の方法において、同様に適用でき、本発明の範囲に含まれると想定される。反応停止後、生成物は遠心により単離される。次に、上清中の反応生成物を担体分子と混合し、動物を免疫感作するための免疫原を形成させる。本発明の実施において有用な担体分子は、上記の生成物と結合できる高分子であって、免疫原として生成物を動物に投与するための担体として供することができ、その結果、動物に免疫応答を引き起こし、生成物に特異的な抗体産生を可能にする全ての高分子である。有用な高分子の例として、多糖、複合糖質、ポリアクリルアミド、ポリニトロヤルロースおよびポリスチレンを含む全ての有機ポリマーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明の好適な実施態様において、担体分子は、ポリペプチドである。最適な実施熊様において、ポリペプチドは、タンパクである。担体分子として有用なタンパクには、ウシ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、キーホールカサガイ（key-hole limpe t）のヘモシアニン、オボアルブミン、またはサイログロブリンのような全てのグロブリンが含まれる。担体分子は、既知の方法にしたがって、生成物に結合させる。例えば、ＰＢＳ中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパクの溶液を調製し、生成物をＢＳＡの溶液と混合して、担体分子に結合した生成物を含んだ免疫原を作成する。生成物と単体分子は、モル比で１：２から１：５の割合で反応させる。反応は、室温で６〜１２時間進行させる。さらに、本発明は、本法により作成した免疫原を提供する。また、本発明は、基質とラベル用物質との反応生成物に特異的に結合する抗体の作成方法であって、上述の免疫原で動物を免疫感作することと、動物が産生した抗体を採取することとを含んでなる方法を提供する。ポリクローナル抗体は、ウサギ、ラット、ヤギ、マウスまたはその他の動物に、本発明の免疫原を注射することにより作成する。宿主動物から血清を抽出し、免疫原に特異的なポリクローナル抗体を得るためにスクリーニングをする。ポリクローナル抗体のスクリーニング法は、通常の技術を有する当業者には周知であり、先に引用したハーローとレーンの「抗体：実験室マニュアル」などに開示されている。上述の方法の好適な実施態様においては、前記動物は、ウサギ、マウスまたはヤギである。また、本発明は、基質とラベル用物質との反応生成物に対するモノクローナル抗体の作成方法であって、上述の免疫原でマウスを免疫感作することと、マウス脾臓から抗体産生能をもつリンパ球を抽出することと、ハイブリドーマ細胞を作るためにリンパ球を不死化した細胞系と融合させることと、抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択することと、ハイブリドーマ細胞から抗体を採取することとを含んでなる方法を提供する。モノクローナル抗体は、例えば、マウスを免疫原で免疫感作することにより得られる。上記免疫原を免疫感作量で、マウスに腹腔内接種し、その後同様な量の免疫原を追加接種して、効果を持続させる。最後の追加接種から２〜３日後に、免疫感作されたマウスの脾臓を集め、細胞懸濁液を脾臓から調製し、融合に用いる。ハイブリドーマは、コーラー（Ｋohler,Ｂ.）とミルシュタイン（Ｍilstein ,Ｃ.）の一般的な体細胞雑種作成技術（Ｎature(1975)256:495-497）により、脾臓細胞とマウス腫瘍の組み合わせを用いて作成する。アメリカ合衆国２０８５２ＭＤロックビル、パークローンドライブ１２３０１所在のアメリカン・タイプ・コレクション（ＡＴＣＣ）などからマウスのミエローマ系が入手でき、雑種作成に用いることができる。基本的には、前記技術は、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて腫瘍細胞と脾臓細胞を融合することを含む。融合後、細胞を融合液から分離し、融合しなかった親細胞を取り除くために、ＨＡＴ培養液などの選択的増殖培養液で増殖させる。ハイブリドーマを増大させ、例えば、免疫化剤を抗原として、放射性免疫定量法（Ｒadioimmunoassay）のような従来の免疫定量法により上清を定量することもできる。陽性の細胞を特定して、さらに、それらが本発明の抗体の基準に適合するかどうかを決定する。このような抗体を産生するハイブリドーマは、周知の手順を用いて、インビトロまたはインビボで増殖させ得る。この場合、モノクローナル抗体は、硫安沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、限外濾過などの従来の免疫グロブリン精製法により、培養液または体液から単離できる。本発明は、また、上述の方法で産生したポリクローナルまたはモノクローナル抗体を提供する。これらの抗体は、検出用ラベルでラベルすることができる。本発明の実施において有用な検出用ラベルは、酵素、色素、蛍光マーカー、着色した粒子、放射性同位体、またはビオチンなどを含む。最後に、本発明は、サンプル中の、調べたい核酸配列を有する核酸分子を検出する方法であって：ａ）適切な条件下で、調べたい核酸配列を有する核酸分子を含むと考えられるサンプルをラベルしたプローブ（調べたい核酸配列と相補的な核酸配列を有する核酸分子を含む）と接触させ、ラベルしたプローブとサンプル中の調べたい核酸配列を含む全ての核酸分子とが結合した複合体を生成させることと；ｂ）（ａ）の複合体に結合しなかったラベルされたプローブを全て除去する。；ｃ）適切な条件下で、（ｂ）で得られた複合体を基質と接触させ、（ｂ）の複合体に結合した、ラベルされたプローブ上のラベル用物質と基質との反応生成物を得る。ｄ）適切な条件下で、（ｃ）で得られた生成物を、当該生成物に特異的に結合するラベルされた抗体と接触させ、抗体を生成物に結合させることと；ｅ）ラベルされた抗体を検出し、それにより調べたい抗原を検出することとを具備してなる方法を提供する。本法の実施において、サンプル中の調べたい核酸分子と、ラベルされた第一の抗体との複合体を形成する段階であるステップ（ａ）の「接触」では、調べたい核酸分子を含有すると予測されるサンプルの培養液と抗体をインキュベートする。インキュベーションは、３０分から３時間の間で、４〜３７℃の温度範囲の下で行う。好適な実施態様において、インキュベーションは、３７℃で、１時間行う。ステップ（ｂ）における、未結合プローブと結合プローブとの分離は、通常の技術を有する当業者に周知の方法によってなし得る。基質とラベルされた第一の抗体上のラベル用物質との反応生成物を生成する段階であるステップ（ｃ）における「接触」では、ラベルされた、結合した第一の抗体を含む培養液に基質を添加し、室温付近で、１５分から１時間程度、基質をラベルされた抗体と反応させる。ラベル用物質と基質との反応により生じた生成物と、ラベルされた第二の抗体との複合体を産生する段階であるステップ（ｄ）における「接触」では、ステップ（ｃ）で得られた複合体をさらにインキュベートする。インキュベーションは、３０分から３時間の間で、およそ４〜３７℃の温度範囲の下で行う。好適な実施態様において、インキュベーションは、３７℃で、１時間行う。上記方法の好適な実施態様においては、ラベルされたプローブは、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、またはβ−ガラクトシダーゼのような酵素によりラベルされる。本明細書において、“プローブ”とは、ラベルすることができ、相補的塩基対により、調べたい核酸配列を含有する分子に結合して二重螺旋を形成する全ての核酸分子をいう。当業者は、プローブのことを「ハイブリッド形成用プローブ（ hybriization probe）」とも称する。例えば、調べたいＤＮＡ配列の位置を定めるためにＤＮＡプローブを用いるときには、二本鎖ＤＮＡを含むサンプルをＤＮＡプローブと反応させれば、サンプル中の、調べたい配列を含む全てのＤＮＡ（ “target ＤＮＡ”）の位置を決定することができる。このような方法においては、サンプル中の二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡに解離した後、ＤＮＡプローブと反応する。プローブは、相補的塩基対（すなわちアデニンとチミジン、グアニンとシトシン）により、サンプル中の全ての標的ＤＮＡと結合する。それ故、ＤＮＡプローブは、二重螺旋ＤＮＡのうちの一本鎖であり、調べたい配列に相補的な核酸分子を含む。ラベルされた核酸プローブを作成する方法は、ＤＮＡ、ＲＮＡともに、通常の技術を有する当業者に周知である。それ故、上記の方法は、検出不能な微量でサンプル中に存在し得る、調べたい核酸分子を増幅して検出することができる。ラベルされたプローブが酵素でラベルされた場合の好適な実施態様において、上述のように、好適な基質は、ベンジジンまたはその誘導体である。上記の方法の最適な実施態様においては、ベンジジン誘導体には、３，３’−ジアミノベンジジン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンが含まれる。本発明の実施においては、ラベルされた抗体は、酵素、色素、蛍光マーカー、着色された粒子または放射線同位体でラベルすることができる。上述のように、ラベルされた抗体は、通常の技術を有する当業者に周知の技術を用いて、検出することができる。上述の方法は、既知の核酸プローブを用いて、任意の核酸配列を検出するのに使用することができる。このような核酸配列は、どのようなＤＮＡおよびＲＮＡの核酸配列であってもよい。上述の方法の好適な実施態様において、調べたい核酸配列は、ＤＮＡ配列であり、プローブもＤＮＡ配列である。上述の方法の他の好適な実施態様において、調べたい核酸配列は、ＲＮＡ配列であり、プローブもＲＮＡ配列である。以下の「実験の詳細」の項では、後述の特許請求の範囲において更に完全に定義される本発明を例示するにすぎない。本実例は、いかなる意味においても、請求の範囲を制限することを意図するものではなく、またそのように解釈してはならない。〔実験方法〕本発明の一実施例として、我々は、ペルオキシダーゼと３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）との反応生成物に対する抗体の作成を選ぶことにする。抗体を得ることができれば、何らかの既知の有用な抗体検出方法によって、ラベルすることができる。例として、ペルオキシダーゼまたは検出用ラベルとして有用な他の酵素によるラベリング、またはビオチンによるラベリングが含まれる。後者の場合、本発明による抗体の検出は、既知のアビジン−酵素法またはアビジン− フルオレセイン検出により行われる。それ故、最終的なシグナルは、色、光、または蛍光である。例１−抗体の産生Ａ．抗原の合成ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）４８ｍｇ（０．７２μｍｏｌ）を２ｍｌのＰＢＳに溶かし、希釈した重炭酸ナトリウムでｐＨを６．５に調整する。ＤＡＢ・４Ｈ₂０７. ６ｍｇ（２１μｍｏｌ）を５ｍｌのＰＢＳに溶かす。３０％の過酸化水素を２μｌ加える。この溶液に、０. ５ｍｇのペルオキシダーゼを溶かした蒸留水３００μｌのうち５０μｌを添加する。即座に、呈色し始める。鮮やかな赤色になったら、すぐにスパーテル１匙のパラジウムブラックを加え、混合し、反応を停止させる。遠心して、懸濁液を清澄にし、上清をＢＳＡ溶液に添加する。再度、ｐＨを６．５に調整して、２５％グルタルアルデヒド４０μ ｌを溶液に加え、室温で８時間放置する。その後、溶液にエタノールアミン４０ μｌ添加してグルタルアルデヒドを除去し、反応を停止させる。低温室で、一晩、溶液を透析する。Ｂ．抗原による免疫化不完全アジュバント中の抗原で強化した、フロイントの完全アジュバントハンド中の抗原により、ウサギを免疫化する。特異的抗体の存在は、上記手順で作成された生成物とウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）との抱合体の沈殿および当該ＲＳＡ抱合体を用いたＥＬＩＳＡによって決定される。前記特異的抗体は、抗血清として用いることもできるし、固定化したＲＳＡ抱合体などを用いて作成した、特に精製された抗体として用いることもできる。このような場合、標準的な方法で、抗体をペルオキシダーゼに結合してラベルすることができる。あるいは、精製抗体をビオチン化し、シグナル発信用にアビジン −ペルオキシダーゼまたはアビジン−フルオレセインを用いることができる。Ｃ．抗体の精製抗体は、必ずしも精製する必要はなく、抗血清として用いることができる。しかし、以下の方法により、アフィニティーカラムで抗体を精製することもできる。Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（ＢＩＯＲＡＤ）の製造者の記載にしたがって、免疫原である一部重合させた３，３’−ジアミノベンジジンの抱合体（この場合ＲＳＡ抱合体）をＡｆｆｉｇｅｌ−１０と反応させて固定化する。抗血清を、固定化した抱合体とともに、４℃で、混合しながら２４時間インキュベートする。ＰＢＳで完全に洗浄した後、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５で、アフィニティー精製された抗体を溶出し、すぐにトリス緩衝液ｐＨ７．４で中和する。その後、ＰＢＳに対して、２時間透析を行う。抗体は、上述したように、免疫用抱合体に対するＥＬＩＳＡおよび沈殿により同定される。例２− 増幅法を用いた、マウスタンパク用のウェスタンブロットおよびドットブロットニトロセルロース膜へ負荷または転写し、さらに２％ウシ血清アルブミンによる遮断を行った後、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸で緩衝化した生理的食塩水（ＰＢＳ）中で、適度に希釈した、ペルオキシダーゼラベルを行ったヤギ抗マウス抗体とともに、３０分間室温で膜をインキュベートする。膜を上記のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄し、３，３’−ジアミノベンジジン（30％過酸化水素10μｌを含有した5.0mＭトリス-ＨＣl pＨ7.410ml中に6mgの3,3'-ジアミノベンジジン）を用いて、１０分間、室温で展開する。膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、室温で３０分間、適度な希釈（通常ＰＢＳ -Ｔweenで、抗血清を１：５００に希釈）を行った、本発明による抗−生成物抗体とインキュベートする。膜を洗浄し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１：１０００に希釈した、ペルオキシダーゼでラベルしたヤギ抗ウサギ免疫グロブリンとともに、３０分間インキュベートする。もう一度ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、前述のごとく、３，３’−ジアミノベンジジンで展開する。例３− 検出方法の比較Ａ．ドットブロット図１Ａ−１Ｄに、請求の範囲の方法により、標準的免疫定量法に比べて、増幅の改善がなされたこと、およびサイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）を検出するために使用したＰＡＰ−増幅免疫定量法を示す。４種類の濃度のサイクロスポリンＡ−４−ベンゾイル安息香酸−ウシ血清アルブミン抱合体（ＣｓＡ−ＢＢａ−ＢＳＡ）を、４片の各ニトロセルロース膜に、スポット状に負荷した。各ニトロセルロース膜とも、左から右に、５００ｎｇ、１００ｎｇ、２０ｎｇ、４ｎｇ（リン酸緩衝液を含む生理的食塩水ｐＨ７．４中）の濃度である。１．標準的免疫定量法１ｍｇ／ｍｌのマウス抗サイクロスポリンモノクローナル抗体Ｈ４．１３とともに、膜を１時間インキュベートする。ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で、過剰分を洗浄する。つぎに、ペルオキシダーゼラベルされたヤギ抗マウス免疫グロブリンＧとともに、膜を室温で、３０分間インキュベートし、余分なラベルされた抗体をＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で取り除く。６ｍｇの３，３’− ジアミノベンジジンの溶液１０ｍｌ、３０％過酸化水素（５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタンｐＨ７．５中）１０ｍｌとともに１０分間インキュベートする。図１Ａは、この方法では、５００ｎｇと１００ｎｇの濃度しか検出できないことを示している。２．ＰＡＰ増幅ペルオキシダーゼラベルしたヤギ抗マウス抗体とともにインキュベーションした後、公知の方法に従い、膜をペルオキシダーゼ−抗ペルオキシグーゼ抗体（ＰＡＰ）とともにインキュベーションする以外は、Ａで詳述した方法をくり返す。図１Ｂに示されているように、図１Ａに示される標準的免疫定量法にくらべて、ほとんど増幅がなされていない。３．請求の範囲に記載された増幅方法３、３’−ジアミノベンジジンで展開した後、請求の範囲の記載による抗−生成物抗体（Ｒ５９４）を点状のブロット（blot）とともに３０分間インキュベーションする以外は、Ａの方法を再度くり返す。抗体は、ビオチン化された、特に精製した抗体（図１Ｃ）または１：５００に希釈したＲ９５４抗血清（図１Ｄ）として用いることができる。ラベルされた精製抗体を用いる場合には、公知の手順にしたがい、アビジン−ペルオキシダーゼおよび３，３’−ジアミノベンジジンを用いて展開する。非精製抗体を用いる場合には、ペルオキシダーゼラベルされたヤギ抗ウサギ抗体とともにインキュベーションして展開し、さらに３，３’ −ジアミノベンジジンを用いて展開する。図１Ｃおよび図１Ｄに示されているように、標準的免疫定量法およびＰＡＰ増幅定量法に比べて２５倍増幅されており、４ｎｇの濃度のサンプルも検出されている。Ｂ．ウェスタンブロット公知の手順にしたがって、マウス免疫グロブリンＧをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動する。図２Ａは、上記の標準的免疫定量法において概説した条件に従って行った、ペルオキシダーゼラベルされたヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ抗体ウェスタンブロットの展開および３，３’−ジアミノベンジジンによる展開を示している。図２Ｂは、１：５００に希釈したＲ５９５（抗−生成物抗体）抗血清、さらにペルオキシダーゼラベルしたヤギ抗ウサギ抗体を用いた検出を示す。請求の範囲に記載の方法に対して、前に概説した条件に従って、展開は、３，３’−ジアミノベンジジンを用いて行う。図２Ｂには、ウェスタンブロットの場合、通常の検出方法を用いたときと比べて、請求の範囲に記載の方法を用いた検出では、２５倍増幅されることが示されている。例４−増幅法を用いた核酸分子の検出１００ｍｇ／ｍｌ溶液を、１０ｍＭトリス−１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８中で、１０分間煮沸した後、氷上で急冷して、ＤＮＡのサンプルを線状化する。１０ μｌのＤＮＡ溶液それぞれに、１．１μｌのソラーレン−ビオチン試薬（Ｐsora len-biotin−reagent；Ｓchelercher and Ｓchuell）を加える。混合液に、３６５ｎｍの放射を１時間行う。架橋されたサンプルをブタノールで二度抽出し、過剰な試薬を除去し、ニトロセルロース膜に載せる。２％ウシ血清アルブミンで、膜を遮断する。１：１０００に希釈したアビジン−ペルオキシダーゼで、膜上のサンプルを処理し、例２のように視覚化する。例５−ＤＮＡ検出法の比較例４のようにＤＮＡサンプルを調製し、２枚のニトロセルロース膜各々に、２．５ｎｇ、０．５ｎｇおよび０．１ｎｇの濃度のものを載せる。図３Ａに、アビジン−ペルオキシダーゼ、さらに基質３，３’−ジアミノベンジジンを用いる標準的免疫定量法技術による展開を示す。図３Ｂには、上述のように、未精製のＲ５９５抗血清を用い、さらにペルオキシダーゼラベルしたヤギ抗ウサギ抗体とジアミノベンジジンで検出を行う、請求の範囲に記載の方法による展開を示す。図３Ａおよび３Ｂに示されているように、請求の範囲に記載の方法により、２５倍の増幅がなされ、標準的方法では見ることができない０．５ｎｇおよび０，１ｎｇのＤＮＡが検出できる。

【手続補正書】【提出日】１９９８年４月１日【補正内容】請求の範囲１．標識物質と基質との間の反応生成物に対して特異的に結合する抗体。２．請求項１に記載の抗体であって、前記標識物質が酵素である抗体。３．請求項２に記載の抗体であって、前記酵素がペルオキシダーゼである抗体。４．請求項２に記載の抗体であって、前記酵素がアルカリホスフアターゼである抗体。５．請求項２に記載の抗体であって、前記酵素がβ−ガラクトシダーゼである抗体。６．請求項２に記載の抗体であって、前記基質がベンジジンまたはベンジジン誘導体である抗体。７．請求項１に記載の抗体であって、該抗体は非精製ポリクローナル抗血清である抗体。８．請求項１に記載の抗体であって、該抗体は精製ポリクローナル抗体である抗体。９．請求項１に記載の抗体であって、該抗体はモノクローナルである抗体。１０．請求項１に記載の抗体であって、検出マーカーで標識された抗体。１１．サンプル中の問題の抗原を検出する方法であって：ａ）当該抗原を含有していることが疑われる前記サンプルを、適切な条件下において、当該抗原に特異的に結合する第一の標識抗体と接触させ、当該抗原に結合した第一の標識抗体を含む複合体を形成させることと；ｂ）上記（ａ）で形成された複合体中に結合していない何れの標識抗体をも除去することと；ｃ）上記（ｂ）で得た複合体を適切な条件下で基質と接触させて、（ｂ）の複合体における前記第一の標識抗体の標識物質と前記基質との間の反応生成物を生成させることと；ｄ）上記（ｃ）で生成した生成物を、適切な条件下において、該生成物に特異的に結合する第二の標識抗体と接触させ、前記第二の標識抗体を前記生成物に結合させることと；ｅ）上記（ｄ）において前記生成物に結合しなかった第二の標識抗体を何れも除去することと；ｆ）前記結合した第二の標識抗体を検出することにより、問題の抗原を検出することとを具備した方法。１２．請求項１１に記載の方法であって、前記第一の標識抗体は酵素で標識される方法。１３．請求項１２に記載の方法であって、前記酵素がペルオキシダーゼである方法。１４．請求項１２に記載の方法であって、前記酵素がアルカリホスファターゼである方法１５．請求項１２に記載の方法であって、前記酵素がβ−ガラクトシダーゼである方法。１６．請求項１１に記載の方法であって、前記基質がベンジジンまたはベンジジン誘導体である方法。１７．請求項１６に記載の方法であって、前記ベンジジン誘導体が３，３´− ジアミノベンジジンまたは３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジンである方法。１８．請求項１１に記載の方法であって、前記第二の標識抗体は、酵素、色素、蛍光マーカー、着色ビーズ、放射性アイソトープまたはビオチンで標識される方法。１９．請求項１１に記載の方法であって、前記抗原は細胞関連抗原である方法。２０．請求項１１に記載の方法であって、前記抗原は組織関連抗原である方法。２１．請求項２０に記載の方法であって、前記組織関連抗原が腫瘍関連抗原である方法。２２．請求項２１に記載の方法であって、前記腫瘍関連抗原が悪性腫瘍に関連した抗原である方法。２３．請求項２１に記載の方法であって、前記抗原は、リンパ腫または白血病に関連した抗原である方法。２４．サンプル中において、問題のアミノ酸配列を有するタンパクを検出する方法であって：ａ）問題のアミノ酸配列を含む当該タンパクを含有することが疑われる前記サンプルを、適切な条件下で、問題のアミノ酸配列に特異的に結合する第一の標識抗体と接触させて、前記サンプル中の問題のアミノ酸配列を含む何れかのタンパクに結合した前記第一の標識抗体を含む複合体を生成させることと；ｂ）工程（ａ）で形成された複合体中に結合されなかった何れの標識抗体をも除去することと；ｃ）上記（ｂ）の複合体を、適切な条件下で基質と接触させて、上記（ｂ）の複合体における前記第一の標識抗体の標識物質と前記基質との間の反応生成物を生成させることと；ｄ）上記（ｃ）で生成した生成物を、適切な条件下で、該生成物に特異的に結合する第二の標識抗体と接触させて、該第二の標識抗体を前記生成物に結合させることと；ｅ）上記（ｄ）で前記生成物に結合しなかった第二の標識抗体の何れをも除去することと；ｆ）前記結合した第二の標識抗体を検出することにより、前記タンパクを検出することとを具備した方法。２５．請求項２４に記載の方法であって、前記第一の標識抗体が酵素で標識されている方法。２６．請求項２５に記載の方法であって、前記酵素がペルオキシダーゼである方法。２７．請求項２５に記載の方法であって、前記酵素がアルカリホスファターゼである方法。２８．請求項２５に記載の方法であって、前記酵素がβ−ガラクトシダーゼである方法。２９．請求項２４に記載の方法であって、前記基質がベンジジンまたはベンジジン誘導体である方法。３０．請求項２９に記載の方法であって、前記ベンジジン誘導体が３，３´− ジアミノベンジジンまたは３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジンである方法。３１．請求項２４に記載の方法であって、前記第二の標識抗体が、酵素、色素、蛍光マーカー、着色ビーズ、放射性アイソトープまたはビオチンで標識されている方法。３２．基質と標識物質との間の反応生成物に向けられた抗体を作成するために使用される免疫原を製造する方法であって、ａ）適切な条件下で標識物質と基質とを組み合わせて、該標識物質と基質との間の反応を起こさせることと；ｂ）工程（ａ）の反応を、前記反応生成物の中間体が形成された時点で停止させることと；ｃ）前記中間体を単離する工程と；ｄ）適切な条件下で前記中間体とキャリア分子とを組み合わせて、前記中間体を前記キャリア分子に結合させることにより、免疫原を形成することとを具備した方法。３３．請求項３２の方法によって製造された免疫原３４．基質と標識物質との間の反応生成物に特異的に結合する抗体を製造する方法であって、請求項３３の免疫原で動物を免疫感作することと、該動物により産生された抗体を回収することとを具備した方法。３５．請求項３４に記載の方法であって、前記動物がウサギである方法。３６．請求項３４に記載の方法であって、前記動物がマウスである方法。３７．請求項３４に記載の方法であって、前記動物がヤギである方法。３８．基質と標識物質との間の反応生成物に向けられたモノクローナル抗体を製造する方法であって、請求項３３の免疫原でマウスを免疫感作することと、該マウスの脾臓から前記抗体を産生するリンパ球を抽出することと、該リンパ球を不死細胞株と融合させてハイブリドーマ細胞を形成することと、前記抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択することと、該ハイブリドーマ細胞から前記抗体を回収することとを具備した方法。３９．請求項３４または３８の方法によって製造された抗体。４０．検出可能な標識で標識された請求項３９に記載の抗体。４１．請求項４０に記載の抗体であって、前記検出可能な標識が酵素、色素、蛍光マーカー、着色ビーズ、放射性アイソトープまたはビオチンである抗体。４２．サンプルにおいて、問題の核酸配列を含む核酸分子を検出する方法であって：（ａ）問題の核酸分子を含む前記核酸分子を含有することが疑われるサンプルと、標識されたプローブ（該プローブは前記問題の核酸配列に対して相補的な核酸配列を有する核酸分子を含む）とを適切な条件下で接触させて、前記サンプル中の問題の核酸配列を含む何れかの核酸分子に結合した前記標識プローブを含む複合体を生成させることと；ｂ）上記（ａ）の複合体中に結合していない何れの標識プローブをも除去することと；ｃ）上記（ｂ）で得た複合体と基質とを適切な条件下で接触させて、上記（ｂ）の複合体に結合した標識プローブの標識物質と前記基質との間の反応生成物を生成させることと；ｄ）上記（ｃ）で生成した複合体を、適切な条件下で、該生成物に特異的に結合する標識抗体に接触させて、該抗体を前記生成物に結合させることと；ｅ）前記標識抗体を検出することにより、前記問題の抗原を検出することとを具備する方法。４３．請求項４２に記載の方法であって、前記標識プローブは酵素で標識されている方法。４４．請求項４３に記載の方法であって、前記酵素はペルオキシダーゼである方法。４５．請求項４３に記載の方法であって、前記酵素はアルカリホスファターゼである方法。４６．請求項４３に記載の方法であって、前記酵素はβ−ガラクトシダーゼである方法。４７．請求項４２に記載の方法であって、前記基質はベンジジンまたはベンジジン誘導体である方法。４８．請求項４７に記載の方法であって、前記ベンジジン誘導体は３，３´− ジアミノベンジジンまたは３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジンである方法。４９．請求項４２に記載の方法であって、前記標識抗体は酵素、色素、蛍光マーカー、着色ビーズ、放射性アイソトープまたはビオチンである方法。５０．請求項４２に記載の方法であって、前記問題の核酸配列はＤＮＡ配列であり、前記プローブはＤＮＡプローブである方法。５１．請求項４２に記載の方法であって、前記問題の核酸配列はＲＮＡ配列であり、前記プローブはＲＮＡプローブである方法。

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Claims

【特許請求の範囲】１．標識物質と基質との間の反応生成物に対して特異的に結合する抗体。２．請求項２に記載の抗体であって、前記標識物質が酵素である抗体。３．請求項３に記載の抗体であって、前記酵素がペルオキシダーゼである抗体。４．請求項３に記載の抗体であって、前記酵素がアルカリホスファターゼである抗体。５．請求項３に記載の抗体であって、前記酵素がβ−ガラクトシダーゼである抗体。６．請求項２に記載の抗体であって、前記基質がベンジジンまたはベンジジン誘導体である抗体。７．請求項１に記載の抗体であって、該抗体は非精製ポリクローナル抗血清である抗体。８．請求項１に記載の抗体であって、該抗体は精製ポリクローナル抗体である抗体。９．請求項１に記載の抗体であって、該抗体はモノクローナルである抗体。１０．請求項１に記載の抗体であって、検出マーカーで標識された抗体。１１．サンプル中の問題の抗原を検出する方法であって：ａ）当該抗原を含有していることが疑われる前記サンプルを、適切な条件下において、当該抗原に特異的に結合する第一の標識抗体と接触させ、当該抗原に結合した第一の標識抗体を含む複合体を形成させることと；ｂ）上記（ａ）で形成された複合体中に結合していない何れの標識抗体をも除去することと；ｃ）上記（ｂ）で得た複合体を適切な条件下で基質と接触させて、（ｂ）の複合体における前記第一の標識抗体の標識物質と前記基質との間の反応生成物を生成させることと；ｄ）上記（ｃ）で生成した生成物を、適切な条件下において、該生成物に特異的に結合する第二の標識抗体と接触させ、前記第二の標識抗体を前記生成物に結合させることと；ｅ）上記（ｄ）において前記生成物に結合しなかった第二の標識抗体を何れも除去することと；ｆ）前記結合した第二の標識抗体を検出することにより、問題の抗原を検出することとを具備した方法。１２．請求項１１に記載の方法であって、前記第一の標識抗体は酵素で標識される方法。１３．請求項１２に記載の方法であって、前記酵素がペルオキシダーゼである方法。１４．請求項１２に記載の方法であって、前記酵素がアルカリホスファターゼである方法１５．請求項１２に記載の方法であって、前記酵素がβ−ガラクトシダーゼである方法。１６．請求項１１に記載の方法であって、前記基質がベンジジンまたはベンジジン誘導体である方法。１７．請求項１６に記載の方法であって、前記ベンジジン誘導体が３，３´− ジアミノベンジジンまたは３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジンである方法。１８．請求項１１に記載の方法であって、前記第二の標識抗体は、酵素、色素、蛍光マーカー、着色ビーズ、放射性アイソトープまたはビオチンで標識される方法。１９．請求項１１に記載の方法であって、前記抗原は細胞関連抗原である方法。２０．請求項１１に記載の方法であって、前記抗原は組織関連抗原である方法。２１．請求項２０に記載の方法であって、前記組織関連抗原が腫瘍関連抗原である方法。２２．請求項２１に記載の方法であって、前記腫瘍関連抗原が悪性腫瘍に関連した抗原である方法。２３．請求項２１に記載の方法であって、前記抗原は、リンパ腫または白血病に関連した抗原である方法。２４．サンプル中において、問題のアミノ酸配列を有するタンパクを検出する方法であって：ａ）問題のアミノ酸配列を含む当該タンパクを含有することが疑われる前記サンプルを、適切な条件下で、問題のアミノ酸配列に特異的に結合する第一の標識抗体と接触させて、前記サンプル中の問題のアミノ酸配列を含む何れかのタンパクに結合した前記第一の標識抗体を含む複合体を生成させることと；ｂ）工程（ａ）で形成された複合体中に結合されなかった何れの標識抗体をも除去することと；ｃ）上記（b）の複合体を、適切な条件下で基質と接触させて、上記（b ）の複合体における前記第一の標識抗体の標識物質と前記基質との間の反応生成物を生成させることと；ｄ）上記（ｃ）で生成した生成物を、適切な条件下で、該生成物に特異的に結合する第二の標識抗体と接触させて、該第二の標識抗体を前記生成物に結合させることと；ｅ）上記（ｄ）で前記生成物に結合しなかった第二の標識抗体の何れをも除去することと；ｆ）前記結合した第二の標識抗体を検出することにより、前記タンパクを検出することとを具備した方法。２５．請求項２４に記載の方法であって、前記第一の標識抗体が酵素で標識されている方法。２６．請求項２５に記載の方法であって、前記酵素がペルオキシダーゼである方法。２７．請求項２５に記載の方法であって、前記酵素がアルカリホスファターゼである方法。２８．請求項２５に記載の方法であって、前記酵素がβ−ガラクトシダーゼである方法。２９．請求項２４に記載の方法であって、前記基質がベンジジンまたはベンジジン誘導体である方法。３０．請求項２９に記載の方法であって、前記ベンジジン誘導体が３，３´− ジアミノベンジジンまたは３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジンである方法。３１．請求項２４に記載の方法であって、前記第二の標識抗体が、酵素、色素、蛍光マーカー、着色ビーズ、放射性アイソトープまたはビオチンで標識されている方法。３２．基質と標識物質との間の反応生成物に向けられた抗体を作成するために使用される免疫原を製造する方法であって、ａ）適切な条件下で標識物質と基質とを組み合わせて、該標識物質と基質との間の反応を起こさせることと；ｂ）工程（ａ）の反応を、前記反応生成物の中間体が形成された時点で停止させることと；ｃ）前記中間体を単離する工程と；ｄ）適切な条件下で前記中間体とキャリア分子とを組み合わせて、前記中間体を前記キャリア分子に結合させることにより、免疫原を形成することとを具備した方法。３３．請求項３２の方法によって製造された免疫原３４．基質と標識物質との間の反応生成物に特異的に結合する抗体を製造する方法であって、請求項３３の免疫原で動物を免疫感作することと、該動物により産生された抗体を回収することとを具備した方法。３５．請求項３４に記載の方法であって、前記動物がウサギである方法。３６．請求項３４に記載の方法であって、前記動物がマウスである方法。３７．請求項３４に記載の方法であって、前記動物がヤギである方法。３８．基質と標識物質との間の反応生成物に向けられたモノクローナル抗体を製造する方法であって、請求項３３の免疫原でマウスを免疫感作することと、該マウスの脾臓から前記抗体を産生するリンパ球を抽出することと、該リンパ球を不死細胞株と融合させてハイブリドーマ細胞を形成することと、前記抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択することと、該ハイブリドーマ細胞から前記抗体を回収することとを具備した方法。３９．請求項３４または３８の方法によって製造された抗体。４０．検出可能な標識で標識された請求項３９に記載の抗体。４１．請求項４０に記載の抗体であって、前記検出可能な標識が酵素、色素、蛍光マーカー、着色ビーズ、放射性アイソトープまたはビオチンである抗体。４２．サンプルにおいて、問題の核酸配列を含む核酸分子を検出する方法であって：（ａ）問題の核酸分子を含む前記核酸分子を含有することが疑われるサンプルと、標識されたプローブ（該プローブは前記問題の核酸配列に対して相補的な核酸配列を有する核酸分子を含む）とを適切な条件下で接触させて、前記サンプル中の問題の核酸配列を含む何れかの核酸分子に結合した前記標識プローブを含む複合体を生成させることと；ｂ）上記（ａ）の複合体中に結合していない何れの標識プローブをも除去することと；ｃ）上記（ｂ）で得た複合体と基質とを適切な条件下で接触させて、上記（ｂ）の複合体に結合した標識プローブの標識物質と前記基質との間の反応生成物を生成させることと；ｄ）上記（ｃ）で生成した複合体を、適切な条件下で、該生成物に特異的に結合する標識抗体に接触させて、該抗体を前記生成物に結合させることと；ｅ）前記標識抗体を検出することにより、前記問題の抗原を検出することとを具備する方法。４３．請求項４２に記載の方法であって、前記標識プローブは酵素で標識されている方法。４４．請求項４３に記載の方法であって、前記酵素はペルオキシダーゼである方法。４５．請求項４３に記載の方法であって、前記酵素はアルカリホスフアターゼである方法。４６．請求項４３に記載の方法であって、前記酵素はβ−ガラクトシダーゼである方法。４７．請求項４２に記載の方法であって、前記基質はベンジジンまたはベンジジン誘導体である方法。４８．請求項４７に記載の方法であって、前記ベンジジン誘導体は３，３´− ジアミノベンジジンまたは３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジンである方法。４９．請求項４２に記載の方法であって、前記標識抗体は酵素、色素、蛍光マーカー、着色ビーズ、放射性アイソトープまたはビオチンである方法。５０．請求項４２に記載の方法であって、前記問題の核酸配列はＤＮＡ配列であり、前記プローブはＤＮＡプローブである方法。５１．請求項４２に記載の方法であって、前記問題の核酸配列はＲＮＡ配列であり、前記プローブはＲＮＡプローブである方法。