CH675880A5 - - Google Patents

Description

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Beschreibung

Die Erfindung bezieht sich auf neue monoklonale Antikörper und auf Verfahren zur Erzeugung und Verwendung solcher neuer monoklonaler Antikörper, die für Karzinom-Antigene spezifisch sind. Genauer gesagt sind die monoklonalen Antikörper nach der Erfindung immunspezifisch für und/oder immunreaktiv mit einem Proteinantigen, das mit Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom (NSCLC) und bestimmten anderen Humankarzinomen,' einschliesslich einigen Karzinomen der Brust, des Dickdarms usw., assoziiert ist.

Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung ist mit einer Determinanten eines Glycopro-tein-Antigens, assoziiert mit NSCLC-Zellen und auch mit anderen Karzinomen, einschliesslich Brust-, Dickdarm- und Kleinzellen-Lungen-Karzinomen reaktiv. Der monoklonale Antikörper nach der Erfindung besitzt unterscheidende Charakteristiken und Fähigkeiten, welche ihn für klinische diagnostische Zwecke sowohl in vivo als auch in vitro geeignet machen. Ausserdem ist der Antikörper nach der Erfindung für therapeutische Zwecke geeignet. So kann zum Beispiel der Antikörper als ein targetselektiver Träger von verschiedenen Agentien verwendet werden, die Antitumorwirkung haben, wie zum Beispiel Chemotherapeutika, Toxine, immunologische Respons-Modifizierer und Radioisotope. Darüber hinaus können die Hybridome, die solchen Antikörper erzeugen, unter Verwendung der Recombinant-DNA-Technologie modifiziert werden, so dass die resultierenden Antikörper antikörperabhängige Zellu-larcytotoxizität vermitteln können oder cytolytisch zu Tumorzellen in Gegenwart von Komplementkomponenten sein können.

Human-Lunaenkarzinom

Lungenkarzinome sind für die Mehrzahl der Karzinom-Todesfälle beim Menschen verantwortlich und holen die Brustkarzinome als die häufigste Ursache von Krebstod bei Frauen ein. Diese Krankheit kann in vier histologische Haupttypen unterteilt werden: (1 ) epidermoider oder schuppiger Typ (30%), (2) Ade-nokarzinom-Typ (35%), (3) undifferenzierter Grosszellen-Typ (15%) und (4) Kleinzellen-Typ (20%). Der Ausdruck Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom («NSCLC») schliesst folgende Zelltypen ein: epidermoide Karzinomzellen, Adenokarzinomzellen und grosse undifferenzierte Karzinomzellen.

Die meisten Lungenkarzinom-Fälle sind durch Chemotherapie und Strahlentherapie nicht heilbar. Kleinzellen-Lungenkarzinome können auf Chemotherapie und Strahlentherapie durch Verminderung in der Grösse ansprechen, aber dies bedeutet keine vollständige Heilung. Vollständige chirurgische Entfernung des Tumors scheint die einzige wirksame Therapie zu sein. Leider haben jedoch weniger als 30% der Lungenkarzinompatienten Tumore, die nach Diagnose vollständig durch Resektion entfernt werden können. Von diesen überleben weniger als ein Drittel fünf Jahre nach der scheinbar vollständigen chirurgischen Entfernung des Tumors. Es besteht daher eine grosse Nachfrage nach Verfahren, die eine frühzeitigere Diagnose des Lungenkarzinoms und eine bessere Bestimmung des Grades der Karzinomausbreitung möglich machen würden, und nach einer wirksameren Therapie.

Monoklonale Antikörper

Monoklonale Antikörper, dargestellt durch homogene Antikörpermoleküle, welche sich an eine einzige Molekülstelle (d.h. ein Epitop) an einem Antigen mit einer spezifischen Bindungs- oder Affinitätskonstanten binden, werden nach drei bekannten Methoden hergestellt.

Monoklonale Antikörper können nach den Hybridom-Techniken von Kohler und Milstein hergestellt werden (1975 Nature 256: 495; 1976, Eur. J. Immunol. 6: 511). Durch Verschmelzen von Antikörper erzeugenden Zellen (Milzlymphocyten) mit Myelomzellen erzeugten Kohler und Milstein Hybridzellen, die immortale Zellstämme hervorrufen, die beides besitzen, die Fähigkeit, Antikörper zu bilden und die Fähigkeit, in Zellkulturen permanent zu wachsen. Die Hybridome scheiden einen einzigen Immunglobulintyp von vorbestimmter Antigenspezifität aus, abhängig von dem Antigen, welchem die Lymphocyten vorher ausgesetzt gewesen sind.

Alternativ können monoklonale Antikörper durch in vitro Transformation von peripherem Säugetierblut B-Lymphocyten, zum Beispiel mit dem Epstein Barr-Virus (EBV) erzeugt werden. Das Virus macht die Antikörper erzeugenden Lymphocyten immortal. Techniken fiir solche Transformation sind Stand der Technik (siehe zum Beispiel Steinmetz et al. 1977, Nature 269: 420; Crawford et al., 1983, The Lancet, i: 386).

Schliesslich können monoklonale Antikörper durch Anwendung von Techniken erzeugt werden, welche die EBV-Immortalisation und die Zellfusion- oder Hybridom-Technik kombinieren. Cole et al. (1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., pp. 77-96) beschreiben Techniken zum Verschmelzen eines Human-Plasmacytom- oder Lymphoblastoid-Zellstammfusionspartners mit EBV-transformierten Donoriymphocyten, die vorher als ein Zellstamm nachgewiesen worden sind. In einem solchen System sind beide parenteralen Zellstämme immortal. Deshalb muss der Fusionspartner eine geeignete Kennzeichnung zum Zähl-Auswählen gegenüber den parenteralen Stämmen haben, wenn das verschmolzene Hybridom kultiviert wird.

Die resultierenden EBV-Hybridome erzeugen Antikörper mit der Spezifität des verwendeten EBV-

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Lymphocyten-Zellstammes.

Monoklonale Antikörper können in grossen Mengen durch in vitro Zellkultur von bestimmten Hybri-dom-oder transformierten Zellstämmen gemacht werden. Ausserdem resultiert Inokulieren eines Hybri-dom-Zellstammes in den peritonealen Hohlraum verträglicher Säugetiere, wie Mäuse, in einem Tumor, der hohe Konzentrationen (1 bis 20 mg/ml) des monoklonalen Antikörpers in die Tumoraszites-Flüssigkeit sekretiert. Durch Entfernung der Aszitesflüssigkeit und Reinigen des monoklonalen Antikörpers kann eine einzige Maus genügend Antikörper für-die Verwendung in Tausenden von diagnostischen Essays liefern.

Monoklonale Antikörper und Antigene, assoziiert mit Lunaenkarzinom

Monoklonale Antikörper für Human-Lungenkarzinom-Antigene sind beschrieben worden von: Sikora et al., 1981, Brit. J. Cancer 43: 696; Cuttita et al., 1981, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 78: 4591 ; Moody et al., 1981, Science 214:1246; Minna et al.,1981, In Vitro 17:1058; Kenneletal., 1981, Cancer Res. 41:3465; Chem. Abst. 95(15): 1 308 502; Baylin et al., 1982, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 79: 4650; Carney et al.,

1982, Pathobiology Annual 12:115; Gazdar et al., 1983, Seminars in Oncology 10: 3; Hollinshead et al.,

1983, Cancer Detect. Prevent 6: 185; Mulshine et al., 1983, J. Immunol. 131: 497; Huang et al., 1983, Arch. Biochem.Biophys. 220: 318; Saji et al., 1984, Hybridoma 3: 119; Bio. Abst. 79 005 569; Bosslet et al., Behring. Inst. Mitt. 74: 27; Chem. Abst. AC101(9): 706 686; Roset et al., 1984, Cancer Res. 44: 2052; Bio. Ast. 79 023 605; Princier et al., 1982, Cancer Res. 42: 843; Mazauric et al., 1982, Cancer Res. 42:150; Braatz et al., 1982, Cancer Res. 42: 849; Sobel et al., 1982, Fed. Proc. 41: 409; Cole et al., 1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., pp. 77-96; und Varki et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc. p. 207.

Die US-Patentanmeldungen Serial Nos. 667 521 vom 2.11.84, 785 177 vom 7.10.85, 684 759 vom 21.12.84, 776 321 vom 18.10.85, 738 612 vom 28.5.85 offenbaren bestimmte monoklonale Antikörper gegen Human-Nicht-Kieinzellen-Lungenkarzinom.

Monoklonale Antikörper können für Verfahren verwendet werden, die eine frühere Diagnose von Lungenkarzinom und eine bessere Definition der Ausbreitung des Karzinoms möglich machen würden und die auch wirksamere Methoden zur Therapie von Lungenkarzinom ermöglichen würden. Ein Erfordernis ist jedoch, Antikörper für Antigene zu finden, die sich in Lungenkarzinomen schneller zu erkennen geben als in normal reifen Geweben. Im Hinblick auf die bekannte Heterogenität von Tumorzellenpopulationen, die Anwesenheit von verschiedenen Determinanten in dem gleichen Antigenmolekül, die erwarteten Unterschiede zwischen Antigenen mit Bezug auf ihre Stabilität als diagnostische Anzeiger und therapeutische Targets und die verschiedenen biologischen Charakteristiken von verschiedenen Antikörpern zum gleichen Antigen können eine Anzahl von verschiedenen Antikörpern für eine Anzahl von verschiedenen Antigenen notwendig machen.

Die Erfindung bezieht sich auf die im Anspruchsteil definierten monoklonalen Antikörper. Die neue Klasse von monoklonalen Antikörpern, bezeichnet mit L20, ist für eine Determinantstelle an einem Glyco-protein-Antigen, assoziiert mit Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom (NSCLC)-Zellen spezifisch. Der Ausdruck «NSCLC-Zellen» umfasst epidermoide Karzinomzellen, Adenokarzinomzellen und undifferenzierte Grosszellen-Karzinomzellen. Die Determinantstelle kann auch an Antigenen von anderen Karzinomen, zum Beispiel einigen Karzinomen der Brust und des Dickdarms und KleinzellervLungenkar-zinom gefunden werden. So wird sich der Antikörper nach der Erfindung auch an Zellen von anderen Karzinomen binden und für die Diagnose und Therapie von allen anderen Tumoren geeignet sein, die das Antigen auspressen, das durch den Antikörper L20 identifiziert wird. Der monoklonale Antikörper bindet sich in einem viel geringeren Grade an normal gereifte Zellen als an Tumorzellen. Der Ausdruck «bindet sich in viel geringerem Grade» bedeutet, dass die Bindung überhaupt nicht nachweisbar sein wird oder nur als eine sehr schwache Färbung, wenn immunhistologische Techniken angewendet werden. So hat der Antikörper einen hohen Spezifitätsgrad für Antigencharakteristik von NSCLC und bestimmten anderen Karzinomen.

Die Erfindung umfasst auch das durch den Antikörper L20 identifizierte neue Antigen L20, und die Klasse von Antikörpern, die daran binden, sind immunspezifisch für oder immunreaktiv mit diesem Antigen.

Bestimmte Diagnoseverfahren, die den monoklonalen Antikörper der Erfindung verwenden, werden beschrieben. Der Antikörper kann zum Beispiel in Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von dem bösartigen Zustand in Human-Lungengewebe und anderen Humangeweben verwendet werden. Die Verfahren schliessen die Prüfung von Gewebe auf die Anwesenheit eines Antigens ein, das die Charakteristiken eines Glycoproteins, 110 000 U (Dalton), definiert durch den Antikörper L20 hat. Zum Beispiel kann das Gewebe mit einem Antikörper in Kontakt gebracht werden, der eine Determinantstelle an einem zellassoziierten Antigen definiert, welches die Charakteristiken des durch den Antikörper L20 bestimmten Antigens, eine funktionale Äquivalenz oder ein Fragment dieses Antikörpers hat und irgendwelche Zwischenwirkungen des Antikörpers und der antigenen Determinanten werden nachgewiesen. Ein solches Verfahren schliesst die Bestimmung der Anwesenheit von NSCLC-Zellen in einer Probe, bei der solche Zellen vermutet werden, ein. Die Probe wird mit dem monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht, der in der Lage ist, solche Zellen von anderen Zelltypen, die in der Probe vorhanden sein kön-

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nen, zu unterscheiden. Der Kontakt wird unter Bedingungen zur Bindung des Antikörpers an solche Zellen ausgeführt. Nach dem Kontakt wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von Bindung des Antikörpers an die Zellen in der Probe bestimmt. Diese Bindung wird mit der Anwesenheit oder dem Fehlen von NSCLC-Zellen in der Probe in Verbindung gebracht. Im allgemeinen wird die Probe mit einem markierten spezifischen Bindungspartner des monoklonalen Antikörpers in Kontakt gebracht. Diese Markierung ist in der Lage, ein nachweisbares Signal zu erzeugen.

Der erfindungsgemässe Antikörper kann für die in vivo Lokalisation eines Tumors verwendet werden, indem ein gereinigter solcher Antikörper oder ein Antikörper-Bruchstück die mit einem Agens, welches ein nachweisbares Signal gibt, markiert sind, an einen Patienten verabreicht werden. Die Lokalisation wird dann unter Anwendung externer Szintographie, Emissionstomographie oder Kernstrahlungsabtastung nachgewiesen. Dieses Verfahren kann auch bessere Möglichkeiten bieten, Patienten hinsichtlich des Ausmasses der Krankheit einzustufen und Änderungen in Erwiderung auf Therapie zu überwachen.

Bei therapeutischen Anwendungen können der Antikörper L20 und ähnliche Antikörper mit dem Antigen L20, das in hohen Konzentrationen an der Tumorzelloberfläche ausgepresst wird, reagieren. Die Antikörper können daher als Träger verschiedener Agenzien verwendet werden, die Antitumorwirkung haben, einschliesslich, aber nicht darauf beschränkt, Chemotherapeutika, Toxine, Immunantwort-Modi-fikatoren und Radioisotope.

Darüber hinaus kann der Antikörper L20 so modifiziert werden, dass er antikörperabhängige Zellu-larcytotoxizität (ADCC) vermitteln kann, d.h., dass er NSCLC-Zellen in Gegenwart von Human-Lym-phocyten oder Makrophagen töten kann oder dass er cytolytisch gegenüber Tumorzelien in Gegenwart des Human-Komplements wird. Eine derartige Modifikation kann zum Beispiel durch in neuerer Zeit entwickelte Techniken zur Erzeugung von «schimärischen Antikörpern» durchgeführt werden. Demgemäss werden Gencodierung für den variablen Bereich des Antikörper-Moleküls L20 mit Humangencodierung für den Fc-Bereich eines Antikörpers mit geeigneter biologischer Aktivität (wie der Fähigkeit, das Humankomplement zu aktivieren und ADCC zu vermitteln) zusammengefügt. Neue Antikörper, deren Herkunft die Maus oder der Mensch ist, können auch zu dem Antigen L20 mit den geeigneten biologischen Funktionen gemacht werden.

Die erfindungsgemässe neue monoklonale Antikörper, mit L20 bezeichnet, ist immunspezifisch für und/oder immun-reaktiv mit einem Antigen an Human-NSCLC-Zellen und Zellen von mehreren anderen Humankarzinomen, einschliesslich Dickdarm-, Brust- und Kleinzellen-Lungenkarzinom.

Die Erfindung betrifft ferner ein neues Zellenoberflächen-Antigen, das charakteristisch für Human-NSCLC und bestimmte andere Human-Karzinome der Brust, des Dickdarms und der Lunge ist, wie im Anspruch 13 definiert.

Verfahren zur Erzeugung von monoklonalem Antikörper aeaen NSCLC

Monoklonale Antikörper gegen Human-NSCLC und bestimmte andere Humankarzinome können durch Hybridom-Fusionstechniken, durch EBV-Transformation von Human-Antikörper produzierenden Lymphocyten oder durch Techniken, die Zellfusion und EBV-Immortalisationstechnologien vereinigen, hergestellt werden.

Fusionstechniken

Nach einer Ausführungsform werden monoklonale Antikörper gegen NSCLC unter Anwendung der Hybridom-Zellfusionstechnik hergestellt. So werden zum Beispiel Human-Lungenkarzinomzellen von in Kulturen gezüchteten Pleuraleffusionszellen von explantierten Human-NSCLC-Tumoren oder Zellen von einer normalen Fetallunge oder Lysate von solchen Zellen als das Immunogen verwendet. In einem Erläuterungsbeispiel wurden explantierte Zellen von einem NSCLC-Human Lungenadenokarzinom Nr. 3082 als das Immunogen verwendet (siehe Kapitel «Herstellung von monoklonalen Antikörpern»). Die Zellen wurden zum Beispiel einer Maus injiziert. Nach ausreichender Zeit wurde die Maus geopfert und es wurden somatische Antikörper produzierende Lymphocyten erhalten. Antikörper produzierende Zellen können von Lymphknoten, Milz und peripherem Blut von vorbereiteten Tieren stammen. Milzzellen werden bevorzugt. Mäuselymphocyten geben einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen mit dem weiter unten beschriebenen Maus-Myelom. Es ist auch möglich, somatische Zellen von Ratten, Kaninchen und Fröschen zu verwenden. Die Milzzellenchromosomen, die gewünschte Immunglobuline codieren, werden durch Fusion der Milzzellen mit Myelomzellen immortalisiert, im allgemeinen in Gegenwart von Polyethylenglycol. Es können verschiedene Myelomzellstämme zur Erzeugung von verschmolzenen oder vereinigten Zellhybriden verwendet werden, einschliesslich NSI-Ag4/1, X63-Ag8, MPC11-45. 6TG1.7, X63-Ag.653, Sp2/0-Ag14, Fo, und S194/5XXO.Bu.1, von Mäusen stammend, und 210.RCY3.Ag1.2.3, U-226AR und GM1 500GTGAL2 von Ratten stammend (Hammerling, et al., 1981, «Monoclonal Antibodies and T-cell hybridomas» in Research Monographs in Immunology, Vol. 3, J.L. Türk, ed; Elsevier/North Holland Biomedicai Press. New York). In einem Erläuterungsbeispiel wurden NS1-Zellen verwendet (siehe Kapitel «Herstellung von monoklonalen Antikörpern»). Die resultierenden Zellen, welche die vereinigten Hybridome einschliessen, werden in einem selektiven Medium, wie HAT-

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Medium, gezüchtet und die überlebenden Zellen werden in solchem Medium unter Anwendung begrenzender Verdünnungsbedingungen gezüchtet. Die Zellen werden in einem geeigneten Behälter, zum Beispiel in Mikroliter-Behältern, gezüchtet und der Überstand wird abgesiebt für die Gewinnung monoklonaler Antikörper der gewünschten Spezifität.

Es gibt verschiedene Methoden für die Isolierung und Reinigung der monoklonalen Antikörper, um sie von anderen Proteinen und anderen Verunreinigungen zu befreien.

EBV-Transformationstechniken

Gemäss einer alternativen Ausführungsform werden monoklonale Antikörper gegen NSCLC unter Anwendung von EBV-Transformationstechniken hergestellt. So werden zum Beispiel Lymphocyten von peripherem Blut, Tumor-dränierenden Lymphknoten, Knochenmarkaspiraten, Tumoren oder Pleuraleffu-sionen von Patienten mit NSCLC unter Anwendung von EBV immortalisiert nach den Methoden von Cole et al., 1984, Cancer Rs. 44: 2750. Wie von Cole et al. bemerkt, sind für Tumorantigene spezifische B-Lymphocyten bei Lungenkarzinompatienten selten. Daher ist es besonders wichtig, die Zahl der Antikörper erzeugenden Lymphocyten durch vorselektierende Lymphocyten, die Antikörper gegen das relevante Antigen erzeugen, zu erhöhen. So schliessen die EBV-Transformationstechniken zwei Stufen ein: (1) Anreicherung von Zellen mit Rezeptoren für das gegebene Antigen, d.h. das Antigen L20, beschrieben im Kapitel «Monoklonale Antikörper»; und (2) lmmortalisation solcher Zellen durch Infektion mit EBV.

EBV-Hvbridom-Techniken

Nach einer anderen alternativen Ausführungsform werden monoklonale Antikörper gegen NSCLC durch Verwendung einer Kombination von EBV-Transformation und Hybridom-Fusionstechnik hergestellt, wie beschrieben bei Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.; pp. 77-96. Zum Beispiel wird ein Myeiom-Zellstamm mit Donorlymphocyten von NSCLC-Patienten, die vorher durch EBV transformiert und als Zellstamm, der in Kultur gezüchtet und entwickelt werden kann, nachgewiesen worden ist, vereinigt. Um in der Lage zu sein, die resultierenden EBV-Hybridom-Fusionszellstämme zu selektieren, ist es notwendig, dass der Fusionspartner dominant geeignet selektierbare Markierungen besitzt, wie Ouabain-oder Neomycin-Resistenz, so dass sich Parentalzellen nicht entwickeln, wenn die vereinigten Hybridomzellstämme gezüchtet werden. Geeignete Zellstämme sind der Thioguamin-resistente GM-150, der Ouabain-resistente Lymphoblastoide Zellstamm KR-4, beschrieben bei Cole et al. weiter oben. Die resultierenden Hybridome werden nach üblichen Techniken geklont.

Zellvermehruna und Antikörpererzeuauna

Sobald die gewünschten verschmolzenen Zellhybride oder transformierten Zellstämme selektiert und in individuelle Antikörper erzeugende Zellstämme geklont worden sind, kann jeder Zellstamm nach einer von zwei üblichen Methoden vermehrt werden. Der einzelne Zellstamm kann in vitro vermehrt werden, zum Beispiel in Laborkulturgefässen, und das Kulturmedium, das hohe Konzentrationen eines einzigen spezifischen monoklonalen Antikörpers enthält, kann durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren geerntet werden. Alternativ kann die Ausbeute an monoklonalem Antikörper erhöht werden durch Injizieren einer Probe des Hybridoms in ein gewebeverträgliches Tier des Typs, der verwendet worden ist, um die somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion zu liefern. Tumore, die den spezifischen monoklonalen Antikörper sekretieren, der durch das vereinigte Zellhybrid erzeugt worden ist, entwickelt sich in dem Tier. Die Körperflüssigkeiten des Tieres, wie Aszitesflüssigkeit oder Serum, liefern monoklonale Antikörper in hohen Konzentrationen. Wie von Cole et al. in der weiter oben angegebenen Literaturstelle diskutiert, ist es bei Verwendung von Humanhybridomen oder EBV-Hybridomen nicht nötig, Rejektion des in die Tiere, wie Mäusen, injizierte Xenograft zu vermeiden. Immundefiziente oder kahle Mäuse können verwendet werden oder das Hybridom kann passiert werden zuerst durch bestrahlte kahle Mäuse als ein fester subkutaner Tumor, in vitro gezüchtet und dann intraperitoneal in pristane vorbereitete bestrahlte kahle Mäuse injiziert, welche Aszitestumore entwickeln, die grosse Mengen der spezifischen Human-monoklonalen Antikörper sekretieren (siehe Cole et al. weiter oben).

Monoklonale Antikörper

Der erfindungsgemässe Antikörper verbindet sich mit einem neuen Zelloberflächen-Glycoprotein-An-tigen, bezeichnet mit Antigen L20, charakteristisch für Human-NSCLC-Zellen und Zellen von bestimmten anderen Humankarzinomen (siehe nächstes Kapitel). Das Glycoprotein-Antigen hat ein Molekulargewicht von etwa 110 000 Dalton, wenn es der Immunpräzipitation bei der Elektrophorese an Po-lyacrylamidgel unterworfen wird (siehe Kapitel «Antigen, anerkannt durch Antikörper L20» im Beispielteil). Digerieren des Antigens L20 mit Glycanase zeigte, dass es N-verknüpfte Oligosaccharid-ketten enthält.

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Als ein Erläuterungsbeispiel wird der Antikörper L20 durch das murine (zu Mäusen gehörige) Hybri-dom erzeugt, wie im Kapitel «Herstellung von monoklonalen Antikörpern» beschrieben. Der Antikörper L20 ist vom IgGI-lsotyp und (siehe Kapitel «Isotyp-Bestimmung von Antikörper L20» im Beispielteil) hat eine Avidität von etwa 3 x 108. Es bindet sich nicht nachweisbar an normale Zellen, wie Fibroblaste, Endothelzellen oder Epithelzellen in den wichtigsten Organen. Mit «bindet sich nicht nachweisbar» ist gemeint, dass nur eine sehr schwache Färbung oder überhaupt keine Färbung in immunhistologischen Tests nachweisbar ist.

In den Rahmen der Erfindung fallen auch geeignete Bindungsfragmente von dem vorstehenden monoklonalen Antikörper, wie Fab, F(ab')2 und (Fv-Fragmente. Die Antikörperfragmente werden nach üblichen Techniken erhalten. So können zum Beispiel geeignete Bindungsfragmente durch Peptidase-Dige-stion des Antikörpers unter Verwendung von Papain oder Pepsin hergestellt werden. Ähnliche Antikörper, einschlienlich Antikörper verschiedener Isotypen, verschiedener Affinität und neuer biologischer Funktionen, wie die Fähigkeit, Tumorzellen in Gegenwart von Komplement- oder Effektorzellen, wie Lymphocyten oder Makrophage, zu töten, liegen ebenfalls im Rahmen der Erfindung. Während das weiter vorn gebrachte spezifische Beispiel für den neuen Antikörper nach der Erfindung auf einen Antikörper gerichtet ist, der an eine spezifische Determinantstelle an dem jeweiligen Antigen bindet, und von der Unterklasse IgGI einer murinen (murine = zu den Mäusen gehörig) Quelle ist, ist dies nicht als eine Beschränkung hierauf aufzufassen. Der vorstehend beschriebene Antikörper und Antikörper mit funktionaler Äquivalenz mit dem oben beschriebenen Antikörper sind in die Erfindung eingeschlossen, gleichgültig, ob sie von einer murinen Quelle stammen oder von anderen Säugetierquellen, einschliesslich den Menschen oder anderen Quellen oder Kombinationen davon sowie Antikörper anderer Isotypen. Der Ausdruck «funktionale Äquivalenz» bedeutet, dass der Antikörper in der Lage ist, sich an die oben beschriebene Determinantstelle zu binden und in der Lage ist, mit einem bestimmten Antikörper nach der Erfindung für solche Stelle zu konkurrieren. Das heisst, wenn ein solcher Antikörper mit einer Probe zusammengebracht wird, die eine Zelle oder ein Zellfragment mit einer solchen Determinantstelle enthält, wird er sich an die Determinantstelle binden und einen Antikörper nach der Erfindung am Binden an der Stelle hindern.

Die Erfindung schliesst auch Antikörper ein, die in Gegenwirkung auf Antigen-Bindungsstellen hergestellt sind, oder Idiotypen von dem Antikörper L20, weil solche anti-idiotypischen Antikörper zum Analysieren der Immunantwort auf Tumorantigene für Diagnosezwecke zum Einleiten von Immunantworten für therapeutische oder profilaktische Zwecke verwendet werden können (Nepom et al., 1984, Proc. Nat'1 Acad. Sei. 81:2664).

Antigen L20. erkannt durch monoklonale Antikörper

Das Antigen, durch die monoklonalen Antikörper nach der Erfindung erkannt, ist ein neues Zellober-flächen-Glycoprotein-Antigen, charakteristisch für NSCLC-Zellen und bestimmte andere Karzinome, einschliesslich Brust-, Dickdarm- und Kleinzellen-Lungen-Karzinome. Das Antigen hat ein Molekulargewicht von etwa 110 000 Dalton.

Die aminoterminale Aminosäuresequenz des neuen Glycoprotein-Antigens ist wie folgt:

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L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-v-A-L-V-G-T-D-A-X-L

in welcher X für eine Aminosäure steht, die bis jetzt noch nicht identifiziert ist, und die übrigen Buchstaben die für die Aminosäuren gebräuchlichen Abkürzungen sind. Ein Vergleich dieser Sequenz mit denen, die in der gegenwärtigen Proteindatenbank (PIR Release 6.0, November 1985) gespeichert sind, zeigt keine signifikante Sequenzübereinstimmung mit irgendwelchen anderen bekannten Sequenzen.

Verwendung der monoklonalen Antikörper und des Antigens L20

ai Diagnostische Anwendungen

Die monoklonalen Antikörper nach der Erfindung können als Sonden zum Nachweis diskreter Antigene in Human-NSCLC und anderen Tumoren verwendet werden. Ein Verfahren nach der Erfindung umfasst die Bestimmung der Anwesenheit einer bösartigen Kondition in Lungengewebe und anderen Humangeweben durch Prüfung des Gewebes auf das Auspressen oder das Fehlen des Auspressens eines Glycoprotein-Antigens mit den Charakteristiken von dem Antigen L20. Der Ausdruck «mit den Charakteristiken von» bedeutet, dass das Antigen mit einem Antikörper reaktiv ist, welcher das Antigen L20 erkennt. Das Auspressen oder das Fehlen des Auspressens dieses Antigens kann eine klinisch ausnutzbare Information geben, die mit Standard histopathologischen Techniken nicht verfügbar ist.

Die monoklonalen Antikörper nach der Erfindung können zum Beispiel verwendet werden zum Nachweis von Kieinzellen-Lungenkarzinomzellen in histologischen und cytologischen Proben. Bei Verwen-

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dung der Immunperoxidase-Färbetechnik, beschrieben im Kapitel «In vitro immunhistologische Anwendung» zeigen herausgeschnittene Gewebsproben von Adenokarzinom, Epidermoid- und Kleinzellenkar-zinom der Lunge intensive positive Färbung. Normale Lunge, Milz, Brust, Dickdarm, Niere, Leber, Gehirn, Herz, Haut, Schilddrüse, Hoden, Vagina und normale Lymphocyten waren negativ.

Eine andere wichtige diagnostische in vitro Anwendung der erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper ist die Bewertung von anderen Karzinomen als dem NSCLC. Der Antikörper ist zum Nachweisen des Epitops in Karzinomen der-Brust,-des Dickdarms und nn Kleinzellen-Lungenkarzinomen verwendet worden. Normale Proben dieser Gewebe pressten die Determinante nicht aus. So ist der monoklonale Antikörper zum Nachweis einer antigenen Determinante in diesen Karzinomen, welche tumor-assoziiert ist, geeignet. Daher ist der monoklonale Antikörper ein geeignetes diagnostisches Reagens für Brust-und Dickdarm-Karzinome und für Kleinzellen-Lungenkarzinom.

Alternativ können Immunfluoreszenztechniken zur Prüfung von Humangewebsproben mit den monoklonalen Antikörpern nach der Erfindung verwendet werden. Objektträger mit kryostatischen Sektionen von gefrorenen unfixierten Biopsie-Geweben oder herausgeschnittenen Tumorproben oder cytologi-schen Abstrichen werden an der Luft getrocknet und mit dem monoklonalen Antikörper in einer befeuchteten Kammer von Raumtemperatur bebrütet. Die cytologischen Abstriche schliessen abblätternde Zellproben ein. Der Ausdruck «abblätternd» bedeutet, dass die Probe isolierte Zellen oder Zellklumpen, die durch Abschaben oder Abwaschen der Gewebsoberfläche erhalten worden sind, einschliesst, wobei die Zellen einzeln oder in Schuppen oder Schichten entfernt werden. Die abblätternde Zellprobe ist von herausgeschnittenen Geweben und durch Biopsie erhaltenen zu unterscheiden. Das Verfahren kann zum Nachweis einer bösartigen Kondition in abblätternden Zellproben der Lunge, wie Sputumproben, der Bronchien, dem Gastrointestinaltrakt, einschliesslich oraler Pharynx, Mund, einem Halsabstrich usw. Verwendung finden.

Nach dem Trocknen werden die Objektträger mit einer Zubereitung von Antikörper gegen den monoklonalen Antikörper beschichtet, gewöhnlich mit irgendeinem Typ von Antimaus-Immunglobulin, wenn der verwendete monoklonale Antikörper von der Fusion von Mausmilz-Lymphocyten und einem Maus-Mye-lomstamm stammt. Dieses Antimaus-Immunglobulin wird unter Anwendung bekannter Techniken mit einer Verbindung, wie Rhodamin oder Fluorescein-Isothiocyanat, die bei einer bestimmten Wellenlänge fluoresziert, konjugiert. Das Farbmuster und die Intensität der Probe werden dann durch Fluoreszenzlichtmikroskopie bestimmt und wenn gewünscht, fotografisch festgehalten.

Die vorstehende Beschreibung ist in erster Linie auf die Vewendung der Antikörper nach der Erfindung bei Immunofluoreszenztechniken gerichtet. Die Antikörper nach der Erfindung können jedoch in den meisten Essays verwendet werden, die Antigen-Antikörper-Reaktionen einschliessen. Die Essays können homogen oder heterogen sein. In einem homogenen Essay kann die Probe ein gelystes und zur Entfernung von Resten geklärtes Gewebe sein. Die immunologische Reaktion umfasst gewöhnlich den spezifischen Antikörper, eine markierte Analysierkomponente und die interessierende Probe. Das Signal, das von der Markierung kommt, wird nach der Bindung des Antikörpers an die markierte Analysierkomponente (analyte) direkt oder indirekt modifiziert. Beides, die immunologische Reaktion und der Nachweis des Grades derselben werden in einer homogenen Lösung vorgenommen. Immuno-chemische Markierungen, die verwendet werden können, schliessen freie Radikale, Fluoreszenzfarbstoffe, Enzyme, Bakteriophage, Coenzyme und dergleichen ein.

Bei einem heterogenen Essay-Versuch sind die Reagenzien gewöhnlich die Probe, der spezifische Antikörper und ein Mittel zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals. Der monoklonale Antikörper ist gewöhnlich als eine Schicht auf einen festen Träger oder einer festen Phase aufgebracht. Die in flüssiger Phase befindliche Probe wird dann mit dem Antikörper in der festen Phase in Kontakt gebracht. Der Festphasen-Träger wird dann von der flüssigen Phase getrennt und entweder die feste Phase oder die flüssige Phase auf ein nachweisbares Signal hin geprüft, wobei Mittel zur Erzeugung eines solchen Signals verwendet werden. Das Signal zeigt die Anwesenheit der analytischen Komponente in der Probe an. Mittel zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals sind zum Beispiel die Verwendung von radioaktiven Markierungen, fluoreszierenden Verbindungen, Enzymen usw. Beispiele für heterogene Immunessays sind der Radioimmunessay, Immunfluoreszenzverfahren, enzymverknüpfte Immunessays und dergleichen. Über eine detailliertere Besprechung der vorstehenden Immunassaytechniken siehe: «Enzyme-Immunoassay» von Edward T. Maggio, 1980, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida; US 3 690 834, 3 791 932, 3 817 837, 3 850 578, 3 853 987, 3 867 517, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345 und 4 098 876. Diese Liste ist nicht vollständig.

Die Antikörper nach der Erfindung können auch für in vivo diagnostische Anwendungen herangezogen werden. Zum Beispiel können Antikörper oder Fragmente, hergestellt aus Antikörpern, wie Fab und F(ab')2-Fragmente zur Darstellung von Tumoren verwendet werden, einschliesslich metastabiler Abscheidungen in Humanpatienten mit NSCLC analog der Art und Weise wie es Larson et al. für bösartiges Melanom beschrieben hat: 1983, J. Nucl. Med. 24:123, und 1983, J. Clin. Invest. 72:2101. Der gereinigte Antikörper oder die Fragmente davon werden mit einem Agens markiert, das ein nachweisbares Signal gibt, zum Beispiel mit einem Radioisotop, wie 131l und in einem geeigneten Träger, zum Beispiel intravenös einem Patienten eingegeben. Die Lokalisation des tumorgebundenen Antikörpers wird nachgewiesen durch externe Szintographie, Emissionstomographie oder Kernstrahlen-Scannen unter Verwendung von zum Beispiel einer Gamma-Kamera.

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fcrt Therapeutische Anwendungen

Die Antikörper nach der Erfindung können auch therapeutisch verwendet werden. Die monoklonalen Antikörper können in Verbindung mit einem breiten Spektrum von pharmazeutischen und cytotoxischen Mitteln verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Antikörper gebunden werden an ein Toxin zur Bildung eines muntoxins (Jansen et al., 1982, Immunol. Rev. 62:185) oder an ein radioaktives Material, z.B. 125J, 131J usw. (Order, 1984, Compr. Ther. 10: 9; Larson et al., 1983, J. Glin. Invest. 72: 2101; Carrasquillo et al., 1984, Cancer Treatment Reports, 68:317) oder an ein Arzneimittel (Rowland et ai., 1985, Cancer Immunol. Immunother. 19:1), um ein Radiopharmazeutikum oder Pharmazeutikum zu bilden. Konjugierte Antikörper können Patienten verabreicht werden, um die tumoriziden Effekte durch die cytotoxische Wirkung des chemotherapeutischen Mittels, das an den Tumor abgegeben wird und auf der Bindungsaffinität des Antikörperteiis basiert, zu erhöhen.

Sogenannte «schimärische Antikörper»-Moleküle des Antikörpers nach der Erfindung können hergestellt werden, die eine Maus-Antigen-Bindungsdomäne mit Humandomänen mit konstantem Teil (mouse antigen-binding domain with human constant région domains) enthalten (Morrison et al., 1984, Proc. Nat'1 Acad Sei. USA 81: 6851; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452). Dieser Versuch kann benutzt werden, um neue Antikörpermoleküle mit den gewünschten Wirkfunktionen aufzubauen, wie mit der Fähigkeit, das Humankomplement zu aktivieren und ADCC zu vermitteln (Neuberger et al., 1984, Nature 312:604).

Eine andere therapeutische Anwendung der monoklonalen Antikörper der Erfindung ist die Herstellung von anti-idiotypischen Antikörpern unter Verwendung des Antikörpers L20 als dem Immunogen (siehe zum Beispiel Nepom et al., 1984, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA, 81:2864; Lee et al:, 1985, Proc. Nat'1 Acad. Sei 82:6286).

Ein attraktiver Aspekt der Erfindung ist, dass die Antikörper mit anderen Antikörpern auf NSCLC und andere Tumore kombiniert werden kann, wie offenbart in den US-Patentanmeldungen Serial No. 667 521 vom 2.11.84; Serial No. 684 759 vom 21.12.1984 und Serial No. 738 612 vom 28.5.85. Die Kombination ist zum Nachweis der oben erwähnten Typen von Nichtkleinzellen-Lungenkarzinomen, nämlich undifferenziertem Grosszellen-Lungenkarzinom, Adenokarzinom und Epidermoidkarzinom geeignet.

Die monoklonalen Antikörper nach der Erfindung definieren auch Determinantstellen an einem Antigen, das mit anderen Karzinomen assoziiert ist, wie Brustkarzinom, Dickdarmkarzinomen und Kleinzellen-Lungenkarzinom (siehe Tabelle I). Folglich können die Antikörper nach der Erfindung in therapeutischen Verfahren und therapeutischen Produkten, die auf solche Karzinome gerichtet sind, Verwendung finden.

Das neue Antigen nach der Erfindung, mit Antigen L20 bezeichnet, kann auch therapeutisch verwendet werden. Das Antigen kann aus Tumoren herausgewaschen oder nach der DNA-Rekombinant-Tech-nologie erzeugt werden (schwebende US-Patentanmeldung Serial No. 827 313 eingereicht am 7.2.86 und hier durch den Hinweis eingearbeitet). Die Gencodierung für das Antigen L20 kann nach Verfahren klo-niert werden, bei welchen zuerst das mRNA des Antigens L20 angereichert wird. Bei einem solchen Verfahren können Polysome (bestehend aus mRNA, Ribosome und naszierenden Polypeptidketten) gereinigt werden durch Immunaffinitätschromatographie mit einem Antikörper, der die antigenische Determinante von L20 an der naszierenden Kette erkennt. Das mRNA wird durch Immunpräzipitation mit zum Beispiel dem Antikörper L20 isoliert und das cDNA wird in einem geeigneten Expressionsvektor geklont.

Alternativ kann der Antikörper L20 oder das Antiserum zum Antigen L20 verwendet werden «to screen a cDNA library» unter Verwendung eines Expressionsvektors. Das gereinigte oder geklonte Antigen L20 kann allein als ein Immunogen oder zusammen mit einem geeigneten immunologischen Adjuvant verabreicht werden. Alternativ kann die Gencodierung für das Antigen in das Gen eines Virus eingesetzt werden, zum Beispiel in das Vakzinevirus, um ein Rekombinant-DNA-Produkt zu erzeugen, das als Immunogen verwendet werden kann (schwebende US-Patentanmeldung Serial No. 827 313, eingereicht am 7. Februar 1986).

Diagnostik-Kits (Diaonostik-Reaaenssätzei

Diagnostik-Kits zur Ausführung der vorstehend offenbarten Verfahren können enthalten: (a) einen monoklonalen Antikörper, der vorstehend genauer beschrieben ist, und (b) ein Konjugat eines spezifischen Bindungspartners für den monoklonalen Antikörper und eine Markierung, die in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Die Reagenzien können auch Hilfsagenzien einschliessen, wie Puffer und Proteinstabilisierungsmittel, zum Beispiel Polysaccharide und dergleichen. Das Diagnostik-Kit kann ferner, wenn nötig, andere Komponenten des signalerzeugenden Systems enthalten, einschliesslich Mittel zur Herabsetzung der Hintergrundinterferenz, Kontrollreagenzien, ein Gerät zur Durchführung eines Tests usw. Bei einer anderen Ausführungsform enthält das Diagnostik-Kit ein Konjugat eines monoklonalen Antikörpers nach der Erfindung und eine Markierung für die Erzeugung eines nachweisbaren Signals. Hilfsmittel, wie vorstehend angegeben, können ebenfalls vorliegen.

Beispiele

Die Erfindung wird nun an Beispielen näher beschrieben.

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1. Herstelluno von monoklonalen Antikörpern

Monoklonale Antikörper wurden unter Anwendung der Hybridom-Fusionstechniken, beschrieben von Yeh et al., 1979, Int. J. Cancer 29: 299, hergestellt. Eine drei Monate alte Balb/cMaus wurde unter Verwendung explantierter gezüchteter Zellen von einem Human-Adenokarzinom der Lunge, bezeichnet mit 3082, als dem Immunogen immunisiert. Die Maus erhielt vier intraperitoneale Injektionen von etwa 107 Zellen. Drei Tagenach der letzten Immunisierung wurde ihr die Milz entfernt, in Kulturmedium suspendiert und mit NS1-Maus-Myelomzellen durch Fusion vereinigt (Kohler und Milstein, o.a.). Die Mischung wurde geimpft, um Kulturen niedriger Dichte zu bilden, die aus einzelnen durch Fusion vereinigten Zellen entstanden sind (Klone).

Überstände von Hybridzellen wurden gesichtet auf (screened for) direkte Bindungsaktivität an Lun-genkarzinom-Zellstämmen unter Anwendung sowohl eines Elisa-Essays, als auch eines autoradiographischen Essays mit 125J-markiertem Protein A (Brown et al., 1979, J. Immunol. Meth., 31:201 ). Extrakte von Zellmembranen von dem Tumor, verwendet für Immunisierung, wurden hergestellt unter Anwendung eines Verfahrens, modifiziert von Colcher et al., 1981, Cancer Res. 42: 1451; Yeh et al., o.a. Gewebe wurden mit PBS gewaschen und Zellen von intakten Tumoren wurden durch Pressen durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl suspendiert. Danach wurde 1 mM NaHC03, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthaltend (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA) zugegeben und das Material auf Eis mit 50 Schlägen des Stössels B eines Dounce-Homogenisators homogenisiert. Nach 15 Minuten langem Zentrifugieren bei 27 000 x g wurde der Überstand entfernt, das Pellet in PBS resuspendiert, 1 Minute beschallt und bei -70°C gelagert.

Hybridome, die Antikörper erzeugen, welche an die Zellmembranextrakte binden, wurden geklont, in vitro expandiert und auf Antikörper-Spezifität getestet. Die Hybridome, die Antikörper von ersichtlicher Spezifität auf Human-Lungenkarzinom erzeugen, wurden reklont, expandiert und in mit Pristan vorbehandelte, drei Monate alte Balb/c-Mäuse injiziert, wo sie als Aszitestumore wuchsen.

Nach diesem Verfahren wurde der Hybridom-Zellstamm L20 erhalten, geklont und Mäusen injiziert, um einen Aszites-Tumor zu entwickeln. Antikörper, in den Aszites-Tumor sekretiert, wurde an Protein A Separose (Ey et al., 1978, Immunochemistry, 15: 429) oder durch Gelfiltration in Sephacryl S-300 gereinigt. Der gereinigte Antikörper wurde für eine weitere Charakterisierung verwendet.

2. Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers L20 2.1. Nachweisen und Binden von L20 an gezüchteten Zellen

Die subzellulare Lokalisation von Antigen wurde bestimmt durch Messung der Antikörperbindung an Zellen vor und nach der Permeabilisation mit nicht-ionischem Detergens. Die Antikörperbindungen an die Zelloberfläche von intakten gezüchteten Zellen wurde identifiziert entweder durch direkte Bindungsessays mit 125J-markiertem Antikörper (Brown et al., 1981, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA, 78: 539) oder durch indirekte Fluoreszenz unter Verwendung des fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers (FACS) II. Antikörperbindungen an intrazellulare Lagen wurden bestimmt durch direkte Bindung von mit 125J-mar-kiertem Antikörper an Zellen, Fixierung mit Paraformaldehyd und anschliessender Permeabilisierung mit dem nicht-ionischen Detergens NP-40.

Für die Bindungsessays, die unter Verwendung von mit radioisotopen markierten Antikörpern (Brown et al., o.a.) durchgeführt wurden, wurden gezüchtete Zellen (106) 30 Minuten auf Eis mit 106 cpm von i25j-markiertem Antikörper in 100 nl Bindungspuffer bebrütet. Die Suspension wurde als Schicht auf 0,2 ml Dinonylphthalat:Dibutylphthalat (1:1 v/v) aufgetragen und zentrifugiert. Das Pellet und die wässrige Phase wurden auf 125J gezählt. Zum Bestimmen von nicht-spezifischen Bindungen wurden parallel dazu Bebrütungen von unmarkiertem Antikörper als Vergleich durchgeführt (Brown et. al., o.a.).

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Tabelle I

Bindung von mit radioaktivem Jod markiertem Antikörper L20

an gezüchtete Zellen

Zeilen

Spezifische Bindungen

Calu-1 -Lungen-Adenokarzinom

H3082 Lungen-Adenokarzinom

H2981 Lungen-Adenokarzinom

H2984 Lungen-Adenokarzinom

MCF7 Brustkarzinom

3017 Melanom

Normal T Zellen

JurkatT Leukemia

Daudi B Lymphoma

45.400

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78.800

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2.2. Isotyp-Bestimmuna von Antikörper L20

Um die Klasse der Immunglobuline, die durch den Hybridomzellstamm L20 erzeugt werden, zu bestimmen, wurden folgende Techniken angewendet:

ai Ouchterlonv Immundiffusion

Ein Aliquotüberstand von partikulären Hybridomzellen wurde in den im mittleren Behälter einer 25%igen Agarplatte eingebracht. Monospezifische Kaninchen-Antimaus-Ig-Isotype Antikörper (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) wurden in die äusseren Behälter eingebracht und die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur und über Nacht bei 4°C bebrütet.

bi ELISA-Isotvoina

Dynatech Immuolon-Platten mit 96 Behältern wurden mit jedem Antiserum einer Konzentration von 1 jig/ml in PBS, 50 fxl pro Behälter, beschichtet und über Nacht bei 4°C zugedeckt stehen gelassen. Die Platten wurden mit PBS/Tween 20, 0,05%ig, gewaschen und mit Nährboden (medium) 100 nl pro Behälter eine Stunde bei Raumtemperatur eingeschlossen. Nach dem Waschen der Platten wurden die Überstände von dem Hybridom L20 zugefügt und bei Raumtemperatur eine Stunde bebrütet. Nach dem Waschen mit PBS wurden Rinderserumalbumin (BSA)-Platten bei 37°C zwei Stunden mit monospezifischen Kanin-chen-Antimaus-lg-lsotyp-Antikörpern an Peroxidase (Zymed) gekuppelt. Nach dem Waschen wurden die Platten mit 1 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,03%igem H2O2 in 0,1 M Citratpuffer von ph 4,5 bebrütet. Die optische Dichte bei 630 nm wurde an einem Dynatec-ELISA Plattenableser bestimmt.

Der monoklonale Antikörper L 20 ist von dem IgGHsotyp.

3. Antigen, erkannt durch den Antikörper L20

Um Protein-Antigene zu identifizieren, wurden Lungenkarzinomzellen an der Oberfläche mit radioaktivem Jod oder metabolisch mit 35S-Methionin markiert. Antigene wurden aus Zellysaten isoliert durch Bebrüten mit monoklonalem Antikörper, Zugeben von Ziegen-Antimaus-IgG und Adsorption an Staphylo-coccus aureus. Die Immunpräzipitate wurden gewaschen und der präparativen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) an einem 10 bis 20%igem Acrylamidgel ausgesetzt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Brillant Blau (0,5 Gew.-% zu 10% Essigsäure und 30% Isopropanol) gefärbt und in einer Lösung von Essigsäure (5%, v:v) und Methanol (17%, v:v) entfärbt. Das gefärbte Antigen L20-Band wurde mit einer Rasierklinge beaufschlagt und unmittelbar einer Elektro-elution mit einem ECU-040-Elektroeluter/Konzentrator (C.B.S. Scientific Co., San Diego, CA) nach den Methoden von Hunkapiller et al., 1983, Methods in Enzymol. 91:227-236 unterworfen.

Der automatisierte Edman-Abbau wurde mit etwa 23 pMol Antigen L20 (basiert auf der Ausbeute von identifiziertem L-1) in einem Gasphasen-Sequenzer (Modell 470A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) durchgeführt. Die Phenylthiohydantoin-Aminosäure-Derivate wurden analysiert mittels Hochiei-stungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Model 120A on-line HPLC-Einheit (Applied Biosystems, Inc.) mit einer PTH-C18-Säule (2,1 x 220 mm, Applied Biosystems, Inc.) und einem Natriumacetat/Tetrahydrofuran/Acetonitril-Gradient für die Elution.

Die aminoterminale Aminosäuresequenz ist wie folgt:

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in der X eine Aminosäure bedeutet, die nicht identifiziert worden ist.

Ein Vergleich dieser Sequenz mit denen, die in der Protein-Datenbank (PIR Release 6.0, November 1985) gespeichert sind, zeigte keine signifikante Ähnlichkeit mit irgendeiner anderen bekannten Sequenz.

Das Antigen, das von dem Antikörper L20 erkannt wurde, ist ein Glycoprotein-Antigen eines Molekulargewichts von etwa 110 000 Dalton.

4. In vitro immunhistoloaische Anwendung

Die Techniken mit unmarkiertem Antikörper von Sternberger, 1979, Immunochemistry, John Wiley + Sons, New York, pp: 104-169, modifiziert von Garrigues et al., 1982, Int. J. Cancer 29: 511 wurde für im-munhistologische Studien an eingefrorenen Gewebsschnitten (frozen sections) herangezogen. Die Tar-get-Gewebe für diese Tests wurden bei chirurgischer Behandlung erhalten und innerhalb von vier Stunden nach Entnahme in in flüssigem Stickstoff vorgekühltem Isopentan eingefroren. Die Gewebe wurden dann in flüssigem Stickstoff oder bei -70°C bis zu ihrem Gebrauch gelagert. Kaninchen-Antimaus-IgG (Sternberger-Meyer, Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) wurde bei einer Verdünnung von 1/50 verwendet. Maus-Peroxidase-Antiperoxidase-Komplexe (PAP, Sternberger-Meyer, Immunochemicals, Inc.), die 2 mg/ml von speziell gereinigtem PAP enthielten, wurden bei einer Verdünnung von 1/80 verwendet. Die eingefrorenen Schnitte wurden präpariert, getrocknet, mit Aceton behandelt und getrocknet (Garrigues et al., o.a.). Die für die histologische Bewertung verwendeten Schnitte wurden mit Häma-toxylin gefärbt. Um die nicht-spezifischen Hintergründe zu vermindern, wurden die Schnitte mit Normalhumanserum, 1/5 verdünnt, vorbebrütet (Garrigues et al., o.a.). Maus-Antikörper, Ziegen-Antimaus-IgG und Maus-PAP wurden in einer Lösung von 10%igem Normalhumanserum und 3%igem Kaninchenserum verdünnt.

Das Färbeverfahren bestand aus 2,5 Stunden langem Behandeln von Reihenschnitten mit entweder spezifischem oder Kontroll-Antikörper, 30 Minuten langem Bebrüten mit Kaninchen-Antimaus-IgG, 1/50 verdünnt, und 30 Minuten langem Aussetzen dem PAP-Komplex, 1/80 verdünnt. Nach jeder Behandlung mit Antikörper wurden die Objektträger zweimal in PBS gewaschen. Die immunhistochemische Reaktion wurde mit frisch bereitetem 0,5%igem 3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (Sigma, St. Louis, MO) und 0,01%igem Ha02 in 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,6, 8 Minuten entwickelt. Weiteres Aussetzen einer 1%igen OsCXt-Lösung in destilliertem Wasser 20 Minuten lang verstärkte die Färbung. Die Schnitte wurden mit Wasser gespült, in Alkohol entwässert, in Xylol gereinigt und auf Objektträger aufgebracht.

Jeder der Objektträger wurde unter einem Code bewertet und die codierten Proben wurden durch einen unabhängigen Wissenschaftler geprüft. Typische Objektträger wurden unter Benutzung von Diffe-rential-Interferenz-Kontrast-Optiken (Zeiss-Nomarski) fotografiert. Der Grad der Antikörperfärbung wurde wie folgt bewertet: 0 keine Reaktivität, + ganz schwach positive Zellen, ++ mindestens ein Drittel der Zellen positiv, +++ fast alle Zellen positiv, ++++ nahezu alle Zellen stark positiv. Da die Unterschiede zwischen + und 0-Färbung weniger deutlich waren als zwischen + und ++-Färbung, wurde eine Färbung mit ++ und mehr als «positiv» angesehen. Sowohl neoplastische als Stromazellen wurden in Tumorproben beobachtet. Die registrierte Färbung ist die der Tumorzellen, da die Stromazellen überhaupt nicht gefärbt wurden oder wenn gefärbt, dann sehr viel schwächer als die Tumorzellen.

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Tabelle II

Immunperoxidase-Färbung von Tumor- und normalen Gewebszellproben mit dem monoklonalen Antikörper L20

Gewebetyp

Zahl positiv/Zahl getestet*

Lungenkarzinom:

Adenokarzinom

Epidermoid

Bronchial

Kleinzellen

Lungenkarzinom:

Zellstämme

Brustkarzinom

Dickdarmkarzinom

Melanom

Rückenmarkskarzinom

Liposarcom

Normale Lunge

Normale Milz

Normale Brust

Normaler Dickdarm

Normale Niere

Normale Leber

Normales Gehirn

Normales Herz

Normale Haut

Normale Schilddrüse

Normaler Hoden

Normale Vagina

Normales Lymphocyten-Pellet

18/20 3/3 0/1 4/4

3/3 4/7 5/8 5/8 1/1 0/1

1 von 3 getesteten Proben schwach gefärbt negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ

* Alle geprüften Proben waren eingefrorene Gewebsschnitte, die chirurgisch erhalten worden sind. Siehe Text der detaillierten Beschreibung von immunhistologi-schen Methoden. Eine Färbung von 2+ (was bedeutet, dass mindestens ein Dritte! aller Zellen positiv waren) wurde als positiv angesehen.

Ein Zellstamm L20, wie er hier beschrieben ist, ist am 9. Oktober 1985 hinterlegt worden bei «The American Type» Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland «20 852-US» und hat die AT-CC-Hinteriegungsnummer HB8913 erhalten.

Claims (14)

Patentansprüche 1. Monoklonaler Antikörper, der sich an eine Zelldeterminantstelle an einem Oberflächenglycoprotein-Antigen von Human-Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinomzellen bindet, wobei das Antigen gekennzeichnet ist durch ein Molekulargewicht von etwa 110.000 u (Dalton), bestimmt mittels Polyacrylamidgel-Elektro-phorese, und eine aminoterminale Aminosäuresequenz wie folgt:

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|__x-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L

in welcher X eine nicht-identifizierte Aminosäure bedeutet, sowie Fab-, F(ab')2- und Fv-Fragmente und anti-idiotypische Antikörper des Antikörpers.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er mit einer Markierung konjugiert ist, die in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zu erzeugen.

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3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung eine fluoreszierende Verbindung oder ein Chromophor ist.

4. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er von der Klasse IgG ist.

5. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er von der Unterklasse IgGI ist.

6. Verfahren -zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Zellstamm A.T.C.C. Nr. HB 8913 gezüchtet wird, und die sekretierten Antikörper gewonnen werden.

7. Verfahren zum in-vitro-Nachweis von Nicht-Kleinzellen-Lungenkarzinom, gekennzeichnet durch Inkontaktbringen des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1 mit einer Human-Gewebsprobe, und Nachweisen der Zusammenwirkung des Antikörpers mit antigenisch korrespondierenden Karzinomzellen oder antigenen Determinanten davon in der Probe.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Humangewebe Lungengewebe verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammenwirkung durch immunhi-stologische Färbung nachgewiesen wird.

10. Verfahren zum in-vitro-Nachweis von KleinzellenLungenkarzinom, gekennzeichnet durch Inkontaktbringen des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1, mit einer Humangewebsprobe und Nachweisen der Zusammenwirkung des Antikörpers mit antigenisch korrespondierenden Karzinomzellen oder antigenen Determinanten davon in der Probe.

11. Verfahren zum in-vitro-Nachweis von Brustkarzionom, gekennzeichnet durch Inkontaktbringen des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1 mit einer Probe von Humangewebe oder Humanflüssigkeit und Nachweisen der Zusammenwirkung des Antikörpers mit antigenisch korrespondierenden Karzinomzellen oder antigenen Determinanten davon in der Probe.

12. Verfahren zum in-vitro-Nachweis von Dickdarmkarzinom, gekennzeichnet durch Inkontaktbringen des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1 mit einer Probe von Humangewebe oder Humanflüssigkeit und Nachweisen der Zusammenwirkung des Antikörpers mit antigenisch korrespondierenden Karzinomzellen der antigenen Determinanten davon in der Probe.

13. Glycoprotein-Antigen in weitgehend gereinigter Form, welches durch einen Antikörper gemäss Anspruch 1 gebunden wird, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 110 000 u (Dalton), bestimmt mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese, und eine aminoterminale Aminosäuresequenz wie folgt:

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L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L

in der X eine nicht-identifizierte Aminosäure bedeutet.

14. Ein Zellstamm mit der A.T.C.C. Nr. HB 8913 zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gemäss Anspruch 1.

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