SE9201529A0 - Monoklonala antikroppar och antigen för icke-småcelligt humanlungkarcinom och vissa andra humankarcinom - Google Patents

Description

OO nl O 0 000 000! 000 Û O OI nu 0000 oo oc: un: 0000 s.::"' = - Ü I , _ _ I... Û '° l É' o o o o . . .ggn n o: nu n en o I de erhållna antikropparna kan förmedla antikroppberoende cellular cytotoxicitet eller kan vara cytolytieka mot tumörceller i närvaro av kompletterande komponenter.

E. UDÜFINNINGENS BQRGRUND 3.1. HUMQNLUNGHQRCINOM Lungkarcinom är ansvariga för huvuddelen av dödsfallen i cancer bland man och håller på att överta rollen hos bröstkarcinom som den vanligaste orsaken till cancerdöd bland kvinnor. Denna sjukdom kan uppdelas i fyra histo~ logiska huvudtyper: (1) epidermoid eller skvamös (30 %), (E) adenokarcinom (35 %), (3) stürcellig üdifferentierad (15 %) och (4) smàcellig (EQ %). Uttrycket "icke~små~ celligt lungkarcinom" (NSCLC) innefattar följande cell- typer: epidermoida karcinomceller, adenokarcinomceller och stora odifferentierade karcinomceller.

De flesta Fall av lungkarcinom kan ej botas med kemote- rapi och strâlningsterapi. Småcelliga lungkarcinom kan svara på kemoterapi och strâlningsterapi genom en minsk- ning i storlek men detta ger ej ett Fullständigt hotande.

Fullständigt kirurgiskt avlägsnande av tumören synes vara den enda effektiva terapin. Ülyckligtvis har emellertid Färre an 30 H av lungcancerpatienterna tumörer, som Ful1~ ständigt kan resekteras vid diagnos. Qv dessa lever mindre än en tredjedel 5 år efter ett synbarligen fu11~ ständigt kirurgiskt avlägsnande av tumören. Det finns därför ett stort behov av metoder, som skulle möjliggöra en tidigare diagnos av lungcancer, en bättre definition av graden av spridning av cancern och en mera effektiv terapi.

O OIOO 00 0 I CIO 0 9 to l n; I I 0 I 0 0 000 0 0 I 0 0 I I II 0000 O! 000 000 o 0 v - . - - ~ . . . ' ' 2 : 'f gg. øznø 0 .øo- nu.. n :no I 0 O ¿.¿, MUNUKLUNHLM QNTIKRÜWWQR Muneklunuln antikroppar, som representerar hemegena anti* krwppmmnlehyler, vilka binder till ett enda mmlekylärt etalle (dvs. en epitmp) på ett antigen med en specifik bindninge» eller affinitetehonetant, frametälls medelet tre inüm tekniken kända metüder.

Monoklonala antikrdppar kan framställas medelst en hybri- dmm~teknik som anvisas av Hehler üch Miletein (1975, Nature ägg: 495; 1976, Eur. J. Immunol. Q: 511). Genem eammanemältning av antiRrdpp~prÜducerande celler (mjält- lymfecyter) med myelom-celler skapade Mahler och Milstein hybrid~celler, som gav upphev till eföränderliga cel1~ linjer med Förmåga både att preducera antikropp dch att växa permanent i cellkultur. Hybridemen uteöndrar en enda typ av immunoglobulin med i förväg definierad antigenisk epecificitet beroende på det antigen för vilket 1ymfü~ cyterna tidigare har exponerats.

Qlternativt kan munmalonala antikroppar framställas genam tranefdrmatidn in vitrg av B~lymFocyter från perifert daggdjureblod med exempelvis Epetein Harr-virus (EBV). viruset immdrtalieerar de antikrepp~preducerande 1ymFe~ cyterna. Teknik För dylik tranefermatidn är känd (se exempelvis Steinmetz et al., 1977, Nature QQQ: 430; Crawfürd et al., 1983, The Landet, i: 386).

Slutligen kan monoklunala antikrmppar framställas under användning av teknik, som kombinerar bade EBV~immdrtali- sering och celleammanemältning eller hybriddmtekndlegi.

Cole et al., (1965, Mdnmclünal Qntibüdiee and Cancer Therapy, Qlan Lise, Inc., sid. 77~96) beskriver teknik för eammanemaltning av en humanp1asmacytam~ eller 1ymFm~ blaetdid~eellinjewfueienepartner med EHV~traneformerade ddnatmr~lymtdmyter, sem tidigare har etablerats som cell- 0 Ill till Ino sienna» a. nu n ana n v I 4 linjfi. I ett dylikt syßtëm än båda Föväldracællinjærna odödliga. Följaktligæn måsta Fusiünßpartnærn ha lämpliga lákæmedelsmarkörev föv att kontrasælæutæwa mot Fövä1dva~ linjerna när det fiammansmälta hybvldümet üdlaß. Da ær" hållna EBV~hybridmmen pwoduuæraw antikvwppav mæd ßpecifiw citeten hos dan använda Eßvmlymfücytßcellinjæn.

Monwklünala antikroppar kan Framätállas 1 ätøva mängden genom cellodling ¿g_vitrn av äpæciella hybv1dÜm~ ellev tranæformevade cellinjev. Vidare vesultevaw inympning av en hybPid0m~ce11inJ@ i pevitünealhälan hüæ kompatibla däggdjur, sâsmm möss, i en tumör äom utsöndrar höga koncentrationen (1~EC mg/ml) av mmnmklonal antikvmpp i tumöP~asHitesvätskan. Genom att avlägæna askitesvätskan och rena den monoklünala ant1hvüppæn kan æn enda muä till” handahälla tillräckligt mæd antikrmpp Füw användning i tusentals diagncstiska analyser.

E.u. MÜNÜHLÜNQLQ QNTIHRÜPPQR ÜÜH HNTIGEN MED LUNGCHNCER :TA R HSSÜCIERQDE Monmklünala antikwmppav mmt humanlungcancæP~antigenæv han beæurivits av Biküva æt al., 1981, Brit. J. Cancer gå: EQT; Cuttita et al., 1981, Brac. Nat”l ficad. Sci. USG Z*: 4591; Moody æt al., 1981, Bciænce Éliz 1E4ß; Minna et al., 1981, In Vitro ll: 1056; Kennel æt al., 1981, Cancëv Res. gl: 34ü5; Chem. Qbst. 95(15):13Ü95ÜE; Baylin at al., 1983, Prcc. Nat*1 ficad. 4650; Carney et al., Soi. USQ 79: 115; Gazdav æt al., 1983, ßathobiology ñnnual LE: 19B3, Semlnars in Üncolügy lg: 3; Hnllinßhæad et al., 1983, Cancæv Detect. Pravent Q: 185; Mulshine et al; 1983, J. ímmunøl. 131: 497; Huang et al., 1983, Qnch. Eiücham.

Biüphyš. SEO: 318; Saji et al., 1984, Hybridoma Q: 119; fin. Qbst. 79005569; Hosslet et al., Hehninc. Inst. Mitt. : 37; Chem. Qbst. QC101(9): 706686; Rüæet et al., 1984, Cancew Qst.

Ill Res. 44: 2053; Bio. __..- "ZQCHEEC-Sifilízj; Fï'\~"ir|C2lGr“ et OI 0 IOI QIIO ICQ OIOI UL al., 1962, Cancer Res. 32: 843; Mazauric et al., 1983, Cancer Res. fiëz 150; Braat: et al., 1983, Cancer Res- íåfl B49; Sobel et al., 1983, Fed. Proc. gl: 409; Cole et al., 1965, Monoclonal Qntibodies and Cancer Therapy, Qlan Liss, Inc., sid. 77-96; och Varke et al., 1985, Monoclonal Qntibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, E07.

Inc., sid.

De amerikanska patentansökningarna nr 667,5E1 av den E november 1984, 785,17? av den 7 oktober 1985, 684,759 av den El december 1984, 776,3E1 av den 18 oktober 1985 och 738,61E av den EB maj 1985 avslöjar vissa monoklonala antikroppar mot icke-smàcelligt humanlungkarcinom.

Monoklonala antikroppar kar anvandas För metoder, som skulle möjliggöra en tidigare diagnos av lungcancer, en battre definition av spridningen av cancern och effekti- vare metoder För terapi av lungcancer. En förutsättning är emellertid att Finna antikroppar mot antigener, som är mera rikligt förekommande i lungcancer än i normal vävnad hos vuxna. Mot bakgrund av den kända heterogeneteten hos tumörcellpopulationer, närvaron av Flera determinanter på samma antigenmolekyl, de förväntade skillnaderna mellan antigener med avseende pa deras stabilitet som diagnos- tiska markörer och terapeutiska målobjekt och de olika biologiska egenskaperna hos olika antikroppar mot samma antigen kan ett antal olika antikroppar mot ett antal olika antigener komma att krävas. 3. SQMMQNFQTTNING QV UÜPFINNINGEN Föreliggande uppfinning avser en ny klass av monoklonal antikropp, som åskadliggöres av LEÜ och som är specifik För ett determinantstalle på ett glykoprotein-antigen, som är associerat med ickersmacelli t humanlun karcinom Q IQ O Ola 0001 00; I I Cl (NSCLC)~celler. Uttrycket "N8CLC*celler" innefattar epi- dermoida karoinomceller, adenokarcinom~ce1ler och stor~ celliga och odifferentierade karcinomceller. Determinant~ stallet kan även återfinnas på antigener från nagra andra karcinom, exempelvis vissa karcinom i bröst och kolon och smacelligt lungkarcinom. Qntikroppen enligt uppfinningen binder således även till celler från andra karcinom och kan vara användbar För diagnos och terapi av alla andra tumörer, som avger det antigen som identifieras av anti- kroppen LED. Föreliggande monoklonala antikropp binder i mycket mindre grad till normala vuxenceller än till tumör~ celler. Uttrycket "binder till en mycket mindre grad" innebar att bindningen icke alls kan påvisas eller kan påvisas endast som en mycket svag Färgning när immunohis- tologisk teknik utnyttjas. Qntikroppen har således en hög grad av specificitet För antigen, som är karakteristiskt För NSCLC och vissa andra karcinom.

Uppfinningen innefattar aven det nya LED-antigen som idenfl tifieras av antikroppen LEO och den klass av antikroppar som binder till, är immunospecifika för eller immunoreak~ tiva med detta antigen. Vidare innefattas metoder För an~ vändning av det renade eller klonade LED-antigenet som vaccin För immunisering mot vissa karcinom.

Föreliggande uppfinning avser även vissa diagnostiska me- toder, som utnyttjar den monoklonala antikroppen enligt uppfinningen. Sa exempelvis kan antikroppen användas vid metoder för bestämning av närvaron av det maligna ti1l~ ståndet i humanlungvävnad och annan humanvavnad. Metoden innefattar att man undersöker vavnaden med avseende på närvaron av ett antigen med egenskaperna hos ett 110.000 dalton glykoprotein, som definieras av antikroppen LEO.

Vavnaden kan exempelvis bringas i kontakt med en anti" kropp, som definierar ett determinantställe på ett cell» associerat antigen med egenskaperna hos det antigen som 04 n øll IOOI 001 0 I li o bl definieras av antikvoppen LEO, en funktionell ekvivalëfit eller ett fragment av denna antikvøpp och eventuella vaxelvevkningav mellan antikwoppen och antigeniska de~ terminanter påvisas. En dylik metod innebär bestämning av navvawon av NSCLC*cellew i ett prov, sem man misstänker innehåller dylika celler. Frdvet bvingas i kontakt med den mmneklenala antikvoppen, som har förmåga att sawekil~ ja dylika celler Fvàn andva celltyper, sem kan vana naP~ vawande i provet. Hnntakten utföves under sådana betingelfl ser att antikvnppen bindefl till dylika celler. Efter kon" takt beetammee navvavün ellen Fvânvanen av bindning av antikvoppen till cellerna i prevet. Denna bindning av re~ laterad till navvaron ellen frânvaren av NSCLC~cellen i pvevet. I allmänhet bringas provet i kontakt med en mankt epeeifik bindningepavtnev till den meneklmnala antikrop* pen. Denna mavkör har Förmåga att alstra en pâviebar eig~ nal.

En annan diagnestiek metod innefattar lekaliseving in ïiïg av en tumör genom att man till en patient adminiet~ vevar en wenad antikvopp ellen antikvoppfwagment enligt Föreliggande uppfinning, märkt med ett medel sem ger en pàvisbar signal. Lckaliseringen påvisas därefter under användning av yttre scintogwafi, emiseionetdmügvafi eller Padíonukleav svepteknik. Denna metüd kan även tillhanda~ hälla battre sätt att kontrollera cancerpatientev med av~ eeende pa ejukdomegwaden ach att övervaka Förändringar i svar på tevapin.

UppFinningen innefattav även terapeutiska applikationer, efteveüm LEÜ-antikweppen och liknande antikroppan kan rea~ geva med det LEO~antigen sem avges i höga kancentvatiünen på tumövcellytan. Qntikroppav kan dävföv användas sem bä~ rare av elika medel, sem har antitumövverkan mch vilka innefattav men ej än begväneade till kemetenapeutiska läkemedel, toxiner, immunevavsmodifievande medel den II III Ifl-I GUI O OO con so; coq; 1 U I av: nu n u un 00. .' . "°' 00 n i! U a u c 0 I f ° ' , , , g u p n 0 0 q o o 0 f ' ' ' . . q n 0 o v v00! 0 oc: oc: oo II' , , , n u 0 8 I g I 'f .f 0:" o .u nu n ne ~ * . ~ radioisotoper.

Vidare kan LEO~antikroppen modifiæras så att den kan För~ mædla antikroppberoende cellular cytotoxicitet (QDCC), dvs. att den kan döda NSCLC“cæller i närvaro av human” lymfocytær eller makrofager ællar att den blir cytolytisk mot tumörceller i närvaro av humankomplemænt. En dylik modifikation kan åstadkommas exæmpælvis genom den tæknik som nyligæn har utvecklats För framställning av "chimera antikroppar". Följaktligan splitsas genær, som kodar för den variabla regionen av L3ü~antikroppsmolekylen, tillr sammans med humana ganer, som kodar För Fc~regionen av en (såsom Förmågan QDCC). kan även Fram- antikropp med lämplig biologisk aktivitet att aktiværa humankomplement och Förmedla Nya 1nti~ kroppar Från mus æller av humant ursprung ställas mot LEO~antig@net med do lämpliga biologiska Funk* tionerna. 4. BESKRIVNING GV UPPFINNINGEN Föreligganda uppfinning avsær en ny monoklonal antikropp, som betecknas LED och som är immunospecifik För och/eller immunoreaktiv med ett antigen på NSCLC*humancæller och Galler från flæra andra humankarcinom innæfattanda karci~ nom i kolon och bröst och smâcelligt lungkarcinom, metor der För framställning av æn dylik ny monoklonal antikropp och vissa diagnostiska och terapæutiska metoder, som ut* nyttjar antikroppan.

Uppfinníngæn innefattar vidaræ att nytt callyteantigen, som är karakteristiskt För humant NSCLC och vissa andra humankarcinom i bröst, kolon och lunga, och mætoder För användning av ett dylikt nytt antigen. vnvoiu 00 o CIO DUO! CIO 'ÛÛÛ oo: oc. I I I' ' ' ' oo o 09 'V o o I U ° 2 2' u : :ooo o o o I '_ g o I c I ' ,, . . a o o o coon I ¿ no- ouo. II. , , . o z z . u Û I > 9 : . g o oo Oovfl 9 00 "' ' '. 4.1. METÜDER FÖR FRQMSTÄLLNING GV MÜNOHLÜNQL QNTIHRÜPP MOT NSCLC Mdnoklonala antikvcppan mat humant NGCLC och vieea andra humankawcindm kan Fvamßtällae medalet hybvid@mFueidns~ teunik, gendm EBV-transfürmabíün av antikvmpp-pPdduee~ rande humanlymfdcyter ellen medelst teknik emm kombinerav cellfueiün och EBV-immüfltalisevingsteknik. 4.1.1. Fusimneteknik Enligt en utfövingefdvm av Föreliggande uppfinning fram* stalles mdndklmnala antikvøppaw mot NSCLC under använd~ ning av hybviddmcel1~fueidnetehnik. åâ exempelvis används som immundgen humanlungkarcinomcellew från pleuvala ut~ sändningar, odlade celler från explanterade NSCLC-human~ tumöven eller cellev från en normal Fdeterlunga ellen lyeat Fvån dylika cellen. Vid ett utföringeexempel användes explanterade celler fvän ett NSCLC“humanlungM adenükavcinom nn 3083 som immundgen (se avenitt 5.1.).

Cellevna injicevae exempelvie i en mue och eftew till- räcklig tid avlivas mueen och edmatieka antikvüpp~pn0~ ducerande lymfücyter evhàlls. ñntiHn@pp~pnUducePande celler kan evhâllae från lymfknutawna, mjalten och pePi~ Fert blad hos de behandlade djunen. Mjaltcellev FöPedva~ gee. Muelymfmcytev gen en högre pndcentuell andel stabifl la fusionen med nedan beskrivna musmyelom. finvändningen av somatiska rått-, kanin~ men gwddcellev är även möjlig.

De mjältcellkvommeomen som Hodan Föv önskade immundgldbu- liner immontalieevae genom Fueinnering av mjältcellevna med myelomceller, i allmänhet i närvaro av polyety1en~ glykül. Flera myelümcellinjev kan användas För Fram- stallning av Fusidnevade cellhybviden innefattande NSI~Qg4/1, XQE-Qgß, MPC11~45.5TG1.7, X6E~Qg.653, Spå/O« Qglfi, Fd och S194/5XXÜ.Bu.1, som harvör från möes och ElO.RÜY3.Qgl.E.3, UEEEQR üüh GMIÜOÜBTGQLE, ämm hänvön I O non :Ola ons 0 0 0 ola 000 :ola In m '=.=' '::ï.=:.:=..=...=: S Från råttor, (Hammerling, et al., 1981, "Monoclonal Qntibodies and T~cell hybridomas" 3, J.L. Turk, red; Eleevier/North New York). exempel användes N51-celler i Research Monographs in Immunology, Vol.

Holland Biomedical Dress. I ett utFörings~ De erhåll~ na cellerna, som innefattar de fusionerade hybridomen, (se avsnitt 5.1.). får växa i ett selektivt medium, såsom HQT~medium, och de överlevande cellerna får växa i ett dylikt medium under gränsspadningsbetingelser. Cellerna får växa 1 en lämplig behållare, exempelvis mikrotiterfack, och den överliggan~ de vätskan underkastas screening med avseende på monoRlo~ nala antikroppar med den önskade specificiteten. Ülika konventionella metoder Förekommer För isolering och rening av de monoklonala antikropparna För att befria den från andra proteiner och andra föroreningar. 4.1.3. EBV-transformationsteknik Enligt en alternativ utföringsform av Föreliggande uppFín~ ning framställes monoklonala antikroppar mot NSCLC under användning av EBV-transformationsteknik. Sa exempelvis immortaliseras lymfocyter, som härrör från perifert blod, tumörutsöndrande lymfhnutar, benmargsaspirat, tumörer eller pleurala utsöndringar från patienter med NSCLC, under användning av EBV enligt de metoder som anvisas av Cole et al., 1984, Qi: E75Ü.

Cancer Res. Såsom anges av Cole et al., är B-lymfocyter, vilka är specifika För tu~ mörantiger, sällsynta hos lungcancerpatienter. Det är således speciellt viktigt att utöka antalet lymfocyter, som producerar antikropp, genom att man preselekterar lymfocyter, som producerar antikropp mot det relevanta antigenet. Således innefattar EBV~transformationstekniken tvâ steg: (1) anrikning av celler med receptorer För det givna antigenet, dvs. LEO~antigen som beskrivs i avsnitt 4.3., och (E) immortalisering av dylika celler genom inr :ovan 9 00 0 0 U 0 I CIO 0.00 OII 0 000 0 OO 000 000 Ü '0 É É 0 ' 0 0 U '°' :u 0 > u: ,' 'g : 2' ß 2 'I u u." 0 u IH I f 0 01 0 0000 0 0 00 0 0001 Fektiwn med EBV. 4.1.3. EHV«hybriddm~teknik Enligt en annan alternativ utföringefürm av Föreliggande uppfinning framställes mpndkldnala antikrdppar mot NSCLC under användning av en Rdmbinatiün av Eüvntranfifdrmution och hybriddmfueidneteknik, såsom beskrivs av Cole et al., 1985, Mdndclenal Qntibddiee and Cancer Therapy, Glen R.

Lise, Inc; eid. 77~96. Sá exempelvis fusidnerae en myelmm- cellinje med ddnatdrlymfdcyter från NSCLC”patienter, vilka tidigare har tranefdrmerats med EBV och etablerats eom en eellinje med Förmåga ett växa och utvecklas under ddlingsbetingeleer. I syfte att kunna eelektera de erhâ1l~ na EBV~hybriddmFueidn“cellinjerna är det nödvändigt att fueionepartnern uppvisar dominerande lämpliga se1ekter~ bara läkemedelsmarkörer, såsom duabair~ eller nedmycin~ resistens. så att Föräldracellerna ej utvecklas när de Fueidnerade hybriddmcellinjerna odlas. En lämplig linje är den tipLuamin~reeietenta GM~15Ü, duabain~resietenta lymfdblaetdid-cellinje, HR~4, som beskrivs av Cole et al., sugra. Erhàllna hybridpm klonas medelst konven- tionell teknik. 4.1.4. Cellförökninq och antikroppwpreduktion transfor- till viduella ant1Hrdpp~prpducerande cellinjer, kan varje ee1l~ Då de önskade Fueipnerade cellhybriderna eller merade cellinjerna har selekterate och kldnate indi~ linje Förökeß på endera av tvâ kdnventipnella sätt. Den individuella cellinjen han Förökae ln vgggg, exempelvie i labdratorieddlingekärl, och ddlingemediumet, som innehâ1~ ler höga küneentraifiøner av en enda epecifik mnnehlmnal antikropp, kan ekördas genüm dekantering, Filtrering eller centrifugering. Qlternativt kan utbytet av mdndk1e~ nal antikrmpp ökad genpm injicering av ett prev av hybri~ Ii o 00 l p = 000 0000 IOI n I O O OII 0 n o o v - f-f a o 1* ".: "z -' '= ' E. ° g O o U ' u u oo "osv n! N' ' ' domwt i ætt histmhompatibelt djur av dan typ sam användas För att tillhandahålla de somatißha cællæwna och myelom~ cellerna FÖP den uvspvungliga Fußiønæn. Tumören, sam ut” söndnav den specifika mmnokldnala antikropp ämm produce" Pas av den fusidnenade cellh bridæn utvecklas hdd dæt Y 1 injiceradd djuret. Kvoppsvätskorna hos djuvet, æâsmm aæci~ tæsvätska eller serum, tillhandahåller mündklonala anti” knüppan i höga kancentvationev.

Cole at al., sugna, hybvidom användeß, nödvändigt att Sâsmm har diskutævats av än det, då humanhybridom eller EBV* undvika avstötning av dæt Fvämmande ympämna som injiceras i djuvæn sâæom möss.

Nääs med ímmunübrist eller nakna mösa kan användas milen mcksâ kan hybvidümet Först få pasßava bestnálade nakna möæs som en Fast subkutan tumör, ddlaß in vitgg och där- æftæn injicævas intvapævitonæalt i pnistan~b@handladæ be~ strålade nakna möës, som utvecklan ascitæætumörew, vilka avßöndnar stava mängder av specifika mønmklünala human~ antikvoppav (se Cole et al., supwal. 4.3. MÜNÜKLÛNQLQ QNTIHRÜÜPQR fintikvoppæn ænligt Föræliggande uppfinning bindan till ett nytt cællyt@~g1yRdpvotæinantigæn, æom bætæcknaä LEO" antigdn och som är karaktæristiskt För NSCLC~humancæ1leP och celler Fvân vissa andva humankavcinom (sæ avsnitt 4.E.1.). Glykopruteinantigenet har en molekylvikt av cirka 110.0ÜO daltmn då dæt underkastad immundpv@cipita~ tiün vid polyaknylamidgel~æ1æRtnmFÜræ§ (sa avænitt 5.3).

Uppslutning av LEO~antigen@t mad glykanaß har vißaw att dat innahåller N~länkade oligdsackanidkædjmr.

Enligt ett utföwingsæxempel framställes Lâüflantikwdppæn mædælst dæt Lâüwmurinhybvidøm ämm beßkvivs i avsnitt 5 punkt 1. LEÜ~antikvdppen än av Igßlwisotyp och (aa avm snitt 5.3.3.) han en aviditet av civka 3 x 109. Den bin~ dar icke påvisbart till novmala cæller såsom Fibwdb1as~ 0:0 QQ OO 0 0 o 010 bli! ltl i 0000 00 0 t Itt 0 0 I un; ann 0000 v OO. v 0 f i 00I1 U ' ' ' ' * 0 00! U I I I I I I l O Ü .

, H, .u .u o n un I 0 0 z' , l ^ n a n nu I I ° ° u, , u. - . g g n oo 0.00 0 00 ter, endotelialceller eller epiteliska celler i huvud- organen. Med "binder ej pâviobart" aveee att endast en mycket svag Färgning eller icke någon Färgning alle er* hålls vid immunohietologi.

Inom ramen För uppfinningen Faller aven användbara bind~ ningefragment av ovan angivna monoklonala antikropp eâr som Fab", F(ab')æ~, Fv~Fragment etc. Hntikroppsfragmenten erhålla medelst konventionell teknik. Så exempelvis kan användbara bindningstragment Frametallae genom peptidae~ digerering av antikroppen under användning av papain el" ler pepsin.

Liknande antikroppar, innefattande antikroppar av olika isotyper, olika affiniteter och nya biologiska funkr tioner, eåeom förmågan att döda tumörceller i närvaro av komplement eller effektorceller eâecm lymfocyter eller makrofager, faller även inom ramen För uppfinningen.

Ehuru ovan angivna specifika exempel på den nya anti* kroppen enligt uppfinningen avser en antikropp, som bin~ der till ett epeeifikt determinantetalle på respektive antigen och är av Igßlflunderklaee harrörande från en murinkälla, ar detta icke aveett att vara en begränsning.

Ovan angivna antikropp och sådana antikroppar med Funk* tíonell ekvivalens med ovan angivna antikropp Faller inom ramen För denna uppfinning vare eig de härrör från en murinkalla, andra daggdjurskallor innefattande människa eller ndra källor, liksom kombinationer därav och anti" kroppar av andra ieotyper. Med uttrycket "Funktionell ekvivalene" avses att antikroppen har Förmåga att binda till ovan beskrivna determinantetalle och kan konkurrera med en epeciell antikropp enligt uppfinningen med avaeenfl de på ett dylikt ställe. Det vill eaga, vid kombination av en dylik antikropp med ett prov, som innehåller en cell eller cellfragment med ett dylikt determinantetalle, binder antikroppen till ett dylikt determinantstalle och 0001 Öë O ti: Otno :nu 0 Ica Ola tone 1 oo ul I "" ' " o: :oo- an. I. . . . , . z ::.. o: z i zu. . c O 0 0 9 i ' . . q n u I coon 0 I ou en o o 0 , , . o c 0 0 14 : 1 2 .ca oc. 0:00 o oo III W "' ' ' ' kommæn att hindra en antiknopp enligt uppfinningen från att binda till ett dylikt ställe. Eftevsom vidare anti~ gonat ænligt uppfinningen kan uppvisa man än ett detævmin nantætälle innefattaw uppfinningæn monoklonala antikrop~ par, dom dæfinierav andra dætevminantställen än de datan* minantställæn som dæfinieras av ovannämnda monoklonala antikvopp och som kan identifieras medelst inom tekniken kända æëkvensimmunopvæcipitations~ana1yseP.

Uppfínningæn avsæw även antikroppar fvamställda som svar på antigænbindningsställæn ellæv idiotypær av LEü~anti~ kroppen, eftewsom dylika anti-idiotypiska antikroppar kan användas För att analysera immunsvavet mot tumörantigænen för diagnostiska ändamål och för att inducewa immunsvav Fön tærapeutiska allow pvofylaktíska ändamål maa. fvatn mean. sm. gg 26.64).

(Nëpüm Et E11 f. 9 FWNZIC, 4.3.1. LEO~antigæn som igenkänns av monoklonala anti~ knopnar Dot antigæn som igænkanns av de monoklonala antikroppanna ænligt Föreliggande uppfinning innefattar ett nytt ce11~' yt@~g1ykopPot@inantig@n, ëom är karakteristiskt För NSCLC~ mellan och viæsa andva kawcinom innefattande bröst~, kolon- och småcelligt lungkarcinom. Qntiganot har en mole~ kylvikt av civka 110,0ÜO dalton.

Dan aminotævminala aminoayrasekvensen hos det nya g1yko~ proteinantigænet av som Följæn: 1 5 10 15 EQ L-X~V~Û~V"P~E-X~@~V~V~Q~L~V*G~T~D*Q“X"L vavi X ræpveaæntevar en aminosyva, som icke har identifie- rats ännu, och återstoden av bokstävævna Papresentærav de konventionella enbokstavsförkortningawna för aminoayrov.

En jamfövelsæ av dænna sekvena med de som av lagvadæ i 4 OI OO O C 000 00!! 000 I 0 CO 0 i 400 Ota 0000 1 5 den aktuella proteindatabaeen (DIR~version 6.0, November 1965 avelöjar icke någon signifikant sekvenehomologi med nagra andra kända sekvenser. 4.3. QNVANDNINGSOMRÅDEN FÖR MONOHLDNQLQ QNTIKROPPQR OCH LED-QNTIGENET 4.3.1. Diaunostieka applikationer De monoklonala antikropparna enligt denna uppfinning kan användas som proveonder För påvieande av enskilda anti" gener i NSCLC~humantumörer och andra humantumörer. En metod enligt uppfinningen innefattar beetamning av när- varon av ett malignt tillstànd i lungvavnad och andra humanvavnader genom undersökning av vavnaden med avseende på närvaron eller frånvaron av ett glykoproteinantigen med egenskaperna hos LEÛ-antigenet. Uttrycket "med egen” skaperna hos" innebär att antigenet är reaktivt med en antikropp, eom känner igen LEÛ~antigenet. Narvaron eller frånvaron av detta antigen kan tillhandahålla kliniskt värdefull information, som ej är tillgänglig med híeto~ patologiek etandardteknik.

Monoklonala antikroppar enligt uppfinningen kan exempe1~ vis användas för att påvisa celler från icke-emåcelligt lungkareinom i hietologiska och cytologieka prover. Vid användning av den immunoperoxidaerfärgningeteknik som beekrivs 1 avenitt 5.4. uppvisar exempelvis utskurna väv- nadeprover av adenokarcinom, epidermoidkarcinom och smâ~ celligt karcinom i lunga en inteneiv positiv Färgning.

Normal lunga, hud, cyter var negativa. mjalte, bröst, kolon, teetikel, njure lever h arna I 7 'I hjärta, tyroid, vagina och normala lymfo~ En annan viktig diagnostíek applikation in vitro av de monoklonala antikropparna enligt denna uppfinning är pà~ av!! O Oil 0000 QIO . unc un! oo OI' v '; ; 5' i n 0 le! ' 2 : .If nu. 0:00: 00 nu; o nov I 0 vieandet av andva karcinom än NSCLC. Qntikroppen har ann vänta för att pàviea epitopen i Ravcinom från bröst, Rolon och i emâcelligt lungkavcinom. Novmala proven av dessa vävnæden uttryckte icke detevminanten. Den monoklon nala antikroppen är således användbar för påvisande av en antigenisk determinant i dessa karcinom, vilken determi~ nant än tumöraesocierad. Följaktligen kan den monoklflnfilä antikroppen vana ett användbart diagnostiskt neagens för bvöst~ och kolonkarcinom och för emâcelligt lungkarcinom.

Qltennativt kan immunofluoreecensteknik användae FÖP att undevæöka humanvävnadsprovev med de monoklonala anti” kropparna enligt Föveliggande uppfinning. Enligt ett typiekt protokoll lufttorkas objektglas innehållande kvyoetataektionev av Fryetï icke^finePad vävnadsbiopei el 1521-* Lmtehclirwfia t1.xr|1ö^r“p'r~|::-\.fer* 'eller cytol-Jgisåfca utstrylf. och inkubevas med den monoklonala antíkroppen i en fuktig Hammare vid Pumetemperatur, De cytoíogiska utetvyken inne~ faktan exfoliativa cellprovew. Med uttnycket "exfoliativ" avses att provet innefattar ieolevade celler ellen klum~ pan av celler, som har erhållits genom ekvapníng eller tvättning av vävnadeytan och vilka celler avlägenaü indi~ viduellt eller i skal eller laminat. Det exfoliativa cell" pwovet skall skiljas fvàn utskuren vävnad, såsom den Qom evhâlle vid biopei. Metoden kan Finna användning vid pâ~ vieande av ett malignt tillstånd i exfoliativa cellpwovev från lunga såsom ett eputumpvov, fvân bronkevna, mag~tePmM kanalen innefattande oral Farynx, munnen, ett cePvikal~ utstryk. etc.

Efter tovkning ehiktae objektglasen med en pwepavation av antikwopp mot den monoklonala antikroppen, vanligen någon typ av antimusimmunoglobulin om den monoklonala antikvopp som användes härvör Fvân Fusion av en musmjältlymfocyt och en musmyelomlinje. Detta antimusimmunoglobulin konju~ genes under användning av känd teknik med en Förening 5å~ ß OO O OQO OIOO III ämm wmdamin ellær F1uovesc@in~iuotimcyunat, Bum FlumPæßcæ~ var vid en spæciell våglängd. Fäwgningmmönfitwet och «in~ tenaitætævna i provet bæstämmcä däræftev mødelst F1uüP@~ æcenæljußmihvüskopi och vægifltvævas ævwntuællk Fot@gPa~ 12' fiskb.

Beskrivningen ovan än primärt inwiktad på användningæn av antikvoppavna enligt uppfinningæn vid ímmunmflumræscænsn teknik. Emællertid kan antikrwppavnm ënligt uppfinningæn användaë vid de Flæsta analyæmætodæv innæFattand@ antíg@n~ antikvwpp~veaktionev. Qnalyämætodewna kan vara hnmmgænm ællev hætevøgena. vid en homngën analys kan provet vara æn vävnad, Qom har undærkaßtntæ lya wch Hlavatm För av- lägsnande av debvis. Dan immunologiska væaktionæn inn@~ vattav vanligæn dan äpæcifika antikvüppæn, en mänkt anaw lyt och pvovet av intvæsse. Den fiignal sam hävvöv Från marköwen mmdifieras, diræät eller índivækt, vid bindning av antikvoppen till den mävkta anzlyten. Både dæn immunø~ logiska Pæaktionen och pâviæandet nv gvaden därav utfövfi i an homogmn lösning, Immunokæmiskfl mflvkövær, süm kan an" vändas, innefattar fria radihalmr, Flumræficænæmfärgämnæn, enzymæv, baktæriofagev, cüenzymmw, wav.

Vid en hetevogen anfllyæmætod är Pfiagensen vanligen pPü~ den spæciFiRa flntikwmppæn och ett mæáel FÖP att FPam~ kalla en pâviæbar æignal. Dan manuklonala antiknoppen är vanligæn applicævad på æn Faæt bärara ællæw æn Fast Faæ.

Dwüvet i vätskæfaß bvingas däræfüer i Rmntakt med anti" hrwppen i Faflt Fan. Fastfafibäraræn ææpaværas dävæftær Från dæn Flytande faaan och antingæn dan faæta Fasmn ellen den Flytandæ faaan undærsöhz ed avsæendæ på an pâv'æbar signal under utnyttjandw av att mædæl FÖP att Framkalla en dylik signal. Signalen är wælatevad till näP~ varan av analytæn i pnmvæt. Mædel för att alstva en påvis- baw signal innefattar användningæn av vndiwaktiva maPkö~ ren Fluovescænsmedæl en:\mev. wav. Exæm el ä h@tewo~ 1 1 ./ r P p OO C000 U O 00 O I oil 0000 'OI C O I O J Ica! 9 sin 0 I IDO Gli 4 1 ::.f:: :: : zzu. '=La : uu nu o o "ß .' 'z z :' Ü I I : g z a. no IQOO I i' "9 ' "° Ü . gena immundanalyemetodev är Padidimmundanalye, immunüm Flupveecene~metmdev, enzymlänkade immunüanalysev dch lik~ nande.

För en mera detaljevad diekuseidn av ovan angivna immunü" analyeteknik hänvisas till "Enzyme-Immundaesav", av Edwavd T. 1980, CRC Üvess, Flürida.

Maggie, Inc., Büca Raten, Se exempelvis även de amerikanska patentekPiF~ 3,B17,837; 3,850,57S; 3,8G7,517; 3,901,654; k och 4,Ü98,87G, tevna 3,G90,B34; 3,79l,93E; 7 -7 n 'T 1 ' 'P - JT: u, gsm, 1 u, gus, U74; u, 991%, man: n, 3,99ß,345; vil en Förteckning icke skall Q; nees vara uttömmande.

Qntikvoppawna enligt uppfinningen kan även användas föv diagnostiska applikationer ¿g_¿¿vg. Så exempelvis kan antikvpppav eller Fvagment tvametallda av antikreppavna, exempelvis Fab- och för att F(ab')E~fragment, användas visualisera tumörer innefattande metaetatieka avsätt- ningar hos humanpatientev med NSCLC, på ett satt eüm är analogt med dæt som har beekvivite för malignt melanmm av Lareon et al., 1983, J. Nucl. Med. Qi: IEE pch av Lawson et al., 1933, J. Clin. Invest., 73: Elül. Den Penade anti- kwpppen ellen Fwagment därav Märke med ett medel, som gen en påvíebar signal, exempelvie en vadidieotdp såsom *3*I, och adminietrevae 1 en lämplig bärare, exempelvis intran venöet, till en patient. Lokalieevingen av den tumörbund~ na antikvoppen påvisas genom yttre scintegvafi, emieeiünen tmmmgrafi ellen vadionukleär evepteknik under användning av exempelvis en gamma~MameVa. 4.3.3. Tewapeutieka applicationer Qntikrmpparna enligt uppFinningen kan även användas teva~ peutiekt. De mondkldnala antikveppavnn kan användas till* sammans med ett brett epektrum av fanmaceutieka eller cytdtpxieha medel. Så exempelvis kan en antikrdpp bindae 1 0100 0 000 0000 000 0 ru°".:: ."-fä :':"T 4 É. än 19 :|.'E": .ua .n v: : :o : II:0 å till ett tdxin För Dildnint av ett immunmtdxin (Jansæn at J al., 1983, Immundl. Ræv. GE: 185) ellær till att radiüak~ tivt material, exempalvis *ü“I, *3*I, etc. (Order, 1984, Cmmpr. Thar, iQ: 9; Laræon et al., 1983, J. Clin. Invëßt- lg: 3101; Carrasquilld et al., 1964, Cancar Treatment Ræpmrts, gg: 317) eller till ett läkæmedel (Rnwland at al., 1985, Cancer Immunwl. Immundther. lg: 1) För bild~ ning av ett radiøfarmaceutiskt material ellær farmaceu- tiskt matarial. Mnnjugarade antikrdppar kan adminiatraras till patienter För att uppnå Förstärkt tumoricidisk verkan gændm den cytotdxiska verkan av det kemdtærapeutiska medel aom transportæras till tumören baserat på bindnings~ affinitetæn hos antikroppdelen.

Eå kallade "chimeriska antiHrüpp"~mü1æHyler av antikrmp~ den enligt Föreliggandæ uppfinning kan Framstallaæ inne" hàllanda att musantigæn~bindningsdmrâde med humankonstant- rægionområden (Morriæon at al., 1964, Qrdc. Nat“l Qcad.

Sci. U.S.ñ. _¿: 6851; Takada et al., 1985, Nature, Elfi: 455) och denna teknik kan användas För att framätalla nya antihrüppmdiækyler mad önækadæ effaktürfunktiüner sàsüm -w förmågan att aktiværa humankomplæment och förmedla HDCL (Næuberger at al., 1964, 313: 604).

Nature En annan terapæutiæk användning av de mcnoklünala anti* kropparna enligt föreliggande uppfinning är att Framstäl~ la anti~ididtypi5k antikrmpp under användning av LEO~anti~ kroppæn som immunogen (se axempelvis Nepüm et al., 1984, Drum. Natll Qcad. Sci. U.5.Q., Qi: 2664; Lee et al., 1965, firüc. Nat“l Qcad. Sci. Qfi: EEBG).

En attraktiv aspækt av föreliggande uppfinning är att Föreliggande antikroppar kan kümbineras med andra anti" Hrøppar mat NSCLÜ eller andra tumörer, såsom da süm av* slüjas 1 de amerikanska patæntansökningarna 667,5E1 av den E nüvæmber 1984, 6B4,759 av den El december 1984 och I n0u004 I CIO IOOI ÛÛÛ 0 ' q Q 0 O I 0 I u u vv- - v -. - - .30 :n :nu 1.: n: 0 : { ' I "I p |._ g g g g u n" . n n: u ut I 0 73B,G1E av den EB maj 1965. Hombinationæn än effektiv För att påvisa dæ ovannämnda typevna av ick@~ßmâc@lliga 1unt“ Rarcinwm, nämligen ætowcællígt üdiffermntiævat lungkawci- nom, adænøkavcinmm mch apidevmuidkarcinüm.

De mmnnklnnala antikropparna ænligt uppfínningæn deFiniæ~ var ävæn dætævminantställen på att antigwn, som är afißüß cievat mad andwa karcinom sâæom bröstkarcinom, kolünkawcim nom üch småcelligt lungkarcinom (ae avsnitt 5, tabæll 1).

Följaktligen kan Föveliggande antikvcppar Finna använd~ ning vid tærapeutiska metudæv mch tæwapæutißka pwnduktæv riktadæ mot dylika karcinom.

Det nya antigænet ænligt Füwæliggandæ uppfinning, som b@~ kan ävæn användas tficknaß som antigen LEG, ha applihationer. Qntigenæt kan wënafi från tumövæn ellen Fvamställas medelst vækumbinerandæ DNQ~tæRno1ügi (ae den samtidigt anhängiga amærikanßka patentanßökan BE7,E1E av den 7 februari 1986, innænåll vana införlivaæ härmed genom hänvisning därtill). Dan gen som undan För LED* antigænet kan klmnas mædælæt mætodærü som först anwikav mRNfi has tåü-antigenet. Mædelst an dylmk metod kan po1y~ ammar (som bæstàr av mRNñ, ribmæomer och naæcærandæ poly~ pæptidkædjmn) vænas medælfit immunwaffinitætßmhromatmgrafi mad antikvopp, som kännæw igen den L I~antigæniska datan* minanten på den nascenandæ kæfijan. mfiflñ isüleras medelst immunopnæcipitation mad æxæmpelvis LEÛ~antikropp och CDNQ klonaæ i en lämplig expvefisionsvektmr. Qlternativt skulle LEÛ-antikvopp Eller -antifiævum mat LEO~antigen kunna an~ vändaß för æcveæning av att cDNfiWbib1iotæk under använd- ning av an expræßsionsvektüw. Det Pænadæ ællev Rlonade “Eü~antig@næt kan administræras separat ämm an immunügæn ellær tillsammans med ætt lämpligt immunolugiskt adju~ vana. Qltævnativt kan dun gen som kodar För antigenet in~ föras i gænf Füv ett vivus, ßâsmm vaccinia~virufi, Föv framställning av æn vekmmbinævandæ DNQ~pwmdukt, Qom kan för tærapeutiß~ : .n z 'f uu' 0:a: a 'un' un' u oÉø Ü i Ö F13 [_13 användas ämm immunügen (se dæn fiamtídigt anhängiga amæPi~ kanäka patæntansökningæn 8E7,313 av dæn 7 Februari 19863- 4.4. DIHGNÜSTISÅQ TESTSQTSER Uppfinningæn innefattar ävæn diagnostisua testsatææv För utförande av üvan avslöjadæ metoder. Enligt en utföwings~ fovm innefattav den diagnostiska tæstßatsen ia) en mona* Hlonal antihropp som har definiwvats nävmanæ üvan Üch (bi ett konjugat av en specifik bindningßpartner Föv den monoklünala antikrnppen mch en marköv mad Förmåga att alstva en påvisbav signal. Ræagænsen kan även innefatta hjàlpmadel såsüm buffewtämnæn men proteinstabilismwingsn mædæl, exæmpelviæ polysackavidæv och liknandæ, Den diag~ nmstiæka tmstæatsen kan vidane innefatta, om så ewfovdfl Pas, andra komponenter av dat signalprodumævandæ æystgmæt innefattanda medel Föv att weducæna bakgrundsstövningar, Rontrollveagæns, en apparat För utfürandæ av ætt tææt, ætc. Enligt en annan utfövingsfmvm innafattar den diar~ nostiska tastsatßæn ett Ronjugat av en mmnoklonal anti~ kropp anligt uppfinningen cvh an mawflón mad Fövmäga att alstra æn påvisbar ßignal. Hjälpmedel såsom nämnts mvan kan även vana näwvavandæ. _ gig-bits:Nx5s5E: Uppfinningen àskàdliggöres nàwmaræ mæoælst Följandæ icke" begwánæandæ utföringfiæxæmpæl. q.. 1..

FRQMSTÄLLNING QV MÜNÜKLÜNQLH QNTIKRÜPPHR Monüklonaia antikroppar Fvamställdæs under användning av dan hybnidmmfusiunätæknih sam tidigare han besknivíts av Yeh æt al., 1979, Int.

J. Cancew EE: 399. En tva månader gammal Balb/c~mus immunisewadæs undan användning av ex* 00 0 I I 00 00 O 0 000 Inuø :00 O ID 0 0000 II O 0 000 I O 0.4 000 u u v... v 00 o: o 0001 0 0001 0: plantevade odlade cellev från ett humanadenokarcinom i lunga med beteckningen 3083 som immunogen. Musen erhöll tyna intrapevioneala injektioner om cirka 107 cellen. Twe dagen efter den sista immuniseringen avlägsnadee mjälten, euæpendevae i odlingsmedium och Fusionenades med N81~mu$~ myelommeller (Hohlev och Milstein, sugna). Hlandningen Föreattee med gwoddaw För bildning av 1ågdensitetsku1tu~ ver hänwönande Fwân enetaka Fusionerede celler (kloner). övevliggænde vätskor från hybvidcellew underkastades smveening med avseende på direkt bindningsaktivitet på lungcancewcellinjew under användning av både en ELI5fi~ analys och en autoradiografisk indirekt *üßlflmärkt pwo~ tein fi~analys (Hwown et el., 1979, J. Immunol. Meth., Qi: eül). Extvakt av cellmembran fwàn den tumöw som an~ vändee föv immuniseringen Fnametälldes undev användning av ett modifierat föwtarande enligt Colchev et al., 1961, Cancefi Ree. gg: 145 ; Yeh et al., ägggg. Vävnadevna tvät~ tades med WBS och celler Fvàn intakta tumören suspendePa~ dee genom pveesning genom en sikt av rostfritt stål. Dän~ eften tillsattes 1 mM NQHCÜQ innehållande 1 nM Feny1metyl~ sulfonyltlourid (Calbiochem~BehPing Corp., San Diego, GQ) och materialet homogenieevades dänefter på is, med 50 slag av B~stampen i en Dounce~homogenisatoP. Ffter centPi~ Fugeving under 15 minuter vid 27,000 x g avlägsnadee den üverliggande vätskan och tabletten àtewsuspendevades i ßßå, undevkastades ultraljudbehandling undew 1 minut och lagwadee vid ~70°C.

Hybvidom, eom pnoducevade antikvoppav, vilka binden till cellmembnanextvakten, Hlonadee, expanderades in vitro, och testades ytterligare med avseende på antikropp- specificitet. De hybridom som producerade antiknopp med uppenbar specificitet För humanlungcandew âtevklonades, expandevadee och injicevades i pfliätafi-behandlade E månader gamla Balm/c~möss däv de tillväxte eom aecites* un!! nt O 0 IG n 2 C :in I U coin Oona tumörer.

Genom att följa detta förfarande erhölls hybridomce11~ linjen LED, som Rlonades och injiceradee pà möss För att utvecklae som en aecitestumör. Qntikropp som utsöndradee i aseites renades pâ protein Q~Separose (Ey et al., 1976, Immunochemietry, lä: 429) eller genom gelfiltrering 1 Sephacryl S~3ÜÜ. Renad antikropp användee För ytterligare Rarakteriseríng.

.E. HQRRHTERISERING GV DEN MÜNÜHLDNQLQ QNTIHRÜPPEN LED .3.1" Detektering och bindning av LED till odlade celler Den eubcellulära lokaliseringen av antigen bestämdes ge~ nom uppmatning av antikroppsbindningen till celler före eller efter permeabilíeeríng med icke~joniek detergent.

Qntikroppar, eom band till cellytan hos intakta odlade celler, identifierades antingen medelst direktbindningefl analyser med *““I~marRt antikropp (Brown et al., 1981, Wroc. Natll Qead. 501. U.S.Q., ZQ: 539) eller medelst in- direkt Fluoreecene under användning av den F1uoreecene~ aktiverade cellsorteraren (FQCS) II. Qntikroppar, som band till intracellulara lokalisationer, bestämdes genom dírektbíndning av 1flflI~märkt antikropp till celler efter vixering med paratormaldehyd och efterföljande permeabili~ eering med den icHe~joniska detergenten NW~40.

För bindningeanalyeer utförda genom användning av radio~ aktivt märkta antikroppar (Brown et al., supra), inkubefl ílüß) radee odlade celler på ie under 30 minuter med IOG cpm av *É“I~markt antikropp i IÜÜ pl bindningsbuffert.

Eågggpfgrwç. i Ünær; Ek i kt; ades på (I), E ml Cl i Yuïlfiy 1 “Fta lat I d i Duty 1 *- Ftalat i volymförhållandet 1:1 och eentrifugeradee. Ûule* talet med avæeende på *H51 räknades För tabletten och OO I 000 0010 000 I t ;' : a. un. 0:0! 0 D01. "'. ' ';' z m o: vattenFa§efi. Föv att uppmäta ickæ-spænifík bindning ut~ Föwdæs pavallella iwkubatiofiev mad ümäwkt antihwopp ämm _, Supra). künkurrænt (Erüwn et al TQBELL I ÜINDNING GV RQDIÜJÜDERQD LEÜWQNTIKRÜPH TILL ÜDLQDE CELLER QÉLLQQ Qgacifik bindninq Calu-1 lufig~adefiøkaPcin@m 45400 HEOBE lumg~aUefioRarcifiom 50100 HE981 luwg~adenokaPcifimm öälüü I (L.

Q ß '4 lung~adænnkaPcin@m 119300 v MCF? bvöstkavcifiom 76800 301? mælawom 3300 Nüvmala T-celler E00 Juvkat T~1eukemi E00 Daudi B lymfüm EGO 3.3.3 Iæüåvnbæætämninq av L&Ü~an%iRPmwm Föv att bestämma den klass av immuwogïobulimer som pra- ducævas av LED-hybvidoficellifijan utnyttjadæs följafidë teknik: (a) Üuchtevlofiyflimmuwodiffuæion En alikvot av överlL¿gande vätska Från æpeciella hybridüm~ celler plzøwfafies i cumtvumfackæt hos æn 35 % agavplatta.

Münüspæcifikm ¿an1n~anti~mus~Ig~isütyp~antikvmppaw (Southern Biotechnology, HiPm1ngham, QL) placerades i de yttre Facken mch plattan inkuberadeæ under P timmav vid vumætempevatur och över nattwn vid 4°C. (b) ELIBQ-isotygning Dywatech Immu@1on~plattor med 96 Fack baströks med vavja antisærum i en Hmncentratiøn av 1 pg/ml, 50 pl/fack i I III UIQ! IOI O 99 uçqnu vv vuu v v-v v ~ - DES, QÜC. De rnecá efter och plattorna Fick età täckta över natten vid tvàttadee med FHS/Tween EÛ, 0,05 %, och hlockeradee medium IOÜ ml/Fack under 1 timme vid rumstemperatur. tvättning av plattorna tillsattes överliggande vätskor från LEO~hybridom och inhuberadee 1 timme vid rumstempera~ tur. Efter tvättning med BBS mnkuberadee bovinserumalbumin (ßäfiíflplattor vid ETÛC under E timmar med monoepecifika Ranin~anti~mue~Ig*isotyp-antikroppar kopplade till peroxi- das (Zymed). Efter tvättning inkuberades plattorna med 1 pg/ml ortofenylendiamin och 0,03 % Hede i 0,1 M citrat~ buffert pH 4,5. Den optiska deneiteten vid E30 nm heetäm~ dee med en Dynatec ELISQ~p1att1äsare.

Den monoklonala antikroppen LEU ar av Igül-isotypen. -u xJn w- QNTIBEN IGENHÄNT HV LEÜ-QNTIHRÜPÜ I syfte att identifiera proteinantigener radiojoderadefi lungkarcinomceller på ytan eller märktes metaboliekt med 359~metionin. Qntigener ieoleradeß Från cellyeat genom 1nHubation med monoklonal antikropp, tillsats av get~anti~ mue~IgG och adsorption på Btaphviococcue aureus. Immunpre~ cipitaten tváttadee och underkastadee preparativ natrium~ dodecylsulFat-polyakrylamid~gelelektrofores (SDB~DQGE? pà en 10~EU % akrylæmidgel. Efter elektrofores Färgades gelen till 10 % ättik~ med Coomaeeie Erillant Blue (0,5 vikt~% eyra och BÜ % isopropanol) och avfärgades 1 en löening av ättikeyra (5 vo1ym~%) och metanol (17 vo1ym~%). Det Färga~ de LEO~antigenbandet utekare med ett rakblad och underkasw tadee omedelbart elektroeluering med en ECU~O4C elektrofl eluator/koncentrator (C.B.S.

Scientific Co., San Diego, CH) enligt de metoder som har beekrivite av Hunkapiller et al., 1983, Methods in Enzymol. 21: 3¿?~E“ë. fiutomatieerad Edman-nedbrytning utfördes med cirka EB pmol av LEÛ~antigen (baserat på utbytet av identifierat L~1) i en gasfas-sekvensiator (Model 4709, Qpplied Biosyetems, Inc., Foster City, CA). Fenyltiohydantoin~aminosyraderiva~ ten analyeerades medelst högpreetandavätskekromatografi v.- I O O IQ QIO GCI' It" I 01 nu uu vn I d 0 I ICO O I C oli 000 0000 (HWLC) i omvand fas under användning av en Model 1309 on* line HPLC-enhet (Applied Biosystems, Inc.) med en DTH~C1B~ kolonn (3,1 x SEO mm, Applied Biosystems, Inc.) och en natriumacetat/tetrahytdrofuran/acetonitri1-gradient för eluering.

Den aminoterminala aminosyrasekvensen ar som följer: 1 5 10 15 E0 L-Xflv~Û-V-D~E~X~D~V~v~Q-L*V~G~T-D-Q~X~L dar X representerar en aminosyra som ej har identifierats- Jamförelse av denna sekvens med de som är lagrade i den aktuella proteindatabasen (filR~version 6.0, november 1985) avslöjade icke någon signifikant sekvenshomologi med någon annan kand sekvens.

Det antigen som igenkanns av LEO-antikroppen är ett glykofl proteinantigen med en molekylvikt av cirka 110.000 dalton. .4. INNUNUHISTÜLÜGISH QPPLICQTIÜN IN VITRÜ Tekniken med omarkt antikropp enligt Sternberger, 1979, in Immunochemistry, John Wiley & Sons, New York, sid. 10#« 169, modifierad av Garrigues et al., 1963, Int. J. Cancer EQ: 511, användes För immunohistologiska studier på Frysta sektioner. Mälvavnaderna För dessa provningar erhölls vid kirurgi och Frystes inom 4 timmar efter avlagsnandet i iso* pentan, som hade För~kylts i Flytande kväve. Vävnaderna Förvarades därefter i flytande kväve eller vid -70°C fram till användningen. Hanin~anti-mus-IQG (Sternberger~Meyer Immurochemicals, Inc., Jarettsville, MD) användes i en spadning av 1/50. Mus-peroxidas~antiperoxidas*komplex (PGP, Sternberger~Meyer Immunochemicals, Inc.) innehål~ lande E mg/ml av specifikt renat DMD användes i en späd- ning av 1/60. Frysta sektioner preparerades, torkades, behandlades med aceton och torkades (Barrigues et al., segra). Sektioner, som skulle användas För histologisk dtvardering, Färgades med hematoxylin. För att minska icke~ specifik bakgrund förinkuberades sektioner med normalt -_, Ilo 0000 ICO I I OI l G O o Iooo to u Û OQO O I 000 bio v ~ - ~ ' - ' ' ' ' ' ' a s . am . o o o o o u o o b I I IG' E? on ou n-o oc: .o I: : :O : °':° : : : z 11 o. oo non 0 oo nu 0 'OI 0 ' ' humansævum 1 spädningen 1/5 (ßavvigues æt al., supna). Muä~ antikrmppan, get~anti~mu$~IgG och mus-D00 æpäddæs 1 an 1ös~ ning av 10 % nünmalt humansænum üch E % kanin§en4m.

Fàvgningsfövfaflandæt utgjüvdæs av bæhandling av sæniæfi sæktionæn med antingen spæcifik eller kontn@l1~antikv0pp undæw 3,5 timmar, inkubatiøn undan 30 minuten med kaninw anti~mu$~IgG i spädningæn 1/50 üch axponeving För muß~ÜQW~ komplex i spädningæn 1/80 undan 30 minuten. Efter varje behandling med antiknüpp tvättmdæs Übjektglasen två gången 1 WB". Dan immunohistakæmiska neaktionæn Fvamkalladæs med nyfwamställd 0,5 % 3,3”~diaminnbænsidin-tëtnahydnmklnnid (Sigma, St. Lwuífi, M0) och 0,01 L HÉÜQ i 0,05 M TPis~ buffewt, pH 7,6, under 8 minutær. Ytterligave expnnewing För en lmpnocæntig 0äÜ4~1öaning i dæstillenat vattæn undan H0 minuten intænßifiævade Fängænfl Sektiünenna sköljdæs med vattæn, tünkades i alkohol, Rlanadæs i xylæn och mmnt@na~ das pà objæhtglaæ. Übjektglafiæn utvàndævadæs vant och ett undæn Rud och koda* de provar küntrollenadeß av æn obwvüendæ opæratön. Typiska objekiglas Fmtmgvafævadeä undan användning av diffænæntial- intæPFePænß~küntna5toptik (Z@issMNwmaP$ki;. Gnadæn av antikvoppsfävgning utvärdævadæs som 0 (ingæn næaktivitæt), + (ætt fåtal svagt pnæxtiva cellen), ++ íminæà an tn@dJæ~ dal av cællænna positiva), +++ (de Flesta cællev püsitifl va), ++++ (aâ gott som alla cællæn är knaftigt pofiitiva).

Eftæwænm æhillnadærna mellan +~ och 0~fäPgningen var mindre distinkt än mellan +~ mch ++~FängningaPna bætPakta~ das en Färgning gnadewad sam ++ ellæv dänöven som "pmsi~ tiv”. Eàdæ næüplastiæka cellær och fitnümacæller @bsePv@Pa~ des i tumdnpnüven. Den negistnenadæ Fängningen var Fänr* ningæn has tumörcællerna, eftænsom strümacellerna ickæ fàngadææ alla ellæn Fängadeæ myckæt svaganæ än tumönw cellanna.

I O OOI III. Oll O Ola 0 O O C000 0 .T IMMUNÜ9ERÜXïDQSFÄRGNING GV TUMÖRER OCH NÜRMQLQ VÄVNQD5~ PRÜVER MED MONÜHLÜNQL QNTIHRÜWP LEO Vävnadstyp fintal pmæitiva/ antal testade * Lung~RaPcinmm: adenmkavcinmm 16/EO epidevmmidkarcinüm 3/3 brmnkialkavcinmm Q/1 smâcelligt karcinom 4/4 Lung~kawcinüm: cellinjer 3/E Brößtkancinom 4/7 H III 1 ü 1": P. a Y* CI i WII H1 5 / B Nælanüm 5/6 Renalkancinom líl Lipüsarkom O/1 Normal lunga Nnwmaí mjältæ Novmalt bröst Normal kolün Normal njuve Nüvmal levæv Nünmal hjävna Normalt hjävta Nüvmal hud Normal tyvüíd Nowmal tæstikel Nøvmal vagina Novmal lymfücyttablætt nægativ nægaüiv nægativ nagatin negativ nægativ nægativ negativ negativ nagativ negativ negativ svag färgning hos 1 av 3 teatade pvmver * Qlla undawaökta pvmvær van Frysta sektioner av vävnadev sam hade ewhàllits vid kirurgi.

Hänvisning snar till tæxten föv en dætaljævad baskwivning av immunohistm1n~ giska mætmdær. En färgning av E+ en twedjadel (wæpwasæntævaw minst pmsitiva cellen) betvaktadæs som poßitiv. :vv ~ O C00 IÛIC GUI I O I I I OOCO i I ICO I I 000 010 g 9 a q c c I U I oo Iqøul nl ICQ 0 Ole O 0 I Dæt är uppenbart att många müdifikationer mæh vaviatiøner av dænna uppfinning, ääsom den angeæ ovan, kan gövafi utan att man avviker fvån andemeningan mch nmfângæt. De speci~ Fika utföringsformew sam han beskwivits han endast givits i exæmplifievande syfte mch uppfinningen begränsas endast av lydælsen av de bifügadæ patantkvaven.

En cellinje, LED, ænligt mvan han deponevatß has The rärnæricarf Type Tisasnla C1-11'l:«.u^@ flc-llcacizi-rnfi, R-Jzrlævillæ, fflar'*y~- land och har ævhàllit dæpmsitinnanumwet Q.T.C.C. nr HB 8913. Uppfinningæn såsom dan har beskrivits hävi och med det begärda skyddsmmfänget är ej bagwänæßd till omfånget av den deponerade cællinjæn, æftæwßüm dan depünevadæ utFö~ Pingsfüvmæn är avßedd som en ænkel illustvatiün på en aspekt av uppFinningen och vilka som hælßt ækvivalænta cellinjav sam pvüducævav æn Funktiünællt ekvivalænt münmklünal antikrüpp Fallæw inüm ramæn För denna upp~ finninn. I æjälva vevket än olika müflifikatiünev av upp” Finningæn, Fövutüm dm ämm ovan har viäats üch beßuwivits, uppænbava Föv Fackmannæn mæd ledning av Fövegâendæ be~ skrivning. Dylika mødifikatianev än avsædda att falla inmm ramen Föw dæ bifügade patentkwaven.

Claims (1)

1. c oo U I o c g »oo unna so: g a I; ut 0 I CIO. I to 0 0 0 000 I 0 OO ÜÛO IQ OI OI g 0 o I 0 000 o 0 I o i 01 0009 BO 10 15 20 25 30 g; _guq' co lov. o Iv v :' :_ ":' É f. g g ct' an. o:øuo.ov. 000 f 'fl ' "' ' PATENTKRAV Monoklonal antikropp, kännetecknad av att dess antigenbindande ställe kompetitivt inhiberar den immunospecifika bindningen av den monoklonala antikroppen L20 framställd av hybridom HB8913, såsom deponderad av ATCC, till dess målprotein- antigen, vilket proteinantígen är en cellyte- determinant av icke-småcelligt humanlungkarcinom. Monoklonal antikropp enligt patentkrav 1, känne- tecknad av att den är konjugerad till en markör med förmåga att avge en detekterbar signal. Monokonal antikropp enligt patentkrav 2, kännetecknad av att markören innefattar ett fluorescerande medel, en radiomarkör, en kromofor eller ett enzym. Ett Fab-, (Fab')2~ eller Fv-fragment av den mono- klonala antikroppen enligt patentkrav 1. Fragment av monoklonal antikropp enligt patentkrav 4, kännetecknad av att den är konjugerad till en markör till en förmåga att producera en detekterbar signal. Fragment av monoklonal antikropp enligt patentkrav 5, kännetecknad av att markören innefattar ett fluorescerande medel, en radiomarkör, en kromofor eller ett enzym. O OQO IIIU IDO I O II v o U I 0 O I IIOI IC vv u O UÛO I Q OO' Oil ny; o o .' ÜÜÜ' .Ü 'i ä=~§~f j; :in i I!! I > 'OC O U un- O C .I ,- O., ' .ozon 'Odd P.anä. nr 87OOBO5~8 Föreliggande uppfinning avser nya mdndkldnala antikrdppar, som kraftigt binder till ett prdteinantigen, som är assm~ cierat med icke~emacel1igt humanlungkarcindm (NSCLC>, små~ æelligt humanldngkarcindm och vissa andra humankarcindm innefattande många karcindm i Rdldn och bröst. Qntikrdppar* na binder till normala humanceller i mycket mindre grad än till tumörceller. Qntikrdpparna Finner användning bade vid diagnostiska metoder, såsom detektering av maligna celler associerade med NSCLC, dch vid terapeutiska metdder för be- handling av människa med NSCLC och vissa andra humankarci* ndm. Ett nytt glykdprdteinantigen med mdlekylvikten 110.000 daltdn avslöjas aven, vilket har påvisats på cell- ytan hos celler av icke-smâcelligt humanlungkarcinmm dch i celler från vissa andra humancancerfdrmer. Den amindtermi- nala amindsyrasekvensen hos detta antigen är 1 5 10 4 15 EQ L-X-V-Q~V~P~E~X~P-V~V-Q~L~V-G~T~D~Q~X~L vari X är en oidentifierad amindsyra.