DD266028A5

DD266028A5 - Verfahren zur herstellung eines monoklonalen antikörpers

Info

Publication number: DD266028A5
Application number: DD30018987A
Authority: DD
Inventors: Karl Erik Hellstrom; Joseph P Brown; Ingegerd Hellstrom; Hans Marquardt
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1986-02-26
Filing date: 1987-02-25
Publication date: 1989-03-22
Also published as: DK98187A; FI870764A0; SE9201529D0; IE870487L; SE467988B; GB2186885B; LU86786A1; JPS62220197A; BE1000611A5; GB8703700D0; CH675880A5; GR870294B; DD276165A5; ATA43587A; AT400577B; YU25787A; NO870770L; SE9201529A0; AU612967B2; PT84370A

Abstract

Erfindungsgemaess wird ein Verfahren zur Herstellung neuer monoklonaler Antikoerper bereitgestellt, die stark an ein Proteinantigen binden, das mit menschlichen nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen ("ESCLC"), menschlichen kleinzelligen Lungenkarzinomen und anderen menschlichen Karzinomen einschliesslich vieler Karzinome des Colons und der Brust assoziiert ist. Die Antikoerper binden wesentlich weniger stark an normale Humanzellen als an Tumorzellen. Erfindungsgemaess umfasst ist auch ein neues Glykoproteinantigen mit 110 000 Dalton, das auf der Zelloberflaeche menschlicher nicht-kleinzelliger Lungenkarzinomtumorzellen und auf Zellen bestimmter anderer Humankarzinome zu finden ist. Die aminoterminale Aminosaeuresequenz dieses Antigens ist: 1XVC5PEXP10VALV15TDAX20 LXVCVPEXPVVALVCTDAXLworin X eine nicht-identifizierte Aminosaeure bedeutet.

Description

266 02β

Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers

Anwendungsgebiet der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung eines neuen monoklonalen Antikörpers bereitgestellt. Dieser erfindungsgemäß hergestellte neue monoklonale Antikörper ist spezifisch für Karzinoiuantigene. Der erfindungsgemäß hergestellte monoklonale Antikörper ist insbesondere inununospezifisch für und/oder immunoreaktiv mit einem Proteinantigen, das beim nicht-kleinzelligen Karzinom beim Menschen (human non-small cell lung carcinoma "'SCLC) und bei bestimmten anderen. Karzinomen beim Menschen einschließlich bei Brust- und Colonkarzinomen auftritt.

Der erfindungsgemäß hergestellte monoklonale Antikörper reagiert mit einer Determinante eines Glycoproteinantigens, das mit NSCLC-Zellen und auch mit anderen Karzinomen assoziiert ist, wozu Brust, Colon- und kleinzellige Lungenkarzinome gehören. Der erfindungsgemüß erhältliche monoklonale Antikörper besitzt klar unterscheidbare Eigenschaften und Fähigkeiten. Dieser Antikörper findet daher Anwendung sowohl bei in vivo als auch bei in vitro klinisehen Diagnosen. Der erfindungsgemäß hergestellte Antikörper

kann außerdem therapeutisch eingesetzt werden, So kann der neue Antikörper ein zielselektiver Träger verschiedener Agentien sein, welche gpgen Turaore wirken, wozu beispielsweise chemotherapeutische Arzneimittel, Toxine, Modifikatoren des immunologischen Ansprechens und Radioisotope gehören. Ferner können die durch diesen Antikörper produzierten Hybridomzellen unter Einsatz der rekombinante DNA ver- *

wendenden Technik so modifiziert werden, daß die erhaltenen Antikörper eine antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität vermitteln oder für Tumorzellen in Anwesenheit von Komplementkomponenten zytolytisch sind.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Männer, die ihrem Krebsleiden erliegen, sterben vorwiegend an Lungenkrebs. Dabei sterben mehr Männer an Lungenkrebs als Frauen an Brustkrebs, welcher die bei Frauen häufigste Krebserkrankung ist. Der Lungenkrebs bzw. die Lungenkarzinome können in die folgenden vier histology sehen Haupttypen unterteilt werden:

(1) Epidermoides oder Plattenepithelkarzinom (30%),

(2) Adenokarzinom (35%),

(3) undifferenziertes großzelliges Karzinom (15%) und (4) kleinzelliges Karzinom (20%).

Zum sogen, nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) gehören die folgenden Zelltypen:epidermoide Karzinomzeli«in, Adenokarzinomzellen und große undifferenzierte Karzinomzellen.

In den meisten Fällen sind Lungenkarzinome durch Chemotherapie oder Bestrahlung nicht heilbar. Klelnzellige

Lungenkarzinome können auf eine Chemotherapie und eine Bestrahlungstherapie durch Reduktion ihrer Größe ansprechen. Jedoch stellt dies keine endgültige Heilung dar. Nur durch eine vollständige chirurgische Entfernung des Tumors scheint eine wirksame Therapie möglich zu sein. Leider haben jedoch weniger als 30% der Lungenkrebspatienten Tumore, die, nachdem sie diagnostiziert worden sind, auch völlig reseziert werden können. Von denjenigen Patienten, denen der Tumor chirurgisch vollständig (soweit feststellbar) entfernt wurde, überleben nur 1/3 mehr als fünf Jahre. Es besteht daher ein großes Bedürfnis danach, Lungenkrebs in einem früheren Stadium diagnostizieren zu können, die Ausbreitung des Krebses besser definieren zu können und eine wirksamere Therapie zur Hand zu haben.

Monoklonale Antikörper, die homogene Antikörpermoleküle darstellen, welche an eine einzelne molekulare Stelle (d.h. ein Epitop) an einem Antigen mit einer spezifischen Bindungs- oder Affinitätskonstante binden, kann man nach drei im Stand der Technik beschriebenen Verfahren herstellen .

Man kann monoklonale Antikörper nach der Hybridomtechnik herstellen, die von Kohler und Milstein entwickelt wurde (1975, Nature 2^6:495; 1976, Eur. J. Immunol. 6: 511). Durch Verschmelzen antikörper-produzierender Zellen (splenische Lymphozyten) mit Myelomzellen schufen Kohler und Milstein Hybridzellen, wobei immortale Zellinien entstanden, welche einerseits die Fähigkeit zur Antikörperherstellung besitzen und andererseits in einer Zellkultur permanent wachsen können. Die Hybridome sekretieren einen einzelnen Typ von Immunoglobulin einer prädefinierten Aiitigenspezifizität in Abhängigkeit von dem Antigen, dem die Lymphozyten zuvor ausgesetzt waren.

In alternativer Weise kann man monoklonale Antikörper durch in vitro-Transformation von B Lymphozyten aus dem peripheren Blut von Säugetieren mit beispielsweise dew Epstein Barr Virus (EBV) produzieren. Das Virus immortalisiert die antikörperproduzierenden Lymphozyten. Derartige Transformations techniken sind im Stand der Technik bekannt, man vgl. beispielsweise Steinmetz et al., 1977, Nature 269; ' 420; Crawford et al., 1983, The Lancet, i: 386).

Schließlich ist es auch möglich, monoklonale Antikörper unter Einsatz von Techniken zu produzieren, bei denen die EBV-Immortalisierung und die Zellverschmelzung oder die Hybridomtechnik kombiniert werden. Coie et al. (1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., S. 77-96) beschreiben Techniken zum Verschmelzen eines menschlichen Plasmazytom- oder lymphoblastoiden Zellinien-Fusicnspartners mit EBV-transformierten Donorlymphozyten, welche zuvor als eine Zeilinie erkannt worden sind. In einem solchen System sind beide ursprünglichen Zellinien immortal. Der Fusionspartner muß somit geeignete Arzneimittel-Marker aufweisen, um gegen die ursprünglichen Zellinien zu ^ junter-selektieren, wenn das verschmolzene Hybridom kultiviert wird. Die entstehenden EBV-Hybridome produzieren Antikörper, welche spezifisch für die eingesetzte EBV-Lymphozyten-Zellinie ist.

Monoklonale Antikörper können in großen Mengen durch in vitro-Zellkultivierung bestimmter Hybridome oder traneformierter Zellinien hergestellt werden. Außerdem führt die Inokulierung einer Hybridomzellinie in die Peritonealhöhle geeigneter Säugetiere, beispielsweise Mäuse, zu einem Tumor, der hohe Konzentrationen (1-20 mg/ml) des monoklonalen Antikörpers in die TumoraszitesflUssigkeit sekretiert. Durch Entfernen der AszitesflUssigkeit und Reinigen des monoklonalen Antikörpers kann eine einzelne

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Maus eine ausreichende Menge eines Antikörpers bereitstallen, die für tausende von Diagnose-Assays genügt.

Monoklonale Antikörper für menschliche Lungenkrebsantigene B sind in den folgenden Literaturstellen beschrieben:

Sikora et al., 1981, Brit. J. Cancer 4^: 696; Cuttita et al., 1981, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 78_: 4591; Moo .y et al., 1981, Science 214; 1246; Minna et al., 1981, In Vitro j_7: 1058; Kennel et al., 1981, Cancer Res. 4J_:

3465; Chem. Abst, 95(15):1308502; Baylin et al., 1982, Proc. Nat ¹I Acad. Sei. USA 22^: 4650; Carney et al., 1982, Pathobiology Annual J_2: 115; Gazdar et al., 1983, Seminars in Oncology H^: 3; Hollinshead et al., 1983, Cancer Detect. Prevent 6: 185; Mulshine et al; 1983,

J. Immunol. J_3_I: 497; Huang et al., 1983, Arch.Biochem. Biophys. 220: 318; Saji et al., 1984, Hybridoma ,3_^{: 1}"3; Bio. Abst. 79005569; Bosslet et al., Behring. In&t. Mitt. J±: 27; Chem. Abst. AC101{9): 706686; Roset et al., 1984, Cancer Res. £4: 2052; Bio. Ast. 7S023605; Princler et al., 1982, Cancer Res. ^2: 843; Mazauric et al., 1982, Cancer Res. 4j2: 150; Braatz et al., 1982, Cancer Res. 42: 849; Sobel et al., 1982, Fed. Proc. 4_^: 409, CoIe et al., 1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, Inc., S. 77-96 und Varki et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan List., Inc., S. 207.

In den US-Patentanmeldungen mit den Ser.Nos. 667 52! (eingereicht am 2. November 1984); 785 177 (eingereicht am 7. Oktober 1985); 684 759 (eingereicht am 21. Dezember 1984); 776 321 (eingereicht am 18. Oktober 1985) und 738 612 (eingereicht am 28. Mai 1985) sind bestimmte monoklonale Antikörper gegen menschliche nicht-kleinzellige Lungenkarzinome beschrieben.

Monoklonale Antikörper können zur früheren Diagnose von Lungenkrebs, zur genaueren Bestimmung des Ausbreitungsgrades von Krebs und für eine wirksamere Therapie vor. Lungenkrebs eingesetzt werden. Voraussetzung dafür ist jedoch, daß man Antikörper für Antigene findet, die in Lungenkrebsgewebe stärker exprimiert werden als in normalem Gewebe von Erwachsenen. Angesichts der bekannten Heterogenität von Tumorzellpopulationen, der Anwesenheit verschiedener Determinanten auf demselben Antigenmolekül, der zu erwartenden Unterschiede zwischen Antigenen bezüglich ihrer Stabilität als diagnostische Marker und als therapeutische Targets und des unterschiedlichen biologischen Verhaltens verschiedener Antikörper zu demselben Antigen müssen für mehrere unterschiedliche Antikörper auch mehrere unterschiedliche Antigene zum Einsatz gebrach⁴-, werden.

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von monoklonalen Antikörpern, die maligne Zellen erkennen, die mit nicht- *® kleinzelligen Lungenkarzinomzellen assoziiert sind. Die Antikörper können auch therapeutisch zur Bvi'analung von Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen und bestimmten anderen Humankarzinomen eingesetzt werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper zur Verfügung zu stellen, welche Oberflächenantigene ven bestimmten menschlichen Krebszellen spezifisch erkennen.

Der erfindungsgemäß erhältliche monoklonale Antikörper gehört zu einer neuen Klasse, die als L20 bezeichnet ist. Dieser monoklonale Antikörper ist spezifisch für eine Determinante (Determinantenstelle) an einem Glucoproteinantigen, das mit menschlichen nicht-kleinzelligen Lungen-

karzinomzellen (NSCLC) assoziiert ist. Zu diesen Zellen, die nachstehend als "NSCLC-Zellen" bezeichnet sind, gehören epidermoide Karzinomzellen, Adenokarzinomzellen und undifferenzierte großzellige Karzinomzellen. Die Determinante kann auch an Antigenen von einigen anderen Karzinomen vorhanden sein, beispielsweise bei einigen Karzinomen der Brust und des Colon und beim kleinzelligen Lungenkarzinom. So'mic bindet der erfindungsgemäß erhältliche Antikörper auch an Zellen von anderen Karzinomen und kann zur Diagnose und Therapie von allen anderen Tumoren eingesetzt werden, die das durch den AntiKörper L20 identifizierte Antigen exprimieren. Der erf jr. lungsgemäß hergestellte monoklonale 'Vntikörper bindet wesentlich weniger stark an normale erwachsene Zellen als an Tumorzellen. Mit dem Ausdruck 'bindet wesentlich weniger stark an "soll zum Ausdruck gebracht werden, daß ein Binden überhaupt nicht detektierbar ist oder nur als sehr schwaches Anfärben detektierbar ist, falls immunohistologische Techniken zur Anwendung kommen. Der Antikörper ist somit in hohem Maße spezifisch für das Antigen, das charakteristisch für NSCLC und bestimmte andere Karzinome ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das neue L20-Antigen, das durch den Antikörper L20 identifiziert wird, und die Klasse von Antikörpern, die an dieses Antigen binden, dafür immunospezifisch sind oder damit immunoreak-civ sind. Erfindungsgemäß werden ferner Verfahren zur Verwendung des gereinigten oder klonierten L20-Antigens als Vakzin zum Immunisieren gegen bestimmte Karzinome bereitgestellt.

Der erfindungsgemäß hergestellte monoklonale Antikörper kann bei bestimmten Diagnoseverfahren eingesetzt werden. So kann dieser Antikörper zur Bestimmung malignen Lungengewebes und anderer maligner Humangeviebe eingesetzt werden. Dabei untersucht man das Gewebe auf die Anwesenheit eines

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Antigens mit den Charakteri.stika eines durch den Antikörper L20 definierten Glycoproteins mit 110 000 Dalton. So kann das Gewebe mit eineir Antikörper in Kontakt gebracht werden, der eine Determinan«;enstelle auf einer Zelle definiert, welche mit dem Antigen assoziiert ist, das die Charakteristika des Antigens besitzt, das durch den Antikörper L20, oin funktionelles Äquivalent oder ein Fragment dieses Antikörpers definiert ist. So kann jede Interaktion des Antikörpers und der Antigendeterminanten detektiert werden. Bei einer solchen Arbeitsweise wird die Anwesenheit von NSCLC-Zellen in einer Probe untersucht, von der angenommen wird, daß sie derartige Zollen enthält. Die Probe wird mit dem monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht, der derartige Zellen von anderen Zelltypen unterscheiden kann, welche in der Probe ebenfalls vorhanden sein können- Den Antikörper bringt man bei solchen Bedingungen mit der Probe in Kentakt, bei denen er an die Zellen binden kann. Nach dem Inkontaktbringen wird die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Bindung des Antikörpers an die Zellen in der Probe bestimmt. Ob der Antikörper bindet, hängt davon ab, ob NSCLC-Zellen in der Probe vorhanden sind oder nicht. Im allgemeinen wird die Probe mit einem markierten spezifischen Bindungspartner des monoklonalen Antikörpers in Kontakt gebracht. Diese Markierung ist in der Lage.ein detek :ierbares Signal zu liefern.

Bei einem weiteren Diagnoseverfahren unter Anwendung der in vivo-Lokalisierung eines Tumors wird ein erfindungsgemäß erhältlicher, gereinigter Antikörper oder ein Antikörperfragment, der (das) mit einem Agens markiert ist, das ein detektierbares Signal liefert, an einen Patienten verabreicht. Die Lokalisation wird dann durch externe Szintographie, Emissionstomographie oder Scannen auf Radionuklide detektiert. Dieses Verfahren kann auch dazu eingesetzt werden, bösartige Geschwülste bei Krebspatienten in pathologische Stadien anhand deren Ausbreitung

einzuteilen und die Veränderungen beim Ansprechen auf die Therapie zu überwachen.

Der erfindungsgemäß erhältliche Antikörper kann auch therapeutisch eingesetzt werden, da der L20-Antikörper und ähnliche Antikörper mit dem L20-Antigen reagieren, welches in hohen Konzentrationen an der Oberfläche der Tumorzelle exprimiert wird. Antikörper können dah, r als Träger verschiedener Agentien eingesetzt werden, welche Antitumorwirkung besitzen. Dazu zählen chemotherapeutische Arzneimittel, Toxine, Immunmodulatoren und Radioisotope

Außerdem kann der L20-Antikörper derart modifiziert werden, daß er eine antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) vermittelt; d.h. er kann NSCLC-Zellen in Anwesenheit von Humanlymphozyten oder Makrophagen töten oder er wird für Tumorzellen in Anwesenheit des Humankomplements zytolytisch.

Eine derartige Modifikation kann beispielsweise mit Hilfe von Techniken erzielt werden, die kürzlich für die Produktion von "chimeren Antikörpern" entwickelt wurde . Demgemäß werden Gene, die für die variable Region des L20-Antikörpermoleküls kodieren, mit Humangenen verknüpft, die für die Fc-Region eines Antikörpers mit einer geeigneten biologischen Aktivität (beispielsweise die Fähigkeit, das Humankomplement zu aktivieren und ADCC zu vermitteln) kodieren. Es könncm auch neu? Antikörper, die von der Maus oder vom Menschen stammen, für das L20-Antigen mit den geeigneten biologischen Funktionen hergestellt werden.

Erf indungr'temäß wird ein neuer mcnoklonaler Antikörper hergestellt, Λί2Γ als L20 bezeichnet ist und der immunospezifisch für und/oder immunoreaktiv mit einem Antigen an menschlichen

NSCLC-Zellen und Zellen von verschiedenen anderen Humankarzinomen ist, wozu Karzinome des Colons und der Brust und kleinzellige Lungenkarzinome zählen. Erfindungsgemäß werden somit Verfahren zur Herstellung eines derartigen

^ neuen monoklonalen Antikörpers bereitgestellt, der für bestimmte diagnost ».sehe und therapeutische Zwecke Anwendung finden kann.

Die Erfindung betrifft auch ein neues Selloberflächenanti-¹^ gen, das für menschl ".ehe NSCLC-Zellen und bestimmte andere Humankarzinome der Brust, des Colons und der Lunge charakteristisch ist.

Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen NSCLC

Monoklonaie Antikörper gegen Human-NSCLC und bestimmte

andere Humankarzinome können nach der Hybridom-Fusionstechnik, durch EBV-Transformation von humanen Lymphozyten, welche Antikörper produzieren, oder nach Techniken, bei „_ denen die Zellverschmelzung und EBV-Immortalisationstechnikvjn kombiniert werden, hergestellt werden.

Fusionstechniken

Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die monoklonalen Antikörper gegen NSCLC unter Anwendung der

*° Hybridomzell-Fusionstechnik hergestellt. So werden beispielsweise menschliche Lungenkarzinomzollen von pleuralen Ergüssen, kultivierte Zellen von explantierten menschlichen NSCLC-Tunoren oder Zellen von einer normalen fötalen Lunge oder Lysate von derartigen Zellen als Immunogen eingesetzt.

^O so wurden beispielsweise explantierte Zellen von einem NSCLC, menschliches Lungenadenokarzinom Nr. 3082, als Immunogen eingesetzt, man vgl. die weiter unten gemachten Ausführungen. Die Zellen wurden beispielsweise einer Maus injiziert. Nachdem genügend Zeit verstrichen war, wurde die

^^ Maus getötet. Es wurden somatische Antikörper-produzierende Lymphozyten erhalten. Die Antikörper-produzierenden Ztrllen können von den Lymphknoten, der Milz und dem peripheren Blut der primierten Tiere stammen, wobei jedoch Milzzellen

bevorzugt sind. Mäuselymphozyten führen zu einem höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen mit den unten beschriebenen Mäusemyelomen. Es ist auch möglich, somatische Zellen von Ratten, Kaninchen und Fröschen einzusetzen. Die rtilz-Zell-Chromosomen, die für die gewünschten Immunoglobuline kodieren, werden durch Verschmelzen der Milzzellen mit Myelomzellen, im allgemeinen in Anwesenheit von Polyethylen- ^lycol,immortalisiert. Es können verschiedene Myelomzell" li'-.xen zur Herstellung verschmolzener Zellhybride eingesetzt werden. Dazu zählen NSI-Ag4/l, X63-Ag8, MPC11-45.6TG1.7, X63-Ag.6 53, Sp2/0-Ag14, Fo und S194/5XXO.Bu.1, von Mäusen erhalten, und 210 .RCY3 . Ag1. 2 . 3 , U-226AR und GM1 500GTGAL.2, von Ratten erhalten (Hammerling et al., 1981, "Monoclonal Antibodies and T-cell hybridomas" in Research Monographs in Immunology, Band 3, J.L. Turk, Hrsg. Elsevier/ North Holland Biomedicai Press, New York). So wurden beispielsweise NS1-Zellen eingesetzt. Die erhaltenen Zellen/ die die fusionierten Hybridome umfassen, läßt man in > inem selektiven Medium wachsen, wozu beispielsweise H/\T-i>i^viium zählt. Die überlebenden Zellen werden in diesem Medium unter Einsatz limitierender Verdünnungstechniken vermehrt. Die Zellen wachsen in einem geeigneten Behälter, beispielsweise den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte. Der überstand Wird auf monoklonale Antikörper mit der gewünschten Spezifitat gescreent.

Es existieren verschiedene übliche Verfahren, um die monoklonalen Antikörper zu isolieren und zu reinigen und um sie beispielsweise von anderen Proteinen oder anderen Verunreinigungen zu befreien.

EBV-Transformations Techniken

Bei eimjr alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die monoklonalen Antikörper gegen NSCLC unter Anwendung der EBV~Transformationstechnik hergestellt. So werden beispielsweise Lymphozyttm, die aus dem peripheren Ulut, aus Tumor-abgebenden Lymphknoten, aus aus

Markknochen gewonnenen Aspiraten, aus Tumoren oder aus pleuralen Ergüssen von Patienten mit NSCLC stammen, unter Verwendung von EBV immortalisiert, gemäß den von CoIe et al., 1984, Cancer Res. ££: 2750, beschriebenen Methoden. Wie dort bereits ausgeführt ist, sind B-Lymphozyten, die für Tumorantigene spezifisch sind, in Lungenkrebspatienten selten. Es ist daher insbesonders wichtig, die Zahl der Antikörper-produzierenden Lymphozyten zu erhöhen, indem man Lymphozyten, welche den Antikörper gegen das relevante Antigen produzieren, präselektiert. Die EBV-Transformationstechnik umfaßt somit zwei Stufen:

(1) Anreicherung von Zellen mit Rezeptoren für das gegebene Antigen, i.e. L20-Antigen, das nachstehend beschrieben ist; und

(2) Immortalisierung derartiger Zellen durch Infektjon mit EBV.

EBV-Hybridorn Techniken

Die erfindungsgemäßen Antikörper gegen NSCLC können erfindungsgemäß auch durch Kombination der Transformationsund Hybridom-Fusionstechnik hergestellt werden, man vgl. CoIe et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96. So kann man beispielsweise eine Myelomzellinie mit Donorlymphozyten von NSCLC-Patienten verschmelzen, welche zuvor durch EBV-transformiert und als eine Zellinie erkannt worden sind, die unter Kulturbedingungen wachsen und sich entwickeln kann. Um in der Lage sein zu können, die erhaltenen EBV-Hybridom-Fusionszellinien zu selektieren, ist es erforderlich, daß der Fusionspartner dominante geeignete selektierbare Arzneimittelmarker, beispielsweise Ouabain- oder Neomycinresistenz, besitzt, so daß sich keine parentale Zellen entwickeln, wenn die verschmolzenen Hybridomzelllinien kultiviert werden. Eine geeignete Linie ist die

thioguaminresistente IM-150, ouabainresistente lymphoblastoide Zelliline, KR-4, beschrieben von Cole et al., s. oben. Die erhaltenen Hybridomzellen werden nach üblichen Techniken kloniert.

Zellvermehrung und Antikörperproduktion Sobald die gewünschten verschmolzenen Zellhybride oder

transformierten Zellinien selektiert und kloniert sind t

in t nzelne Antikörper-produzierende Zellinien, kann jede Zellinie nach beiden von zwei üblichen Wegen vermehrt werden. Die einzelne Zellinie kann in vitro, beispielsweise in Laboratoriums-Kulturgefäßen, vermehrt werden. Das Kulturmedium, das hohe Konzentrationen eines einzelnen spezifischen monoklonalen Antikörpers enthält, kann durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen werden, In alternativer Weise kann die Ausbeute an monoklonalem Antikörper durch Injizieren einer Probe des Hybridoms in ein histokompatibles Tier des gewählten Typs erhöht werden, um so die somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Verschmelzung bereitzustellen. Tumore, die den spezifischen monoklonalen Antikörper sekretieren, der durch das verschmolzene Zellhybrid produziert wird, entwickeln sich in dem Tier, dem die Injektion gegeben wurde. Die Körperflüssigkeiten des Tieres, beispielsv/eise Aszitesflüssigkeit oder Serum, stellen monoklonale Antikörper in hohen Konzentrationen bereit. Wie bereits von CoIs et al in der oben angeführten Literaturstelle ausgeführt ist, ist es dann, falls Humanhybridome oder EBV-Hybridome eingesetzt werden, erforderlich, eine Abstoßung des den Tieren, beispielsweise Mäusen, injizierten Xenotransplantatszu verhindern. Es können immunodefiziente oder nackte Mäuse eingesetzt werden oder das Hybridom kann zuerst eine Passage in bestrahlten nackten Mäusen als fester subkutaner Tumor durchlaufen, in vitro kultiviert werden und dann intraperitonoal in mit Pristan primierte, bestrahlte nackte Mäuse injiziert werden, welche Aszitestumore entwickeln,

die große Mengen spezifischer monoklonaler Humanantikörper sekretieren, man vgl. die oben aufgeführte Literaturstelle von CoIe et al.

Der erfindungsgemäß erhältliche monoklonale Antikörper bindet an ein neues Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen, das als L20-Antigen bezeichnet ist und charakteristisch für menschliche NSCLC-Zellen und Zellen von bestimmten anderen menschlichen Karzinomen ist, wie dies nachstehend beschrieben ist. Das Glycoprotein-Antigen besitzt ein Molekulargewicht von etwa 110 000 Dalton, wenn es einer Immunopräzipitation in einer Elektrophorese an Polyacrylamidgel unterworfen wird, wie dies ebenfalls nachstehend beschrieben ist. Durch Verdauung des L20-Antigen/$ mit Glycanase konnte gezeigt werden, daß es N-verbundene Oliyosaccharidketten enthält.

Der L20-Antikörper wird beispielsweise von dem nachstehend beschriebenen L20-murinen Hybridom produziert. Der L20-Antikörper ist vom Isotyp IgGI (dies ist ebenfalls nachstehend beschrieben) und besitzt einen Avidität von etwa 3 χ 10 . Der Antikörper bindet nicht detektierbar an normale Zellen, wozu beispielsweise Fibroblasten, endotheliale Zellen oder Epithelzellen in den Hauptorganen zählen. Mit dem Ausdruck "er bindet nicht detektierbar" soll zum Ausdruck gebracht werden, daß immunohistologisch nur eine sehr schwache Anfärbung oder überhaupt keine Anfärbung detektierbar ist.

Erfindungsgemäß umfaßt sind auch nützliche bindende Fragmente des obigen monoklonalen Antikörpers, beispielsweise Fab, F(ab')_, Fv-Fragmente etc. Die Antikörperfragmente erhält man nach üblichen Techniken. So kann man beispielsweise nützliche bindende Fragmente herstellen durch Peptidaseverdauung des Antikörpers unter Einsatz von Papain oder Pepsin.

Ähnliche Antikörper, wozu auch Antikörper unterschiedlicher Isotypen, unterschiedlicher Affinität und mit neuen biologischen Funktionen, wie der Fähigkeit Turaorzellen in Anwesenheit des Komplements oder von Effektorzellen, beispielsweise Lymphozyten oder Makrophagen, zu töten, sind ebenfalls erfindungsgemäß umfaßt. Das oben aufgeführte spezifische Beispiel für einen neuen erfindungsgemäßen Antikörper, das auf einen Antikörper gerichtet ist, der an eine spezifische Determinante an dem entsprechenden Antigen bindet und zu der IgGI-Unterklasse aus einer murinen Quelle stammt, soll die vorliegende Erfindung nicht einschränken. Sowohl diesei. oben beschriebene Antikörper als auch solche Antikörper, die über eine funktionelle Äquivalenz mit dem oben beschriebenen Antikörper verfügen, unabhängig davon, ob sie auch einer murinen Quelle, aus einer "Säugetierquelle" einschließlich des Menschen oder aus anderen Quellen oder aus Kombinationen davon stammen, sind erfindungsgemäß umfaßt. Dies gilt auch für die Antikörper anderer Isotypen. Mit dem Ausdruck "funktioneile Äquivalenz" wird ein Antikörper bezeichnet, der in der Lage ist, an die oben beschriebene Determinante zu binden und mit einem bestimmten erfindungsgemaß erhältlichen Antikörper um dieue Determinante bzw. Determinantenstellung in Wettbewerb zu treten. Dies bedeutet, daß ein derartiger Antikörper, falls er mit einer Probe vereinigt wird, die eine Zelle oder ein Fragment mit einer derartigen Determinante enthält, an diese Determinante bindet und einen erfindungsgemäß erhältlichen Antikörper davon abhält, an diuse Determinante bzw. an diese Stelle zu binden. Da außerdem das erfindungsgemäße Antigen mehr als eine Determinante aufweisen kann, umfaßt die Erfindung auch monoklonale Antikörper, welche anderes Determinanten als die durch den zuvor genannten monoklonalen Antikörper definierte Determinante definieren und dio durch im Stand der Technik bekannte sequentielle Imrounopräsipitations-Assays identifiziert werden können.

Zur Erfindung gehörig sind auch Antikörper, die in Antwort auf die Antigen-bindenden Stellen hergestellt wurden, oder Idiotypen des L20-Antikörpers, da derartige anti-idiotypische Antikörper zur Analyse des Imniunansprechens auf Tumorantigene für diagnostische Zwecke und zum Induzieren eines Immunansprechens für therapeutische oder prophylaktische Zwecke eingesetzt werden können (man vgl. Nepom et al., 1984, Proc. Nat'l Acad. Sei. {Π: 2664).

Das durch die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper erkannte Antigen weist ein neues Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen auf, das für NSCLC-Zellen und andere Karzinome, einschließlich Brust- und Colonkarzinomen sowie kleinzelligen Lungenkarzinom charakteristisch ist. Das Antigen besitzt ein Molekulargewicht von etwa 110 000 Dalton.

Die aminoterminale Aminosäuresequenz des neuen Glycoprotein-Antigens ist die folgende: 20

1 5 10 15 20 L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D--A-X-L

Dabei bedeutet X eine Aminosäure, die bis jetzt noch nicht identifiziert worden ist. Die übrigen Buchstaben stellen die üblichen Abkürzungen für Aminosäuren dar. Ein Vergleich dieser Sequenz mit denjenigen, die in der Proteindatenbank (PIR Release 6.0, November 1985) gespeichert sind, ::eigt keine signifikante Übereinstimmung mit irgendeiner ι er anderen benannten Sequenzen.

Diagnostische Anwendungen

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können al3 Sonden zum Detektieren diskreter Antigene in menschlichen NSCLC und anderen Humantumoren eingesetzt werden. i!o kann man die Anwesenheit eines malignen Zustands in Lungenge-

webe oder anderen Humangeweben bestimmen, indem man das Gewebe auf die Expression oder auf das Fehlen einer derartigen Expression eines Glycoprotein-Antigens mit den Charakteristika des L20-Antigens untersucht. Der Ausdruck "mit den Charakteristika des" bezeichnet, daß das Antigen mit einem Antikörper reagieren kann, der das L20-Antigen erkennt. Die Expression oder das Fehlen der Expression dieses Antigens kann eine für klinische Zwecke verwertbare Information darstellen, die mit Hilfe von üblichen histopathologischen Techniken nicht erhalten werden kann.

Die erfindungsgr ..äßen monoklonalen Antikörper können beispielsweise dazu eingesetzt werden, niclit-kleinzel] ige Lungenkarzinomzellen in histologischen und zytologischen Proben zu detektieren. Bringt man beispielsweise die nachstehend beschriebene Technik zum Anfärben nut Immunoperoxidase zur Anwendung, dann zeigen exzisierte Gewebeproben von Adenokarzinomen, epidermoiden und kleinzelligen Karzinomen der Lunge eine intensive positive Verfärbung.

Normales Lungen-, Milz, Brust-, Colon-, Nieren, Leber-, Hirn-, Herz-, Haut-, Schilddrüsen-, Hoden- und Vaginagewebe sowie normale Lymphozyten waren negativ.

Eine weitere wichtige in vitro diagnostische AnwendungsmögMchkeit für die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper besteht in der Bewertung von Karzinomen, die sich vo.j den NSCLC unterscheiden. Der Antikörper wurde eingesetzt, um das Epitop bei Brust- und Colonkarzinomen und in kleinzelligen Lungenkarzinomen zu detektieren. Normale Proben dieser Gewebe exprimierten die Determinante nicht.

Somit ist der mon'iklonale Antikörper nützlich üum Detektieren einer mit dem Tumor assoziierten antigenischen Determinante bzw. Antigendeterminante in diesen Karzinomen. Der monoklonale Antikörper kann somit ein nützliches diagnostisches i'.eager ^ für BruKt- und Colonkarzinome und für klein-

18 zellige Lungenkarzinome sein.

In alternativer Wr se können Immunofluoreszenztechniken zur Anwendung gebracht werden, um Humangewebeproben mit den orfindungsgemäßen ironoklonalen Antikörpern zu untersuchen. So

wurden beispielsweise Objektträger mit Kryostatschnitten _t einer gefrorenen, nicht-fixierten Gewebebiopsie oder exzisierten Tumorproben oder zytologiscnen Ausstrichen an der Luft getrocknet und mit dem monoklonalen Antikörper in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur inkubiert. Die zytologischen Ausstriche enthielten exfoliative Zellproben. Der Ausdruck "exfoliativ" bringt zum Ausdruck daß die Probe isolierte Zellen oder Zellklumpen enthält, die durch Kratzen oder Waschen der Gewebeoberfläche erhalten wurden, wobei diese Zellen einzeln oder als Schuppen oder als Plättchen e.rtfernt wurden. Die exfoliative Zellprobe kann unterschieden werden von exisiertem Gewebe, wie demjenigen, das bei der Biopsie erhalten wurde. Dieses Verfahren findet Anwendung bei der Detektion eines malignen Zustande in exfoliativun Zellproben aus der Lunge, beispielsweise Sputumprobe, aus den Bronchen, dem Gastrointestinaltrakt einschließlich Rachen und Mund, aus einem zervikalen Ausstrich etc..

Nach dem Trocknen wurden die Objektträger mit einem Antikörperpräparat gegen den monoklonalen Antikörper überschichtet. Es handelt sich dabei gewöhnlich um eine Art von Antimausimmunoglobulin, falls der eingesetzte monoklonale Antikörper aus der Verschmelzung von Milzlymphezyten von einer Maus mit einer Myelomlinie von der Maus stammt. Dieses Antimausimmunoglobulin wurde nach bekannten Techniken mit einer Verbindung konjugiert, beispielsweise Rhodamin oder Fluoresceinisothiocyanat,die bei einer bestimmten Wellenlänge fluoresziert. Das Färbungsmuster und die Intensitäten innerhalb der Probe wurden dann mit Hilfe

einee Fluoreszenzlicht-Mikroskops bestimmt und gegebenenfalls photographisch festgehalten.

Obige Ausführungen beschreibung primär die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper in Immunofluoreszenztechniken. Die erfindungsgemäßen Antikörper können jedoch *"ch in den meisten Assays eingesetzt werden, bsi denen Antigen-Antikörper-Reaktionen stattfinden. Es kann sich dabei um homogene oder heterogene Assays handeln. In einem homogenen Assay kann die Probe ein Gewebe sein, das lysiert und gsklärt ist, um Debris zu entfernen. An der Immonologischen Reaktion nehmen gewöhnlich der spezifische Antikörper, ein mit einer Markierung ausgestatteter Analyt und die interessierende Probe teil. Das von der Markierung stammende Signal wird direkt oder indirekt modifiziert, sobald der Antikörper an den mit der Markierung ausgestatteten Analyt bindet. Sowohl die immunologische Reaktion als auch die Untersuchung darauf, wie stark diese Reaktion war, werden in einer homogenen Lösung durchgeführt. Σλι den immunochemischen Markierungen, die Anwendung finden können, zählen freie Radikale, Fluoreszenzfarbstoffe, Enzyme,Bakteriophagen, Coenzyme etc..

Bei einem heterogenen Assay werden normalerweise die Probe, der spezifische Antikörper und Mittel zur Produktion eines detektierbaren Signals eingesetzt. Der monoklonale Antikörper ist gewöhnlich in Form eines Überzugs auf einem festen Träger oder einer festen Phase aufgebracht. Die Probe wird dann in flüssiger Phase mit dem Antikörper in der Festphase in Kentakt gebracht. Der Träger für die Festphiise wird dann von der flüssigen Phase abgetrennt. Entweder die Festphase oder die flüssige Phase wird auf ein detektierbares Signal untersucht, wobei Mittel zum Erzeugen eines derartigen Signals eingesetzt werden. Das Signal steht mit der Anwesenheit des Analyts in der Probe

in Beziehung. Zu den Mitteln zu Erzeugung eines detektierbaren Signals gehören radioaktive Markierungen, fluereszierende Agentien, Enzyme etc.. Derartige heteroyene Immunoassays sind beispielsweise nadioirnmunoassays, Immunofluoreszenzverfahren, Enzym-linked-immunoassays und dergleichen.

Eine genauere Beschreibung obiger Immunoassaytechniken findet sich in "Enzyme-Immunoassay" von Edward T.Maggio, 1980, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida. Diesbezüglich wird auch auf die folgenden US-PSen verv.'iesen: 3 690 R^-U.. 3 791 932, 3 817 837, 3 850 578, 3 853 987, 3 867 517,

3 901 654, 3 935 074, 3 984 533 3 996 345 und

4 098 876. Obige Aufzählung ist nicht vollständig.

Therapeutische Anwendungen

Dies erfindungsgemäßen Antikörper können auch für in vivo diagnostische Anwendungen eingesetzt werden. So können beispielsweise Antikörper oder Fragmente, die -aus den Antikörpern erhalten wurden, z.B. Fab- und F(ab')₂~ Fragmente, zum Sichtbarmachen von Tumoren, einschließlich von metastatischen Einlagerungen, bei Patienten mit NSCLC eingesetzt werden,und zwar in ähnlicher Weise, wie dies für maligne Melanome beschrieben ist von Larson et al., 1983, J. Nucl. Med. 2A_: 123 und von Larson et al., 1983,

J. Clin. Invest., Ί2_\ 2101. Der gereinigte Antikörper oder die Fragmente davon werden mit einem Agens markiert, das ein detektierbares Signal liefert. Es kann sich dabei um ein Radioisotop, beispielsweise Jod handeln. Der Antikörper wird dann in einem geeigneten Träger, beispielsweise intravenös, an einen Patienten verabreicht. Die Lokalisation des an den Tumor gebundenen Antikörpers wird durch externe Szintigraphie, Emis&ionstomographie oder durch Radioisotop-Scannen unter Verwendung beispielsweise einer Gamma-Kamera detektiert.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch therapeutisch eingesetzt werden. Die monoklonalen Antikörper können in Verbindung mit einem breiten Spektrum pharmazeutischer oder zytotoxischer Agentien eingesetzt werden. So kann der Antikörper beispielsweise an ein Toxin zur Bildung eines Immunotoxins (Jansen et al. 1982, Immunol. Rev. 6j2: 185) oder an ein radioaktives Material, z.B. I, ¹³^I etc. (Order, 1984, Compr. Ther. JH): 9; Larson et al., 1083, J. Clin. Invest. 21: 2101; Carrasquillo et al., 1984, Cancer Treatment Reports, 68^: 317) oder an ein Arzneimittel (Rowland et al., 1985, Cancer Immunol. Immurother. JJ5: 1) zur Bildung eines Radiopharmakons oder eines Pharmakons gebunden werden. Konjugierte Antikörper können an Patienten verabreicht werden, um die tumorzerstörenden Wirkungen durch die zytotoxische Wirkung des chemotherapeutischen Agens zu unterstützen, welches aufgrund der bindenden Affinität der Antikörpereinheit zu dem Tumor transportiert wird.

Sogenannte "chimere Antikörpermoleküle" des erfindungsgemäßen Antikörpers können hergestellt werden, die eine Maus-Antigen-bindende Domäne mit menschlichen Konstantregion-Domänen enthalten (Morrison et al., 1984, Proc. Nat'l Acad. Sei. U.S.A. JMi 6851; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452). Man kann so neue Antikörpermoleküle konstruieren, die wünschenswerte Effektorfunktionen besitzen. Sie haben beispielsweise die Fähigkeit, das Humankomplement zu aktivieren oder ADCC zu vermitteln (Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604).

Eine weitere therapeutische Anwendung der erfindungsgsmäßen monoklonalen Antikörper besteht darin, einen anti-idiotypischen Antikörper unter Verwendung des L20 Antikörpers als Immunogen herzustellen (man vgl. beispielweise Nepon et al., 1984, Proc. Nat'l Acad. Sei. U.S.A., 8J_: 28f4, Lee et al., 1985, Proc. Nat'l Acad. Sei. 8_2: 6286),

Erfindungsgemäß ist ferner von Interesse, daß die erfindungsgemäßen Antikörper mit anderen Antikörpern für NSCLC oder für andere Tumore kombiniert werden können. Dazu zählen diejenigen, die beschrieben sind in den U.S.-Patentanmeldungen

B mit den Ser.No. 667 521 (eingereicht am 2. November 1984); 684 759 (eingereicht am 21. Dezember 1984) und 738 612

(eingereicht am 28. Mai 1985). Die Kombination ist wirksam »

beim Detektieren der oben genannten Typen von nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen, nämlich undifferenzierten großzelligen Lungenkarzinomen, Adenokarzinomen und epidermoiden Karzinomen.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper definieren auch Determinanten (Determinantenstellen) an einem Antigen, das mit anderen Karzinomen assoziiert ist, wozu Brustkarzinome, Colonkarzinome und kleinzellige Lungenkarzinome zählen (man vgl. die nachstehend aufgeführte Tabelle I). Die erfindungsgemäßen Antikörper können folglich für therapeutische Verfahren und in therapeutischen Produkten eingesetzt werden, die für diese Karzinome bestimmt sind.

Das neue Antigen der vorliegenden Erfindung, das als Antigen L20 bezeichnet ist, kann auch für therapeutische Anwendungen eingesetzt werden. Das Antigen kann von Tumoren gewonnen . werden oder durch die rekombinante DNA-Technik hergestellt werden (Brown et al., U.S.-Patentanmeldung mit der Ser.No. 827 313, eingereicht am 7. Februar 1986, worauf hiermit bezug genommen wird). Das für das L20-Antigen kodierende Gen kann nach Verfahren kloniert werden, bei denen zuerst die mRNA des L20-Antigens angereichert wird. Bei einem derartigen Verfahren können Polysome (bestehend aus mRNA, Ribosomen und naszierenden Polypeptidketten) mit Hilfe der Immunoaffinitätschromatographie unter Anwendung des Antikörpers, der die L20-Antigen-Determinante auf der naszierencen Kette erkennt, gereinigt werden. Die

mRNA wird durch Inununopräzipitation mit beispielsweise L20 Antikörper isoliert und die cDNA wird in einem geeigneten Expressionsvektor kloniert. In. alternativer Weise kann der L20-Antikörper oder das Antiserum für das L20-Antigen dafür eingesetzt werden, eine cDNA-Library unter Verwendung eines Expressionsvektors zu screenen. Das gereinigte oder klonierte L20-Antigen kann alleine als Immunogen oder zusammen mit einem geeigneten immunologischen Adjuvans verabreicht werden. In alternativer Weise ):ann man das Gen, das für das Antigen kodiert, in das Gen für ein Virus, wie das Vaccinia-Virus, insertieren, um ein Rekombinante-DNA-Produkt zu produzieren, das als Immunogen eingesetzt wird (man vgl. Brown et al., U.S.-Patentanmeldung Ser.No. 827 313, eingereicht am 7. Februar 1986).

Diagnostische Kits Erfindungsgemäß sind auch diagnostische Kits zur Durchführung der oben beschriebenen Verfahren umfaßt. Bei einer Ausführungsform umfaßt das diagnostische Kit

(a) einen wie oben näher beschriebenen monoklonalen Antikörper und

(b) ein Konjugat eines spezifischen Bindungspartners für den monoklonalen Antikörper und eine Markierung, die ein dstektierbares Signal liefern kann.

Zu den Reagentien gehören auch zusätzliche Agentien, wie Puffernuttel und proteinstab.llisierende Mittel, z.B. Polysaccharide und dergleichen. Das diagnostische Kit bzw. das Diagnosekit kann außerdem, soweit erforderlich, andere Komponenten des das Signal liefernden Systems enthalten, wozu auch Agentien zur Reduktion der Wechselwirkungen mit dem Untergrund, Kontrollreagentien, eine Vorrichtung zur Durchführung eines Tests etc. enthalten. Der Diagnosekit kann ferner ein Konjugat eines erfindungsgemäßen monoklonalen

Antikörpers und einer ein detektierbates Signal liefernden Markierung enthalten. Auch in diesem Fall können die oben genannten zusätzlichen Agentien vorhanden sein.

Beispiele

Herstellung der monoklonalen Antikörper

Die monoklonalen Antikörper stellt man nach der Hybridomfusionstechnik her, die zuvor beschrieben wurde von Yeh et al., 1979, Int. J. Cancer j29: 299. Eine drei Monate alte Balb/c-Maus wurde unter Verwendung verpflanzter kultivierter Zellen aus einem menschlichen Adenokarzinom der Lunge, bezeichnet mit 3082,als Immunogen immunisiert.

Die Maus erhielt vier intraperitoneale Injektionen von etwa

7 10 Zellen. Drei Tage nach der letzter. Immunisierung wurde die Milz der Maus entfernt, im Kulturmedium suspendiert und mit NS1-Mäusemyleomzellen (Kohler und Milstein, s.oben) verschmolzen. Die Mischung wurde beimpft, um Kulturen mit niedriger Dichte zu bilden, die aus einzelnen verschmolzenen Zellen (Klonen) stammen.

Die Überstände von den Hybridzellen wurden auf die direkte Bindungsaktivität an Lungenkrebszellinien gescreent unter Verwendung von sowohl einem ELISA-Assay als auch einem autoradiographischen indirekten I-markierten Protein A-Assay (Brown et al., 1979, J. Immunol. Meth., 3^: 201). Die Extrakte der Zellmembranen von dem Tumor, der zur Immunisierung eingesetzt wurde·/ wurden hergestellt unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens nach Colcher et al., 1981, Cancer Res. £2: 1451; Yeh et al., s.oben. Die Gewebe warden mit PBS gewaschen und die Zellen von intakten Tumoren wurden suspendiert durch Pressen durch ein rostfreies Stahlsieb. Danach wurde 1 roM NaHCO₂ mit einem Gehalt von 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (Calbiochem-Behring Corp. , San Diego, CA) hinzugegeben. Das Material wurde dann auf

Eis durch 50 Schläge mit dem B-Stößel eine?: Dounce-Homogenisiervorrichtung homogenisiert. Nach 15-minütigem Zentrifugieren bei 27 000 g wurde der überstand entfernt. Das Pellet wurde in PBS resuspendiert, 1 min beschallt und bei -7O⁰C gelagert.

Hybridome, die Antikörper produzierten, die an die ZeIlmembranextrakte binden, wurden kloniert, in vitro expandiert und weiterhin auf ihre Antikörperspezifität getestet.

Diese Hybridome, die Antikörper mit einer deutlichen Spezifizität für Humanlungenkrebs produzierten, wurden rekloniert, expandiert und in Pristan-primierte 3 Monate alte BALB/c-Mäuse injiziert, wo sie als Aszitestumore wuchsen.

Nach dieser Arbeitsweise wurde die Hybridomzellinie L20 erhalten, kloniert und in Mäuse injiziert, um einen Aszitestumor zu entwickeln. Der in die Aszites sekretierte Antikörper wurde an Protein A-Separose (Ey et al., 1978, Immunochemistry, J_5: 4 29) oder durch Gelfiltration in Sephacryl S-300 gereinigt. Der gereinigte Antikörper wurde für die weitere Charakterisierung eingesetzt.

Charakterisierung des L20-monoklonalen Antikörpers 26

Die subzelluläre Lokalisation des Antigens wurde durch Messen der Antikörperbindung an Zellen vor oder nach der Permeabilisierung mit einem nicht-ionischen Detergens bestimmt. Antikörper, die an die Zelloberfläche intakter kultivierter Zellen binden, wurden entweder durch direkte

125 Bindungsassays mit I-markiertem Antikörper (Brown et al., 1981, Proc. Nat'l Acad. Sei. U.S.A., 7jJ: 539) oder mit Hilfe der indirekten Fluoreszenz unter Anwendung des fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS) II (cell

sorter (FACS) II) identifiziert. Antikörper, die an intrazelluläre Stellen binden, wurden durch direkte Bindung des

125

!-markierten Antikörpers an Zellen nach Fixierung mit

Paraformaldehyd und anschließende Permeabilisierung mit δ dem nicht-ionischen Detergens NP-40 bestimmt.

Für die durchgeführten Bindungsassays unter Anwendung radiomarkierter Antikörper (Brown et al., s. oben) wurden kultivierte Zellen (10 ) auf Eis 30 min mit 10 cpm von

125 I-markiertem Antikörper in 100 μΐ bindenden Puffer inkubiert. Die Suspension wurde auf 0,2 ml Dinonylphtiialat: Dibutylphthalat (1:1 V/V) geschichtet und zentrifugiert. Das Pellet und die wäßrige Phat;e wurden ausgezählt (I). Zur Untersuchung der nicht-spezifischen Bindung wurden parallele Inkubationen mit nicht-markiertem Antikörper als Kornpetitor durchgeführt (man vgl. Brown et al., s. oben).

TABELLE I

Bindung des mit radioaktivem Jod markierten L20-Antikörpers an kultivierte Zellen

Zellen 26

CaIu-1 Lungenadenokarzinom

H3082 Lungenadenokarzinom

H2981 Lungenadenokarzinom

H298 4 Lungenadenokarzinom

MCF7 Brustkarzinom

3017 Melanom

Normale T-Zellen Jurkat T-Leukämie Daudi L-Lymphom

spezifische Bindung	400
45	100
50	100
64	300
119	800
78	200
2	200
	200
	200

27 j Isotyp Bestimmung des L-20 Antikörpers

Zur Bestimmung der Klasse der durch die L20-Hybridomzelllinie produzierten Immunoglobuline wurden die folgendrη Techniken eingesetzt:

(a) Ouchterlony-Immunodiffusion

Ein Aliquot des Uberstandes bestimmter Hybridomzellen wurde in die zontrale Vertiefung einer 25% Agarplatte gegeben. Monospezifische Kaninchen-Anti-Maus-Ig-Isotypen-Antikörper (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) wurden in die Außenvertiefungen gegeben und die Platte wurde 2 h bei Raumtemper^'ir und über Nacht bei 4⁰C inkubiert.

(b) Isotypisierung mit ELISA

Dynatech Immuolon-Platten mit 96 Vertiefungen (Dynatech Immuolon 96-well plates) wurden beschichtet mit jeweils Antiserum .in einer Konzentration von 1 ug/ral, 50 μΙ/Vertiefung in PBS und über Nacht bei 4⁰C stehengelasen. Die Platten wurden mit PBS/Tween 20, 0,05% gewaschen und 1 h

bei Raumtemperatur blockiert mit Medium 100 μΙ/Vertiefung.

Nach Waschen der Platten wurden die überstände von dem L20-Hybridom hinzugegeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen mit TBS wurden Rinderserumalbumin-(BSA)-Platten 2 h bei 37⁰C mit monospezifischen Kaninchen-Anti-Maus-Ig-Isotyp-Antikörpern inkubiert, die an Peroxidase (Zymed) gekuppelt waren. Nach Waschen wurden die Platten mit 1 mg,'ml o-Phenylendiamin und 0,03 % H₃O₃ in 0,1 M Citratpuffer pH 4,5 inkubiert. Die optische Dichte bei 630 nm wurde mit einer Dynatec-ELISA-Plattenlesevorrichtung bestimmt.

Der monoklonale Antikörper L20 ist vom IgG₁-Isotyp.

Antigenerkennung durch den L20 Antikörper

Um I'roteinantigene zu identifizieren wurden Lungenkarζinomzellen an der Oberfläche mit radioaktivem Jod oder metabolisch mit S-Methionin markiert. Die Antigene wurden aus Zelllysaten durch Inkubation mit dem monoklonalen Anti-

körper, Addition von Anti-Maus-IgG von der Ziege und Adsorption an Staphylococcus aureus isoliert. Die Immunpräzipitate wurden gewaschen und einer präparativen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) an einem 10 - 20% Acrylaraidgel unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Brillant Blue

(0,5 Gew.-% zu 10% Essigsäure und 30% Isopropanol) anget färbt und in einer Lösung von Essigsäure (5%, V:V) und

Methanol (17%, V:V) entfärbt. Das angefärbte L20-Antigenband wurde mit einer Rasierklinge herausgeschnitten und unverzüglich einer Elektroelution mit einem ECU-040-Elektroeluator/Konzentrator (ECU 040 Electroe]v.tor/ Concentrator; C.B.S. Scientific Co., San Diego. CA) unterworfen, wobei nach den Verfahren vorgegangen wurde, die IB beschrieben sind von Hungapiller et al., 1983, Methods in Enzymol. SM: 227-236.

Ein automatisierter Edman-Abbau (automated Edman degradation) wurde mit etwa 23 pmol des LL/O-Antigens (auf Basis der Ausbeute des identifizierten L-1) \n einer Gasphasen-Sequentierungsvorrichtung (gas-phase sequencer; Model 470A, Applied 3iosyste,ns, Inc., Foster City, CA) durchgeführt. Die Phenylthiohydatoinaminosäurederivate wurden durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeit schromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Model 120A on-line HPLC-IZinheit (Applied Biosystems, INc.) mit einer PTH-C18-Säule (2,1 χ 220 mm, Applied Biosystems, Inc.) und einem Natr.iumacetat/Tetrahydrofuran/Acetonitril-Gradienten für die Elution durchgeführt.

Die aminotermina]e Aminosäuresequenz ist die folgende:

1 5 10 15 20 L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-G-T-D-A-X-L

worin X eine Aminosäure bedeutet, die bis jetzt noch nicht identifiziert wurde.

Ein Vergleich dieser Sequenz mit denjenigen, die in der derzeitigen Proteindatenbank (PIR Relase 6.0; November 1985) gespeichert sind, ergab keine signifikante Ähnlichkeit hinsichtlich der Sequenz mit irgendeiner anderen Sequenz. «

Das durch den L20-Antikörper erkannte Antigen ist ein Glycoproteinantigen mit einem Molekulargewicht von etwa 110 000 Dalton.

Nachstehend ist die in vitro immunohistologische Anwendung beschrieben.

Die einen nicht-markierten Antikörper verwer. tende Technik von Sternberger (1979 in Immunoohemistry, John Wiley & Sons, New York, S. 104-169, modifiziert durch Garrigues et al., 1982, Int. J. Cancer 2^: 511) wurde für die immunohistologischen Untersuchungen an gefrorenen Schnitten eingesetzt. Die Target-Gewebe für diese Tests '/urden durch chirurgische Eingriffe erhalten und innerhalb von 4 h nach der Entnahme in Isopentan, das in flüssigem Stickstoff vorgekühlt ist, eingefroren. Die Gewebe wurden dann in flüssigem Stickstoff oder bei mindestens 70⁰C bis zur Verwendung gelagert. Kaninchen-Anti-Maus IgG (rabbit anti-mouse IgG; Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) wurde in einer Verdünnung von 1/50 eingesetzt. Maus-Peroxidase-Antiperoxidase-Komplexe (PAP, Sterngerger-Meyer Immunochemicals, Inc.) mit einem Gehalt von 2 mg/ml an spezifisch gereinigtem PAP wurde in einer Verdünnung von 1/80 zur Anwendung gebracht. Es wurden gefrorene Schnitte hergestellt, getrocknet, mit Aceton behandelt und getrocknet (Gar_iyues et al., s. oben). Die für die histologische Be-Wertung verwendeten Schnitte wurden mit Hematoxylin ange-

färbt. Um den nicht-spezifischen Untergrund "zu vermindern", wurden die Schnitte mit 1/5 verdünntem normalen Humanserum präinkubiert (Garrigues et al., s. oben). Antikörper von der Maus, '.nti-Maus-IgG von der Ziege und PAP von der Maus wurden in einer Lösung von 10% normalem Humanserum und 3% Kaninchenserum verdünnt.

Zum Anfärben wurden Serienschnitte entweder mit spezifischem Antikörper oder Kontrollantikörper 2,5 h behandelt, 30 min mit Kaninchen-Anti-Maus-IgG (verdünnt 1/50) inkubiert und 30 min einem Maus-PAP-Komplex (verdünnt 1/80) ausgesetzt. Nach jeder Behandlung mit dem Antikörper wurden die Objektträger zweimal in PBS gewaschen. Die inununohistochemische Reaktion wurde entwickelt mit frisch hergestelltem 0,5%igem 3,3'-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (Sigma, St.Louis, MO) und 0,01% H O₂ in 0,05 M Tr.'.s-Puffer, pH 7,6, während 8 min. Die Anfärbung konnte intensiviert werden, indem man die Schnitte 20 min einer 1%igen OsO.-Lösung in destilliertem Wasser aussetzte. Die Schnitte wurden mit Wasser gespült.

in Alkohol vom Wasser befreit, in Xylol geklärt und auf Objektträgern befestigt.

Die Objektträger wurden jeweils mit Hilfe eines Kodes bewertet. Die kodierten Proben wurden durch eine unabhängige Person überprüft. Typische Objektträger wurden photographiert, wobei die differentielle Interferenz-Kontrast-Optik (Zeiss-Nomarski) eingesetzt wurde. Das Ausmaß der Antikörperanfärbung wurde wie folgt bewertet: 0 bedeutet keine Reaktivität;

+ bedeutet wenige schwach positive Zellen; ++ bedeutet,daß mindestens 1/3 der Zellen positiv sind; +++ bedeutet, daß die moisten Zellen positiv sind; +*++ bedeutet, daß etwa alle Zellen stark positiv sind. Da die Unterschiede der Verfärbungen, die mit + und 0 bewertet wurden, wesentlich weniger au* »prägt sind, als die,

31

die mit + und ++ bewertet wurden, wurde eine mit ++ oder mehr bewertete Anfärbung als positiv angesehen. Sowohl neoplastische als auch Stromazellen wurden in Tumcrproben untersucht. Die aufgeführte Anfärbung ist diejenige von Tumorzellen, da die Stromazellen überhaupt nicht oder wesentlich schwächer als die Tumorzellen gefärbt waren.

32 TABELLE II

Immunoperoxidase-Anfärbung von Tumoren und normalen Gewebeproben mit L20-moiioklonalem Antikörper

Gewebetyp

Zahl der positiven Proben/ Zahl der getesteten Proben*

Lungenkarzinom: Adenokarzinom epidermoid bronchial kleinzellig	18/20 3/3 0/1 4/4
Lungenkarzincm: Zellinien	3/3
Brustkarzinom	4/7
Colonkarzinom	5/8
Melanom	5/8
renales Karzinom	1/1
Liposarcom	0/1
normale Lunge	schwache Anfärbung von eine der drei getesteten Proben
normale Milz	negativ
normale Brust	negativ
normales Colon	negativ
normale Niere	negative
normale Leber	negativ
normales Hirn	negativ
normales Herz	negativ
normale Haut	negativ
normale Schilddrüse	negativ
normaler Hoden	negativ
normale Vagina	negativ
normaleis Lymphozytpellet	negativ

*Bei allen untersuchten Proben handelte es sich um Gefrierschnitte von Geweben, die durch chirurgischen Eingriff erhalten wurden. Die eingesetzten immunohistologischen Verfahren sind im Text näher beschrieben. Eine mit 2+ bewertete Anfärbung (zeigt an, daß mindestens ein Drittel der Zellen positiv sind) wurde als positiv betrachtet.

33

Eine hier beschriebene Zellinie, L20, wurde bei der American Type Tissue Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und hat die ATCC Nr. HB8913 erhalten. Die hier beschriebene und beanspruchte Erfindung ist hinsichtlich ihres Umfangs nicht auf die hinterlegte Zellinie beschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform nur eine einzelne Illustration eines Aspekts der Erfindung

darstellt und jede äquivalente Zellinie, die einen funktionell äquivalenten monoklonalen Antikörper produziert, erfindungsgeriäß umfaßt ist. Insbesondere dienen die hier beschriebenen Ausführungsformen nur zur beispielhaften Erläuterung.

Claims

266 it M/27 ERFINDUNGSANSPRUCH

1. Verfahren zur Herstellung eines raonoklonaler Antikörpers, der an eine Determinante auf einem Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen von menschlichen nicht-kleinze¹ligen Lungenkarzinomzellen, menschlichen Brustkarzi:»omzellen, * menschlichen kleinzelligen Lungenkarzinomzellen oder menschlichen Colonkarzinomzellen bindet, gekennzeichnet dadurch , daß man

a) ein Hybridom mit den identifizierenden Charakter istika von ATCC Nr. HB8913, das curch Verschmelzen

(i) einer Anti'.iörper-produzierenden Zelle, die aus

der Milz eines Tieres stammt, das mit pleuralen 16

Ergüssen, kultivierten Zellen oder Lungengewebe eines latienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom immunisiert worden war, mit

(ii) einer Myelomzelle

erhalten worden ist, vermehrt unddie durch das Hybridom produzierten monoXlonalen Antikörper gewinnt, oder

b) ein Hybridom vermehrt, das durch Verschmelzen 26

(i) einer transformierten B-Zellinie, die durch

Imnortalisieren einer Antikörper-produzierenden Zelle erhalten wurde, welche aus einem Patienten

mit einem nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom ge-30

wonnen wurde, mit

(ii) einer Myleomzelle gewonnen wurde

und die durch das Hybridom produzierten monoklonalen Antikörper gewinnt, oder

is

c) eine transformierte B-Zellinie vermehrt, die durch Imraortalisieren einer Antikörper-produzierenden Zelle erhalten wurde, welche aus einem Patienten mit einem nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom gewonnen wurde, und die durch die transformierte B-Zellinie produzierten Antikörper gewinnt.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet

dadurch , daß man das Hybridom gemäß Anspruch I

in vivo vermehrt.

3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch , daß man das Hybridom vermehrt, indem

C man es einer pristan-primiertdi BALE/c-Maus injiziert und einen Aszitestumor wachsen läßt, und daß man die in die Aszitcssekretierten monoklonalen Antikörper durch Adsorption an Protein Λ-Sepharose oder Gelfiltration reinigt.

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet

dadurch , daß man einen monoklonalen Antikörper herstellt, der an eine Determinante auf einem Zelloberflächen-Glycoprotein-Antigen von menschlichen nichtkleinzelligen Lungenkarzinomzellen bindet, wobei das Antigen ein durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestimmtes Molekulargewicht von 110 000 Dalton und folgende aminoterminale Aminosäuresequenz:

15 10 "5 20

L-X-V-Q-V-P-E-X-P-V-V-A-L-V-C-T-D-A-X-L

besitzt, worin X eine unidentifi2ierte Aminosäure bedeutet .

5. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet

dadurch , daß das eingesetzte Hybridom eine Hvbridomzellinie L20, ATCC Nr. HB 8913, aufweist.

6. Verfahren nach Punkt A oder 5, gekennzeichnet dadurch , daß man einen monoklonalen Antikörper herstellt, der zur Klasse IgG gehört.

7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet

dadurch , daß man einen monoklonalen Antikörper

produziert, der zur Unterklasse IgGl gehört.

8· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch , daß man die Immortalisierung durch EBV-Infektion vollzieht.

9. Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet jg dadurch, daß man die Hybridomzellinie L20, ATCC Ht. HB 8913, vermehrt, die durch Verschmelzen

(i) einer Antikörper-produzierenden Zelle, die ausder Milz einer BALB/c-Maus stammte, die mit menschlichen Zellen vom Lungenkarzinom 3082

immunisiert worden waren, mit

(ii) einer NSl-Maus - Myelomzelleerhalten wurde , und die durch das Hybridom produzierten monoklonalen Antikörper gewinnt.