WO2020221466A1 - Biologische bindemoleküle - Google Patents

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WO2020221466A1
WO2020221466A1 PCT/EP2019/061308 EP2019061308W WO2020221466A1 WO 2020221466 A1 WO2020221466 A1 WO 2020221466A1 EP 2019061308 W EP2019061308 W EP 2019061308W WO 2020221466 A1 WO2020221466 A1 WO 2020221466A1
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cells
bcr
antibody
antibodies
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PCT/EP2019/061308
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Holger Klapproth
Marc A. Kessemeier
Ulrich Birsner
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Ava Lifescience Gmbh
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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    • C07K16/3061—Blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Definitions

  • the present invention relates to the field of the production, identification and selection of antibodies or fragments thereof, as well as their use in the context of the prophylaxis and therapy of cancer diseases such as in particular malignant B-cell neoplasms, and the accompanying diagnosis.
  • Malignant B-cell neoplasms are generally used to describe malignant diseases of the blood-forming or lymphatic system. They include clinical pictures such as leukemia and, in a broader sense, are cancer diseases.
  • Leukemias are characterized by a greatly increased formation of non-functional precursor cells of the white blood cells, which are also called leukemia cells. These cells spread in the bone marrow, displace the usual blood formation there and, as a rule, also accumulate in the peripheral blood. They can infiltrate the liver, spleen, lymph nodes and other organs and thereby impair their function.
  • the disruption of blood formation leads to a reduction in the normal blood components, which can lead to anemia due to a lack of oxygen-carrying red blood cells, a lack of blood platelets that stop bleeding, and a lack of mature, functional white blood cells.
  • Acute leukemias are life-threatening diseases which, if left untreated, can lead to death within a few weeks to months.
  • Chronic leukemia usually lasts for several years and is often asymptomatic in the early stages.
  • the main types of leukemia are:
  • AML Acute myeloid leukemia
  • CML chronic myeloid leukemia
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • Leukemia is usually treated with chemotherapy.
  • Newer forms of therapy increasingly rely on the use of monoclonal antibodies such as GA101 (obinutuzumab), which acts as a CD20 antibody similar to rituximab and ofatumumab and is used to treat chronic lymphocytic leukemia (CLL).
  • GA101 bisnutuzumab
  • CD20 antibody similar to rituximab and ofatumumab and is used to treat chronic lymphocytic leukemia (CLL).
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • malignant diseases of the hematopoietic or lymphatic system concern lymphomas, such as the Hodgkin lymphoma and the B-cell variants of the non-Hodgkin lymphoma.
  • antibodies are generated against receptors
  • animals are usually immunized with the receptor (purified, cloned, or as peptide fragments) and hybridoma cells are generated. These hybridoma cells produce antibodies, which are then tested by ELISA or by means of expressed receptors in cell systems. Conventionally established cell lines are used for this purpose, since only these can easily be cultivated.
  • Antibodies can be generated that bind relatively specifically to a certain type of receptor (e.g. anti-IgGl, anti-IgE). However, this often leads to cross-reactions with other receptors or other epitopes.
  • BCR antibodies For diagnostic or therapeutic use of BCR antibodies, it is usually not sufficient to use only one antibody against the BCR in general, since such broad-spectrum use can lead to false positive results or cause considerable side effects. Rather, it would be desirable to provide an antibody that selectively binds to a receptor that has a light chain with the epitope VL3-21 according to SEQ ID NO. 18 has. This light chain epitope is overrepresented in neoplastic B cells. Such a Antibodies are not known in the prior art and there is no method of producing or obtaining them by selection.
  • the object of the present invention is therefore to provide alternative concepts and active ingredients such as in particular alternative antibodies for diagnostic, prophylactic and / or therapeutic use, with which the existing problems of the prior art are overcome.
  • the present invention should also be suitable for detecting the presence of suitable surface structures for therapeutic use of the antibody (“companion diagnostics”).
  • neoplasia used here generally denotes a new formation of body tissue if it is a pathological or malignant manifestation, one speaks of a malignant neoplasm.
  • a malignant B-cell neoplasm is therefore a malignant and uncontrolled formation of new tissue from B-cells, whereby this terminology applies equally to all B-cell-associated cancers such as leukemia and B-cell lymphomas.
  • An "area for killing neoplasms" can kill neoplasms either as a result of a direct or indirect effect.
  • a molecule is attached to the antibody or to a functional fragment of this antibody or of another comprising this antibody or its fragment biological binding molecule bound so as to exert an effect beyond the effect of binding the antibody or its fragment.
  • a molecule can for example be selected from the group consisting of an immunotoxin, a cytokine, a chelator, a radioisotope, and combinations thereof .
  • biological binding molecules are understood to mean, for example, but not exclusively, antibodies including fusion proteins.
  • an antibody is selected from the group consisting of an IgG antibody, an IgM antibody, a humanized IgG antibody, and a human Antibody into which the recognition sequence of the epitope is inserted.
  • Such a binding molecule can also be provided in the form of a functional fragment of the entire antibody, for example a Fab fragment.
  • a binding molecule can also comprise further regions which, for example, are used to kill / die off neoplasms lead and accordingly have the functionality of an immunotoxin and / or immunocytokine.
  • such a binding molecule can also be membrane or cell-based.
  • Such a membrane-related form of the binding molecule is, for example Chimeric antigen receptor on CAR-T cells.
  • a binding molecule can also comprise further areas or additional entities, the use of which is advantageous in the context of diagnostic applications. Using flow cytometry, these can be fluorescent dyes (e.g. FITC, R-phycoerythrin (R-PE), allophycocyanin (APC)) or also biotin and other substances known to the person skilled in the art. Furthermore, a binding molecule can also be used together with substrate-converting enzymes (e.g. HRP) in the context of immunohistochemical processes. Furthermore, fusion proteins can also be provided for diagnostic purposes in which fluorescent proteins such as e.g. the green fluorescent protein (GFP) are coupled to the FC part of the antibody.
  • fluorescent proteins e.g. the red fluorescent protein (GFP) are coupled to the FC part of the antibody.
  • BCR B-cell receptor complex
  • B-cell development the formation of a functioning B-cell receptor (the membrane-bound form of the 'antibody') is of crucial importance. Only with this antigen receptor are mature B cells later able to recognize foreign antigens and to bind them to hostile structures through the formation of appropriate antibodies.
  • the antigen specificity of the receptor is determined by linking certain gene segments. The segments are called V, D, and J segments, which is why the process is called V (D) J recombination.
  • the entire receptor consists of two identical light protein chains and two identical heavy protein chains, with the heavy and light chains being linked to one another via disulfide bridges.
  • the light chains each consist of a variable and a constant domain, with the variable area determining the antigen recognition, while the constant area defines the five immunoglobulin classes and is responsible for membrane anchoring in the case of the T cell receptor.
  • the light chain is built up by somatic recombination from a pool of V and J genes and the constant chain lambda or kappa.
  • the heavy chain consists of three components that make up the variable part (V, D, J). While research has so far mainly focused on the heavy chain and has been very well investigated, little attention has been paid to the light chain. Two gene loci are known from the light chain, namely one locus for kappa with 40 V gene segments and one locus for lambda with 30 V gene segments.
  • V chain VL3-21 occurs in three variants, these variants differing from one another by a maximum of two amino acids and can be used with the same effect with regard to the present invention.
  • D, J are available in several copies before the rearrangement, which can be combined with one another as required in the manner of a combination lock during the maturation of the lymphocytes.
  • VDJ recombination first the V, D and J segments of the heavy chain of the B cell receptor are linked, then the V and J segments of the light receptor chain. Only when the genes are successfully rearranged, which is known as productive gene rearrangement, the cell can move on to the next development step.
  • an “autonomously active” or “autonomously activated” BCR is a special type of permanently active BCR. While the conventional activation proceeds from an external antigen (see above), the autonomously active BCR results from its interaction with membrane structures on the surface of the same cell. For the clinical picture of CLL, an interaction that triggers autonomous activation was shown between BCRs that were located adjacent to one another on the surface of the same cell (M. Dmixen-von Minden et. Al; Nature 2012). Another example of an autonomously active BCR is the pre-BCR, which is expressed as a development check in the course of the development of a B cell. In addition to the interaction between neighboring receptors (BCR: BCR), an interaction between receptor and a membrane protein (BCR: membrane protein) can also lead to an autonomously active or activated BCR.
  • BCR neighboring receptors
  • BCR membrane protein
  • the inventive solution to these problems is based on the surprising finding that there are B-cell receptors on tumor cells from patents with CLL that are autonomously active or autonomously activated, and that these autonomously active or activated receptors by the presence of common epitopes in corresponding Receptors from healthy cells from the same patient cannot be detected are labeled. Due to the presence of autonomously active B-cell receptors, which are characterized by the occurrence of the above-mentioned epitopes, these cells can therefore be specifically recognized and treated by an antibody, so that healthy B-cells without this characteristic are not affected. whereby the treatment can be carried out much more specifically and with fewer undesirable side effects.
  • biological binding molecules in the form of antibodies or functional fragments of the same and a method for the production (identification and selection) of such binding molecules are provided which are selectively attached to B cells with B cell receptors with the epitope VL3-21 and mostly also to the bind modified epitopes of autonomously active membrane-bound immunoglobulins of B-cell neoplasias.
  • diagnostic methods using such binding molecules are proposed, the therapeutic application relating to the inhibition of the growth or the killing of cells which express such membrane-bound immunoglobulins of this type. Diagnostic methods relate primarily to the in vitro detection of this receptor subtype, which is characterized by the presence of VL3-21 on the light chain of BCRs on B cells, especially in the frame a therapy decision to use the proposed antibody ("companion diagnostics").
  • Plant toxins such as the ricin A chain and bacterial toxins such as Pseudomonas exotoxin A (PE) have been generated (Uckun et al., (1992), Blood 79, 2201-2214; Ghetie et al.,
  • each individual B-cell precursor generates its own and almost unique B-cell receptor (BCR) through the rearrangement of individual gene segments.
  • BCR B-cell receptor
  • subset 2 Two variants (subset 2; subset 4) of the autonomously active BCR are known, which differ from one another in terms of their characterizing molecular motif (epitope) (Minici, C. et al., Distinct homotypic B-cell receptor interactions shape the outcome of chronic lymphocytic leukaemia, Nature Comm. (2017)). Both variants have different short amino acid sequences for this Variants are each specific. It is known to the person skilled in the art that, in addition to the subsets listed, other CLL B cell receptors are also autonomously active. The area of subset 2 that is decisive for the autonomously active functionality of the receptor is characterized by the amino acid sequences KLTVLRQPKA (SEQ ID NO. 1) and VAPGKTAR (SEQ ID NO.
  • subset 4 is defined by the amino acid sequences PTIRRYYYYG (SEQ ID NO. 3) and NHKPSNTKV (SEQ ID NO. 4) of the variable part of the heavy chain.
  • the sequences for subsets 2 and 4 used to generate the murine antibodies as part of the immunization are shown in SEQ ID NOS. 5 and 6 (vHC; LC) or 7 and 8 (vHC; LC).
  • SEQ ID NO. 17 (VSSASTKG) a further target sequence or a further epitope with specificity for the variable part of the heavy chain of a BCR of subset 4 is given.
  • target sequences responsible for the development of the autonomously active state of the BCR (subset 4) according to SEQ ID NOS. 3 and 4 represents the sequence according to SEQ ID NO. 17 thus represents a further characteristic for this subset.
  • subsets 2 and 4 as two variants of the B cell receptor in patients with critical disease progression is based on the examination of numerous individual case studies and therefore does not mean that the same are not present in a possible large number of other subtypes of the BCR target sequences (epitopes) characterizing the two known subtypes are present and correlate with a severe course of the disease.
  • the methods used up to this point included not only standard methods such as ELISA and SPR, but also intracellular expression in fibroblasts with intracellular FACS staining as a binding control.
  • binding molecules suitable according to the invention can neither be carried out with free receptors or their fragments nor with membrane-bound or intracellular receptor fragments. Instead it was observed that the selection was only successful using a cell system in which the complete and functional B-cell receptor was presented in the membrane. It is of great importance that the BCR with its modified areas (epitopes) is autonomously active in or on these cells.
  • BCRs B cells that express a BCR with an epitope on their cell membrane, which is characteristic of subset 2 or subset 4 of this cell type, but not to other B cells or their receptors (BCRs), which by definition are not B cells of subset 2 or 4.
  • these binding molecules bind selectively to autonomously active or autonomously activated B-cell receptors, which are characterized by the presence of structural domains or epitopes (target sequences) and are the cause of the autonomously active or activated state of the B-cell receptors.
  • the deletions (knockouts) set out below prevent recombination or the use of surrogates from being easy Chain ("surrogate light chain”) a change in the desired BCR takes place.
  • surrogate light chain By using these cells or this cell type of arrested pro- / pre-B cells for expression and presentation of BCRs in the context of a selection of antibodies with selectively specific binding behavior towards autonomous active or activated B-cell receptors, a selection platform is provided which, compared to the systems conventionally used for selection in the prior art, is characterized by a much higher quality, which reduces the effort involved in using primary TKO cells or their cultivation justified over a few passages.
  • the antibodies suitable for diagnostic, prophylactic and / or therapeutic purposes could be obtained in larger quantities in the form of monoclonal antibodies.
  • the binding site of the antibody could be determined by sequencing the DNA of these cells (cf. SEQ ID NOS. 9 and 10). Corresponding processes are known to the person skilled in the art and are also commercially available. It is advantageous here if a larger number of hybridoma cells is obtained and those with the best binding activity (specificity and binding strength / affinity) are selected.
  • the genetic information thus obtained about the binding site was used to insert the coding sequence into an expression plasmid with the DNA of a human antibody sequence in order to generate a humanized monoclonal antibody with the desired specificity in the usual way of recombination. Due to their unique specificity, these humanized antibodies showed a better diagnostic specificity or prophylactic and therapeutic effectiveness with comparatively very few side effects compared with conventional diagnostic agents and active substances. It is clear to the person skilled in the art that these humanized antibodies can be biotechnologically developed in large quantities Have quantities produced.
  • Standardized methods can be used to purify the synthesized antibodies, such as combinations of precipitation, filtration and chromatography, which is well known to the person skilled in the art, whereby it should be ensured that the antibodies are not denatured and possible foreign substances such as proteins, pyrogens and toxins are added quantitatively remove.
  • the desired antibodies are preferably expressed in systems in which the antibody undergoes glycosylation such as, in particular, human glycosylation.
  • glycosylation such as, in particular, human glycosylation.
  • Such systems are well known to the person skilled in the art and include the use of insect cells (S2 cells), mammalian cells (CHO cells) and, particularly preferably, human cells such as, for example, cells of the type HEK293T.
  • the sufficiently purified antibody can be therapeutically effective in and of itself, provided that it has an isotype that elicits a specific immune response, e.g. an IgG subtype that leads to an immune response against the tumor via Fc receptors.
  • the antibody can also be present as a fragment. It is important that the antigen binding site is present in the fragment, i.e. that it is a functional fragment. Such fragments can e.g. by protease treatment as F (ab) fragments. Since these fragments are truncated in the constant part of the antibody, it is advantageous and therefore preferred here to insert an effector molecule for killing neoplasms.
  • the antibody is provided with a conjugate in order to increase its effect.
  • This conjugate is an area for killing neoplasms and can kill such neoplasms either as a direct or indirect effect.
  • An example of such a conjugate is the attachment of ricin to the antibody, whereby whose preferably covalent attachment is carried out, for example, by using chemical crosslinkers.
  • Such molecules and methods are extensively described in the book Bioconjugate Techniques by Greg T. Hermanson in Chapter 11 Immunotoxin Conjugation Techniques.
  • the antibody can also be used in modified form, e.g. present as a biological binding molecule in the form of a fusion protein with T-cell-specific activation domains.
  • modified form e.g. present as a biological binding molecule in the form of a fusion protein with T-cell-specific activation domains.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • T cells are first obtained from the patient's peripheral blood and genetically modified in vitro in such a way that they express the CAR on their cell surface. These modified T cells are then reintroduced into the patient, which means that CAR-T cell immunotherapy can be carried out (see e.g. N Engl J Med. 2014 Oct 16; 371 (16): 1507-17. Doi: 10.1056 / NEJMoal407222 ).
  • the antibody is preferably used in a composition which has a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier is one that is physiologically acceptable to a patient being treated and that retains the therapeutic properties of the compound with which it is administered.
  • An exemplary pharmaceutically acceptable carrier is physiological saline.
  • Other suitable physiologically acceptable carriers and their formulations are known to those skilled in the art and are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Edition), Ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA).
  • Another therapeutic application of the binding molecules according to the invention is the known method of apharesis, in which the blood is treated or a blood sample is taken from a patient outside his body in the sense of a "blood wash”.
  • the antibody according to the invention can be used in an apharesis system for the separation of leukemia cells from a blood sample of a patient.
  • various methods are suitable for this, as is known to the person skilled in the art.
  • the antibodies can be bound to magnetizable particles (beads) (e.g. Dynabeads).
  • the blood is provided with an anticoagulant and brought into contact with the particles outside the patient's body.
  • at least one particle, preferably 10 to 100 particles, is used per tumor cell.
  • a particle with a size of, for example, less than 20 ⁇ m typically contains several antibodies of the same specificity (number of particles greater than 5000 / ml blood). With the help of magnets, these particles can then be bound before the cleaned, remaining blood is returned to the patient. This therapeutic measure significantly reduces the number of tumor cells in the patient's blood.
  • the particles have sizes of more than 20 ⁇ m and likewise have a large number of antibodies per particle (> 100,> 1000). So many lymphocytes (tumor cells) can be bound and removed with one particle. These particle / cell conjugates are removed by conventional centrifugation, as is commonly used in apharesis. The times required for this depend on the type of particle and the apparatus and must be determined experimentally.
  • both the particle / cell conjugates (especially when using large particles over 20 ⁇ m in diameter) and free particles without cell binding can be separated from blood with the aid of a fine network will.
  • Such networks are commercially available, for example, as so-called “cell trainers”. Methods for conjugating the antibodies to the particles are well known to those skilled in the art. Process instructions are made available to their customers, for example by the Dynal company.
  • the antibody is preferably used in standardized procedures such as flow cytometry or immunohistochemistry.
  • the antibodies, biological binding molecules or functional fragments thereof proposed for diagnostic purposes preferably have a murine basic structure.
  • a detection in the flow cytometer takes place preferably by means of secondary antibodies, or alternatively preferably by means of fluorescent dyes bound directly to the antibodies, biological binding molecules or functional fragments thereof.
  • a stabilizing salt buffer e.g. be phosphate buffered saline (PBS) as known to those skilled in the art.
  • PBS phosphate buffered saline
  • a suitable form of drying is e.g. Freeze drying or lyophilizing.
  • the production and identification of antibodies that selectively bind to the modified B-cell receptors has been characterized by major and unforeseen problems.
  • the hybridomas were generated using standard methods.
  • the Supernatant from the hybridoma groups was pooled and examined for positive binding events by ELISA (soluble B-cell receptors on the ELISA plate). Positive pools were isolated and the individual clones tested. Surprisingly, no more positive clones were identified in the ELISA. In retrospect, the positive ELISA signals from the pools turned out to be unspecific bindings.
  • the light chain of the BCR has now been expressed in fibroblasts. This should ensure the correct folding of the protein that carries the motif (epitope) responsible for the autonomous signal. Intracellular FACS analyzes were carried out with these cells. No positive clone (antibody) could be identified.
  • RAMOS cells human Burkitt lymphoma cell line
  • CRISPR CRISPR
  • CLL receptor molecular biology
  • the knockout of RAG2 or RAG1 and Lambda5 is sufficient for the expression of the BCR and selection of the appropriate antibody.
  • the activity of the BCR can be measured.
  • the method of choice here is to measure the Ca-flux after induction of the SLP65 by means of FACS analysis and the use of a Ca 2+ dependent dye such as Indo-1.
  • the first two knockouts ensured that only the "BCR of Interest" was expressed on the surface.
  • the function of the expressed BCRs and thus the autonomously active state can also be characterized the BCRs on the surface are verified prior to selection.
  • the expression of the BCR was determined by means of anti-IgM and anti-LC antibodies on the FACS. For this purpose, some cells were removed and each stained with 5 ml of antibody in a total volume of 100 ml in PBS.
  • FACS has now succeeded in identifying an antibody that specifically binds to the modified area that is responsible for and characterizes the autonomous activation of the BCR. And this although binding to the same type of receptor in RAMOS cells was not successful!
  • TKO cells TKOs
  • the selection matrix shown in FIG. 1 is an example of the selection of a CLL subset 2 BCRs and was used to identify and select positive clones.
  • the supernatants of the hybridomas were pooled and measured. The groups that showed binding were isolated and the supernatants of the respective hybridomas tested for binding.
  • the variant VL3-21 described in the present case is expressed in “healthy”, ie non-tumor-like B cells by less than 5% of the cells.
  • This results in the therapeutic one Possibility of priority control of neoplastic B cells (tumor cells) with a much lower impairment of healthy, non-tumor-like B cells compared to the conventional use of non-specific antibodies against the BCR.
  • the antibody proposed according to the invention or a functional Fragment of the same with specificity for VL3-21 a much more specific and less for the patient stressful therapy can be carried out.
  • the antibody against VL3-21 can be used for so-called companion diagnostics in CLL patients, for example. As part of this diagnosis, it is proven that the target structure VL3-21 of the therapeutic antibody is present on the tumor cells and justifies a corresponding treatment with good prospects of success.
  • mice which have a respective knockout for the genes Lambda5, RAG2 and SLP65 (Dlicken von Minden et al., 2012, Nature 489, p309-313).
  • the creation of such mice is known to the person skilled in the art and belongs to the state of the art.
  • the cells obtained in this way were then cultured under conditions that favor the survival of pro- / pre-B cells (37 ° C, 7.5% CO 2, Iscove's medium, 10% FCS, P / S, murine IL7) .
  • a FACS sorting was carried out as a control, the pro- / pre-B cells were sorted and then put back into culture.
  • the markers used for this are known to the person skilled in the art.
  • the corresponding sequences coding for the heavy (HC) and light (LC) chains were synthesized and then each cloned into expression vectors containing a CMV promoter. These were introduced into the packaging cell line (Phoenix cell line) by means of lipofection. After a 36 hour incubation, the virus supernatant was removed and used for a spinfection of TKO cells. Both the work to obtain the supernatants and the spin infection of the TKO are widely known methods and known to those skilled in the art.
  • subset-2 B-cell receptors The structural peculiarities of subset-2 B-cell receptors were taken from the relevant literature (see above). Exemplary CLL subset 2 VH and complete LC DNA segments were synthesized by a contract manufacturer using a standard method. These were then fused with a murine IgG1 constant segment by means of PCR and cloned into a CMV vector. The sequence of the finished vector was confirmed by Sanger sequencing.
  • a human cellular expression system based on HEK293T cells was used for the expression of the CLL subset 2 IgG1.
  • a polyethyleneimine (PEI) based protocol was used for transfection. After several passages, the supernatant was pooled and the medium contained in the pooled cell supernatant was purified using protein G columns. The purity and quality of the soluble subset-2 IgGl was determined by Western blot.
  • This selection procedure is illustrated schematically in FIG. 1 using the example of the CLL subset 2 BCRs, the designation 'TKO' referring to TKO cells (see above).
  • the mRNA was isolated from the individual hybridoma clones, cDNA was generated from it and this was amplified by means of anchor PCR (rapid expression cloning of human immunoglobulin Fab fragments for the analysis of antigen specificity of B cell lymphomas and anti-idiotype lymphoma vaccination; Osterroth F, Alkan 0, Mackensen A, Lindemann A, Fisch P, Skerra A, Veelken H., J Immunol Methods 1999 Oct 29; 229 (1-2): 141-53).
  • anchor PCR rapid expression cloning of human immunoglobulin Fab fragments for the analysis of antigen specificity of B cell lymphomas and anti-idiotype lymphoma vaccination; Osterroth F, Alkan 0, Mackensen A, Lindemann A, Fisch P, Skerra A, Veelken H., J Immunol Methods 1999 Oct 29; 229 (1-2): 141-53).
  • CDRs areas important for binding
  • these were transferred to human antibody scaffold by means of PCR.
  • the VH sequence was generated in silico from the human FR regions and the murine CDR regions and then synthesized as DNA fragments. These were then fused with a human IgG1 by means of PCR and cloned into a vector suitable for expression.
  • the partial sequences of the heavy chain corresponding to CDR1, CDR2 and CDR3 according to SEQ ID NO. 9 are in SEQ ID NOS. 11 to 13 indicated, while the partial sequences of the light chain corresponding to CDR1, CDR2 and CDR3 according to SEQ ID NO. 10 in SEQ ID NOS. 14 to 16 are shown.
  • Exemplary CLL subset 4 VH and complete LC DNA segments were synthesized by a contract manufacturer using a standard method. These were then fused with a murine IgG1 constant segment by means of PCR and cloned into a CMV vector. The sequence of the finished vector was confirmed by Sanger sequencing.
  • the areas marked in bold denote the target sequences (epitopes) of the variable part of the heavy chain of the BCR of subset 4, which are responsible for its autonomously active state (cf. SEQ ID NOS. 3 and 4).
  • the partial sequences of the heavy chain corresponding to CDR1, CDR2 and CDR3 according to SEQ ID NO. 25 are in SEQ ID NOS. 19 to 21, while the partial sequences of the light chain corresponding to CDR1, CDR2 and CDR3 according to SEQ ID NO. 26 in SEQ ID NOS. 22 to 24 are shown.
  • peripheral blood was drawn from a patient.
  • 100 ml of blood were transferred to a reaction vessel and topped up with 2 ml of PBS-BSA buffer solution.
  • the sample was then centrifuged in an Eppendorf centrifuge 5804 at 1500 rpm for a period of five minutes. The supernatant was discarded and the sediment mixed well.
  • the antibody was then added.
  • the following surface parameters were stained against: 1) CD19-FITC, 2) CD5-PE, and 3) the VL3-21 specific antibody (APC), before the mixtures were incubated for 15 minutes at room temperature in the dark. Lysis was then initiated and the erythrocytes were lysed.
  • washing was carried out twice with PBS-BSA buffer solution, and the cells were taken up and resuspended in 500 ml 0.1% PBS-BSA buffer solution. The cells were stored in the dark at 2-8 ° C. until the measurement on the flow cytometer.
  • the analysis at the FACS was carried out on a BDCalibur.
  • the individual laser and detection parameters were set according to the instructions of the device manufacturer and are well known to those skilled in the art.
  • the raw data from the analysis were then evaluated using FlowJo analysis software.
  • Figure 2 shows such an analysis using the example of the use of the VL3-21-specific antibody.
  • the CD19 positive B cells for the further analysis selected (left panel). These were then examined for the binding of the specific antibody (right panel)
  • the antibody according to the invention with specificity for a BCR with VL3-21 was used in an apharesis system for the separation of leukemia cells from a blood sample of a patient.
  • Peripheral blood was drawn from a patient (EDTA blood from blood collection tubes). The lymphocyte count was determined using a cell counter and resulted in 80,000 lymphocytes / m2. To determine the "tumor load", ie the exposure of the sample with tumor cell material, immunophenotyping was carried out by FACS (with the CLL standard panel WHO tumor load). Secondly, those cells which carry the CLL epitope were treated with the antibody according to the invention stained to show that the cells are positive for this epitope. 500 ml of this blood was then mixed with 5 x 108 MACS MicroBeads (Miltenyi Biotech) conjugated with the specific antibody and the mixture was shaken for 5 minutes at room temperature before the blood was processed using Miltenyi LS columns.
  • lymphocytes conjugated with the particles remained on the column so that lymphocytes were largely removed from the column as a flow-through.
  • a FACS measurement showed a lymphocyte count of less than 5000 lymphocytes / m n.
  • this purification did not, as expected, result in a significant reduction in the B cells in the blood.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Herstellung, Identifizierung und Selektion von biologischen Bindemolekülen wie Antikörpern oder Fragmenten derselben, sowie deren Verwendung im Rahmen der Diagnose und Therapie von Krebserkrankungen wie insbesondere malignen B-Zell Neoplasien. Die Bindemoleküle sind in der Lage, selektiv an B-Zell Rezeptoren zu binden, die eine leichte Kette gemäß SEQ ID NO. 18 aufweisen.

Description

Biologische Bindemoleküle
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Herstellung, Identifizierung und Selektion von Antikörpern oder Fragmenten derselben, sowie deren Verwendung im Rahmen der Prophylaxe und Therapie von Krebserkrankungen wie insbesondere malignen B-Zell Neoplasien sowie der begleitenden Diagnose.
Mit malignen B-Zell Neoplasien werden allgemein maligne Erkrankungen des blutbildenden oder des lymphatischen Systems bezeichnet. Sie umfassen Krankheitsbilder wie beispielsweise die Leukämie und zählen im weiteren Sinne zu den Krebserkrankungen. Leukämien zeichnen sich durch eine stark vermehrte Bildung von funktionsuntüchtigen Vorläuferzeilen der weißen Blutzellen aus, welche auch Leukämiezellen genannt werden. Diese Zellen breiten sich im Knochenmark aus, verdrängen dort die übliche Blutbildung und akkumulieren in der Regel auch stark vermehrt im peripheren Blut. Sie können Leber, Milz, Lymphknoten und weitere Organe infiltrieren und dadurch deren Funktion beeinträchtigen. Die Störung der Blutbildung führt zu einer Verminderung der normalen Blutbestandteile, wodurch eine Anämie durch Mangel an Sauerstoff transportierenden roten Blutkörperchen, ein Mangel an blutungs stillenden Blutplättchen, und ein Mangel an reifen funktions tüchtigen weißen Blutzellen entstehen können.
Je nach Krankheitsverlauf unterscheidet man zwischen akuter und chronischer Leukämie. Akute Leukämien sind lebensbedrohliche Erkrankungen, die unbehandelt in wenigen Wochen bis Monaten zum Tode führen. Chronische Leukämien hingegen verlaufen meist über mehrere Jahre und sind im Anfangsstadium häufig symptomarm.
Die wichtigsten Leukämieformen sind:
· akute myeloische Leukämie (AML)
• chronische myeloische Leukämie (CML)
akute lymphatische Leukämie (ALL) • chronische lymphatische Leukämie (CLL) .
Üblicherweise werden Leukämien im Rahmen einer Chemotherapie behandelt. Neuere Therapieformen setzen dabei vermehrt auf die Verwendung von monoklonalen Antikörpern wie z.B. GA101 (Obinutuzumab) , der ähnlich wie Rituximab und Ofatumumab als CD20-Antikörper wirkt und zur Behandlung der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) eingesetzt wird. Durch Verwendung dieser Antikörper kann die remissionsfreie Zeit um ca. 10 Monate verlängert werden.
Weitere maligne Erkrankungen des blutbildenden oder des lymphatischen Systems (maligne B-Zell Neoplasien) betreffen Lymphome, wie z.B. das Hodgkin Lymphom und die B-Zell Varianten der Non-Hodgkin Lymphome.
Werden Antikörper gegen Rezeptoren generiert, so werden in der Regel Tiere mit dem Rezeptor (aufgereinigt, kloniert, oder als Peptidfragmente) immunisiert und Hybridomazellen erzeugt. Diese Hybridomazellen produzieren Antikörper, die dann mittels ELISA oder mittels exprimierter Rezeptoren in Zellsystemen getestet werden. Dazu werden herkömmlich etablierte Zelllinien verwendet, da sich nur diese einfach kultivieren lassen. Dabei können Antikörper erzeugt werden, die relativ spezifisch an einen bestimmten Rezeptortyp (z.B. Anti-IgGl, Anti-IgE) binden. Hierbei kommt es jedoch häufig zu Kreuzreaktionen mit anderen Rezeptoren oder anderen Epitopen.
Für eine diagnostische oder therapeutische Anwendung von BCR- Antikörpern ist es zumeist nicht ausreichend, nur einen Antikörper gegen den BCR im allgemeinen einzusetzen, da ein solcher Breitbandeinsatz zu falsch positiven Ergebnissen führen bzw. erhebliche Nebenwirkungen auslösen kann. Vielmehr wäre es wünschenswert, einen Antikörper bereitzustellen, der selektiv an einen Rezeptor bindet, der eine leichte Kette mit dem Epitop VL3- 21 gemäß SEQ ID NO. 18 aufweist. Dieses Epitop der leichten Kette ist bei neoplastischen B-Zellen überrepräsentiert. Ein solcher Antikörper ist im Stand der Technik nicht bekannt und ein Verfahren zu dessen Herstellung oder Gewinnung durch Selektion existiert nicht.
Die Therapien des Standes der Technik zur Behandlung von Leukämien sind für den Patienten sehr belastend. Generell kann man zusammenfassen, dass die unerwünschten Nebenwirkungen der Therapie und die oftmals nicht ausreichende Wirkung der Medikamente zu einer hohen Todesrate dieser Erkrankung führen, denn es werden nicht nur Tumorzellen, sondern auch gesunde Zellen des Immunsystems geschädigt. Zudem kommt es oftmals nicht zu einer Heilung, sondern nur zur Schaffung eines gewissen Zeitraums, in welchem die Erkrankung demissionsfrei verläuft. Daher ist es wichtig für die Bestimmung und Auswahl zu behandelnder Patienten sowie für die Erstellung eines individuellen Therapieplans, diagnostische Mittel und diagnostische Verfahren unter Verwendung derselben zur Verfügung zu haben, mit denen sich bestimmte Formen maligner B- Zell Neoplasien differenziell nachweisen lassen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt daher in der Bereitstellung alternativer Konzepte und Wirkstoffe wie insbesondere alternativer Antikörper zur diagnostischen, prophylaktischen und/oder therapeutischen Verwendung, mit denen die bestehenden Probleme des Standes der Technik überwunden werden. Vorzugsweise soll die vorliegende Erfindung auch zum Nachweis des Vorliegens geeigneter Oberflächenstrukturen zur therapeutischen Anwendung des Antikörpers („Companion Diagnostik") geeignet sein.
Bevor auf die einzelnen Aspekte der vorliegenden Erfindung detailliert eingegangen wird, erfolgt eine Klärung relevanter Begriffe, die im Rahmen der vorliegenden Beschreibung verwendet werden .
Der vorliegend verwendete Begriff „Neoplasie" bezeichnet generell eine Neubildung von Körpergewebe. Handelt es sich dabei um eine krankhafte oder bösartige Erscheinungsform, spricht man von einer malignen Neoplasie. Bei einer malignen B- Zell Neoplasie handelt es sich also um eine bösartige und unkontrollierte Neugewebsbildung von B-Zellen, wobei diese Begrifflichkeit alle B-Zell assoziierten Krebserkrankungen wie z.B. Leukämien und B-Zell Lymphome gleichermaßen betrifft.
Ein „Bereich zum Abtöten von Neoplasien" kann Neoplasien entweder als Folge einer direkten oder indirekten Wirkung abtöten. Im Falle der therapeutischen Verwendung spezifischer Antikörper wird ein Molekül an den Antikörper oder an ein funktionelles Fragment dieses Antikörpers oder eines anderen, diesen Antikörper oder sein Fragment umfassendes biologisches Bindemolekül gebunden, um so eine Wirkung auszuüben, die über die Wirkung der Bindung des Antikörpers oder seines Fragments hinausgeht. Ein solches Molekül kann beispielsweise aus der Gruppe bestehend aus einem Immuntoxin, einem Zytokin, einem Chelator, einem Radioisotop, und Kombinationen davon ausgewählt sein .
Unter „biologischen Bindemolekülen" werden vorliegend beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Antikörper inklusive Fusionsproteinen verstanden. Vorteilshafterweise, und daher bevorzugt, ist ein solcher Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem IgG Antikörper, einem IgM Antikörper, einem humanisierten IgG Antikörper, und einem humanen Antikörper, in den die Erkennungssequenz des Epitops eingefügt ist. Ein derartiges Bindemolekül kann auch in Form eines funktionellen Fragments des gesamten Antikörpers bereitgestellt sein, z.B. ein Fab-Fragment . Ein Bindemolekül kann auch noch weitere Bereiche umfassen, die z.B. zum Abtöten/Absterben von Neoplasien führen und demgemäß die Funktionalität eines Immuntoxins und/oder Immunzytokins aufweisen. Insbesondere kann ein solches Bindemolekül auch membran- oder zellständig sein. Eine solche membranständige Form des Bindemoleküls ist z.B. der Chimäre Antigenrezeptor („Chimeric-Antigen Receptor") auf CAR-T Zellen .
Ferner kann ein Bindemolekül auch noch weitere Bereiche oder zusätzliche Entitäten umfassen, deren Verwendung im Rahmen diagnostischer Anwendungen vorteilhaft ist. Dies können unter Anwendung der Durchflusszytometrie Fluoreszenzfarbstoffe (z.B.-.FITC, R-Phycoerythrin (R-PE) , Allophycocyanin (APC) ) oder auch Biotin sowie andere dem Fachmann bekannte Substanzen sein. Ferner kann ein Bindemolekül im Rahmen immunhistochemischer Verfahren auch zusammen mit substratumsetzenden Enzymen (z.B. HRP) verwendet werden. Des weiteren können für diagnostische Zwecke auch Fusionsproteine bereitgestellt werden, bei denen zur Detektion Fluoreszenzproteine wie z.B. das Green- Fluoreszenz-Protein (GFP) an dem FC-Teil des Antikörpers gekoppelt vorliegen.
Die Aufgabe des B-Zell Rezeptorkomplexes (BCR) auf der Oberfläche einer B-Zelle ist es, Pathogene zu erkennen und zu binden. Diese Bindung führt zu einer Konformationsänderung des BCRs, wodurch eine Signalkaskade ausgelöst wird, die letzten Endes zu einer Aktivierung der B-Zelle führt. Der BCR wird in großer Vielfalt in reifenden B-Zellen gebildet.
Die Entwicklung der B-Zellen findet beim Menschen und auch bei einigen anderen Säugern im Knochenmark bzw. in der fetalen Leber statt. Die Signale, die für das Entwicklungsprogramm notwendig sind, erhalten die sich entwickelnden Lymphozyten von so genannten Stromazellen. Bei der B-Zell-Entwicklung ist die Bildung eines funktionierenden B-Zell Rezeptors (die membrangebundene Form des 'Antikörpers') von entscheidender Bedeutung. Nur mit diesem Antigenrezeptor sind reife B-Zellen später in der Lage, fremde Antigene zu erkennen und durch die Bildung von entsprechenden Antikörpern an feindliche Strukturen zu binden. Die Antigenspezifität des Rezeptors wird durch die Verknüpfung bestimmter Gensegmente bestimmt. Die Segmente heißen V-, D- und J-Segmente, weshalb der Prozess als V(D)J- Rekombination bezeichnet wird. Dabei werden diese Segmente, die den Antigen-bindenden Teil des B-Zell-Rezeptors bilden, umgeordnet. Der gesamte Rezeptor besteht aus zwei identischen leichten Proteinketten und zwei identischen schweren Proteinketten, wobei die schweren mit den leichten Ketten jeweils über Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind.
Die leichten Ketten bestehen aus jeweils einer variablen und einer konstanten Domäne, wobei der variable Bereich bestimmend ist für die Antigenerkennung, während der konstante Bereich die fünf Immunglobulinklassen festlegt bzw. beim T-Zell-Rezeptor für die Membranverankerung verantwortlich ist. Die leichte Kette wird durch somatische Rekombination aus einem Pool aus V und J Genen und der konstanten Kette Lambda oder Kappa aufgebaut. Bei der schweren Kette handelt es sich um drei Komponenten, die den variablen Teil aufbauen (V,D,J) . Während bisher vor allem die schwere Kette im Fokus der Forschung war und sehr gut untersucht ist, wurde bisher der leichten Kette wenig Beachtung geschenkt. Von der leichten Kette sind 2 Genloci bekannt, nämlich einen Locus für Kappa mit 40 V- Gensegmenten, sowie einen Locus für Lambda mit 30 V- Gensegmenten . Bei CLL kommen auf entsprechenden B-Zellen gewisse Kombinationen prädominant vor ( Stamatopoulus et al 2005 (BLOOD Vol 106, Nummer 10) . Bei der Analyse von B-Zellen aus CLL-Patienten zeigte sich insbesondere, dass die Zellen einer überraschend hohen Anzahl an Patienten mit autonom aktiven BCRs die V-Kette VL3-21 aufweisen. Es ist bekannt, dass die V-Kette VL3-21 in drei Varianten vorkommt, wobei diese Varianten sich durch maximal zwei Aminosäuren voneinander unterscheiden und bezüglich der vorliegenden Erfindung gleichwirkend eingesetzt werden können.
Das große Repertoire an Immunglobulinen und T-Zell-Rezeptor- Spezifitäten, das die Größe des Genoms sprengen würde, wenn für jedes Molekül ein eigenes Gen vorliegen würde, wird unter anderem dadurch realisiert, dass die einzelnen Gensegmente (V,
D, J) vor dem Rearrangement in mehreren Kopien vorliegen, die während der Reifung der Lymphozyten in der Art eines Zahlenschlosses beliebig miteinander kombiniert werden können.
Bei der VDJ-Rekombination werden zuerst die V-, D- und J-Segmente der schweren Kette des B-Zell Rezeptors verknüpft, danach die V- und J-Segmente der leichten Rezeptorkette . Nur wenn die Gene dabei erfolgreich umgeordnet werden, was als produktive Genumordnung bezeichnet wird, kann die Zelle in den jeweils nächsten Entwicklungsschritt übergehen.
B-Zellen, die während ihrer Ausreifung im Knochenmark auf körpereigene Antigene reagieren, sterben in den allermeisten Fällen durch Apoptose ab. Im Blut von gesunden Menschen lassen sich geringe Mengen an autoreaktiven Zellen, unter anderem gegen Thyreoglobulin oder auch Kollagen, nachweisen (Abul K. Abbas: Diseases of Immunity in Vinay Kumar, Abul K. Abbas, Nelson Fausto : Robbins and Cotran - Pathologie Basis of Disease. 7. Auflage. Philadelphia 2005, S. 224f) .
Da der Prozess der Generierung eines solchen BCRs auf einer zufälligen Zusammenlagerung von Gensegmenten basiert, kann es Vorkommen, dass der neu entstandene BCR unerwünscht körpereigene Strukturen erkennt und so „daueraktiviert" wird. Um die Entstehung eines derart „dauerhaft aktiven oder aktivierten" BCRs zu verhindern, existieren verschiedene körpereigne Schutzmechanismen. Werden diese allerdings auf Grund einer krankhaften Veränderung der sich entwickelnden B- Zelle überwunden, kann sich daraus eine maligne oder auch autoimmun manifestierende Erkrankung entwickeln.
Bei einem „autonom aktiven" oder „autonom aktivierten" BCR handelt es sich demgegenüber um eine besondere Art eines dauerhaft aktiven BCRs. Während die konventionelle Aktivierung von einem externen Antigen ausgeht (s.o.), resultiert der autonom aktive BCR aus seiner Interaktion mit Membranstrukturen auf der Oberfläche derselben Zelle. Für das Krankheitsbild der CLL konnte eine die autonome Aktivierung auslösende Interaktion zwischen BCRs gezeigt werden, die sich zueinander benachbart auf der Oberfläche derselben Zelle befanden (M. Dühren-von Minden et. al; Nature 2012). Ein weiteres Beispiel für einen autonom aktiven BCR stellt der prä-BCR dar, der im Laufe der Entwicklung einer B-Zelle als Entwicklungscheck exprimiert wird. Neben der Interaktion benachbarter Rezeptoren (BCR:BCR) kann aber auch eine Interaktion zwischen Rezeptor und einem Membranprotein (BCR:Membranprotein) zu einem autonom aktiven oder aktivierten BCR führen.
Die erfindungsgemäße Lösung dieser Probleme beruht auf der überraschenden Erkenntnis, dass sich auf Tumorzellen von Patenten mit CLL B-Zell Rezeptoren befinden, die autonom aktiv oder autonom aktiviert sind, und dass diese autonom aktiven oder aktivierten Rezeptoren durch das Vorhandensein gemeinsamer Epitope, die in entsprechenden Rezeptoren von gesunden Zellen desselben Patienten nicht nachgewiesen werden können, gekennzeichnet sind. Diese Zellen können somit aufgrund der Anwesenheit von autonom aktiven B-Zell Rezeptoren, die durch das Vorkommen der oben genannten Epitope gekennzeichnet sind, durch einen Antikörper spezifisch erkannt und therapiert werden, sodass gesunde B-Zellen ohne diese Charakteristik dadurch nicht in Mitleidenschaft gezogen werden, wodurch die Behandlung deutlich spezifischer und mit weniger unerwünschten Nebenwirkungen durchgeführt werden kann.
Im Rahmen der zahlreichen für die vorliegende Erfindung durchgeführten Experimente stellte sich jedoch überraschender weise heraus, dass Antikörper mit besonderer Spezifität für diese modifizierten Rezeptorbereiche (Epitope) nicht mit üblichen Standardmethoden hergestellt und selektioniert werden können. Erst nachdem die experimentellen Bedingungen derart angepasst wurden, dass im Rahmen von Bindungsstudien gentechnisch veränderte Zellen eingesetzt wurden, deren modifizierte B-Zell Rezeptoren sich in einem nativen und aktivierten Zustand befanden, konnten geeignete Antikörper mit der gewünschten und erforderlichen Spezifität gewonnen werden. Mit anderen Worten ist es für die erfindungsgemäß vorgeschlagenen Lösungen von essenzieller Bedeutung, dass die in Bindungsstudien zur Selektion geeigneter diagnostischer, prophylaktischer oder therapeutischer Antikörper eingesetzten Zellen ihre modifizierten Bereiche (Epitope) in weitgehend nativer und aktivierter Form präsentieren. Hierbei zeigte es sich, dass sog. pro-/prä-B-Zellen aufgrund ihrer physiologischen Konstitution besonders geeignet sind. Die Bereitstellung derartig spezifischer Antikörper und funktioneller Fragmente derselben, die ebenfalls über dieses spezifische Bindungsverhalten verfügen, ermöglicht somit eine Tumor-spezifische Diagnose und Behandlung, die durch einen deutlich verbesserten Behandlungserfolg und, dank der Reduktion von unerwünschten systemischen Wirkungen, einen deutlich erhöhten Therapieerfolg gekennzeichnet ist.
Wie bereits erwähnt, werden biologische Bindemoleküle in Form von Antikörpern oder funktionellen Fragmenten derselben und ein Verfahren zur Herstellung (Identifizierung und Selektion) solcher Bindemoleküle bereitgestellt, welche selektiv an B- Zellen mit B-Zellrezeptoren mit dem Epitop VL3-21 sowie zumeist auch an die modifizierten Epitope autonom aktiver membranständiger Immunglobuline von B-Zell Neoplasien binden. Ferner werden sowohl diagnostische, prophylaktische als auch therapeutische Verfahren unter Verwendung derartiger Bindemoleküle vorgeschlagen, wobei sich die therapeutische Anwendung auf die Hemmung des Wachstums oder das Abtöten von Zellen bezieht, die solche membranständigen Immunglobuline dieses Typs exprimieren. Diagnostische Verfahren beziehen sich vor allem auf den In-Vitro Nachweis dieses Rezeptorsubtyps , der durch das Vorhandensein von VL3-21 auf der leichten Kette von BCRs auf B-Zellen charakterisiert ist, insbesondere im Rahmen einer Therapieentscheidung zur Verwendung des vorgeschlagenen Antikörpers („Companion-Diagnostik" ) .
Im Allgemeinen stellen Leukämien und Lymphome attraktive Ziele für die Behandlung mit Immuntoxinen und/oder Immuncytokinen dar. Die Reaktion von Patienten mit B-Zell-Malignitäten ist in klinischen Studien der Phase I/II der Immuntoxin-Aktivität umfassend untersucht worden (Amlot et al., (1993), Blood 82, 2624-2633; Sausville et al., (1995), Blood 85, 3457-3465;
Grossbard et al . , (1993), Blood 81, 2263-2271; Grossbard et al., (1993) Clin. Oncol . 11, 726-737) . Bisher sind einige
Antitumor-Reaktionen festgestellt worden, doch verhinderte eine Immuntoxin-vermittelte Toxizität gegenüber normalem Gewebe oftmals Dosis-Eskalationen auf therapeutische Mengen. Mehrere B-Zell-spezifische Antigene, wie etwa CD19, CD22 und CD40, wurden als Ziele von Immuntoxinen ausgewählt, die mit
Pflanzentoxinen, wie etwa der Ricin A-Kette, und bakteriellen Toxinen, wie etwa Pseudomonas Exotoxin A (PE) , erzeugt wurden (Uckun et al . , (1992), Blood 79, 2201-2214; Ghetie et al . ,
(1991), Cancer Res. 51, 5876-5880; Francisco et al., (1995), Cancer Res. 55, 3099-3104).
Für eine zielgerichtete, d.h. spezifische Immuntherapie stellen membranständige Immunglobuline gut geeignete Ziele dar. Während der B-Zell Entwicklung im Knochenmark generiert jeder einzelne B-Zell Vorläufer durch die Umlagerung von einzelnen Gen- Segmenten seinen eigenen und nahezu einzigartigen B-Zell Rezeptor (BCR) .
Es sind zwei Varianten (Subset 2; Subset 4) des autonom aktiven BCRs bekannt, die sich hinsichtlich ihres jeweils charak terisierenden molekularen Motivs (Epitops) voneinander unterscheiden (Minici, C. et al . , Distinct homotypic B-cell receptor interactions shape the outcome of chronic lymphocytic leukaemia, Nature Comm. (2017)). Beide Varianten weisen unterschiedliche kurze Aminosäuresequenzen auf, die für diese Varianten jeweils spezifisch sind. Dem Fachmann ist bekannt, dass neben den aufgeführten Subsets auch andere CLL-B-Zell Rezeptoren autonom aktiv sind. Der für die autonom aktive Funktionalität des Rezeptors maßgebliche Bereich von Subset 2 kennzeichnet sich hierbei durch die Aminosäuresequenzen KLTVLRQPKA (SEQ ID NO. 1) und VAPGKTAR (SEQ ID NO. 2) der leichten Kette, während der für die autonom aktive Funktionalität des Rezeptors maßgebliche Bereich von Subset 4 durch die Aminosäuresequenzen PTIRRYYYYG (SEQ ID NO. 3) und NHKPSNTKV (SEQ ID NO. 4) des variablen Teils der schweren Kette definiert wird. Die zur Erzeugung der murinen Antikörper im Rahmen der Immunisierung eingesetzten Sequenzen für die Subsets 2 und 4 sind in den SEQ ID NOS. 5 und 6 (vHC; LC) bzw. 7 und 8 (vHC; LC) angegeben. Der Vollständigkeit halber wird in SEQ ID NO. 17 (VSSASTKG) eine weitere Zielsequenz bzw. ein weiteres Epitop mit Spezifität für den variablen Teil der schweren Kette eines BCR des Subsets 4 angegeben. Neben den für die Ausbildung des autonom aktiven Zustand des BCR (Subset 4) verantwortlichen Zielsequenzen (Epitopen) gemäß SEQ ID NOS. 3 und 4 stellt die Sequenz gemäß SEQ ID NO. 17 somit eine weitere für diesen Subset charakteristische Eigenschaft dar.
Es wird darauf hingewiesen, dass das Auffinden und Charakterisieren der Subsets 2 und 4 als zwei Varianten des B- Zellrezeptors in Patienten mit kritischem Krankheitsverlauf auf der Untersuchung zahlreicher Einzelfallstudien beruht und daher nicht bedeutet, dass in einer möglichen Vielzahl anderer Subtypen des BCRs nicht dieselben vorliegend für die beiden bekannten Subtypen kennzeichnenden Zielsequenzen (Epitope) vorhanden sind und mit einem schweren Krankheitsverlauf korrelieren .
Es wird darauf hingewiesen, dass die vorliegenden Ausführungen im Zusammenhang mit dem Auffinden von Bindemolekülen mit Spezifität für BCRs der Subtypen 2 und 4 als Vorarbeiten zu verstehen sind, die zum Auffinden des erfindungsgemäßen weiteren Bindemoleküls mit Spezifität für das Epitop VL3-21 geführt haben und ihrerseits Gegenstand paralleler Patentanmeldungen sind.
Obwohl sich Antikörper gegen beide dieser Subsets grundsätzlich mit Standardmethoden z.B. in Mäusen generieren lassen sollten, wurde überraschenderweise beobachtet, dass eine Immunisierung unter Verwendung von Peptiden nicht zur Bildung der gewünschten spezifischen Antikörper führt. Auch die Immunisierung unter Verwendung einzelner Ketten des Rezeptors, wie z.B. der Verwendung der die modifizierten Sequenzbereiche umfassenden leichten Kette des BCR, brachte nicht den gewünschten Erfolg, weshalb Mäuse schließlich mit der rekombinant hergestellten löslichen Form des BCRs (vgl. SEQ ID NOS. 5 und 6) immunisiert wurden. Aus diesen Mäusen konnten anschließend Immunzellen mit der gewünschten Spezifität gewonnen und durch Zellfusion in Hybridoma-Zellen transformiert werden. Hierbei zeigte sich überraschenderweise, dass die aktiven Antikörper nicht mittels ELISA Test oder anderen Standard-Verfahren identifiziert werden konnten. Die in einem ersten Schritt mittels ELISA als potenzielle Bindungspartner identifizierten Klone erwiesen sich jedoch nach der Selektion als entweder unspezifisch bindend oder nicht an den autonom aktiven Rezeptor (einschließlich der SEQ ID NOS. 1 und 2) bindend und mussten daher verworfen werden .
Die bis zu dieser Erkenntnis eingesetzten Verfahren umfassten nicht nur Standardmethoden wie ELISA und SPR, sondern auch die intrazelluläre Expression in Fibroblasten mit einer intrazellulären FACS-Färbung als Bindekontrolle.
Nach aufwendigen weiteren Versuchsreihen konnte gezeigt werden, dass eine erfolgreiche Selektion erfindungsgemäß geeigneter Bindemoleküle weder mit freien Rezeptoren oder deren Fragmenten noch mit membranständigen oder intrazellulären Rezeptor fragmenten durchgeführt werden kann. Stattdessen wurde beobachtet, dass die Selektion nur unter Verwendung eines Zellsystems gelang, im Rahmen dessen der komplette und funktionelle B-Zell Rezeptor membranständig präsentiert wurde . Dabei ist es von großer Bedeutung, dass der BCR mit seinen modifizierten Bereichen (Epitope) in bzw. auf diesen Zellen autonom aktiv vorliegt bzw. präsentiert wird. Nur mit dieser Vorgehensweise, deren Bedingungen ein weitgehend physiologisch natives in situ Szenario widerspiegeln, konnte ein Antikörper identifiziert werden, der hochspezifisch und selektiv lediglich an die Tumorzellen bindet, d.h. an B-Zellen, die einen BCR mit einem Epitop auf ihrer Zellmembran exprimieren, welches für den Subset-2 oder Subset-4 dieses Zelltyps charakteristisch ist, nicht jedoch an andere B-Zellen oder deren Rezeptoren (BCRs), die definitionsgemäß keine B-Zellen des Subsets 2 oder 4 darstellen. Mit anderen Worten binden diese Bindemoleküle selektiv an autonom aktive oder autonom aktivierte B-Zell Rezeptoren, die durch das Vorhandensein von strukturellen Domänen oder Epitopen (Zielsequenzen) charakterisiert und für den autonom aktiven oder aktivierten Zustand der B-Zell Rezeptoren ursächlich sind.
Es konnte ferner gezeigt werden, dass die Verwendung von arretierten pro-/prä-B-Zellen, die aus 'Triple Knockout ' -Mäusen (TKO) gewonnen wurden, trotz der schwierigen Handhabung und der aufwendigen Gewinnung besonders gut geeignet sind, diese Rezeptoren zu exprimieren und im Rahmen eines Testsystems zur Identifikation dieser Rezeptoren verwendet zu werden. Das Stadium der pro-/prä-B-Zellen ist natürlicherweise dazu ausgelegt, die Reifung und Selektion der BCRs durchzuführen, und die Zellen dieses Stadiums sind aufgrund ihrer Enzymausstattung (Chaperone etc.) besonders geeignet, auch „schwierige" BCR-Komponenten korrekt zu falten und auf Ihrer Oberfläche in hinreichend physiologisch nativer Form darzustellen. Durch die nachfolgend dargelegten Deletionen (Knockouts) wird verhindert, dass durch eine Rekombination oder die Verwendung der Surrogaten Leichten Kette („Surrogate light chain") eine Veränderung des gewünschten BCR stattfindet. Durch Verwendung dieser Zellen oder dieses Zelltyps arretierter pro-/prä-B-Zellen zur Expression und Präsentation von BCRs im Rahmen einer Selektion von Antikörpern mit selektiv-spezifischem Bindungsverhalten gegenüber autonom aktiven oder aktivierten B-Zell Rezeptoren wird eine Selektionsplattform bereitgestellt, die im Vergleich mit den im Stand der Technik herkömmlich zur Selektion eingesetzten Systemen durch eine sehr viel höhere Qualität gekennzeichnet ist, welche den hohen Aufwand der Verwendung von primären TKO Zellen, bzw. deren Kultivierung über wenige Passagen rechtfertigt.
Nach der zuvor beschriebenen Selektion geeigneter Hybridomazellen konnten die für diagnostische, prophylaktische und/oder therapeutische Zwecke geeigneten Antikörper in Form monoklonaler Antikörper in größeren Mengen gewonnen werden. Durch Sequenzierung der DNA dieser Zellen konnte die Bindungsstelle des Antikörpers ermittelt werden (vgl. SEQ ID NOS. 9 und 10) . Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt und sind auch kommerziell verfügbar. Hierbei ist es vorteilhaft, wenn man eine größere Zahl an Hybridomazellen gewinnt und diejenigen mit der besten Bindeaktivität (Spezifität und Bindestärke/Affinität) auswählt.
Durch die somit erhaltene genetische Information über die Bindungsstelle wurde die dafür kodierende Sequenz in ein Expressionsplasmid mit der DNA einer humanen Antikörpersequenz eingefügt, um auf üblichem Weg der Rekombination einen humanisierten monoklonalen Antikörper mit der gewünschten Spezifität zu erzeugen. Diese humanisierten Antikörper zeigten aufgrund ihrer einzigartigen Spezifität eine im Vergleich mit herkömmlichen diagnostischen Mitteln und Wirkstoffen bessere diagnostische Spezifität bzw. prophylaktische und therapeutische Wirksamkeit bei vergleichsweise sehr geringen Nebenwirkungen. Dem Fachmann ist klar, dass sich diese humanisierten Antikörper auf biotechnologischem Weg in großen Mengen hersteilen lassen. Zur Aufreinigung der synthetisierten Antikörper können standardisierte Verfahren angewendet werden, wie z.B. Kombinationen aus Präzipitation, Filtration und Chromatographie, was dem Fachmann hinreichend bekannt ist, wobei beachtet werden sollte, die Antikörper nicht zu denaturieren und mögliche Fremdsubstanzen wie z.B. Proteine, Pyrogene und Toxine quantitativ zu entfernen.
Bevorzugt werden die gewünschten Antikörper in Systemen exprimiert, in denen der Antikörper eine Glykosylierung wie insbesondere eine humane Glykosylierung erfährt. Solche Systeme sind dem Fachmann hinreichend bekannt und schließen die Verwendung von Insektenzellen (S2-Zellen), Säugerzellen (CHO- Zellen) und, besonders bevorzugt, humane Zellen wie zum Beispiel Zellen des Typs HEK293T ein.
Der hinreichend aufgereinigte Antikörper kann an sich schon therapeutisch wirksam sein, sofern er einen Isotyp aufweist, der eine spezifische Immunantwort hervorruft, wie z.B. ein IgG Subtyp, der über Fc-Rezeptoren zu einer Immunantwort gegen den Tumor führt .
Der Antikörper kann aber auch als Fragment vorliegen. Dabei ist es wichtig, dass die Antigen-Bindestelle in dem Fragment vorliegt, es sich also um ein funktionales Fragment handelt. Solche Fragmente lassen sich z.B. durch Protease-Behandlung als F(ab) Fragmente herstellen. Da diese Fragmente im konstanten Teil des Antikörpers trunkiert sind, ist es hier vorteilhaft und deshalb bevorzugt, ein Effektormolekül zum Abtöten von Neoplasien einzufügen.
Nach einer alternativ bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper mit einem Konjugat versehen, um dessen Wirkung zu steigern. Dieses Konjugat ist ein Bereich zum Abtöten von Neoplasien und kann solche Neoplasien entweder als direkte oder indirekte Wirkung abtöten. Ein Beispiel für ein solches Konjugat ist die Anbindung von Ricin an den Antikörper, wobei dessen bevorzugt kovalente Anbindung z.B. durch Verwendung chemischer Crosslinker durchgeführt wird. Derartige Moleküle und Verfahren sind in dem Buch Bioconjugate Techniques von Greg T. Hermanson im Kapitel 11 Immunotoxin Conjugation Techniques umfänglich beschrieben.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann der Antikörper auch in modifizierter Form wie z.B. als biologisches Bindemolekül in Form eines Fusionsproteins mit T-Zell spezifischen Aktivierungsdomänen vorliegen. Zur Generierung dieses sogenannten Chimären Antigen-Rezeptors (Chimeric Antigen Receptor; CAR) werden zunächst T-Zellen aus dem peripheren Blut des Patienten gewonnen und in vitro derart gentechnisch verändert, dass sie den CAR auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Anschließend werden diese modifizierten T-Zellen wieder in den Patienten eingebracht, wodurch somit eine CAR-T- Zell Immuntherapie durchführbar ist (siehe z.B. N Engl J Med. 2014 Oct 16; 371 (16) : 1507-17. doi : 10.1056/NEJMoal407222 ) .
Zur therapeutischen Verwendung wird der Antikörper bevorzugt in einer Zusammensetzung eingesetzt, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger aufweist.
Ein pharmazeutisch verträglicher Träger ist ein Träger, der für einen behandelten Patienten physiologisch verträglich ist und die therapeutischen Eigenschaften der Verbindung, mit welcher er verabreicht wird, bewahrt. Ein beispielhafter pharmazeutisch verträglicher Träger ist physiologische Kochsalzlösung. Andere geeignete physiologisch verträgliche Träger und deren Formulierungen sind dem Fachmann bekannt und werden beispielsweise beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Ausgabe), Hrsg. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA) .
Eine weitere therapeutische Anwendungsmöglichkeit der erfindungsgemäßen Bindemoleküle stellt das an sich bekannte Verfahren der Apharese dar, bei der eine Behandlung des Blutes oder einer Blutprobe eines Patienten außerhalb seines Körpers im Sinne einer "Blutwäsche" erfolgt.
Beispielsweise kann der erfindungsgemäße Antikörper in einem Apharesesystem zur Abtrennung von Leukämiezellen aus einer Blutprobe eines Patienten verwendet werden. Hierzu sind grundsätzlich verschiedene Verfahren geeignet, wie dem Fachmann bekannt ist.
Nach einer ersten beispielhaften Ausführungsform können die Antikörper an magnetisierbare Partikel (Beads) (z.B. Dynabeads) gebunden sein. Das Blut wird mit einem Antikoagulans versehen und außerhalb des Körpers des Patienten mit den Partikeln in Kontakt gebracht. Idealerweise wird dazu pro Tumorzelle mindestens ein Partikel, vorzugsweise 10 bis 100 Partikel eingesetzt. Ein Partikel mit einer Größe von beispielsweise kleiner 20 pm enthält dabei typischerweise mehrere Antikörper derselben Spezifität (Anzahl der Partikel größer 5000/m1 Blut) . Mit Hilfe von Magneten können diese Partikel dann gebunden werden, bevor das gereinigte, restliche Blut dem Patienten rückgeführt wird. Durch diese therapeutische Maßnahme wird die Anzahl der Tumorzellen im Blut des Patienten deutlich reduziert. Nach einer anderen Ausführungsform haben die Partikel Größen von mehr als 20 pm und weisen ebenfalls eine Vielzahl von Antikörpern pro Partikel auf (> 100, > 1000) . So können mit einem Partikel viele Lymphozyten (Tumorzellen ) gebunden und entfernt werden. Diese Partikel/Zell-Konjugate werden durch klassische Zentrifugation, wie sie bei der Apharese üblicherweise verwendet wird, entfernt. Die dafür notwendigen Zeiten hängen von der Art der Partikel und der Apparatur ab und müssen experimentell ermittelt werden.
Im Rahmen einer weiteren Ausführungsform können sowohl die Partikel/Zell-Konjugate (insbesondere bei Verwendung großer Partikel über 20 pm Durchmesser) als auch freie Partikel ohne Zellbindung mit Hilfe eines feinen Netzwerks von Blut abgetrennt werden. Solche Netzwerke sind z.B. als sog. ' Cellstrainer’ kommerziell erhältlich. Verfahren zum Konjugieren der Antikörper an die Partikel sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Verfahrensanweisungen werden z.B. von der Firma Dynal ihren Kunden zur Verfügung gestellt.
Zur diagnostischen Verwendung wird der Antikörper bevorzugt in standardisierten Verfahren wie im Rahmen einer Durchfluss- zytometrie oder Immunhistochemie eingesetzt. Vorzugsweise weisen die für diagnostische Zwecke vorgeschlagenen Antikörper, biologischen Bindemoleküle oder funktionellen Fragmente derselben ein murines Grundgerüst auf. Eine Detektion im Durchflusszytometer erfolgt vorzugsweise mittels sekundärer Antikörper, oder alternativ bevorzugt mittels direkt an die Antikörper, biologischen Bindemoleküle oder funktionellen Fragmenten derselben gebundene Fluoreszenzfarbstoffe.
Zur stabilen Lagerung kann es von Vorteil sein, den Antikörper oder dessen Fragmente in einer stabilisierten Form bereitzustellen, was dementsprechend auch bevorzugt ist. Dazu kann z.B. eine Trocknung mit einem stabilisierenden Salzpuffer erfolgen. Ein solcher Puffer kann z.B. eine Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) sein, wie dem Fachmann bekannt ist. Eine geeignete Trocknungsform ist z.B. Gefriertrocknen oder Lyophilisieren .
Einzelne Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend anhand von Beispielen naher erläutert.
Bevor detaillierte Erläuterungen zum experimentellen Vorgehen dargelegt werden, sei auf die nachfolgenden Ausführungen verwiesen .
Die Herstellung und Identifizierung von Antikörpern, die selektiv an die modifizierten B-Zell Rezeptoren binden, war von größeren und unvorhergesehenen Problemen gekennzeichnet. Die Erzeugung der Hybridome erfolgte mittels Standardmethoden. Der Überstand von den Hybridomgruppen wurde gepoolt und mittels ELISA auf positive Bindungsereignisse untersucht (lösliche B- Zell Rezeptoren auf der ELISA-Platte ) . Positive Pools wurden vereinzelt und die individuellen Klone getestet. Dabei wurden im ELISA überraschenderweise keine positiven Klone mehr identifiziert. Die positiven ELISA Signale der Poole stellten sich im Nachhinein als unspezifische Bindungen heraus.
Um bessere Epitope für die Erkennung der Antikörper zu schaffen, wurde nun die leichte Kette des BCRs in Fibroblasten exprimiert. Dies sollte die korrekte Faltung des Proteins gewährleisten, welches das für das autonome Signal verantwortliche Motiv (Epitop) trägt. Mit diesen Zellen wurden intrazelluläre FACS-Analysen durchgeführt. Es konnte kein positiver Klon (Antikörper) identifiziert werden.
Aus diesem Grund wurden in einem weiteren Experiment RAMOS Zellen (humane Burkitt Lymphom Zellline) modifiziert, so dass diese funktionelle modifizierte BCRs aufwiesen. Damit sollte die vollständig korrekte Biosynthese, Faltung und Modifikation des BCRs gewährleistet sein. Dazu wurde der zelleigene BCR mittels CRISPR deletiert und dann der „CLL-Rezeptor" molekularbiologisch rekonstituiert (Elektroporation von CMV- Vektoren) . Diese Zellen wurden zum Testen von positiven Bindungsereignissen verwendet. Auch hier war mittels FACS kein positiver Klon nachweisbar.
Überraschenderweise brachte dagegen die Verwendung von murinen TKO ('Triple Knock-out') Zellen (arretierte pro-/prä-B-Zellen) , in die der CLL-Rezeptor mittels eines Genshuttles eingebracht wurde, einen positiven Klon. Und das, obwohl das humane Zellsystem dies nicht gewährleisten konnte. Diese Zellen weisen als Besonderheit folgende drei Knockouts in ihrem Genom auf: der Knockout von RAG2 verhindert die somatische
Rekombination von eigenen schweren und leichten
Immunglobulinketten, weshalb die endogene Bildung eines BCR ausgeschlossen ist. Dies führt zu einer Arretierung, einem Blockieren oder 'Einfrieren' entsprechend behandelter B- Zellen in diesem Entwicklungsstadium. Es ist bekannt, dass RAG1 und RAG2 einen Komplex bilden, der das übliche VDJ- Rearrangement erst ermöglicht, weshalb ein Knockout von RAG1 ein gleich wirkendes Mittel und somit eine Alternative zum Knockout von RAG2 darstellt und von der erfindungsgemäßen Lehre umfasst ist. die Deletion von Lambda5, einem Teil der Surrogaten Leichten Kette, verhindert die Formation eines prä-BCR. Da der prä-BCR autonom aktiv ist, würde dies den Nachweis eines autonom aktiven Rezeptors stören. Da hier ein neuer BCR in die Zelle kloniert wird, ist ein prä-BCR unerwünscht, da dieser mit der erwünschten Schweren Kette (HC) in Verbindung mit der unerwünschten Surrogaten Leichten Kette auf der Oberfläche erscheinen und die Selektion stören würde. der Knockout von SLP65, einem Adapterprotein von zentraler - Bedeutung im BCR-Signalweg, verhindert die Aktivierung der TKO Zelle durch einen eventuell rekonstruierten BCR.
Die Kombination der Knockouts von RAG2 oder RAG1 und Lambda5 führt zu einer Blockade im Übergang von dem pro-B Zell-Stadium hin zum prä-B Zell-Stadium, welches klassischerweise mit der beginnenden Umlagerung der VDJ-Segmente der schweren Kette (HC) gekennzeichnet ist. Daher handelt es sich um pro-/prä-B Zellen.
Für die Expression des BCR und Selektion des geeigneten Antikörpers ist der Knockout von RAG2 oder RAGl und Lambda5 ausreichend. Durch die Rekonstitution mit dem induzierbaren SLP65 kann die Aktivität des BCR gemessen werden.
Die Methode der Wahl hierbei ist die Messung des Ca-flux nach Induktion des SLP65 mittels FACS-Analyse und der Verwendung eines Ca2+ abhängigen Farbstoffes wie Indo-1. Diese Methoden sind dem Fachmann bekannt (s. (M. Dühren-von Minden et. al; Nature 2012) .
Durch die ersten beiden Knockouts wurde sichergestellt, dass nur der „BCR of Interest" auf der Oberfläche exprimiert wird. Durch die Verwendung eines induzierbaren SLP65, mit welchem die Zellen rekonstituiert wurden, können überdies die Funktion der exprimierten BCRs charakterisiert und somit der autonom aktive Zustand der BCRs auf der Oberfläche vor der Selektion verifiziert werden.
Die Expression des BCRs wurde mittels anti-IgM und anti-LC Antikörper am FACS bestimmt. Dazu wurden einige Zellen abgenommen und mit je 5m1 Antikörper in einem Gesamtvolumen von IOOmI in PBS gefärbt.
Mit diesen Zellen als „Target" gelang es nun mittels FACS, einen Antikörper zu identifizieren, der an den modifizierten Bereich, durch welchen die autonome Aktivierung des BCR begründet und gekennzeichnet ist, spezifisch bindet. Und dies, obwohl eine Bindung an den gleichen Rezeptortyp in RAMOS Zellen nicht erfolgreich war!
Dazu wurden die Zellen, welche den „BCR of Interest" auf der Oberfläche trugen, zunächst mit den gepoolten Überständen inkubiert, und nach einigen Waschschritten wurden die gebundenen Antikörper mittels Sekundärantikörpern detektiert. Für eine spezifische Selektion wurden TKO-Zellen (TKOs) verwendet, welche verschiedene Versionen des „BCR of Interest" exprimierten. Die in Figur 1 dargestellte Selektionsmatrix ist exemplarisch für die Selektion eines CLL-Subset 2 BCRs und diente der Identifizierung und Selektion positiver Klone. Zur einfacheren Identifikation wurden die Überstände der Hybridome gepoolt und gemessen. Die Gruppen, die eine Bindung zeigten, wurden vereinzelt, und die Überstände der jeweiligen Hybridome auf Bindung getestet. Die Bestätigung, dass der selektierte Antikörper spezifisch an den modifizierten BCR und nicht an andere BCR Varianten bindet, erfolgte mittels zweier Blindproben, d.h. mit Zellen ohne BCR (s. Figur 1 A) sowie mit Zellen mit Non-CLL-BCR (s. Figur 1 E) . Primäre B-Zellen aus dem Blut von Leukämiepatienten wurden mittels FACS auf Bindung untersucht. Der selektionierte Antikörper war in der Lage, spezifisch diejenigen BCRs zu identifizieren, welche die Zielstruktur aufwiesen. Dies wurde auf genomischer Ebene bestätigt. Proben ohne diese Zielstruktur wiesen keine Bindung auf.
Im Rahmen der Untersuchungen stellte sich heraus, dass sämtliche verwendeten autonom aktiven Zellen des Typs CLL- Subset 2 neben einer speziellen Mutation (R110G) zusätzlich eine spezielle Variante des V-Bereiches der leichten Kette des BCR aufwiesen. Diese Epitop-Variante wurde als VL3-21 (SEQ ID NO 18) identifiziert und bildet den Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Epitop bei ca 30% aller CLL-Fälle auf dem BCR der Tumorzellen vorhanden ist. Allerdings kann dieses Epitop auch auf gesunden Zellen Vorkommen. Somit handelt es sich hierbei um ein Tumor assoziiertes Epitop, das zur Diagnose und Therapie des Tumors verwendet werden kann. Dies gilt insbesondere, da es eine Vielzahl von Varianten dieses V-Bereiches gibt, sodass die vorliegend beschriebene Variante VL3-21 bei „gesunden", d.h. nicht tumorartigen B-Zellen von weniger als 5% der Zellen exprimiert wird. Somit ergibt sich die therapeutische Möglichkeit einer vorrangigen Bekämpfung neoplastischer B- Zellen (Tumorzellen) bei einer im Vergleich zu der herkömmlichen Verwendung von unspezifischen Antikörpern gegen den BCR sehr viel geringeren Beeinträchtigung von gesunden, nicht tumorartigen B-Zellen. Aus diesem Grund kann mit dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Antikörper oder einem funktionellen Fragment desselben mit Spezifität für VL3-21 eine wesentlich spezifischere und für den Patienten weniger belastende Therapie durchgeführt werden. Zudem kann der Antikörper gegen VL3-21 bei z.B. CLL-Patienten zur sogenannten Companion-Diagnostik verwendet werden. Im Rahmen dieser Diagnostik wird nachgewiesen, dass die Zielstruktur VL3-21 des therapeutischen Antikörpers auf den Tumorzellen vorhanden ist und eine diesbezügliche Behandlung mit guten Erfolgsaussichten rechtfertigt .
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen unter Berücksichtigung der Figuren näher erläutert .
Beispiel 1
Den Ausgangspunkt für die Herstellung von Triple-Knockout- Zellen (TKO) bilden transgene Mäuse, welche einen jeweiligen Knockout für die Gene Lambda5, RAG2 und SLP65 aufweisen (Dühren von Minden et al., 2012, Nature 489, p309-313). Die Erstellung solcher Mäuse ist dem Fachmann bekannt und gehört zum Stand der Technik. Für die Gewinnung der Zellen wurde den Mäusen nach ihrer Tötung das Knochenmark der Oberschenkelknochen extrahiert. Die so gewonnenen Zellen wurden anschließend unter Bedingungen in Kultur genommen, die das Überleben von pro-/prä- B-Zellen begünstigen (37°C, 7,5% C02, Iscoves Medium, 10% FCS, P/S, murinem IL7) . Nach mehreren Passagen wurden zur Kontrolle eine FACS-Sortierung durchgeführt, die pro-/prä-B-Zellen sortiert und anschließend wieder in Kultur genommen. Die dazu verwendeten Marker sind dem Fachmann bekannt.
Für die Rekonstitution mit einem ' BCR of Interest' wurden die entsprechenden, für die schweren (HC) und leichten (LC) Ketten kodierenden Sequenzen synthetisiert und dann jeweils in einen CMV-Promotor aufweisende Expressionsvektoren kloniert . Diese wurden mittels Lipofektion in die Verpackungszelllinie (Phoenix-Zelllinie) eingebracht. Nach einer 36 Stunden andauernden Inkubation wurde der Virusüberstand abgenommen und für eine Spinfektion der TKO Zellen verwendet. Sowohl die Arbeiten zur Gewinnung der Überstände als auch die Spinfektion der TKO sind weitläufig bekannte Verfahren und dem Fachmann bekannt .
Die strukturellen Besonderheiten von Subset-2 B-Zell Rezeptoren wurden der entsprechenden Literatur entnommen (s.o.) . Exemplarische CLL-Subset 2 VH und vollständige LC DNA-Segmente wurden von einem Lohnhersteller in einem Standardverfahren synthetisiert. Diese wurden dann mit einem murinen IgGl- Konstantensegment mittels PCR fusioniert und in einen CMV- Vektor kloniert. Die Sequenz des fertigen Vektors wurde mittels Sanger-Sequenzierung bestätigt.
Figure imgf000026_0001
Für die Expression des CLL-Subsets 2 IgGl wurde ein humanes zelluläres Expressionssystem basierend auf HEK293T Zellen genutzt. Für die Transfektion wurde ein auf Polyethylenimin (PEI) basierendes Protokoll angewendet. Nach mehreren Passagen wurde der Überstand gepoolt, und das in dem vereinigten Zellüberstand enthaltende Medium wurde mittels Protein G Säulchen aufgereinigt . Die Reinheit und Qualität der löslichen Subset-2 IgGl wurde mittels Westernblot bestimmt.
Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern erfolgte nach dem Standardverfahren in Mäusen und der anschließenden Generierung von Hybridoma-Zellen. Das Screening nach positiven Klonen erfolgte nicht wie herkömmlich mittels ELISA. Da es sich bei der Zielstruktur um einen membranständigen Rezeptor handelt, ist es von zentraler Bedeutung, die Bindung der potentiellen Antikörper auch in einem zellulären System, d.h. unter weitgehender Wahrung der für diesen Zelltyp nativen zellphysiologischen Zustande, zu validieren. Es wurden zunächst Gruppen von gepoolten Überständen mittels FACS-Analyse auf Bindungsereignisse untersucht. Dazu wurden verschiedene CLL- Subset 2 BCR Varianten auf der Oberfläche einer Zelllinie (TKO) exprimiert, welche selber keinen BCR exprimieren kann. So konnten zunächst die Überstände identifiziert werden, deren Antikörper eine Bindung aufzeigten. Anschließend wurden die Überstände der einzelnen Hybridom-Klone hinsichtlich ihrer Bindung eingehender untersucht, um auf diese Weise hochspezifische Klone mit hoher Affinität zu identifizieren.
Für das Screening-Verfahren wurden im Rahmen der vorhergehenden Transformation unterschiedliche Vektoren für die folgenden Kombinationen aus schwerer Kette (HC) und leichter Kette (LC) der entsprechenden CLL-BCRs eingesetzt, wobei diese Kombinationen auf der Oberfläche des BCR-Rekonstitutionssystems verwendet wurden:
• Kontrolle (Transformationsvektor ohne BCR) (s. Fig.l A)
• Vektor mit für den CLL-Subset 2 typischer HC / LC (VL3-21)
(s. Fig. 1 B)
• Vektor mit einer non-CLL-Subset 2 HC / einer für den CLL- Subset 2 typischen LC (VL3-21; ohne Zielmotiv R110G) (s. Fig. 1 C)
• Vektor mit für den CLL-Subset 2 typischer HC / einer non- CLL-Subset 2 LC (s. Fig. 1 D)
• Vektor mit einer non-CLL-Subset 2 HC / einer non-CLL- Subset 2 LC (s. Fig. 1 E) • Vektor mit für den CLL-Subset 2 typischer HC / LC (VL3-21; einschließlich Mutation R110G (Zielmotiv)) (s. Fig. 1 F) .
Diese Vorgehensweise der Selektion ist in Figur 1 schematisch am Beispiel der CLL-Subset 2 BCRs veranschaulicht, wobei sich die Bezeichnung 'TKO' auf TKO-Zellen (s.o.) bezieht.
In der 1. Selektionsrunde wurden Überstände mehrerer Klone vereinigt und hinsichtlich ihres Bindungsprofils an die Selektionsmatrix untersucht. Ein positives Bindungsprofil ist gegeben, wenn sich eine spezifische Bindung an den „BCR-of- Interesst" zeigt. Gruppen, die ein solches Profil zeigten, wurden vereinzelt, und das Bindungsprofil der einzelnen Klone wurde im Rahmen einer zweiten Selektionsrunde nochmals auf der Selektionsmatrix charakterisiert. Die Bindung der monoklonalen Antikörper wurde unter Anwendung eines FACS- Bindungsassays unter Verwendung eines Fluoreszenz-markierten Anti-Mouse-IgG Antikörpers verifiziert. Es bezeichnen: A) kein BCR (Kontrolle); B) ein CLL-Subset2 typischer BCR; C) ein BCR mit willkürlicher schwerer Kette und einer CLL- Subset2 typischen leichten Kette; D) ein BCR mit einer CLL- Subset2 typischen schweren Kette und einer willkürlichen leichten Kette; E) ein BCR mit willkürlicher schwerer und leichter Kette (Kontrolle; nicht CLL-Subset2 typischer BCR) ;
F) ein CLL-Subset2 typischer BCR mit einer Mutation im Zielmotiv (R110G) (Kontrolle) . Es wird darauf hingewiesen, dass als leichte Kette in den Fällen gemäß Figur 1 B, C und F die Variante VL3-21 eingesetzt wurde.
Aufgrund des Befundes, dass der Antikörper nur an die Zellen mit den Zielstrukturen bindet (CLL-Subset 2 BCR; Fig. 1B) , kann gefolgert werden, dass hier ein Antikörper vorliegt, der spezifisch an Zellen mit autonom aktiven Rezeptoren bindet.
Hierbei zeigte sich, dass die Verwendung von Zellen, die sich im pro-/prä-Stadium der B-Zell Entwicklung befinden, für die zum Nachweis benötigte exakte Expression des BCR notwendig ist. Diese Zellen sind entwicklungsgenetisch eingerichtet, um neue BCR durch exakte Faltung und Expression auf ihrer Oberfläche darzustellen. Durch die Inaktivierung (Knockout) von RAG2 und Lambda5 wird die Expression eines endogenen BCR bzw. prä-BCR verhindert. Die Deletion von SLP65 und die anschließende Rekonstruktion eines induzierbaren SLP65 ermöglicht es, das Aktivitätsniveau des "BCR of Interest" zu charakterisieren .
Zur Bestimmung der Aminosäurensequenz der mittels Selektion ausgewählten monoklonalen Antikörper wurde aus den einzelnen Hybridom-Klonen die mRNA isoliert, daraus cDNA generiert und diese mittels Anchor-PCR amplifiziert (Rapid expression cloning of human immunoglobulin Fab fragments for the analysis of antigen specificity of B cell lymphomas and anti-idiotype lymphoma vaccination; Osterroth F, Alkan 0, Mackensen A, Lindemann A, Fisch P, Skerra A, Veelken H., J Immunol Methods 1999 Oct 29; 229 ( 1-2 ) : 141-53 ) .
Nach Identifizierung und Sequenzbestimmung der für die Bindung wichtigen Bereiche (CDRs) wurden diese mittels PCR auf humanes Antikörpergerüst übertragen. Dazu wurde die VH-Sequenz aus den humanen FR-Regionen und den murinen CDR Regionen in silico generiert und anschließend als DNA-Fragmente synthetisiert. Diese wurden anschließend mittels PCR mit einem humanen IgGl fusioniert und in einen für die Expression geeigneten Vektor kloniert .
Für die Generierung der monoklonalen Antikörper wurden neben den kompletten Immunglobulinen auch synthetische Peptide verwendet, welche die Regionen für die Fähigkeit eines autonomen Signals repräsentierten.
Der spezifische monoklonale Antikörper gegen Subset-2 wurde sequenziert und bildet den Gegenstand separater Patentanmeldungen . Im Rahmen der Sequenzierung wurden die folgenden Aminosäurequenzen bestimmt, wobei die SEQ ID NO. 9 den variablen Teil der schweren Kette (HC), und die SEQ ID NO. 10 den variablen Teil der leichten Kette (LC) betreffen, und wobei die markierten Bereiche - in der angegebenen Reihenfolge - CDR 1, 2 und 3 bezeichnen.
Figure imgf000030_0001
Die mit CDR1, CDR2 und CDR3 korrespondierenden Teilsequenzen der schweren Kette gemäß SEQ ID NO. 9 sind in den SEQ ID NOS. 11 bis 13 angegeben, während die mit CDR1, CDR2 und CDR3 korrespondierenden Teilsequenzen der leichten Kette gemäß SEQ ID NO. 10 in den SEQ ID NOS. 14 bis 16 dargestellt sind.
Figure imgf000030_0002
Die oben beschriebene Vorgehensweise ist exemplarisch für die Generierung von gegenüber CLL-Subset 2 spezifischen Antikörpern. Der gleiche Prozess wurde auch unter Verwendung von spezifischen Sequenzen und Isotypen für Subset 4 durchgeführt .
Exemplarische CLL-Subset 4 VH und vollständige LC DNA-Segmente wurden von einem Lohnhersteller in einem Standardverfahren synthetisiert. Diese wurden dann mit einem murinen IgGl- Konstantensegment mittels PCR fusioniert und in einen CMV- Vektor kloniert. Die Sequenz des fertigen Vektors wurde mittels Sanger-Sequenzierung bestätigt.
Figure imgf000031_0002
Die fett markierten Bereiche bezeichnen die Zielsequenzen (Epitope) des variablen Teils der schweren Kette des BCR des Subsets 4, die für dessen autonom aktiven Zustand verantwortlich sind (vgl. SEQ ID NOS. 3 und 4) .
Figure imgf000031_0001
Hieran anschließende Untersuchungen an zunächst verworfenen Hybridomzelllinien führten zum überraschenden Auffinden des vorliegenden erfindungsgemäßen Bindemoleküls mit Spezifität für VL3-21 der leichten Kette des B-Zellrezeptors . Der jeweilige Überstand dieser Hybridomzelllinien zeigte eine Bindung an die TKO-Zelllinien gemäß Figur 1B, IC, und 1F. Der hierbei identifizierte spezifische monoklonale Antikörper gegen B-Zellrezeptoren mit dem Epitop VL3-21 wurde sequenziert. Dabei wurden die folgenden Aminosäurequenzen bestimmt, wobei die SEQ ID NO. 25 den variablen Teil der schweren Kette (HC), und die SEQ ID NO. 26 den variablen Teil der leichten Kette (LC) betreffen, und wobei die markierten Bereiche - in der angegebenen Reihenfolge - CDR 1, 2 und 3 bezeichnen.
Figure imgf000032_0001
Die mit CDR1, CDR2 und CDR3 korrespondierenden Teilsequenzen der schweren Kette gemäß SEQ ID NO. 25 sind in den SEQ ID NOS. 19 bis 21 angegeben, während die mit CDR1, CDR2 und CDR3 korrespondierenden Teilsequenzen der leichten Kette gemäß SEQ ID NO. 26 in den SEQ ID NOS. 22 bis 24 dargestellt sind.
Figure imgf000032_0002
SEQ ID NO. 24 (AVA-mAB02 CDR3 LC)
LQYDEFPRT
Beispiel 2
Unter Anwendung der erfindungsgemäßen Lehre wurde einem Patienten eine geringe Menge peripheres Blut entnommen. Für die Analyse wurden 100 mΐ Blut in ein Reaktionsgefäß überführt und mit 2 ml PBS-BSA Pufferlösung aufgefüllt. Anschließend wurde die Probe in einer Eppendorf Zentrifuge 5804 bei 1500 U/Min für eine Zeitdauer von fünf Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Sediment wurde gut durchgemischt. Anschließend wurde der Antikörper hinzugegeben. Gegen folgende Oberflächenparameter wurde gefärbt: 1) CD19-FITC, 2) CD5-PE, und 3) der VL3-21 spezifische Antikörper (APC) , bevor die Ansätze 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert wurden. Danach wurde die Lyse eingeleitet, und die Erythrozyten wurden lysiert. Wie zuvor schon beschrieben, wurde zwei mal mit PBS-BSA Pufferlösung gewaschen, und die Zellen wurden in 500 mΐ 0,1% PBS-BSA Pufferlösung aufgenommen und resuspendiert . Die Zellen wurden bis zur Messung am Durchflusszytometer bei 2-8 °C im Dunkeln aufbewahrt.
Die Analyse am FACS erfolgte auf einem BDCalibur. Die Einstellung der einzelnen Laser- und Detektionsparameter erfolgte nach Anweisung des Geräteherstellers und ist dem Fachmann hinreichend bekannt. Die Rohdaten der Analyse wurden anschließend mittels FlowJo-Analyse Software ausgewertet. Zunächst wurde die Lymphozytenpopulation im FSC/SSC-Blot ausgewählt und markiert. Für diese Auswahl wurde sich dann auf die CD19-positiven B-Zellen fokussiert und nach der Bindung des VL3-21 spezifischen Antikörpers hin analysiert. In Abbildung 2 ist exemplarisch eine solche Analyse am Beispiel der Verwendung des VL3-21 spezifischen Antikörpers dargestellt. In einem ersten Schritt wurden die CD19 positiven B-Zellen für die weitere Analyse ausgewählt (linkes Panel). Diese wurden dann auf die Bindung des spezifischen Antikörpers hin untersucht (rechtes Panel)
Beispiel 3
Der erfindungsgemäße Antikörper mit Spezifität für einen BCR mit VL3-21 wurde in einem Apharesesystem zur Abtrennung von Leukämiezellen aus einer Blutprobe eines Patienten verwendet.
Einem Patienten wurde peripheres Blut entnommen (EDTA Blut aus Blutentnahmeröhrchen) . Die Bestimmung die Lymphozytenzahl erfolgte mit einem Zellcounter und ergab 80.000 Lymphozyten/mΐ . Zur Bestimmung des „Tumorload", also der Belastung der Probe mit Tumorzellmaterial, wurde eine Immunphänotypisierung per FACS durchgeführt (mit dem CLL-Standard-Panel WHO- Tumorload) . Sekundär wurden diejenigen Zellen, die das CLL-Epitop tragen, mit dem erfindungsgemäßen Antikörper angefärbt, um nachzuweisen, dass die Zellen für dieses Epitop positiv sind. Anschließend wurden 500 mΐ dieses Blutes mit 5 x 108 MACS MicroBeads (Miltenyi Biotech) , die mit dem spezifischen Antikörper konjugiert waren, gemischt. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt, bevor das Blut über Miltenyi LS Säulen aufgearbeitet wurde. Hierbei verblieben die mit den Partikeln (Beads) konjugierten Lymphozyten auf der Säule, sodass aus der Säule als Durchfluss weitgehend von Lymphozyten befreites Blut gewonnen wurde. Nach zweifacher Aufreinigung über die Säulen (nach Vorschrift des Herstellers) konnte in einer FACS Messung eine Lymphozytenzahl von unter 5000 Lymphozyten/mΐ festgestellt werden. In einem Kontrollexperiment unter Verwendung von Blut eines CLL- Patienten ohne das Vorhandensein eines BCR mit VL3-21 auf den Leukämiezellen erbrachte diese Aufreinigung wie erwartet keine signifikante Reduktion der B-Zellen im Blut.

Claims

Patentansprüche
1. Biologisches Bindemolekül, welches selektiv an B-Zell Rezeptoren bindet, die durch das Vorhandensein einer leichten Kette mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 18 gekennzeichnet ist, nicht jedoch an B-Zell Rezeptoren ohne eine leichte Kette gemäß SEQ ID NO. 18.
2. Biologisches Bindemolekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment desselben ist.
3. Biologisches Bindemolekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines Fusionsproteins mit T-Zell spezifischen Aktivierungsdomänen vorliegt .
4. Biologisches Bindemolekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen zusätzlichen Bereich zum Isolieren oder Abtöten von B-Zell Neoplasien umfasst.
5. StoffZusammensetzung, welche ein biologisches Bindemolekül gemäß Definition in einem der Ansprüche 1 bis 4 für prophylaktische und/oder therapeutische Zwecke umfasst.
6. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich einen Antikörper oder ein funktionelles Fragment desselben gegen die leichte und/oder schwere Kette des B-Zell Rezeptors umfasst.
7. Verwendung des biologischen Bindemoleküls gemäß Definition in einem der Ansprüche 1 bis 4, oder der
Stoffzusammensetzung gemäß Definition in Anspruch 5 oder 6, für diagnostische, prophylaktische und/oder therapeutische Zwecke .
8. Verwendung nach Anspruch 7 zur Diagnose, Prophylaxe und/oder Therapie von malignen B-Zell Neoplasien.
9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8 im Rahmen einer Apharese oder CAR-T-Zell Immuntherapie.
10. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei der diagnostische
Zweck den Nachweis einer B-Zelle mit einem B-Zellrezeptor betrifft, der durch das Vorhandensein einer leichten Kette gemäß SEQ ID NO. 18 charakterisiert ist.
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