DE3883803T2 - Monoklonale Antikörper gegen melanoma-assoziierte Antigene, Hybridzellinien, die diese Antikörper produzieren, und ihre Verwendung. - Google Patents

Monoklonale Antikörper gegen melanoma-assoziierte Antigene, Hybridzellinien, die diese Antikörper produzieren, und ihre Verwendung.

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DE3883803T2 DE88102451T DE3883803T DE3883803T2 DE 3883803 T2 DE3883803 T2 DE 3883803T2 DE 88102451 T DE88102451 T DE 88102451T DE 3883803 T DE3883803 T DE 3883803T DE 3883803 T2 DE3883803 T2 DE 3883803T2
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Description

    Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung ist auf monoklonale Antikörper gegen Gangliosidantigene, die mit Melanomen assoziiert sind, Hybridzellinien zur Herstellung dieser Antikörper und Verfahren zur Verwendung dieser monoklonalen Antikörper gerichtet.
    • Beschreibung des Standes der Technik
  • Ganglioside sind eine Hauptklasse von kohlenhydratreichen Glycolipiden von extremer Größe und Komplexität. Ganglioside werden üblicherweise auf der äußeren Oberfläche von Zellmembranen, insbesondere bei Zellen des Nervensystems, gefunden. Es ist vorgeschlagen worden, daß Ganglioside als Membranrezeptoren für Wachstumsfaktoren, Hormone und Adhäsionsmoleküle wirken. In den letzten Jahren hat die mögliche Rolle von Gangliosiden als Tumormarker erhebliche Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Als Folge davon haben Forscher monoklonale Antikörper hergestellt, die spezifisch mit Gangliosiden auf der Oberfläche von menschlichen Melanomen (Cheresh et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Bd. 82 (1985), S. 5155; Cheresh et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Bd. 81 (1984), S. 5767; Pukel et al., Journal of Experimental Medicine, Bd. 155 (1982), S. 1133; Cheresh et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 259 (1984), S. 7453), Neuroblastomen (Schulz et al., Cancer Research, Bd. 44 (1984), S. 5914) und Colonkarzinomen (Koprowski et al., Somatic Cell Genetics, Bd. 5 (1979), S. 957-972) reagieren. Mehrere neuere Untersuchungen sind auf das Gangliosidantigen GD3 gerichtet, bei dem es sich um ein mögliches Ziel für eine Immuntherapie von menschlichen Melanomen handelt (Hellstrom et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Bd. 82 (1985), S. 1499). Vorhergehende Untersuchungen haben das Gangliosidantigen GD2 als weiteres mit Melanomen assoziiertes Antigen identifiziert.
  • Obwohl Gangliosidantigene im Gewebe des zentralen Nervensystems vorhanden sind, ist GD2 in Melanomen, Hirntumoren, Neuroblastomen, Kleinzellkarzinomen der Lunge und anderen Tumoren neuroectodermalen Ursprungs stark angereichert. Untersuchungen zur Entwicklung dieser Gangliosidantigene zeigen, daß GD3 eine Vorstufe von GD2 ist und daß die Verteilung von GD2 und GD3 in verschiedenen Melanomen abhängig von der Schwere der Erkrankung variiert. Im allgemeinen tritt das Gangliosidantigen GD2 hauptsächlich in fortgeschrittenen primären und metastatischen Melanomen und selten in normalen Geweben auf.
  • Honsik et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Bd. 83 (1986), S. 7893) beschreiben zwei gegen GD2 bzw. GD3 gerichtete monoklonale Antikörper. Diese Antikörper werden zusammen mit IL-2-stimulierten Effektorzellen zur Lyse menschlicher Melanom- und Neuroblastom- Zellen verwendet.
  • Aus WO 86/00909 ist ein Antikörper-bildendes Hybridom bekannt, das mit GD2 reagierende Antikörper bildet, die zur Diagnose von GD2 tragenden Tumoren verwendet werden.
  • Ein spezifisch mit GD3 reagierender monoklonaler Antikörper (AbR&sub2;&sub4;) wird in EP-A 0 091 005 beschrieben, wobei dieser Antikörper zur Tumordiagnose verwendet wird.
  • Keiner der vorstehenden Antikörper reagiert jedoch mit beiden Gangliosidantigenen GD2 und GD3.
  • Gegenwärtig besteht die Methode der Wahl zur Behandlung von Melanomen und anderen, die Gangliosidantigene GD2 und GD3 tragenden Tumoren in einem Ausschneiden des betroffenen malignen Gewebes. Allerdings macht bei fortgeschrittenen Stadien das damit verbundene tiefe Eindringen des Tumors in das Gewebe diesen Ansatz sehr schwierig, und zwar aufgrund des verstärkten chirurgischen Traumas und der Menge an Gewebe, die ausgeschnitten werden muß. Da die Überlebensrate bei malignen Melanomen in einer inversen Beziehung zum Grad des Eindringens in das Gastgewebe steht, hat die gegenwärtige klinische Strategie keine andere Wahl, als chirurgische Verfahren anzuwenden. Bei fortgeschrittenen Stadien führt die verstärkte Ausbreitung des Tumors jedoch zu einer Situation, in der der Erfolg eines chirurgischen Ausschneidens weit weniger wahrscheinlich ist. Folglich führt dies zu einer wesentlich verschlechterten Prognose für Patienten mit fortgeschrittenen bösartigen Tumoren.
    • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen monoklonalen Antikörper bereitzustellen, der zur Reaktion sowohl mit GD2 als auch mit GD3 fähig ist, und zwar zum Zweck einer wirksamen Diagnose und Therapie neoplastischer Erkrankungen, bei denen diese Antigene exprimiert werden.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, monoklonale Antikörper bereitzustellen, die zur Reaktion mit beiden Gangliosidantigenen GD2 und GD3 fähig sind, die aber eine wesentlich größere Reaktivität gegenüber GD2 als gegenüber GD3 zeigen und die im wesentlichen keine Reaktivität mit anderen Gangliosidantigenen, wie GQ 1b zeigen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verfahren zur in vitro- und in vivo-Diagnose maligner Tumoren unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die mit den Gangliosidantigenen GD2 und GD3 reagieren, bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verfahren zur Unterdrückung einer malignen Erkrankung in einem Tier unter Verwendung unmarkierter oder therapeutisch markierter monoklonaler Antikörper, die mit den Gangliosidantigenen GD2 und GD3 reagieren, bereitzustellen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft also neue monoklonale Antikörper, die spezifisch für die Gangliosidantigene GD2 und GD3 sind, die aber im wesentlichen gegenüber anderen Gangliosidantigenen, wie GQ 1b, nicht reaktiv sind. Die Erfindung umfaßt ferner Hybridzellinien, die diese Antikörper bilden, sowie Methoden zur Verwendung und Verfahren zur Herstellung dieser monoklonalen Antikörper.
  • Die Fähigkeit, mit beiden Gangliosiden zu reagieren, während sie gleichzeitig im wesentlichen gegenüber Gangliosiden, wie GQ 1b, die in normalen Fibroblasten vorkommen, nicht reaktiv sind, ist sehr wesentlich im Hinblick auf den Nachweis dieser Antigene und die immuntherapeutische Verwendung dieser monoklonalen Antikörper. Da Tumoren im Hinblick auf die Expression von GD2 und GD3 variieren, d. h. einige Tumoren nur das eine oder das andere dieser Gangliosidantigene exprimieren, während andere Tumoren beide exprimieren, ist die Fähigkeit, mit beiden Antigenen zu reagieren, von offensichtlicher klinischer Bedeutung. Andererseits ist die Tatsache, daß die monoklonalen Antikörper gemäß einer Ausführungsform der Erfindung bevorzugt gegenüber dem Gangliosidantigen GD2 reaktiv sind, wichtig, da GD2, im Gegensatz zu GD3, das auch in der normalen Haut vorkommt, wesentlich weniger häufig in normalem Gewebe gefunden wird. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper zeigen also einen Grad an Spezifität für maligne Gewebe, der bisher nicht beobachtet wurde.
    • Beschreibung der Zeichnung
  • Fig. 1. Graph, der die Reaktivität der monoklonalen Antikörper ME 361-S2a (ATCC HB 9326) und ME 361 (ATCC HB 9325) gegenüber Gangliosidantigenen in einer Verdünnungsreihe zeigt.
  • Gefüllte Kreise und Quadrate zeigen GD2- bzw. GD3-Ganglioside, die mit dem monoklonalen Antikörper vom IgG2a (ME 361-S2a)-Isotyp nachgewiesen wurden, und offene Kreise und Quadrate zeigen Ganglioside, die mit dem IgG3 (ME 361)-Isotyp nachgewiesen wurden. Das gefüllte Dreieck zeigt die Reaktivität gegenüber den Gangliosiden GM4, GM3, GM2, GM1, GD1a, GD1b, GT1a, GQ1b und Disialoparaglobosid (III²(NeuAc)&sub2;nLc&sub4;Cer), wie sie mit beiden Isotypen IgG2a und IgG3 nachgewiesen wurden.
    • Fig. 2.
  • (A) Dünnschichtchromatogramm von Gesamtgangliosidfraktionen aus Wistar-Melanom-Zellkulturen (WM-Zellkulturen): (1) WM 75, (2) WM 373, (3) WM 115, (4) WM 266-4, (5) WM 239-A, (6) WM 165-1, (7) WM 278, (8) WM 46, (9) WM 164, (10) WM 9 und (11) SK MEL 23.
  • (B) 20 Stunden entwickeltes Autoradiogramm der gleichen Fraktionen wie in (A).
  • (C) 20 Stunden entwickeltes Autoradiogramm der gleichen Fraktionen wie in (A), die mit 0,1 m KOH in Methanol behandelt wurden. Alle Fraktionen wurden, bezogen auf den Proteingehalt der extrahierten Zellen, verdünnt, und entsprechen ungefähr 50 ug Gangliosid/Spur.
  • Fig. 3. Diagramm, das die Bindung des monoklonalen Antikörpers ME 361 des gamma-3-Isotyps (ME 361) an serumfreie Kulturüberstände der angegebenen Zelltypen zeigt. Die Zellkulturen wurden gemäß der Art der krankhaften Veränderung, aus der sie stammten, in Gruppen eingeteilt: Melanom in radialer Wachstumsphase (RGP), Melanom in vertikaler Wachstumsphase (VGP) und metastatisches Melanom (MET).
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper mit einer Spezifität für Antigene, die Melanome sowie andere Tumoren, z. B. Hirntumoren, Neuroblastome, Kleinzellkarzinome der Lunge und im allgemeinen beliebige Tumore neuroectodermalen Ursprungs anzeigen. Diese monoklonalen Antikörper sind sowohl in vitro als auch in vivo zum immunologischen Nachweis von Gangliosidantigenen, die üblicherweise mit diesen Tumoren assoziiert sind, und zur Immuntherapie von Tumoren, die diese Gangliosidantigene tragen, sehr gut geeignet.
  • Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von Hybridomen, die monoklonale Antikörper absondern, ist dem Durchschnittsfachmann bekannt. Zur Erläuterung der in der vorliegenden Erfindung angewandten Techniken können die in Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Bd. 75 (1978), S. 3405 und die von Koprowski im US-Patent 4 172 124 mit dem Titel "Method of Producing Tumor Antibodies" beschriebenen Techniken genannt werden.
  • Kurz zusammengefaßt wurden BALB/c-Mäuse mit gezüchteten metastatischen Melanomzellen (SK MEL 23) immunisiert, und die Immunisierung wurde später mit der gleichen Zellinie aufgefrischt. Nach 3 Tagen wurden die Tiere getötet, und die Milzzellen wurden mit der 653-Variante des Mäusemyeloms P3X63 Ag8 verschmolzen. Die erhaltenen Hybridome wurden auf die Bildung monoklonaler Antikörper abgesucht und auf Spezifität unter Verwendung verschiedener Melanom- und Krebszellkulturen getestet. Außerdem wurde eine Class-switch-Variante nach bekannten Techniken (Steplewski et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Bd. 82 (1985), S. 8653) hergestellt und isoliert.
  • Die Isolierung weiterer Hybridome, die monoklonale Antikörper mit der Spezifität der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper absondern, kann von einem Durchschnittsfachmann gemäß der Technik des anti-idiotypen Absuchens (Potocnjak et al., Science, Bd. 215 (1982), S. 1637) durchgeführt werden. Kurz zusammengefaßt handelt es sich bei einem anti-idiotypen Antikörper um einen Antikörper, der einzigartige Determinanten erkennt, die auf dem von dem untersuchten Hybridom gebildeten Antikörper vorhanden sind. Der anti-idiotype Antikörper wird durch Immunisierung eines Tiers, wie es als Quelle für den monoklonalen Antikörper verwendet wurde, mit dem untersuchten monoklonalen Antikörper hergestellt. Das immunisierte Tier erkennt die idiotypen Determinanten des immunisierenden Antikörpers und reagiert darauf durch Bildung eines Antikörpers gegen diese idiotypen Determinanten. Unter Verwendung der Antikörper des zweiten Tiers, die spezifisch für die von einem einzelnen Hybridom gebildeten monoklonalen Antikörper sind, ist es nun möglich, andere Klone mit genau dem gleichen Idiotyp wie der des zur Immunisierung verwendeten Antikörpers des Hybridoms zu identifizieren. Idiotype Identität zwischen monoklonalen Antikörpern von zwei Hybridomen zeigt, daß die beiden monoklonalen Antikörper im Hinblick auf die Erkennung der gleichen epitopen Determinante die gleichen sind. Unter Verwendung von Antikörpern gegen die epitopen Determinanten auf einem monoklonalen Antikörper ist es also möglich, andere Hybridome zu identifizieren, die monoklonale Antikörper der gleichen Epitopspezifität exprimieren. Bei Antikörpern sind diese idiotypen Determinanten in der hypervariablen Region vorhanden, die an ein gegebenes Epitop bindet.
  • Die vorliegende Erfindung ist auf monoklonale Antikörper und Hybridome, die diese bilden, gerichtet, wobei die Antikörper in bezug auf die Gangliosidantigene GD2 und GD3 reaktiv sind und in bezug auf andere Gangliosidantigene im wesentlichen nicht reaktiv sind. Es kann einfach bestimmt werden, ob ein monoklonaler Antikörper die erforderliche Spezifität aufweist, indem ein Antigen bindender Immunoassay, wie ELISA und RIA, die im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben sind, durchgeführt wird.
  • Alternativ dazu liegt es nun, da die Erfinder den Epitopteil, mit dem die monoklonalen Antikörper mit der Spezifität der monoklonalen Antikörper der Erfindung reagieren, charakterisiert haben, im Bereich des Durchschnittskönnens, mehr Hybridome herzustellen, die monoklonale Antikörper mit identischer Epitopspezifität absondern. Der Saccharidanteil des gereinigten GD2-Gangliosids, der an die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper bindet, kann aus dem Hauptanteil von GD2 durch Techniken, wie Ozonolyse (Sabesan et al., Canadian Journal of Chemistry, Bd. 62 (1984), S. 1034), oder durch spezifische enzymatische Hydrolyse mit Endoglyceroceramidase (Ito et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 261 (1986), S. 14278) isoliert werden. So können weitere Hybridome, die monoklonale Antikörper mit der Spezifität der monoklonalen Antikörper, die von den Zellinien ME 361 (ATCC HB 9325) und ME 361-S2a (ATCC HB 9326) gebildet werden, absondern, hergestellt werden, z. B. durch Kupplung dieses Epitops an ein inertes oder immunogenes Trägermolekül, wie KLH, um das Epitop in immunogener Form zu präsentieren (Hudson und Hay, Practical Immunology, S. 5-8, Blackwell Scientific Publications, 1980). Auf diese Weise können Tiere zuerst mit ganzen malignen Zellen zur anfänglichen Sensibilisierung immunisiert werden, und anschließend können sie mit dem Epitopkonjugat oder dem gereinigten Antigen allein in einer Auffrischungsimmunisierung immunisiert werden, um das Wachstum bevorzugter B-Zellklone zu stimulieren. Durch dieses Vorgehen ist es möglich, das Repertoire an ansprechenden B-Zellklonen, die für die Hybridomverschmelzung vorliegen, stark zu beschränken und dabei übermäßige Versuche zur Isolierung von Hybridomen mit der gewünschten Spezifität zu vermeiden. Nach der Verschmelzung werden die Hybridome unter Verwendung des Epitops und des freien Trägers abgesucht, um diejenigen Klone zu selektieren, die monoklonale Antikörper bilden, die für dieses Epitop spezifisch sind.
  • Während die Verwendung eines fremden monoklonalen Donor-Antikörpers einer Spezies in einer zweiten aufnehmenden Spezies normalerweise bei der in vivo-Immuntherapie oder Immundiagnostik nicht zu Problemen führt, besteht eine mögliche Schwierigkeit, die sich ergeben kann, im Auftreten einer ungünstigen immunologischen Antwort des Wirts auf die antigenen Determinanten, die auf dem Donor-Antikörper vorhanden sind. In einigen Fällen kann diese ungünstige Antwort so ernsthaft sein, daß sie die in vivo- Anwendung des Donor-Antikörpers in dem Wirt einschränkt. Ferner kann die ungünstige Antwort des Wirts dazu führen, daß die Wirksamkeit des Donor- Antikörpers hinsichtlich der Unterdrückung des malignen Tumors beeinträchtigt wird. Ein Weg, durch den es möglich ist, die Wahrscheinlichkeit einer ungünstigen Immunantwort, die im Wirt auftritt, zu umgehen, besteht in der Verwendung schimärer Antikörper (Sun et al., HYBRIDOMA, Bd. 5 (Supplement l), (1986), 517; Oi et al., Bio Techniques, Bd. 4 (3), (1986), S. 214). Schimäre Antikörper sind Antikörper, bei denen die verschiedenen Domänen der schweren und leichten Ketten des Antikörpers durch DNA von mehr als einer Spezies codiert werden. Typischerweise umfaßt ein schimärer Antikörper die variablen Domänen der schweren (VH) und leichten (VL) Ketten, die aus der den Antikörper der gewünschten antigenen Spezifität bildenden Donor-Spezies stammen, und die konstanten Antikörperdomänen der schweren (CH) und leichten (CL) Ketten, die aus der aufnehmenden Wirtsspezies stammen. Man nimmt an, daß dadurch, daß das Immunsystem des Wirts in einem verringerten Maß den antigenen Determinanten der Donor-Antikörperdomänen ausgesetzt wird, die Möglichkeit einer ungünstigen immunologischen Antwort, die in der aufnehmenden Spezies auftritt, verringert wird. So ist es z. B. möglich, einen schimären Antikörper zur klinischen in vivo-Anwendung beim Menschen herzustellen, der die VH- und VL-Domänen aus Mäusen, für die aus ME 361 (ATCC HB 9325) oder ME 361-S2a (ATCC HB 9326) isolierte DNA codiert, und die CH- und CL-Domänen, für die aus menschlichen Zellen isolierte DNA codiert, umfaßt.
  • Unter bestimmten Umständen können monoklonale Antikörper eines Isotyps stärker bevorzugt sein als die eines anderen Isotyps, und zwar im Hinblick auf ihre diagnostische oder therapeutische Wirksamkeit. Z.B. ist bekannt, daß monoklonale Mäuse-Antikörper der Isotypen gamma-2a und gamma-3 im Hinblick auf eine Hemmung des Tumorwachstums wirksamer sind als die des Isotyps gamma-1. Man nimmt an, daß diese unterschiedliche Wirksamkeit ihre Ursache in der Fähigkeit der Isotypen gamma-2a und gamma-3, aktiver an der zytolytischen Zerstörung der Tumorzellen teilzunehmen, hat. Spezielle Isotypen eines monoklonalen Antikörpers können entweder direkt durch Selektion ausgehend von der anfänglichen Hybridomverschmelzung hergestellt werden, oder sie können sekundär ausgehend von einem Elternhybridom, das einen monoklonalen Antikörper eines anderen Isotyps absondert, unter Verwendung der Sippen-Selektionstechnik, um Class-switch-Varianten zu isolieren, hergestellt werden (Steplewski et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Bd. 82 (1985), S. 8653; Spira et al., Journal of Immunological Methods, Bd. 74 (1984), S. 307). Die monoklonalen Antikörper der Erfindung umfassen also Classswitch-Varianten mit der gleichen Spezifität wie der monoklonale Antikörper ME 361, der von ATCC HB 9325 gebildet wird, oder ME 361-S2a, der von ATCC HB 9326 gebildet wird.
  • Die erfindungsgemäßen monoklonalen und schimären Antikörper können bei einem beliebigen Tier verwendet werden, bei dem es wünschenswert ist, eine in vitro- oder in vivo-Immundiagnose oder Immuntherapie durchzuführen. Der Ausdruck "Tier" umfaßt hier sowohl Menschen als auch Nicht-Menschen.
  • Der Ausdruck "Antikörper" umfaßt in dieser Anmeldung intakte Moleküle sowie Fragmente davon, z. B. Fab und F(ab')&sub2;, die zur Bindung der epitopen Determinante fähig sind.
  • Der Ausdruck "im wesentlichen nicht reaktiv" bedeutet, wenn er zur Charakterisierung der Reaktivität zwischen den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern und einem Antigen verwendet wird, daß eine beliebige Reaktion, die auftreten kann, nicht signifikant im Hinblick auf eine Beschränkung der diagnostischen oder therapeutischen Anwendbarkeit der Antikörper ist.
  • Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind insbesondere zur Verwendung bei Immunoassays geeignet, wobei sie in einer flüssigen Phase oder gebunden an einen festen Träger verwendet werden können. Außerdem können die monoklonalen Antikörper dieser Immunoassays auf verschiedene Weise nachweisbar markiert werden. Beispiele für Arten von Immunoassays, bei denen die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper verwendet werden können, sind kompetitive und nicht-kompetitive Immunoassays entweder in einem direkten oder in einem indirekten Format. Beispiele üblicher Immunoassays sind der Radioimmunoassay (RIA) und der Sandwich-Assay (immunometrischer Assay). Der Nachweis von Antigenen unter Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper kann durch Anwendung von Immunoassays, die entweder im Vorwärtsmodus, im Rückwärtsmodus oder im Simultanmodus durchgeführt werden, unter Einschluß von immunhistochemischen Assays auf physiologische Proben durchgeführt werden.
  • Es gibt viele Träger, an die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gebunden werden können und die zum Nachweis von mit Melanomen assoziierten Antigenen verwendet werden können. Bekannte Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylosen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Die Beschaffenheit des Trägers kann für die Zwecke der Erfindung entweder löslich oder unlöslich sein. Dem Fachmann sind weitere geeignete Träger zur Bindung monoklonaler Antikörper bekannt, oder er kann solche durch Routineversuche ermitteln.
  • Es gibt viele verschiedene Markierungen und Verfahren zum Markieren, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Beispiele von Arten von Markierungen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, umfassen Enzyme, Radioisotope, fluoreszierende Verbindungen, chemolumineszierende Verbindungen und biolumineszierende Verbindungen. Der Durchschnittsfachmann kennt weitere geeignete Markierungen zur Bindung des monoklonalen Antikörpers, oder er ist in der Lage, derartige Markierungen durch Routineversuche zu ermitteln. Darüber hinaus kann die Bindung dieser Markierungen an den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gemäß Standardtechniken, mit denen ein Durchschnittsfachmann vertraut ist, durchgeführt werden.
  • Für die Zwecke der Erfindung kann das mit Melanomen assoziierte Antigen, das durch die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper nachgewiesen wird, in biologischen Flüssigkeiten oder Geweben vorhanden sein. Beliebige Proben, die eine nachweisbare Menge des mit Melanomen assoziierten Antigens enthalten, können verwendet werden. Normalerweise handelt es sich bei der Probe um eine Flüssigkeit, wie Urin, Speichel, Cerebrospinalflüssigkeit, Blut, Serum und dergl., oder einen Feststoff oder Halbfeststoff, wie Gewebe, Kot und dergl.
  • Eine weitere Technik, die auch zu einer größeren Empfindlichkeit führen kann, besteht in der Kupplung der Antikörper an Haptene mit geringem Molekulargewicht. Diese Haptene können dann spezifisch mittels einer zweiten Reaktion nachgewiesen werden. Z.B. ist es üblich, Haptene, wie Biotin, das mit Avidin reagiert, oder Dinitrophenyl, Pyridoxal und Fluoreszein, die mit spezifischen Antihaptenantikörpern reagieren können, zu verwenden.
  • In dieser Anmeldung umfaßt der Ausdruck "Epitop" beliebige Determinanten, die zu einer spezifischen Wechselwirkung mit den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern fähig sind. Epitope Determinanten bestehen üblicherweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppen von Molekülen, wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, und sie weisen üblicherweise spezielle dreidimensionale Strukturmerkmale sowie spezielle Ladungsmerkmale auf.
  • Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper für den in vivo-Nachweis eines Antigens wird der nachweisbar markierte monoklonale Antikörper in einer Dosis verabreicht, die diagnostisch wirksam ist. Der Ausdruck "diagnostisch wirksam" bedeutet, daß der nachweisbar markierte monoklonale Antikörper in einer ausreichenden Menge verabreicht wird, um den Nachweis der Stelle, die die Gangliosidantigene, für die die monoklonalen Antikörper spezifisch sind, aufweist, zu ermöglichen. Die Konzentration des nachweisbar markierten monoklonalen Antikörpers, die verabreicht wird, sollte ausreichend sein, so daß die Bindung an die Tumorstelle im Vergleich zum Hintergrundsignal nachweisbar ist. Ferner ist es wünschenswert, daß der nachweisbar markierte monoklonale Antikörper rasch aus dem Kreislaufsystem entfernt wird, um das bestmögliche Tumor- Hintergrund-Signalverhältnis zu ergeben.
  • In der Regel variiert die Dosierung des nachweisbar markierten monoklonalen Antikörpers zur Diagnose abhängig von Faktoren, wie Alter, Geschlecht und Ausmaß der Erkrankung des Einzelnen. Die Dosierung des monoklonalen Antikörpers kann von 0,01 mg/kg bis 2000 mg/kg und vorzugsweise von 0,1 mg/kg bis 1000 mg/kg variieren.
  • Für die diagnostische in vivo-Bildgebung ist die Art des verfügbaren Nachweisinstruments der Hauptfaktor für die Auswahl eines gegebenen Radioisotops. Das gewählte Radioisotop muß eine Art von Abfall aufweisen, der mit einer gegebenen Art von Instrument nachweisbar ist. Ein weiterer wichtiger Faktor für die Auswahl eines Radioisotops zur in vivo-Diagnose besteht darin, daß die Halbwertszeit des Radioisotops lang genug sein muß, so daß es zum Zeitpunkt der maximalen Aufnahme durch das Ziel noch nachweisbar ist, aber kurz genug, so daß eine schädliche Bestrahlung in bezug auf den Wirt minimiert wird. Idealerweise weist ein Radioisotop für die in vivo-Bildgebung keine Teilchenemission auf, erzeugt aber eine große Zahl von Photonen im Bereich von 140 bis 250 keV, die durch herkömmliche Gammakameras leicht nachgewiesen werden können.
  • Zur in vivo-Diagnose können Radioisotope an das Immunglobulin entweder direkt oder indirekt unter Verwendung einer vermittelnden funktionellen Gruppe gebunden werden. Vermittelnde funktionelle Gruppen, die oft zur Bindung von Radioisotopen, die als Metallionen vorliegen, an Immunglobuline verwendet werden, sind die bifunktionellen Chelatbildner Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).
  • Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können zum Zweck der in vivo-Diagnose, wie der magnetischen Resonanzbildgebung (MRI) oder der Elektronenspinresonanz (ESR), auch mit paramagnetischen Isotopen markiert werden. Im allgemeinen können beliebige herkömmliche Verfahren zur bildgebenden Diagnostik verwendet werden. Üblicherweise werden Gammastrahlen oder Positronen emittierende Radioisotope für die Kamerabildgebung und paramagnetische Isotope für NMR verwendet.
  • Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können verwendet werden, um den Verlauf einer malignen Erkrankung in einem Individuum zu überwachen. So wäre es durch Messung der Zunahme oder Verringerung der Größe oder Anzahl der malignen Stellen oder der Änderungen der Konzentration des in verschiedene Körperflüssigkeiten abgegebenen Antigens möglich, zu bestimmen, ob eine bestimmte Therapie, mit der der maligne Zustand gebessert werden soll, wirksam ist.
  • Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können auch allein oder in Kombination mit Effektorzellen (Douillard et al., Hybridoma, Bd. 5 (Supp. 1) (1986), 5139) zur Immuntherapie eines Tiers mit einem Tumor, der mit dem malignen Zustand assoziierte Ganglioside mit Epitopen, die mit den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern reagieren, exprimiert, verwendet werden. Wenn die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper zur Immuntherapie verwendet werden, dann können sie unmarkiert oder mit einem therapeutischen Mittel markiert sein. Diese Mittel können entweder direkt oder indirekt an die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gekuppelt sein. Ein Beispiel für eine indirekte Kupplung besteht in der Verwendung einer Abstandshalter-Gruppe. Diese Abstandshalter-Gruppen können wiederum entweder unlöslich oder löslich sein (Diener et al., Science, Bd. 231 (1986), S. 148), und sie können so ausgewählt werden, daß sie die Freisetzung eines Arzneistoffs von dem monoklonalen Antikörpermolekül an der Zielstelle ermöglichen. Beispiele für therapeutische Mittel, die mit den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern zur Immuntherapie gekuppelt werden können, sind Arzneistoffe, Radioisotope, Immunmodulatoren, Lectine und Toxine.
  • Die Arzneistoffe, die mit den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern konjugiert werden können, umfassen nicht-proteinartige sowie proteinartige Arzneistoffe. Der Ausdruck "nicht-proteinartige Arzneistoffe" umfaßt Verbindungen, die klassisch als Arzneistoffe bezeichnet werden, z. B. Mitomycin C, Daunorubicin und Vinblastin.
  • Die proteinartigen Arzneistoffe, mit denen die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper markiert werden können, umfassen Immunmodulatoren und andere, die biologische Antwort modifizierende Mittel. Der Ausdruck "biologische Antwort modifizierende Mittel" umfaßt Substanzen, die an einer Modifizierung der Immunantwort in einer solchen Weise, daß die Zerstörung der die Ganglioside tragenden Tumoren, gegen die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper spezifisch sind, verstärkt wird, teilnehmen. Beispiele für die die Immunantwort modifizierende Mittel umfassen Verbindungen, wie Lymphokine. Beispiele für Lymphokine umfassen Tumornekrosefaktor, Interleukine 1, 2 und 3, Lymphotoxin, Makrophagen-aktivierenden Faktor, migrationshemmenden Faktor, Kolonie-stimulierenden Faktor und Interferon. Interferone, mit denen die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper markiert werden können, umfassen alpha-Interferon, beta-Interferon und gamma-Interferon sowie ihre Subtypen.
  • Bei der Verwendung erfindungsgemäßer monoklonalen Antikörper, die mit Radioisotopen konjugiert sind, zur Immuntherapie sind bestimmte Isotope stärker bevorzugt als andere, und zwar abhängig von Faktoren, wie der Tumorverteilung und -masse sowie der Stabilität und Emission des Isotops. Gegebenenfalls können die Tumorverteilung und -masse durch die vorstehend beschriebenen in vivo-Diagnosetechniken bewertet werden. Abhängig von der Art der malignen Erkrankung sind einige Emitter gegenüber anderen bevorzugt. Im allgemeinen sind α- und β-Teilchen emittierende Radioisotope bei der Immuntherapie bevorzugt. Wenn z. B. ein Tier einen festen Tumorherd aufweist, dann ist ein hochenergetischer beta-Emitter, der zur Durchdringung mehrerer Millimeter Gewebe in der Lage ist, wie &sup9;&sup0;Y, bevorzugt. Wenn andererseits die maligne Erkrankung aus einzelnen Zielzellen besteht, wie im Fall von Leukämie, dann ist ein hochenergetischer alpha-Emitter mit kurzer Reichweite, wie ²¹²Bi, bevorzugt. Beispiele für Radioisotope, die für therapeutische Zwecke an die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gebunden werden können, sind ¹²&sup5;I, ¹³¹I, &sup9;&sup0;Y, &sup6;&sup7;Cu, ²¹²Bi, ²¹¹At, ²¹²Pb, &sup4;&sup7;Sc, ¹&sup0;&sup9;Pd und ¹&sup8;&sup8;Re.
  • Lectine sind Proteine, die üblicherweise aus Pflanzenmaterial isoliert werden und spezifisch an Zuckergruppen binden. Viele Lectine sind auch zur Agglutinierung von Zellen und zur Stimulierung von Lymphozyten fähig. Ricin ist ein toxisches Lectin, das immuntherapeutisch verwendet wird. Dies wird durchgeführt, indem die α-Peptidkette von Ricin, die für die toxische Wirkung verantwortlich ist, an das Antikörpermolekül gebunden wird, um eine ortsspezifische Ausübung der toxischen Wirkung zu ermöglichen.
  • Toxine sind giftige Substanzen, die von Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen gebildet werden und in ausreichender Dosis oft letal sind. Das Diphterietoxin ist eine Substanz, die von Corynebacterium diphtheriae gebildet wird und in dieser Weise verwendet werden kann. Das Toxin besteht aus einer α- und einer β-Untereinheit, die unter geeigneten Bedingungen getrennt werden können. Die toxische A-Komponente kann an einen Antikörper gebunden und für die gerichtete Freisetzung an einen Tumor, der die Gangliosidantigene, für die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper spezifisch sind, exprimiert, verwendet werden.
  • Weitere therapeutische Mittel, die an die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gekuppelt werden können, sind dem Durchschnittsfachmann bekannt oder können von ihm leicht ermittelt werden.
  • Es ist auch möglich, Liposomen mit den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern in ihrer Membran zu verwenden, um spezifisch das Liposom im Bereich des die Gangliosidantigene GD2 oder GD3 exprimierenden Tumors abzugeben. Diese Liposomen können so hergestellt werden, daß sie zusätzlich zu dem monoklonalen Antikörper immuntherapeutische Mittel, wie sie vorstehend beschrieben wurden, enthalten, die dann an der Tumorstelle freigesetzt werden (Wolff et al., Biochemica et Biophysica Acta, Bd. 802 (1984), S. 259).
  • Die Dosierungen zur Verabreichung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind groß genug, um die erwünschte Wirkung hervorzubringen, so daß die Symptome des die Ganglioside exprimierenden Tumors gelindert werden. Die Dosierung sollte jedoch nicht so groß sein, daß sie unerwünschte Nebenwirkungen, wie unerwünschte Kreuzreaktionen, anaphylaktischer Reaktionen und dergl., hervorruft. Im allgemeinen variiert die Dosierung mit dem Alter, dem Zustand, dem Geschlecht und dem Ausmaß der Erkrankung des Patienten und kann von einem Fachmann bestimmt werden. Die Dosierung kann vom einzelnen Arzt abhängig von irgendwelchen Gegenanzeigen, der Immuntoleranz oder ähnlichen Bedingungen eingestellt werden. Die Dosierung kann von 0,01 bis 2000 mg/kg/Dosis in einer oder mehreren täglich verabreichten Dosen für ein oder mehrere Tage variieren. Die Antikörper können parenteral durch Injektion oder allmählich durch Perfusion über die Zeit verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intracavitär oder transdermal allein oder in Kombination mit Effektorzellen verabreicht werden.
  • Zubereitungen für die parenterale Verabreichung umfassen sterile wäßrige und nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wäßrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Wäßrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wäßrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen unter Einschluß von Kochsalzlösung und gepufferten Medien. Parenterale Träger umfassen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, mit Lactat versetzte Ringer- Lösung oder nicht-flüssige Öle. Intravenöse Träger umfassen Flüssigkeits- und Nährstoffersatz, Elektrolytersatz, z. B. auf der Basis von Ringer-Dextrose, und dergl. Konservierungsmittel und andere Additive, wie antimikrobielle Mittel, Antioxidationsmittel, chelatisierende Mittel, inerte Gase und dergl., können ebenfalls vorhanden sein.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper umfaßt, wobei das Medikament zur Therapie von Tumoren, die die mit den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern reagierenden Gangliosidantigene exprimieren, umfaßt.
  • Monoklonale Antikörper können erfindungsgemäß verwendet werden. Me 361 wird aus einem Antikörper erhalten oder hat die identifizierenden Merkmale von einem Antikörper, wobei der Antikörper aus einer Zellinie mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 9325 erhalten wird. Me 361-S2a wird aus einem Antikörper erhalten oder hat die identifizierenden Merkmale von einem Antikörper, wobei der Antikörper aus der Zellinie mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 9326 erhalten wird. Diese Zellinien wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, Maryland, vor dem 19. Februar 1987 für 30 Jahre hinterlegt.
  • Die vorstehende Offenbarung beschreibt allgemein die vorliegende Erfindung. Ein weitergehendes Verständnis ist mit Bezug auf die nachstehenden speziellen Beispiele möglich, die ausschließlich zur Erläuterung vorgelegt werden und den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken sollen.
    • Beispiel 1 Herstellung von Hybridomzellinien, die monoklonale Antikörper gegen mit Melanomen assoziierte Antigene bilden A. Gewebe und Zellen
  • Ursprung und Erhaltung des größten Teils der Melanomzellkulturen und anderer Zellinien sind beschrieben worden (Herlyn et al., Journal of the National Cancer Institute, Bd. 74 (1985), S. 283; Herlyn et al., Cancer Investigation, Bd. 1 (1983), S. 215; Clark et al., Human Pathology, Bd. 15 (1985), S. 1147). Ursprung und Gangliosidgehalt der verwendeten Zellkulturen sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Ursprung sowie GD2- und GD3-Gehalt ausgewählter Melanomzellkulturen Patienten primär (VGP) metastatisch (MET)
  • Gewebe wurden, wie von Thurin et al. (Journal of Biological Chemistry, Bd. 260 (1985), S. 14556) beschrieben, erhalten und präpariert. Lymphozyten und Monozyten wurden aus heparinisiertem menschlichem peripherem Blut durch Zentrifugation auf einem Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten erhalten, wonach eine Abtrennung anhaftender Zellen (Monozyten) und nicht-anhaftender Zellen (Lymphozyten) unter Verwendung von Plasma-Gelatine-überzogenen Flocken durchgeführt, wie von Steplewski et al. (Science, Bd. 221 (1983), S. 865) beschrieben. Natürliche Killerzellen wurden aus den Monozytenzubereitungen durch Behandlung mit einem monoklonalen Anti-Mensch-Leu-11b-Antikörper (Becton und Dickinson, Mountain View, CA) unter Anwendung einer Konzentration von 0,5 ug/ml und Kaninchenkomplement entfernt.
    • B. Immunisierung und Herstellung von Hybridomen
  • BALB/c-Mäuse wurden intraperitoneal mit 3x10&sup7; Zellen der metastatischen Melanomzellkultur SK MEL 23 immunisiert, und die Immunisierung wurde intravenös 4 Wochen später mit 2·10&sup6; Zellen aufgefrischt. 3 Tage später wurden Milzzellen mit der 653-Variante des Mäusemelanoms P3X63 Ag8 verschmolzen. Wachstum, Klonierung und Erhaltung der hergestellten Hybridome wurde bereits von Koprowski et al. (Somatic Cell Genetics, Bd. 5 (1979), S. 957) beschrieben. Von den verschiedenen Hybridomen gebildete monoklonale Antikörper wurden unter Verwendung von serumfreien Kulturüberständen (Thurin et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 260 (1985), S. 14556) verschiedener Melanom- und Krebszellkulturen abgesucht. Monoklonale Antikörper wurden, wie von Lubeck et al. (Journal of Immunology, Bd. 135 (1985), S. 1299) beschrieben, gereinigt. Class-switch-Varianten der Hybridome wurden unter Verwendung der von Steplewski et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Bd. 82 (1985), S. 8653) beschriebenen Verfahren hergestellt.
  • Das Absuchen der Hybridome auf die gesuchten monoklonalen Antikörper wurde zunächst durch Messung der Bindung an serumfreie Kulturüberstände von Zellkulturen durchgeführt, wie es in Fig. 3 angegeben ist. Wie in dieser Figur gezeigt ist, setzen alle getesteten Kulturen das Antigen in das Medium frei. Die von metastatischen Melanomen stammenden Zellkulturen setzten geringfügig größere Mengen an antigenem Material frei als die von primären Melanomen stammenden. Nicht-Melanom-Zellkulturen, die keines der Antigene freisetzten, waren: SW 1783 und SW 1088-Astrocytom, SW 620, SW 707, SW 1116 und SW 1345-Colorektalkarzinom, KATO III-Darmkarzinom, Capan-2-Pankreaskarzinom, 2774 und CaOV 3-Ovarkarzinom, T-24-Blasenkarzinom, SW 75568-Cervikalkarzinom, Raji und MOLT-Lymphoblastoid, HL-60 und K 562-Leukämie, SW 648-Sarkom, Tera 1-Teratokarzinom und WI 38-Fibroblasten.
    • C. Glycolipide
  • Nicht mit Alkali behandelte Melanomzellgangliosid-Gesamtfraktionen wurden, wie von Herlyn et al. (Cancer Research, Bd. 45 (1985), S. 5670) beschrieben, hergestellt. Die Reinigung und Charakterisierung der Ganglioside wurde im wesentlichen wie von Thurin et al. (Journal of Biological Chemistry, Bd. 260 (1985), S. 14556) beschrieben, durchgeführt. Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde unter Verwendung von auf der Rückseite mit Glas verstärkten und auf der Rückseite mit Aluiminiumoxid verstärkten Hochdruck-TLC-Platten (Bodman Chemicals, Gibbstown, NJ) durchgeführt. Das Entwicklungssystem für die Entwicklung der TLC-Platten war Chloroform/Methanol/0,2% CaCl&sub2; in H&sub2;O (60 : 40 : 9, Vol./Vol./Vol.), und der Nachweis der verschiedenen Fraktionen wurde unter Verwendung des Recinolreagenzes durchgeführt (Herlyn et al., Cancer Research, Bd. 45 (1985), S. 5670).
    • Beispiel 2 Identifizierung des durch den monoklonalen Antikörper ME 361 nachgewiesenen Antigens
  • Festphasen- Enzymimmunoassays (ELISA) und Radioimmunoassays (RIA) wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Linbro/Titertek, Flow Laboratories, McLean, VA für ELISA und Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA für RIA) mit gereinigten monoklonalen Antikörpern ME 361 (1 ug/ul) und ME 361-S2a (1 mg/ml) mit Gangliosidantigenen in einer Verdünnungsreihe durchgeführt. Es wurde eine Verdünnungsreihe der Ganglioside in Methanol aufgestellt und auf die Platte mit einem Volumen von 50 ul/Vertiefung aufgebracht. 4 Proben jeder Verdünnung wurden mittels ELISA (Thurin et al., a.a.O.) nach Verdampfen des Methanols bei 22ºC und mittels RIA unter Verwendung von ¹²&sup5;I-markiertem Ziegen-Antimaus-F(ab' (1500 cpm/ul) als zweitem Antikörper (Hansson et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 258 (1983), S. 4019) getestet. Für alle Werte betrug die Standardabweichung weniger als 7%. Die Ergebnisse des ELISA-Tests zeigten, daß der höchste Bindungsgrad von ME 361 und ME 361-S2a für das Gangliosid GD2 auftrat, gefolgt vom Gangliosid GD3 (Fig. 1). ME 361 und ME 361-S2a zeigten im wesentlichen keine Reaktivität mit den Gangliosiden GM4, GM3, GM2, GM1, GD1a, GD1b, GT1a, GQ 1b und Disialoparaglobosid (III²(Neu Ac)&sub2;nLC&sub4;Cuer).
  • Der TLC-Bindungsassay wurde im wesentlichen wie von Magnani et al. (Methods in Enzymology, Bd. 83 (1983), S. 235) unter Verwendung von Hybridomkulturüberständen als Quelle des Antikörpers und unter Verwendung des gleichen zweiten Antikörpers wie vorstehend durchgeführt. Ergebnisse von negativen Vergleichsglycolipiden (500 ng/Bande) wurden aus dem chromatographischen Bindungsassay erhalten, mit der Ausnahme von GM1, das in einer Verdünnungsreihe mittels ELISA untersucht und aus Gründen der Einfachheit graphisch dargestellt wurde (Fig. 1).
  • Western-Blot und Immunopräzipitation unter Verwendung von Extrakten bzw. Zellen der Melanomzellkulturen WM 75, WM 373, WM 115, WM 266-4, WM 164 und SK MEL 23 zeigten keine mit dem Antikörper ME 361 assoziierten Glycoproteinantigenformen (Daten nicht gezeigt).
  • Gesamtglycolipidfraktionen aus menschlichem Gehirn und aus Erythrozyten zeigten, daß keine Reaktion mit anderen Gangliosiden bei Verwendung des chromatographischen Bindungsassays (TLC) auftrat. Wie in Fig. 2B gezeigt ist, wurde gezeigt, daß der Antikörper ME 361 an das GD2-Gangliosid (unterer Pfeil) und auch an das GD3-Gangliosid (oberer Pfeil) bindet, was mit den ELISA-Daten konsistent ist. Die am schnellsten wandernden Banden, die am deutlichsten in den Spuren 1, 4 und 10-11 in Fig. 2B zu sehen sind, verschwanden nach Behandlung mit Alkali (Fig. 2C). Dies zeigt, daß mit größter Wahrscheinlichkeit auf GD2 vorhandene Lactone mit dem monoklonalen Antikörper ME 361 reagieren. Der monoklonale Antikörper ME 361 war fähig, an die Gesamtgangliosidfraktionen aus allen 11 untersuchten Melanomzellkulturen zu binden (Fig. 2, B und C).
    • Beispiel 3 Gewebespezifität des monoklonalen Antikörpers ME 361
  • Die Reaktivität von erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern mit Cryostatschnitten von frisch gefrorenen melanozytischen Läsionen, die, wie von Ross et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Bd. 81 (1984), S. 6681) beschrieben, fixiert wurden, wurde unter Anwendung des Peroxidase-Antiperoxidase-Verfahrens für Immunoperoxidaseassays (Ortho Diagnostic Systems Inc., Raritan, NJ) bestimmt. Die Bindung monoklonaler Antikörper an Antigen, das in angereicherten serumfreien Kulturüberständen vorhanden war, wurde durch indirekten Festphasen-RIA (Thurin et al., a.a.O) bestimmt. Western-Blot und Immunopräzipitation wurden, wie von Laemmli (Nature (London), Bd. 227 (1970), S. 680) beschrieben, durchgeführt. Die Bindung des monoklonalen Antikörpers ME 361 an Gewebe, die alle Stadien des Melanomtumorwachstums repräsentierten (Clark et al., Human Pathology, Bd. 15 (1985), S. 1147), unter Verwendung der Immunoperoxidasefärbung gefrorener Cryostatschnitte ist in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Immunoveroxidasefärbung gefrorener Schnitte mit ME 361 Gewebe Zahl der Fälle Zahl der positiven Fälle Positive Melanozyten/Keratinozyten Nerven Langerhans-Zellen Nevi Dysplastische Nevi Primäre Melanome Metastastische Melanome Lymphozyten a Hirn Pankeas Leben, Nieren, Hoden a Lymphozyten in Schnitten von Melanozytenläsionen. b Jeweils ein Fall.
  • Die zelluläre Färbung war im gesamten Cytoplasma verbreitet. Im allgemeinen war die Aktivität mäßig bis stark hinsichtlich der Intensität, und zwar beinhaltete sie 50% oder mehr der Läsionszellen in den meisten Fällen. Die Reaktivität gegenüber Hirn war hauptsächlich auf das Myelin beschränkt. Periphere Nerven waren bei allen untersuchten Geweben nicht reaktiv. Die Bindung von ME 361 an alle Gangliosidfraktionen in Fig. 2 und alle Zellen in Tabelle 2 war konsistent mit der hochgradigen Bindung an primäre und metastatische Melanome.
    • Beispiel 4 Durchflußcytometrische Zellbindung der monoklonalen Antikörper ME 361 und ME 361-S2a
  • Zur Durchflußcytometrie von Melanomzellkulturen wurden Zellen aus einem 75 cm² einen Tag vor dem Assay mit Trypsin behandelt und in einen neuen Kolben überführt. Zellen wurden aus dem Kolben am Tag des Assays durch eine kurze Inkubation mit 0,1% EDTA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung entfernt und in Hanks-Medium (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY) mit einem Gehalt an 10% hitzeinaktiviertem menschlichem Serum resuspendiert. Die Lebensfähigkeit wurde unter Anwendung der Trypanblau- Ausschlußtechnik bestimmt, und es wurde festgestellt, daß sie mehr als 90% betrug. Die Zellen wurden anschließend auf 4·10&sup6; Zellen pro ml verdünnt, und 250 ul (1·10&sup6; Zellen) wurden in ein 1,5 ml fassendes Eppendorf-Röhrchen für jeden Test gegeben. Der primäre Antikörper (50 ul) wurde anschließend zugegeben, und es wurde 30 Minuten auf Eis inkubiert. Unverdünnter Kulturüberstand des Mäusemyeloms P3X63 Ag8 wurde als negative Kontrolle verwendet. Die Zellen wurden 2-mal gewaschen, resuspendiert und 30 Minuten in 50 ul mit Fluoreszein markiertem Ziegen-Antimaus- F(ab')&sub2;, das 1 : 100 in dem vorstehenden Hanks-Medium verdünnt wurde (Cappel, Worthington, P.A.), inkubiert. Die Zellen wurden anschließend 2- mal gewaschen, in 0,5 ml Hanks-Medium resuspendiert und für weniger als 2 Stunden vor der Durchflußcytometrie auf Eis gehalten. Ein Ortho-Cytofluorograf 50 HH, der mit einem Data General MP/200-Mikroprozessor verbunden war (Ortho Instruments, Westwood, MA), wurde für die cytometrischen Bestimmungen verwendet. Zellen wurden als positiv betrachtet, wenn ihre Fluoreszenzintensität einen Schwellenwert überschritt, bei dem 99% mit nicht-reaktivem Kontrollantikörper (negative Kontrolle) behandelte Zellen eine geringere Fluoreszenzintensität aufwiesen.
  • Die mit den monoklonalen Antikörpern ME 361 (ATCC HB 9325) und ME 361-S2a (ATCC HB 9326) erhaltenen Ergebnisse unter Verwendung der indirekten Durchflußcytometrie zeigten, daß die Bindung an allen 6 untersuchten Zellkulturen stattgefunden hatte (Tabelle 3). ME 361 hat Isotyp gamma-3, und ME 361-S2a hat Isotyp gamma-2a. Tabelle 3 Bindung der Antikörper ME 361 und ME 361-S2a an Melanomzellkulturen in der indirekten Durchflußcytometrie Zellen Antikörper a mittlere prozentuale Gesamtbindung (Zahl der Bestimmungen) MCF b a P3: Kulturüberstand aus Mäusemyelom 3X63-Ag8; 2a: 10 ug/ml gereinigter ME 361-S2a-Antikörper; 3: ME-361 enthaltende Ascites, 1 : 100 verdünnt. b MCF: Mittlere Kanalfluoreszenz.
  • Die Zellen mit den höchsten extrahierbaren Mengen an GD2-Gangliosid, d. h. WM 75, WM 115, WM 226-4 und SK MEL 23, zeigten einen höheren Grad an Antikörperbindung als die Kulturen WM 373 und WM 164, die vergleichsweise kleine Mengen an GD2 enthielten. Die WM 373- und WM 164-Zellen wiesen jedoch ausreichende Mengen an GD3-Gangliosid auf, so daß unabhängig von der schwachen Antikörperreaktivität gegenüber GD3 (Fig. 1) diese Kulturen immer noch fähig waren, ME 361 und ME 361-S2a (Tab. 3) zu binden. Andere Melanomzellkulturen, die ebenfalls gegenüber den monoklonalen Antikörpern ME 361 und ME 361-S2a reaktiv waren, waren WM 9, WM 46 und die Neuroblastomzellkultur IMR-5.
    • Beispiel 5 Cytotoxizität von ME 361, gemessen als antikörperabhängige Zellcytotoxizität (ADCC) und komplementabhängige Cytotoxizität (CDC)
  • ADCC wurde unter Verwendung eines 18-stündigen ¹¹¹-In-Freisetzungsassays gemessen. Bei diesem Assay wurde Ascitesflüssigkeit in einer Verdünnung von 1 : 100 verwendet, wobei es sich um die höchste Verdünnung handelte, die eine signifikante Lyse in dem Assay ergab, wenn die Bestimmung mit der Melanomzellkultur WM 164 vorgenommen wurde. Es wurden keine Versuche unternommen, um die Wirksamkeit bei der Abtötung für zwei verschiedene ME 361-Isotypen zu bestimmen, da der gereinigte gamma-3-Antikörper (ME 361) schwierig in ausreichenden Konzentrationen in Lösung zu bringen war. Gereinigter monoklonaler gamma-2a-Antikörper (ME 361-S2a) bei einer Konzentration von 10 ug/ml zeigte jedoch die gleiche Wirkung wie eine 1:100-Verdünnung von Ascitesflüssigkeit. Zielzellen (1·10&sup6;) wurden mit 10 uCi [¹¹¹In]-Indiumoxin (Medi-Physic Inc., Emeryville, CA) 15 Minuten in 15 ul Kochsalzlösung bei 21ºC markiert. Die Zellen wurden 3-mal mit Medium gewaschen und bei 1·10&sup4; Zellen/Vertiefung in Rundboden-Mikrotiterplatten (Linbro, Flow Laboratories, McLean, VA) gegeben. Bei dem ADCC-Assay wurden Effektorzellen und verschiedene Konzentrationen an monoklonalen Antikörpern 3-fach zugegeben und 18 Stunden bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert. Die Platten wurden anschließend bei 80 g für 2 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden geerntet und unter Verwendung eines Gammazählers analysiert. Die prozentuale Cytotoxizität wurde gemäß der nachstehenden Formel berechnet:
  • Cyytotoxizität (%) = experimenteller CPM - spontaner CPM/eingegebener CPM - spontaner CPM·100
  • Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 4 gezeigt und spiegeln die nach Abziehen der Kontrollwerte ¹¹¹In-Freisetzung ohne monoklonalen Antikörper ME 361 oder ME 361-S2a) erhaltenen Zahlen wider. Die Standardabweichung bei diesen Bestimmungen betrug weniger als 10% für alle Werte. Tabelle 4 ADCC und CDC gegen 6 Melanomzellkulturen in ¹¹¹In-Freisetzungsassay Zellen Antikörper Monozyten a Lymphozyten a CDC a Das Verhältnis Effektorzellen zu Zielzellen beträgt 50 : 1. b Bezeichnet Donoren der peripheren Blutlymphozyten. c Ausgedrückt als prozentuale Cytotoxizität über dem Hintergrund, der in keinem Fall höher als 10% bei ADCC und 6% bei CDC war.
  • Für den CDC-Assay wurden ¹¹¹In-markierte Zielzellen in Mikrotiterplatten mit 40% autologem Plasma von menschlichen Donoren und verschiedenen Konzentrationen an monoklonalen Antikörpern inkubiert.
  • Bei der Bewertung der ADCC- und CDC-Aktivität von ME 361 und ME 361- S2a wurden 6 Melanomzellkulturen ausgewählt, die verschiedene Gangliosidmuster aufwiesen. Diese Zellkulturen sind in Tabelle 1 beschrieben. Alle Zellen wurden signifikant im ADCC lysiert, wenn menschliche Monozyten und Lymphozyten in einem Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen von 50 : 1 verwendet wurden, sowie im CDC mit Komplement in einem 18-stündigen ¹¹¹In-Freisetzungsassay (Tabelle 4). Die Wirksamkeit bei der Abtötung von ME 361 und ME 361-S2a war signifikant höher (p = 0,01, Student-T-Test unter Verwendung aller vier Werte) für WM 75-Zellen als für WM 373-Zellen. Dieser Befund ist konsistent mit der höheren Konzentration an GD2 und dem höheren Antikörperbindungsgrad bei den WM 75-Zellen. Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Lyse von WM 115-und WM 266-4- Zellen (die von einem einzelnen Individuum stammten) festgestellt, was gut mit den ähnlichen Gangliosidmustern dieser Kulturen korrelierte. Die Antikörperbindung bei dem vorstehend beschriebenen indirekten Durchflußcytometrie-Assay war für WM 115- und WM 266-4-Zellen ebenfalls ähnlich, d. h. sie betrug 73% bzw. 83% (Tabelle 3). Die Verteilung der Hauptganglioside GM3, GM2, GD3 und GD2 in diesen Zellkulturen war ähnlich, in scharfem Gegensatz zu dem bei WM 75-Zellen, bei denen GD2 das Hauptgangliosid war, und bei WM 373-Zellen, bei denen GD3 das Hauptgangliosid war und GD2 nur in geringen Mengen gefunden wurde, festgestellten Muster (Fig. 2, A und B, Spuren 1-4). Im Fall von zwei Zellkulturen von verschiedenen Individuen waren die Bindung monoklonaler Antikörper und die Abtötung von Zellen, die sowohl GD2 als auch GD3 exprimierten (SK MEL 23), größer als bei Zellen, die nur GD3 exprimierten (WM 164).
  • Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben ist, ist es dem Durchschnittsfachmann klar, daß viele Änderungen und Modifikationen gemacht werden können, ohne vom Geist oder Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.

Claims (15)

1. Kontinuierliche Hybridoma-Zellinie, die zur Absonderung monoklonaler Antikörper fähig ist, die gegenüber den Gangliosid-Antigenen GD2 und GD3 reaktiv sind und die im wesentlichen gegenüber anderen Gangliosid-Antigenen nicht reaktiv sind.
2. Hybridoma-Zellinie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie unter ATCC HB 9325 und ATCC HB 9326 und ihren Isotyp-Switch-Varianten ausgewählt ist.
3. Monoklonaler Antikörper, der gegenüber den Gangliosid-Antigenen GD2 und GD3 reaktiv ist, wobei der Antikörper bevorzugt gegenüber GD2 reaktiv ist und gegenüber GQ 1b im wesentlichen nicht reaktiv ist.
4. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper von einer unter ATCC HB 9325 und ATCC HB 9326 ausgewählten Zelline hergestellt wird; insbesondere der monoklonale Antikörper nach Anspruch 3 mit der Spezifität eines monoklonalen Antikörpers, der von der Hybridoma-Zellinie ATCC HB 9325 hergestellt wird.
5. Chimärer Antikörper, umfassend die Domänen VL und VH eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 3; wobei der monoklonale Antikörper insbesondere von einer unter ATCC HB 9325 und ATCC HB 9326 ausgewählten Zellinie hergestellt wird.
6. Verfahren zum Nachweis des Gangliosid-Antigens GD2 oder GD3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Quelle, von der man vermutet, daß sie GD2 oder GD3 enthält, mit einer diagnostisch wirksamen Menge eines nachweisbar markierten Antikörpers oder Fragments davon in Kontakt bringt, wobei der Antikörper gegenüber den Gangliosid-Antigenen GD2 und GD3 reaktiv ist und gegenüber anderen Gangliosid-Antigenen im wesentlichen nicht reaktiv ist, und bestimmt, ob der Antikörper an die Quelle bindet.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper von einer unter ATCC HB 9325 und ATCC HB 9326 ausgewählten Zellinie hergestellt wird.
8. Nachweisbar markierter Antikörper oder Fragment davon, wobei der Antikörper gegenüber den Gangliosid-Antigenen GD2 und GD3 reaktiv ist und gegenüber anderen Gangliosid-Antigenen im wesentlichen nicht reaktiv ist, zur Verwendung bei einem in vivo-Verfahren zum Nachweis der Gangliosid- Antigene GD2 und GD3; wobei die nachweisbare Markierung insbesondere unter einem Radioisotop und einer paramagnetischen Markierung ausgewählt ist.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis in vitro erfolgt wobei die nachweisbare Markierung insbesondere unter einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Verbindung, einer chemolumineszierenden Verbindung, einer biolumineszierenden Verbindung und einem Enzym ausgewählt ist.
10. Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Antikörpers oder von Fragmenten davon, wobei der Antikörper gegenüber den Gangliosid-Antigenen GD2 und GD3 reaktiv und gegenüber anderen Gangliosid-Antigenen im wesentlichen nicht reaktiv ist, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Unterdrückung einer malignen Erkrankung bei einem Tier.
11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper von einer unter ATCC HB 9325 und ATCC HB 9326 ausgewählten Zellinie hergestellt wird; insbesondere die Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei es sich bei der malignen Erkrankung um ein Melanom handelt.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Unterdrückung auf parenteralem Weg erzielt wird; insbesondere auf subkutanem, intramuskulärem, intraperitonealem, interkavitärem, transdermalem oder intravenösem Weg.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Zusammensetzung in einer Konzentration von 0,01 bis 2000 mg/kg/Dosis verwendet wird; wobei die Zusammensetzung insbesondere Effektor-Zellen umfaßt.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper therapeutisch markiert ist; wobei die therapeutische Markierung insbesondere unter einem Radioisotop, einem Arzneistoff, einem Immunmodulator, einem die biologische Antwort modifizierenden Mittel, einem Lectin und einem Toxin ausgewählt ist.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper nach einem der Ansprüche 3 bis 5 in eine maligne Erkrankung unterdrückenden Mengen zusammen mit einem pharmazeutisch inerten Träger; wobei es sich bei der malignen Erkrankung insbesondere um ein Melanom handelt.
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