PT86792B - Anticorpos monoclonais contra antigenios associados a melanomas e linhas de celulas hibridas produzindo esses anticorpos - Google Patents

Anticorpos monoclonais contra antigenios associados a melanomas e linhas de celulas hibridas produzindo esses anticorpos Download PDF

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Description

MEMORIA descritiva
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A
Âmbito da Invenção
A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais contra antigénios de gangliósidos associados a melanomas, linhas de células híbridas que produzem esses anticorpos e métodos de utilização destes anticorpos monoclonais.
Descrição do Estado da Técnica
Os gangliósidos são uma classe principal dos glicolípidos ricos em hidratos de carbono, de tamanho e complexidade extremamente grandes. Os gangliósidos encontram-se geralmente na superfície exterior das membranas das células, especialmente nas células do sistema nervoso. Tem sido sugerido que os gangliósidos podem funcionar como receptores das membranas nos factores de crescimento, hormonas e moléculas de adesão. Nos últimos anos, recebeu especial atenção a possível função dos gangliósidos como marcadores de tumores. Em resultado disto, investigadores produziram anticorpos monoclonais que reagem de modo específico com gangliósidos na superfície do melanoma humano (Cheresh, et al., Proceedinqs of the National Academy of Sciences, U.S.A», 82,:5155, 1985; Cheresh, et al., Proceedinqs of the Natiqnal Academy of Sciences, USA., 81:5767, 1984; Pukel et al., Journal of Experimental Medicine, 155:1133, 1982; Cheresh, et al., Journal of Biological Chemistry, 259:7453, 1984), neuroblastoma (Schulz, et al., Câncer Research, 44:5914, 1984), e carcinoma do cólon (Koprowski, et al., Somatic Cell Genetics, 5.:957-972, 1979). Vários estudos recentes apontaram para o antigénio de gangliósidos GD3 como sendo o alvo potenci al da imunoterapia do melanoma humano (Hellstrom, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 82: :1499, 1985). Estudos anteriores identificaram o antigénio de gangliósidos GD2 como outro antigénio associado ao melanoma.
Embora os antigénios de gangliósidos estejam presentes no tecido nervoso central, o GD2 aparece grandemente aumentado
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-3no melanoma, tumores do cérebro, neuroblastoma, carcinoma das células pequenas do pulmão e outros tumores de origem neuroectodérmica. Estudos sobre o desenvolvimento destes antigénios de gangliósidos indicam que o GD3 é um precursor do GD2 e que a distribuição de GD2 e GD3 em vários melanomas, varia, d.e pendendo da gravidade da doença. De um modo geral, o antigénio de gangliósidos GD2 ocorre principalmente no melanoma primário e metastático avançados e raramente está presente em tecido normal.
Presentemente o método de eleição para o tratamento do melanoma e outros tumores que apresentam antigénios de ganglió sidos GD2 e GD3 envolve a excisão do tecido maligno envolvido. Infelizmente em estádios avançados a profunda invasão do tecido pelo tumor, associada, torna esta abrodagem muito mais difí cil devido ao aumento do trauma cirúrgico e à quantidade de te eido que tem de ser excisada. Visto que a taxa de sobrevivência ao melanoma maligno está inversamente relacionada com o nível de invasão do tecido do hospedeiro, a presente estratégia clínica não tem outra escolha senão a de recorrer à cirúrgia. Contudo, em estádios avançados, o aumento da disseminação do tumor cria uma situação em que a excisão cirúrgica tem muito menos probabilidades de ser bem sucedida. Consequentemente, isto resulta num prognóstico muito pior para os doentes que possuem doenças malignas num estádio avançado.
SUMARIO DA INVENÇÃO
E objecto da presente invenção proporcionar um anticorpo monoclonal capaz de reagir com GD2 e GD3, com a finalidade de um diagnóstico e terapia eficazes de doenças neoplásicas que manifestem estes antigénios.
Outro objecto da presente invenção é produzir anticorpos monoclonais capazes de reagir com ambos os antigénios de gangliósidos GD2 e GD3, mas que apresentam uma reactividade muito maior com GD2 do que com GD3 e, essencialmente, nenhuma reacti vidade com outros antigénios de gangliósidos, tais como GQlb.
E outro objecto da presente invenção proporcionar méto-
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-4dos para □ diagnóstico de doenças malignas, in vitro e in vivo, utilizando anticorpos monoclonais que reagem com antigénios de gangliósidos GD2 e GD3.
/
E ainda outro objecto da presente invenção proporcionar métodos para /eliminar uma doença maligna num animal utilizando anticorpos monoclonais não marcados ou marcados terapeuticameri te que reagem com antigénios de gangliósidos GD2 e GD3.
Assim, a presente invenção refere-se a novos anticorpos monoclonais específicos para antigénios de gangliósidos GD2 e GD3 mas que são essencialmente não-reactivos com outros antigé. nios de gangliósidos tais como GQ lb. A invenção inclui ainda linhas de células híbridas que produzem estes anticorpos bem como métodos de utilização e processos de preparação destes ari ticorpos monoclonais.
A capacidade de reagir com ambos os gangliósidos enquanto, simultaneamente, se mantêm essencialmente não-reactivos com gari gliósidos tais como GQ lb que está presente nos fibroblastos normais, é muito significativa em termos de detecção destes a_n tigénios e da utilização imunoterapêutica destes anticorpos mo noclonais. Já que os tumores variam em relação à sua expressão de GD2 e GD3, isto é, alguns tumores expressam só um ou outro destes antigénios de gangliósidos enquanto outros tumores expressam ambos , a capacidade em reagir com ambos estes antigéni os é de óbvia importância clínica. Por outro lado, o facto de que os anticorpos monoclonais, numa concretização da invenção, serem preferencialmente reactivos com antigénio de gangliósidos GD2 é importante visto que GD2, ao contrário de GD3,que também está presente em pele normal, é encontrado com muito menor fre quência no tecido normal. Assim, os anticorpos monoclonais da invenção apresentam um nível de especificidade para tecido maligno, antes não verificado.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1. Gráfico mostrando a reactividade do anticorpo monoclonal ME 361-S2a (ATCC HB 9326) e ME 361 (ATCC HB 9325) a antigénios de gangliósidos diluídos serialmente.
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-5Os círculos e os quadrados a cheio indicam gangliósidos GD2 e GD3, respectivamente, detectados com anticorpo monoclonal do isótipo IgG2a (ME 361-S2a) e os círculos e os quadrados abertos com isótipo IgG3 (ME 361). 0 triângulo a cheio indica a reactividade com gangliósidos GM4, GM3, GM2, GM1, GDla, GDlb, GTla, GQlb e disialoparaglobósido (ΠΙ (NeuAc^nLc^Cer) detecta do com ambos os isótipos IgG2a e IgG3.
Figura 2 (A) Cromatografia de camada fina de fracçães de ganglió sido total de culturas de células de melanoma Wistar (WM):
(1) WM 75, (2) WM 373, (3) WM 115, (4) WM 266-4, (5) WM 239-A, (6) WM 165-1, (7) WM 278, (8) WM 46, (9) WM 164, (10)
WM 9, e (11) SK MEL 23.
(B) Autorradiograma, revelado durante 20 horas, das mes. mas fracções de (A).
(c) Autorradiograma, revelado durante 20 horas, das mes. mas fracçães de (A) tratadas com 0,1 Μ KOH em metanol. Todas as fracçSes foram diluídas em relação ao conteúdo de proteínas das células extraídas e corresponde a aproximadamente SO^ug de gangliósido/faixa.
Figura 3. Gráfico de blocos representando a ligação de anticorpo monoclonal ME 361 de isótipo gama-3 (ME 361) a sobre nadantes de cultura sem soro dos tipos de células indicados. As culturas de células foram agrupadas de acordo com o tipo de lesão de que foram derivadas: melanoma em fase de crescimento radial (RGP), melanoma em fase de crescimento vertical (VGP) e melanoma metastático (MET).
DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS
A presente invenção diz respeito a anticorpos monoclonais com especificidade para antigénios indicadores de melanoma bem como outros tumores como, por exemplo, tumores do cérebro, neuroblastoma, carcinoma das células pequenas do pulmão e, na generalidade, qualquer tumor de origem neuroectodérmica. Es. tes anticorpos monoclonais são altamente úteis para a detecção
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-6imunológica quer in vitro quer in vivo de antigénios de gangliósidos vulgarmente associados com estes tumores e para a imunoterapia de tumores que produzem estes antigénios de ganglió sidos .
método comum utilizado para a produção de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais é bem conhecido dos peritos da matéria. Ilustrativo das técnicas utilizadas na presente invenção são as descritas em Proceedings of the National Açademy of Science, USA, 75: 5405, (1978) e em Koprou/ski, Patente Americana Na. 4 172 124 intitulada Method of Producing Tumor Antibodies.
Resumidamente, imunizaram-se ratinhos/BALB com células de melanoma metastático de cultura (SK MEL 23) e posteriormente aplicaram-se reforços com a mesma linha de células. Após 3 dias, os animais foram sacrificados e as células fundidas com a variante 653 de mieloma de ratinho P3X63 Ag8. Os hibridomas resultantes foram analisados em relação à produção de anticorpos monoclonais e testados relativamente à especificidade utilizando várias culturas de células de cancro e melanoma. Em complemento produziu-se e isolou-se uma variante dependente da classe utilizando técnicas conhecidas (Stepletuski, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, U.5.A», 82: 8653, 1985).
isolamento de outros hibridomas que segregam anticorpos monoclonais com a especificidade dos anticorpos monoclonais da presente invenção pode ser realizado por um perito comum na matéria pBla técnica de análise anti-idiotípica (Potocnjak, et al., Science, 215: 1637, 1982). Resumidamente, um anticorpo anti-idiotípico é um anticorpo que reconhece os determinantes raros presentes no anticorpo produzido pelo hibridoma em questão. 0 anticorpo anti-idiotípico é preparado pela imunização de um animal, como se utilizou como fonte do anticorpo monoclonal, com o anticorpo monoclonal desejado. 0 animal imunizado reconhecerá e responderá aos determinantes idiotípicos do anticorpo imunizante ao produzir um anticorpo para esses determinantes idiotípicos. Pela utilização dos anticor-
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-7pos do segundo animal, que são específicos para os anticorpos monoclonais produzidos por um único hibridoma, é agora possível identificar outros clones com exactamente o mesmo idiâtipo do anticorpo do hibridoma utilizado para a imunização. A ideji tidade idiotípica entre os anticorpos monoclonais dos dois hibridomas demonstra que os dois anticorpos monoclonais são os mesmos relativamente ao seu reconhecimento do mesmo determinar) te epitópico. Assim, pela utilização de anticorpos para os de terminantes epitúpicos num anticorpo monoclonal é possível identificar outros hibridomas que expressem anticorpos monocljo nais com a mesma especificidade epitópica. Em anticorpos, estes determinantes idiotípicos estão presentes na região hipervariável que se liga a um dado epitopo.
A presente invenção é dirigida a anticorpos monoclonais, e hibridomas que os produzem , que são reactivos com antigénios de gangliósidos GD2 e GD3 e são essencialmente não-reactivos com outros antigénios de gangliósidos. Pode facilmente determinar-se se um anticorpo monoclonal tem a especificidade reque rida pela realização de um teste imunológico de ligação do antigénio, como o ELISA e o RIA descritos no Exemplo 2 infra.
ComD alternativa, visto que os inventores caracterizaram uma porção epitópica com a qual reagem os anticorpos monoclonais que possuem a especificidade dos da invenção, é agora uma questão de perícia de rotina produzir mais hibridomas que segreguem anticorpos monoclonais de especificidade epitópica idêntica. A porção de sacárido do gangliósido GD2 purificado, que liga os anticorpos monoclonais da invenção, pode ser purificada a partir da porção maior de GD2 por técnicas coma a oz£ nólise (Sabesan, et al.» Canadian Journal of Chemistry, 62: 1034, 1984) ou por hidrólise enzimática específica como com e_n dogliceroceramidase (Ito, et al., Journal of Biological Chemistry, 261: 14278, 1986), Assim, os hibridomas adicionais que se, gregam anticorpos monoclonais possuindo a especificidade dos anticorpos monoclonais produzidos por linhas de células ME 361 (ATCC HB 9325) e ME 361-S2a (ATCC HB 9326) podem ser produzidos, por exemplo, por acoplamento deste epitopo a uma molécula
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-8portadora inerte ou imunogénica, como a KLH, para apresentar o epitopo em forma imunogénica (Hudson & Hay, Practical Immunology, p. 5-8, Blackwell Scientific Publications, 1980). Deste modo, os animais podem ser primeiro imunizados com todas as cé lulas malignas para sensibilização inicial seguida pelo epitopo conjugado, ou só antigénio purificado, na imunização de reforço para estimular o crescimento dos clones de células B pre feridos. Ao fazer isto, é possíuel restringir grandemente o reportório de clones de células B respondentes que estão preseri tes para a fusão do hibridoma e evitam assim a experiência inde. vida no isolamento de hibridomas de especificidade desejada. Apôs a fusão, os hibridomas são analisados utilizando o epitopo e o portador livre para seleccionar os clones que produzem anticorpos monoclonais que são específicos para este epitopo.
Embora a utilização de um anticorpo monoclonal de um dador de uma espécie estranha numa segunda espécie receptora não seja vulgarmente um factor de imunoterapia ou imunodiagnose in vivo, um problema potencial que pode surgir é a ocorrência de uma resposta imunológica adversa pelo hospedeiro aos determinantes antigénicos presentes no anticorpo do dador. Em alg_u mas circunstâncias esta resposta adversa pode ser tão grave que reduza a utilização in vivo do anticorpo do dador no hospei deiro. Para além disso esta resposta adversa do hospedeiro po. de servir para impedir a eficácia supressora da malignidade do anticorpo do dador. Uma via pela qual é possível evitar a pro babilidade da ocorrência de uma resposta imunológica adversa no hospedeiro é pela utilização de anticorpos quiméricos (Sun, et al., HYBRIDOMA, 5(Supplement 1); S17, 1986; Oi, et al., Bio Techniques, 4(3): 214, 1986). Os anticorpos quiméricos são anticorpps em que os vários domínios das cadeias leves e pesadas do anticorpo são codificados pelo ADN de mais de uma espécie. Tipicamente o anticorpo quimérico compreenderá os domíni os variáveis das cadeias pesadas (V^) e leves (V^) derivadas a partir da espécie dadora que produz o anticorpo de especificidade antigénica desejável e os domínios do anticorpo constantes das cadeias pesadas (C^) e leves (C^) derivadas a partir da espécie receptora hospedeira. Acredita-se que, pela redução da
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4'
V'· |Β exposição do sistema imunológico do hospedeiro aos determinantes antigénicos nos domínios do anticorpo do dador, a possibilidade de uma resposta imunológica aduersa ocorrer na espécie receptora será reduzida. Assim, por exemplo, é possível produ zir um anticorpo quimérico para utilização clínica in vivo em seres humanos que compreende domínios e do ratinho codificados pelo ADN isolado de ME 361 (ATCC HB 9325) ou ME 361-S2a (ATCC HB 9326) e domínios C^ e C|_ codificados pelo ADN isolado de uma célula humana.
Sob certas circunstâncias os anticorpos monoclonais de um isotipo podemser mais preferíveis do que os de outro em termos da sua eficácia terapêutica e de diagnóstico. Por exemplo, sa be-se que os anticorpos monoclonais de ratinha do isótipo gama-2a e gama-3 são mais eficazes na inibição do crescimento de tu mores do que o isótipo gama-1. Pensa-se que esta eficácia dife rencial se deve à capacidade dos isótipos gama-2 e gama-3 em participar mais activamente na destruição citolítica das células tumorais. Podem preparar-se isotipos particulares de um an ticorpo monoclonal quer directamente pela selecção a partir da fusão do hibridoma inicial quer secundariamente a partir de um hibridoma parente que segrega um anticorpo monoclonal de isoti po diferente pela utilização da técnica de selecção de parentes para isolar as variantes ligadas à classe. (Steplewski, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82.:8653, 1985; Spira, et al., Journal of Immunological Methods, 74:307, 1984). Assim, os anticorpos monoclonais da presente in venção devem incluir as variantes ligadas à classe que possuam a especificidade do anticorpo monoclonal ME 361 que é produzido pelo ATCC HB 9325 ou ME 361-S2a que é produzido pelo ATCC HB 9326.
Os anticorpos monoclonais e quiméricos da invenção podem ser utilizados em qualquer animal em que seja desejável administrar imunodiagnose ou imunoterapia in vitro ou in vivo. 0 termo animal” aqui utilizado inclui tanto seres humanos como não-humanos.
termo anticorpo” utilizado nesta invenção inclui tanto
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23176 ' _ JK · ϊ^ί'-'.ρ.ι.Μ^
-10a molécula intacta como os seus fragmentos, tais como, por exemplo, Fab e F(ab’)2» 0ue s^° caPazes de ligar o determinante epitópico.
termo essencialmente não-reactivo quando utilizado para caracterizar a reactividade entre os anticorpos monoclonais da invenção e um antigénio significa que qualquer reacção que possa ocorrer é insignificante em termos de limitação da utilidade dos anticorpos no diagnóstico ou terapêutica.
Os anticorpos monoclonais da invenção são especialmente adequados para utilização em testes imunológicos em que podem ser utilizados em fase líquida ou ligados a um veículo em fase sólida. Em complemento, os anticorpos monoclonais nestes testes imunológicos podem ser marcados de modo detectâvel de vári as maneiras. Exemplos de tipos de testes imunológicos que podem utilizar os anticorpos monoclonais da invenção são os testes imunológicos competitivos e não-competitivos no formato di. recto ou indirecto. Exemplos de tais testes imunológicos vulgares são os testes radio-imunológicos (RIA) e o teste sandtuich” (imunométrico). A detecção dos antigénios utilizando os anticorpos monoclonais da invenção pode ser realizada utilizando testes imunológicos que sejam efectuados nos modos directo, in verso ou simultâneo, incluindo os testes imuno-histoquímicos em amostras fisiológicas.
Existem muitos veículos aos quais os anticorpos monoclonais da invenção podem ser ligados e que podem ser utilizados na detecção da presença do antigénio associado ao melanoma. Veículos bem conhecidos incluem o vidro, poliestireno, polipro pileno, polietileno, dextrano, nilão, amilases, celuloses natu rais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetite. A natureza do veículo pode ser quer solúvel quer insolúvel para os propósitos da invenção. Os peritos na matéria saberão de outros veículos apropriados para a ligação do anticorpo monoclonal, ou serão capazes de os determinar, utilizando experimentação de rotina.
Existem muitos marcadores e métodos de marcação diferentes, conhecidos dos peritos comuns da matéria. Exemplos de ti67 367
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-11pos de marcadores que podem ser utilizados na presente invenção incluem enzimas, radio-isótopos, compostos fluorescentes, compostos quimiluminescentes e compostos bioluminescentes. Os peritos comuns na matéria conhecerão outros marcadores apropriados para a ligação ao anticorpo monoclonal, ou serão capazes de os determinar, utilizando experimentação de rotina. Além disso, a ligação destes marcadores ao anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser efectuada utilizando técnicas padrão comuns aos peritos na matéria.
Para os propósitos da presente invenção, o antigénio associado ao melanoma que é detectado pelos anticorpos monoclonais da invenção podem estar presentes em tecidos e fluidos biológicos. Qualquer amostra que contenha uma quantidade detectável de antigénio associado ao melanoma pode ser utilizada. Normalmente, a amostra é um líquido como urina, saliva, fluido cerebro-espinal, sangue, soro e análogos, ou um sólido ou semi -sólido como os tecidos, fezes e análogos.
Outra técnica que também pode resultar em maior sensibilidade consiste em acoplar os anticorpos a haptenos de baixo peso molecular. Estes haptenos podem então ser especificamente detectados por meio de uma segunda reacção. Por exemplo, é vulgar utilizar estes haptenos como biotina, que reage com avi, dina, ou dinitrofenilo, piridoxal e fluoresceína, que podem reagir com anticorpos específicos anti-hapteno.
termo epitopo utilizado na invenção inclui qualquer determinante capaz de interacção específica com os anticorpos monoclonais da invenção. Os determinantes epitópicos consistem geralmente em grupos de moléculas de superfície quimicameri te activa como os aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm geralmente características de estrutura tridimensional específicas, bem como características de carga específicas.
Ao utilizar os anticorpos monoclonais da invenção para a detecção in vivo do antigénio, o anticorpo monoclonal marcado de modo detectável é administrado numa dose que seja diagnosti camente eficaz. A expressão diagnosticamente eficaz signifi ca que a quantidade do anticorpo monoclonal marcado de modo de,
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-12tectável é administrado em quantidade suficiente para permitir a detecção do local que possui antigénios de gangliósidos para os quais os anticorpos monoclcnais são específicos. A concentração do anticorpo monoclonal marcado de modo detectável que é administrada devia ser suficiente para que a ligação ao local do tumor fosse detectável comparada com o sinal de fundo. Além disso é desejável que o anticorpo monoclonal marcado de modo detectável seja rapidamente removido do sistema circulató rio a fim de proporcionar a melhor razão tumor/sinal de fundo.
Geralmente, a dosagem do anticorpo monoclonal marcado de modo detectável para diagnóstico variará de acordo com factores como a idade, sexo e a extensão da doença do indivíduo. A dosagem do anticorpo monoclonal pode variar entre 0,01 mg/kg a 2000 mg/kg, de preferência 0,1 mg/kg a 1000 mg/kg.
Para detecção in vivo do diagnóstico, o tipo de instrumento para detecção disponível é um factor vital na selecção de um dado radio-isótopo. 0 radio-isótopo escolhido deve possuir um tipo de enfraquecimento que seja detectável por um dado tipo de instrumento. Ainda outro factor importante na selecção de um radio-isótopo para diagnose in vivo é que a semi-vida do radio-isótopo seja suficientemente longa para que ain da seja detectável no momento de absorção máxima pelo alvo, mas suficientemente curta para que a radiação nociva seja minimiza, da em relação ao hospedeiro. Idealmente, um radio-isótopo uti. lizado para a detecção para visualização in vivo não terá uma emissão de partícula, mas produzirá um grande número de fotões no intervalo de 140-250 keV, que podem ser imediatamente dete£ tados por câmaras-gama convencionais.
Para a diagnose in vivo os radio-isótopos podem ser liga dos a imunoglobina quer directa quer indirectamente utilizando um grupo funcional intermediário. 0s grupos funcionais intermediários que são muitas vezes utilizados para ligar radio-is^ topos que existem como iões metálicos para imunoglobinas são os agentes quelantes bi-funcionais ácido di-etileno-tri-aminapentacético (DTPA) e ácido etileno-di-aminotetracético (EDTA).
Os anticorpos monoclonais da invenção podem também ser
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-13marcados com isótopos paramagnéticos para fins de diagnose in vivo, como na detecção por ressonância magnética (MRl) ou na ressonância electrónica de spine (ESR). Em geral, pode-se uti lizar qualquer método convencional de detecção de visualização do diagnóstico. Usualmente os radio-isótopos e emissores gama e de posição são utilizados para detecção por câmara e os isótopos paramagnéticos para RMN.
Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser utilizados para controlar o progresso da doença maligna num indivíduo. Assim, pela medição do aumento ou diminuição no tamanho ou número dos locais malignos, ou alterações na concentração do antigénio espalhado nos vários fluidos corporais, seria possível determinar se um regime terapêutico específico efectuado para melhorar a malignidade é eficaz.
Os anticorpos monoclonais da invenção podem também ser utilizados isolados ou em combinação com células efectoras (Douillard, et al., Hybridoma, 5(Supp. 1): S139, 1986), para imunoterapia num animal que tenha um tumor que expresse gangliósidos associados a malignidade com epítopos reactivos com os anticorpos monoclonais da invenção. Quando utilizados para imunoterapia, os anticorpos monoclonais da invenção podem ser não marcados ou marcados com um agente terapêutico. Estes agentes podem ser acoplados quer directa quer indirectamente aos anticorpos monoclonais da invenção. Um exemplo de acoplamento indirecto é a utilização de uma porção espaçadora. Por sua vez estas porções espaçadoras podem ser solúveis ou insolú veis (Diener, et al., Science, 231:148, 1986) e podem ser seleccionadas para permitir a libertação da droga da molécula do anticorpo monoclonal no local do alvo. Exemplos de agentes te rapêuticos que podem ser acoplados aos anticorpos monoclonais da invenção para imunoterapia são drogas, radio-isótopos, imuno-moduladores, lectinas e toxinas.
As drogas que podem ser conjugadas com os anticorpos monoclonais da invenção incluem drogas não proteicas bem como dro gas proteicas. A expressão drogas não proteicas abarca compostos que são classicamente referidos como drogas como por
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-14exemplo, mitomicina C, daunorrubicina e vinblastina.
As drogas proteicas com as quais os anticorpos monoclonais da invenção podem ser marcados incluem imuno-moduladores e outros modificadores de resposta biológica. A expressão modificadores de resposta biológica abarca substâncias que estão implicadas na alteração da resposta imune de tal modo que aumenta a destruição do tumor portador de gangliósidos para os quais são específicos os anticorpos monoclonais da presente invenção. Exemplos de modificadores de resposta imune incluem compostos como as linfocinas. Exemplos de linfocinas incluem o factor de necrose tumoral, interleucinas 1, 2 e 3, linfotoxinas, factor de activação dos macrófagos, factor de inibição da migração, factor estimulante de colónias e interferão. Os interferãos com os quais os anticorpos monoclonais da invenção podem ser marcados incluem alfa-interferão, beta-interferão, e gama-interferão e os seus subtipos.
Ao utilizar anticorpos monoclonais da invenção conjugados radio-isotopicamente para imunoterapia, certos isótopos podem ser de maior preferência do que outros dependendo de factores como a massa e a distribuição do tumor bem como a emissão e es. tabilidade do isótopo. Se se desejar, a massa e a distribuição do tumor podem ser avaliadas pelas técnicas de diagnóstico in vivo descritas anteriormente. Dependendo do tipo da malignidade alguns emissores podem ser preferíveis em relação a outros. Geralmente os radio-isótopos emissores de partículas alfa e beta são os preferidos em imunoterapia. Por exemplo, se um animal tem focos de tumor sólido pode ser preferível um emissor beta de alta energia capaz de penetrar vários milime90 tros de tecido, como o Y. Por outro lado se a malignidade consiste em células de alvo simples, como no caso da leucemia pode ser preferível um emissor alfa de alta energia e curto
212 alcance como o Bi. Exemplos de radio-isótopos que podem ser ligados aos anticorpos monoclonais ra fins terapêuticos sao I, I, 212Pb, 47SC> 109Pd e ieeRe.
da presente invenção pa Y, 67Cu, 212Bi, 211At,
As lectinas são proteínas, geralmente isoladas de maté67 367
3176 Μ
......·ν - Vx·-«j*** c?''/ <*'
-15ria vegetal, que se ligam a porções de açúcar específicas. Mui. taslectinas são também capazes de aglutinar células e estimular linfócitos. A ricina é uma lectina tóxica que tem sido utilizada imunoterapeuticamente. Realiza-se pela ligação da ca deia alfa-peptídica da ricina, que é responsável pela toxicida. de, à molécula do anticorpo para permitir a libertação, no local específico, do efeito tóxico.
As toxinas são substâncias venenosas produzidas por pla_n tas, animais e microrganismos que, em dose suficiente, são mui, tas vezes letais. A toxina da difteria é uma substância prodjj zida por Corynebacterium diphteriae que pode ser utilizada des, te modo. Esta toxina consiste numa subunidade alfa e beta que em condições próprias podem ser separadas. 0 componente tóxico A pode ser ligado a um anticorpo e utilizado para libertação em local específico para um tumor expressando os antigénios de gangliósidos para os quais são específicos os anticorpos monoclonais da invenção.
Outros agentes terapêuticos que podem ser acoplados aos anticorpos monoclonais da invenção são conhecidos, ou podem ser facilmente determinados, por peritos na matéria.
E também possível utilizar lipossomas com os anticorpos monoclonais da invenção na sua membrana para libertar especifi camente o lipossoma na área do tumor que expressa antigénios de gangliósidos GD2 e GD3. Estes lipossomas podem ser produzidos de modo a que contenham, em adição ao anticorpo monoclonal, os agentes imunoterapêuticos como os descritos anteriormente, os quais serão então libertados no local do tumor (Wolff, et al. , Biochemica et Biophysica Apta, 802; 259, 1984).
As gamas de dosagem para a administração dos anticorpos monoclonais da invenção são as suficientemente amplas para pro duzir o efeito desejado no qual os sintomas do gangliósido que expressa o tumor são melhorados. A dosagem não deve ser tão ampla que cause efeitos secundários adversos, tais como reacções cruzadas não desejadas, reacções anafilácticas e análogas. Geralmente, a dosagem variará com a idade, condição, sexo e ex. tensão da doença no paciente e pode ser determinada por um peri
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-16to na matéria. A dosagem pode ser ajustada pelo médico do indivíduo para o caso de quaisquer contra-indicações, tolerância imunológica ou condições similares. A dosagem pode variar entre 0,1 mg/kg a 2000 mg/kg, de preferência entre 0,1 mg/kg a 2000 mg/kg/dose, em administrações diárias de uma ou mais doses, durante um ou vários dias. 0s anticorpos podem ser administrados via parentérica por injecção, ou por perfusão gradual ao longo do tempo. Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser administrados via intravenosa, intraperitoneal, intramuscu lar, subcutânea, intracavidade, ou transdérmica, isolados ou em combinação com células efectoras.
As preparações para administração parentérica incluem s_g luções, suspensões e emulsões estéreis aquosas ou não aquosas. Exemplos de solventes não aquosos são propileno-glicol, polietileno-glicol, óleos vegetais tais como o azeite e ésteres οχ gânicos injectáveis como o oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem a água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo meios salinos e tamponados. Veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, dextrose de Ringer lactada ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de electrólitos, tais como os baseados na dextrose de Ringer e análogos. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes cjo mo, por exemplo, agentes quelantes, anti-oxidantes, antimicrobianos e gases inertes e análogos.
A invenção também se refere a um método para a preparação de um medicamento ou composição farmacêutica compreendendo os anticorpos monoclonais da invenção, sendo o medicamento uti lizado para terapia de tumores que expressem os antigénios de gangliósidos reactivos com os anticorpos monoclonais da presejj te invenção.
anticorpo monoclonal pode ser utilizado na presente i_n venção. Obtém-se ME 361 a partir de, ou possuindo as características identificadoras de, um anticorpo obtido a partir da linha celular com o n2. de acesso HB 9325 do ATCC. Obtém-se ME 361-S2a a partir de, ou possuindo as caracteristicas identi
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-17ficadoras de um anticorpo obtido a partir de uma linha celular com o número de acesso HB 9326 do ATCC. Estas linhas celulares foram depositadas por 30 anos na American Type Culture Col. lection (ATCC) em Rockville, Maryland, antes de 19 de Feverei ro de 1987«
A exposição anterior descreve na generalidade a presente invenção. Pode obter-se uma compreensão mais completa por referência aos exemplos específicos que se seguem que são propor, cionados com a única finalidade de ilustração, e não pretendem limitar o âmbito da invenção.
EXEMPLO 1
PREPARAÇÃO DE LINHAS DE CÉLULAS DE HIBRIDOMA QUE PRODUZEM ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA ANTIGENIOS ASSOCIADOS A MELANOMA
A. Tecidos e Células
Têm sido descritas a origem e a subsistência da maioria das culturas de células de melanoma e de outras linhas de células (Herlyn, et al., Journal of the National Câncer Institute, 74:283, 1985 ; Herlyn, et al. , Câncer Investiqation, 1.:215, 1983; Clark, et al., Human Pathology, 15:1147, 1985). A origem e o conteúdo de gangliôsidos das culturas de células utili zadas são apresentados no quadro 1
QUADRO 1
ORIGEM E CONTEÚDO DE GD2 E GD3 DE CULTURAS SELECCIONADAS DE
CÉLULAS DE MELANONA
Pacientes A B C D
Primária WM 75 WM 115
(VGP) (GD2) (GD2+GD3)
Metastática WM 373 WM 266-4 WM 164 SK MEL 23
(MET) (GD3) (GD2+GD3) (GD3) (GD2+GD3)
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23176 : : - ' #*
-18Os tecidos foram obtidos e preparados como descrito por Thurin, et al. (Journal of Bioloqical Chemistry, 260:14556, 1985). Obtiveram-se linfócitos e monócitos a partir de sangue humano periférico com heparina por centrifugação num gradiente de densidade Ficoll-Hypaque em que a separação subsequente das células aderentes (monócitos) e células não-aderentes (linfóci tos) utilizando frascos revestidos de gelatina-plasma se reali zou como descreveram Steplewski, et al. (Science, 221:865. 1983).
Η II
As células killer naturais foram retiradas das preparações de monócitos por tratamento com anticorpo monoclonal anti-humano Leu-llb (Becton & Dickinson, Mountain Vietu, CA), utilizando uma concentração de 0,5 yxg/ml e complemento de coelho.
B. Imunização e Produção de Hibridomas
Imunizaram-se ratos BALB/c por via intraperitoneal com
3x10 células de cultura de células SK MEL 23 de melanoma metas, tático e quatro semanas depois aplicaram-se reforços por via ijn travenosa, com 2x10^ células. Três dias mais tarde as células de baço foram fundidas com a variante 653 de melanoma de ratinho P3X63 Ag8. 0 crescimento, clonação e manutenção dos hibri. domas produzidos foi como a descrita por Koproiuski, et al.
(Somatic Cell Genetics, 5.:957, 1979). Os anticorpos monoclonais produzidos pelos vários hibridomas foram analisados utili. zando sobrenadantes de cultura sem soro (Thurin, et al., Journal of Biological Chemistry, 260:14556, 1985) de várias culturas de células de cancro e de melanomas. 0 anticorpo monoclonal foi purificado como descrito por Lubeck, et al., (Oournal of Immunology) 135:1299, 1985). As variantes do hibridoma ligadas à classe fcram produzidas usando os procedimentos descri, tos por Steplewski, et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 82:8653, 1985).
A análise dos hibridomas em relação aos anticorpos monoclonais de interesse foi inicialmente realizada por medição da ligação aos sobrenadantes de cultura sem soro de culturas de células como se indica na figura 3. Como se mostra nesta fiqu ra, todas as culturas testadas libertaram o antigénio no meio. As culturas de células estabelecidas a partir de melanoma me67 367
23176
-19tastático libertaram quantidades um pouco maiores de material antigénico do que as estabelecidas a partir de melanoma primário. As culturas de células que não são de melanoma que não libertaram nenhum dos antigénios foram: astrocitoma SW 1783 e SW 1088, carcinoma colo-rectal SW 620, SW 707, SW 1116 e SW 1345, carcinoma gástrico ΚΑΤΟ III, carcinoma pancreático Capancarcinoma da vesícula TMOLT, Tera 1
2774 e CaOV3,
SW 75568, linfoblastóide Raji e sarcoma SW 648, teratocarcinoma
-2, carcinoma do ovário -24, carcinoma cervical leucemia HL-60 e K 562, e fibroblastos WI 38.
C. Glicolípidos de mePrepararam-se fracções de gangliósidos de células lanoma total tratadas com não alcalinos como indicado por Herlyn, et al. (Câncer Research, 45:5670, 1985). Realizou-se a purificação e caracterização dos gangliósidos essencialmente como descreveram Thurin, et al. (Oournal of Biological Chemistry, 260:14556, 1985). Efectuou-se a cromatografia em camada fina (TLC) utilizando placas de TLC de alta pressão com verso de vidro ou de alumina (Bodman Chemicals, Gibbstotun, N.3.). 0 sistema de solventes utilizado para o desenvolvimento das placas de TLC foi clorofórmio/metanol/0,2/£ CaCl V/V/V), e fez-se gente resorcinol 1985).
2 em H20 (60:40:9, a detecção das várias fracçães utilizando rea (Herlyn, et al., Câncer Research, 45:5670,
IDENTIFICAÇÃO D0
ME 361
EXEMPLO 2
ANTIGENIO DETECTADO PELO ANTICORPO MONOCLONAL teste em fase sólida de imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) e o teste radio-imunológico (RIA) foram realizados em placas de microtitulação com 96 reservatórios (Linbro/Tite_r tek, Flow Laboratories, McLean, VA para o ELISA e Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA para o RIA) com anticorpo monoclonal ME 361 purificado (1 jjug/pl) e ME 361-S2a (1 mg/ml) com antigénios de gangliósidos diluídos em série. Diluíram-se os gangliósidos, em série, em metanol e colocaram-se numa placa
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-20num volume de 50 y^l/reservatório. Testaram-se em ELISA (Thurin, et al., ibid) quatro amostras de cada diluição após evaporação do metanol a 22^0 e em RIA utilizando F(ab*)? anti-ratinho, de.
senvolvido em cabra e marcado com
como se gundo anticorpo (Hansson, et al., Oournal of Biological Chemistry» 258:4019» 1983). Para todos os valores o desvio padrão foi inferior a 1%, Os resultados do teste ELISA indicaram que os maiores níveis de ligação de ME 361 e ME 361-S2a foram do gangliósido GD2 seguido pelo gangliósido GD3 (Fig. 1). ME 361 e ME 361-S2a não apresentaram essencialmente reactividade com os gangliósidos GM4, GM3, GM2, GM1, GDla, GDlb, GTla, GQlb, e com disialoparaglobósido (III (Neu Ac^nLC^Cuer).
Realizou-se o teste de ligação por TLC essencialmente co mo descreveram Magnani, et al. (Methods in Enzymoloqy» 83:235. 1983), utilizando sobrenadantes de cultura de hibridoma como uma fonte de anticorpo e o mesmo segundo anticorpo mencionado anteriormente. Obtiveram-se resultados a partir dos glicolípi. dos de controlo negativo (500 ng/banda) a partir do teste de ligação em cromatograma, excepto GM1, que foi efectuado diluído em série, pelo ELISA e representado graficamente para simplicidade (Figura 1).
blotting1* de Western e a imunoprecipitação utilizando extractos e células, respectivamente de culturas de células de melanoma WM 75, WM 373, WM 115, WM 266-4, WM 164, e SK MEL 23, não revelaram formas de antigénios de glicoproteínas associadas ao anticorpo ME 361 (dados não representados).
As fracções totais de glicolípidos de cérebro e eritróci tos humanos indicaram que não houve reacção com outros ganglió sidos utilizando o teste de ligação sm cromatograma (TLC). Cçj mo se representa na figura 28, o anticorpo ME 361 mostrou ligar-se ao gangliósido GD2 (seta inferior) e também ao gangliósido GD3 (seta superior), consistente com os dados do ELISA. As bandas migratórias mais rápidas, vistas com maior clareza nas colunas 1, 4 e 10-11 na figura 28, desapareceram após tratamento com alcáli (figura 20). Isto indica que com toda a probabilidade é a presença das lactonas em GD2 que são reactivas com o anticorpo monoclonal ME 361. 0 anticorpo monoclo67 367
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4'.....Λ
-21nal ME 361 foi capaz de ligar-se às fracções totais dos gangli ósidos de todas as onze culturas de células de melanoma estuda das (figura 2, B e C).
EXEMPLO 3
ESPECIFICIDADE DO ANTICORPO MONOCLONAL ME 361 PARA TECIDO
A reactividade dos anticorpos monoclonais da invenção com secções criostáticas de lesões melanocíticas recentemente congeladas, fixadas como descreveram Ross, et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 81:6681, 1984), foi determinada utilizando o procedimento de peroxidase-antipe, roxidase por testes de imunoperoxidase (Ortho Diagnostic Systems Inc., Raritan, MO.). A ligação dos anticorpos monoclonais ao antigénio presente em sobrenadantes das culturas sem soro suplementadas foi determinada pelo RIA em fase sólida indirecta (Thurin, et al., Ibid). 0 blotting de Western e a imunoprecipitação foram realizados de acordo com o que descreveu Laemmli (Nature, (London), 227:680, 1970). No Quadro 2 apresenta-se a ligação do anticorpo monoclonal ME 361 a tecidos que representam todos os estádios da progressão do tumor de melanoma (Clark, et al., Human Pathology, 15:1147, 1985) utilizando a cloração com imunoperoxidase nas secções criostáticas congeladas.
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-22QUADRO 2
CLORAÇÃO COM IMUNOPEROXIDASE EM SECÇÕES CONGELADAS COM ME 361
T ecidos Número de casos Número de casos po. sitivos % de positivos
Melanócitos queratinócitos 71 0 0
nervos
células de Langerhans
Nevos 7 4 57
Nevos displásticos 51 19 37
Melanoma primário 10 6 60
Melanoma metastático 23 22 96
Linfócitos3 126 23 1Θ
Cérebro 1 1 100
Pâncreas 1 0 0
Fígado, rim, testículo lb 0 0
Sl Linfócitos em secções de lesões melanocíticas.
b Um caso cada.
A cloração celular foi difundida através do citoplasma. Na generalidade a reactividade foi de moderada a forte em intensidade, envolvendo 50% ou mais das células lesionadas na maioria dos casos. A reactividade ao cérebro foi confinada principalmente à mielina. Os nervos periféricos não foram reactivos em todos os tecidos estudados. A ligação de ME 361 a todas as fracções de gangliósidos na Figura 2 e a todas as células do Quadro 2 foi consistente com a elevada ligação a melanoma primário e metastático.
67 367 23176
- ’· -•'nsmigjjH
-2 3-
z EXEMPLO 4
LIGAÇÃO DE CELULfiS POR CITOMETRIA DE FLUXO DO ANTICORPO MONOCLONAL ME 361 e ME 361-S2a
Para a citometria de fluxo das culturas de células de me lanoma, as células de uma cultura de 75 cm foram sujeitas a tripsina no dia anterior ao teste e transferidas para outro frasco. Retiraram-se as células do frasco no dia do teste atra vés de uma pequena incubação com 0,1$ de EDTA em solução saliem , na tamponada com fosfato e re-sus penderam-se/meio de Hanks (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY) contendo 10% de soro humano inactivado pelo calor. Determinou-se a viabilidade utilizando a técnica de exclusão com azul tripan e verificou-se ser maior que 90$. Diluíram-se, então, as células a 4x10^ células/ml, e colocsram-se 250 yd. (1x10^ células) num tubo Eppendorf de 1,5 ml para cada teste. Adicionou-se, então, o anticorpo primário (50 yd) e incubou-se em gelo durante 30 minutos. Utilizou-se a sobrenadante de cultura não diluída do mieloma de ratinho P3X63 Ag8 como controlo negativo. Lavaram-se as células duas vezes, re-suspenderam-se e incubaram-se durante 30 minutos em 50 yi de F^b'^ anti-ratinho, desenvolvido em cabra marcado com fluoresceína, diluído 1/100 (Cappel, Worthington, P.A.) em meio de Hanks como anteriormente mencionado. Lavaram-se, então, as células duas vezes, re-suspenderam-se em 0,5 ml de meio de Hanks e conservaram-se em gelo durante menos de duas horas antes da citometria de fluxo. Utilizou-se um Ortho Citofluoró grafo 50 HH ligado a um micro-processador Data General MP/200 (Ortho Instruments, Westwood, MA) para determinações citométri. cas. As células foram consideradas positivas quando a sua intensidade de fluorescência excedeu o limiar no qual 99$ das cé lulas tratadas com anticorpo de controlo não reactivo (controlo negativo) tinham uma intensidade de fluorescência menor.
Os resultados obtidos a partir da ligação do anticorpo monoclonal ME 361 (ATCC HB 9325) e ME 361-S2a (ATCC HB 9326) utilizando a citometria de fluxo indirecta indicaram que a ligação ocorreu em todas as seis culturas de células que foram testadas (Quadro 3). ME 361 possui isótipo gama-3 e ME 361-S2a isótipo gama-2a.
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23176
-24QUADRO 3
LIGAÇÃO DO ANTICORPO ME 361 E ME 361-S2a fl CÉLULA DE MELANOMA
CULTURAS EH CITOMETRIA DE FLUXO INDIRECTA
Células Anticorpo3 /a média (número da ligação total de determinações) MCFb
WM 75 P3 2,7(2)
2a 30,1(2) 83
3 36,0(2) 76
WM 373 P3 3,8(2)
2a 11,2(3) 118
3 16,1(2) 138
WM 115 P3 1,6(2)
2a 74,2(2) 94
3 80,0(1) 90
WM 266-4 P3 2,5(2)
2a 91,6(3) 142
3 96,4(2) 172
WM 164 P3 1,2(3)
2a 5,6(2) 45
3 16,2(2) 57
SK MEL 23 P3 2,3(3)
2a 80,6(4) 141
3 93,9(2) 162
Q
P3, sobrenadante de cultura de mieloma de rato 3X63~Ag8; 2a, ju.g/ml de anticorpo ME 361-S2a purificado; e 3, fluído as. cítico contendo ME-361 diluído a 1/100.
b MCF, fluorescência média em canal.
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-25As células com a maior quantidade extractável de ganglió sido GD2 isto é, WM 75, WM 115, WM 226-4 e SK MEL 23 apresenta ram níveis mais altos de ligação a anticorpo do que as culturas WM 373 e WM 164, que contêm quantidades relativamente peque, nas de GD2. Contudo, as células WM 373 e WM 164 possuíam quan, tidades suficientes de gangliósidos GD3, por isso, apesar da fraca reactividade do anticorpo ao GD3 (Fig. 1), estas culturas foram ainda capazes de ligar ME 361 e ME 361-S2a (Quadro 3), Outras culturas de células de melanoma que também foram reacti. vas com o anticorpo monoclonal ME 361 e ME 361-S2a foram WM 9, WM 46 e a cultura de células de neuroblastoma IMR-5.
EXEMPLO 5
CITOTOXICIDADE DE ME 361 MEDIDA PELA CITOTOXICIDADE DAS CÉLULAS DEPENDENTES DO ANTICORPO (ADCC) E CITOTOXICIDADE DEPENDENTE DO COMPLEMENTO (CDC)
A ADCC foi medida utilizando um teste de libertação de H^In durante 18 horas. No teste, o fluído ascítico foi utili. zado numa diluição de 1/100, que foi a diluição mais alta que apresentou a lise, significativa no teste, titulada em cultura de células de melanoma WM 164. Não se fizeram tentativas para comparar a eficiência killingdos dois isótipos diferentes ME 361, visto que o anticorpo purificado gama-3 (ME 361) foi difí cil de solubilizar nas concentraçães desejadas. Contudo, o an. ticorpo monoclonal purificado gama-2a (ME 361-S2a) na concentração de 10 ^g/ml apresentou o mesmo efeito que as diluiçães a 1/100 de fluido ascítico. As células alvo (1x10^) foram maj? cadas com 10 pCi de oxina de índio (Medi-Physics Inc.,
Emeryville, CA) durante 15 minutos em 15 pl de solução salina a 215C, Lavaram-se as células três vezes em meio e adicionaram-se a 1x10^ células/reservatório em placas de microtitulação de fundo redondo (Linbro, Flow Laboratores, McLean, VA). No teste da ADCC, as células efectoras e as várias concentraçães de anticorpos monoclonais fcram adicionadas em triplicado e incubadas durante 18 horas a 373C em 5/a de C02» As placas foram, então, centrifugadas a 80 g durante dois minutos. Co67 367
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-26- ~ ' lheram-se os sobrenadantes e analisaram-se utilizando um conta dor gama. A percentagem de citotoxicidade foi calculada pela fórmula seguinte:
CPM experimental - CPM expontâneo fo de citotoxicidade = ------------------------------------------ x 100
CPM inicio (input) - CPM expontâneo
Os valores obtidos estão representados no Quadro 4 e reflectem os números obtidos depois de terem sido subtraídos os valores de controlo (percentagem de libertação de 11-1In sem anticorpo monoclonal ME 361 ou ME 361-S2a). Um desvio padrão nestas determinações foi inferior a 10^ para todos os valores.
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3176 J1 ...7--27QUADRO 4
ADCC E CDC CONTRA SEIS CULTURAS DE CÉLULAS DE MELANOMA EM TESTE
DE LIBERTAÇÃO DE 1UIn
Isótipo Células de anticorpo Q Monócitos u Linfócitos CDC
ME 361 #1 #2 ^1 #2 £1
WM 75 3 48,3— 41,1 28,5 35,1 49,3
2a 36,4 29,9 30,1 35,1 24,7
WM 373 3 22,8 15,5 17,4 19,2 15,1
2a 12,4 7,2 6,7 7,9 2,8
WM 115 3 27,6 21,8 19,1 21,7 19,1
2a 15,6 9,4 7,4 15,8 1,1
WM 266-4 3 29,8 27,6 24,7 24,4 46,1
2a 17,6 13,7 12,1 24,3 7,2
WM 164 3 29,8 30,4 13,1 26,2 36,2
2a 12,3 14,5 6,7 15,2 15,2
S!< MEL 23 3 48,9 34,4 35,7 32,0 59,9
2a 41,3 26,6 22,2 35,3 64,6
a A proporção de células efectoras para células alvo é de 50:1.
& Indica dadores de linfócitos de sangue periférico.
c Expresso como / da citotoxicidade em relação à linha de fundo que em nenhum dos casos foi superior a 10/ em ADCC e a 6/0 em CDC.
Para o teste CDC, as células alvo marcadas com foram incubadas em placas de microtitulação com 40/ de plasma au. tólogo de dadores humanos e várias concentrações de anticorpos monoclonais.
Na avaliação da actividade ADCC e CDC do ME 361 e ME 361-S2a, seleccionaram-se seis culturas de células de melanoma que tinham padrões diferentes de gangliósidos. Estas culturas de células descrevem-se no Quadro 1. Todas as células foram signi
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23176
-28ficativamente lisadas em ADCC quando eram monócitos e linfócitos humanos, utilizando uma proporção de células efectoras para células alvo de 50:1, bem como em CDC com complemento em teste de libertação de ^In durante 18 horas (Quadro 4). A eficiência killing de ME 361 e ME 361-S2a foi significativamente maior (ρ^Ο,ΟΙ, teste T de Student) utilizando todos os quatro valores) para as células WM 75 do que para as células WM 373. Este resultado é consistente com a maior concentração de GD2 e níveis mais altos de ligação do anticorpo nas células WM 75. Contudo não se verificou diferença significativa entre a lise das células WM 115 e WM 266-4 (derivadas de um ónico in divíduo) o que se correlaciona bem com os padrões similares de gangliósidos destas culturas. A ligação do anticorpo no teste de citometria de fluxo indirecto, descrito anteriormente, foi também semelhante para as células WM 115 e WM 266-4, isto é, 73% e 83% respectivamente (Quadro 3). A distribuição da maioria dos gangliósidos GM3, GM2, GD 3 e GD2 nestas culturas de células foi semelhante, em contraste nítido com o padrão verificado para as células WM 75, nas quais GD2 foi o gangliósido principal, e para as células WM 373, em que GD3 foi o gangliósido principal e GD2 foi encontrado apenas em pequenas quantidades (figuras 2, A e B, faixas 1-4). No caso das duas cultu, ras de células de diferentes indivíduos, a ligação do anticorpo monoclonal e o killing” de células expressando quer GD2 quer GD3 (SK MEL 23) foi superior ao das células expressando somente GD3 (WM 164).
Estando agora a invenção descrita na totalidade, será evidente para os peritos na matéria que podem fazer-se muitas alterações e modificações sem sair do espírito ou âmbito da in venção.
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R E j [ V J INDICAÇÕES

Claims (22)

1 - Linha de células de hibridoma contínua, caracterizada por ser capaz de segregar anticorpos monoclonais reactivos com antigénios de gangliósidos GD2 e GD3 e por ser essencialmente não reactiva com outros antigénios de gangliósidos.
2 - Hibridoma de acordo com a reivindicação 1, caracterí zado por ser seleccionado de entre o grupo que consiste em ATCC HB 9325 e ATCC HB 9326 e as suas variantes de comutação isotípica.
3 - Anticorpo monoclonal reactivo com antigénios de gangliósidos GD2 e GD3 caracterizado por ser, de preferência, reactivo com GD2 e ser essencialmente não reactivo com GQ lb.
4 - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ser produzido por uma linha de células seleçi cionada do grupo que consiste em ATCC HB 9325 e ATCC HB 9326.
5 - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por possuir a especificidade de um anticorpo monoclonal produzido pela linha de células de hibridoma ATCC HB
9325.
6 - Anticorpo quimérico caracterizado por compreender os domínios e de um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 3.
7 - Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal ser produzido por uma linha de células seleccionada de entre o grupo que consiste em ATCC HB 9325 e ATCC HB 9326.
Θ - Método de detecção de antigénios de gangliósidos GD2 ou GD3, caracterizado por se fazer contactar uma fonte que se suspeita conter GD2 ou GD3 com uma quantidade de anticorpo majr cado de forma detectável, ou de um seu fragmento, eficaz para diagnóstico sendo o referido anticorpo reactivo com antigénios
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-30de gangliósidos GD2 e GD3 e essencialmente não reactivo com oju tros antigénios de gangliósidos e por se determinar se o anticorpo se liga à referida fonte.
9 - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o anticorpo ser produzido por uma linha de células sele£ cionada de entre o grupo que consiste em ATCC HS 9325 e ATCC HB
9326.
10 - Método de acordo com a reivindicação 8, caracteriz^ do por a detecção se realizar in vivo»
11 - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a marcação detectável ser seleccionada de entre o gru po que consiste numa marcação rádio-isotópica e numa marcação paramagnética.
12 - Método de acordo com a reivindicação 8, caracteriz£ do por a detecção se realizar in vitro.
13 - Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a marcação detectável ser seleccionada de entre o gru. po que consiste num rádio-isótopo, num composto fluorescente, num composto quimiluminescente, num composto bioluminiscente e numa enzima.
14 - Método para suprimir uma doença maligna num animal caracterizado por compreender a administração ao referido animal de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou de um seu fragmento sendo o referido anticorpo reactivo com antigénios de gangliósidos GD2 e GD3 e essencialmente não reaç; tivo com outros antigénios de gangliósidos.
15 - Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o referido anticorpo ser produzido por uma linha de células seleccionada de entre o grupo que consiste em ATCC HB 9325 e ATCC HB 9326.
16 - Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a referida doença maligna ser melanoma.
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3 ou 6 com
24 rizado por noma.
Lisboa,
17 - Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a referida administração ser parenteral.
18 - Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a referida administração parenteral ser por injecção subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intracavidade, transdérmica ou intravenosa.
19 - Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a referida administração ser constituída por uma dosa^ gem compreendida entre 0,01 mg/kg a 2000 mg/kg/dose.
20 - Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o referido anticorpo ser administrado em combinação com células efectoras.
21 - Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o referido anticorpo ser terapeuticamente marcado.
22 - Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a referida marcação terapêutica ser seleccionada de entre o grupo que consiste num rádio-isótopo, numa droga, num imuno-modulador, num modificador de resposta biológica, numa le citina e numa toxina.
23 - Processo para a preparação de uma composição farama cêutica caracterizado por se misturar quantidades de anticorpo, supressores de doença maligna, de acordo com as reivindicações um veículo farmacêuticamente inerte.
Processo de acordo com a reivindicação 23, caractea doença maligna que se pretende suprimir ser mela-
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