BRPI1015350B1 - Célula do hibridoma, anticorpo isolado ceacam1 ou fragmento de anticorpo, método para diagnosticar um câncer em um sujeito em necessidade do mesmo e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

anticorpos de anti-ceacam1 e métodos de usar os mesmos uma célula do hibridoma que foi depositada sob o número de acesso de atcc pta-9974 é revelada. também fornecidos são anticorpos e métodos de usar os mesmos.

Description

Campo e Antecedentes da Invenção

[001]A presente invenção, em algumas modalidades da mesma, diz respeito aos anticorpos de anti-CEACAM1, às células do hibridoma produzindo os mesmos e aos métodos de usar os mesmos.

[002]A proteína da transmembrana CEACAM1 [também conhecida como gli- coproteína biliar (BGP), CD66a e C-CAM1] é um membro da família de antígenos carcinoembriônicos (CEA) que também pertence à superfamília das imunoglobuli- nas. CEACAM1 interage com outras proteínas CD66 conhecidas, incluindo as prote-ínas CD66a, CD66c, e CD66e. É expressada em um amplo espectro de células, va-riando de células epiteliais àquelas de origem hemopoiéticas (por exemplo células imunes).

[003]Muitas funções diferentes foram atribuídas à proteína CEACAM1. Foi mostrado que a proteína CEACAM1 apresenta propriedades antiproliferativas em carcinomas de cólon, próstata, como também outros tipos de câncer. Dados adicio-nais confirmar o envolvimento central de CEACAM1 em angiogênese e metástase. CEACAM1 também representa um papel na modulação de respostas imunes natu-rais e adaptáveis. Por exemplo, CEACAM1 foi mostrada ser um receptor inibidor para células T ativadas contidas dentro do epitélio intestinal humano [vide WO99/52552 e Morales et al. J. Immunol. 163 (1999), 1363-1370]. Relatórios adicionais indicaram que o envolvimento de CEACAM1 ou por reticulação de TCR com mAb ou por meio das proteínas Opa de Neisseria gonorrhoeae inibem a ativação e proliferação de células T.

[004]Melanoma é uma malignidade das células produtoras de pigmento (me- lanócitos), responsáveis por 75% da incidência relacionada ao câncer de pele mundial, principalmente devido à metástase extensiva. Melanoma metastático (MM) responde em nível baixo à maioria dos regimes anticâncer e a média de sobrevivência geral para pacientes com MM são 8,5 meses. CEACAM1 raramente é expressa por melanócitos normais, mas frequentemente encontrada em células de melanoma. Expressão de CEACAM1 em lesões primárias de melanoma cutâneo prognostica expressivamente o desenvolvimento da doença metastática com prognóstico ruim. Além disso, expressão de CEACAM1 aumentada foi observada em células NK derivadas de alguns pacientes com melanoma metastático comparado com doadores saudáveis.

[005]WO2007/063424 e Pedido de Patente U. S. 20070110668 revelam mé-todos para regular o sistema imune, e em particular métodos para a regulação de uma resposta imune específica, incluindo a regulação da atividade dos linfócitos. Estes métodos compreendem a modulação tanto negativa como positiva da função da proteína CEACAM1.

[006]O Pedido de Patente U. S. 20070071758 revela métodos e composições para o tratamento e diagnose de cânceres. Especificamente, o Pedido de Patente U. S. 20070071758 ensina métodos e composições para intensificar a eficácia da terapia de linfócitos infiltrante do tumor (TIL) no tratamento de câncer mediante modulação negativa da atividade da proteína CEACAM1, tal como, por exemplo, usando uma imunoglobulina específica para CEACAM1.

[007]O Pedido de Patente U. S. 20080108140 revela métodos de modular respostas imunes específicas para criar uma imunidade protetora no tratamento de doenças autoimunes e doenças que requerem a transplantação de tecido. Em parti-cular, trata-se o Pedido de Patente U. S. 20080108140 da supressão das respostas imunes em uma maneira orientada, aumentando a concentração funcional da proteí-na CEACAM1 no tecido alvo.

[008]O Pedido de Patente U. S. 20040047858 revela anticorpos específicos (isto é, 34B1, 26H7 e 5F4) que são capazes de modular a atividade das células T por meio de CEACAM1 e usos dos mesmos tais como no tratamento de doenças relacionadas à resposta imune (por exemplo, doença de hospedeiro versus enxerto, doenças autoimunes, cânceres etc.).

[009]O Pedidos de Patente U. S. 20020028203, 20050169922 e 20080102071 revelam composições que ligam as moléculas do receptor inibidor de células T e modulam (isto é, intensificam ou suprimem) a atividade das células T (por exemplo, citotoxicidade e proliferação), tal como agentes de ligação de glicoproteí- nas biliares, e métodos de usar tais composições tais como para o tratamento de doenças (por exemplo, uma doença autoimune, imunodeficiência, câncer etc.).

Outra técnica relacionada:

[010]mAb de 5F4: Regulação da função citolítica de linfócitos intraepiteliais intestinais por meio da glicoproteína biliar (CD66a) [Morales VM et al., J Immunol. (1999) 163(3):1363-70].

[011]GM8G5 e 29H2 - ambas comercialmente disponíveis de Abcam Inc. abcamdotcomdotportal.

Sumário da Invenção

[012]De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente in-venção, é fornecida uma célula do hibridoma que foi depositada sob o Número de Acesso de ATCC PTA-9974.

[013]De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente in-venção, é fornecido um anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo compreendendo um domínio de reconhecimento de antígeno tendo as sequências de CDR e orienta-ção do anticorpo produzido da célula do hibridoma.

[014]De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente in-venção, é fornecido um método de imunomodulação, o método compreendendo con- tatar um linfócito de expressão de CEACAM1 com o anticorpo ou fragmento de anti-corpo.

[015]De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente in-venção, é fornecido um método de inibir migração ou proliferação de uma célula tu-moral de expressão de CEACAM1, o método compreendendo contatar a célula tu-moral de expressão de CEACAM1 com o anticorpo ou fragmento de anticorpo, assim inibindo a migração ou proliferação de uma célula tumoral de expressão de CEACAM1.

[016]De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente in-venção, é fornecido um método para diagnosticar um câncer em um sujeito em ne-cessidade do mesmo, o método compreendendo contatar uma amostra biológica derivada do sujeito com o anticorpo ou fragmento de anticorpo, em que uma forma-ção complexa além de um limiar pré-determinado é indicativo do câncer no sujeito.

[017]De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente in-venção, é fornecido um método de tratar câncer, o método compreendendo adminis-trar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente efe-tiva do anticorpo ou fragmento de anticorpo, assim tratando o câncer no sujeito.

[018]De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente in-venção, é fornecido um método de inibir interação de proteína-proteína homotípica ou heterotípica de CEACAM1, o método compreendendo contatar um linfócito de expressão de CEACAM1 com o anticorpo ou fragmento de anticorpo, assim inibindo a interação de proteína-proteína homotípica ou heterotípica de CEACAM1.

[019]De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente in-venção, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo como um ingre-diente ativo o anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[020]De acordo com algumas modalidades da invenção, o anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo é ligado a uma metade citotóxica.

[021]De acordo com algumas modalidades da invenção, a metade citotóxica compreende uma citotoxina, uma quimocina, uma quimioterapia, um pró-apoptótico, uma interferona, uma metade radioativa, ou combinações dos mesmos.

[022]De acordo com algumas modalidades da invenção, o anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo é ligado a uma metade identificável.

[023]De acordo com algumas modalidades da invenção, as células cancero-sas são caracterizadas por supraexpressão de CEACAM1 quando comparada às células não afetadas.

[024]De acordo com algumas modalidades da invenção, o método de tratar câncer ainda compreende administrar ao sujeito linfócitos.

[025]De acordo com algumas modalidades da invenção, os linfócitos com-preendem células T ou células NK.

[026]De acordo com algumas modalidades da invenção, o linfócito de ex-pressão de CEACAM1 é um Linfócito Infiltrante do Tumor ou célula NK.

[027]De acordo com algumas modalidades da invenção, o linfócito de ex-pressão de CEACAM1 é uma célula T citotóxica.

[028]De acordo com algumas modalidades da invenção, a célula tumoral compreende uma célula tumoral de melanoma.

[029]De acordo com algumas modalidades da invenção, o câncer é mela-noma.

[030]A menos que do contrário definido, todos os termos técnicos e/ou cien-tíficos aqui usados têm o mesmo significado que comumente entendido por alguém de habilidade usual na técnica ao qual a invenção se refere. Embora métodos e ma-teriais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na práti-ca ou teste das modalidades da invenção, métodos e/ou materiais exemplares são descritos abaixo. No caso de conflito, o relatório de patente, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos apenas e não são intencionados ser necessariamente limitativos.

Breve Descrição dos Desenhos

[031]Algumas modalidades da invenção são aqui descritas, por via de exemplo apenas, com referência aos desenhos em anexo. Com referência específica agora aos desenhos em detalhes, é enfatizado que os particulares mostrados são por via de exemplo e para propósitos de debate ilustrativo das modalidades da invenção. Nesta consideração, a descrição considerada com os desenhos torna evidentes àqueles versados na técnica como as modalidades da invenção podem ser praticadas.Nos desenhos:

[032]Figs. 1A-B descrevem a especificidade de mAb de MRG1. Células B parentais de 721.221 estavelmente transfeccionadas com CEACAM1 (verde), CEACAM5 (vermelho), CEACAM6 (roxo), CEACAM8 (azul) ou controle negativo (preto) foram submetidas à análise de FACS usando os anticorpos de CEACAM anti- humanos diferentes: mAb de MRG1 (Figura 1A) e mAb de Kat4c (Figura 1B).

[033]FIG. 2 descreve uma inibição dose-dependente das interações homofí- licas de CEACAM1 pelo MRG1 de mAb de anti-CEACAM1. MAb de anti-CEACAM1 foi adicionado a BW/CEACAM1 (células efetoras) ou 221/CEACAM1 (células alvo) em várias concentrações. Seguindo incubação de uma hora em gelo, as células re-cíprocas (221/CEACAM1 ou BW/CEACAM1) foram adicionadas e a secreção de IL-2 de camundongo foi medida por ELISA. 100% são definidos como a atividade na au-sência de qualquer anticorpo. Os resultados de um experimento representativo de quatro são apresentados, cada um executado em triplicatas.

[034]FIG. 3 descreve a abolição da função inibidora de CEACAM1. MAb de MRG1 foi pré-incubado com células alvo (representadas em cinza) ou com células efetoras (representadas em branco). As células incubadas sem a adição do mAb estão representadas em preto. As linhagens de melanoma indicadas (526mel, 624mel ou 09mel) foram usadas como células alvo. Células TIL014 foram usadas como células efetoras em uma razão de E:T de 10:1. Seguindo incubação de uma hora em gelo, as células recíprocas foram adicionadas e coincubadas durante 5 ho-ras a 37°C. Células alvo foram pré-marcadas com tintura fluorescente verde (CFSE) e lise específica foi determinada por meio de cotingimento de Iodeto de Propídio (PI) em citometria de fluxo. Morte espontânea foi subtraída. Ensaio foi executado em tri- plicatas.

[035]FIG. 4 descreve o bloqueio da invasão de melanoma por meio de mAbs de MRG1. Células de melanoma (08mel ou 09mel) foram pré-incubadas na ausência ou presença de 1 μg/ml de mAb de MRG1 e depois testadas por meio de ensaios de invasão de Matrigel. Invasão foi permitida por 24 horas e a quantidade de células invasoras foi quantificada com XTT padronizado.

[036]FIG. 5 descreve o bloqueio da proliferação livre das células de mela-noma por meio de mAbs de MRG1. Células de melanoma de 526mel foram incuba-das com as doses indicadas (0,5 μg, 1 μg ou 3 μg) de mAbs de MRG1 e a proliferação foi monitorada 2 dias ou 5 dias seguindo o tratamento.

[037]Figs. 6A-B descrevem a inibição do crescimento de tumor humano in vivo em camundongos SCID por injeções sistêmicas de MRG1 quando comparadas a PBS. Experimentos foram executados em dois planejamentos como segue: Figura 6A: injeções simultâneas do anticorpo (0,5 mg/camundongo intraperitonealmente) e inoculação das células cancerosas (5.000.000 células subcutaneamente); Figura 6B: tratamento dos tumores gerados em camundongos SCID (volume do tumor de 75 mm3) por injeções de anticorpo de MRG1 (como indicado acima).

[038]FIG. 7 descreve a eficácia intensificada na inibição do crescimento do tumor por uma combinação de MRG1 com administração intravenosa de TIL reativo humano quando comparado ao TIL intravenoso apenas.

[039]FIG. 8 descreve o efeito superior de mAb de MRG1 em anticorpos mo- noclonais de anti-CEACAM1 previamente descritos, como também anticorpo policlo- nal de coelho comercialmente disponível visando CEACAM1 humana (DAKO, Glos- trup, Dinamarca), como determinado por ensaio de bloqueio funcional. Vários anticorpos de anti-CEACAM1 foram testados para bloqueio da atividade de CEACAM1, como relatado pela secreção de mIL-2. 100% foram definidos como atividade na ausência de qualquer anticorpo. Os resultados de um experimento representativo de três são apresentados, cada um executado em triplicatas.Descrição das Modalidades da Invenção

[040]A presente invenção, em algumas modalidades da mesma, diz respeito a anticorpo monoclonal de anti-CEACAM1 e células do hibridoma produzindo o mesmo como também métodos de usar o anticorpo em imunomodulação e tratamento de câncer.

[041]Antes de explicar pelo menos uma modalidade da invenção em deta-lhes, é para ser entendido que a invenção não é necessariamente limitada em sua aplicação aos detalhes expostos na descrição seguinte ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras modalidades ou de ser praticada ou reali-zada de vários modos.

[042]O inventor presente produziu por meio de experimentação laboriosa e triagem um anticorpo monoclonal seletivo para CEACAM1. Este anticorpo foi mos-trado ser superior aos outros anticorpos monoclonais de anti-CEACAM1 como de-monstrado pelos ensaios de bloqueio funcional.

[043]Como é ilustrado aqui abaixo, o anticorpo de MRG1 produzido de acor-do com os ensinamentos presentes, é seletivo para CEACAM1 e não reage cruzado com outros membros da família de CEACAM (isto é, CEACAM 5, 6 e 8, vide Exemplo 2). O anticorpo inibe as interações homofílicas de CEACAM1, como determinado por coincubação das células efetoras imunes e células de melanoma alvo e ensaio de secreção de IL-2 e lise celular (vide Exemplo 3). Além disso, o anticorpo foi mos- trado efetivo em inibir a invasão e proliferação das células de melanoma. Por fim, administração in vivo do anticorpo ou sozinho ou em combinação com linfócitos rea-tivos foi mostrada efetiva em inibir crescimento de tumores de melanoma. De modo geral, os ensinamentos presentes sugerem que o anticorpo de MRG1, fragmentos e derivados possam ser usados como uma ferramenta efetiva para imunomodulação e tratamento de câncer.

[044]Desse modo, de acordo com um aspecto da invenção, é fornecida uma célula do hibridoma que foi depositada sob Número de Acesso de ATCC PTA-9974.

[045]De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo compreendendo um domínio de reconhecimento de antígeno tendo os segmentos de CDR e orientação do anticorpo produzido da célula do hibridoma, descrita acima.

[046]O anticorpo dos ensinamentos presentes é capaz de ligar CEACAM1 com uma afinidade mínima de 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 M.

[047]Como aqui usado o termo “CEACAM1” refere-se ao produto de proteína do gene de CEACAM1, por exemplo, NP_001020083.1, NP_001703.2.

[048]O termo “anticorpo”, como usado nesta invenção, inclui moléculas intac-tas como também fragmentos funcionais das mesmas, tais como Fab, F(ab’)2, e Fv que são capazes de ligar aos macrófagos. De acordo com uma modalidade exemplar, o anticorpo é um anticorpo monoclonal tal como denominado aqui, MRG1. Fra-gmentos de anticorpo funcionais são definidos como segue: (1) Fab, o fragmento que contém um fragmento de ligação de antígeno monovalente de uma molécula de anticorpo, pode ser produzido por digestão do anticorpo inteiro com a enzima papaí- na para render uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada; (2) Fab’, o fragmento de uma molécula de anticorpo que pode ser obtido tratando o an-ticorpo inteiro com pepsina, seguido por redução, para render uma cadeia leve intac-ta e uma porção da cadeia pesada; dois fragmentos Fab’ são obtidos por molécula de anticorpo; (3) (Fab’)2, o fragmento do anticorpo que pode ser obtido tratando o anticorpo inteiro com a enzima pepsina sem redução subsequente; F(ab’)2 é um dí- mero de dois fragmentos Fab’ mantidos unidos por duas ligações de dissulfeto; (4) Fv, definido como um fragmento geneticamente engenheirado contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressas como duas cadeias; e (5) anticorpo de cadeia simples (“SCA”), uma molécula geneticamente engenheirada contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da ca-deia pesada, ligadas por um ligante polipeptídico adequado como uma molécula de cadeia simples geneticamente fundida.

[049]Como indicado acima, o anticorpo da presente invenção tem a mesma orientação das regiões de determinação de complementaridade (CDR) como que do anticorpo produzido pela célula do hibridoma, tendo os detalhes de depósito como descritos acima. Isto é, CDR1, CDR2, CDR3 são colocadas na mesma orientação nas cadeias VH e VL.

[050]Fragmentos de anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser preparados por hidrólise proteolítica do anticorpo ou por expressão em células de E. coli ou mamíferas (por exemplo, cultura de células de ovário de hamster chinês ou outros sistemas de expressão de proteína) do DNA que codifica o fragmento. Fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por digestão pepsina ou papaína de anticorpos inteiros pro meio de métodos convencionais. Por exemplo, fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por clivagem enzimática dos anticorpos com pepsi- na para fornecer um fragmento 5S denotado F(ab’)2. Este fragmento pode ser ainda clivado usando um agente redutor de tiol, e opcionalmente um grupo de bloqueio para os grupos sulfidrila resultantes da clivagem das ligações de dissulfeto, para produzir fragmentos monovalentes 3.5S Fab’. Alternativamente, uma clivagem enzi- mática usando pepsina produz dois fragmentos Fab’ monovalentes e um fragmento Fc diretamente. Estes métodos são descritos, por exemplo, por Goldenberg, Pats. U. S. 4.036.945 e 4.331.647, e referências nelas contidas, cujas patentes são, por este meio, incorporadas por referência em sua totalidade. Vide também Porter, R. R. [Bi- ochem. J. 73: 119-126 (1959)]. Outros métodos de clivar anticorpos, tais como sepa-ração das cadeias pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadeias leve- pesada, clivagem adicional de fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas, ou genéticas podem também ser usados, contanto que os fragmentos liguem ao an- tígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

[051]Fragmentos Fv compreendem uma associação de cadeias VH e VL. Esta associação pode ser não-covalente, como descrita em Inbar et al. [Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (1972)]. Alternativamente, as cadeias variáveis podem ser ligadas por uma ligação de dissulfeto intermolecular ou podem ser reticuladas por meio de compostos químicos tais como glutaraldeído. Preferivelmente, os fragmentos Fv compreendem cadeias VH e VL conectadas por um ligante de peptídeo. Estas proteínas ligantes de antígeno de cadeia simples (sFv) são preparadas construindo um gene estrutural compreendendo as sequências de DNA que codificam os domínios VH e VL conectados por um oligonucleotídeo. O gene estrutural é inserido em um vetor de expressão que é subsequentemente introduzido em uma célula hospedeira tal como E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma cadeia de polipeptídeo simples com um peptídeo ligante que atravessa os dois do-mínios V. Os métodos para produzir sFvs são descritos, por exemplo, por [Whitlow e Filpula, Methods 2: 97-105 (1991); Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993); e Pat. U. S. 4.946.778, que é por este meio incorporada por referência em sua totalidade.

[052]Outra forma de um fragmento de anticorpo é um peptídeo que codifica para uma região de determinação de complementaridade simples (CDR). Peptídeos de CDR (“unidades de reconhecimento mínimo”) podem ser obtidos construindo ge-nes que codificam a CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, usando a reação em cadeia de polimerase para sintetizar a região va-riável de RNA das células produtoras de anticorpo. Vide, por exemplo, Larrick e Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)]. De acordo com algumas modalidades da presente in-venção, as CDRs podem ser implementadas em qualquer forma de um anticorpo tal como pelo uso de tecnologia de DNA recombinante.

[053]As formas humanizadas de anticorpos não-humanos (por exemplo, mu- rinos) são moléculas quiméricas das imunoglobulinas, cadeias da imunoglobulina ou fragmentos dos mesmos (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab’).sub.2 ou outras subse- quências de ligação de antígeno dos anticorpos) que contém sequência mínima de-rivada de imunoglobulina não-humana. Anticorpos humanizados incluem imunoglo- bulinas humanas (anticorpo recipiente) em que os resíduos que formam uma região de determinação de complementar (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não-humana (anticorpo doador) tal como ca-mundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade deseja-das. Em algumas circunstâncias, resíduos da estrutura de Fv da imunoglobulina hu-mana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Anticorpos hu-manizados podem também compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recipiente nem nas sequências de CDR ou de estrutura importadas. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todas de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis em que todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não- humana e todas ou substancialmente todas as regiões de FR são aquelas de uma sequência consenso da imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante da imunoglobulina (Fc), tipicamente à de uma imunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

[054]Métodos para humanizar anticorpos não-humanos são bem conhecidos na técnica. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de amino- ácido introduzidos no mesmo de uma fonte que é não-humana. Estes resíduos de aminoácidos não-humanos são frequentemente referidos como resíduos de importa-ção que são tipicamente tirados de um domínio variável de importação. Humaniza-ção pode ser essencialmente executada seguindo o método de Winter e colaborado-res [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], substituindo as CDRs ro-edor ou sequências de CDR pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméri-cos (Pat. U. S. 4.816.567), em que substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos nos anticorpos de roedor.

[055]Anticorpos humanos podem também ser produzidos usando várias téc-nicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibição de fago [Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. Similarmente, anticorpos humanos podem ser feitos por introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos em que os genes de imunoglobulina endógena foram parcial ou completamente ina- tivados. Sob desafio, produção de anticorpo humano é observada, que estritamente se assemelha ao visto sob todos os aspectos em seres humanos, incluindo rearranjo gênico, conjunto, e repertório de anticorpo. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Pats. U. S. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, e nas publicações científicas seguintes: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).

[056]De acordo com algumas modalidades da invenção, o anticorpo é ligado a uma metade citotóxica.

[057]De acordo com algumas modalidades da invenção, o anticorpo é ligado a uma metade identificável.

[058]A metade identificável pode ser um membro de um par de ligação que é identificável por meio de sua interação com um membro adicional do par de ligação e uma marcação que é visualizada diretamente. Em um exemplo, o membro do par de ligação é um antígeno que é identificado por um anticorpo marcado correspondente. Em um exemplo, a marcação é uma proteína fluorescente ou uma enzima que produz uma reação colorimétrica.

[059]A Tabela 1 seguinte fornece exemplos de sequências de metades iden-tificáveis.

[060]A metade citotóxica ou terapêutica pode ser, por exemplo, uma metade citotóxica, uma metade tóxica, uma metade de citocina, uma metade de anticorpo biespecífico, uma citotoxina, uma quimocina, uma quimioterapia, um pró-apoptótico, interferona, uma metade radioativa, ou combinações das mesmas, exemplos destas é fornecido infra.

[061]A Tabela 2 seguinte fornece exemplos de sequências de metades tera-pêuticas.

[062]Será apreciado que tais fusões podem ser realizadas usando conjugação química ou por meio de tecnologia de DNA recombinante.

[063]O anticorpo da presente invenção pode diminuir as interações homofíli- cas (ou homotípicas) ou heterotípicas de CEACAM1 inibidor para assim aumentar a atividade dos linfócitos. As interações homofílicas de CEACAM1 ocorrem por meio do domínio N. Vários aminoácidos são cruciais para esta interação, incluindo R43, Q44, D64 e R82. A interação causa fosforilação de um resíduo de tirosina citoplás- mica que recruta a SHP-1 fosfatase. Isto inicia uma cascata inibidora dentro dos lin- fócitos, que visa mediadores proximais tais como ZAP70.

[064]Desse modo, o anticorpo da presente invenção pode ser usado para bloquear CEACAM1 em qualquer uma ou ambas as células efetoras imunes (linfóci- tos de expressão de CEACAM1, por exemplo, células infiltrantes de tumor, células T ou células NK) e células alvo (por exemplo, células patológicas de expressão de CEACAM1 tais como células cancerosas). Exemplos de células cancerosas que são candidatos para esta terapia incluem, mas não são limitadas a, células de melanoma, pulmão, tiróide, mama, cólon, próstata, hepáticas, bexiga, renais, cervicais, pan- creáticas, leucemia, linfoma, mielóides, ovarianas, útero, sarcoma, biliares, ou en- dometriais.

[065]A presente invenção também contempla anticorpos isolados ou fragmentos de anticorpo que competem para ligar a CEACAM1 com os anticorpos produzidos pela célula do hibridoma acima descrita. Aqueles anticorpos podem ser anticorpos humanizados, xenogênicos, ou quiméricos (como descritos acima em detalhes) sendo adequados, por exemplo, para aplicações terapêuticas. Um fragmento de anticorpo do anticorpo pode ser, por exemplo, um fragmento Fv de cadeia simples, um fragmento F(ab’), um fragmento F(ab), e um fragmento F(ab’)2.

[066]Desse modo, de acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um método de transmitir uma célula tumoral de expressão de CEACAM1 suscetível à imunomodulação. O método compreendendo contatar a célula tumoral de expressão de CEACAM1 (por exemplo, célula de melanoma, pulmão, tiróide, mama, cólon, próstata, hepática, bexiga, renal, cervical, pancreática, leucemia, linfoma, mielóide, ovariana, útero, sarcoma, biliar ou endometrial) com o anticorpo ou fragmento de anticorpo descrito acima, assim tornando a célula tumoral de expressão de CEACAM1 suscetível à imunomodulação.

[067]Como aqui usado “imunomodulação” refere-se à imunomodulação de-pendente de linfócito (por exemplo, por células NK ou linfócitos infiltrantes de tumor).

[068]Adicional ou alternativamente, a presente invenção também visa um método de imunomodulação (por exemplo, inibindo a interação de proteína-proteína homotípica ou heterotípica de CEACAM1), contatando um linfócito de expressão de CEACAM1 com o anticorpo ou fragmento de anticorpo descrito aqui.

[069]Os métodos dos ensinamentos presentes podem ser realizados in vitro, ex vivo (por exemplo, usados em imunoterapia adotiva com base em célula T) ou in vivo.

[070]Como mencionado, os anticorpos de algumas modalidades da invenção podem ter atividade anticâncer que é independente de sua atividade imunomodula- dora descrita acima.

[071]Desse modo, os ensinamentos presentes ainda fornecem um método de inibir migração ou proliferação de uma célula tumoral de expressão de CEACAM1, o método compreendendo contatar a célula tumoral de expressão de CEACAM1 com o anticorpo ou fragmento de anticorpo descrito aqui, assim inibindo a migração ou proliferação de uma célula tumoral de expressão de CEACAM1.

[072]Como aqui usado “inibindo” refere-se a pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 100% de inibição em proliferação ou migração que pode ser ensaiada usando métodos que são bem conhecidos na técnica (vide seção de exemplos abaixo).

[073]Os anticorpos da presente invenção podem ser usados efetivamente para o tratamento de câncer.

[074]Desse modo de acordo com um outro aspecto, é fornecido um método de tratar câncer, o método compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente efetiva do anticorpo ou fragmento de anticorpo descrito aqui, assim tratando o câncer no sujeito. Exemplos de câncer que pode ser diagnosticado ou tratado de acordo com os ensinamentos presentes incluem, mas não são limitados a, melanoma, sarcoma, câncer pulmonar, câncer da tirói- de, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer hepático, câncer de bexiga, câncer renal, câncer cervical, câncer pancreático, leucemia, linfoma, câncer relacionado à célula mielóide, câncer ovariano, câncer de útero, câncer biliar ou câncer endometrial.

[075]De acordo com uma modalidade específica da presente invenção, o câncer é melanoma.

[076]O termo “tratando” refere-se a inibir, impedir ou deter o desenvolvimento de uma patologia (doença, distúrbio ou condição) e/ou causar a redução, remissão, ou regressão de uma patologia. Aqueles de habilidade na técnica entenderão que várias metodologias e ensaios podem ser usados para avaliar o desenvolvimento de uma patologia, e similarmente, várias metodologias e ensaios podem ser usados para avaliar a redução, remissão ou regressão de uma patologia.

[077]Como aqui usado, o termo “impedindo” refere-se a impedir uma doença, distúrbio ou condição de ocorrer em um sujeito que pode estar em risco da doença, mas ainda não foi diagnosticado como tendo a doença.

[078]Como aqui usado, o termo “sujeito” inclui mamíferos, preferivelmente seres humanos em qualquer idade que sofre da patologia. Preferivelmente, este termo abrange indivíduos que estão em risco de desenvolver a patologia.

[079]Para intensificar o tratamento (por exemplo, tratamento de câncer), lin- fócitos tais como células T (por exemplo, Linfócitos Infiltrantes do Tumor) ou células NK podem ser administrados ao sujeito antes, concomitantemente ou seguindo a administração do anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção. Con-sequentemente, linfócitos podem ser obtidos do sujeito (por exemplo, do sangue pe- riférico ou do tumor do mesmo) ou de um doador (um doador de linfócito alogênico ou um singênico), tratado por meio de métodos de expansão ex vivo a fim de se obter linfócitos viáveis [por exemplo, por crescimento em camada alimentadora irradiada suplementada com IL-2, como previamente descrito em Besser MJ et al., Clin Cancer Res (Epub ahead of print) 1° de maio 2010 e em Besser MJ et al., Journal of Immunotherapy (Epub ahead of print) 1° de abril de 2009, completamente incorporados aqui por referência] e administrado ao sujeito.

[080]Será apreciado que o sujeito pode ser tratado por qualquer outro tratamento anticâncer (por exemplo, quimioterapia, terapia de radiação, etc.) antes da administração do anticorpo ou fragmento de anticorpo ou antes da administração dos linfócitos.

[081]O anticorpo da presente invenção pode ser administrado a um organismo per se, ou em uma composição farmacêutica onde é misturado com veículos ou excipientes adequados.

[082]Como aqui usado uma “composição farmacêutica” refere-se a uma pre-paração de um ou mais dos ingredientes ativos descritos aqui com outros componentes químicos tais como veículos e excipientes fisiologicamente adequados. O propósito de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um organismo.

[083]Aqui o termo “ingrediente ativo” refere-se ao anticorpo responsável para o efeito biológico.

[084]Doravante, as frases “veículo fisiologicamente aceitável” e “veículo far- maceuticamente aceitável”, que podem ser alternadamente usadas, referem-se a um veículo ou um diluente que não causa irritação significativa a um organismo e não ab-roga a atividade biológica e propriedades do composto administrado. Um adjuvante está incluso nestas frases.

[085]Aqui o termo “excipiente” refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para também facilitar a administração de um ingre-diente ativo. Exemplos, sem limitação, de excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietileno glicóis.

[086]Técnicas para formulação e administração de fármacos podem ser en-contradas em “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição, que é incorporada aqui por referência.

[087]Rotas adequadas de administração podem, por exemplo, incluir liberação oral, retal, transmucosal, especialmente transnasal, intestinal ou parenteral, incluindo injeções intramusculares, subcutâneas e intramedulares como também injeções intraventriculares intratecais, diretas, intracardíacas, por exemplo, na cavidade ventricular direita ou esquerda, na artéria coronária comum, intravenosas, intraperi- toneais, intranasais, ou intraoculares.

[088]Abordagens convencionais para liberação de fármaco para o sistema nervoso central (CNS) incluem: estratégias neurocirúrgicas (por exemplo, injeção intracerebral ou infusão intracerebroventricular); manipulação molecular do agente (por exemplo, produção de uma proteína de fusão quimérica compreendendo um peptídeo de transporte tendo uma afinidade por uma molécula de superfície de célula endotelial em combinação com um agente que é por si só incapaz de cruzar a BBB) em uma tentativa para explorar uma das vias de transporte endógeno da BBB; estratégias farmacológicas projetadas para aumentar a solubilidade de lipídio de um agente (por exemplo, conjugação de agentes solúveis em água para veículos de lipídio ou de colesterol); e o rompimento transitório da integridade da BBB por meio de rompimento hiperosmótico (sendo o resultado da infusão de uma solução de ma- nitol na artéria carótida ou o uso de um agente biologicamente ativo tal como um peptídeo de angiotensina). Porém, cada uma destas estratégias tem limitações, tais como os riscos inerentes associados a um procedimento cirúrgico invasivo, uma limi- tação de tamanho imposta por uma limitação inerente nos sistemas de transporte endógeno, efeitos colaterais biológicos potencialmente indesejáveis associados à administração sistêmica de uma molécula quimérica compreendida de um motivo de veículo que poderia ser ativo fora do CNS, e o possível risco de lesão cerebral dentro das regiões do cérebro onde a BBB é rompida, o que torna um método de liberação subótimo.

[089]Alternadamente, pode-se administrar a composição farmacêutica em um local ao invés de maneira sistêmica, por exemplo, por meio de injeção da composição farmacêutica diretamente em uma região do tecido de um paciente.

[090]O termo “tecido” refere-se à parte de um organismo que consiste em um agregado de células tendo uma estrutura similar e/ou uma função comum. Exemplos incluem, mas não são limitados a, tecido do cérebro, retina, tecido da pele, tecido hepático, tecido pancreático, osso, cartilagem, tecido conjuntivo, tecido do sangue, tecido do músculo, tecido cardíaco, tecido do cérebro, tecido vascular, tecido renal, tecido pulmonar, tecido gonádico, tecido hematopoético.

[091]Composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas por processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, feitura de drágeas, levigação, emulsificação, encapsulamento, captura ou liofilização.

[092]Composições farmacêuticas para o uso de acordo com a presente in-venção desse modo podem ser formuladas de maneira convencional usando um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares, que facilitem o processamento dos ingredientes ativos nas preparações que podem ser usados farmaceuticamente. Formulação apropriada é dependente da rota de administração selecionada.

[093]Para injeção, os ingredientes ativos da composição farmacêutica podem ser formulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologica- mente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou tampão de sal fisiológico. Para administração transmucosal, penetrantes apropriados para a barreira ser penetrada são usados na formulação. Tais penetrantes são em geral conhecidos na técnica.

[094]Para administração oral, a composição farmacêutica pode ser facilmente formulada combinando os compostos ativos com veículos farmaceuticamente bem aceitáveis conhecidos na técnica. Tais veículos permitem a composição farmacêutica ser formulada como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões, e outros, para ingestão oral por um paciente. Preparações farmacológicas para uso oral podem ser feitas usando um excipiente sólido, opcionalmente moendo a mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, após adicionar auxiliares adequados se desejado, para obter tabletes ou núcleos de drágea. Excipientes adequados são, em particular, enchedores tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil-celulose, carbometilcelulose sódi- ca; e/ou polímeros fisiologicamente aceitáveis tais como polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, agentes desintegrantes podem ser adicionados, tais como polivinil pir- rolidona reticulada, ágar, ou ácido algínico ou um sal do mesmo tal como alginato de sódio.

[095]Núcleos de drágea são fornecidos com revestimentos adequados. Para este propósito, soluções de açúcar concentradas podem ser usadas que pode opci-onalmente conter goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, gel de carbopol, polietile- no glicol, dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Substância corante ou pigmentos podem ser adicionados aos tabletes ou revestimentos de drágea para identificação ou para caracterizar combinações diferentes das doses do composto ativo.

[096]Composições farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsulas de pressão feitas de gelatina como também cápsulas macias, vedadas feitas de gelatina e um plasticizante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de pressão podem conter os ingredientes ativos em mistura com enchedor tal como lactose, aglutinantes tais como amidos, lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas macias, os ingredientes ativos podem ser dissolvidos ou suspendidos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, óleo de parafina, ou polietileno glicóis líquidos. Além disso, estabilizantes podem ser adicionados. Todas as formulações para administração oral deveriam ser em dosagens adequadas para a rota escolhida de administração.

[097]Para administração bucal, as composições podem ter a forma de tabletes ou pastilhas formuladas de maneira convencional.

[098]Para administração por meio de inalação nasal, os ingredientes ativos para o uso de acordo com a presente invenção são convenientemente liberados na forma de uma apresentação de pulverização de aerossol de um pacote pressurizado ou um nebulizador com o uso de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluo- rometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano ou dióxido de carbono. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvula para liberar uma quantidade dosimétrica. Cápsulas e cartuchos, por exemplo, de gelatina, para uso em um dispensador contendo uma mistura de pó do composto e uma base de pó adequada tal como lactose ou amido, podem ser formulados.

[099]A composição farmacêutica descrita aqui pode ser formulada para ad-ministração parenteral, por exemplo, por injeção de bolo ou infusão contínua. As formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosagem de unidade, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de multidoses com, opcionalmente, um conservante adicionado. As composições podem ser suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formuladores tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersantes.

[0100]Composições farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas da preparação ativa na forma solúvel em água. Adicionalmente, as suspensões dos ingredientes ativos podem ser preparadas conforme apropriado suspensões de injeção com base em oleoso ou água. Solventes ou veículos lipofíli- cos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos tais como oleato de etila, triglicerídeos ou lipossomas. Suspensões aquosas de injeção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão tais como carboximetilcelulose sódica, sorbitol ou dextrana. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes adequados ou agentes que aumentam a solubilidade dos ingredientes ativos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

[0101]Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril, solução com base em pirógeno, antes do uso.

[0102]A composição farmacêutica da presente invenção pode ser também formulada em composições retais tais como supositórios ou enemas de retenção, usando, por exemplo, bases de supositório convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicerídeos.

[0103]Composições farmacêuticas adequadas para o uso no contexto da presente invenção incluem composições em que os ingredientes ativos são contidos em uma quantidade efetiva para alcançar o propósito intencionado. Mais especifi-camente, uma quantidade terapeuticamente efetiva significa uma quantidade de in-gredientes ativos efetivos para impedir, aliviar ou melhorar os sintomas de um distúrbio (por exemplo, câncer) ou prolongar a sobrevivência do sujeito sendo tratado.

[0104]Determinação de uma quantidade terapeuticamente efetiva está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica, especialmente levando em conta a revelação detalhada fornecida aqui.

[0105]Para qualquer preparação usada nos métodos da invenção, a quantidade ou dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente de ensaios in vitro e de cultura de célula. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para alcançar uma concentração ou titulação desejada. Tal informação pode ser usada para determinar com mais precisão doses úteis em seres humanos.

[0106]Toxicidade e eficácia terapêutica dos ingredientes ativos descritos aqui podem ser determinadas por meio de procedimentos farmacêuticos padrões in vitro, em culturas de célula ou animais experimentais. Os dados obtidos destes ensaios in vitro e de cultura de célula e estudos em animais podem ser usados formulando uma faixa de dosagem para o uso em ser humano. A dosagem pode variar, dependendo da forma de dosagem empregada e da rota de administração utilizada. A formulação exata, a rota de administração e a dosagem podem ser selecionadas pelo médico individual em vista da condição do paciente. (Vide, por exemplo, Fingl, et al., 1975, em “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Capítulo 1 pág.1).

[0107]A quantidade e intervalo da dosagem podem ser ajustados individual-mente para fornecer níveis de anticorpo do ingrediente ativo que sejam suficientes para induzir ou suprimir o efeito biológico (concentração efetiva mínima, MEC). A MEC variará para cada preparação, mas pode ser estimada de dados in vitro. Dosagens necessárias para alcançar a MEC dependerão das características individuais e da rota de administração. Ensaios de detecção podem ser usados para determinar as concentrações plasmáticas.

[0108]Eficácia terapêutica pode ser ainda validada em modelos animais cor-relativos que são bem conhecidos na técnica. Xenoenxertos humanos em camun-dongos imunodeficientes. Dependendo da severidade e responsividade da condição a ser tratada, o doseamento pode ser de uma administração só ou uma pluralidade, com curso de tratamento durando de vários dias a várias semanas ou até que a cura seja realizada ou diminuição do estado da doença seja alcançada.

[0109]A quantidade de uma composição a ser administrada dependerá, claro, do sujeito sendo tratado, da severidade da aflição, da maneira de administração, do julgamento do médico prescrevente, etc.

[0110]Composições da presente invenção podem ser, se desejado, apresen-tadas em um pacote ou dispositivo dispensador, tal como um kit aprovado pela FDA que pode conter uma ou mais formas de dosagem de unidade contendo o ingrediente ativo. O pacote pode, por exemplo, compreender folha metálica ou plástica, tal como um pacote de bolhas. O pacote ou dispositivo dispensador pode ser acompanhado por instruções para administração. O pacote ou dispensador pode também ser acomodado por uma notificação associada ao recipiente em uma forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de farmacêuticos, cuja notificação é refletiva da aprovação pela agência da forma das composições ou administração humana ou veterinária. Tal notificação, por exemplo, pode ser da etiqueta aprovada pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos para fármacos de prescrição ou de uma inserção de produto aprovado. Composições compreendendo uma preparação da invenção formulada em um veículo farmacêutico compatível podem também ser preparadas, colocadas em um recipiente apropriado, e marcadas para tratamento de uma condição indicada, como é também detalhado acima.

[0111]Aparte das aplicações terapêuticas, os anticorpos da presente invenção podem também ser usados em aplicações de diagnósticos.

[0112]Desse modo, de acordo com um outro aspecto, é provido um método para diagnosticar um câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo contatar uma amostra biológica derivada do sujeito (in vivo ou ex vivo) com o anticorpo ou fragmento de anticorpo descrito aqui, em que uma forma- ção complexa além de um limiar predeterminado é indicativa do câncer no sujeito. De acordo com algumas modalidades, as células do câncer são caracterizadas por supraexpressão de CEACAM1 quando comparada às células não afetadas.

[0113]Como mencionado, o método da invenção é realizado sob condições suficientes para formar um imunocomplexo; tais condições (por exemplo, concentrações apropriadas, tampões, temperaturas, tempos de reação) como também métodos para otimizar tais condições são conhecidos àqueles versados na técnica, e os exemplos são revelados aqui. Como aqui usado, a frase “imunocomplexo” refere-se a um complexo compreendendo o anticorpo da invenção e a CEACAM1.

[0114]Determinar uma presença ou nível do imunocomplexo da invenção pode ser direto ou detectando uma metade identificável (detectável) que possa estar ligada ao anticorpo.

[0115]O nível do imunocomplexo na célula testada (por exemplo, uma célula de um sujeito em necessidade do mesmo) é comparado a um limiar predeterminado. Será apreciado que o anticorpo da presente invenção pode também ser usado para medir a quantidade de CEACAM1 solúvel em soro. Indiferentemente, o limiar pode ser determinado com base em um nível de referência conhecido e/ou um nível em uma célula de controle ou soro. A célula de controle pode ser obtida de um controle, sujeito saudável (por exemplo, um sujeito que não sofre do câncer) ou do mesmo sujeito antes da iniciação da doença ou seguindo o tratamento. De acordo com algumas modalidades da invenção, o sujeito de controle é da mesma espécie, por exemplo, humana, preferivelmente equiparando a mesma idade, peso, sexo etc. que o sujeito em necessidade do mesmo.

[0116]Como aqui usado, o termo “diagnosticar” refere-se em determinar a presença ou ausência de uma patologia, classificar uma patologia ou um sintoma, determinar uma severidade da patologia, monitorar a progressão da patologia, prever um resultado de uma patologia e/ou prospectos de restabelecimento.

[0117]Para facilitar a diagnose, os ensinamentos acima podem ser combinados com outros métodos de diagnosticar câncer que são bem conhecidos na técnica que incluem mas não são limitados a imagem, testes moleculares e biópsias cirúrgicas.

[0118]Uma vez a diagnose é estabelecida, o sujeito é informado da diagnose e os tratamentos adequados podem ser iniciados.

[0119]Os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “tendo” e seus conjugados significam “incluindo, mas não limitado”. Este termo abrange os termos “consistindo em” e “consistindo essencialmente em”.

[0120]A frase “consistindo essencialmente em” significa que a composição ou método pode incluir ingredientes e/ou etapas adicionais, mas apenas se os in-gredientes e/ou etapas adicionais não materialmente alterarem as características básicas e novas da composição reivindicada ou método.

[0121]Como aqui usado, a forma singular “um(a)” e “o/a” incluem referências plurais a menos que o contexto dite claramente do contrário. Por exemplo, os termos “um composto” ou “pelo menos um composto” podem incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas dos mesmos.

[0122]Ao longo deste pedido de patente, várias modalidades desta invenção podem ser apresentadas em um formato de faixa. Deveria ser entendido que a des-crição em formato de faixa é meramente para conveniência e brevidade e não deveria ser interpretado como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Conse-quentemente, a descrição de uma faixa deveria ser considerada ter especificamente revelado todas as possíveis subfaixas como também valores numéricos individuais dentro daquela faixa. Por exemplo, descrição de uma faixa tal como de 1 a 6 deveria ser considerada ter especificamente subfaixas reveladas tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., como também números individuais dentro daquela faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isto se aplica independente da am plitude da faixa.

[0123]Sempre que uma faixa numérica for indicada aqui, é significado incluir qualquer numeral citado (fracionário ou inteiro) dentro da faixa indicada. As frases “variando/varia(m) entre” um primeiro número indicado e um segundo número indicado e “variando/varia(m) de” um primeiro número indicado “a” um segundo número indicado são aqui usadas alternadamente e são significadas incluir o primeiro e segundo números indicados e todos os numerais fracionários e inteiros entre os mesmos.

[0124]Como aqui usado o termo “método” refere-se aos modos, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma tarefa dada incluindo, mas não limitada a, aqueles modos, meios, técnicas e procedimentos conhecidos, ou facilmente desenvolvidos de modos, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por médicos das técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.

[0125]A palavra “exemplar” é aqui usada para significar “servir como um exemplo, circunstância ou ilustração”. Qualquer modalidade descrita como “exemplar” não é necessariamente para ser interpretada como preferida ou vantajosa a outras modalidades e/ou excluir a incorporação de características de outras modalidades.

[0126]A palavra “opcionalmente” é aqui usada para significar “é fornecido em algumas modalidades e não fornecido em outras modalidades.” Qualquer modalidade particular da invenção pode incluir uma pluralidade de características “opcionais” a menos que tais características se conflitem.

[0127]É apreciado que certas características da invenção, que são, para clareza, descritas no contexto de modalidades separadas, podem também ser fornecidas em combinação em uma modalidade só. Inversamente, várias características da invenção, que são, para brevidade, descritas no contexto de uma modalidade só, podem também ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação ade- quada ou como adequado em qualquer outra modalidade descrita da invenção. Certas características descritas no contexto de várias modalidades não são para serem consideradas características essenciais daquelas modalidades, a menos que a mo-dalidade seja inoperante sem aqueles elementos.

[0128]Várias modalidades e aspectos da presente invenção como delineados acima e como reivindicados na seção das reivindicações abaixo encontram suporte experimental nos exemplos a seguir.Exemplos

[0129]Referência é agora feita aos exemplos seguintes que juntamente com as descrições acima, ilustram algumas modalidades da invenção de uma maneira não limitativa.

[0130]Em geral, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos de laboratório utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, mi- crobiológicas e de DNA recombinante. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Vide, por exemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nova Iorque; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque (1998); metodologias expostas nas Pats. U.S. 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a Edição), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell e Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., Nova Iorque (1980); imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na literatura de patente e cientificas, vide, por exemplo, Patentes U.S. 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., e Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) e “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); todas essas são incorporadas por referência como se completamente expostas aqui. Outras referências gerais são fornecidas ao longo deste documento. Os procedimentos nas mesmas são acreditados ser bem conhecidos na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor. Toda a informação contida nos mesmos é aqui incorporada por referência.Exemplo 1Geração de Anticorpos MonoclonaisGeração de Anticorpos Monoclonais de MRG1

[0131]Um anticorpo monoclonal que efetivamente bloqueia as interações homofílicas de CEACAM1 in vitro em concentrações nanomolares foi gerado. Bre-vemente, os camundongos foram imunizados 3 vezes, em intervalos de 2 semanas, com 5 microgramas de CEACAM1 humano recombinante (proteína inteira, comerci-almente disponível de R&D Systems). Os esplenócitos foram colhidos e fundidos com células SP2/0, para gerar uma biblioteca de hibridoma.

[0132]O hibridoma produzindo o anticorpo de bloqueio de CEACAM1 (mAb de MRG1) foi reclonado várias vezes para dar um clone estável. Outros Anticorpos Monoclonais

[0133]MAb de Kat4c e anti-CEACAM policlonal de coelho foram comprados de DAKO (Glostrup, Dinamarca).Exemplo 2Especificidade do mAB de Anti-CEACAM1Materiais e Procedimentos ExperimentaisGeração das Células de Expressão de CEACAM

[0134]Células humanas de 721.221 CEACAM-negativas (células B parentais) foram estavelmente transfeccionadas com CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6 ou CEACAM8 por eletroporação e seleção com G418.

[0135]As células parentais de timoma BW murino (células desprovidas das cadeias de TCR alfa e beta, ainda retêm o mecanismo de secreção total de IL-2) foram transfeccionadas com uma molécula quimérica compreendendo a porção ex- tracelular de CEACAM1 humana fundida com a transmembrana e cauda citosólica da cadeia murina zeta. Transfecção foi executada por eletroporação e seleção com G418.Triagem de Anticorpo por FACS

[0136]Os hibridomas foram triados para atividade de ligação de CEACAM1 por meio de citometria de fluxo como segue:(a) 50.000 células de CEACAM transfeccionadas foram colocadas em 96 poços em forma de U.(b) As células foram lavadas com tampão de FACS frio (PBS, BSA 0,5%, Azida 0,05%).(c) As células foram incubadas com o mAb de tingimento (MRG1 ou Kat4c): 0,1 micrograma de mAb por 100 microlitros, durante 30 minutos, em gelo.(d) As células foram centrifugadas, os sobrenadantes foram removidos e as células foram ressuspensas em 100 microlitros de anticorpos de anticamundongo de cabra conjugados com FITC (Jackson Immunoresearch) a uma diluição de 1:200.(e) Após incubação de 30 minutos (em gelo em condições no escuro), as cé-lulas foram centrifugadas, lavadas e ressuspensas em tampão de FACS.(f) As células foram analisadas usando um software FACScalibur e CellQuest.Resultados

[0137]Como as células parentais de 721.221 não expressam nenhuma das proteínas de CEACAM, estas células foram estavelmente transfeccionadas com CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6 ou CEACAM8 para testar a especificidade dos anticorpos monoclonais de CEACAM1 (mAbs). Os hibridomas foram depois triados para atividade de ligação de CEACAM1 por meio de citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 1A, o mAb de MRG1 gerado de acordo com os ensinamentos presentes é específico para CEACAM1 humana. Ele tem uma reatividade cruzada insignificante com CEACAM5 e nenhuma ligação à CEACAM6 ou CEACAM8. Figura 1B mostra que todos os transfectantes expressaram moléculas de CEACAM, com CEACAM1 sendo o mais baixo, o que enfatiza o padrão de especificidade de MRG1.Exemplo 3O mAB é capaz de inibir Ligação Homofílica de CEACAM1Materiais e Procedimentos ExperimentaisTriagem de Anticorpo por Elisa

[0138]Atividade de bloqueio de CEACAM1 foi testada usando um sistema funcional de BW. O sistema funcional de BW compreende uma linhagem celular de camundongo (BW) estavelmente transfeccionada com uma molécula quimérica compreendendo o domínio extracelular de CEACAM1 humana fundida com a cadeia zeta de camundongo (BW/CEACAM1-zeta, vide Exemplo 2, acima). Coincubação das células BW/CEACAM1-zeta com as outras células CEACAM1-positivas resultou na secreção das concentrações mensuráveis de IL-2 de camundongo.

[0139]Desse modo, BW/CEACAM1-zeta (células efetoras) ou 221/CEACAM1 (células alvo) foram cada pré-incubadas separadamente com 10-40 ng/ml de mAb de MRG1. Seguindo uma hora incubação em gelo, as células recíprocas (221/CEACAM1 ou BW/CEACAM1) foram adicionadas e a secreção de IL-2 de camundongo foi medida por meio de ELISA sanduíche (R&D Systems).Ensaio de Citotoxicidade

[0140]Ensaios de citotoxicidade testando a matança de várias linhagens de melanoma por linfócitos infiltrantes do tumor na presença ou ausência de 1 μg/ml de mAb de MRG1. Células de melanoma de 526mel de CEACAM1Alto, 624mel e 09mel de CEACAM1dim foram usadas como células alvo. Células TIL014 foram usadas como células efetoras em uma razão de E:T de 10:1. Seguindo incubação de uma hora com o mAb de MRG1 em gelo, as células recíprocas foram adicionadas e coincuba- das por 5 horas a 37°C. As células alvo foram pré-marcadas com uma tintura fluorescente verde (CFSE) e lise específica foi determinada por meio de cotingimento de Iodeto de Propídio (PI) em citometria de fluxo. Morte espontânea foi subtraída.Resultados

[0141]A capacidade do mAb de MRG1 purificado para inibir ligação homofí- lica de CEACAM1 foi verificada. Como mostrado na Figura 2, o MRG1 de mAb purificado mostrou uma inibição dose-dependente da ligação homofílica de CEACAM1. Em uma concentração de 10 ng/ml, o mAb reduziu eficientemente as interações de CEACAM1, efetivamente alcançando um planalto em uma concentração de 20 ng/ml. Importantemente, os dois cenários experimentais, isto é, a adição de mAb de MRG1 às células efetoras, BW/CEACAM1-zeta, ou às células alvo, 221/CEACAM1, mostraram resultados similares (secreção do IL-2 de camundongo foi efetivamente bloqueada).

[0142]O efeito do bloqueio de mAb de MRG1 foi ainda demonstrado em ensaios de citotoxicidade. Como mostrado na Figura 3, morte das células de 526mel de CEACAM1Alto e 624mel foi intensificada por incubação do anticorpo com células efetoras (mas não em células alvo). A morte das células de 09mel de CEACAM1dim não foi afetada pela presença de mAb de MRG1 (Figura 3).Exemplo 4mAB de Anti-CEACAM1 Inibe Migração e Proliferação das Células CancerosasMateriais e Procedimentos ExperimentaisEnsaio de Invasão

[0143]O efeito do bloqueio dos anticorpos foi testado em um ensaio de invasão. Brevemente, as células de melanoma (08mel ou 09mel) foram pré-incubadas na presença ou ausência de 1 μg/ml de mAb de MRG1 e depois testadas por meio de ensaios de invasão de Matrigel. A invasão foi permitida por 24 horas e a quantidade de células invasoras foi quantificada com XTT padronizado.Ensaio de Proliferação Livre

[0144]Células de 526mel de CEACAM1Alto foram semeadas no dia 0 em placas de 48 poços (2.500 células por poço). Na semeadura, MRG1 foi adicionado em 3 concentrações diferentes (0,5, 1, ou 3 μg/ml), ou não adicionado nada. As células viáveis totais foram contadas 2 dias ou 5 dias após a semeadura. Proliferação foi determinada com XTT padronizado e por contagem direta das células.Resultados

[0145]Como mostrado na Figura 4, MRG1 bloqueou a invasão de células de 08mel CEACAM1-positivas (nível de expressão de CEACAM1 foi médio, isto é, a intensidade de fluorescência média da expressão de CEACAM1 foi 50) e teve pouco ou nenhum efeito nas células de 09mel de CEACAM1dim (nível de expressão de CEACAM1 foi baixo, isto é, intensidade de fluorescência mediana da expressão de CEACAM1 foi 15).

[0146]MRG1 foi também testado em ensaios de proliferação livre. Uma inibi- ção dose-dependente na proliferação livre de células de 526mel foi observada (Figura 5). Seguindo 5 dias de tratamento, a proliferação foi reduzida em mais de 60% (com 3 μg de mAb de MRG1).Exemplo 5MRG1 Inibe Crescimento das Células Cancerosas em Modelos Experimentais AnimaisMateriais e Procedimentos ExperimentaisModelos de Xenoenxerto de Melanoma

[0147]5 x 106 células de melanoma humanas de CEACAM1+ foram injetadas subcutaneamente ao flanco de camundongos de SCID-NOD de 7 semanas de idade. Massas tumorais formaram em 100% dos camundongos dentro de 14-17 dias e continuaram crescendo. As dimensões do tumor foram monitoradas não- invasivamente com um calibrador 3 vezes por semana e aproximação em volume foi calculada como (d1 x d2 x d3/2).

[0148]Administração de MRG1 foi executada por injeção de 0,5 mg de anticorpo diluída em 0,5 ml de PBS estéril intraperitonealmente. Injeção de PBS serviu como controle.

[0149]Administração dos linfócitos reativos de antimelanoma humana foi executada por meio de injeção intravenosa na veia da cauda de 20 x 106 células di-luídas em 200 μl de PBS estéril.Resultados

[0150]Em linha com as funções de bloqueio demonstradas acima, a adminis-tração de anticorpo de MRG1 inibiu o crescimento do tumor. Este efeito foi evidente quando o anticorpo foi administrado na hora da inoculação da célula tumoral (Figura 6A, “Planejamento de Prevenção”) ou após uma massa tumoral mensurável já ter sido formada (Figura 6B, “Planejamento de Tratamento”). Estes efeitos foram evidentes após 4 injeções dentro de 8 dias, seguido por monitoramento não-invasivo (vide setas na Figura 6). Deveria ser observado que este efeito foi independente de quaisquer efeitos de imunomodulação, uma vez que os camundongos de SCID- ACENO são imunodeficientes.

[0151]Simulação de resposta imune de antimelanoma foi executada por uma injeção intravenosa simples de linfócitos reativos de antimelanoma humana que ini-biram o crescimento do tumor (Figura 7). Este efeito foi significativamente intensificado por meio de injeções intraperitoneais de MRG1 uma vez por semana.Exemplo 6MRG1 é Superior aos Anticorpos de Anti-CEACAM1 Previamente DescritosMateriais e Procedimentos ExperimentaisTriagem de Anticorpo Por Elisa

[0152]A atividade de bloqueio de CEACAM1 foi testada usando um sistema funcional de BW como descrito em detalhes no Exemplo 3, aqui acima.

[0153]100.000 células de BW/CEACAM1-zeta foram pré-incubadas com 15 ng/ml de mAb de MRG1, 2600 ng/ml de mAb de Kat4c ou 600 ng/ml de anticorpo de anti-CEACAM policlonal de coelho. Seguindo uma hora de incubação em gelo, 50.000 células de 721.221/CEACAM1 foram adicionadas e a secreção de IL-2 de camundongo foi medida por meio de ELISA sanduíche (R&D Systems).Resultados

[0154]Como descrito no Exemplo 3, aqui acima, os inventores demonstraram um bloqueio quase completo da atividade de CEACAM1 usando 15 ng/ml de mAb de MRG1. Em contraste, o anticorpo monoclonal de anti-CEACAM1 Kat4c foi capaz de dar um efeito de bloqueio secundário apenas quando concentrações de 200 vezes mais altas foram testadas e o anticorpo de anti-CEACAM de coelho policlonal deu um efeito inibidor similar com concentração de 40 vezes mais altas (2600 ng/ml e 600 ng/ml, respectivamente, Figura 8).

[0155]Embora a invenção tenha sido descrita junto com as modalidades es- pecíficas da mesma, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes àqueles versados na técnica. Consequentemente, é intencionado abranger todas tais alternativas, modificações e variações que caiam dentro do espírito e escopo vasto das reivindicações em anexo.

[0156]Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporadas em sua totalidade por referência no relatório descritivo, à mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individuais específica e individualmente fossem indicados para ser incorporados aqui por referência. Além disso, citação ou identificação de qualquer referência neste relatório descritivo não deve ser interpretada como uma admissão que tal referência esteja disponível como técnica anterior à presente invenção. À medida que os títulos de seção são usados, eles não devem ser interpretados como necessariamente limitativos.

Claims (15)

1. Célula do hibridoma, CARACTERIZADA pelo fato de que foi depositada sob o Número de Acesso de ATCC PTA-9974.

2. Anticorpo isolado CEACAM1 ou fragmento de anticorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um domínio de reconhecimento de antígeno tendo as sequências de CDR e orientação do anticorpo produzido da célula do hibridoma que foi depositada sob o Número de Acesso de ATCC PTA-9974.

3. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindica-ção 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é seletivo ao CEACAM1.

4. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindica-ção 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é produzido a partir da célula de hibri- doma que foi depositada sob o Número de Acesso ATCC PTA-9974.

5. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindica-ção 2, CARACTERIZADO pelo fato de que é ligado a uma parte citotóxica.

6. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindica-ção 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita metade citotóxica compreende uma citotoxina, uma quimocina, uma quimioterapia, um pró-apoptótico, uma interfe- rona, uma metade radioativa, ou combinações dos mesmos.

7. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindica-ção 2, CARACTERIZADO pelo fato de que é ligado à uma metade identificável.

8. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindica-ção 2, CARACTERIZADO pelo fato de que é para tratar câncer, preferivelmente me-lanoma.

9. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindica-ção 2, CARACTERIZADO pelo fato de que é para imunomodulação de uma célula tumoral de expressão de CEACAM1 por um linfócito de expressão de CEACAM1; preferivelmente em que o um linfócito de expressão de CEACAM1 é uma célula T citotóxica.

10. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindi-cação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que inibi a migração ou proliferação de uma célula tumoral de expressão de CEACAM1, preferivelmente em que a dita célu-la tumoral compreende uma célula tumoral de melanoma.

11. Método para diagnosticar um câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo contatar uma amostra biológica derivada do su-jeito com o anticorpo ou fragmento de anticorpo, conforme definido na reivindicação 2 ou 5, em que células do câncer são CARACTERIZADAS pelo fato de que são uma superexpressão de CEACAM1 comparado às células não afetadas e em que uma formação complexa além de um limiar pré-determinado é indicativa do câncer no sujeito.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito câncer é melanoma.

13. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindi-cação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que é para inibir a interação de proteína- proteína homotípica ou heterotípica de CEACAM1 de um linfócito de expressão de CEACAM1.

14. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindi-cação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito linfócito de expressão de CEACAM1 é um Linfócito Infiltrante do Tumor ou célula NK; ouem que o dito linfócito de expressão de CEACAM1 é uma célula T citotóxica.

15. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compre-ende como um ingrediente ativo o anticorpo ou fragmento de anticorpo conforme definido na reivindicação 2 ou 5.

Images