JPH05317081A - ヒト−ヒト型モノクローナル抗体 - Google Patents
ヒト−ヒト型モノクローナル抗体Info
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- JPH05317081A JPH05317081A JP4156013A JP15601392A JPH05317081A JP H05317081 A JPH05317081 A JP H05317081A JP 4156013 A JP4156013 A JP 4156013A JP 15601392 A JP15601392 A JP 15601392A JP H05317081 A JPH05317081 A JP H05317081A
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- cells
- monoclonal antibody
- cancer
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 扁平上皮癌の診断および治療などに有用な、
扁平上皮癌に特異的なヒト−ヒト型モノクローナル抗体
を提供することである。 【構成】 工業技術院微生物工業研究所に微工研条寄第
3850号で寄託された細胞の特性を有するヒト−ヒト型ハ
イブリドーマおよび当該ハイブリドーマにより産生され
るヒト扁平上皮癌を認識するヒト−ヒト型モノクローナ
ル抗体である。
扁平上皮癌に特異的なヒト−ヒト型モノクローナル抗体
を提供することである。 【構成】 工業技術院微生物工業研究所に微工研条寄第
3850号で寄託された細胞の特性を有するヒト−ヒト型ハ
イブリドーマおよび当該ハイブリドーマにより産生され
るヒト扁平上皮癌を認識するヒト−ヒト型モノクローナ
ル抗体である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト扁平上皮癌を認識
するヒト−ヒト型モノクローナル抗体および該モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
するヒト−ヒト型モノクローナル抗体および該モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、消化器癌、子宮癌などヒト悪性腫瘍に対するモノク
ローナル抗体の作製が行なわれている。これらにより腫
瘍関連抗原の解析が進められ、また、それらのうちのい
くつかは、腫瘍細胞に特異的な腫瘍マーカーとして癌の
組織診断のみならず癌の血清診断にも有用であることが
示されている。
年、消化器癌、子宮癌などヒト悪性腫瘍に対するモノク
ローナル抗体の作製が行なわれている。これらにより腫
瘍関連抗原の解析が進められ、また、それらのうちのい
くつかは、腫瘍細胞に特異的な腫瘍マーカーとして癌の
組織診断のみならず癌の血清診断にも有用であることが
示されている。
【０００３】悪性腫瘍に対するモノクローナル抗体は、
治療目的でも有効に用いられる。モノクローナル抗体単
独で、リンパ腫、大腸癌、メラノーマ、類上皮癌などの
治療に応用した例が報告されている（ミラー アール
エイ(Miller RA) ら、ブラッド(Blood) 、58：78、198
1；ハーリー ディー(Herly D) ら、プロシーディング
オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス オ
ブ ユナイティド ステイツ オブ アメリカ(Proc.Na
tl. Acad.Sci.USA) 、79：476 、1982；ディポルド ダ
ブリュー ジー(Dippold WG)ら、キャンサー リサーチ
（Cancer Res.)、44：806 、1984 およびマスイ エイ
チ(Masui H) ら、キャンサー リサーチ、44：1002、19
84参照）ほか、モノクローナル抗体に制癌剤やジフテリ
ア毒素などを結合させ、選択的に癌細胞へ輸送する方法
（いわゆるミサイル療法）も行なわれている（ギリラン
ド ディー ジー(Gilliland DG)ら、Proc.Natl.Acad.S
ci. USA,77：4539、1980参照）。
治療目的でも有効に用いられる。モノクローナル抗体単
独で、リンパ腫、大腸癌、メラノーマ、類上皮癌などの
治療に応用した例が報告されている（ミラー アール
エイ(Miller RA) ら、ブラッド(Blood) 、58：78、198
1；ハーリー ディー(Herly D) ら、プロシーディング
オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス オ
ブ ユナイティド ステイツ オブ アメリカ(Proc.Na
tl. Acad.Sci.USA) 、79：476 、1982；ディポルド ダ
ブリュー ジー(Dippold WG)ら、キャンサー リサーチ
（Cancer Res.)、44：806 、1984 およびマスイ エイ
チ(Masui H) ら、キャンサー リサーチ、44：1002、19
84参照）ほか、モノクローナル抗体に制癌剤やジフテリ
ア毒素などを結合させ、選択的に癌細胞へ輸送する方法
（いわゆるミサイル療法）も行なわれている（ギリラン
ド ディー ジー(Gilliland DG)ら、Proc.Natl.Acad.S
ci. USA,77：4539、1980参照）。
【０００４】以上のようにモノクローナル抗体は臨床的
には、治療面への応用も広がっている。しかし、現在確
立されているモノクローナル抗体の多くはマウス−マウ
ス型であるため、人体に注射すると、それらは異物とし
て認識され、投与された抗体の活性が十分発揮されない
うちに排除されてしまうことが知られている（ジェイム
ス ケー(James K) ら、ジャーナル オブ イムノロジ
ー メソッズ(J. Immunol.Methods ）、100 ：５、1987
参照）。すなわち、マウス抗体に対する免疫反応が起こ
る結果、免疫複合体が形成されて排除されるとともに、
ときとして激しい炎症症状が血管系や腎臓を中心に発生
することがある。
には、治療面への応用も広がっている。しかし、現在確
立されているモノクローナル抗体の多くはマウス−マウ
ス型であるため、人体に注射すると、それらは異物とし
て認識され、投与された抗体の活性が十分発揮されない
うちに排除されてしまうことが知られている（ジェイム
ス ケー(James K) ら、ジャーナル オブ イムノロジ
ー メソッズ(J. Immunol.Methods ）、100 ：５、1987
参照）。すなわち、マウス抗体に対する免疫反応が起こ
る結果、免疫複合体が形成されて排除されるとともに、
ときとして激しい炎症症状が血管系や腎臓を中心に発生
することがある。
【０００５】ＥＢＶトランスフォーム法を用いたヒト−
ヒト型モノクローナル抗体がスタイニツ(Steinitz)らに
よって報告された（スタイニツ エムら、ネイチャー(N
ature)269 ：420 、1977参照）。その後、オルソン(Ols
son)らがヒト−ヒト型ハイブリドーマ法を報告し（オル
ソン エルら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77 ：5429、19
80参照）、さらにグラシー(Glassy)らがヒトＢリンパ芽
球細胞株ＷＩ−Ｌ２よりＨＡＴ感受性細胞株を分離した
（グラシー エム シーら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
0 ：6327、1983参照）。それ以来、親細胞株の開発が進
みかなり安定したヒト−ヒト型ハイブリドーマを作製で
きる親細胞株がえられるようになった。これらの親細胞
株を用いて、あるいはＥＢＶ−トランスフォーム法を用
いてさまざまなヒト−ヒト型モノクローナル抗体の作製
が試みられている。
ヒト型モノクローナル抗体がスタイニツ(Steinitz)らに
よって報告された（スタイニツ エムら、ネイチャー(N
ature)269 ：420 、1977参照）。その後、オルソン(Ols
son)らがヒト−ヒト型ハイブリドーマ法を報告し（オル
ソン エルら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77 ：5429、19
80参照）、さらにグラシー(Glassy)らがヒトＢリンパ芽
球細胞株ＷＩ−Ｌ２よりＨＡＴ感受性細胞株を分離した
（グラシー エム シーら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
0 ：6327、1983参照）。それ以来、親細胞株の開発が進
みかなり安定したヒト−ヒト型ハイブリドーマを作製で
きる親細胞株がえられるようになった。これらの親細胞
株を用いて、あるいはＥＢＶ−トランスフォーム法を用
いてさまざまなヒト−ヒト型モノクローナル抗体の作製
が試みられている。
【０００６】ヒト−ヒト型モノクローナル抗体とは、ヒ
ト抗体産生細胞（Ｂリンパ球）とヒト由来の親細胞株を
融合させたハイブリドーマが産生する抗体をいう。この
ような抗体は人体において異物として認識されにくいた
め、癌の治療に安全に応用できる。また、ヒト−ヒト型
モノクローナル抗体が癌を特異的に認識するものであれ
ば、診断にも応用することができる。癌を特異的に認識
する抗体もメラノーマ、胃癌、乳癌などで報告されてい
る。しかし、扁平上皮癌に対するヒト−ヒト型モノクロ
ーナル抗体の報告はまだなく、診断、または治療に有効
な抗体が求められている。
ト抗体産生細胞（Ｂリンパ球）とヒト由来の親細胞株を
融合させたハイブリドーマが産生する抗体をいう。この
ような抗体は人体において異物として認識されにくいた
め、癌の治療に安全に応用できる。また、ヒト−ヒト型
モノクローナル抗体が癌を特異的に認識するものであれ
ば、診断にも応用することができる。癌を特異的に認識
する抗体もメラノーマ、胃癌、乳癌などで報告されてい
る。しかし、扁平上皮癌に対するヒト−ヒト型モノクロ
ーナル抗体の報告はまだなく、診断、または治療に有効
な抗体が求められている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は工業技術院微生
物工業研究所に微工研条寄第3850号で寄託された細胞の
特性を有するハイブリドーマから産生される、ヒト扁平
上皮癌を認識するヒト−ヒト型モノクローナル抗体およ
び工業技術院微生物工業研究所に微工研条寄第3850号で
寄託された細胞の特性を有するヒト−ヒト型ハイブリド
ーマに関する。
物工業研究所に微工研条寄第3850号で寄託された細胞の
特性を有するハイブリドーマから産生される、ヒト扁平
上皮癌を認識するヒト−ヒト型モノクローナル抗体およ
び工業技術院微生物工業研究所に微工研条寄第3850号で
寄託された細胞の特性を有するヒト−ヒト型ハイブリド
ーマに関する。
【０００８】本発明のモノクローナル抗体は、たとえば
つぎのようにしてえることができる。
つぎのようにしてえることができる。
【０００９】すなわち、まず、扁平上皮癌患者から採取
したリンパ節より細胞を分離する。この中には、患者の
体内で癌細胞によって感作された抗体産生細胞（Ｂリン
パ球）が含まれている。そこで、これらのリンパ節細胞
をポリエチレングリコール存在下でヒト由来親細胞株と
細胞融合させ、ＨＡＴ培地により融合した細胞を選択す
る。ヒト由来親細胞株としては、ヒト由来骨髄腫細胞株
またはたとえばＨＯ-323などのヒト由来リンパ芽球細胞
などが用いられる。ほかに、ヒト骨髄腫細胞株Ｕ-266
（前出のオルソンら、Proc. Natl. Acad. USA,77：542
9，1980）やヒトＢリンパ芽球細胞株ＫＲ-4（コズボル
（Kozbor）ら、ジャーナル オブ イムノロジー（J.Im
munol.）,133：3001-5,1984 ）を親細胞として用いた研
究がある。つぎに、抗体産生クローンを扁平上皮癌由来
細胞株ＳＣＣ25（American Type Culture Collection,
Rockbill, MD,USA）または癌組織切片を用いて、これら
との反応性をたとえば酵素抗体法による免疫組織化学を
行なうことでスクリーニングすることによって、扁平上
皮癌に特異的なモノクローナル抗体をえることができ
る。
したリンパ節より細胞を分離する。この中には、患者の
体内で癌細胞によって感作された抗体産生細胞（Ｂリン
パ球）が含まれている。そこで、これらのリンパ節細胞
をポリエチレングリコール存在下でヒト由来親細胞株と
細胞融合させ、ＨＡＴ培地により融合した細胞を選択す
る。ヒト由来親細胞株としては、ヒト由来骨髄腫細胞株
またはたとえばＨＯ-323などのヒト由来リンパ芽球細胞
などが用いられる。ほかに、ヒト骨髄腫細胞株Ｕ-266
（前出のオルソンら、Proc. Natl. Acad. USA,77：542
9，1980）やヒトＢリンパ芽球細胞株ＫＲ-4（コズボル
（Kozbor）ら、ジャーナル オブ イムノロジー（J.Im
munol.）,133：3001-5,1984 ）を親細胞として用いた研
究がある。つぎに、抗体産生クローンを扁平上皮癌由来
細胞株ＳＣＣ25（American Type Culture Collection,
Rockbill, MD,USA）または癌組織切片を用いて、これら
との反応性をたとえば酵素抗体法による免疫組織化学を
行なうことでスクリーニングすることによって、扁平上
皮癌に特異的なモノクローナル抗体をえることができ
る。
【００１０】つぎに実施例にもとづいて本発明をさらに
詳しく説明するが、本発明はもとよりこれに限定される
ものではない。
詳しく説明するが、本発明はもとよりこれに限定される
ものではない。
【００１１】
実施例１ (1) リンパ節細胞の調整 癌抗原に感作されたＢリンパ球を含むリンパ節細胞は以
下の方法にしたがって調製した。高分化型舌扁平上皮癌
患者（68才、男性）に頸部郭清術を施した際に採取され
た頸部リンパ節を細切し、Ｅ−ＲＤＦ培地（ＲＰＭＩ、
ＤＭＥＭ、ハムＦ12を２：１：１に混和したもの）中で
細胞を分散したのち、10％ＦＣＳ添加Ｅ−ＲＤＦ培地中
で24時間培養した。なお、リンパ節を採取する際、放射
線照射部位は避けるようにした。 (2) ハイブリドーマの作製 前項の方法にしたがって調製したリンパ節細胞と親細胞
株ＨＯ-323（タマキワイ(Tamaki Y.) ら、ハイブリドー
マ(Hybridoma),８：293,1989）（ヒトＢリンパ芽球細胞
株：ハイブリドーマ作製用親細胞株で、九州大学大学院
農学研究科遺伝子資源工学専攻 村上浩紀教授より供与
された）をＥ−ＲＤＦ培地で洗浄したのち、２：１の割
合で混合し、1,200rpmで５分間遠心した。上清を吸引
後、ペレットに50％ポリエチレングリコール4,000(メル
ク社製）１mlを撹拌しながら加えて、30秒間静置した。
さらにＥ−ＲＤＦ培地を30秒毎に１mlずつ計９ml静かに
添加し、10分間室温で静置した。10％ＦＣＳ添加ＨＡＴ
培地（16μM チミジン、100 μM ヒポキサンチン、0.4
μM アミノプテリン）に細胞を再浮遊させて96穴マルチ
ウエルプレートに１×106 個／ウエル／100 μl となる
ように播種した。ＨＡＴ培地は３〜４日毎に50μl ずつ
添加して、２週間〜１ケ月培養した。
下の方法にしたがって調製した。高分化型舌扁平上皮癌
患者（68才、男性）に頸部郭清術を施した際に採取され
た頸部リンパ節を細切し、Ｅ−ＲＤＦ培地（ＲＰＭＩ、
ＤＭＥＭ、ハムＦ12を２：１：１に混和したもの）中で
細胞を分散したのち、10％ＦＣＳ添加Ｅ−ＲＤＦ培地中
で24時間培養した。なお、リンパ節を採取する際、放射
線照射部位は避けるようにした。 (2) ハイブリドーマの作製 前項の方法にしたがって調製したリンパ節細胞と親細胞
株ＨＯ-323（タマキワイ(Tamaki Y.) ら、ハイブリドー
マ(Hybridoma),８：293,1989）（ヒトＢリンパ芽球細胞
株：ハイブリドーマ作製用親細胞株で、九州大学大学院
農学研究科遺伝子資源工学専攻 村上浩紀教授より供与
された）をＥ−ＲＤＦ培地で洗浄したのち、２：１の割
合で混合し、1,200rpmで５分間遠心した。上清を吸引
後、ペレットに50％ポリエチレングリコール4,000(メル
ク社製）１mlを撹拌しながら加えて、30秒間静置した。
さらにＥ−ＲＤＦ培地を30秒毎に１mlずつ計９ml静かに
添加し、10分間室温で静置した。10％ＦＣＳ添加ＨＡＴ
培地（16μM チミジン、100 μM ヒポキサンチン、0.4
μM アミノプテリン）に細胞を再浮遊させて96穴マルチ
ウエルプレートに１×106 個／ウエル／100 μl となる
ように播種した。ＨＡＴ培地は３〜４日毎に50μl ずつ
添加して、２週間〜１ケ月培養した。
【００１２】その結果、396 ウェル中57ウェル(14.4
％）に１個以上のハイブリドーマが出現した。 (3) ハイブリドーマのスクリーニング ハイブリドーマのスクリーニングはＳＣＣ25細胞を用い
て行なった。96穴マルチウエルプレートにＳＣＣ25細胞
を５×105 個／ウエル／200 μl ずつ播種し、24時間培
養した。そののち、各ウエルに４％パラホルムアルデヒ
ド（ＰＦＡ）を100 μl 加えて20分間固定した。そこへ
１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を100 μl 加えて１
時間ブロッキングを行なったのち、ハイブリドーマの上
清を100μl 加えて４℃で１晩反応し、ホースラティッ
シュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ
＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ抗体（ザイメッツ社製）を加えて室温
で２時間反応させた。ＰＢＳによる洗浄後ディアミノベ
ンチジン（ＤＡＢ）で発色させ、細胞の反応の有無を顕
微鏡で観察した。
％）に１個以上のハイブリドーマが出現した。 (3) ハイブリドーマのスクリーニング ハイブリドーマのスクリーニングはＳＣＣ25細胞を用い
て行なった。96穴マルチウエルプレートにＳＣＣ25細胞
を５×105 個／ウエル／200 μl ずつ播種し、24時間培
養した。そののち、各ウエルに４％パラホルムアルデヒ
ド（ＰＦＡ）を100 μl 加えて20分間固定した。そこへ
１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を100 μl 加えて１
時間ブロッキングを行なったのち、ハイブリドーマの上
清を100μl 加えて４℃で１晩反応し、ホースラティッ
シュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ
＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ抗体（ザイメッツ社製）を加えて室温
で２時間反応させた。ＰＢＳによる洗浄後ディアミノベ
ンチジン（ＤＡＢ）で発色させ、細胞の反応の有無を顕
微鏡で観察した。
【００１３】強く染まった１ウェルについて、限界希釈
法で２回クローニングし、モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマをえた。このハイブリドーマはＢＭ２
と命名され平成４年５月13日、工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託された（微工研条寄第3850号（ＦＥＲＭ
ＢＰ-3850)）。
法で２回クローニングし、モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマをえた。このハイブリドーマはＢＭ２
と命名され平成４年５月13日、工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託された（微工研条寄第3850号（ＦＥＲＭ
ＢＰ-3850)）。
【００１４】ハイブリドーマの培養上清中のモノクロー
ナル抗体は、硫安沈殿法による通法したがって精製し
た。 (4) 抗体のクラスの決定 えられたモノクローナル抗体のクラスの決定は、ＨＲＰ
標識抗ヒトＩｇＧ抗体および抗ヒトＩｇＭ抗体（ザイメ
ッツ社製）を用いてＥＲＩＳＡ法で行なった。
ナル抗体は、硫安沈殿法による通法したがって精製し
た。 (4) 抗体のクラスの決定 えられたモノクローナル抗体のクラスの決定は、ＨＲＰ
標識抗ヒトＩｇＧ抗体および抗ヒトＩｇＭ抗体（ザイメ
ッツ社製）を用いてＥＲＩＳＡ法で行なった。
【００１５】その結果、ＢＭ２のクラスはＩｇＭであっ
た。 (5) モノクローナル抗体の培養細胞に対する反応性の検
討 使用した細胞株とその培地
た。 (5) モノクローナル抗体の培養細胞に対する反応性の検
討 使用した細胞株とその培地
【００１６】
【表１】 ヒト歯肉線維芽細胞の採取とその培養 可及的に無菌的状態で採取したヒト歯肉をメスで細切
し、ペニシリン(100unit／ml）とアンフォテリシンＢ
（５μｇ/ml ）を添加したＤＭＥＭに静置した。これを
0.25％トリプシンで20分間処理したのち、ＤＭＥＭで２
回洗浄し、メッシュに通した。約５×105 個の細胞を60
mmディッシュに播種し、10％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ中で24
時間培養した。
し、ペニシリン(100unit／ml）とアンフォテリシンＢ
（５μｇ/ml ）を添加したＤＭＥＭに静置した。これを
0.25％トリプシンで20分間処理したのち、ＤＭＥＭで２
回洗浄し、メッシュに通した。約５×105 個の細胞を60
mmディッシュに播種し、10％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ中で24
時間培養した。
【００１７】モノクローナル抗体の培養細胞に対する
反応性の検討 ＳＣＣ25、ＳＣＣＫＮ、Ｃａ9-22および歯肉線維芽細胞
を８穴のラブテックチャンバーに播種し、サブコンフル
エントになるまで培養した。４％ＰＦＡを加えて20分間
固定したのち、ハイブリドーマの培養上清を加えて室温
で２時間反応させた。フルオレセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＭ抗体を室温暗所で30分
間反応させたのち、蛍光顕微鏡で観察した。また、生細
胞のばあいはサブコンフルエントになった培養細胞をリ
ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、モノクローナ
ル抗体と氷冷下で２時間反応させ、４％ＰＦＡで固定
し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＭ抗体と反応させた。
反応性の検討 ＳＣＣ25、ＳＣＣＫＮ、Ｃａ9-22および歯肉線維芽細胞
を８穴のラブテックチャンバーに播種し、サブコンフル
エントになるまで培養した。４％ＰＦＡを加えて20分間
固定したのち、ハイブリドーマの培養上清を加えて室温
で２時間反応させた。フルオレセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＭ抗体を室温暗所で30分
間反応させたのち、蛍光顕微鏡で観察した。また、生細
胞のばあいはサブコンフルエントになった培養細胞をリ
ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、モノクローナ
ル抗体と氷冷下で２時間反応させ、４％ＰＦＡで固定
し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＭ抗体と反応させた。
【００１８】
【表２】 ＢＭ２と固定した培養細胞との反応性を表２にまとめ
た。蛍光抗体染色により染色されたものを「＋」、まっ
たく染色されなかったものを「−」と評価した。またＳ
ＣＣ25については、増殖中の細胞を蛍光抗体染色したも
のの写真を図１ａに、同じものの位相差顕微鏡写真を図
１ｂに、コンフルエントになった細胞を蛍光抗体染色し
たものの写真を示す。
た。蛍光抗体染色により染色されたものを「＋」、まっ
たく染色されなかったものを「−」と評価した。またＳ
ＣＣ25については、増殖中の細胞を蛍光抗体染色したも
のの写真を図１ａに、同じものの位相差顕微鏡写真を図
１ｂに、コンフルエントになった細胞を蛍光抗体染色し
たものの写真を示す。
【００１９】表２より、ＢＭ２はすべての扁平上皮癌株
細胞に強い反応性を示し、歯肉から分離した線維芽細胞
には反応性を示さないことがわかる。図１ａより、増殖
中のＳＣＣ25において分裂中の細胞では核膜の周囲が、
分裂直後の細胞では細胞質全体が網状にＢＭ２と反応し
ていることがわかる。図１ｃの、コンフルエントになっ
たＳＣＣ25においては、細胞質の反応性は消失し、細胞
間隙に顆粒状の反応産物が観察された。
細胞に強い反応性を示し、歯肉から分離した線維芽細胞
には反応性を示さないことがわかる。図１ａより、増殖
中のＳＣＣ25において分裂中の細胞では核膜の周囲が、
分裂直後の細胞では細胞質全体が網状にＢＭ２と反応し
ていることがわかる。図１ｃの、コンフルエントになっ
たＳＣＣ25においては、細胞質の反応性は消失し、細胞
間隙に顆粒状の反応産物が観察された。
【００２０】一方、生細胞の染色では、すべての扁平上
皮癌由来細胞の細胞間隙に顆粒状の反応産物が観察され
たが、歯肉線維芽細胞では陰性であった。 (6) モノクローナル抗体の組織標本に対する反応性の検
討 検索した腫瘍の種類と例数は表３に示すとおりである。
皮癌由来細胞の細胞間隙に顆粒状の反応産物が観察され
たが、歯肉線維芽細胞では陰性であった。 (6) モノクローナル抗体の組織標本に対する反応性の検
討 検索した腫瘍の種類と例数は表３に示すとおりである。
【００２１】
【表３】 標本は摘出後速やかに５％シュークロース添加ＰＢＳに
浸漬し、続いてシュークロースの濃度を順次20％まで上
げ、ＯＴＣ コンパウンド（Miles Scientific, Naperv
ille,IL,USA ）に包理した。ブロックは５μm に薄切
後、冷アセトンにて固定した。免疫染色は、３％ヤギ血
清にてブロッキングしたのち、ＡＢＣ法（Vecter,Labor
atories Inc., Burlingame, CA,USA）によって行なっ
た。対比染色としては、ＨＥ染色を行なった。結果を表
３に示す。さらに、高分化型舌扁平上皮癌、中分化型舌
扁平上皮癌、低分化型頬粘膜扁平上皮癌、胃癌（未分化
型腺癌）、乳癌および正常口腔粘膜上皮について、それ
ぞれＡＢＣ法によるＢＭ２の免疫染色を行なったものの
写真を、図２ａ、図３ａ、図４、図５ａ、図６および図
７ａに、同一標本のＨＥ染色を図２ｂ、図３ｂ、図５ｂ
およひ図７ｂに示す。
浸漬し、続いてシュークロースの濃度を順次20％まで上
げ、ＯＴＣ コンパウンド（Miles Scientific, Naperv
ille,IL,USA ）に包理した。ブロックは５μm に薄切
後、冷アセトンにて固定した。免疫染色は、３％ヤギ血
清にてブロッキングしたのち、ＡＢＣ法（Vecter,Labor
atories Inc., Burlingame, CA,USA）によって行なっ
た。対比染色としては、ＨＥ染色を行なった。結果を表
３に示す。さらに、高分化型舌扁平上皮癌、中分化型舌
扁平上皮癌、低分化型頬粘膜扁平上皮癌、胃癌（未分化
型腺癌）、乳癌および正常口腔粘膜上皮について、それ
ぞれＡＢＣ法によるＢＭ２の免疫染色を行なったものの
写真を、図２ａ、図３ａ、図４、図５ａ、図６および図
７ａに、同一標本のＨＥ染色を図２ｂ、図３ｂ、図５ｂ
およひ図７ｂに示す。
【００２２】ＢＭ２は検索したすべての口腔扁平上皮癌
に反応性を示した。高分化型の扁平上皮癌においては、
癌胞巣の最外層とそのやや内層で細胞質内に強い陽性を
示した。しかし、癌真珠を形成しているばあい、その中
心部は陰性だった（図２ａ参照）。中分化型扁平上皮癌
では、軽度の角化を起こしている細胞も含めて、癌胞巣
全体が陽性反応を示した（図３ａ参照）。低分化型扁平
上皮癌でも、癌胞巣全体が陽性で、外側の細胞よりも中
心部の細胞の方がより強く反応する傾向が観察された
（図４ａ参照）。皮膚癌の２例はいずれも扁平上皮癌
で、口腔扁平上皮癌と同様の染色傾向を示した。胃癌お
よび大腸癌の反応性はいずれも陰性であった（図５ａ参
照）。乳癌においては腫瘍胞巣自体は陰性であったが、
その周囲を取り囲む筋上皮細胞様細胞は強い反応性を示
した（図６参照）。舌白板症の症例では、肥厚した上皮
細胞全体が陽性だった。また、ＢＭ２は正常口腔粘膜上
皮の基底細胞層および傍基底細胞層に対しても陽性反応
を示した（図７ａ参照）。正常な乳腺、胃および大腸の
組織はいずれも陰性であった。 (7) ウエスタンブロッティングによる抗原の分子量の推
定 試料は以下の方法で調製した。ＳＣＣ25細胞を10cmシャ
ーレにコンフルエントになるまで培養し、ＰＢＳで洗浄
後１mlの10mM Tris-HCl （ｐＨ 7.4）、150mMＮａＣ
ｌ、0.5 ％Triton X-100、0.2mM フェニルメタンスルホ
ニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を加え15分間静置した。溶
解液をラバーポリスマンで集め、10,000rpm で５分間遠
心し、上清を試料とした。ドデシル硫酸ナトリウム・ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は
ラエムリ（Lamemli)ら（ネイチャー，227:680,1970参
照）の方法で12.5％ゲルを用いて還元および非還元条件
下で行なった。泳動されたタンパク質をニトロセルロー
ス膜へ転写し、３％ヤギ血清にて４℃で１晩ブロッキン
グした。これをクマージーブルー染色したもの、ＢＭ２
による染色をしたもの、および染色をしなかったもの
（コントロール）それぞれの写真を図８ａ、図８ｂ、図
８ｃに示した。ＢＭ２による染色は、以下のように行な
った。すなわち、ＢＭ２を室温で２時間反応させたの
ち、Tween-PBS （0.5％）で洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒト
ＩｇＭ抗体で１時間反応させた。再びTween-PBS で洗浄
後、４- クロロナフトールで発色させた。
に反応性を示した。高分化型の扁平上皮癌においては、
癌胞巣の最外層とそのやや内層で細胞質内に強い陽性を
示した。しかし、癌真珠を形成しているばあい、その中
心部は陰性だった（図２ａ参照）。中分化型扁平上皮癌
では、軽度の角化を起こしている細胞も含めて、癌胞巣
全体が陽性反応を示した（図３ａ参照）。低分化型扁平
上皮癌でも、癌胞巣全体が陽性で、外側の細胞よりも中
心部の細胞の方がより強く反応する傾向が観察された
（図４ａ参照）。皮膚癌の２例はいずれも扁平上皮癌
で、口腔扁平上皮癌と同様の染色傾向を示した。胃癌お
よび大腸癌の反応性はいずれも陰性であった（図５ａ参
照）。乳癌においては腫瘍胞巣自体は陰性であったが、
その周囲を取り囲む筋上皮細胞様細胞は強い反応性を示
した（図６参照）。舌白板症の症例では、肥厚した上皮
細胞全体が陽性だった。また、ＢＭ２は正常口腔粘膜上
皮の基底細胞層および傍基底細胞層に対しても陽性反応
を示した（図７ａ参照）。正常な乳腺、胃および大腸の
組織はいずれも陰性であった。 (7) ウエスタンブロッティングによる抗原の分子量の推
定 試料は以下の方法で調製した。ＳＣＣ25細胞を10cmシャ
ーレにコンフルエントになるまで培養し、ＰＢＳで洗浄
後１mlの10mM Tris-HCl （ｐＨ 7.4）、150mMＮａＣ
ｌ、0.5 ％Triton X-100、0.2mM フェニルメタンスルホ
ニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を加え15分間静置した。溶
解液をラバーポリスマンで集め、10,000rpm で５分間遠
心し、上清を試料とした。ドデシル硫酸ナトリウム・ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は
ラエムリ（Lamemli)ら（ネイチャー，227:680,1970参
照）の方法で12.5％ゲルを用いて還元および非還元条件
下で行なった。泳動されたタンパク質をニトロセルロー
ス膜へ転写し、３％ヤギ血清にて４℃で１晩ブロッキン
グした。これをクマージーブルー染色したもの、ＢＭ２
による染色をしたもの、および染色をしなかったもの
（コントロール）それぞれの写真を図８ａ、図８ｂ、図
８ｃに示した。ＢＭ２による染色は、以下のように行な
った。すなわち、ＢＭ２を室温で２時間反応させたの
ち、Tween-PBS （0.5％）で洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒト
ＩｇＭ抗体で１時間反応させた。再びTween-PBS で洗浄
後、４- クロロナフトールで発色させた。
【００２３】その結果、還元および非還元条件下とも
に、41Ｋと52Ｋの２本のバンドが観察された（図８ｂ参
照）。ケラチノサイトに含まれる既知のタンパクのう
ち、サイトケラチン19（40kD) とサイトケラチン８(52.
5kD)が最も近い分子量をもっている。そこで、サイトケ
ラチン８，18，19，を認識するモノクローナル抗体であ
るＰＫＫｌ（ホルテファー(Holthofer) ら、ラボラトリ
ー インベスティゲーション(Lab,Innvest.)49:317,198
3 参照）を用いて、正常および癌組織切片を免疫染色
し、ＢＭ２と比較検討した。その結果、両者の染色パタ
ーンはかなり異なっていた。最も著しい違いは乳癌にお
いて見られ、ＰＫＫ１は癌実質のみが陽性であったのに
対し、ＢＭ２は逆に癌実質が陰性で癌胞巣を取り囲む線
維芽細胞株細胞が強い陽性を示した。以上の結果から、
ＢＭ２はサイトケラチンとは異なるタンパクを認識して
いることがわかる。
に、41Ｋと52Ｋの２本のバンドが観察された（図８ｂ参
照）。ケラチノサイトに含まれる既知のタンパクのう
ち、サイトケラチン19（40kD) とサイトケラチン８(52.
5kD)が最も近い分子量をもっている。そこで、サイトケ
ラチン８，18，19，を認識するモノクローナル抗体であ
るＰＫＫｌ（ホルテファー(Holthofer) ら、ラボラトリ
ー インベスティゲーション(Lab,Innvest.)49:317,198
3 参照）を用いて、正常および癌組織切片を免疫染色
し、ＢＭ２と比較検討した。その結果、両者の染色パタ
ーンはかなり異なっていた。最も著しい違いは乳癌にお
いて見られ、ＰＫＫ１は癌実質のみが陽性であったのに
対し、ＢＭ２は逆に癌実質が陰性で癌胞巣を取り囲む線
維芽細胞株細胞が強い陽性を示した。以上の結果から、
ＢＭ２はサイトケラチンとは異なるタンパクを認識して
いることがわかる。
【００２４】
【発明の効果】以上の記載から明らかなように、本発明
のヒト−ヒト型モノクローナル抗体は、ヒト扁平上皮癌
を認識するものであり、ヒト扁平上皮癌の診断と治療に
極めて有用なものである。また、本抗体はヒト乳癌胞巣
を取り囲む筋上皮細胞様細胞と反応する性質を持ってい
ることから、乳癌と組織反応の研究のための有力な手段
となるものと考えられる。
のヒト−ヒト型モノクローナル抗体は、ヒト扁平上皮癌
を認識するものであり、ヒト扁平上皮癌の診断と治療に
極めて有用なものである。また、本抗体はヒト乳癌胞巣
を取り囲む筋上皮細胞様細胞と反応する性質を持ってい
ることから、乳癌と組織反応の研究のための有力な手段
となるものと考えられる。
【図１】(a) 増殖中のヒト扁平上皮癌由来ＳＣＣ25細胞
をＢＭ２により蛍光抗体染色したものの写真である。 (b) 図１ａと同一標本の位相差顕微鏡写真である。 (c) コンフルエントになったＳＣＣ25細胞をＢＭ２によ
り蛍光抗体染色したものの写真である。
をＢＭ２により蛍光抗体染色したものの写真である。 (b) 図１ａと同一標本の位相差顕微鏡写真である。 (c) コンフルエントになったＳＣＣ25細胞をＢＭ２によ
り蛍光抗体染色したものの写真である。
【図２】(a) 高分化型舌扁平上皮癌についてＡＢＣ法に
よるＢＭ２の免疫染色を行なったものの写真である。 (b) 図２ａと同一標本のＨＥ染色像である。
よるＢＭ２の免疫染色を行なったものの写真である。 (b) 図２ａと同一標本のＨＥ染色像である。
【図３】(a) 中分化型舌扁平上皮癌についてＡＢＣ法に
よるＢＭ２の免疫染色を行なったものの写真である。 (b) 図３ａと同一標本のＨＥ染色像である。
よるＢＭ２の免疫染色を行なったものの写真である。 (b) 図３ａと同一標本のＨＥ染色像である。
【図４】低分化型頬粘膜扁平上皮癌についてＡＢＣ法に
よるＢＭ２の免疫染色を行なったものの写真である。
よるＢＭ２の免疫染色を行なったものの写真である。
【図５】(a) 胃癌（未分化型腺癌）についてＡＢＣ法に
よるＢＭ２の免疫染色を行なったものの写真である。 (b) 図５ａと同一標本のＨＥ染色像である。
よるＢＭ２の免疫染色を行なったものの写真である。 (b) 図５ａと同一標本のＨＥ染色像である。
【図６】乳癌についてＡＢＣ法によるＢＭ２の免疫染色
を行なったものの写真である。
を行なったものの写真である。
【図７】(a) 正常口腔粘膜上皮についてＡＢＣ法による
ＢＭ２の免疫染色を行なったものの写真である (b) 同一標本のＨＥ染色像である。
ＢＭ２の免疫染色を行なったものの写真である (b) 同一標本のＨＥ染色像である。
【図８】(a) ＳＣＣ25細胞の溶解液についてウエスタン
ブロッティングを行なったもののクマージーブルー染色
の写真である。 (b) 図８ａと同一標本のＢＭ２による染色の写真であ
る。 (c) 図８ａと同一標本のコントロールの写真である。
ブロッティングを行なったもののクマージーブルー染色
の写真である。 (b) 図８ａと同一標本のＢＭ２による染色の写真であ
る。 (c) 図８ａと同一標本のコントロールの写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/07 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (2)
- 【請求項１】 工業技術院微生物工業研究所に微工研条
寄第3850号で寄託された細胞の特性を有するハイブリド
ーマから産生される、ヒト扁平上皮癌を認識するヒト−
ヒト型モノクローナル抗体。 - 【請求項２】 工業技術院微生物工業研究所に微工研条
寄第3850号で寄託された細胞の特性を有するヒト−ヒト
型ハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4156013A JPH05317081A (ja) | 1992-05-21 | 1992-05-21 | ヒト−ヒト型モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4156013A JPH05317081A (ja) | 1992-05-21 | 1992-05-21 | ヒト−ヒト型モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317081A true JPH05317081A (ja) | 1993-12-03 |
Family
ID=15618414
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4156013A Pending JPH05317081A (ja) | 1992-05-21 | 1992-05-21 | ヒト−ヒト型モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05317081A (ja) |
-
1992
- 1992-05-21 JP JP4156013A patent/JPH05317081A/ja active Pending
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