JPH06102038B2 - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
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- JPH06102038B2 JPH06102038B2 JP61191589A JP19158986A JPH06102038B2 JP H06102038 B2 JPH06102038 B2 JP H06102038B2 JP 61191589 A JP61191589 A JP 61191589A JP 19158986 A JP19158986 A JP 19158986A JP H06102038 B2 JPH06102038 B2 JP H06102038B2
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- antibody
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は消化器癌に含まれる抗原と反応するモノクロー
ナル抗体に関するものである。
ナル抗体に関するものである。
胃癌中に含まれる抗原と反応するモノクローナル抗体が
種々提案されている。
種々提案されている。
しかしながら、現在のところ、胃癌の血清診断法はまだ
確立されていない。従って、胃癌の血清による早期診断
法の確立が望まれている。
確立されていない。従って、胃癌の血清による早期診断
法の確立が望まれている。
本発明者は、胃癌に対するモノクローナル抗体について
種々検討を行った結果、本発明を完成した。
種々検討を行った結果、本発明を完成した。
即ち、本発明は、 「ヒト胃癌に含まれる分子量70万ダルトン以上（ゲル
過法）で生理食塩水又は1M過塩素酸溶液にて抽出される
抗原と抗原抗体反応をし、シアル酸が含まれる抗原部位
と反応し、次の性質を有するIgMのクラスに属するモノ
クローナル抗体。
過法）で生理食塩水又は1M過塩素酸溶液にて抽出される
抗原と抗原抗体反応をし、シアル酸が含まれる抗原部位
と反応し、次の性質を有するIgMのクラスに属するモノ
クローナル抗体。
（１）ヒト胃癌と反応する。
（２）ヒトの膵臓、肝、食道上皮、大腸粘膜及び腎の正
常組織の一部と反応する。
常組織の一部と反応する。
（３）正常人及び癌患者の血清中にこのモノクローナル
抗体との反応する抗原が存在する。」に関するものであ
る。
抗体との反応する抗原が存在する。」に関するものであ
る。
本発明のモノクローナル抗体と反応する抗原は、癌患者
血清において高値を示す例が多く、診断的価値が高い。
血清において高値を示す例が多く、診断的価値が高い。
なお、以下の説明において、抗体産生ハイブリドーマの
製造のために免疫原として使用する癌細胞及び、本発明
のモノクローナル抗体の各組織との反応性を調べるため
に用いる各種組織は全て人の組織である。
製造のために免疫原として使用する癌細胞及び、本発明
のモノクローナル抗体の各組織との反応性を調べるため
に用いる各種組織は全て人の組織である。
コブロスキー等の報告した抗大腸癌モノクローナル抗体
19−９（Cancer Res.,42,4820−4823,1982）は膵、胃、
大腸、胆道等の癌と反応すると報告されている。しか
し、同一検体を本発明のモノクローナル抗体と19−９抗
体で免疫染色して比較したところ、ある胃癌検体は本発
明のモノクローナル抗体と強く反応したが19−９抗体と
は全く反応しなかった。従って両者は異なった抗原決定
基を認識している。
19−９（Cancer Res.,42,4820−4823,1982）は膵、胃、
大腸、胆道等の癌と反応すると報告されている。しか
し、同一検体を本発明のモノクローナル抗体と19−９抗
体で免疫染色して比較したところ、ある胃癌検体は本発
明のモノクローナル抗体と強く反応したが19−９抗体と
は全く反応しなかった。従って両者は異なった抗原決定
基を認識している。
本発明のモノクローナル抗体は新らしい癌関連抗原と反
応するモノクローナル抗体である。
応するモノクローナル抗体である。
本発明のモノクローナル抗体は、甲状腺、心筋、脾、脊
髄、小腸、睾丸の正常組織とは反応しない。
髄、小腸、睾丸の正常組織とは反応しない。
胃癌組織をシアル酸分解酵素であるニユーラミニダーゼ
で処理すると該胃癌組織に対する本発明のモノクローナ
ルの反応性は失われる。よって、本発明のモノクローナ
ル抗体の認識する抗原部位にシアル酸が存在する。
で処理すると該胃癌組織に対する本発明のモノクローナ
ルの反応性は失われる。よって、本発明のモノクローナ
ル抗体の認識する抗原部位にシアル酸が存在する。
本発明のモノクローナル抗体抗体が反応する胃癌に含ま
れる抗原の分子量は70万ダルトン以上（ゲル過法）で
あり該抗原は生理食塩水で抽出することが出来、又1M過
塩素溶液によっても抽出することが出来る。
れる抗原の分子量は70万ダルトン以上（ゲル過法）で
あり該抗原は生理食塩水で抽出することが出来、又1M過
塩素溶液によっても抽出することが出来る。
本発明のモノクローナル抗体はIgMのクラスに属するも
のであり、分子量は約90万である。
のであり、分子量は約90万である。
本発明のモノクローナル抗体の製法は、例えば次のよう
にして行うことが出来る。即ち、本発明の抗体に対する
抗原（本発明の抗体に対する抗原を含む細胞例えば胃癌
細胞等が使用出来る）でマウス又はラット等の動物を免
疫し、免疫された動物から抗体産生細胞を得、これと骨
髄腫細胞を融合し、得られた融合細胞をクローン化し、
ヒト胃癌に対する抗体を産生する融合細胞を選択し、こ
れを培養し抗体を回収する。免疫法、融合法、融合細胞
の選択等は通常の方法によって行うことが出来、具体的
には、例えば後述の方法によって行うことが出来る。
にして行うことが出来る。即ち、本発明の抗体に対する
抗原（本発明の抗体に対する抗原を含む細胞例えば胃癌
細胞等が使用出来る）でマウス又はラット等の動物を免
疫し、免疫された動物から抗体産生細胞を得、これと骨
髄腫細胞を融合し、得られた融合細胞をクローン化し、
ヒト胃癌に対する抗体を産生する融合細胞を選択し、こ
れを培養し抗体を回収する。免疫法、融合法、融合細胞
の選択等は通常の方法によって行うことが出来、具体的
には、例えば後述の方法によって行うことが出来る。
本発明のモノクローナル抗体は、これと反応する抗原で
免疫された、例えば本発明のモノクローナル抗体と反応
する細胞等、例えば胃癌細胞等で免疫された動物の抗体
産生細胞と骨髄腫細胞との融合によって形成されるハイ
ブリドーマによって産生される。
免疫された、例えば本発明のモノクローナル抗体と反応
する細胞等、例えば胃癌細胞等で免疫された動物の抗体
産生細胞と骨髄腫細胞との融合によって形成されるハイ
ブリドーマによって産生される。
更に詳しくは、例えば次のようにして本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造することが出来る。
ーナル抗体を製造することが出来る。
まず、マウスを胃癌細胞で免疫する。免疫する動物はマ
ウスに限らず、ラット等のネズミ科の動物又はその他の
動物を使用してもよいが、通常はマウスが用いられる。
例えばBALB/cマウスに胃癌細胞又はそのホモジネート又
はそれから採取された抗原を数日〜数週間おきに数回接
種する。接種量は１匹あたり１回につき105〜107個の細
胞を使うのが好ましい。その後マウスより脾臓を摘出し
遠心分離により抗体産生細胞を得る。この細胞は増殖し
ていく能力を持たないので、自己増殖能力を有する細胞
と融合させる。自己増殖能力を有する細胞としては骨髄
腫細胞が特に好ましい。骨髄腫細胞としては、同種の動
物のものを用いるのが好ましい。又、骨髄腫細胞として
は、抗体を産生しないものを選択するのが好ましい。抗
体産生細胞と骨髄腫細胞をポリエチレングリコール等の
細胞融合剤を含む溶液（又は懸濁液）に加え細胞融合を
行う。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の使用割合は、細胞数
比で5:1〜10:1とするのが好ましい。得られた融合細胞
は限界希釈法により分離し、分離した融合細胞は増殖さ
せたのち、各ウエルにおいて産生される抗体は公知の方
法、例えば螢光抗体法又は酵素抗体法等により、各種細
胞組織等と反応させ、その結果から所望の抗体を産生す
るハイブリドーマを選択する。選択したハイブリドーマ
を培養器中で培養し上清液から抗体を得ることも出来る
が、生体内例えばヌードマウス腹腔内にハイブリドーマ
を注入し、ヌードマウス体内で腫瘍として生育させ、ヌ
ードマウス血清あるいは腹水から抗体を回収する方法に
よることも出来る。
ウスに限らず、ラット等のネズミ科の動物又はその他の
動物を使用してもよいが、通常はマウスが用いられる。
例えばBALB/cマウスに胃癌細胞又はそのホモジネート又
はそれから採取された抗原を数日〜数週間おきに数回接
種する。接種量は１匹あたり１回につき105〜107個の細
胞を使うのが好ましい。その後マウスより脾臓を摘出し
遠心分離により抗体産生細胞を得る。この細胞は増殖し
ていく能力を持たないので、自己増殖能力を有する細胞
と融合させる。自己増殖能力を有する細胞としては骨髄
腫細胞が特に好ましい。骨髄腫細胞としては、同種の動
物のものを用いるのが好ましい。又、骨髄腫細胞として
は、抗体を産生しないものを選択するのが好ましい。抗
体産生細胞と骨髄腫細胞をポリエチレングリコール等の
細胞融合剤を含む溶液（又は懸濁液）に加え細胞融合を
行う。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の使用割合は、細胞数
比で5:1〜10:1とするのが好ましい。得られた融合細胞
は限界希釈法により分離し、分離した融合細胞は増殖さ
せたのち、各ウエルにおいて産生される抗体は公知の方
法、例えば螢光抗体法又は酵素抗体法等により、各種細
胞組織等と反応させ、その結果から所望の抗体を産生す
るハイブリドーマを選択する。選択したハイブリドーマ
を培養器中で培養し上清液から抗体を得ることも出来る
が、生体内例えばヌードマウス腹腔内にハイブリドーマ
を注入し、ヌードマウス体内で腫瘍として生育させ、ヌ
ードマウス血清あるいは腹水から抗体を回収する方法に
よることも出来る。
本発明のモノクローナル抗体を作るために免疫原として
使用する細胞としては胃癌細胞等が使用出来る。これら
胃癌細胞は特定の株のものに限定されず、胃癌細胞で本
発明の抗体と反応する抗原を含むものであれば使用可能
である。
使用する細胞としては胃癌細胞等が使用出来る。これら
胃癌細胞は特定の株のものに限定されず、胃癌細胞で本
発明の抗体と反応する抗原を含むものであれば使用可能
である。
本発明のモノクローナル抗体を作るために用いる抗体産
生細胞はＢ細胞であり、Ｂ細胞は体内を循環するが脾臓
等に蓄積するので脾臓を摘出して使用するのが好ましい
が、必ずしも脾臓でなくてもよく、Ｂ細胞が多く存在す
る部分を使用すればよい。
生細胞はＢ細胞であり、Ｂ細胞は体内を循環するが脾臓
等に蓄積するので脾臓を摘出して使用するのが好ましい
が、必ずしも脾臓でなくてもよく、Ｂ細胞が多く存在す
る部分を使用すればよい。
本発明のモノクローナル抗体は、胃癌の診断薬の材料と
して使用することが出来、又、本発明のモノクローナル
抗体と抗癌剤を組合わせてミサイル療法に用いることが
出来る。
して使用することが出来、又、本発明のモノクローナル
抗体と抗癌剤を組合わせてミサイル療法に用いることが
出来る。
実施例１ （１）モノクローナル抗体の製造 ヒト胃癌をヌードマウスに移植継代した株（St−15）を
リン酸緩衝食塩水に10％の割合でホモジエネートしたも
のと同量のフロインド完全アジュバントとを混合したも
のを0.2ml8週令の雌BALB/cマウスの腹腔に投与、１ケ月
間おいて更に２回、次いで３ケ月後に更に１回同量を投
与した。最終免役はホモジエネートのみ0.1mlを腹腔に
投与（前回より２ケ月後）し、その３日後にマウスから
脾臓を摘出した。
リン酸緩衝食塩水に10％の割合でホモジエネートしたも
のと同量のフロインド完全アジュバントとを混合したも
のを0.2ml8週令の雌BALB/cマウスの腹腔に投与、１ケ月
間おいて更に２回、次いで３ケ月後に更に１回同量を投
与した。最終免役はホモジエネートのみ0.1mlを腹腔に
投与（前回より２ケ月後）し、その３日後にマウスから
脾臓を摘出した。
細胞融合の方法は、渡辺等の方法（免役実験操作法VI
I、2963−2967,1978）に準じて行った。
I、2963−2967,1978）に準じて行った。
即ち、摘出した脾臓を細切したのち、ステンレスメツシ
ユを通し、1500rpm,200Gで遠沈して得た沈渣に50mlの0.
7％NH4Clを加え赤血球を除き、RPMI−1640で２回洗浄し
て得た脾細胞浮遊液2.8×108個/20mlにマウス骨髄腫細
胞（P3−X63−Ag8−U1）（以下P3U1という）をRPMI−16
40で２回洗浄して得たP3U16.4×106/2ml（5:1）を混合
し、2000rpm,200Gで10分間遠沈した。沈殿細胞をよくと
きほぐした後、45％（w/v）のポリエチレングリコール4
000（メルク社）を含有した37℃、pH7.4のRPMI−1640,1
mlを加え８分間処理した。
ユを通し、1500rpm,200Gで遠沈して得た沈渣に50mlの0.
7％NH4Clを加え赤血球を除き、RPMI−1640で２回洗浄し
て得た脾細胞浮遊液2.8×108個/20mlにマウス骨髄腫細
胞（P3−X63−Ag8−U1）（以下P3U1という）をRPMI−16
40で２回洗浄して得たP3U16.4×106/2ml（5:1）を混合
し、2000rpm,200Gで10分間遠沈した。沈殿細胞をよくと
きほぐした後、45％（w/v）のポリエチレングリコール4
000（メルク社）を含有した37℃、pH7.4のRPMI−1640,1
mlを加え８分間処理した。
反応１分後からRPMI−1640を徐々に加え総量30mlとして
細胞融合を終了した。1000rpm,200Gで遠沈後10％牛胎児
血清を含んだRPMI−1640,100mlを加えて細胞浮遊液を作
り、Falconmicro culture plate（3042）の１ウエルあ
たり0.2mlずつ分注し37℃、５％CO2充填培養器中で培養
した。24時間後から２日毎に上清の半量をHAT培地（ヒ
ポキサンチン、アミノプテリン、チミジン及び10％牛胎
児血清を含むRPMI−1640培地）と入れ換えた。
細胞融合を終了した。1000rpm,200Gで遠沈後10％牛胎児
血清を含んだRPMI−1640,100mlを加えて細胞浮遊液を作
り、Falconmicro culture plate（3042）の１ウエルあ
たり0.2mlずつ分注し37℃、５％CO2充填培養器中で培養
した。24時間後から２日毎に上清の半量をHAT培地（ヒ
ポキサンチン、アミノプテリン、チミジン及び10％牛胎
児血清を含むRPMI−1640培地）と入れ換えた。
10日目に上清を取り出し、胃癌組織のホルマリン固定、
パラフイン切片を酵素抗体法で染色する事により抗体産
生の有無を確かめ、抗体産生が陽性を示したウエル中の
ハイブリドーマを１ウエルあたり0.3〜0.6個となるよう
限界希釈法によって行った。培地は最初HT（ヒポキサン
チン、チミジン、10％牛胎児血清を加えたRPMI−1640培
地）を用い、feeder layerとしてBALB/cマウスの胸腺細
胞５×105／ウエルを加えた。次に10％牛胎児血清を加
えたRPMI−1640培地に置換した。
パラフイン切片を酵素抗体法で染色する事により抗体産
生の有無を確かめ、抗体産生が陽性を示したウエル中の
ハイブリドーマを１ウエルあたり0.3〜0.6個となるよう
限界希釈法によって行った。培地は最初HT（ヒポキサン
チン、チミジン、10％牛胎児血清を加えたRPMI−1640培
地）を用い、feeder layerとしてBALB/cマウスの胸腺細
胞５×105／ウエルを加えた。次に10％牛胎児血清を加
えたRPMI−1640培地に置換した。
限界希釈法によるクローニングは２回行った。
また、大量培養には１ウエルのハイブリドーマを５ウエ
ル、2.4ウエル（Falcon308）と増量しながら、最終的に
はFaIcon tissue cul ture flaskを用いた。flask培養
で得た上清にNaN3を0.1％加え４℃にて保存した。
ル、2.4ウエル（Falcon308）と増量しながら、最終的に
はFaIcon tissue cul ture flaskを用いた。flask培養
で得た上清にNaN3を0.1％加え４℃にて保存した。
（２）本発明のモノクローナル抗体の選定及びモノクロ
ーナル抗体による各種組織の染色。
ーナル抗体による各種組織の染色。
本発明のモノクローナル抗体選定のための各種組織の染
色及び該モノクローナル抗体による各種組織の染色はHs
u,S.M.等の方法（J.Histochem.Cytochem.,29,577−580,
1981）に準じてアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ
複合体法によるホルマリン固定、パラフイン切片の染色
により行った。即ち、広く一般的に用いられている10％
ホルマリン固定後パラフイン包埋、薄切されたヒト胃癌
組織、他のヒト癌組織及びヒト正常組織を脱パラフイン
後、0.3％H2O2を含むメタノールにて20分間処理した。
その後リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗った後、10％牛胎
児血清を含むPBSにて30分間処理した。次いで、抗体を
含む溶液（抗体濃度２μg/ml）と室温で１時間反応させ
た。そしてPBSで15分間洗った後、ビチオン化抗マウス
免疫グロブリン（7.5μg/ml）にて60分間処理した。こ
れをPBSで15分間洗った後、アビジンDH−ビオチン化ペ
ルオキシダーゼ複合体と室温で30分間処理した。これを
PBSで15分間洗った後ジアミノベンチジン溶液（1mg/ml
ジアミノベンチジン、0.01％H2O2、トリスバツフアーpH
7.6）にて５〜10分間反応させた。細胞核をヘマトキシ
リンにて染色後、通常の方法で封入し検鏡した。
色及び該モノクローナル抗体による各種組織の染色はHs
u,S.M.等の方法（J.Histochem.Cytochem.,29,577−580,
1981）に準じてアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ
複合体法によるホルマリン固定、パラフイン切片の染色
により行った。即ち、広く一般的に用いられている10％
ホルマリン固定後パラフイン包埋、薄切されたヒト胃癌
組織、他のヒト癌組織及びヒト正常組織を脱パラフイン
後、0.3％H2O2を含むメタノールにて20分間処理した。
その後リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗った後、10％牛胎
児血清を含むPBSにて30分間処理した。次いで、抗体を
含む溶液（抗体濃度２μg/ml）と室温で１時間反応させ
た。そしてPBSで15分間洗った後、ビチオン化抗マウス
免疫グロブリン（7.5μg/ml）にて60分間処理した。こ
れをPBSで15分間洗った後、アビジンDH−ビオチン化ペ
ルオキシダーゼ複合体と室温で30分間処理した。これを
PBSで15分間洗った後ジアミノベンチジン溶液（1mg/ml
ジアミノベンチジン、0.01％H2O2、トリスバツフアーpH
7.6）にて５〜10分間反応させた。細胞核をヘマトキシ
リンにて染色後、通常の方法で封入し検鏡した。
（３）結果 288ウエル中28ウエルについて抗体産生の反応性が認め
られ、その中から本発明のモノクロナール抗体を産生す
るハイブリドーマ１株を選択した。
られ、その中から本発明のモノクロナール抗体を産生す
るハイブリドーマ１株を選択した。
本発明のモノクローナル抗体の胃癌組織又は各種正常組
織との反応試験は、上記（２）に記載した方法に従って
行った。
織との反応試験は、上記（２）に記載した方法に従って
行った。
（Ａ）表−１に本発明のモノクローナル抗体の胃癌組織
に対する反応性試験結果を示した。
に対する反応性試験結果を示した。
表−１に示したとおり、胃癌組織については、24例中14
例が陽性であったが、この内強陽性は６例であった。
又、ルイス式血液型陰性 〔Le（ａ−ｂ−）〕が１例あり、その組織に含まれてい
た胃癌細胞が、本発明の抗体による染色では陽性であっ
た。
例が陽性であったが、この内強陽性は６例であった。
又、ルイス式血液型陰性 〔Le（ａ−ｂ−）〕が１例あり、その組織に含まれてい
た胃癌細胞が、本発明の抗体による染色では陽性であっ
た。
19−９抗体ではLe（ａ−ｂ−）例は陽性にはならない。
しかし本発明の抗体では陽性であった事は非常に有意義
である。
しかし本発明の抗体では陽性であった事は非常に有意義
である。
（Ｂ）表−２に本発明のモノクローナル抗体の各種正常
組織に対する反応試験の結果を示した。
組織に対する反応試験の結果を示した。
尚、表−２中の「例数」は、検体の中で表−２右側の反
応様式を示したものの数を示している。
応様式を示したものの数を示している。
実施例２ ヒト血清中の抗原の定量法 本発明の抗体を産生するハイブリドーマをプリスタン
（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン0.5mlをあらか
じめ腹腔に投与しておいたBALB/cマウスの腹腔に106〜1
07個接種する。
（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン0.5mlをあらか
じめ腹腔に投与しておいたBALB/cマウスの腹腔に106〜1
07個接種する。
１〜２週間後に腹水を採取する。この腹水をセフアロー
スCL−6Bによりゲル過を行い、IgMを最も多く含む分
画を集め精製抗体とする。
スCL−6Bによりゲル過を行い、IgMを最も多く含む分
画を集め精製抗体とする。
抗体吸着マイクロプレートの作製：上記精製抗体を50μ
g/mlの濃度になる様0.1MpH9.6の炭酸バツフアーにて希
釈する。この抗体溶液を50μｌずつ96ウエル、平底マイ
クロプレート（例えばNunc社、Immunoplate I）の各ウ
エルに分注し、４℃、２日間蒸発を防ぎながら静置す
る。次ぎでPBS（リン酸緩衝食塩水）にて３回洗った
後、ウシ血清アルブミンの１％PBS溶液を各ウエルに300
μｌずつ分注した後４℃に保存する。
g/mlの濃度になる様0.1MpH9.6の炭酸バツフアーにて希
釈する。この抗体溶液を50μｌずつ96ウエル、平底マイ
クロプレート（例えばNunc社、Immunoplate I）の各ウ
エルに分注し、４℃、２日間蒸発を防ぎながら静置す
る。次ぎでPBS（リン酸緩衝食塩水）にて３回洗った
後、ウシ血清アルブミンの１％PBS溶液を各ウエルに300
μｌずつ分注した後４℃に保存する。
モノクローナル抗体のビオチン化；精製抗体1mgにつき1
0μｇのＮ−ハイドロキシサクシイミドビオチン（Perac
e社製）を0.1Mの重炭酸ソーダ溶液中にて、室温で５時
間反応させ、次いで、PBSにて十分透析する。
0μｇのＮ−ハイドロキシサクシイミドビオチン（Perac
e社製）を0.1Mの重炭酸ソーダ溶液中にて、室温で５時
間反応させ、次いで、PBSにて十分透析する。
標準抗原：ヒト胃癌のヌードマウス移植株St−15の10％
PBSホモジエネートを15000回転20分遠心した上清を標準
抗原とした。
PBSホモジエネートを15000回転20分遠心した上清を標準
抗原とした。
この抽出液が64000単位の抗原を含むものと定め、以下
の測定を行った。
の測定を行った。
測定法：抗体吸着マイクロプレートの各ウエルに、10μ
ｌの検体又は標準抗原と40μｌの検体希釈液（２％正常
マウス血清と10mMEDTAを含むPBS）を加え混合後粘着テ
ープ等でシールし37℃の温水上にうかべ２時間反応させ
る。次いで0.05％のTween20を含むPBSにて10回洗った後
0.5μg/mlのビオチン化モノクローナル抗体と1.25μg/m
lのアビジン化ホースラデイシユペルオキシダーゼ（ベ
クター社製）を２％正常マウス血清を含むPBSにとかし
たものを各ウエル当り50μｌ加え室温で蒸発を防ぎなが
ら３時間反応させる。次いで0.05％Tween20を含むPBSに
て10回洗い発色液を100μｌ各ウエルに加える、発色液
は、オルトフエニレンジアミン1mg/ml、H2O2％を含むク
エン酸リン酸バツフアーpH5.0よりなる。室温で20分間
反応させた後25μｌの2MH2SO4を加え反応を停止させ
る。490nmの吸収を測定し、その結果を標準抗原の吸光
度と比較する事により検体中に含まれていた本発明の抗
体と反応する抗原の単位数を決定する。
ｌの検体又は標準抗原と40μｌの検体希釈液（２％正常
マウス血清と10mMEDTAを含むPBS）を加え混合後粘着テ
ープ等でシールし37℃の温水上にうかべ２時間反応させ
る。次いで0.05％のTween20を含むPBSにて10回洗った後
0.5μg/mlのビオチン化モノクローナル抗体と1.25μg/m
lのアビジン化ホースラデイシユペルオキシダーゼ（ベ
クター社製）を２％正常マウス血清を含むPBSにとかし
たものを各ウエル当り50μｌ加え室温で蒸発を防ぎなが
ら３時間反応させる。次いで0.05％Tween20を含むPBSに
て10回洗い発色液を100μｌ各ウエルに加える、発色液
は、オルトフエニレンジアミン1mg/ml、H2O2％を含むク
エン酸リン酸バツフアーpH5.0よりなる。室温で20分間
反応させた後25μｌの2MH2SO4を加え反応を停止させ
る。490nmの吸収を測定し、その結果を標準抗原の吸光
度と比較する事により検体中に含まれていた本発明の抗
体と反応する抗原の単位数を決定する。
正常人血清218例について測定したところ正常人血清の
平均＋２標準偏差は３単位であり、８例（3.7％）が３
単位/mlを越えていた。
平均＋２標準偏差は３単位であり、８例（3.7％）が３
単位/mlを越えていた。
３単位以上の抗原を含むものを陽性とすると各種の癌患
者及び良性疾患々者の血清例での陽性率は表−３に示す
ごとくである。
者及び良性疾患々者の血清例での陽性率は表−３に示す
ごとくである。
実施例３ 実施例１の（２）において、アビジン−ビオチン−ペル
オキシダーゼ複合体法による染色をほどこす前にニユー
ラミニダーゼ0.1U/mlによりpH6.4、室温にて胃癌組織を
１時間処理した。かくして得られた胃癌組織に対する本
発明のモノクローナル抗体の反応試験を実施例１と同様
にして行った所、ニユーラミニダーゼ処理により染色性
は失われた。
オキシダーゼ複合体法による染色をほどこす前にニユー
ラミニダーゼ0.1U/mlによりpH6.4、室温にて胃癌組織を
１時間処理した。かくして得られた胃癌組織に対する本
発明のモノクローナル抗体の反応試験を実施例１と同様
にして行った所、ニユーラミニダーゼ処理により染色性
は失われた。
以上のことより、本発明のモノクローナル抗体の認識す
る抗原部位にはシアル酸の関与があることがわかる。
る抗原部位にはシアル酸の関与があることがわかる。
実施例４ St−15株及びヒト癌性腹水（胃癌）に含まれる抗原のSe
pharose CL−6Bによるゲル過では、St−15株に含まれ
る本発明の抗体と反応する抗原は分子量70万ダルトンか
らVo分画（分子量150万ダルトン以上）にわたった抗原
が検出された。一方癌性腹水ではVo分画にのみ検出され
た。この抗原はSDS−PAGE（５％アクリルアミド）では
２ーメルカプトエタノール処理の有無にかかわらず、わ
ずかにゲル内を移動したのみであった。
pharose CL−6Bによるゲル過では、St−15株に含まれ
る本発明の抗体と反応する抗原は分子量70万ダルトンか
らVo分画（分子量150万ダルトン以上）にわたった抗原
が検出された。一方癌性腹水ではVo分画にのみ検出され
た。この抗原はSDS−PAGE（５％アクリルアミド）では
２ーメルカプトエタノール処理の有無にかかわらず、わ
ずかにゲル内を移動したのみであった。
又、上記抗原は、生理食塩水にて抽出することが出来
た。更にこの抗原は1M過塩素酸溶液で抽出することが出
来た。
た。更にこの抗原は1M過塩素酸溶液で抽出することが出
来た。
実施例５ 本発明のモノクローナル抗体のイムノグロブリンクラス
を知るため、本モノクローナル抗体と抗ヒトIg血清と寒
天ゲル内沈降反応による試験を実施した。
を知るため、本モノクローナル抗体と抗ヒトIg血清と寒
天ゲル内沈降反応による試験を実施した。
本モノクローナル抗体は、抗ヒトIgM血清に明らかな沈
降線を示したが、IgG.IgA.IgD.IgEのどの血清とも反応
せず、本モノクローナル抗体がIgMイムノグロブリンで
あることが判明した。
降線を示したが、IgG.IgA.IgD.IgEのどの血清とも反応
せず、本モノクローナル抗体がIgMイムノグロブリンで
あることが判明した。
本発明のモノクローナル抗体を用いることによる利点は
例えば次のとおりである。
例えば次のとおりである。
（１）血清により膵、胆、肝、胃等の癌のスクリーニン
グが効果的に行ないうる。
グが効果的に行ないうる。
（２）血清による上記癌の診断に有用である。
（３）血清により上記癌の治療後の再発予知に有用であ
る。
る。
（４）ルイス式血液型陰性〔Le（ａ−ｂ−）〕の癌組織
で反応することにより、血液型による影響なく、上記癌
のスクリーニング、診断、モニタリングを行ないうる。
で反応することにより、血液型による影響なく、上記癌
のスクリーニング、診断、モニタリングを行ないうる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】ヒト胃癌に含まれる分子量70万ダルトン以
上（ゲル濾過法）で生理食塩水又は1M過塩素酸溶液にて
抽出される抗原と抗原抗体反応をし、シアル酸が含まれ
る抗原部位と反応し次の性質を有するIgMのクラスに属
するモノクローナル抗体。 （１）ヒト胃癌と反応する。 （２）人の膵臓、肝、食道上皮、大腸粘膜及び腎の正常
組織の一部と反応する。 （３）正常人及び癌患者の血清中にこのモノクローナル
抗体と反応する抗原が存在する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61191589A JPH06102038B2 (ja) | 1986-08-18 | 1986-08-18 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61191589A JPH06102038B2 (ja) | 1986-08-18 | 1986-08-18 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6349094A JPS6349094A (ja) | 1988-03-01 |
| JPH06102038B2 true JPH06102038B2 (ja) | 1994-12-14 |
Family
ID=16277154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61191589A Expired - Fee Related JPH06102038B2 (ja) | 1986-08-18 | 1986-08-18 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06102038B2 (ja) |
-
1986
- 1986-08-18 JP JP61191589A patent/JPH06102038B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JNCI J NATL CANCER INST=1984 * |
| PROC NATL ACAD USA=1984 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6349094A (ja) | 1988-03-01 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |