JPS62123200A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
- Publication number
- JPS62123200A JPS62123200A JP60261541A JP26154185A JPS62123200A JP S62123200 A JPS62123200 A JP S62123200A JP 60261541 A JP60261541 A JP 60261541A JP 26154185 A JP26154185 A JP 26154185A JP S62123200 A JPS62123200 A JP S62123200A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cancer
- cells
- kato
- iii
- monoclonal antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分骨〕
本発明は、印環型胃癌由来細胞株（ＫＡＴＯ−■）を免
疫原として作製されたノ１イブリドーマの産生ずる特定
の特性を持つモノクローナル抗体に関する。
疫原として作製されたノ１イブリドーマの産生ずる特定
の特性を持つモノクローナル抗体に関する。
癌研究の究極の目標は、抗癌、制癌作用を示す物質の探
索と、癌の早期発見、即ら早期診断法の確立にあるとい
える。従来、癌に関して種々の薬剤、治療法、試薬が開
発されているが、これらはいずれも癌細胞ばかりでなく
、正常組織、正常細胞にも影響を与え、如何に有効な薬
剤とはいえ、その副作用のために使用が著しく制限され
ているのが現状である。
索と、癌の早期発見、即ら早期診断法の確立にあるとい
える。従来、癌に関して種々の薬剤、治療法、試薬が開
発されているが、これらはいずれも癌細胞ばかりでなく
、正常組織、正常細胞にも影響を与え、如何に有効な薬
剤とはいえ、その副作用のために使用が著しく制限され
ているのが現状である。
免疫反応（抗原−抗体反応） １．ｔ、非常に特異性が
高いものであるが、従来のポリクローナル抗体ではいか
に吸収操作を繰り返しても、例えばリンパ球間のサブセ
ットのような、非常にマイナーな抗原決定基によって区
別されろものを認識することは困難であった。ミルステ
ィン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らによって開発されたモノク
ローナル抗体〔ケーラー、ジー、およびミルスティン、
シー、：ネーチャ（Ｋ″６ｈｌｅｒ、Ｇ、ａｎｄ Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，＋Ｎａｔｕｒｅ、） ２５Ｂ。
高いものであるが、従来のポリクローナル抗体ではいか
に吸収操作を繰り返しても、例えばリンパ球間のサブセ
ットのような、非常にマイナーな抗原決定基によって区
別されろものを認識することは困難であった。ミルステ
ィン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らによって開発されたモノク
ローナル抗体〔ケーラー、ジー、およびミルスティン、
シー、：ネーチャ（Ｋ″６ｈｌｅｒ、Ｇ、ａｎｄ Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，＋Ｎａｔｕｒｅ、） ２５Ｂ。
４９５ （＋９７５） ）は、この壁を打ち破るもの
であり、癌細胞上の癌特異抗原、あるいは癌関連抗原を
特異的に認識するモノクローナル抗体を得ろ乙とにより
、正常Ｓｆｌ織へのダメージを与えずに癌組織のみを特
異的に排除できろものと期待される。また、モノクロー
ナル抗体を用いた診断薬あるいは検査試薬は、正常血清
成分に対ずろ交叉反応がなく、感度良く、癌関連抗原、
癌特異抗原を検出できるものと思われろ。
であり、癌細胞上の癌特異抗原、あるいは癌関連抗原を
特異的に認識するモノクローナル抗体を得ろ乙とにより
、正常Ｓｆｌ織へのダメージを与えずに癌組織のみを特
異的に排除できろものと期待される。また、モノクロー
ナル抗体を用いた診断薬あるいは検査試薬は、正常血清
成分に対ずろ交叉反応がなく、感度良く、癌関連抗原、
癌特異抗原を検出できるものと思われろ。
本発明の目的は、特定の癌抗原に対して特異的に反応す
るモノクローナル抗体を提供する乙とにある。さらには
、上記特定層に対する抗原検出用試薬を提供することに
ある。
るモノクローナル抗体を提供する乙とにある。さらには
、上記特定層に対する抗原検出用試薬を提供することに
ある。
本発明は、胃痛、特に胃癌の細胞膜表作型抗原に対して
特異的に反応するモノクローナル抗体よりなるものであ
る。
特異的に反応するモノクローナル抗体よりなるものであ
る。
本発明のモノクローナル抗体は印環型胃癌由来細胞株（
ＫＡＴＯ−ＩＩＩ）を免疫原として作製されたハイブリ
ドーマの産生ずるモノクローナル抗体であって、以下の
特性を持つ３種である。
ＫＡＴＯ−ＩＩＩ）を免疫原として作製されたハイブリ
ドーマの産生ずるモノクローナル抗体であって、以下の
特性を持つ３種である。
すなわち、第１の種類は、
■ １ｇクラス（サブクラス）：ｒｇＧ１■ ・認識抗
原タイプ：細胞膜表作型抗原■ 癌細胞との反応性：肺
癌（ＰＣ−１） 、肺癌（ＰＣ−３） 、肺癌（ＰＣ−
９）、１ｌｉｌ′ｉ癌（ＰＣ−１０）、胃癌（ＫＡＴＯ
−Ｉ） 、膀胱癌（ＮＢＴ−２）、および喉頭癌（ＨＥ
ｐ＝２）に対して陽性を示すモノクローナル抗体であり
、第２の種類は、 ■ Ｉ ｇクラス（サブクラス）：ＩｇＧ３（２） 認
識抗原タイプ：細胞膜表作型抗原■ 癌細胞との反応性
：肺癌（、ＰＣ−１）、肺癌（ＰＣ−３）、肺１．％、
（ＰＣ−９）、肺癌（ＰＣ−１０，）、胃癌（ＫＡＴＯ
−１［） 、膀胱癌（ＮＢＴ−２）、および喉頭癌（Ｈ
Ｅｐ、−２）に対して陽性を示すモノクローナル抗体で
あり、及び第３の種類は、 ■ Ｉｇクラス（サブクラス）：ＩｇＡ■・ 認識抗原
タイプ：細胞膜表作型抗原。
原タイプ：細胞膜表作型抗原■ 癌細胞との反応性：肺
癌（ＰＣ−１） 、肺癌（ＰＣ−３） 、肺癌（ＰＣ−
９）、１ｌｉｌ′ｉ癌（ＰＣ−１０）、胃癌（ＫＡＴＯ
−Ｉ） 、膀胱癌（ＮＢＴ−２）、および喉頭癌（ＨＥ
ｐ＝２）に対して陽性を示すモノクローナル抗体であり
、第２の種類は、 ■ Ｉ ｇクラス（サブクラス）：ＩｇＧ３（２） 認
識抗原タイプ：細胞膜表作型抗原■ 癌細胞との反応性
：肺癌（、ＰＣ−１）、肺癌（ＰＣ−３）、肺１．％、
（ＰＣ−９）、肺癌（ＰＣ−１０，）、胃癌（ＫＡＴＯ
−１［） 、膀胱癌（ＮＢＴ−２）、および喉頭癌（Ｈ
Ｅｐ、−２）に対して陽性を示すモノクローナル抗体で
あり、及び第３の種類は、 ■ Ｉｇクラス（サブクラス）：ＩｇＡ■・ 認識抗原
タイプ：細胞膜表作型抗原。
■ 癌細胞との反応性；肺癌（ＰＣ−９１、食道癌（Ｔ
Ｅ−］）、食道癌（ＴＥ−２） 、食道癌（ＴＥ−３）
、胃癌（ＫＡＴＯ−１［） 、胃癌（ＭＫＮ−２８）
、胃癌（ＭＫＮ−４５）、および結腸１ｉ （ＣＯＬＯ
−２０１）に対して陽性を示すモノクローナル抗体であ
る。
Ｅ−］）、食道癌（ＴＥ−２） 、食道癌（ＴＥ−３）
、胃癌（ＫＡＴＯ−１［） 、胃癌（ＭＫＮ−２８）
、胃癌（ＭＫＮ−４５）、および結腸１ｉ （ＣＯＬＯ
−２０１）に対して陽性を示すモノクローナル抗体であ
る。
本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によ
って製造されろ。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融＆ 、＼イブリッドを形成させ、該ハイブ
リッドをクローン化し、上記癌細胞（即ち、上記特性を
有する特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずるク
ローンｒ！選択ずろことによって製造される。その操作
は、免疫用細胞として下記細胞を使用ずろ以外は、従来
既知の方法に準ずればよい。
って製造されろ。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融＆ 、＼イブリッドを形成させ、該ハイブ
リッドをクローン化し、上記癌細胞（即ち、上記特性を
有する特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずるク
ローンｒ！選択ずろことによって製造される。その操作
は、免疫用細胞として下記細胞を使用ずろ以外は、従来
既知の方法に準ずればよい。
抗体産生細胞は、例えば株化癌細胞より得られる抗原に
よって免疫されｔ二動物からの肺細胞、リンパ節細胞、
［３−’Ｊリンパ球ある。株化癌細胞としては、印環型
胃癌由来の株化癌細胞（ＫＡＴＯ−Ｍ）が例示されろ。
よって免疫されｔ二動物からの肺細胞、リンパ節細胞、
［３−’Ｊリンパ球ある。株化癌細胞としては、印環型
胃癌由来の株化癌細胞（ＫＡＴＯ−Ｍ）が例示されろ。
免疫されろ動物としては、ｔことえばマウス、うット、
馬、ヤギ、ウサギなどが例示される。
馬、ヤギ、ウサギなどが例示される。
抗体産生細胞は、例えば次のようにして製造されろ。即
ち、印環型胃癌由来細胞株（ＫＡＴＯ−■）を超音波処
理等で破壊し、遠心分離（例、１０、０００〜２０．０
ＯＯＧ 、 １０〜６０分）を行って細胞抽出液を得、
この上清を分子量１０万〜２００万の物質の分離が可能
なゲル濾過担体（例、セファデックス、セファクリル、
セファロース、バイオゲル等）を使用して分子篩し、高
分子画分と低分子画分とに分離する。かくして得られた
分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分は、例えば、
完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ Ｃｏｎ＋
ｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）と混和後、動物の免疫
用として使用する。
ち、印環型胃癌由来細胞株（ＫＡＴＯ−■）を超音波処
理等で破壊し、遠心分離（例、１０、０００〜２０．０
ＯＯＧ 、 １０〜６０分）を行って細胞抽出液を得、
この上清を分子量１０万〜２００万の物質の分離が可能
なゲル濾過担体（例、セファデックス、セファクリル、
セファロース、バイオゲル等）を使用して分子篩し、高
分子画分と低分子画分とに分離する。かくして得られた
分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分は、例えば、
完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ Ｃｏｎ＋
ｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）と混和後、動物の免疫
用として使用する。
免疫は動物の皮下、筋肉内或いは腹腔内に約１゜５ Ｘ
１０ｓ〜１０’ｃｅｌｌ相当分／回を注射することに
より行われ、初回免疫より約３〜５週間ごとに２度免疫
を行い、さらに１〜３ケ月後に最終免疫を行う。最終免
疫より約３〜５日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取
する。
１０ｓ〜１０’ｃｅｌｌ相当分／回を注射することに
より行われ、初回免疫より約３〜５週間ごとに２度免疫
を行い、さらに１〜３ケ月後に最終免疫を行う。最終免
疫より約３〜５日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取
する。
骨ｆｆＪ腫細胞としては、たとえば、マウス、ラッ１−
、ヒ１−等山来のものが使用される。抗体産生細胞と骨
髄肝細胞とは同種動物由来のものである乙とが好ましい
。
、ヒ１−等山来のものが使用される。抗体産生細胞と骨
髄肝細胞とは同種動物由来のものである乙とが好ましい
。
細胞融合は、例えばジー、ガルファ （Ｇ、Ｇａ１ｆｒ
ｅ）〔ネーチャ（Ｎａｔｕｒｅ） ２６６、５５０ （
１９７７） ）に記載の方法またはこれに準する方法に
よって行われる。この際、３０〜５０％ポリエチレング
リコール（平均分子量１． Ｇｏｏ〜４．０００）を用
いて３０〜４０℃の２Ｆａ度下、約１〜３分間程度反応
させることによって行われる。
ｅ）〔ネーチャ（Ｎａｔｕｒｅ） ２６６、５５０ （
１９７７） ）に記載の方法またはこれに準する方法に
よって行われる。この際、３０〜５０％ポリエチレング
リコール（平均分子量１． Ｇｏｏ〜４．０００）を用
いて３０〜４０℃の２Ｆａ度下、約１〜３分間程度反応
させることによって行われる。
細胞融合によって得られた細胞は目的とするモノクロー
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングに付され
る。すなオ〕ら、当該細胞を、例丸ばマイクロプレート
中で培養し、増殖の見られたウェルの培養土清中の抗体
価を、例えば酵素抗体法などによって測定し、適切な抗
体を産生じているウェルを得る。このようなウェルから
さらに例えば限界希釈法によってクローニングを行って
クローンを得る。このクローンは、例丸ばあらかしめプ
リスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移植
し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含
む腹水を採取し、検定する。選ばれたクローンの産生ず
るモノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリンの精製
法として従来既知の硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノ
ール分画法、陰イオン変換体を応用することで、容易に
達成すれる。
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングに付され
る。すなオ〕ら、当該細胞を、例丸ばマイクロプレート
中で培養し、増殖の見られたウェルの培養土清中の抗体
価を、例えば酵素抗体法などによって測定し、適切な抗
体を産生じているウェルを得る。このようなウェルから
さらに例えば限界希釈法によってクローニングを行って
クローンを得る。このクローンは、例丸ばあらかしめプ
リスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移植
し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含
む腹水を採取し、検定する。選ばれたクローンの産生ず
るモノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリンの精製
法として従来既知の硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノ
ール分画法、陰イオン変換体を応用することで、容易に
達成すれる。
本発明によって得られｔこモノクローナル抗体は、細胞
膜表作型抗原を認識し、かつ正常組織由来培養細胞、赤
血球、白血球及び正常組織とは反応せず、癌関連抗原、
癌特異抗原を認識するものと推定される。すなわち、本
発明のモノクローナル抗体は、癌の早期発見、予後の追
跡調査に有用な診断薬として、および腫瘍のイメージン
グあるいは制癌剤とコンジュゲートさせ、ターゲテイン
グ療法等への臨床応用が期待される。
膜表作型抗原を認識し、かつ正常組織由来培養細胞、赤
血球、白血球及び正常組織とは反応せず、癌関連抗原、
癌特異抗原を認識するものと推定される。すなわち、本
発明のモノクローナル抗体は、癌の早期発見、予後の追
跡調査に有用な診断薬として、および腫瘍のイメージン
グあるいは制癌剤とコンジュゲートさせ、ターゲテイン
グ療法等への臨床応用が期待される。
（１）免疫用癌関連抗原の調製：
株化胃癌細胞（ＫＡＴＯ−ＩＩ株）を超音波処理法で破
壊し、遠心分離（１５，０００Ｇ、 ３０分）を行い細
胞抽出液を得た。この上清をセファロース４Ｂのカラム
を用い、ゲル濾過し、高分子画分と低分子画分とに分離
した。
壊し、遠心分離（１５，０００Ｇ、 ３０分）を行い細
胞抽出液を得た。この上清をセファロース４Ｂのカラム
を用い、ゲル濾過し、高分子画分と低分子画分とに分離
した。
分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分を、完全フロ
インドアジュバントと混和後、マウスへ１ケ月毎に３回
免疫した。
インドアジュバントと混和後、マウスへ１ケ月毎に３回
免疫した。
最終免疫より４日後にマウス肺臓を取出し、以下の細胞
融合に用いた。
融合に用いた。
（２）細胞膜きおよびクローニング：
上記のマウス牌細胞と、マウスミエローマＰ３Ｕ１（カ
レント トビツク イン マイクロバイオロジー アン
ド イムノロジー（Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｅｒｏｂｉ
ｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ）、 ８ １ 、 １
（１９７８）） とを３；１の割合で混合し、ケー
ラー（Ｋ′６ｈｌｅｒ） らの方法〔イムノロジカル
メソッド（アカデミツク プレス）、ニューヨーク
（ｒｍｍｕｎｏｌｏｇｉｅａｌ Ｍｅｔｈｏｄ（Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ） 、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）
、 ３９１ 、 （１９７９）、〕を一部改変して
、４５％ポリエチレングリコール（平均分子ｉ４．ｏｏ
Ｏ）を用いて２分間反応させることにより細胞融合を行
った。
レント トビツク イン マイクロバイオロジー アン
ド イムノロジー（Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｅｒｏｂｉ
ｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ）、 ８ １ 、 １
（１９７８）） とを３；１の割合で混合し、ケー
ラー（Ｋ′６ｈｌｅｒ） らの方法〔イムノロジカル
メソッド（アカデミツク プレス）、ニューヨーク
（ｒｍｍｕｎｏｌｏｇｉｅａｌ Ｍｅｔｈｏｄ（Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ） 、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）
、 ３９１ 、 （１９７９）、〕を一部改変して
、４５％ポリエチレングリコール（平均分子ｉ４．ｏｏ
Ｏ）を用いて２分間反応させることにより細胞融合を行
った。
本細胞を９６ウエルマイクロプレー１・に植え込み、Ｈ
Ａ Ｔ培地（表１）で９〜１４日間培養後、ＨＴ培地（
表１）に移行し、更にフラスコ（２５ｃＩＩ＋）に培養
できるようになってからＤ−ＭＥＭ培養地（表１）で培
養した。増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を
酵素抗体法により測定し、適切なウェルから限界希釈法
により、求めるハイブリドーマのクローニングを行った
。
Ａ Ｔ培地（表１）で９〜１４日間培養後、ＨＴ培地（
表１）に移行し、更にフラスコ（２５ｃＩＩ＋）に培養
できるようになってからＤ−ＭＥＭ培養地（表１）で培
養した。増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を
酵素抗体法により測定し、適切なウェルから限界希釈法
により、求めるハイブリドーマのクローニングを行った
。
すなわち、マイクロタイタープレー１・にウェル当たり
２５．０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次に
Ｄ−ＭＥＭ培地で、１０．５．２．５．１個１０１＋ｎ
ｌとなるようにバイプリドーマを希釈し、これをマイク
ロタイタープレートに０．１ｍｔ’ずつ植え込み培養し
た。４日後にＤ−ＭＥＭ培地を０．１ｒｎｌ加え、以後
４〜７日に１度、培地の半量交換を行った。培養開始後
１０〜２０日で肉眼で認められるコロニーが形成され、
クローン株を得た。
２５．０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次に
Ｄ−ＭＥＭ培地で、１０．５．２．５．１個１０１＋ｎ
ｌとなるようにバイプリドーマを希釈し、これをマイク
ロタイタープレートに０．１ｍｔ’ずつ植え込み培養し
た。４日後にＤ−ＭＥＭ培地を０．１ｒｎｌ加え、以後
４〜７日に１度、培地の半量交換を行った。培養開始後
１０〜２０日で肉眼で認められるコロニーが形成され、
クローン株を得た。
（以下余白）
表１
（３） スクリーニング法：
得られたハイブリドーマについて目的とするモノクロー
ナル抗体を産生ずるクローンのスフＩＪ −ニングを次
のように行った。
ナル抗体を産生ずるクローンのスフＩＪ −ニングを次
のように行った。
（イ）方法の説明
以下のようにして酵素抗体法を行った。
抗原（各種株化癌細胞、部分精製癌関連抗原または正常
細胞）をコー！・シたマイクロプレートに検体を加え、
３７℃で１時間反応させ、洗浄後ベルオキンダーゼ標識
抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ＋Ｉ ｇＡ＋Ｉ ｇＭ
）ウサギ抗体を加え、さらに３７℃で１時間反応させた
。未反応の標識抗体を洗浄除去後、０−フェニレンジア
ミン液を加え、室温にて３０分間反応させた後、２Ｍ硫
酸を加えて反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定
した。
細胞）をコー！・シたマイクロプレートに検体を加え、
３７℃で１時間反応させ、洗浄後ベルオキンダーゼ標識
抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ＋Ｉ ｇＡ＋Ｉ ｇＭ
）ウサギ抗体を加え、さらに３７℃で１時間反応させた
。未反応の標識抗体を洗浄除去後、０−フェニレンジア
ミン液を加え、室温にて３０分間反応させた後、２Ｍ硫
酸を加えて反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定
した。
この方法で各種細胞との反応生を調べた。癌胎児性抗原
（ＣＥＡ）との交叉反応性は、ＣＥＡ感作血球を用いＰ
ＨＡ法で行った。
（ＣＥＡ）との交叉反応性は、ＣＥＡ感作血球を用いＰ
ＨＡ法で行った。
モノクローナル抗体がＫＡＴＯ−１の分泌物抗原か或い
は細胞膜表花型抗原のどちらを認識しているかの検討の
ために、ＫＡＴＯ−４１の培養上清でモノクローナル抗
体とＫＡＴＯ−１［細胞そのものとの反応性が阻害され
るかどうかを調べた。
は細胞膜表花型抗原のどちらを認識しているかの検討の
ために、ＫＡＴＯ−４１の培養上清でモノクローナル抗
体とＫＡＴＯ−１［細胞そのものとの反応性が阻害され
るかどうかを調べた。
酵素抗体法を用いたインヒピションテス！・の具体的な
方法は、以下の通りである。即ち、ハイブリドーマの培
養上清を酵素抗体法でタイトレージリンを行い、それよ
り判断して適当な希釈倍率を決める。次にＫＡＴＯ−Ｉ
培養上清を５〜２５培濃縮したものを原液として、１：
５，１： ５２１；５″希釈したものを適当に希
釈したハイプリドーマ培養上清にそれぞれ等承知え、１
時間、３７℃でインキュベーションする。そして、通電
の酵素抗体法（ｔａｒｇｅｔ： Ｋ Ａ Ｔ ０−１１
［）の系で７ツセイを行った。
方法は、以下の通りである。即ち、ハイブリドーマの培
養上清を酵素抗体法でタイトレージリンを行い、それよ
り判断して適当な希釈倍率を決める。次にＫＡＴＯ−Ｉ
培養上清を５〜２５培濃縮したものを原液として、１：
５，１： ５２１；５″希釈したものを適当に希
釈したハイプリドーマ培養上清にそれぞれ等承知え、１
時間、３７℃でインキュベーションする。そして、通電
の酵素抗体法（ｔａｒｇｅｔ： Ｋ Ａ Ｔ ０−１１
［）の系で７ツセイを行った。
（ロ）スクリーニングの流れ
１次スクリーニング：ターゲラ１−セル（ＫＡＴＯ−■
）および正常皮膚繊維芽細胞（ＣＣＤ、、−３Ｋ）を用
いた酵素抗体法で、ＫＡＴＯ−１［に対し゛Ｃ陽性でＣ
ＣＤ４５−５Ｋに対して陰性なウェルを選抜する。
）および正常皮膚繊維芽細胞（ＣＣＤ、、−３Ｋ）を用
いた酵素抗体法で、ＫＡＴＯ−１［に対し゛Ｃ陽性でＣ
ＣＤ４５−５Ｋに対して陰性なウェルを選抜する。
２次スクリーニング： １次スクリーニングで選抜され
た細胞株を２〜３回クローニングし、その培養上清を多
くの痛山来の株化細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ）や他の正
常組織由来細胞との反応性を検討するとともに、分泌型
或いは細胞膜表作型抗原のどちらを認識するかを、酵素
抗体法を用いたインヒビジョン テストで同定する。
た細胞株を２〜３回クローニングし、その培養上清を多
くの痛山来の株化細胞（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ）や他の正
常組織由来細胞との反応性を検討するとともに、分泌型
或いは細胞膜表作型抗原のどちらを認識するかを、酵素
抗体法を用いたインヒビジョン テストで同定する。
（４） モノクローナル抗体の回収、精製：（イ）上
記のスクリーニングによって得られたクローン株を予め
０．５ｍｔ’／匹ブリスタンを投与した４週令後のＢＡ
ＬＢ／Ｃマウス（雄）の腹腔内へ２ 、 Ｏ〜３ 、
ＯＸ １０７ｅｅｌｌ／匹移植し、１０〜１４日後にモ
ノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取した。
記のスクリーニングによって得られたクローン株を予め
０．５ｍｔ’／匹ブリスタンを投与した４週令後のＢＡ
ＬＢ／Ｃマウス（雄）の腹腔内へ２ 、 Ｏ〜３ 、
ＯＸ １０７ｅｅｌｌ／匹移植し、１０〜１４日後にモ
ノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取した。
この腹水に０．９％ＮａＣ１液を加丸５〜１０倍希釈し
た後、硫酸アンモニウムを４０％濃度となるように加え
、沈殿画分を分取した。この沈殿画分をなるへく少量の
０，９％ＮａＣ１液で溶解させた後、０．９％ＮａＣ１
液を外液として透析した。透析終了後、高速液体クロマ
トグラフィー（ＴＳＫ−Ｇｅｌｌ Ｇ−３０００５Ｗ
）を行い、免疫グロブリン画分を得、精製モアツクロー
ナル抗体とした。
た後、硫酸アンモニウムを４０％濃度となるように加え
、沈殿画分を分取した。この沈殿画分をなるへく少量の
０，９％ＮａＣ１液で溶解させた後、０．９％ＮａＣ１
液を外液として透析した。透析終了後、高速液体クロマ
トグラフィー（ＴＳＫ−Ｇｅｌｌ Ｇ−３０００５Ｗ
）を行い、免疫グロブリン画分を得、精製モアツクロー
ナル抗体とした。
（ロ）本りローン株は、ＢＳＡ含無血清培地中でも増殖
させろことができろ。すなわち、０．５％１３ＳＡ含無
血清培地（ＲＩＴＣ５５−９培地）中で増殖させ、培養
上清を集めた。この上清に硫酸アンモニウムを４０％濃
度となるように加え、沈殿両分を分取し、これに０．９
％ＮａＣ１液を加え、溶解させた後、さらに硫酸アンモ
ニウムを４０％濃度となるように加え沈殿画分を分取し
た。
させろことができろ。すなわち、０．５％１３ＳＡ含無
血清培地（ＲＩＴＣ５５−９培地）中で増殖させ、培養
上清を集めた。この上清に硫酸アンモニウムを４０％濃
度となるように加え、沈殿両分を分取し、これに０．９
％ＮａＣ１液を加え、溶解させた後、さらに硫酸アンモ
ニウムを４０％濃度となるように加え沈殿画分を分取し
た。
この沈殿画分をなるべく少量の０，９％ＮａＣ１液で溶
解させた後、０．０２Ｍ生理的リン酸緩衝液を外液とし
て透析した。透析終了後、この溶液をＤＥＡＥ−セルロ
ファインカラムに加え、カラムクロマトグラフィーを行
った。
解させた後、０．０２Ｍ生理的リン酸緩衝液を外液とし
て透析した。透析終了後、この溶液をＤＥＡＥ−セルロ
ファインカラムに加え、カラムクロマトグラフィーを行
った。
（５） モノクローナル抗体の特性：かくしてスクリ
ーニングされたクローンの産生ずるモノクローナル抗体
の性状は、表２および表３のとおりである。免疫グロブ
リンのクラスはオフタロニー法で検定しな。
ーニングされたクローンの産生ずるモノクローナル抗体
の性状は、表２および表３のとおりである。免疫グロブ
リンのクラスはオフタロニー法で検定しな。
なお、本発明で用いた酵素抗体法は、ケネッｌ、（Ｘｅ
ｎｎｅｔｔ ｌ らの方法〔モノクロナル アンチボデ
ィー（フレニウム プレス）ニューヨーク ロンドン、
３７Ｂ、 （１９８０） 〕に準じて細胞をそのま
ま利用ずろＥＬＩＳＡ法〔セルラー エンザイムリンク
ト イムノソルベント アッセイ （Ｃｅ ｌ Ｌｕ１
ｏｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏ
ｒｂｅｎｔ 八５ｓａｙ）以下、ＣＥＬ Ｉ ＳＡと略
す〕によった。
ｎｎｅｔｔ ｌ らの方法〔モノクロナル アンチボデ
ィー（フレニウム プレス）ニューヨーク ロンドン、
３７Ｂ、 （１９８０） 〕に準じて細胞をそのま
ま利用ずろＥＬＩＳＡ法〔セルラー エンザイムリンク
ト イムノソルベント アッセイ （Ｃｅ ｌ Ｌｕ１
ｏｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏ
ｒｂｅｎｔ 八５ｓａｙ）以下、ＣＥＬ Ｉ ＳＡと略
す〕によった。
（以下余白）
注、＊）
ＣＥＬＩＳＡ反応性は、十は反応陽性と判定される測定
検体の程度を示した。−は陰性を示した。
検体の程度を示した。−は陰性を示した。
ＣＥＬＩＳＡ法ニＰ、 １．ｆ ロＯＤ値は、−：０，
０５未満 十：０．１以上０．４未満 である。
０５未満 十：０．１以上０．４未満 である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）印環型胃癌由来細胞株（ＫＡＴＯ−III）を免疫
原として作製されたハイブリドーマの産生する、以下の
特性をもつモノクローナル抗体。 （１）Ｉｇクラス（サブクラス）：ＩｇＧ＿１（２）認
識抗原タイプ：細胞膜表在型抗原 （３）癌細胞との反応性：肺癌（ＰＣ−１）、肺癌（Ｐ
Ｃ−３）、肺癌（ＰＣ−９）、肺癌（ＰＣ−１０）、胃
癌（ＫＡＴＯ−III）、膀胱癌（ＮＢＴ−２）、および
喉頭癌（ＨＥｐ−２）に対して陽性を示す。 （２）印環型胃癌由来細胞株（ＫＡＴＯ−III）を免疫
原として作製されたハイブリドーマの産生する、以下の
特性をもつモノクローナル抗体。 （１）Ｉｇクラス（サブクラス）：ＩｇＧ＿３（２）認
識抗原タイプ：細胞膜表在型抗原 （３）癌細胞との反応性：肺癌（ＰＣ−１）、肺癌（Ｐ
Ｃ−３）、肺癌（ＰＣ−９）、肺癌（ＰＣ−１０）、胃
癌（ＫＡＴＯ−III）、膀胱癌（ＮＢＴ−２）、および
喉頭癌（ＨＥｐ−２）に対して陽性を示す。 （３）印環型胃癌由来細胞株（ＫＡＴＯ−III）を免疫
原として作製されたハイブリドーマの産生する、以下の
特性をもつモノクローナル抗体。 （１）Ｉｇクラス（サブクラス）：ＩｇＡ （２）認識抗原タイプ：細胞膜表在型抗原 （３）癌細胞との反応性：肺癌（ＰＣ−９）、食道癌（
ＴＥ−１）、食道癌（ＴＥ−２）、食道癌（ＴＥ−３）
、胃癌（ＫＡＴＯ−III）、胃癌（ＭＫＮ−２８）、胃
癌（ＭＫＮ−４５）、および結腸癌（ＣＯＬＯ−２０１
）に対して陽性を示す。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60261541A JPS62123200A (ja) | 1985-11-22 | 1985-11-22 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60261541A JPS62123200A (ja) | 1985-11-22 | 1985-11-22 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62123200A true JPS62123200A (ja) | 1987-06-04 |
Family
ID=17363328
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60261541A Pending JPS62123200A (ja) | 1985-11-22 | 1985-11-22 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62123200A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6321562A (ja) * | 1986-07-15 | 1988-01-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体ａｍｃ−４６２ |
-
1985
- 1985-11-22 JP JP60261541A patent/JPS62123200A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6321562A (ja) * | 1986-07-15 | 1988-01-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体ａｍｃ−４６２ |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0171083B1 (en) | Monoclonal antibody, process for preparing same, reagent for detecting cancer antigen containing the monoclonal antibody and process for preparing same | |
| EP0253646B1 (en) | Anti-human gastric cancer monoclonal antibody | |
| JPS62123200A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| JPS6143200A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| EP0428485A1 (en) | Novel antiidiotypic monoclonal antibodies | |
| SUGIYAMA et al. | Preparation of human monoclonal antibodies of IgG type to gastro-intestinal cancer-associated antigen | |
| JPS61167699A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| JPS6233199A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| JPS61183300A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| JPS61250000A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| JPH0421479B2 (ja) | ||
| JPS63179895A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| JPS6236397A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| JPS61249999A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| JPS6236398A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| JPS6245599A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| JPS6279793A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| JPH0379994B2 (ja) | ||
| JPS63157995A (ja) | 抗ヒト大腸癌単クロ−ン性抗体ａｃｃ−５７４ | |
| JPS6253930A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| KR100330311B1 (ko) | 인체에스-100에이6단백질에대한단일클론항체,하이브리도마세포주및그의제조방법 | |
| JPS60243026A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| Fujii et al. | Characterization of a murine monoclonal antibody, 5D-4, reacting with pancreatic cancers and islets of Langerhans | |
| JPH0356425A (ja) | 制癌性組成物 | |
| JPS63243097A (ja) | モノクロ−ナル抗体 |