JPH0379994B2 - - Google Patents
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- JPH0379994B2 JPH0379994B2 JP61143483A JP14348386A JPH0379994B2 JP H0379994 B2 JPH0379994 B2 JP H0379994B2 JP 61143483 A JP61143483 A JP 61143483A JP 14348386 A JP14348386 A JP 14348386A JP H0379994 B2 JPH0379994 B2 JP H0379994B2
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は単クローン性抗体に関し、更に詳細に
は癌マーカーの一つである１−メチルアデノシン
に対する単クローン性抗体に関する。 〔従来の技術及びその問題点〕 近年癌関連抗原に対する単クローン性抗体を用
いた臨床検査診断が盛んに実施されてきている。
また、癌になると増加することが知られている物
質である癌胎児性抗原（CEA）、α−フエトプロ
テンなどに対する抗体を用いて同様なことが行わ
れている。 ところで癌になると増加する物質、すなわち腫
瘍マーカーと呼ばれている物質の一つとして１−
メチルアデノシン（以下「m1Ado」と略称する
ことがある）が知られており、この物質は更に、
マウスのリステリア（Listeria）菌感染を促進す
る作用、すなわち免疫抑制作用を有することも判
明している。そしてこのことはm1Adoが末期癌
患者のおちいりやすい日和見感染の原因の一つで
あることを示唆しており、この分析は臨床的に有
用である。 従来m1Adoの定量は、高速液体クロマトグラ
フイー（HPLC）でおこなわれるため、サンプル
の前処理等が煩雑であり、多検体を測定するには
非常に長時間を要するという欠点があつた。 〔問題を解決するための手段〕 本発明者らは、簡便なm1Adoの測定法を開発
すべく、種々検討をおこなつた結果、m1Adoに
対する単クローン性抗体を新たに作製し、これを
用いることにより、サンプルの前処理操作を行う
ことなくELISA法を応用した多検体同時測定方
法を実施することができ、測定の迅速化、簡素化
がはかれることを見出した。 したがつて、本発明は、進行癌のマーカーであ
るm1Adoに対する単クローン性抗体及びこれを
用いるm1Ado測定方法を提供するものである。 本発明のm1Adoに対する単クローン性抗体は、
例えば次の如くして調製される。 すなわち、まず、m1Adoを用いて動物を免疫
し、その動物の脾細胞を採取する。この工程にお
いて、m1Adoはそれ単独では免疫原となり得な
いので、適当なキヤリア・プロテイン（Carrier
Protein）と結合させたのち、免疫原として用い
る。m1Adoとしては、例えばアデノシンをヨウ
化メチレン（CH3I）によりメチル化することに
より合成したもの、あるいはシグマ（Sigma）社
から販売されている標品を用いることができ、キ
ヤリア・プロテインとしては、ハプテンとなる物
質を免疫担当細胞が認識することを可能にする目
的に用いられるプロテイン、例えばキーホール・
リンペツト・ヘモシアニン、牛血清アルブミン等
を用いることができる。また、このm1Adoとキ
ヤリア・プロテインを結合する方法としては、例
えば核酸塩基の糖部分を過ヨウ素酸で酸化したの
ちにキヤリア・プロテインを結合させる等の方法
が挙げられる。更に、免疫動物としては、マウ
ス、ラツト等が挙げられる。 次に得られた免疫動物の脾細胞を骨髄腫細胞と
融合し、ハイブリドーマを得る。細胞融合におい
ては、公知のポリエチレングリコールを用いる方
法及びウイルスを用いる方法のいずれを用いても
良いが、ハイブリドーマのスクリーニングに当つ
ては、キヤリア・プロテインに対する抗体産生ハ
イブリドーマを除去するための留意が必要であ
る。このためには、免疫に用いたキヤリア・プロ
テインと異なつた種由来のプロテインをm1Ado
に結合させたものを抗原として用い、スクリーニ
ングを行なう等の方法を用いることが望ましい。 斯くして得られるハイブリドーマから産生され
る、本発明の単クローン性抗体は、次に示す如き
性質を有する。 (1) 抗体のクラス：IgG2b (2) 抗 体 価：64〜128倍 (3) 交差反応性：m1Ado及びm1Ade（１−メチル
アデニン、m1Adoの塩基部分）骨格を有する
化合物と99〜100％の交差反応性を有し、他の
ヌクレオシド、塩基等とは反応しない。 叙上の如くして得られた単クローン性抗体を用い
てm1Ado測定するには、次の如くすれば良い。 すなわち、96ウエルプレートに、m1Adoと牛
血清アルブミン（BSA）の結合物を0.2μｇ／穴
で添加したのち４℃で、12〜24hr放置する。次に
各ウエルに１％BSAを含むリン酸緩衝生理食塩
水（PBS）を100μずつ添加することにより、
抗体その他のタンパクを非特異的吸着を防止す
る。次に試料（尿など）を各ウエルに50μ添加
しさらに、m1Adoに対する単クローン性抗体
（20倍希釈液）を各ウエルに50μ添加する。よ
くかくはんしたのちに、４℃で１時間放置する。
反応混合物をPBSでよく洗浄したのちに、アル
カリホスフアターゼ標識ヤギ抗マウスIgG抗体の
1000倍希釈液を各ウエルに100μずつ添加する。
室温で30分間反応させたのちに、PBSでよく洗
い、水分を切つたのちに基質溶液（パラニトロフ
エニルフオスフエート１mg／ml、PH9.8ジエタノ
ールアミンバツフアー）を100μずつ加え37℃
で30分間反応させる。各ウエルの405nｍにおけ
る吸光度をEIAリーダーで測定することにより試
料中に存在するm1Ado量の定量を行なう。 〔本発明の効果〕 以上のように本発明の単クローン性抗体を用い
れば、試料の前処理をおこなうことなくｍ1Ado
の測定をおこなうことができ、しかもHPLCの如
き大がかりな装置も必要としないので、簡便かつ
迅速に進行癌の有無を判定することができる。 〔実施例〕 次に実施例を挙げ、本発明を説明する。 実施例 １ (1) 免疫原の調製：アデノシンをヨウ化メチレン
（CH3I）でメチル化することにより合成した
m1Adoと、キヤリア・プロテインであるキー
ホール・リンペツトヘモシアニン（Keyhole
lympet hemocyanine；KLH）をエルランガ
ー（Erlanger）とビーザー（Bieser）の方法
（過ヨウ素酸酸化法）により結合した。すなわ
ちm1Adoを過ヨウ素酸で酸化し、過剰の過ヨ
ウ素酸をエチレングリコールで分解したのち、
アルカリ性（PH９〜9.5）条件下でKLHと結合
させ、シツフ塩基を形成させる。ついで
NaBH4で還元し、安定化合物を生成させる。
この反応混合物を緩衝液（リン酸緩衝生理食塩
水PH7.4）中で一晩透析し、未反応のm1Adoを
除き、このあと凍結乾燥に付し−20℃の冷凍庫
中に保存した。 (2) 単クローン性抗体の作製： () (1)で得たm1AdoとKLH結合物を、フロ
イントの完全アジユバント（Freund's
Complete Adjuvant）と等量混合し、エマ
ルジヨンとしたのち、BALB／ｃマウスの
腹腔内に一匹当り50μｇ投与した。２回目以
降は不完全アジユバント（incomplete
adjuvant）を用いたエマルジヨンを、10日
間隔で２回腹腔内に投与した。最終免疫は
m1Ado‐KLH100μｇ／ml溶液を0.2ml静脈内
投与した。 () 最終免疫の３日後に過免疫マウスから摘
出した脾細胞（5.9×107個）とBALB／ｃマ
ウス由来ミエローマ細胞株SP2／０−Ag14
（1.6×107個）をポリエチレングリコール
（PEG）4000を用いて融合した。細胞は96穴
プレートに100μ／穴ずつ加え、24時間後
に培地の半量をハツト（HAT）培地に交換
し２日おきに培地交換した。７〜10日後にハ
ツト耐性のハイブリドーマの成長がみられて
くる（384ウエル中、289）。この時期に培地
をHTに変え、約10日間培養したのちにハイ
ブリドーマ生育培地に変えた。 () 抗体産生細胞のスクリーニングはm1Ado
と牛血清アルブミン（BSA）を結合させた
ものを抗原として用い２抗体エライザ
（ELISA）法により行つた。この方法により
最も憂慮されるキヤリア・プロテインに対す
る抗体を産生するハイブリドーマの除外に成
功した。次にm1Adoによる阻害がかかるか
否かを検討することによりm1Adoと特異的
に反応する単クローン性抗体を産生するハイ
ブリドーマを選択した。ここで選択された細
胞株を限界希釈法によりクローン化し単クロ
ーン性抗体産生ハイブリドーマクローン（３
株）を樹立した。 (3) 単クローン性抗体の性質：m1Adoに対する
単クローン性抗体は３種得られ抗体のクラスは
いずれもIgG2bであつた。抗体価は64〜128（培
養上清を２段階希釈し、それぞれとm1Ado−
BSAを反応させるELISAを行つた時、最も高
い吸光度の持続する希釈倍率を抗体価とした）
であつた。交差反応性を検討したところ、
m1Adoおよびm1Adeの骨格をもつ化合物で99
〜100％の交差反応性を示したが他のヌクレオ
シド、塩基等とは反応しなかつた。この結果よ
りこの単クローン性抗体の認識するエピトープ
は、m1Adoの塩基部分であると判断された。 実施例 ２ m1Adoの10、５、１、0.5及び0.1μｇ／ml溶液
をあらかじめm1Ado−BSA0.2μｇ／ウエルでコ
ートされた96ウエルプレートに50μずつ加え、
更に実施例１で得た単クローン性抗体の20倍希釈
液を50μずつ加えて競合阻害試験をおこなつ
た。この結果、第１図に示すように添加した
m1Adoの量に比例して抗体とm1Ado−BSAの結
合が阻害されることが明らかとなつた。 実施例 ３ 実施例２のm1Ado溶液に代えて試料として正
常人及び癌患者の尿を用い、同様に競合阻害試験
をおこなつた。実施例２の結果から得た検量線を
用い、試料中のm1Ado量を測定した。 この結果を下表に示す。
は癌マーカーの一つである１−メチルアデノシン
に対する単クローン性抗体に関する。 〔従来の技術及びその問題点〕 近年癌関連抗原に対する単クローン性抗体を用
いた臨床検査診断が盛んに実施されてきている。
また、癌になると増加することが知られている物
質である癌胎児性抗原（CEA）、α−フエトプロ
テンなどに対する抗体を用いて同様なことが行わ
れている。 ところで癌になると増加する物質、すなわち腫
瘍マーカーと呼ばれている物質の一つとして１−
メチルアデノシン（以下「m1Ado」と略称する
ことがある）が知られており、この物質は更に、
マウスのリステリア（Listeria）菌感染を促進す
る作用、すなわち免疫抑制作用を有することも判
明している。そしてこのことはm1Adoが末期癌
患者のおちいりやすい日和見感染の原因の一つで
あることを示唆しており、この分析は臨床的に有
用である。 従来m1Adoの定量は、高速液体クロマトグラ
フイー（HPLC）でおこなわれるため、サンプル
の前処理等が煩雑であり、多検体を測定するには
非常に長時間を要するという欠点があつた。 〔問題を解決するための手段〕 本発明者らは、簡便なm1Adoの測定法を開発
すべく、種々検討をおこなつた結果、m1Adoに
対する単クローン性抗体を新たに作製し、これを
用いることにより、サンプルの前処理操作を行う
ことなくELISA法を応用した多検体同時測定方
法を実施することができ、測定の迅速化、簡素化
がはかれることを見出した。 したがつて、本発明は、進行癌のマーカーであ
るm1Adoに対する単クローン性抗体及びこれを
用いるm1Ado測定方法を提供するものである。 本発明のm1Adoに対する単クローン性抗体は、
例えば次の如くして調製される。 すなわち、まず、m1Adoを用いて動物を免疫
し、その動物の脾細胞を採取する。この工程にお
いて、m1Adoはそれ単独では免疫原となり得な
いので、適当なキヤリア・プロテイン（Carrier
Protein）と結合させたのち、免疫原として用い
る。m1Adoとしては、例えばアデノシンをヨウ
化メチレン（CH3I）によりメチル化することに
より合成したもの、あるいはシグマ（Sigma）社
から販売されている標品を用いることができ、キ
ヤリア・プロテインとしては、ハプテンとなる物
質を免疫担当細胞が認識することを可能にする目
的に用いられるプロテイン、例えばキーホール・
リンペツト・ヘモシアニン、牛血清アルブミン等
を用いることができる。また、このm1Adoとキ
ヤリア・プロテインを結合する方法としては、例
えば核酸塩基の糖部分を過ヨウ素酸で酸化したの
ちにキヤリア・プロテインを結合させる等の方法
が挙げられる。更に、免疫動物としては、マウ
ス、ラツト等が挙げられる。 次に得られた免疫動物の脾細胞を骨髄腫細胞と
融合し、ハイブリドーマを得る。細胞融合におい
ては、公知のポリエチレングリコールを用いる方
法及びウイルスを用いる方法のいずれを用いても
良いが、ハイブリドーマのスクリーニングに当つ
ては、キヤリア・プロテインに対する抗体産生ハ
イブリドーマを除去するための留意が必要であ
る。このためには、免疫に用いたキヤリア・プロ
テインと異なつた種由来のプロテインをm1Ado
に結合させたものを抗原として用い、スクリーニ
ングを行なう等の方法を用いることが望ましい。 斯くして得られるハイブリドーマから産生され
る、本発明の単クローン性抗体は、次に示す如き
性質を有する。 (1) 抗体のクラス：IgG2b (2) 抗 体 価：64〜128倍 (3) 交差反応性：m1Ado及びm1Ade（１−メチル
アデニン、m1Adoの塩基部分）骨格を有する
化合物と99〜100％の交差反応性を有し、他の
ヌクレオシド、塩基等とは反応しない。 叙上の如くして得られた単クローン性抗体を用い
てm1Ado測定するには、次の如くすれば良い。 すなわち、96ウエルプレートに、m1Adoと牛
血清アルブミン（BSA）の結合物を0.2μｇ／穴
で添加したのち４℃で、12〜24hr放置する。次に
各ウエルに１％BSAを含むリン酸緩衝生理食塩
水（PBS）を100μずつ添加することにより、
抗体その他のタンパクを非特異的吸着を防止す
る。次に試料（尿など）を各ウエルに50μ添加
しさらに、m1Adoに対する単クローン性抗体
（20倍希釈液）を各ウエルに50μ添加する。よ
くかくはんしたのちに、４℃で１時間放置する。
反応混合物をPBSでよく洗浄したのちに、アル
カリホスフアターゼ標識ヤギ抗マウスIgG抗体の
1000倍希釈液を各ウエルに100μずつ添加する。
室温で30分間反応させたのちに、PBSでよく洗
い、水分を切つたのちに基質溶液（パラニトロフ
エニルフオスフエート１mg／ml、PH9.8ジエタノ
ールアミンバツフアー）を100μずつ加え37℃
で30分間反応させる。各ウエルの405nｍにおけ
る吸光度をEIAリーダーで測定することにより試
料中に存在するm1Ado量の定量を行なう。 〔本発明の効果〕 以上のように本発明の単クローン性抗体を用い
れば、試料の前処理をおこなうことなくｍ1Ado
の測定をおこなうことができ、しかもHPLCの如
き大がかりな装置も必要としないので、簡便かつ
迅速に進行癌の有無を判定することができる。 〔実施例〕 次に実施例を挙げ、本発明を説明する。 実施例 １ (1) 免疫原の調製：アデノシンをヨウ化メチレン
（CH3I）でメチル化することにより合成した
m1Adoと、キヤリア・プロテインであるキー
ホール・リンペツトヘモシアニン（Keyhole
lympet hemocyanine；KLH）をエルランガ
ー（Erlanger）とビーザー（Bieser）の方法
（過ヨウ素酸酸化法）により結合した。すなわ
ちm1Adoを過ヨウ素酸で酸化し、過剰の過ヨ
ウ素酸をエチレングリコールで分解したのち、
アルカリ性（PH９〜9.5）条件下でKLHと結合
させ、シツフ塩基を形成させる。ついで
NaBH4で還元し、安定化合物を生成させる。
この反応混合物を緩衝液（リン酸緩衝生理食塩
水PH7.4）中で一晩透析し、未反応のm1Adoを
除き、このあと凍結乾燥に付し−20℃の冷凍庫
中に保存した。 (2) 単クローン性抗体の作製： () (1)で得たm1AdoとKLH結合物を、フロ
イントの完全アジユバント（Freund's
Complete Adjuvant）と等量混合し、エマ
ルジヨンとしたのち、BALB／ｃマウスの
腹腔内に一匹当り50μｇ投与した。２回目以
降は不完全アジユバント（incomplete
adjuvant）を用いたエマルジヨンを、10日
間隔で２回腹腔内に投与した。最終免疫は
m1Ado‐KLH100μｇ／ml溶液を0.2ml静脈内
投与した。 () 最終免疫の３日後に過免疫マウスから摘
出した脾細胞（5.9×107個）とBALB／ｃマ
ウス由来ミエローマ細胞株SP2／０−Ag14
（1.6×107個）をポリエチレングリコール
（PEG）4000を用いて融合した。細胞は96穴
プレートに100μ／穴ずつ加え、24時間後
に培地の半量をハツト（HAT）培地に交換
し２日おきに培地交換した。７〜10日後にハ
ツト耐性のハイブリドーマの成長がみられて
くる（384ウエル中、289）。この時期に培地
をHTに変え、約10日間培養したのちにハイ
ブリドーマ生育培地に変えた。 () 抗体産生細胞のスクリーニングはm1Ado
と牛血清アルブミン（BSA）を結合させた
ものを抗原として用い２抗体エライザ
（ELISA）法により行つた。この方法により
最も憂慮されるキヤリア・プロテインに対す
る抗体を産生するハイブリドーマの除外に成
功した。次にm1Adoによる阻害がかかるか
否かを検討することによりm1Adoと特異的
に反応する単クローン性抗体を産生するハイ
ブリドーマを選択した。ここで選択された細
胞株を限界希釈法によりクローン化し単クロ
ーン性抗体産生ハイブリドーマクローン（３
株）を樹立した。 (3) 単クローン性抗体の性質：m1Adoに対する
単クローン性抗体は３種得られ抗体のクラスは
いずれもIgG2bであつた。抗体価は64〜128（培
養上清を２段階希釈し、それぞれとm1Ado−
BSAを反応させるELISAを行つた時、最も高
い吸光度の持続する希釈倍率を抗体価とした）
であつた。交差反応性を検討したところ、
m1Adoおよびm1Adeの骨格をもつ化合物で99
〜100％の交差反応性を示したが他のヌクレオ
シド、塩基等とは反応しなかつた。この結果よ
りこの単クローン性抗体の認識するエピトープ
は、m1Adoの塩基部分であると判断された。 実施例 ２ m1Adoの10、５、１、0.5及び0.1μｇ／ml溶液
をあらかじめm1Ado−BSA0.2μｇ／ウエルでコ
ートされた96ウエルプレートに50μずつ加え、
更に実施例１で得た単クローン性抗体の20倍希釈
液を50μずつ加えて競合阻害試験をおこなつ
た。この結果、第１図に示すように添加した
m1Adoの量に比例して抗体とm1Ado−BSAの結
合が阻害されることが明らかとなつた。 実施例 ３ 実施例２のm1Ado溶液に代えて試料として正
常人及び癌患者の尿を用い、同様に競合阻害試験
をおこなつた。実施例２の結果から得た検量線を
用い、試料中のm1Ado量を測定した。 この結果を下表に示す。
【表】
第１図はm1Adoの用量と405nｍの吸光度の関
係を示す図面である。
係を示す図面である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ １−メチルアデノシンに対する単クローン性
抗体。 ２ 次の性質、 (1) 抗体のクラス：IgG2b (2) 抗 体 価：64〜128倍 (3) 交差反応性：m1Ado及びm1Ade骨格を有す
る化合物と99〜100％の交差反応性を有し、他
のヌクレオシド、塩基等とは反応しない。 を有する特許請求の範囲第１項記載の単クローン
性抗体。 ３ 被検体に１−メチルアデノシンに対する単ク
ローン性抗体を加え、生じた１−メチルアデノシ
ン−単クローン性抗体複合物量を測定することを
特徴とする１−メチルアデノシンの測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61143483A JPS62299766A (ja) | 1986-06-19 | 1986-06-19 | 単クロ−ン性抗体及びこれを用いる１−メチルアデノシンの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61143483A JPS62299766A (ja) | 1986-06-19 | 1986-06-19 | 単クロ−ン性抗体及びこれを用いる１−メチルアデノシンの測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62299766A JPS62299766A (ja) | 1987-12-26 |
| JPH0379994B2 true JPH0379994B2 (ja) | 1991-12-20 |
Family
ID=15339751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61143483A Granted JPS62299766A (ja) | 1986-06-19 | 1986-06-19 | 単クロ−ン性抗体及びこれを用いる１−メチルアデノシンの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62299766A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU5178090A (en) * | 1989-03-09 | 1990-10-09 | Sendai Institute of Microbiology, The | Monoclonal antibody, and assay method, reagent kit, search method and drug missile using said antibody |
| JP5916058B2 (ja) * | 2011-08-26 | 2016-05-11 | 国立大学法人東北大学 | 細胞ストレス状態のバイオマーカー |
| CN107075505A (zh) * | 2014-09-29 | 2017-08-18 | 富士瑞必欧株式会社 | 含有修饰核酸碱基的靶核酸的测定方法及试剂盒 |
-
1986
- 1986-06-19 JP JP61143483A patent/JPS62299766A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62299766A (ja) | 1987-12-26 |
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