JPS62299766A - 単クロ−ン性抗体及びこれを用いる１−メチルアデノシンの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は患クローン性抗体に関し、更に詳細には癌マー
カーの一つであるｌ−メチルアデノシンに対する単クロ
ーン性抗体に関する。

〔従来の技術及びその問題点〕

近年帰関連抗原に対する単クローン性抗体を用いた臨床
検査診断が盛んに実施されてさている。また、癌になる
と増加することが知られている物質である癌胎児性抗原
（ＣＦＡ）、α−フェトゾロテンなどに対する抗体を用
いて同様なことが行われている。

ところで癌になると増加する物質、すなわチ腫瘍マーカ
ーと呼ばれている物質の一つとしてｌ−メチルアデノシ
ン（以下ｒ　ｍ”Ａｄｏ　Ｊと略称することがある）が
知られており、この物質は更に、マウスのりステビア（
Ｌｉｓｔｅｖｉａ）菌感染を促進する作用、すなわち免
疫抑制作用を有することも判明している。そしてこのこ
とはｍ’Ａｄｏが末期癌患者のおちいりやすい日和見感
染の原因の一つであることを示唆しており、この分析は
臨床的に有用である。

従来ｒｎ’Ａｄｏの定量は、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＩｆ：　）でおこなわれるため、サンゾルの前
処理等が煩雑であり、多検体を測定するには非常に長時
間を要するという欠点があった。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者らは、簡便なｍ’　Ａｄｏの測定法全開発すべ
く、種々検討をおこなった結果、ｍ’Ａｄ。

Ｋ対する単クローン性抗体を新たに作製し、これを用い
ることにより、サンプルの前処理操作を行うことなく　
ＥＬＩＳＡ法を応用した多検体同時測定方法を実施する
ことができ、測定の迅速化、簡素化がはかれることを見
出した。

したがって、本発明は、進行病のマーカーであるｍ”Ａ
ｄｏに対する単クローン性抗体及びこれを用いる”１Ａ
ｄｏ測定方法を提供するものである。

本発明のｍ’Ａｄｏに対する単クローン性抗体は、例え
ば次の如くして調製きれる。

すなわち、まずｓ　ｍ’Ａｄｏ　ｋ用いて動物を免疫し
、その動物の牌細胞を採取する。この工程において、ｍ
１Ａｄｏはそれ単独では免疫原となり得ないので、適当
なキャリア・ゾロテイ７　（Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ　）と結合てせたのち、免疫原として用いる。ｍ
１Ａｄｏとしては１例えばアデノシンをヨウ化メチレン
（ＣＨ３Ｉ　）によりメチル化することにより合成した
もの、あるいはシグマ（Ｓｉｇｍａ）社から販売されて
いる標品を用いることができ、キャリア・プロティンと
しては、ハプテンとなる物質を免疫担当細胞が認識する
ことを可能にする目的に用いられるゾロナイン、例えば
キーホール・リンペット・ヘモシアニン、牛血清アルブ
ミン等を用いることができる。また、このｍ’　Ａｄｏ
　とキャリア・プロティンを結合する方法としては、例
えば核酸塩基の棚部分を過ヨウ素酸で酸化したのちにキ
ャリア・プロティンと結合はせる等の方法が挙げられる
。更に、免疫動物としては、マウス、ラット等が挙げら
れる。

次に得られた免疫動物の牌細胞を骨髄種細胞と融合し、
ハイプリドーマを得る。細胞融合においては、公知の？
リエチレングリコールを用いる方法及びウィルスを用い
る方法のいずれを用いても良いが、ハイプリドーマのス
クリーニングに当っては、キャリア・プロティンに対す
る抗体産生ハイプリドーマ全除去するための留意が必要
である。このためには、免疫に用いたキャリア・ゾロテ
ィンと異なった種由来のゾロナインｋ　ｍ’Ａｄｏに結
合きせたものを抗原として用い、スクリーニングを行な
う等の方法を用いることが望ましい。

斯くして得られるハイプリドーマから産生される、本発
明の単クローン性抗体は、次に示す如き性質を有する０ （１）　　抗体のクラス：　　　ＩｇＧ２ｂシ）　抗　
体　価二　　６４〜１２８倍０）交差反応性： ｍ’Ａｄｏ及びｒｎ１Ａｄｅ骨格を有する化合物と９９
〜１００％の交差反応性を 有し、他のヌクレオシド、塩基等 とは反応しない。

狭止の如くシて得られた凰りローン性抗体金用いてｍ’
Ａｄｏ測定するには、次の如くすれば良い。

すなわち、９６ウエルゾレートに、ｍ”Ａｄ。

と牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の結合物を２μ２／穴で
添加したのち４℃で、１２〜２４　ｈｒ放装する。次に
各ウェルに１％ＢＳＡ　ｋ含むリン酸緩衝生理食塩水（
ＰＢＳ　）　ｆｆｉ　１００μｌずつ添加することによ
り、抗体その他のタンノ♀りの非特異的吸着を防止する
０次に試料（尿など）を谷ウェルに５０μｌ添加しさら
に、ｍ”Ａｄｏに対する単クローン性抗体（２０倍希釈
液）を各ウェルに５０μｇ添加する。よくかくはんした
のちに、４℃で１時間放置する。反応混合物をＰＢＳで
よく洗浄したのちに、アルカリホスファターゼ標識ヤギ
抗マウスＩｇＧ抗体のｉ　ｏｏ。

倍希釈ａ’ｉ各ウェルに１００μｇずつ添加する。

室温で３０分間反応式せたのちに、ＰＢＳでよく洗い、
水分を切ったのちに基質溶液（、Ｑラニトロフェニルフ
オスフエート１１９／ｍｌｓ　ｐＨ９，８ジエタノール
了ミンバツフアー）ｔ−１００μＥずつ加え３７℃で３
０分間反応場せる。各ウェルの４０５　ｎｍにおける吸
光度’！ｒ　ＥＩＡ　ＩＪ−グーで測定することにより
試料中に存在するｍ’Ａｄｏ量の定量を行なう。

〔本発明の効果〕

以上のように本発明の単クローン性抗体を用いれば、試
料の前処理をおこなうことなくｍ　ＩＭｏの測定をおこ
なうことができ、しかもｆ−１ＰＬｃの如き大がかりな
装ｄも必要としないので、簡便かつ迅速に進行癌の有無
を判定することができる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げ、本発明を説明する。

実施例１゜ （１）　　免疫原の調製： アデノシンをヨウ化メチレン（ＣＨａＩ）でメチル化す
ることにより合成したｍ１Ａｄｏと、キャリア・プロテ
ィンであるキーホール・リンベット−ヘモシアニン（Ｋ
ｅｙｈｏｌｅ　ｌｙｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ
；ＫＬＨ）’ｔ　−ｃ　ルランガ−（ｇｒｌａｎｇｅｒ
　）とビーザー（Ｂｉ　ｅｓｅｒ　）の方法（過ヨウ素
酸酸化法）、により結合した。すなわちｍ”Ａｄｏを過
ヨウ素酸で酸化し、過剰の過ヨウ素酸？エチレングリコ
ールで分解したのち、アルカリ性（ｐＨ９〜９．５９条
件下でＫＬＦ（と結合きせ、シッフ塩基を形成させる。

ついでＮａＢＨ４で還元し、安定化合換金生成させる。

この反応混合物を緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７
，４）中で一晩透析し、未反応のｍ’Ａｄｏを除き、こ
のあと凍結乾燥に付し一２０℃の冷凍庫中に保存した。

（２）　　単クローン性抗体の作表： （１）　　（１）で得たｍ’ＡｄｏとＫＬＨ結合物を、
フロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’＋　Ｃ
ｏｍｐｌｅｔｅＡｄｊｕｖａｎｔ　）と等量混合し、エ
マルションとしたのち、　　ＢＡＬＢ／（！マウスの腹
胚内に一匹当り５０μ？投与した。２回目以降は不完全
アジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎ
ｔ　）　ｋ用いたエマルションを、１０日間隔で２回腹
腔内に投与した。最終免疫はｍ’Ａｄｏ　−ＫＬ）１１
００　μｓ’／ｍｌ　１ｇ液を０．２　ｒｎｔ静脈内投
与した。

（ＩＩ）　　最終免疫の３日後に過免疫マウスから摘出
した牌細胞とＢＡＬＢ／ｃマウス由来ミエローマ細胞株
ＳＰ　２１０−Ａｇ　１４を？リエチレングリコール（
ＰＥＧ）４０００’に用いて融合した。細胞は９６穴プ
レートに１００μ！／穴ずつ加え、２４時間後に培地の
半量をハツト（ＨＡＴ）培地に交換し２日おきに培地交
換した。７〜ｌＯ日後にハツト耐性のハイプリドーマの
成長がみられてぐる。この時期に培地ｋＨＴＶｃ変え、
約ｌＯ日間培養したのちにハイブリドーマ生育培地に変
えた。

（ｌｌｌ）抗体産生細胞のスクリーニングはｍ”　Ａｄ
。

と牛血清アルブミン（ＢＳＡ）ｔ−結合式せたものを抗
原として用い２抗体エライザ（ＥＬＩＳＡ）法により行
った。この方法により最も憂慮されるキャリア・プロテ
ィンに対する抗体を産生ずるハイプリドーマの除外に成
功した。次ＫｍｌＡｄｏによる阻害がかかるか否かを検
討することによりｍ１Ａｄｏと特異的に反応する単クロ
ーン性抗体を産生ずるハイプリドーマを選択シた。ここ
で選択された細胞株に限界希釈法によりクローン化し単
りローン性抗体産生ハイブリドーマクローン？樹立した
。

（３）　　単クローナル性抗体の性質：ｍＩＡｄｏに対
する単クローナル性抗体は３種得られ抗体のクラスはい
ずれもＩｇＧ　２　ｂであった。抗体価は６４〜１２８
倍（培養上清を２段階希釈し、それぞれとｍ’　Ａｄｏ
　−ＢＳＡを反応させるＥＬＩＳＡを行った時、最も畠
い吸光度の持続する希釈倍率を抗体価とした）であった
。交差反応性を検討したところ、ｍ’Ａｄｏおよびｍ’
　Ａｄｅの骨格をもつ化合物で９９〜１００％の交差反
応性を示したが他のヌクレオシド、塩基等とは反応しな
かった。この結果よりこの単クローン性抗体の認識する
エピト−ｆは、ｍ’Ａｄ。

の塩基部分であると判断てれた。

実施例２゜ ｍ”Ａｄｏのｌ（Ｌ　　５，１，０．５及び０．１１ｄ
／ｍｅ溶液をあらかじめｍ’Ａｄｏ　−ＢＳＡ　Ｏ，２
μｆｔ／ウェルでコートされた９６ウエルグレートに５
０μβずつ加え、更に実施例１で得た１巨クロ一ン性抗
体の２０倍希釈液を５０μｊずつ加えて競合阻害試験を
おこなった。この結果％Ｊ！１図に示すように添加した
ｍ’ＡｄｏＯ量に比例して抗体とｒｎ’　Ａｄｏ　−Ｂ
ＳＡの結合が阻害されることが明らかとなった。

実施例３ 実施例２．のｒｎ’Ａｄｏ溶液に代えて試料として正常
人及び癌患者の尿？用い、同様に競合阻害試験をふ−こ
なった。実施例２．の結果から得た検量線を用い、試料
中のｍ’Ａｄｏ量を測定した。

この結果？下表に示す。

＊各試料は次の通りである。

１　正常人尿 ２　癌患者尿（肝、息癌、肺転移） ３　　　　ＩＩ（原発性肝癌〕 ４　　　ＩＩ　　（胆管病） ５　　　ｌ　　（胃癌〕 ６　　　〃　　（原発性肝癌） ７　　　　ｇ　　　（、＠、性骨髄性白血病）＊＊　カ
ッコ内は、試料番号１の正常人尿中の１−メチルアデノ
シン量に対する各試料の１−メチルアデノシン量の比？
示す。

【図面の簡単な説明】

第１図はｍ１Ａｄｏの用量と４０５　ｎｍの吸光度の関
係？示す図面である。 第　　１　　図 ｍ１ＡｄＯ量　（μ？） 手続補正υ（自発） 昭和６１年７月３　日 与許庁艮官　宇　賀　道　部　殿 １゜ 昭和６１年６月１９日提出の特許願（１、発明の名称 単クローン性抗体及びこれを用いる１−メチルアデノシ
ンの６１１１　定法 補正をする者 事件との関係　出願人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、１−メチルアデノシンに対する単クローン性抗体。 ２、次の性質、 （１）抗体のクラス：ＩｇＧ２ｂ （２）抗体価：６４〜１２８倍 （３）交差反応性： ｍ＾１Ａｄｏ及びｍ＾１Ａｄｅ骨格を有する化合物と９
   ９〜１００％の交差反応性を 有し、他のヌクレオシド、塩基等 とは反応しない。 を有する特許請求の範囲第１項記載の単クローン性抗体
   。 ３、被検体に１−メチルアデノシンに対する単クローン
   性抗体を加え、生じた１−メチルアデノシン−単クロー
   ン性抗体複合物量を測定することを特徴とする１−メチ
   ルアデノシンの測定法。