JP2896931B2 - モノクローナル抗体、それを用いた測定法、試薬キット、検索法及び薬剤ミサイル - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はモノクローナル抗体に関し、さらに詳細に
は、癌患者体液中に増加する５−メチルシチジン（５−
methylcytidine）等の修飾核酸塩基類に対するモノクロ
ーナル抗体に関する。

また本発明は、かかるモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ、モノクローナル抗体を用いた免疫測定
方法、試薬キット、免疫組織化学的検索方法、及び薬剤
ミサイルに関する。

背景技術 癌の診断や術後のモニタリングにおいて、患者の血清
中や尿中に増加する癌関連物質いわゆる腫瘍マーカーの
測定は欠かせぬものとなっている。現在、測定されてい
る腫瘍マーカーとしては、癌胎児性抗原（CEA）、免疫
抑制酸性蛋白（IAP）や、肝癌に特異的なαフェトプロ
テイン（AFP）あるいは膵癌に特異的な糖鎖抗原の一種
であるCA19−９などがあげられる。ところで、癌患者の
尿中に各種の修飾核酸塩基類が増加することは、古くか
ら知られていた。

本発明者らは、修飾核酸塩基類の腫瘍マーカーとして
の有用性を検討するため、癌患者や、担癌動物の尿、血
清などを従来法である高速液体クロマトグラフィー（HP
LC）で測定した。その結果、癌患者や担癌動物で５−メ
チルシチジンの異常な増加が認められた。

このように、この化合物の腫瘍マーカーとしての有用
性は確認できたが、HPLC分析では試料の前処理が煩雑で
あり多検体の測定に非常に長い時間を要するという欠点
があった。また、５−メチルシチジンの細胞内局在およ
び、細胞レベルでの増加の有無について免疫組織化学的
に検索することは不可能であった。

本発明者らは、５−メチルシチジン等の簡便な測定法
を開発すべく、種々検討をおこなった結果、５−メチル
シチジン等に対するモノクローナル抗体を新たに作製
し、これを用いることにより、サンプルの前処理操作を
行うことなく酵素免疫測定法を応用した多検体同時測定
法を実施することができ、測定の迅速化、簡素化がはか
れることを見出し、本発明に到達した。

発明の開示 本発明は低級アルキルシチジンを認識し得るモノクロ
ーナル抗体、当該モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマに係るものである。

また本発明は、免疫学的方法による被検体中の低級ア
ルキルシチジンを測定する方法において、低級アルキル
シチジンを認識し得るモノクローナル抗体を用いること
を特徴とする測定法；免疫学的方法により被検体中の低
級アルキルシチジンを測定するための試薬キットであっ
て、低級アルキルシチジンを認識し得るモノクローナル
抗体と、低級アルキルシチジンとキャリア・プロテイン
−IIとの結合物を用いたことを特徴とする試薬キット；
及び腫瘍組織中において異常代謝亢進の結果蓄積された
修飾核酸塩基類の存在を免疫組織化学的に検索する方法
において、該修飾核酸塩基類を認識し得るモノクローナ
ル抗体を免疫反応により組織の一部に結合せしめること
を特徴とする検索法に係るものである。

さらに本発明は当該修飾核酸塩基類を認識し得るモノ
クローナル抗体を抗癌剤又は制癌剤のキャリアーとして
用いたことを特徴とする薬剤ミサイルに係るものであ
る。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明のモノクローナル抗体の１例である
MCT−３についての５−メチルシチジンの検出特性を示
したものである。第２図は、本発明におけるモノクロー
ナル抗体の抗体価を求める際に希釈倍率と吸光度の関係
を模式的に示したものである。第３図は食道癌組織を抗
１−メチルアデノシンモノクローナル抗体で免疫染色し
た結果を示し、第４図は食道癌組織を抗シュードウリジ
ンモノクローナル抗体で免疫染色した結果を示し、第５
図は正常食道組織を抗１−メチルアデノシンモノクロー
ナル抗体で免疫染色した結果を示す図面（写真）であ
る。

発明を実施するための最良の形態 本発明のモノクローナル抗体は低級アルキルシチジン
を特異的に認識する抗体である。ここで低級アルキルシ
チジンとしては、シチジンにおける水素原子が、メチル
基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル
基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基等の直
鎖状又は分岐状の炭素原子数が１〜５の低級アルキル基
で置換されたものがあげられる。かかる低級アルキル基
のうちでも、メチル基が特に有利に用いられるものとし
てあげられる。また低級アルキル基の導入位置の好まし
いものとしては、シチジンを構成するピリミジン骨格の
３位、５位及び６位の少なくとも１ヶ所があげられ、特
に５位が有利である。

本発明におけるモノクローナル抗体の中で、腫瘍マー
カーとしての修飾核酸塩基の測定精度や安全性等の点で
特に好ましいものは、５−メチルシチジンを認識する抗
体である。

かかるモノクローナル抗体のクラスとしては、IgGが
好ましく、中でもIgG₁やIgG₂aが有利であり、特にIgG₁
のクラスのモノクローナル抗体が５−メチルシチジンの
認識における反応特異性が高くかつ抗体価が高いことか
ら実用上有利である。

また本発明のモノクローナル抗体は、低級アルキルシ
チジンを認識することができるものであるが、かかる低
級アルキルシチジンが動物の尿や血液、リンパ液等の体
液中にある場合にも認識できるものであることが好まし
く、特にヒトの体液中の低級アルキルシチジンを認識で
きるものが実用上好適である。

本発明の低級アルキルシチジンを認識し得るモノクロ
ーナル抗体の製造法の好ましい例として、次の如く５−
メチルシチジンを認識し得るモノクローナル抗体を調製
する方法があげられる。

すなわち、まず、５−メチルシチジンを用いて動物を
免役し、その動物の脾細胞を採取する。この工程におい
て、５−メチルシチジンはそれ単独では免疫原となり得
ないので、適当なキャリア・プロテイン（Carrier Prot
ein）−Ｉと結合させたのち、免疫原として用いる。

５−メチルシチジンとしては、癌患者尿中から単離・
精製したもの、合成したもの、あるいは市販されている
標準品等を用いることができる。キャリア・プロテイン
−Ｉとしては、ハプテンとなる物質を免疫担当細胞が認
識することを可能にする目的に用いられるプロテイン、
例えばキーホール・リンペット・ヘモシアニン、牛血清
アルブミン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン等を
用いることができる。また、この５−メチルシチジンと
キャリア・プロテイン−Ｉを結合する方法としては、例
えば核酸塩基の糖部分を過ヨウ素酸で酸化したのちにキ
ャリア・プロテイン−Ｉと結合させる等の方法が挙げら
れる。

この様にして得られた５−メチルシチジンとキャリア
・プロテイン−Ｉとの結合物を用いて免疫する動物とし
ては、マウス、ラット等が挙げられ、特にマウスが実用
上有利に用いられる。

次に得られた免疫動物の脾細胞を骨髄腫細胞と融合
し、ハイブリドーマを得る。細胞融合においては、公知
のポリエチレングリコールを用いる方法（Marc Shulma
n,C.D.Wide ＆ G.Khler,Nature276,269−270（197
8））、Sendai Virusにより融合する方法（G.Khler
＆ C.Milstein,Nature256,495−497（1975）又はEur.J.
Immunol.6,511−519（1976））、あるいは電気パルスに
よる方法（J.Vienken ＆ U.Zimmermann,FEBS Letters 1
37,11−13（1982））のいずれを用いても良い。尚、ハ
イブリドーマのスクリーニングに当たっては、キャリア
・プロテインに対する抗体産生ハイブリドーマを除去す
るための工夫が必要である。このためには、免疫に用い
たキャリア・プロテイン−Ｉと異なった種由来のプロテ
インを５−メチルシチジンに結合させたものを抗原とし
て用い、抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行
う等の方法を用いることが望ましい。

この様にハイブリドーマを経由して本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造する際の、脾細胞とミエローマ細胞
は、同一種の動物からのものが好ましく、特にマウス脾
細胞とマウス由来ミエローマ細胞が実用上に好適であ
る。

次に、本発明においては、選択したハイブリドーマ又
は形質転換細胞を培養して、所望の特異的モノクローナ
ル抗体を生成させる。クローニングによって選択され
た、低級アルキルシチジンを認識する抗体を産生するハ
イブリドーマ又は形質転換細胞は凍結して保存すること
ができ、また、これを適当な方法で大量に培養すること
もできる。そして、培養上清から低級アルキルシチジン
に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることがで
きる。また、かかる細胞を動物に移植して腫瘍化し、そ
の腹水や血清から目的とする抗体を得ることもできる。
本発明のモノクローナル抗体の精製は、アフィニティク
ロマトグラフィー等の方法によって行なわれる。

また本発明には、低級アルキルシチジンとキャリア・
プロテイン−Ｉとの結合体を免疫原として用いて得られ
た低級アルキルシチジンを認識し得る抗体の産生能を有
する脾細胞と、ミエローマ細胞とを融合して得られるハ
イブリドーマも含まれる。かかるハイブリドーマを得る
方法としては、前記のモノクローナル抗体の製造法にお
けるハイブリドーマの製造法が好適である。

本発明者らは、かかる低級アルキルシチジンを認識し
得るモノクローナル抗体によって、進行癌のマーカーと
して患者の尿、血清等に体液中の低級アルキルシチジ
ン、特に好適には５−メチルシチジンを簡単に精度よく
測定し得ることを見い出し、本発明の測定法に到達し
た。

即ち本発明の測定法は、免疫学的方法により被検体中
の低級アルキルシチジンを測定する方法において、低級
アルキルシチジンを認識し得るモノクローナル抗体を用
いることを特徴とするものである。ここで被検体（以下
試料ともいう）の好ましいものとしては、前記の如く動
物、特にヒトの体液自体、又は処理を施したものがあげ
られるが、体液自体を用いる方法が簡便であり有利であ
る。

本発明の測定法においては、低級アルキルシチジンを
認識し得るモノクローナル抗体を担体に固定化しておく
のが好ましいが、固定化の方法は公知の方法を採用で
き、担体としては固相の、例えば、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリアクリレート、テフロン、ポリアセター
ル等を用いた、ポール、ビーズ、ギヤ、マイクロプレー
ト等が好ましく使用される。

また、モノクローナル抗体の標識化の方法や手段、そ
れの検出方法や手段は何ら限定されるものではなく、公
知の方法や手段、例えば、放射性物質又は酵素若しくは
蛍光物質で標識された抗免疫グロブリン抗体またはブド
ウ球菌蛋白Ａとの２次反応により測定することができ
る。標識剤としては、酵素を用いる方法（EIA）ではホ
ースラディッシュパーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素が；放射
性物質を用いる方法（RIA）では¹²⁵I，³H等が；蛍光物
質を用いる方法（FIA）ではフルオレセインイソチオサ
イアネート等が通常使用されるが、その標識剤の活性が
測定可能であれば、その他のものであってもよい。

標識剤が酵素である場合には、その活性を測定するた
めに基質が用いられる。基質としては例えば、ホースラ
ディッシュパーオキシダーゼの基質として、2,2′−ア
ジノジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］ア
ンモニウム酸（ABTS）−H₂O₂、５−アミノサリチル酸−
H₂O₂、Ｏ−フェニレンジアミン−H₂O₂、４−アミノアン
チピリン−H₂O₂などを、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基
質として、フルオレセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド）、Ｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシドなどを挙げることが出来る。測定のために
は、これらの試薬以外にも溶解剤、洗浄剤、反応停止剤
等の公知の試薬が使用される。また抗原−抗体複合体の
偏光を利用する方法も考えられる。

本発明の免疫測定法の実施態様として、５−メチルシ
チジンの定量を行う場合について以下の如く例示する。

すなわち、96ウェルマイクロプレートに、５−メチル
シチジンと牛血清アルブミン（BSA）の結合物を１μg/
ウェルで添加したのち４℃で、12〜24時間放置する。次
に各ウェルに１％BSAを含むリン酸緩衝生理食塩液（PB
S）を100μｌずつ添加することにより、抗体その他のタ
ンパクの非特異的吸着を防止する。次に試料（尿および
血清など）を各ウェルに50μｌ添加する。よく攪拌した
のちに、４℃で１時間放置する。各ウェルをPBSでよく
洗浄したのちに、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マ
ウスIgG抗体の3000倍希釈液を各ウェルに100μｌずつ添
加する。４℃で45分間反応させたのちに、PBSでよく洗
い、水分をきったのちに基質溶液（パラニトロフェニル
フォスフェートを1mg/mlの濃度で1Mジエタノールアミン
バッファー（pH9.8）にとかしたもの）を100μｌずつ加
え37℃で30分間反応させる。各ウェルの405nmにおける
吸光度をEIAリーダーで測定することにより試料中に存
在する５−メチルシチジンの定量を行う。

本発明には、また免疫学的方法により被検体中の低級
アルキルシチジンを測定するための試薬キットであっ
て、低級アルキルシチジンを認識し得るモノクローナル
抗体と、低級アルキルシチジンとキャリア・プロテイン
−IIとの結合物を用いたことを特徴とする試薬キット
も、その範囲に含むものである。

かかるモノクローナル抗体とは前記した如き特性を有
するものである。また、低級アルキルシチジンと結合物
をつくるキャリア・プロテイン−IIとしては、前記した
キャリア・プロテイン−Ｉに関するプロテイン群と同様
の群から選ばれるものであって、その結合物としての抗
原性がキャリア・プロテイン−Ｉと異なるものでなけれ
ばならない。

また本発明の試薬キットには、モノクローナル抗体と
結合物の他に、必要に応じて標識剤や、標識化抗体の検
出試薬を含んでもよい。

さらに、本発明には、腫瘍組織中において異常代謝亢
進の結果蓄積された修飾核酸塩基類の存在を免疫組織化
学的に検索する方法において、該修飾核酸塩基類を認識
し得るモノクローナル抗体を免疫反応により組織の一部
に結合せしめることを特徴とする検索方法も含まれる。

かかる免疫組織化学的検索方法における組織とは、動
物、特に実用上好適にはヒトの細胞又は組織切片を意味
する。

本発明の検索法に用いられるモノクローナル抗体とし
ては、前述の低級アルキルシチジンを認識し得るモノク
ローナル抗体のみならず、抗シュードウリジンモノクロ
ーナル抗体（特開昭62−299765号公報、特開昭63−2226
99号公報）、抗１−メチルアデノシンモノクローナル抗
体（特開昭62−299766号公報）などの癌関連修飾核酸塩
基類に対するモノクローナル抗体が挙げられる。

本発明の検索法は、さらに具体的には、組織に前記の
修飾核酸塩基類を認識し得るモノクローナル抗体を作用
させることにより免疫反応を生じさせて組織における当
該修飾核酸塩基類の存在部位にそのモノクローナル抗体
を結合せしめることを特徴としている。さらにその後、
例えばかかるモノクローナル抗体を認識するビオチン化
抗体で処理し、さらに酵素標識アビジンを作用させる等
の方法によって組織における当該修飾核酸塩基類の存在
部位を染色等で標識化せしめて進行癌等の存在部位の検
索を可能にするものである。

この様な本発明の検索法の実施態様例として以下の方
法があげられる。即ち本発明の免疫組織化学的検索法に
おいては、細胞または組織切片をアセトン、ホルマリ
ン、パラホルムアルデヒドなどで固定したのち、１％BS
Aを含むPBSでタンパク質の非特異的吸着を防ぐ。次に、
モノクローナル抗体を反応させ、室温30分放置する。PB
Sでよく洗ったのちビオチン化抗マウスIgG抗体を反応さ
せ室温30分放置する。PBSでよく洗ったのち、アビジン
−ビオチン化ペルオキシターゼ複合体（ABC）溶液を反
応させ室温で30分間放置後PBSでよく洗浄する。次に、
基質溶液（ジアミノベンチジンを0.5mg/ml、過酸化水素
水を0.01％の濃度で含むPBS（pH7.4））を添加し、発色
させる。目的とする修飾核酸塩基類の細胞内局在等を光
学顕微鏡を用いて検討する。

さらに本発明には、腫瘍組織中において異常代謝亢進
の結果蓄積された修飾核酸塩基類を認識し得るモノクロ
ーナル抗体を抗癌剤又は制癌剤のキャリアーとして用い
たことを特徴とする薬剤ミサイルも含まれる。

かかる抗癌剤や制癌剤には、例えば、アルキル化剤と
してクロラムブチル、ACNU、CCNU、シスプラチン等、代
謝拮抗剤としてMTX、5FU、FUDR、ARA−Ｃ等、ビンカア
ルカロイドとしてはビンブラスチン、ビンクリスチン
等、抗生剤としてMMC、アドリアマイシン、ダウノマイ
シン等が用いられるが、いずれもこれらのモノクローナ
ル抗体をキャリアーとして用いることが出来るものであ
ればよく、これらに限定されるものではない。

またこれらのモノクローナル抗体をキャリアーとして
用いる形態としてはいかなるものであってもよく、例え
ば放射性アイソトープのキャリアーとして用いた治療法
も含まれる。かかる放射性アイソトープには、αエミッ
ターである²¹²Bi、²¹¹At等、βエミッターである¹³¹I、
⁹⁰Y等が用いられる。

かかる本発明の薬剤ミサイルによれば、抗癌剤や制癌
剤を患部に有効に到達させることが可能であり、高い治
療効果が得られ且つ副作用を低下させることができる。

また本発明には、放射性物質、常磁性物質、蛍光物質
等の標識となり得る物で標識化された、低級アルキルシ
チジンを認識し得るイメージング診断用モノクローナル
抗体も含まれる。

ここで言う放射性物質としては例えば¹²⁵I、¹¹¹In、
^99mTc等があげられ、常磁性物質としては例えばガドリ
ニウム（Gd）等があげられる。これらはいずれも、本発
明のモノクローナル抗体を標識化したものを動物、特に
好適にはヒトの体内に注入し、体内における低級アルキ
ルシチジンの存在部位に到達せしめて、その部位を標識
化して、放射線や超音波診断でのイメージング診断用に
用いることができるものであれば、いかなるものであっ
てもよい。

かかる本発明のイメージング診断用のモノクローナル
抗体によれば、体内で低級アルキルシチジンの発生をと
もなう進行癌等の有無やその場所及びその進行度を極め
て容易に診断することが可能である。

尚、本発明でモノクローナル抗体の特性を表示するた
めに用いる抗体価とは、例えば５−メチルシチジンの場
合に、５−メチルシチジンと牛血清アルブミン（BSA）
の結合物をあかじめ96ウェルマイクロプレートに吸着さ
せておき、そこへ本発明のモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマの培養上清液を順次２倍希釈した液を
各々加えて、免疫反応させた後、各々の吸光度を測定
し、最大の吸光度が維持される最大の希釈倍率を意味す
る。かかる希釈倍率と得られる吸光度の関係のパターン
と抗体価を模式的に示したのが第２図である。

実施例 次に実施例を挙げ、本発明を説明するが本実施例に限
定されるものではない。

実施例１ （１）免疫原の調製： シグマ（Sigma）社より購入した５−メチルシチジン
と、キャリア・プロテイン−Ｉであるキーホール・リン
ペット・ヘモシアニンとの結合体をエルランガー（Erla
nger）とビーザー（Bieser）の方法（Pro.N.A.S.,52,68
（1964））で作製した。すなわち５−メチルシチジンを
過ヨウ素酸で酸化し、過剰の過ヨウ素酸をエチレングリ
コールで分解したのち、アルカリ性（pH9〜9.5）条件下
でヘモシアニンと反応させる。ついで水素化ホウ素ナト
リウムで還元し、安定化合物を生成させる。この反応混
合物をPBS（pH7.4）中で一晩透析し、未反応の５−メチ
ルシチジンを除き、凍結乾燥に付したのち、−20℃の冷
凍庫中に保存した。

（２）モノクローナル抗体の作製： （ｉ）（１）で得た５−メチルシチジンとヘモシアニン
結合物を、フロイントの完全アジュバント（Freund′s
Complete Adjuvant）と等量混合し、エマルジョンとし
たのち、BALB/cマウスの腹腔内に一匹あたり50μｇ投与
した。２回目以降は不完全アジュバント（Incomplete A
djuvant）を用いたエマルジョンを、マウス一匹あたり5
0μｇ、14日間隔で２回腹腔内に投与した。最終免疫は
５−メチルシチジン−ヘモシアニン結合物100μg/ml溶
液を0.2ml静脈内投与した。

（ii）最終免疫の３日後に過免疫マウスから摘出した脾
細胞とBALB/cマウス由来ミエローマ細胞株Sp2/0−Ag14
をポリエチレングリコール4000を用いて融合した。細胞
は96ウェルマイクロプレートに100μl/ウェルずつ加
え、24時間後に培地の半量をハット（HAT）培地に交換
し２日おきに培地交換した。７〜10日後にハット耐性の
ハイブリドーマの成長がみられてくる。この時期に培地
をHT培地に変え、約10日間培養したのちにハイブリドー
マ生育培地に変えた。

（iii）抗体産生細胞のスクリーニングは５−メチルシ
チジンと牛血清アルブミン（BSA）を結合させたものを
抗原として用いた２抗体エライザ（ELISA）法により行
った。この方法により最も憂慮されるキャリア・プロテ
インに対する抗体を産生するハイブリドーマの除外に成
功した。次に５−メチルシチジンによる阻害がかかるか
否かを検討することにより５−メチルシチジンと特異的
に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを選択した。ここで選択されたハイブリドーマは限界
希釈法によりクローン化しモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマクローンを樹立した。その一例でるハイブリ
ドーマMCT−３は工業技術院微生物工業技術研究所にFER
M BP−2788として寄託した。

（３）モノクローナル抗体の性質： 得られたモノクローナル抗体は、その反応特異性の相
違から３つのグループに分類した。すなわち、（ｉ）５
−メチルシチジンとのみ非常に強く反応するモノクロー
ナル抗体（MST−３他４クローン）（ii）５−メチルシ
チジンとの反応は（ｉ）に示すモノクローナル抗体より
も弱いながらも、他の核酸塩基とは反応しないモノクロ
ーナル抗体（MCT−６他１クローン）（iii）５−メチル
シチジン、５−メチルシトシン、さらには、チミジン、
シチジンと反応するモノクローナル抗体（MCT−８他１
クローン）である。各グループで、最も反応性の高かっ
たモノクローナル抗体、即ちMCT−３、MCT−６およびMC
T−８についての抗体価及び反応特異性を示すと第１表
の如くなる。

実施例２ ５−メチルシチジン−BSA（0.1μg/ウェル）でコート
した96ウェルマイクロプレートに５−メチルシチジンの
10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7Ｍ溶液を各50μｌ
ずつ加えたのちに、MCT−３モノクローナル抗体の30倍
希釈液を50μｌずつ加え、競合実験を行った。その結
果、第１図に示すごとく、添加した５−メチルシチジン
の量に比例して、MCT−３抗体と５−メチルシチジン−B
SAの結合が阻害されることが明らかとなった。この反応
曲線を検量線とした時、５−メチルシチジンの検出限界
は1pmolであり、この測定系を用いれば、高感度に、微
量の５−メチルシチジンの検出が可能であることが判明
した。

実施例３ 実施例２の５−メチルシチジン溶液に代えて試料とし
て健常人および癌患者の尿を用い同様に競合阻害試験を
行なった。実施例２の結果から得た検量線を用い、試料
中の５−メチルシチジンを測定した。この結果を第２表
に示す。

実施例４ 以下の手順にて、抗修飾核酸塩基類モノクローナル抗
体を用いて食道癌組織の免疫組織染色を行なった。

食道癌組織（手術摘出標本）は、ホルマリン固定した
のちにパラフィン包埋し、３〜５μｍの切片を作製す
る。

切片をスライドグラス上にうつしとったのち、正常ウ
マ血清で処理して、非特異的吸着を防ぐ。

次に、モノクローナル抗体（抗１−メチルアデノシン
抗体、抗シュードウリジン抗体,5μg/mlの濃度）で処理
し室温で１時間反応させる。

スライドグラスを緩衝液で、よく洗浄したのち、ビオ
チン化抗マウスIgGで処理し、室温30分間反応させる。

スライドグラスを緩衝液でよく洗浄したのちに西洋ワ
サビペルオキシダーゼ−アビジン複合体で処理し、室温
30分間反応させる。

スライドグラスを緩衝液でよく洗浄したのちに、基質
液（0.5mg/mlジアミノベンチジン、0.01％過酸化水素水
を含むリン酸緩衝液）を加えて発色させる。

核は、ヘマトキシリン液により染色する。

その結果を第３〜５図に示す。その結果、抗１−メチ
ルアデノシンモノクローナル抗体及び抗シュードウリジ
ンモノクローナル抗体のいずれを用いた場合も正常組織
は染色されず、癌組織が特異的に染色された。なお、第
３図及び第４図において濃灰色〜黒色の部分が染色部位
（反応陽性部位）である。

産業上の利用可能性 本発明のモノクローナル抗体は、低級アルキルシチジ
ン、殊に５−メチルシチジンを高感度に認識する優れた
特性を有するものである。また本発明のハイブリドーマ
は、かかる優れた特性を有するモノクローナル抗体を産
生する有用な性質をもつものである。また本発明の測定
法、試薬キットによれば、体液等の被検体の前処理を行
うことなく低級アルキルシチジンの測定を容易に行うこ
とが可能であって、多数の被検体に対して簡便かつ迅速
に進行癌の有無を判定することができる。

さらに本発明の検索法によれば、腫瘍組織において異
常代謝亢進の結果蓄積された修飾核酸塩基類の検出を容
易に行うことができる。また本発明のイメージング診断
用のモノクローナル抗体は、体内で進行中の癌の診断を
極めて容易に行うことを可能にするものであり、薬剤ミ
サイルは、抗癌剤等を患部に有効に投与して高い治療効
果を実現するものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (56)参考文献 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．152，ｐ．115−121（1985) Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ，36ｃ, 459−463（1981) Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ，37ｃ, 399−404（1982) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 16/44 C12N 5/00 G01N 33/577 A61K 39/395 C12P 21/08 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】５−メチルシチジンを認識し、５−メチル
   シトシン、シチジン及びチミジンを認識しない、IgG₁に
   属する抗５−メチルシチジンモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】FERM BP−2788として寄託されたハイブリ
   ドーマMCT−３が産生するものである請求項１記載のモ
   ノクローナル抗体。
3. 【請求項３】請求項１記載のモノクローナル抗体を産生
   するハイブリドーマ。
4. 【請求項４】FERM BP−2788として寄託されたものであ
   る請求項３記載のハイブリドーマ。
5. 【請求項５】免疫学的方法による被検体中の５−メチル
   シチジンを測定する方法において、請求項１又は２記載
   のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする測定
   法。
6. 【請求項６】免疫学的方法により被検体中の５−メチル
   シチジンを測定するための試薬キットであって、請求項
   １又は２記載のモノクローナル抗体と、５−メチルシチ
   ジンとキャリア・プロテイン−IIとの結合物を用いたこ
   とを特徴とする試薬キット。
7. 【請求項７】腫瘍組織中において異常代謝亢進の結果蓄
   積された５−メチルシチジンの存在を免疫組織化学的に
   検索する方法において、請求項１又は２記載のモノクロ
   ーナル抗体を免疫反応により組織の一部に結合せしめる
   ことを特徴とする検索法。