JPH04225162A - ヒト・オステオカルシンフラグメントに対する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト・オステオカルシ
ンのフラグメントに選択的に結合する抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】オステオカルシン〔別名、ｂｏｎｅ　　
ｇｌａ　　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＧＰ）〕は、骨のビタミ
ンＫ依存性のカルシウム結合性タンパクである。その分
子量は５，８００であり４９のアミノ酸残基により構成
されている。このタンパクは、オステオブラスト（骨芽
球）から生産され、骨の非コラーゲンタンパクの構成成
分の約２０％を占めている。このタンパクにはγ−ｃａ
ｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ　　ｒｅｓｉｄｕ
ｅｓがあり、これはハイドロキシアパタイトと強いアフ
ィニテイがあり、それゆえに骨マトリックス形成に重要
な役割を有しているものと推定されている。

【０００３】このオステオカルシンは、ニワトリとウシ
の骨から見出されたのが最初であるが〔Ｐｒｏｃ．　　
Ｎａｔｌ．　　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ．　　ＵＳＡ，ｖ
ｏｌ．７２，ｐｐ３９２５〜３９２９（１９７５）、同
ｖｏｌ．７３，ｐｐ１４４７〜１４５１（１９７６）〕
、その他ヒトを含めて種々の動物の骨から見出されてお
り〔Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｖｏｌ．２５５
，ｐｐ８６８５〜８６９１（１９８０）〕、その構造の
類似性が言われている。

【０００４】このオステオカルシンの測定に関して、い
くつかのグループがチャレンジしている。Ｐｒｉｃｅら
〔Ｊ．　　Ｃｌｉｎ．　　Ｉｎｖｅｓｔ．　　ｖｏｌ．
６６，ｐｐ８７８〜８８３（１９８０）〕や、Ｄｅｌｍ
ａｓら〔Ｊ．　　Ｃｌｉｎ．　　Ｉｎｖｅｓｔ．　　ｖ
ｏｌ．７１，ｐｐ１３１６〜１３２１（１９８３）〕が
ウシとヒト・オステオカルシンの構造の類似性を利用し
てウシのオステオカルシンに対する抗体を用いて競合法
によりヒト・オステオカルシンを測定するためのラジオ
イムノアッセイを開発している。

【０００５】また、Ｃａｔｈｅｒｗｏｏｄらは〔Ｂｏｎ
ｅ　　ｖｏｌ．６，ｐｐ９〜１３（１９８５）〕、ウシ
とヒト・オステオカルシンに共通なアミノ酸配列である
Ｎ末端側から数えて３７から４９残基（Ｃ端）のペプチ
ドを合成し、その抗体を利用して同様に競合法により、
ラジオイムノアッセイを構成し、ヒト・オステオカルシ
ンの測定を可能にしている。

【０００６】一方、これらの方法がポリクローナル抗体
を用いた測定法であるのに対し、感度、精度の面の改良
を目的として、特開平１−１６０４９３号公報では同様
にウシのオステオカルシンに対するモノクローナル抗体
（以下ＭＣＡと記す）をとり、その中にＣ末端（４５Ｐ
ｈｅ−４９Ｖａｌ）を認識するＭＣＡと、中間領域を認
識する（２１Ｇｌａ−３１Ｇｌｕ）ＭＣＡとの２種のＭ
ＣＡを用いたサンドイッチ法が開示されている。従って
、この方法も、ウシとヒトのオステオカルシンの共通ア
ミノ酸配列を利用して測定系を構成し、ヒトの血中系の
測定を行っていることになる。

【０００７】従来、以上のようなヒト・オステオカルシ
ンの測定に対する種々のアプローチがあるが、特定のオ
ステオカルシンフラグメントを選択的に測定しようとす
る試みはほとんどない。このフラグメントは、骨吸収に
おいて出現する可能性が示されている〔Ｊ．　　Ｃｌｉ
ｎ．　　Ｉｎｖｅｓｔ．　　ｖｏｌ．７７，ｐｐ１７６
２〜１７６９（１９８６）〕。このフラグメントを測定
する試みとして、我々は、国際公開ＷＯ９０／０９５８
７号公報にてその内容を公開している。しかしながらこ
の方法においては、完全ヒト・オステオカルシンおよび
そのフラグメントの合計量を測定し、別に測定した完全
ヒト・オステオカルシンの量と組合せてそれらの差を算
出する必要がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒト・オス
テオカルシンフラグメントを選択的に測定するための抗
体を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヒト・オステ
オカルシンのＮ末端１〜１９残基以内のペプチドでその
ペプチドのＣ末端が１９残基目であるペプチドを免疫し
て得られるヒト・オステオカルシンフラグメントに対す
る抗体である。本発明のヒト・オステオカルシンフラグ
メントに対する抗体は、ヒト・オステオカルシンのＮ末
端１〜１９残基以内、好ましくはＮ末端１０〜１９残基
以内のペプチドでそのペプチドのＣ末端が１９残基目で
あるペプチドを免疫して得られる。このペプチドは、ま
た４残基以上のアミノ酸が結合しているものであること
が好ましい。またこのペプチドはそのＮ末端側に、例え
ばシステインのような、キャリヤータンパクとの結合性
を有する官能基が結合されているものであることが好ま
しい。本発明の抗体は、ヒト・オステオカルシン１〜４
９に対する反応性が低く、ヒト・オステオカルシン１〜
１９に対する反応性が高いことが好ましい。固相抗原競
合法による具体的な反応比は２．５以上であることが好
ましく、固相抗原結合法による反応比が１０以上である
ことがさらに好ましい。ここで固相抗原競合法は評価す
べき抗体に対応する抗原を固相化しておき（固相化抗原
）、この固相化抗原と、別に添加した抗原とを競合させ
て抗体がどちらに選択的に反応するかを評価する方法で
あり、固相抗原結合法は、評価すべき抗体に対応する抗
原とその他の抗原をいずれも固相化しておき、抗体がい
ずれの抗原と選択的に反応するかを評価する方法である
。

【００１０】抗体としては、モノクローナル抗体および
ポリクローナル抗体のいずれであってもよいがポリクロ
ーナル抗体であることが好ましい。また本発明の抗体は
、抗体全分子、Ｆ（ａｂ′）２　、Ｆａｂ′またはＦａ
ｃｂフラグメントなど抗原との結合能を保持しているも
のであればそのいずれであってもよい。かかるフラグメ
ントは、Ｆ（ａｂ′）２　やＦａｂ′の場合には後記の
ようにして得られるモノクローナル抗体またはポリクロ
ーナルを公知の方法、例えば該抗体をペプシンで分解し
てＦ（ａｂ′）２　フラグメントとするか、さらにＦ（
ａｂ′）２　フラグメントを還元処理することによって
Ｆａｂ′フラグメントとすることにより得られる〔Ｎｉ
ｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，ｅｔ　　ａｌ．：Ａｒｃｈ．　　
Ｂｉｏｃｈｅｍ．　　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　　８９　　２
３０（１９６０）、Ｐａｒｈａｍ，Ｐ．：Ｊ．　　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．　　１３１　　２８９５（１９８３）など
〕。この抗体は、Ｎ末端１９残基ヒト・オステオカルシ
ンフラグメントに対して選択的に反応する。

【００１１】本発明は、またヒト・オステオカルシンの
Ｎ末端４５〜４９残基のペプチドを免疫して得られる抗
体である。このペプチドはそのＣ末端側に、例えばシス
テインのような、キャリヤータンパクとの結合性を有す
る官能基が結合されているものであることが好ましい。 この抗体は、ヒト・オステオカルシン１〜４９に対する
反応性が低く、Ｎ末端４５〜４９に対する反応性が高い
ことが好ましく、固相抗原競合法による具体的な反応比
は１．５以上であることが好ましく、固相抗原結合法に
よる反応比が５．０以上であることがさらに好ましい。 抗体としては、モノクローナル抗体およびポリクローナ
ル抗体のいずれであってもよいがポリクローナル抗体で
あることが好ましい。またこの抗体は、抗体全分子、Ｆ
（ａｂ′）２　、Ｆａｂ′またはＦａｃｂフラグメント
など抗原との結合能を保持しているものであればそのい
ずれであってもよいことは前記と同様である。この抗体
は、Ｃ末端５残基ヒト・オステオカルシンフラグメント
に選択的に反応する。

【００１２】以下、本発明の抗体の作成法のそれぞれに
ついてポリクローナル抗体を例として説明する。抗体が
モノクローナル抗体である場合は、以下のようにして得
られた免疫源を用い、ケーラーとミルシュタインによる
細胞融合法〔Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒ　　ａｎｄ　　Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、２５６、
４９５─４９７（１９７５）〕により作製されたハイブ
リドーマを培養して分泌させ、その培養液から分離する
ことにより調製することができる。（Ｉ）Ｎ末端１９残
基オステオカルシンフラグメントに選択的に反応する抗
体の採取 Ｉ−ａ　　免疫源の作成 Ｉ−ａ−■　　Ｎ末端（　１Ｔｒｙ−１９Ａｒｇ）合成
ペプチドの作成 ヒト・オステオカルシンのＮ末端側　１ＴｒｙのＮ末端
にシステインを入れて下 記アミノ酸配列 Ｈ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｙ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨで示されるペプチドを合成する。ペ
プチドの合成についてはＡＢＩ社ペプチド合成機を用い
ることができる。 Ｉ−ａ−■　　Ｎ末端（１５Ｐｒｏ−１９Ａｒｇ）合成
ペプチドの作成 ペプチド１５Ｐｒｏ−１９ＡｒｇのＮ末端にシステイン
を入れて下記アミノ酸配列 Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
−ＯＨ で示されるペプチドを合成する。

【００１３】Ｉ−ｂ　　合成ペプチドとキャリヤータン
パクとの結合 免疫にあたっては、免疫源のペプチドを比較的大きな分
子に変換して被免疫動物に投与する。ペプチドを大きな
分子に変換するには、ペプチドとキャリヤータンパクと
結合させる方法と他の高分子物質と結合させる方法があ
る。このキャリヤータンパクとしては、アルブミン、キ
ーホール　　リンペット　　ヘモシアニン（ＫＬＨ）ま
たはプロテインＡなどが挙げられるが、アルブミン、Ｋ
ＬＨが好ましい。また、他の高分子物質としては、ポリ
ビニルピロリドンの如き水溶性高分子が挙げられる。ペ
プチドとキャリヤータンパクとを結合させるに当たって
は、ペプチドのＣＯＯＨ末端基、ＮＨ２　末端基を用い
るか、あるいはキャリヤータンパクと結合しうる適当な
官能基を導入する。ペプチドのＣＯＯＨ末端基を利用す
る場合にはカルボジイミドを用い、一方、ＮＨ２　末端
基を利用する場合にはグルタルアルデヒドが好ましくは
使用される。さらに、特異的な結合を求める場合には、
ペプチドに例えばシステインなどのキャリヤータンパク
との結合性を有する官能基を導入して、キャリヤータン
パク側にマレイミド基またはジチオピリジル基を導入し
これを結合させることにより作成する。なかでもキャリ
ヤータンパクと結合しうる適当な官能基を導入する方法
が好ましい。適当な官能基としてはシステインが好まし
く使用される。キャリヤータンパクとの結合性を有する
官能基の導入はペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側のいずれ
でもよいが、なかでもＮ末端（　１Ｔｒｙ−１９Ａｒｇ
）合成ペプチドの場合はＮ末端側が好ましい。

【００１４】Ｉ−ｃ　　ポリクローナル抗体の作成前記
免疫源の免疫方法としては、高分子物質に変換されたペ
プチドをアジュバントに混ぜ、被免疫動物に投与しそれ
自体知られた方法に従って抗体を作成する方法が採用さ
れる。アジュバンドとしては、完全フロイントアジュバ
ンド、不完全フロイントアジュバンドまたは水酸化アル
ミニウムなどが使用される。また、免疫すべき動物とし
ては、山羊、ウサギ、馬、羊、犬、マウス、モルモット
、ブタなどがある。

【００１５】（ＩＩ）Ｃ末端５残基オステオカルシンフ
ラグメントに選択的に反応する抗体の採取ＩＩ−ａ　　
免疫源の作成 ＩＩ−ａ−■　　Ｃ末端（４５Ｐｈｅ−４９Ｖａｌ）合
成ペプチドの作成 ペプチド４５Ｐｈｅ−４９ＶａｌのＣ末端にシステイン
を入れて下記アミノ酸配列 Ｈ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ
−ＯＨ で示されるペプチドを合成する。ペプチドの合成にあた
っては、ＡＢＩ社のペプチド合成機を使用することがで
きる。 ＩＩ−ｂ　　合成ペプチドとキャリヤータンパクとの結
合Ｉ−ｂと同様にして好ましくはキャリヤータンパクと
の結合体を作成する。キャリヤータンパクとの結合体を
作成するにあたっては、システインなどのキャリヤータ
ンパクと結合性を有する官能基は合成ペプチドのＣ末端
側に導入することが好ましい。 ＩＩ−ｃ　　ポリクローナル抗体の作成Ｉ−ｃに準じて
作成することができる。

【００１６】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳述するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 実施例１（Ｎ末端１〜１９残基高選択性抗体の作成）（
１）免疫源の作成 （ア）Ｎ末端１９残基のペプチドの合成ヒト・オステオ
カルシンのＮ末端に特異的なアミノ酸配列１９残基のＮ
末端側にシステインを入れて図１に示すペプチドを合成
した。合成に際してはＡＢＩ社ペプチド合成機を用いた
。以下このペプチドの名称をＨＯｓｔ−Ｎ（１９）とし
た。 （イ）Ｎ末端５残基のペプチドの合成 ヒト・オステオカルシンのＮ末端１５〜１９残基のペプ
チドのＮ末端側にシステインを入れて図２に示すペプチ
ドを合成した。このペプチドの名称をＨＯｓｔ−Ｎ（１
５−１９）とした。 （ウ）合成ペプチド〔ＨＯｓｔ−Ｎ（１９）、ＨＯｓｔ
−Ｎ（１５−１９）〕とキャリヤータンパクとの結合体
の合成代表的なキャリヤータンパクであるキーホール　
　リンペット　　ヘモシアニン（ＫＬＨ）をＮ−（ｍ−
マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（
ＭＢＳ）によリマレイミド化した。一方、ＨＯｓｔ−Ｎ
（１９）またはＨＯｓｔ−Ｎ（１５−１９）を２−メル
カプトエタノールによりＳＨ基をフリーにし、ＭＢＳ化
ＫＬＨにＨＯｓｔ−Ｎ（１９）またはＨＯｓｔ−Ｎ（１
５−１９）を滴下しながら反応液をｐＨ６．０〜６．５
に保ちつつ反応させた。３時間反応後透析し、得られた
生成物を免疫源として用いた。 （エ）比較のための合成ペプチド−キャリヤータンパク
結合体の合成ヒト・オステオカルシンＮ末端１〜２０（
２１残基目システイン）、ヒト・オステオカルシン全分
子１〜４９をペプチド合成機により合成し、それぞれＨ
Ｏｓｔ−Ｎ（２０）、ＨＯｓｔ（１−４９）と命名した
。つぎにマレイミド化したＫＬＨとＨＯｓｔ−Ｎ（２０
）との結合体、およびジシクロヘキシルカルボジイミド
（ＤＣＣ）を用いてＨＯｓｔ（１−４９）とＫＬＨとの
結合体を作成した。

【００１７】（２）抗体の作成 （１）（ウ）および（エ）で作成した３種の合成ペプチ
ド、ＨＯｓｔ−Ｎ（１５−１９）、ＨＯｓｔ−Ｎ（２０
）、ＨＯｓｔ（１−４９）とＫＬＨとの結合体を完全フ
ロイントアジュバントと混合し家兎に免疫した。抗体価
の上昇を確認後、採血を行い、抗血清を採取した。一方
、ＨＯｓｔ−Ｎ（１９）、ＨＯｓｔ−Ｎ（１５−１９）
、ＨＯｓｔ（１−４９）のＫＬＨ結合体を完全フロイン
トアジュバンドと混合し、マウスに免疫した。抗体価の
上昇を確認後、採血を行い、抗血清を採取した。

【００１８】（３）抗体のＮ末端１〜１９残基特異性の
検討（固相抗原競合法） Ｎ末端１〜１９〔ＨＯｓｔ−Ｎ（１９）〕をその水溶液
を用いてマイクロプレートの固相に固定し、１％牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）にてアフターコート後、（２）で
調製した抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１９）抗体を１次抗体として
反応させた。２次抗体として抗家兎ＩｇＧ・ＨＲＰ標識
を反応させ、１次抗体量に依存した曲線が得られた。こ
れに基づいて至適な抗体量を決定し、液中にＨＯｓｔ−
Ｎ（１９）の量をかえ添加し競合的に反応させ、添加し
たＨＯｓｔ−Ｎ（１９）の量を横軸に、縦軸に固相に結
合した抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１９）抗体量に対応した量を示
した検量線が得られた。その検量線を用いてＨＯｓｔ−
Ｎ（１９）のかわりにＮａｔｉｖｅなヒト・オステオカ
ルシン〔ＨＯｓｔ（１−４９）〕を添加し同様に添加量
依存曲線を描いた。これらの結果を図３に示す。図中、
黒丸はＨＯｓｔ−Ｎ（１９）を添加した場合を、白丸は
ＨＯｓｔ（１−４９）を添加した場合を示す。

【００１９】同様に抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１５−１９）抗体
を用いて前記の操作を行い、その添加量依存曲線を得た
。結果を図４に示す。図中、黒三角はＨＯｓｔ−Ｎ（１
９）を添加した場合を、白三角はＨＯｓｔ（１−４９）
を添加した場合を示す。添加量依存曲線におけるＭａｘ
．ＯＤの１／２ＯＤを与える抗原量に基づいて反応比を
求めた。その結果、抗体のＨＯｓｔ−Ｎ（１９）選択性
は、抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１９）抗体は２．６倍、一方抗Ｈ
Ｏｓｔ−Ｎ（１５−１９）抗体の場合は４．３倍であっ
た。

【００２０】（４）抗体のＨＯｓｔ−Ｎ（１９）／ＨＯ
ｓｔ（１−４９）反応比の検討（固相抗原結合法）ＨＯ
ｓｔ−Ｎ（１９）、ＨＯｓｔ（１−４９）をバッファー
溶液にてマイクロプレートに固定し、１％ＢＳＡにてア
フターコート後、家兎抗ＨＯｓｔ（１−４９）抗体、同
抗ＨＯｓｔ−Ｎ（２０）抗体、同抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１５
−１９）抗体を用いて反応させた。次いで２次抗体とし
て抗家兎ＩｇＧ・ＨＲＰ標識を反応させ洗浄後発色反応
を行った。抗血清の希釈倍率を横軸に、固相に結合した
抗体量に対応した量（ＯＤ４２０ｎｍ　）を縦軸に示す
グラフを得た。これを図５に示す。図中黒丸はＨＯｓｔ
−Ｎ（１９）と結合した家兎抗ＨＯｓｔ（１−４９）抗
体を、黒三角はＨＯｓｔ−Ｎ（１９）と結合した家兎抗
ＨＯｓｔ−Ｎ（２０）抗体を、黒四角はＨＯｓｔ−Ｎ（
１９）と結合した家兎抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１５−１９）抗
体を、白丸はＨＯｓｔ（１−４９）と結合した家兎抗Ｈ
Ｏｓｔ（１−４９）抗体を、白三角はＨＯｓｔ（１−４
９）と結合した家兎抗ＨＯｓｔ−Ｎ（２０）抗体を、白
四角はＨＯｓｔ（１−４９）と結合した家兎抗ＨＯｓｔ
−Ｎ（１５−１９）抗体を示す。その結果、家兎抗ＨＯ
ｓｔ（１−４９）抗体のＨＯｓｔ−Ｎ（１９）／ＨＯｓ
ｔ（１−４９）反応比は約１／２５と抗ＨＯｓｔ（１−
４９）抗体はＨＯｓｔ（１−４９）に対して選択性が高
く、逆に家兎抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１５−１９）抗体の同反
応比は約１００／１とＨＯｓｔ−Ｎ（１９）に対して選
択性が高い結果が得られた。

【００２１】一方同様にマウス抗ＨＯｓｔ−Ｎ（２０）
抗体、同抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１９）抗体および同抗ＨＯｓ
ｔ−Ｎ（１５−１９）抗体を用いて反応させ、抗血清の
希釈倍率と固相に結合した抗体量に対応した量との関係
を得た。この関係を示すグラフを図６に示す。図中、黒
丸はＨＯｓｔ−Ｎ（１９）と反応したマウス抗ＨＯｓｔ
−Ｎ（２０）抗体を、黒三角はＨＯｓｔ−Ｎ（１９）と
反応したマウス抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１９）抗体を、黒四角
はＨＯｓｔ−Ｎ（１９）と反応したマウス抗ＨＯｓｔ−
Ｎ（１５−１９）抗体を、白丸はＨＯｓｔ（１−４９）
と反応したマウス抗ＨＯｓｔ−Ｎ（２０）抗体を、白三
角はＨＯｓｔ（１−４９）と反応したマウス抗ＨＯｓｔ
−Ｎ（１９）抗体を、白四角はＨＯｓｔ（１−４９）と
反応したマウス抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１５−１９）抗体を示
す。

【００２２】この結果、マウス抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１９）
抗体のＨＯｓｔ−Ｎ（１９）／ＨＯｓｔ（１−４９）反
応比は約４０／１、マウス抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１５−１９
）抗体の該反応比は約２５０／１とＨＯｓｔ−Ｎ（１９
）に対して高い選択性がうかがわれた。

【００２３】実施例２：Ｃ末端５残基高選択性抗体の作
成 （１）免疫源の作成 （ア）Ｃ末端５残基のペプチドの合成 ヒト・オステオカルシンのＣ末端に特異的なアミノ酸配
列５残基のＣ末端側にシステインを入れて図７に示すペ
プチドを合成し、このペプチドの名称をＨＯｓｔ−Ｃ（
５）とした。 （イ）免疫源とキャリヤータンパクの結合体の合成実施
例１（１）（ウ）に準じてＨＯｓｔ−Ｃ（５）とＫＬＨ
との結合体を合成した。 （２）抗体の作成 実施例１（２）に準じて作成した。

【００２４】（３）抗体のＣ末端５残基特異性の検討（
固相抗原競合法） Ｃ末端５残基〔ＨＯｓｔ−Ｃ（５）〕の水溶液を用いて
マイクロプレートに固定し、１％ＢＳＡにてアフターコ
ートした。次いで、１次抗体〔抗ＨＯｓｔ−Ｃ（５）抗
体〕を反応させ、２次抗体として抗家兎ＩｇＧ・ＨＲＰ
標識を反応させ、１次抗体量に依存した曲線を得た。抗
体量を５μｇ／ｍｌに固定しＨＯｓｔ−Ｃ（５）の濃度
を数種類かえて同抗体と共存させ、競合反応を行った。 次いで２次抗体を反応後発色を行い、添加したＨＯｓｔ
−Ｃ（５）量を横軸に、固相に結合した抗ＨＯｓｔ−Ｃ
（５）抗体量（すなわち発色のＯＤ）を縦軸に検量線を
得た。その検量線を用いてＮａｔｉｖｅなヒトオステオ
カルシン〔ＨＯｓｔ（１−４９）〕を添加し、添加量依
存曲線を得た。この結果を図８に示す。図中、黒四角は
ＨＯｓｔ−Ｃ（５）を添加した場合を、白四角はＨＯｓ
ｔ（１−４９）を添加した場合を示す。その結果、抗体
のＨＯｓｔ−Ｃ（５）選択性は３．９倍であった。

【００２５】

【発明の効果】本発明によれば、ヒト・オステオカルシ
ンのフラグメントに選択性の高い抗体を得ることができ
る。従って、これらの抗体を用いることによりヒト・オ
ステオカルシンのフラグメントに選択性の高い測定系が
構成しえ、その測定法は骨代謝のなかの骨吸収を反映す
ることが期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で合成したヒト・オステオカルシンＮ
末端１９残基のペプチド〔ＨＯｓｔ−Ｎ（１９）〕を示
す。

【図２】実施例１で合成したヒト・オステオカルシンＮ
末端１５〜１９残基のペプチド〔ＨＯｓｔ−Ｎ（１５−
１９）〕を示す。

【図３】実施例１において、抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１９）抗
体を用いた場合の添加量依存曲線を示す。

【図４】実施例１において、抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１５−１
９）抗体を用いた場合の添加量依存曲線を示す。

【図５】実施例１において、家兎抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１５
−１９）抗体のＨＯｓｔ−Ｎ（１９）に対する選択性を
示す。

【図６】実施例１において、家兎抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１５
−１９）抗体および抗ＨＯｓｔ−Ｎ（１９）抗体のＨＯ
ｓｔ−Ｎ（１９）に対する選択性を示す。

【図７】実施例２で合成したヒト・オステオカルシンＣ
末端５残基のペプチド〔ＨＯｓｔ−Ｃ（５）〕を示す。

【図８】実施例２において、抗ＨＯｓｔ−Ｃ（５）抗体
を用いた場合の添加量依存曲線を示す。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ヒト・オステオカルシンのＮ末端１〜
   １９残基以内のペプチドでそのペプチドのＣ末端が１９
   残基目であるペプチドを免疫して得られるヒト・オステ
   オカルシンフラグメントに対する抗体。
2. 【請求項２】　　ペプチドがヒト・オステオカルシンの
   Ｎ末端１０〜１９残基以内で、かつ４残基以上のアミノ
   酸が結合しているものである請求項１記載のヒト・オス
   テオカルシンフラグメントに対する抗体。
3. 【請求項３】　　ペプチドがそのＮ末端側にキャリヤー
   タンパクとの結合性を有する官能基が結合されているも
   のである請求項１または２記載のヒト・オステオカルシ
   ンフラグメントに対する抗体。
4. 【請求項４】　　官能基がシステインである請求項３記
   載のヒト・オステオカルシンフラグメントに対する抗体
   。
5. 【請求項５】　　ヒト・オステオカルシン１〜４９に反
   応性が低く、ヒト・オステオカルシンのＮ末端１〜１９
   に反応性の高い請求項１〜４のいずれか１項記載のヒト
   ・オステオカルシンフラグメントに対する抗体。
6. 【請求項６】　　固相抗原競合法によるヒト・オステオ
   カルシンのＮ末端１〜１９に対する反応とヒト・オステ
   オカルシン１〜４９に対する反応の反応比が２．５以上
   である請求項５記載のヒト・オステオカルシンフラグメ
   ントに対する抗体。
7. 【請求項７】　　固相抗原結合法による反応比が１０以
   上である請求項５記載のヒト・オステオカルシンフラグ
   メントに対する抗体。
8. 【請求項８】　　ヒト・オステオカルシンのＮ末端４５
   〜４９残基のペプチドを免疫して得られるヒト・オステ
   オカルシンフラグメントに対する抗体。
9. 【請求項９】　　ペプチドがそのＣ末端側にキャリヤー
   タンパクとの結合性を有する官能基が結合されているも
   のである請求項８記載のヒト・オステオカルシンフラグ
   メントに対する抗体。
10. 【請求項１０】　　官能基がシステインである請求項９
    記載のヒト・オステオカルシンフラグメントに対する抗
    体。
11. 【請求項１１】　　ヒト・オステオカルシン１〜４９に
    反応性が低く、ヒト・オステオカルシンのＮ末端４５〜
    ４９に反応性が高い請求項８〜１０のいずれか１項記載
    のヒト・オステオカルシンフラグメントに対する抗体。
12. 【請求項１２】　　固相抗原競合法によるヒト・オステ
    オカルシンのＮ末端４５〜４９残基のペプチドに対する
    反応とヒト・オステオカルシン１〜４９に対する反応の
    反応比が１．５以上である請求項１１記載のヒト・オス
    テオカルシンフラグメントに対する抗体。
13. 【請求項１３】　　固相抗原結合法によるヒト・オステ
    オカルシンのＮ末端４５〜４９残基のペプチドに対する
    反応とヒト・オステオカルシン１〜４９に対する反応の
    反応比が５．０以上である請求項１１記載のヒト・オス
    テオカルシンフラグメントに対する抗体。