CN113929777A

CN113929777A - 抗肌红蛋白的抗体、检测肌红蛋白的试剂盒和方法

Info

Publication number: CN113929777A
Application number: CN202010671335.1A
Authority: CN
Inventors: 崔鹏; 何志强; 孟媛; 钟冬梅; 叶颖; 覃婷; 王晨
Original assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2022-01-14

Abstract

本发明公开了一种抗肌红蛋白的抗体、检测肌红蛋白的试剂盒和方法，涉及抗体技术领域。本发明公开的抗体或其功能性片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区。该抗体或其功能性片段对肌红蛋白具有结合能力和较好的亲和力，使用该抗体或其功能性片段检测肌红蛋白的特异性和灵敏度较好。

Description

抗肌红蛋白的抗体、检测肌红蛋白的试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗肌红蛋白的抗体、检测肌红蛋白的试剂盒和方法。

背景技术

肌红蛋白(肌红蛋白globin,Mb)是哺乳动物细胞(主要是肌细胞)储存和分配氧的蛋白质，它的氧饱和曲线为双曲线型。它是由一条多肽链和一个辅基血红素构成，相对分子质量为16700，含 153个氨基酸残基。除去血红素的脱辅基肌红蛋白称珠蛋白(globin)，它和血红蛋白的亚基(a-珠蛋白链和P-珠蛋白链)在氨基酸序列具有明显的同源性，它们的构象和功能也极其相似。

肌红蛋白的多肽链中氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部,亲水侧链多位于分子表面,形成水溶性较好的水溶性较好的紧密球型三维结构，极性氨基酸分布在分子表面，内部存在一口袋形空穴，血红素在此空穴中保持稳定位置。这种构象非常有利于运氧和储氧功能，同时也使血红素在多肽链中保持稳定。肌红蛋白可逆地与氧结合，把氧从肌细胞附近毛细血管的血液通过细胞膜运到肌细胞中，以MbO₂形式暂时贮氧，并可携带氧在肌肉中运动,在肌肉急剧运动时把氧释放出来，以保障肌肉发生强烈代谢时对氧的需要。肌红蛋白表达水平的增加是动物对低氧适应的机制之一。因此，在低氧分压状态下，组织既可以通过肌红蛋白储存氧,同时也促进了氧向细胞内弥散,从而向线粒体供氧,有益于改善组织氧的弥散，因此肌红蛋白在O₂的贮存、PO₂的缓冲，促进氧的扩散起着重要作用。

急性心肌梗死临床上主要是由于各种诱因导致的心肌耗氧量急剧增加，冠心病患者由于冠状动脉已发生硬化、狭窄，不能充分扩张而造成持续性缺血缺氧，所以目前采用心肌钙蛋白I/肌红蛋白/ 肌酸激酶同工酶(CK-MB)的快速诊断试剂，可作为心肌梗死突发时的快速的辅助诊断。其中肌红蛋白可作为AMI(急性心肌梗死)的早期诊断标志物：通过动态检测二次血清肌红蛋白水平可早期诊断是否有急性心肌梗死发生。如第二次检测值明显高于第一次检测值，则具有极高的阳性预报价值。

肌红蛋白的检测可以用于对AMI的排除诊断：由于肌红蛋白半寿期短(15min)，胸痛发作后6～ 12小时不升高，有助于排除AMI的诊断，是筛查AMI很好的指标；如动态检测二次测定值间无差异，则具有100％的阴性预报价值，排除急性心肌梗死的可能性。

肌红蛋白的检测也可以估测心梗范围：可根据其动态变化曲线早期估计，肌红蛋白峰值小于参考值上限10倍，高峰期持续时间短的患者，心梗范围较小，而肌红蛋白峰值大于参考值上限10倍，高峰期持续时间较长或呈双峰、多峰的患者，心梗范围较大。

肌红蛋白的检测还可以观察有无再梗塞或者梗塞再扩展：由于在AMI后血中肌红蛋白很快从肾脏清除，发病l8～30小时内可完全恢复到正常水平。故肌红蛋白测定有助于在AMI病程中观察有无再梗塞或者梗塞再扩展。如峰值期持续时间较长，超过24小时，恢复正常缓慢，超过4天以上，或下降过程再度升高形成双峰、多峰，则提示可能发生心梗延展或新的部位又发生心梗。

此外肌红蛋白的检测对溶栓再通的判断，准确性可达95％以上；对于AMH的预测预后等方面也有深刻的临床应用价值。

肌红蛋白的测定方法早在1963年Reynafarje等人就建立了分光光度法，但该法敏感度差仅适用于含量较高标本的检测，随着分析技术的不断发展,又相继出现了高效液相色谱(HPLC)法、超滤法、分光光度法、电泳法及层析法、胶乳增强透射比浊法、以及基于免疫学原理的酶联免疫吸附法 (ELISA)，化学发光，胶体金等方法。分光光度法、高效液相色谱(HPLC)法,超滤法、分光光度法、电泳法及层析法需要的设备特殊、方法受到干扰的因素较多以及灵敏度不够等原因，不能被临床广泛应用，现在主流的还是基于免疫原理的酶联免疫吸附法(ELISA)，化学发光，胶体金等。

这些检测方法都是建立在特异单抗的基础上的，都需要针对于肌红蛋白的特异性单克隆抗体。目前用于检测肌红蛋白的单克隆抗体灵敏度、特异性以及亲和力上都存在一些缺陷，还有较大的改善空间，本领域针对检测肌红蛋白的单克隆抗体的仍然存在着强烈需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗肌红蛋白的抗体、检测肌红蛋白的试剂盒和方法。本发明提供的抗体或其功能性片段对肌红蛋白具有结合能力和较好的亲和力，使用该抗体或其功能性片段检测肌红蛋白的特异性和灵敏度较好，该抗体或其功能性片段可用于肌红蛋白的检测和肌红蛋白水平异常疾病的诊断，本发明为肌红蛋白的检测和肌红蛋白水平异常疾病的诊断提供了更多样的试剂选择。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供一种抗肌红蛋白的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

互补决定区CDR1-VH，其氨基酸序列为G-Y-T-X1-T-X2-F-S-X3-H，其中：X1是Y或F；X2是N、D或E；X3是L、V或I；

互补决定区CDR2-VH，其氨基酸序列为W-X1-N-X2-E-T-S-X3-P-T-Y-X4-D-D-F，其中： X1是L、V或I；X2是S或T；X3是Q或E；X4是A或G；

互补决定区CDR3-VH，其氨基酸序列为A-R-R-X1-Y-Y-X2-F-G，其中：X1是T或A；X2是L、V或I；

互补决定区CDR1-VL，其氨基酸序列为X1-A-S-X2-S-V-D-X3-X4-G-D-S-Y，其中：X1是R或 K；X2是Q或K；X3是F或Y；X4是N或D；

互补决定区CDR2-VL，其氨基酸序列为A-A-S-X1-R-X2-S，其中：X1是Q、H或N；X2是D或E；

互补决定区CDR3-VL，其氨基酸序列为Q-X1-S-N-E-X2-P-Y，其中：X1是Q或H；X2是E或D。

具有上述互补决定区的抗体或其功能性片段能够特异性结合肌红蛋白，对肌红蛋白具有较好的亲和力，使用包括上述互补决定区的抗体或其功能性片段检测肌红蛋白，具有较好的特异性和灵敏度，本发明提供的抗体或其功能性片段可用于辅助诊断肌红蛋白水平异常相关的疾病，为肌红蛋白的检测和肌红蛋白水平异常疾病的诊断提供了更多样的试剂选择。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VH中，X1是F；

所述互补决定区CDR2-VH中，X4是A；

所述互补决定区CDR1-VL中，X4是D；

所述互补决定区CDR2-VL中，X2是D；

所述互补决定区CDR3-VL中，X1是Q。

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段与肌红蛋白具有K_D≤6.02×10^- ⁹mol/L的亲和力；

在可选的实施方式中，K_D≤6×10^-9mol/L、K_D≤5×10^-9mol/L、K_D≤4×10^-9mol/L、K_D≤3×10^-9mol/L、 K_D≤2×10^-9mol/L、K_D≤1×10^-9mol/L、K_D≤9×10^-10mol/L、K_D≤8×10^- ¹⁰mol/L、K_D≤7×10^-10mol/L、K_D≤6 ×10^-10mol/L、K_D≤5×10^-10mol/L、K_D≤4×10^-10mol/L、K_D≤3×10^-10mol/L或K_D≤2×10^-10mol/L。

在可选的实施方式中，2.43×10^-10mol/L≤K_D≤8.81×10^-10mol/L。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VH中，X2是N。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VH中，X2是D。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VH中，X2是E。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VH中，X3是L。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VH中，X3是V。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VH中，X3是I。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR2-VH中，X1是L。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR2-VH中，X1是V。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR2-VH中，X1是I。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR2-VH中，X2是S。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR2-VH中，X2是T。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR2-VH中，X3是Q。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR2-VH中，X3是E。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR3-VH中，X1是T。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR3-VH中，X1是A。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR3-VH中，X2是L。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR3-VH中，X2是V。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR3-VH中，X2是I。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VL中，X1是R。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VL中，X1是K。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VL中，X2是Q。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VL中，X2是K。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VL中，X3是F。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VL中，X3是Y。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR2-VL中，X1是Q。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR2-VL中，X1是H。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR2-VL中，X1是N。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR3-VL中，X2是E。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR3-VL中，X2是D。

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区的突变位点选自下述突变组合 1-55中的任一种：

。

在可选的实施方式中，所述互补决定区CDR1-VH中，X1是Y；

所述互补决定区CDR2-VH中，X4是G；

所述互补决定区CDR1-VL中，X4是N；

所述互补决定区CDR2-VL中，X2是E；

所述互补决定区CDR3-VL中，X1是H。

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区的突变位点选自下述突变组合 56-64中的任一种：

。

在可选的实施方式中，所述抗体包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR1-L、 FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H 及FR4-H。

通常情况下，重链可变区(VH)和轻链的可变区(VL)可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其功能性片段的各骨架区氨基酸序列可以与上述对应骨架区(SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8)具有至少80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％的同源性。

在可选的实施方式中，所述抗体还包含恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在可选的实施方式中，所述恒定区来源于小鼠。

在可选的实施方式中，所述恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示，所述恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的VHH、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv 中的任意一种。

另一方面，本发明提供一种检测肌红蛋白的试剂或试剂盒，其包括如上任一项所述的抗体或其功能性片段。

上述抗体的功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。

上述抗体的功能片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

另一方面，本发明提供如上任一项所述的所述抗体或其功能性片段在制备用于诊断肌红蛋白水平异常的疾病的试剂或试剂盒中的应用。

在可选的实施方式中，肌红蛋白水平异常疾病选自急性心肌梗死和急性冠脉综合征中的一种。

另一方面，本发明提供一种检测肌红蛋白的方法，其包括：将如上任一项所述的抗体或其功能性片段与待测样本混合。

需要说明的是，本领域技术人员可以基于抗体/抗原结合形成免疫复合物的特点对待测样本中的肌红蛋白进行定性或定量检测。基于抗体抗原结合形成免疫复合物对抗原或抗体进行检测的方法包括：

(1)通过沉淀反应实现检测目的，包括：单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫比浊法、对流免疫电泳、免疫电泳以及免疫印迹法等；

(2)通过标记显示信号强度的指示剂实现检测目的，包括：免疫荧光法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法(例如双抗体夹心法、间接法或竞争法等)以及化学发光免疫分析法等。

指示剂可以根据不同的检测方法合理选择，包括但不限于如下描述的指示剂：

(a)免疫荧光法中，指示剂可以是荧光染料，例如是荧光素类染料(包括异硫氰酸荧光素(FITC) 羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料(包括红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料(包括Cy2、Cy3、Cy3B、 Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料(包括AlexaFluor350、405、430、488、 532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)、蛋白类染料(包括藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)；

(b)放射免疫分析法中，指示剂可以是放射性同位素，包括但不限于²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、 ¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、 ⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

(c)酶联免疫分析法中，指示剂可以是催化底物显色的酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶等)。

(d)化学发光免疫分析法中，指示剂可以是化学发光试剂，例如吖啶酯、辣根过氧化物酶和鲁米诺、碱性磷酸酶和AMPPD，电化学发光剂三联吡啶钌和三丙胺等。

基于此，在本发明公开了上述抗体或其功能性片段基础上，本领域技术人员容易想到采用上述的任意一种方法或几种方法的组合或其他的方法，以实现对待测样本中肌红蛋白的定量或定性检测，无论选用何种方法，只要是利用了本发明公开的抗体或其功能性片段来检测肌红蛋白，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所示指示剂选自荧光染料、放射性同位素、催化底物显色的酶和化学发光试剂中的任意一种。

另一方面，本发明提供一种载体，其含有编码如上任一项所述抗体或其功能性片段的核酸。

在可选的实施方式中，所述核酸为DNA或RNA。

在本发明公开了上述抗体或其功能性片段的氨基酸序列基础上，本领域技术人员根据氨基酸对应的密码子容易获得编码上述抗体或其功能性片段的核酸序列，并根据密码子的简并性，可以得到多种编码上述抗体或其功能性片段的核酸序列，无论是何种核酸序列，只要其编码上述抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其含有如上所述的载体。

载体中的上述核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是核酸序列以允许表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达，调节序列包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。

在本文中，载体可以指包含本发明的核酸或其片段的、能够携带遗传信息并且可以将遗传信息递送到细胞中的分子或试剂。典型的载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体，可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。

本发明的核酸或其片段可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体。这种新载体也是本发明的一部分。所述载体可以包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸DNA。本发明克隆载体和表达载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，可选的还包括编码使所述蛋白表达产物分泌或整合到膜上的信号肽序列，以及可选的还包括编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以不能被整合到宿主细胞基因组中。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。

另一方面，本发明提供一种生产如上所述的抗体或其功能性片段的方法，其包括：

培养如上所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到所述抗体或其功能性片段。

所述生产方法可以是例如，用编码至少一部分抗体或其功能性片段的核酸载体转染宿主细胞，在合适的条件下培养该宿主细胞使其表达该抗体或其功能性片段。宿主细胞也可以用一个或多个表达载体转染，该表达载体可以单独或结合地包含编码至少一部分抗体或其功能性片段的DNA。利用常规的纯化蛋白质和肽的技术可从培养基或细胞裂解物中分离抗体或其功能性片段，所述技术包括硫酸铵沉淀，层析(如离子交换，凝胶过滤，亲合层析等)和/或电泳。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1的肌红蛋白的单克隆抗体进行还原性的SDS-PAGE。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司 (AcademicPress，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》 (J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》 (F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

下文参考用于说明的实例应用描述了本发明的若干方面。应当理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的充分理解。然而，相关领域普通技术人员将很容易认识到，可以在没有具体细节中的一个或多个具体细节的情况下或用其它方法实践本发明。本发明不限于展示的活动或事件排序，因为一些活动可以以不同的顺序和/或与其它活动或者事件同时发生。此外，实施根据本发明的方法不需要所有展示的活动或事件。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMART^TM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。 pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen 公司完成。

1重组质粒的构建

(1)抗体基因制备

从抗肌红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(5G9)中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA 产物，该产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆各4个克隆送基因测序公司进行测序。

(2)抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为336bp，属于VkII基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；HeavyChain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为360bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

(3)重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM 3.4

vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、 BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.73kb的Light Chain基因片段和1.42kb的Heavy Chain基因片段。

Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI 双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

2稳定细胞株筛选

(1)重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul 细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

包被液稀释重组肌红蛋白(自产)到1ug/ml，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清， 100uL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100uL， 37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)， 10min；加入终止液(50uL/孔)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释 1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对肌红蛋白有活性。

(2)重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：Buffer 50ul、DNA 100ug/管、PuvⅠ酶10ul、无菌水补至500ul，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul 细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/L MSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×10⁶cells/ml，2.2ml 进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

3重组抗体生产

(1)细胞扩培

细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

(2)摇瓶生产及纯化

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第 13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，4μg 外来对照抗体作为对照，电泳图如图1所示，在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD (重链，SEQ ID NO.14)，另一条Mr为28KD(轻链，SEQ IDNO.13)。

实施例2

抗体的性能检测

(1)实施例1抗体及其突变体的活性检测

进一步分析，实施例1的肌红蛋白单克隆抗体(WT)的重链可变区如SEQ ID NO:12所示，其中，其中，各互补决定区的氨基酸序列如下：

CDR1-VH：G-Y-T-Y(X1)-T-E(X2)-F-S-V(X3)-H；

CDR2-VH：W-I(X1)-N-S(X2)-E-T-S-E(X3)-P-T-Y-G(X4)-D-D-F；

CDR3-VH：A-R-R-A(X1)-Y-Y-L(X2)-F-G；

其轻链可变区如SEQ ID NO:11所示，其中，轻链的各互补决定区的氨基酸序列如下：

CDR1-VL：R(X1)-A-S-K(X2)-S-V-D-F(X3)-N(X4)-G-D-S-Y；

CDR2-VL：A-A-S-Q(X1)-R-E(X2)-S；

CDR3-VL：Q-H(X1)-S-N-E-E(X2)-P-Y。

在实施例1的肌红蛋白单克隆抗体基础上，在互补决定区中对于抗体活性有关的位点进行突变，其中，X1、X2、X3、X4均为突变位点。见下表1。

表1与抗体活性有关的突变位点

结合活性检测：

包被液(PBS)稀释重组肌红蛋白到1μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的肌红蛋白单克隆抗体，100μl/孔，37℃，30min-60min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠 IgG-HRP，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液(PBS)清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔，含2.1g/L柠檬酸、12.25g/L柠檬酸、0.07g/L乙酰苯胺和0.5g/L过氧化脲)，加入显色液B液(50μl/ 孔，含1.05g/L柠檬酸、0.186g/LEDTA·2Na、0.45g/L TMB和0.2ml/L浓HCl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含0.75g/EDTA·2Na和10.2ml/L浓H₂SO₄)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD 值。结果见表2。

表2抗体及其突变体的活性数据

抗体浓度(ng/ml)	250	125	62.5	31.25	15.625	0
							WT	2.066	2.029	1.649	1.095	0.537	0.014
突变1	2.264	2.076	1.905	1.747	1.434	0.017
							突变2	2.115	2.010	1.890	1.732	1.425	0.024
突变3	2.107	2.057	1.875	1.754	1.429	0.046
							突变4	2.136	2.044	1.893	1.724	1.481	0.028
突变5	0.665	0.529	0.249	-	-	-
							突变6	0.541	0.324	0.126	-	-	-

从表2的活性数据可以看出，相较于突变5和突变6，WT以及突变1-突变4的结合活性更好，说明CDR1-VH X1和CDR2-VL X2位点的氨基酸残基类型对抗体结合活性有影响。

(2)实施例1抗体及其突变体的亲和力检测

(a)在突变1的基础上，对其他位点进行突变，各突变的序列见下表3。

表3与抗体亲和力有关的突变位点

亲和力检测：

利用AMC传感器，将纯化出来的抗体(表3中的突变抗体)用PBST稀释到1mg/ml，MYO蛋白用PBST进行梯度稀释；

运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育 180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。K_D表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。

表4亲和力检测数据

表4的数据显示，表3中的突变1及其系列突变抗体均具有较好的抗体亲和力，说明在突变1 的基础上，表3所示的突变方式对抗体亲和力不具有负面影响，按其突变，可以获得具有较好亲和力的抗体。

(b)在WT的基础上，对其他位点进行突变，并检测各突变体的亲和力，各突变的序列见下表 5，对应的亲和力数据见表6。

表5以WT为骨架进行的突变

表6以WT为骨架进行的突变的亲和力检测结果

	K<sub>D</sub>(M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)
				WT	4.56E-09	2.59E+04	1.18E-04
WT-1	4.10E-09	3.90E+04	1.60E-04
				WT-2	3.50E-09	3.49E+04	1.22E-04
WT-3	6.02E-09	3.29E+04	1.98E-04
				WT-4	3.82E-09	3.93E+04	1.50E-04
WT-5	5.21E-09	2.90E+04	1.51E-04
				WT-6	5.23E-09	3.52E+04	1.84E-04
WT-7	3.98E-09	4.42E+04	1.76E-04
				WT-8	4.12E-09	3.96E+04	1.63E-04

从表6数据可以看出，WT抗体及其突变其的亲和力不错，在WT的基础上，按表5所示突变位置和突变方式进行突变，获得的抗体对抗原具有不错的亲和力。

(3)裸抗稳定性考核

将上述实施例的抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14 天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21 天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降越势，说明自产抗体稳定。下表为突变1考核21天的酶免活性检测OD结果。

表7

抗体浓度(ng/ml)	125	31.25	0
				4℃，21天样品	2.117	1.734	0.019
-80℃，21天样品	2.067	1.743	0.059
				37℃，21天样品	2.142	1.727	0.041

从表7可以看出，在不同温度下存放21天后，本发明实施例的抗体依然可以将抗原检测出，说明本发明实施例提供的抗体具有较好的稳定性。

(4)性能评价

将突变1抗体与WT抗体作为包被抗体，分别与其他MYO标记抗体配套使用，在荧光快速诊断评台验证突变后抗体与WT抗体的性能水平，其特异性、灵敏度、临床一致性和相关性，测试500 份标本，具体性能见下表8：

表8

	特异性	灵敏度	一致性	相关性
					WT	99.9％	99.8％	100％	0.8949
突变1	100％	100％	100％	0.9537

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 东莞市朋志生物科技有限公司

<120> 抗肌红蛋白的抗体、检测肌红蛋白的试剂盒和方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys

20

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Asn Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 3

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr

1 5 10 15

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10 15

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

1 5 10 15

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

35 40 45

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

65 70 75 80

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

85 90 95

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 10

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Phe Asn

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Gln Arg Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn

85 90 95

Glu Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 12

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Glu Phe

20 25 30

Ser Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ser Glu Thr Ser Glu Pro Thr Tyr Gly Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Tyr Tyr Leu Phe Gly Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 13

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Phe Asn

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Gln Arg Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Asn

85 90 95

Glu Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

145 150 155 160

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

180 185 190

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

195 200 205

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 14

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Glu Phe

20 25 30

Ser Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ser Glu Thr Ser Glu Pro Thr Tyr Gly Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Tyr Tyr Leu Phe Gly Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala

195 200 205

Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys

210 215 220

Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro

290 295 300

Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val

305 310 315 320

Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr

325 330 335

Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys

340 345 350

Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp

355 360 365

Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser

385 390 395 400

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala

405 410 415

Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His

420 425 430

His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

Claims

1.一种抗肌红蛋白的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

互补决定区CDR2-VH，其氨基酸序列为W-X1-N-X2-E-T-S-X3-P-T-Y-X4-D-D-F，其中：X1是L、V或I；X2是S或T；X3是Q或E；X4是A或G；

互补决定区CDR1-VL，其氨基酸序列为X1-A-S-X2-S-V-D-X3-X4-G-D-S-Y，其中：X1是R或K；X2是Q或K；X3是F或Y；X4是N或D；

2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，

所述互补决定区CDR1-VH中，X1是F；

所述互补决定区CDR2-VH中，X4是A；

所述互补决定区CDR1-VL中，X4是D；

所述互补决定区CDR2-VL中，X2是D；

所述互补决定区CDR3-VL中，X1是Q；

优选的，所述抗体或其功能性片段与肌红蛋白具有K_D≤6.02×10^-9mol/L的亲和力；优选的，K_D≤8.81×10^-10mol/L；

优选的，所述互补决定区CDR1-VH中，X2是N；

优选的，所述互补决定区CDR1-VH中，X2是D；

优选的，所述互补决定区CDR1-VH中，X2是E；

优选的，所述互补决定区CDR1-VH中，X3是L；

优选的，所述互补决定区CDR1-VH中，X3是V；

优选的，所述互补决定区CDR1-VH中，X3是I；

优选的，所述互补决定区CDR2-VH中，X1是L；

优选的，所述互补决定区CDR2-VH中，X1是V；

优选的，所述互补决定区CDR2-VH中，X1是I；

优选的，所述互补决定区CDR2-VH中，X2是S；

优选的，所述互补决定区CDR2-VH中，X2是T；

优选的，所述互补决定区CDR2-VH中，X3是Q；

优选的，所述互补决定区CDR2-VH中，X3是E；

优选的，所述互补决定区CDR3-VH中，X1是T；

优选的，所述互补决定区CDR3-VH中，X1是A；

优选的，所述互补决定区CDR3-VH中，X2是L；

优选的，所述互补决定区CDR3-VH中，X2是V；

优选的，所述互补决定区CDR3-VH中，X2是I；

优选的，所述互补决定区CDR1-VL中，X1是R；

优选的，所述互补决定区CDR1-VL中，X1是K；

优选的，所述互补决定区CDR1-VL中，X2是Q；

优选的，所述互补决定区CDR1-VL中，X2是K；

优选的，所述互补决定区CDR1-VL中，X3是F；

优选的，所述互补决定区CDR1-VL中，X3是Y；

优选的，所述互补决定区CDR2-VL中，X1是Q；

优选的，所述互补决定区CDR2-VL中，X1是H；

优选的，所述互补决定区CDR2-VL中，X1是N；

优选的，所述互补决定区CDR3-VL中，X2是E；

优选的，所述互补决定区CDR3-VL中，X2是D；

优选的，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区的突变位点选自下述突变组合1-55中的任一种：

。

3.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，

所述互补决定区CDR1-VH中，X1是Y；

所述互补决定区CDR2-VH中，X4是G；

所述互补决定区CDR1-VL中，X4是N；

所述互补决定区CDR2-VL中，X2是E；

所述互补决定区CDR3-VL中，X1是H；

优选的，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区的突变位点选自下述突变组合56-64中的任一种：

。

4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H；

优选的，所述抗体还包含恒定区；

优选的，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区；

优选的，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人；

优选的，所述恒定区来源于小鼠；

优选的，所述恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示，所述恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示；

优选的，所述功能性片段选自所述抗体的VHH、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

5.一种检测肌红蛋白的试剂或试剂盒，其特征在于，其包括：将权利要求1-4任一项所述的抗体或其功能性片段。

6.权利要求1-4任一项所述的所述抗体或其功能性片段在制备用于诊断肌红蛋白水平异常的疾病的试剂或试剂盒中的应用；

优选的，肌红蛋白水平异常疾病选自急性心肌梗死和急性冠脉综合征中的一种。

7.一种检测肌红蛋白的方法，其特征在于，其包括：将权利要求1-4任一项所述的抗体或其功能性片段与待测样本混合；

优选的，所述方法是通过沉淀反应实现肌红蛋白检测的方法或者是通过标记显示信号强度的指示剂实现肌红蛋白检测的方法；

优选地，所述通过沉淀反应实现肌红蛋白检测的方法选自如下方法中的任意一种或几种：单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫比浊法、对流免疫电泳、免疫电泳以及免疫印迹法；

优选地，所述通过标记显示信号强度的指示剂实现肌红蛋白检测的方法选自如下方法中的任意一种或几种：免疫荧光法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法以及化学发光免疫分析法；

优选地，所示指示剂选自荧光染料、放射性同位素、催化底物显色的酶和化学发光试剂中的任意一种。

8.一种载体，其特征在于，其含有编码如权利要求1～4任一项所述抗体或其功能性片段的核酸。

9.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求8所述的载体。

10.一种生产权利要求1～4任一项所述的抗体或其功能性片段的方法，其特征在于，其包括：

培养权利要求9所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到所述抗体或其功能性片段。