JP7339338B2 - 抗ヒトn末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の組換え抗体 - Google Patents
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Description
本願は、2018年12月19日に中国特許局に提出した、中国特許出願第201811557468.5号で、名称が「抗ヒトN末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の組換え抗体」である中国特許出願の優先権を主張する。この中国特許出願の全文を本願に引用している。
相補性決定領域CDR-VH1はG-X1-S-X2-T-T-Y-Y-X3-Dであり、ここで、
X1がP又はFであり、X2がI、V又はLであり、X3がI、V又はLであり、
相補性決定領域CDR-VH2はM-T-K-D-X1-N-A-V-H-X2-P-T-X3-R-Sであり、ここで、
X1がG又はAであり、X2がQ又はNであり、X3がI、V又はLであり、
相補性決定領域CDR-VH3はV-X1-G-X2-I-D-X3-Gであり、ここで、
X1がK又はRであり、X2がI、V又はLであり、X3がF又はWであり、
相補性決定領域CDR-VL1はG-S-S-D-X1-V-G-X2-G-D-Y-X3-Nであり、ここで、
X1がQ又はNであり、X2がF又はPであり、X3がI、V又はLであり、
相補性決定領域CDR-VL2はI-F-X1-A-X2-S-R-X3-R-Gであり、ここで、
X1がA又はGであり、X2がT、Y又はSであり、X3がI、V又はLであり、
相補性決定領域CDR-VL3はG-S-X1-N-S-R-X2-Y-V-X3-Gであり、ここで、
X1がP、A又はGであり、X2がGG又はNであり、X3がW又はFである。
前記相補性決定領域CDR-VH1では、X1がFであり、
前記相補性決定領域CDR-VH2では、X1がGであり、
前記相補性決定領域CDR-VH3では、X1がRであり、
前記相補性決定領域CDR-VL1では、X2がFであり、
前記相補性決定領域CDR-VL2では、X1がGであり、
前記相補性決定領域CDR-VL3では、X3がFである。
軽鎖定常領域配列はSEQ ID NO:9で示され、
重鎖定常領域配列はSEQ ID NO:10で示される。
上記記載の宿主細胞を培地で適切な培養条件において培養し、培地又は培養された宿主細胞から、このように生じた結合タンパク質を回収するステップを含む、生産方法にさらに関する。
a)十分に抗体/抗原結合反応が発生できる条件において、前記テストサンプル中のNT-proBNP抗原を上記記載の結合タンパク質と接触させて免疫複合体を形成するステップと、
b)前記テストサンプル中の前記NT-proBNPの存在を指示する前記免疫複合体の存在を検出するステップと、を含む、検出方法にさらに関する。
A)十分に結合反応が発生できる条件において、被験者からのサンプルを本開示に記載の結合タンパク質と接触させて結合反応させるステップと、
B)結合反応の生じた免疫複合体を検出するステップと、を含み、
前記免疫複合体の存在は、NT-proBNPに関連する疾患の存在を指示するか、又は、心臓機能レベルを指示する、方法にさらに関する。
「抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質」は、広く、CDR領域を含む全てのタンパク質/タンパク質断片を指す。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗体の抗原化合物の結合断片を含み、Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、二重特異性抗体、抗体の最小識別単位、及びこれらの抗体と断片の一本鎖誘導体を含む。抗体のタイプは、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgDから選択することができる。また、「抗体」という用語は、天然に生じる抗体及び非天然に生じる抗体を含み、例えばキメラ(chimeric)、二元機能型(bifunctional)及びヒト由来型(humanized)の抗体、及び関連する合成アイソフォーム(isoforms)を含む。「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」と互換的に使用できる。
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
本開示は、抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質に関し、前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも1つの相補性決定領域を含むか、又は、以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも80%の配列同一性を有し、かつNT-proBNPとはKD≦2.26×10-8の親和性を有し、
相補性決定領域CDR-VH1はG-X1-S-X2-T-T-Y-Y-X3-Dであり、ここで、
X1がP又はFであり、X2がI、V又はLであり、X3がI、V又はLであり、
相補性決定領域CDR-VH2はM-T-K-D-X1-N-A-V-H-X2-P-T-X3-R-Sであり、ここで、
X1がG又はAであり、X2がQ又はNであり、X3がI、V又はLであり、
相補性決定領域CDR-VH3はV-X1-G-X2-I-D-X3-Gであり、ここで、
X1がK又はRであり、X2がI、V又はLであり、X3がF又はWであり、
相補性決定領域CDR-VL1はG-S-S-D-X1-V-G-X2-G-D-Y-X3-Nであり、ここで、
X1がQ又はNであり、X2がF又はPであり、X3がI、V又はLであり、
相補性決定領域CDR-VL2はI-F-X1-A-X2-S-R-X3-R-Gであり、ここで、
X1がA又はGであり、X2がT、Y又はSであり、X3がI、V又はLであり、
相補性決定領域CDR-VL3はG-S-X1-N-S-R-X2-Y-V-X3-Gであり、ここで、
X1がP、A又はGであり、X2がGG又はNであり、X3がW又はFである。
又は8.10×10-10mol/L≦KD≦2.26×10-8mol/Lであり、
又はKDは、1×10-9mol/L、2×10-9mol/L、3×10-9mol/L、4×10-9mol/L、4.5×10-9mol/L、5×10-9mol/L、6×10-9mol/L、7×10-9mol/L、8×10-9mol/L、9×10-9mol/L、1×10-10mol/L、3×10-10mol/L、5×10-10mol/L、7×10-10mol/L、9×10-10mol/L又は1×10-8mol/L以下である。
前記相補性決定領域CDR-VH1では、X1がFであり、
前記相補性決定領域CDR-VH2では、X1がGであり、
前記相補性決定領域CDR-VH3では、X1がRであり、
前記相補性決定領域CDR-VL1では、X2がFであり、
前記相補性決定領域CDR-VL2では、X1がGであり、
前記相補性決定領域CDR-VL3では、X3がFである。
scFv(sc=一本鎖)、二重特異性抗体(diabodies)。
1つ又は複数の実施形態においては、前記定常領域は羊に由来し、
軽鎖定常領域配列はSEQ ID NO:9で示され、
重鎖定常領域配列はSEQ ID NO:10で示される。
培地で適切な培養条件において上記記載の宿主細胞を培養し、培地又は培養された宿主細胞から、このように生じた結合タンパク質を回収するステップを含む、生産方法にさらに関する。
a)十分に抗体/抗原結合反応が発生できる条件において、前記テストサンプル中のNT-proBNP抗原を上記記載の結合タンパク質と接触させて免疫複合体を形成するステップと、
b)前記テストサンプル中の前記NT-proBNPの存在を指示する前記免疫複合体の存在を検出するステップと、を含む、検出方法にさらに関する。
A)十分に結合反応が発生できる条件において、被験者からのサンプルを本開示に記載の結合タンパク質と接触させて結合反応させるステップと、
B)結合反応の生じた免疫複合体を検出するステップと、を含み、
前記免疫複合体の存在は、NT-proBNPに関連する疾患の存在を指示するか、又は、心臓機能レベルを指示する、方法にさらに関する。
本実施例は、抗ヒトNT-proBNPの組換え抗体の例示的な製造方法を提供する。
本実施例では、制限エンドヌクレアーゼ、Prime Star DNAポリメラーゼは、Takara社から購入された。
MagExtractor-RNA抽出キットは、TOYOBO社から購入された。
BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kitキットは、Takara社から購入された。
pMD-18Tベクターは、Takara社から購入された。
プラスミド抽出キットは、天根公司から購入された。
プライマー合成及び遺伝子の配列測定は、Invitrogen社で完了された。
重鎖及び軽鎖の5’RACE上流プライマーの増幅:
SMARTER II Aオリゴヌクレオチド:
5’> AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3’、
5’-RACE CDSプライマー(5’-CDS):5’>(T)25VN<3’(N=A、C、G、又はT、V=A、G、又はC)、
ユニバーサルプライマーA混合物(UPM):
5’> CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’、
ネステッドユニバーサルプライマーA(NUP):
5’> AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’、
mkR:5’>CCCGAATTCCTAAGAACACTCTGAGGGCTTCACTG<3’、
mHR:5’>CCCGAATTCTCATTTACCCGGAGGCTTAGAGAT<3’。
Anti-NT-proBNP 8B9モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株からRNAを抽出し、SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kitキット及びキットにおけるSMARTER II Aオリゴヌクレオチド及び5’-CDSプライマーで第一鎖cDNAの合成を行い、取得された第一鎖cDNA産物をPCR増幅テンプレートとした。軽鎖遺伝子をユニバーサルプライマーA混合物(UPM)、ネステッドユニバーサルプライマーA(NUP)及びmkRで増幅させ、重鎖遺伝子をユニバーサルプライマーA混合物(UPM)、ネステッドユニバーサルプライマーA(NUP)及びmHRで増幅させた。軽鎖のプライマーペアにより0.7KBほどの目的バンドを増幅し出し、重鎖のプライマーペアにより1.4KBほどの目的バンドを増幅し出した。アガロースゲル電気泳動で精製回収し、産物をrTaq DNAポリメラーゼでA付加反応(Aを付加する反応)を行ってpMD-18Tベクターに挿入し、DH5αコンピテント細胞に形質転換し、コロニが成長した後、それぞれ重鎖及び軽鎖遺伝子クローンの4つのクローンをInvitrogen社に送って序列測定を行った。
上記序列測定して得られた遺伝子配列をIMGT抗体データベースに入れて分析し、VNTI11.5ソフトウェアを利用して分析して、重鎖及び軽鎖プライマーペアの増幅した遺伝子が全て正確であると決定し、ここで、軽鎖の増幅した遺伝子断片では、VL遺伝子配列は402bpであり、VkII遺伝子ファミリに属し、その前に60bpのリーダーペプチド配列があり、重鎖プライマーペアの増幅した遺伝子断片では、VH遺伝子配列は402bpであり、VH1遺伝子ファミリに属し、その前に57bpのリーダーペプチド配列があった。
pcDNATM 3.4 TOPO(登録商標)ベクターは、構築された組換え抗体の真核発現ベクターであり、該発現ベクターは、HindIII、BamHI、EcoRIなどのポリクローナル酵素切断部位が導入されており、pcDNA 3.4A発現ベクターとして命名され、以下、3.4A発現ベクターと略称される。上記pMD-18Tにおける抗体の可変領域遺伝子の配列決定結果に基づき、Anti-NT-pro BNP 8B9抗体のVL及びVHの遺伝子特異性プライマーを設計し、プライマーの両端にそれぞれHindIII、EcoRI酵素切断部位及び保護塩基を持ち、プライマーは、以下のとおりであった。
5’>CCCAAGCTTGCCACCATGAACCCACTGTGGACCCTCCTCTTT<3’、
NT-proBNP 8B9-HR:
5’>CCCGAATTCTCATTTACCCGGAGGCTTAGAGAT<3’、
NT-proBNP 8B9-LF:
5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGCCTGGTCCCCTCTGCTCCTCAC<3’、
NT-proBNP 8B9-LR:
5’>CCCGAATTCCTAAGAACACTCTGAGGGCTTCACTG<3’、
PCR増幅方法により0.7KBの軽鎖遺伝子断片及び1.4kBの重鎖遺伝子断片を増幅させた。重鎖及び軽鎖遺伝子断片をそれぞれHindIII/EcoRIで二重酵素切断し、3.4AベクターをHindIII/EcoRIで二重酵素切断し、また、断片及びベクターを精製回収した後に、重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子をそれぞれ3.4A発現ベクターに連結し、それぞれ重鎖及び軽鎖の組換え発現プラスミドを得た。
S21 組換え抗体発現プラスミドでCHO細胞を一過性形質転換し、発現プラスミドの活性を確定すること
プラスミドを超純水で400ng/mlに希釈し、遠心チューブにおいてCHO細胞を1.43×107cells/mlに調整し、100μlのプラスミドを700μlの細胞と混合し、電気的形質転換用カップに移し、電気的形質転換を行い、3日目、5日目、7日目にサンプリングして計数し、7日目にサンプリングして検出した。
Buffer 50μl、DNA 100μg/チューブ、Puv I酵素 10μlという試薬を用意し、無菌水で500μlに補充し、37℃で一晩水浴しながら酵素切断し、まず等体積のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(下層)25:24:1で抽出し、次にクロロホルム(水相)で抽出し、0.1倍の体積(水相)の3M酢酸ナトリウム及び2倍の体積のエタノールで氷において沈殿させ、70%のエタノールで沈殿を洗浄し、有機溶剤を除去し、エタノールが完全に揮発した後に、適量の滅菌水で再び溶かし、最後に濃度を測定した。
プラスミドを超純水で400ng/mlに希釈し、遠心チューブにおいてCHO細胞を1.43×107cells/mlに調整し、100μlのプラスミドを700μlの細胞と混合し、電気的形質転換用カップに移し、電気的形質転換を行い、次の日に計数し、25μmol/Lのメチオニンスルホキシミンを96ウェルに入れて約25日加圧培養した。
S31 細胞の拡大培養
細胞を復活させた後に、まず125ml仕様の振とうフラスコにおいて培養し、接種体積が30mlであり、培地が100%のDynamis培地であり、回転数が120r/minで、温度が37℃で、二酸化炭素が8%である揺とう器に置いた。72h培養し、50万cells/mlの接種密度で接種して拡大培養を行い、拡大培養体積を生産需要に応じて計算し、培地が100%のDynamis培地であった。次に72hおきに1回拡大培養した。細胞量が生産ニーズを満たすとき、接種密度を50万cells/mlほどに厳密に制御して生産した。
振とうフラスコパラメータは、回転数120r/min、温度37℃、二酸化炭素8%であった。材料の流加供給:振とうフラスコにおいて72h培養してから、毎日に供給し、HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7aは、毎日に初期培養体積の3%を流加し、Feed 7bの毎日の流加量は、初期培養体積の千分の一であり、12日目まで補充した(12日目に供給した)。グルコース3g/Lを6日目に供給した。13日目にサンプリングした。proteinA親和クロマトグラフィーカラムで親和精製を行った。4μgの精製された抗体に対して還元性SDS-PAGEを行い、4μgの外部の対照抗体を対照とし、電気泳動図は図1に示された。還元性SDS-PAGE後に2本のバンドが示され、一方のMrが50KD(重鎖)であり、他方のMrが28KD(軽鎖)であった。
抗体の親和性分析及び活性同定
実施例1で得られた抗体は、分析によれば、配列がSEQ ID NO:11で示される軽鎖及び12で示される重鎖を有する。
CDR-VH1はG-P(X1)-S-I(X2)-T-T-Y-Y-I(X3)-Dであり、
CDR-VH2はM-T-K-D-A(X1)-N-A-V-H-Q(X2)-P-T-I(X3)-R-Sであり、
CDR-VH3はV-K(X1)-G-I(X2)-I-D-W(X3)-Gであり、
軽鎖の相補性決定領域:
CDR-VL1はG-S-S-D-Q(X1)-V-G-P(X2)-G-D-Y-V(X3)-Nであり、
CDR-VL2はI-F-A(X1)-A-T(X2)-S-R-I(X3)-R-Gであり、
CDR-VL3はG-S-P(X1)-N-S-R-GG(X2)-Y-V-W(X3)-Gであり、
ここで、X1、X2、X3は、いずれも突然変異対象の部位である。
活性同定と同じ方法の酵素免疫測定法でデータを作成し、3μg/ml、1.5μg/ml、0.75μg/ml、0.375μg/mlの4つの勾配でコーディングし、抗体を1000ng/mlから開始し、0.977ng/mlまでに2倍勾配希釈してロードした。異なるコーディング濃度で異なる抗体濃度に対応するOD値を得た。同じコーディング濃度で、抗体濃度を横座標とし、OD値を縦座標とし、データを用いて図を構築し、フィッティング方程に基づき、最大OD値の50%での抗体濃度を計算し、式K=(n-1)/(2×(n×Ab`-Ab))に代入して親和性定数の逆数を計算し、但し、Ab及びAb`は、それぞれ、対応するコーディング濃度(Ag、Ag`)において最大OD値の50%での抗体濃度を表し、n=Ag/Ag`、2つずつのコーディング濃度を組合せて1つのK値を計算することができ、最後に6つのK値を得ることができ、これらの平均数値を求め、その逆数を親和性定数KDとして計算した。
抗体を4℃(冷蔵庫)、-80℃(冷蔵庫)、37℃(恒温器)において21日放置し、7日目、14日目、21日目にサンプリングして状態観察を行い、21日目のサンプルに対して活性テストを行い、結果により、3つの観察条件において抗体を21日放置しても、いずれも、タンパク質の顕著な状態変化が見られず、活性が観察温度の上昇とともに低下傾向を呈せしないことが示され、自社製の抗体が安定することが示された。以下の表は突然変異1を21日目に観察した酵素免疫の活性テストのOD結果である。
出願者は、表4における上記抗体及び自社の他の抗体(元のWT配列の抗体とペアされる抗体)に対してペア抗体の実験検証を行い、二重抗体サンドイッチ法のペア実験により検証した結果、特異性がいずれも原の高いレベルを維持したが、突然変異抗体の活性及び親和性が高くなるため、より高い感度が示された。
Claims (19)
- N末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質であって、
前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列から選ばれる6つの相補性決定領域を含み、
相補性決定領域CDR-VH1はG-X1-S-X2-T-T-Y-Y-X3-Dであり、ここで、
X1がFであり、X2がI、V又はLであり、X3がI、V又はLであり、
相補性決定領域CDR-VH2はM-T-K-D-X1-N-A-V-H-X2-P-T-X3-R-Sであり、ここで、
X1がGであり、X2がQ又はNであり、X3がI、V又はLであり、
相補性決定領域CDR-VH3はV-X1-G-X2-I-D-X3-Gであり、ここで、
X1がRであり、X2がI、V又はLであり、X3がF又はWであり、
相補性決定領域CDR-VL1はG-S-S-D-X1-V-G-X2-G-D-Y-X3-Nであり、ここで、
X1がQ又はNであり、X2がFであり、X3がI、V又はLであり、
相補性決定領域CDR-VL2はI-F-X1-A-X2-S-R-X3-R-Gであり、ここで、
X1がGであり、X2がT、Y又はSであり、X3がI、V又はLであり、
相補性決定領域CDR-VL3はG-S-X1-N-S-R-X2-Y-V-X3-Gであり、ここで、
X1がP、A又はGであり、X2がGG又はNであり、X3がFであり、
6つの前記相補性決定領域の突然変異部位は、以下の突然変異組合せから選ばれるいずれかである、ことを特徴とする分離される結合タンパク質。
- F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、二重特異性抗体及び抗体最小識別単位のうちの1つである、ことを特徴とする請求項1に記載のN末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。
- 配列が順にSEQ ID NO:l乃至SEQ ID NO:4で示される軽鎖フレームワーク領域FR-L1、FR-L2、FR-L3及びFR-L4、及び/又は、配列が順にSEQ ID NO:5乃至SEQ ID NO:8で示される重鎖フレームワーク領域FR-H1、FR-H2、FR-H3及びFR-H4を含む、ことを特徴とする請求項1に記載のN末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。
- 抗体の定常領域の配列をさらに含む、ことを特徴とする請求項1に記載のN末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。
- 前記定常領域の配列は、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgDから選ばれるいずれかの定常領域の配列である、ことを特徴とする請求項4に記載のN末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。
- 前記定常領域は、牛、馬、乳牛、豚、綿羊、山羊、ラット、マウス、犬、猫、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、闘鶏又はヒトの物種に由来する、ことを特徴とする請求項4に記載のN末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。
- 前記定常領域は羊に由来し、
軽鎖定常領域配列はSEQ ID NO:9で示され、
重鎖定常領域配列はSEQ ID NO:10で示される、ことを特徴とする請求項6に記載のN末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。 - 信号強度を示す指示薬で標識された、ことを特徴とする請求項6に記載のN末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。
- DNA又はRNAであり、請求項1~8のいずれかに記載の結合タンパク質をコードする、ことを特徴とする分離される核酸分子。
- 請求項9に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項10に記載のベクターで形質転換される、宿主細胞。
- 培地で適切な培養条件において請求項11に記載の宿主細胞を培養し、培地又は培養された宿主細胞から、このように生じた結合タンパク質を回収するステップを含む、ことを特徴とする請求項1~8のいずれかに記載の結合タンパク質の生産方法。
- 請求項1~8のいずれかに記載の結合タンパク質の、心不全を診断する及び心臓機能を評価するための診断剤の製造における使用。
- テストサンプル中のNT-proBNPの検出方法であって、
a)十分に抗体/抗原結合反応が発生できる条件において、前記テストサンプル中のNT-proBNP抗原を請求項1~8に記載の結合タンパク質と接触させて免疫複合体を形成するステップと
b)前記テストサンプル中の前記NT-proBNPの存在を指示する前記免疫複合体の存在を検出するステップと、を含む、検出方法。 - ステップa)では、前記免疫複合体は、前記結合タンパク質に結合される第2の抗体をさらに含む、ことを特徴とする請求項14に記載のテストサンプル中のNT-proBNPの検出方法。
- ステップa)では、前記免疫複合体は、前記NT-proBNPに結合される第2の抗体をさらに含む、ことを特徴とする請求項14に記載のテストサンプル中のNT-proBNPの検出方法。
- 蛍光免疫技術、化学発光技術、金コロイド免疫技術、放射免疫分析及び/又は酵素結合免疫技術に基づくものである、ことを特徴とする請求項14に記載のテストサンプル中のNT-proBNPの検出方法。
- 前記サンプルは、全血、末梢血、血清、血漿又は心筋組織から選ばれる少なくとも1種である、ことを特徴とする請求項14に記載のテストサンプル中のNT-proBNPの検出方法。
- 請求項1~8のいずれかに記載の結合タンパク質を含むキット。
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