JP7339338B2 - 抗ヒトｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の組換え抗体 - Google Patents

抗ヒトｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の組換え抗体 Download PDF

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Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１８年１２月１９日に中国特許局に提出した、中国特許出願第２０１８１１５５７４６８.５号で、名称が「抗ヒトＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の組換え抗体」である中国特許出願の優先権を主張する。この中国特許出願の全文を本願に引用している。
本開示は、免疫技術分野に関し、具体的には、抗ヒトＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の組換え抗体に関する。
１９８８年に日本学者Ｓｕｄｏｈは初めて豚の脳から分離して、高い利尿、血管拡張及び血圧低減作用を有するポリペプチドを取得し、脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｂｒａｉｎ Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＢＮＰ）と命名する。ＢＮＰは心臓に最も多く分布しているが、心筋細胞はまず１０８個のアミノ酸を含有するｐｒｏ ＢＮＰ（ＢＮＰ前駆体）を合成し、心筋細胞が刺激を受けると、ｐｒｏ ＢＮＰはエンドヌクレアーゼの作用で、７６個のアミノ酸を含有する、生物活性がないＮ末端プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏ ＢＮＰ）、及び３２個のアミノ酸を含有する、活性を有するＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）に開裂され、両者の由来が同じでありかつ等モルで分泌して放出されて血液循環に入る。
心臓容量負荷が増加したり心臓機能が損なわれたりすると、Ｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）とＢＮＰの指標濃度が異常に高くなる。ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰはＢＮＰに比べて生体安定性が高く、半減期が長く（１２０min）、濃度が比較的安定し、有効検出時間が長く、血液中の含有量がＢＮＰより約１６～２０倍高いため、検出が容易であり、血漿サンプルの体外での安定性が長く（＞４８ｈ）、心不全を診断し、心臓機能を評価する最適な心筋マーカーである。
正常なヒトの血液中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの含有量は一般的に０.３ng/mLより低い。心臓機能が損なわれ、心筋が拡張されると、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰは迅速に合成され、大量分泌放出されて人体の血液中に入る。いくつかの関連した初期病症を発見するとき、正確で、敏感で、効率的かつ安定して血液中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの量を検出することで、初期の心機能不全、心衰弱、呼吸困難の心原性と非心原性の心衰弱の治療と予後モニタリング、急性冠動脈症候群の層別化などに迅速かつ正確な早期診断の根拠を提供することができる。現在、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ含有量を検出するための方法は、主に金コロイド定性試験、蛍光免疫法、酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）及び化学発光微粒子免疫測定法（ＣＭＩＡ）があるが、これらの測定方法はＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに対する特異性モノクローナル抗体を必要とし、現在、中国内ではＮＴ－ｐｒｏＢＮＰを検出するためのモノクローナル抗体の感度、特異性がいずれも理想的ではない。
本開示は、新規なＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質に関し、該結合タンパク質の製造、使用などについて研究する。
前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域を含むか、又は、以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつＮＴ－ｐｒｏＢＮＰとはＫD≦２.２６×１０-8の親和性を有し、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１はＧ－Ｘ１－Ｓ－Ｘ２－Ｔ－Ｔ－Ｙ－Ｙ－Ｘ３－Ｄであり、ここで、
Ｘ１がＰ又はＦであり、Ｘ２がＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３がＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２はＭ－Ｔ－Ｋ－Ｄ－Ｘ１－Ｎ－Ａ－Ｖ－Ｈ－Ｘ２－Ｐ－Ｔ－Ｘ３－Ｒ－Ｓであり、ここで、
Ｘ１がＧ又はＡであり、Ｘ２がＱ又はＮであり、Ｘ３がＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３はＶ－Ｘ１－Ｇ－Ｘ２－Ｉ－Ｄ－Ｘ３－Ｇであり、ここで、
Ｘ１がＫ又はＲであり、Ｘ２がＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３がＦ又はＷであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１はＧ－Ｓ－Ｓ－Ｄ－Ｘ１－Ｖ－Ｇ－Ｘ２－Ｇ－Ｄ－Ｙ－Ｘ３－Ｎであり、ここで、
Ｘ１がＱ又はＮであり、Ｘ２がＦ又はＰであり、Ｘ３がＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２はＩ－Ｆ－Ｘ１－Ａ－Ｘ２－Ｓ－Ｒ－Ｘ３－Ｒ－Ｇであり、ここで、
Ｘ１がＡ又はＧであり、Ｘ２がＴ、Ｙ又はＳであり、Ｘ３がＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３はＧ－Ｓ－Ｘ１－Ｎ－Ｓ－Ｒ－Ｘ２－Ｙ－Ｖ－Ｘ３－Ｇであり、ここで、
Ｘ１がＰ、Ａ又はＧであり、Ｘ２がＧＧ又はＮであり、Ｘ３がＷ又はＦである。
１つの重要な利点は、前記結合タンパク質の活性が高く、ヒトのＮＴ－ｐｒｏＢＮＰと非常に高い親和性を有することである。
１つ又は複数の実施形態においては、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ１がＦであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＧであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＲであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ２がＦであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ１がＧであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ３がＦである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＶである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ３がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ３がＶである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ３がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ２がＱである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ２がＮである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ３がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ３がＶである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ３がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ２がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ２がＶである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ２がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ３がＦである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ３がＷである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ１がＱである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ１がＮである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ３がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ３がＶである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ３がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ２がＴである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ２がＹである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ２がＳである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ３がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ３がＶである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ３がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ１がＰである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ１がＡである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ１がＧである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ２がＧＧである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ２がＮである。
１つ又は複数の実施形態においては、各相補性決定領域の突然変異部位は、以下の突然変異組合せから選ばれるいずれか一種である。
Figure 0007339338000001
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は、少なくとも３つのＣＤＲｓ（例えば３つの軽鎖ＣＤＲ又は３つの重鎖ＣＤＲ）を含むか、又は、前記結合タンパク質は、少なくとも６つのＣＤＲｓを含む。
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は、可変領域及び定常領域を含む完全な抗体である。
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は、配列が順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される軽鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４、及び／又は、配列が順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示される重鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含む。
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は、抗体の定常領域の配列をさらに含む。
１つ又は複数の実施形態においては、前記定常領域配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選ばれるいずれかの定常領域の配列である。
１つ又は複数の実施形態においては、前記定常領域は、牛、馬、乳牛、豚、綿羊、山羊、ラット、マウス、犬、猫、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、闘鶏又はヒトの物種に由来する。
１つ又は複数の実施形態においては、前記定常領域は羊に由来し、
軽鎖定常領域配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示され、
重鎖定常領域配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示される。
本開示は、上記記載の結合タンパク質をコードする、分離される核酸分子にさらに関する。
本開示は、上記記載の核酸分子を含むベクターにさらに関する。
本開示は、上記記載のベクターで形質転換される宿主細胞にさらに関するにさらに関する。
本開示は、上記記載の結合タンパク質の生産方法であって、
上記記載の宿主細胞を培地で適切な培養条件において培養し、培地又は培養された宿主細胞から、このように生じた結合タンパク質を回収するステップを含む、生産方法にさらに関する。
本開示の一態様によれば、本開示は、上記記載の結合タンパク質の、心不全を診断する及び心臓機能を評価するための診断剤の製造における使用にさらに関する。
本開示の一態様によれば、本開示は、テストサンプル中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの検出方法であって、
ａ）十分に抗体／抗原結合反応が発生できる条件において、前記テストサンプル中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ抗原を上記記載の結合タンパク質と接触させて免疫複合体を形成するステップと、
ｂ）前記テストサンプル中の前記ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの存在を指示する前記免疫複合体の存在を検出するステップと、を含む、検出方法にさらに関する。
１つ又は複数の実施形態においては、ステップａ）では、前記免疫複合体は、前記結合タンパク質に結合される第２の抗体をさらに含む。
１つ又は複数の実施形態においては、ステップａ）では、前記免疫複合体は、前記ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ抗原に結合される第２の抗体をさらに含む。
本開示の一態様によれば、本開示は、上記記載の結合タンパク質を含むキットにさらに関する。
本開示は、本明細書に記載の結合タンパク質の、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに関連する疾患の診断における使用にさらに関する。
本開示は、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに関連する疾患を診断する又は心臓機能を評価する方法であって、
Ａ）十分に結合反応が発生できる条件において、被験者からのサンプルを本開示に記載の結合タンパク質と接触させて結合反応させるステップと、
Ｂ）結合反応の生じた免疫複合体を検出するステップと、を含み、
前記免疫複合体の存在は、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに関連する疾患の存在を指示するか、又は、心臓機能レベルを指示する、方法にさらに関する。
１つ又は複数の実施形態においては、前記方法は、蛍光免疫技術、化学発光技術、金コロイド免疫技術、放射免疫分析及び／又は酵素結合免疫技術に基づくものである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記サンプルは、全血、末梢血、血清、血漿又は心筋組織から選ばれる少なくとも１種である。
１つ又は複数の実施形態においては、前記被験者は哺乳動物、好ましくは霊長類動物であり、さらに好ましくはヒトである。
１つ又は複数の実施形態においては、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに関連する疾患前記は心臓疾患である。
１つ又は複数の実施形態においては、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに関連する前記疾患は、心不全、心機能不全、心原性呼吸困難、肺性呼吸困難、急性冠症候群又はこれらの組合せで構成される群から選ばれる。
１つ又は複数の実施形態においては、前記心全症心原性の心不全又は非心原性の心不全である。
本開示の具体的な実施形態又は従来の技術における技術的解決手段をより明確に説明するために、以下、具体的な実施形態又は従来の技術の説明に必要な図面を簡単に説明し、明らかに、以下に説明される図面は本開示のいくつかの実施形態であり、当業者にとって、創造的な労力を要することなく、これらの図面に基づいて他の図面を取得することができる。
本開示の一実施例での抗ヒトＮＴ－ｐｒｏＢＮＰのモノクローナル抗体の電気泳動図である。
本開示は、本開示の一部の実施案についての以下の説明及び含まれる実施例の詳細な内容を通して、容易に了解することができる。
さらに本開示を記述する前に、本開示は、前記特定の実施案に限定されるものではなく、これらの実施案が必然的にさまざまであるためであることが理解されたい。また、本明細書に使用される用語は、特定の実施案を説明するためのものに過ぎず、制限するためのものではなく、本開示の範囲が添付の特許請求の範囲のみに限定されるためであることが理解されたい。
名詞定義
「抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質」は、広く、ＣＤＲ領域を含む全てのタンパク質／タンパク質断片を指す。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗体の抗原化合物の結合断片を含み、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、抗体の最小識別単位、及びこれらの抗体と断片の一本鎖誘導体を含む。抗体のタイプは、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選択することができる。また、「抗体」という用語は、天然に生じる抗体及び非天然に生じる抗体を含み、例えばキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）、二元機能型（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）及びヒト由来型（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）の抗体、及び関連する合成アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）を含む。「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」と互換的に使用できる。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端のドメインである。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と呼ばれてもよい。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と呼ばれてもよい。これらのドメインは、通常、抗体の可変性が最も高い部分であり、抗原結合部位を含む。軽鎖又は重鎖可変領域（ＶＬ又はＶＨ）は、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる領域及び３つの相補性決定領域に隔てられたフレームワーク領域で構成される。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、例えば、Ｋａｂａｔ（<<免疫学的に関心のあるタンパク質配列>>（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、Ｅ．Ｋａｂａｔら、アメリカ合衆国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、（１９８３））及びＣｈｏｔｈｉａで、正確に定義されている。抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを位置付けて揃える作用を果たし、前記ＣＤＲは、抗原の結合に主に用いられる。
本明細書で使用されるとき、「フレームワーク領域」、「枠組み領域」又は「ＦＲ」は、ＣＤＲとして定義された領域を排除する抗体可変ドメインの領域を意味する。各抗体の可変ドメイン枠組み領域は、さらに、ＣＤＲに隔てられた隣接領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に細分化されてもよい。
通常の場合、重鎖及び軽鎖の可変領域ＶＬ／ＶＨは、以下の番号のＣＤＲとＦＲを以下の組合せ配列で連結して得ることができる。
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
本明細書で使用されるとき、ポリペプチド又は核酸に関連する用語「精製される」又は「分離される」とは、ポリペプチド又は核酸がその天然媒体に存在しない又は天然形態ではないことを意味する。従って、用語「分離される」は、原始的な環境、例えば天然に存在する場合に、天然環境から抽出されるポリペプチド又は核酸である。例えば、分離されるポリペプチドは、通常、それに結合されるもの、又は、通常、それに混合されるもの、又は、溶液における少なくともあるタンパク質又はその他の細胞成分を一般的に含まない。分離されるポリペプチドは、細胞溶解物に含まれた天然に存在する前記ポリペプチド、精製される又は部分的に精製される前記ポリペプチド、組換えポリペプチド、細胞で発現又は分泌される前記ポリペプチド、及び異種宿主細胞又は培養物における前記ポリペプチドを含む。核酸に関連して、用語「分離される」又は「精製される」は、例えば前記核酸が天然のゲノム背景に位置しない（例えば、ベクターでは、発現カセットとして、プロモータに連結され、又は異種宿主細胞に手動で導入される）ことを意味する。
本明細書で使用されるとおり、用語「二重特異性抗体」又は「二重機能性抗体」は、異なる２ペアの重／軽鎖及び２つの異なる結合部位の人工ハイブリッド結合タンパク質を意味する。二重特異性結合タンパク質は、ハイブリドーマの融和又はＦａｂ’断片の連結を含む複数種の方法で生成することができる。
本明細書で使用されるとおり、用語「配列同一性」は、少なくとも２種の異なる配列間の類似性を意味する。このパーセント同一性は、ベーシック・ローカルアライメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎなど、又はＭｅｙｅｒｓなどの基準アルゴリズムで決定することができる。
１つ又は複数の実施形態では、１組のパラメータは、Ｂｌｏｓｕｍ６２スコアリングマトリックス並びにギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、及びフレームシフトギャップペナルティ５であってもよい。１つ又は複数の実施形態では、２種のアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、さらに、Ｍｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７）のアルゴリズムで決定されてもよく、該アルゴリズムがＡＬＩＧＮプログラム（２.０バージョン）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長さペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を用いる。パーセント同一性は、通常、類似した長さの配列を比較することで計算される。
本明細書で使用されるとおり、用語「親和性」とは、結合タンパク質又は抗体の抗原結合ドメインと抗原又は抗原エピトープとの結合強度である。親和性は、ＫＤ値で評価することができ、ＫＤ値が小さければ、親和性が大きいことが示される。
本開示の例示的な実施案
本開示は、抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質に関し、前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域を含むか、又は、以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつＮＴ－ｐｒｏＢＮＰとはＫD≦２.２６×１０-8の親和性を有し、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１はＧ－Ｘ１－Ｓ－Ｘ２－Ｔ－Ｔ－Ｙ－Ｙ－Ｘ３－Ｄであり、ここで、
Ｘ１がＰ又はＦであり、Ｘ２がＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３がＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２はＭ－Ｔ－Ｋ－Ｄ－Ｘ１－Ｎ－Ａ－Ｖ－Ｈ－Ｘ２－Ｐ－Ｔ－Ｘ３－Ｒ－Ｓであり、ここで、
Ｘ１がＧ又はＡであり、Ｘ２がＱ又はＮであり、Ｘ３がＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３はＶ－Ｘ１－Ｇ－Ｘ２－Ｉ－Ｄ－Ｘ３－Ｇであり、ここで、
Ｘ１がＫ又はＲであり、Ｘ２がＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３がＦ又はＷであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１はＧ－Ｓ－Ｓ－Ｄ－Ｘ１－Ｖ－Ｇ－Ｘ２－Ｇ－Ｄ－Ｙ－Ｘ３－Ｎであり、ここで、
Ｘ１がＱ又はＮであり、Ｘ２がＦ又はＰであり、Ｘ３がＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２はＩ－Ｆ－Ｘ１－Ａ－Ｘ２－Ｓ－Ｒ－Ｘ３－Ｒ－Ｇであり、ここで、
Ｘ１がＡ又はＧであり、Ｘ２がＴ、Ｙ又はＳであり、Ｘ３がＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３はＧ－Ｓ－Ｘ１－Ｎ－Ｓ－Ｒ－Ｘ２－Ｙ－Ｖ－Ｘ３－Ｇであり、ここで、
Ｘ１がＰ、Ａ又はＧであり、Ｘ２がＧＧ又はＮであり、Ｘ３がＷ又はＦである。
本明細書に使用される用語「Ｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）」は、「Ｎ末端プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド」と互換的に使用でき、脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体又はＢ型ナトリウム利尿ペプチドを酵素切断した後、例えば、エンドヌクレアーゼで酵素切断した後に生じた生物活性がないＮ末端断片を意味する。
１つ又は複数の実施形態においては、前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、かつＮＴ－ｐｒｏＢＮＰとＫD≦２.２６×１０-8mol/Lの親和性を有し、ＫD値は、１×１０-9mol/L、２×１０-9mol/L、３×１０-9mol/L、４×１０-9mol/L、４.５×１０-9mol/L、５×１０-9mol/L、６×１０-9mol/L、７×１０-9mol/L、８×１０-9mol/L、９×１０-9mol/L、１×１０-10mol/L、３×１０-10mol/L、５×１０-10mol/L、７×１０-10mol/L、９×１０-10mol/L又は１×１０-8mol/Lから選ばれてもよく、
又は８.１０×１０-10mol/L≦ＫD≦２.２６×１０-8mol/Lであり、
又はＫDは、１×１０-9mol/L、２×１０-9mol/L、３×１０-9mol/L、４×１０-9mol/L、４.５×１０-9mol/L、５×１０-9mol/L、６×１０-9mol/L、７×１０-9mol/L、８×１０-9mol/L、９×１０-9mol/L、１×１０-10mol/L、３×１０-10mol/L、５×１０-10mol/L、７×１０-10mol/L、９×１０-10mol/L又は１×１０-8mol/L以下である。
親和性を本開示の明細書の方法で測定する。
１つ又は複数の実施形態においては、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ１がＦであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ１がＧであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ１がＲであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ２がＦであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ１がＧであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ３がＦである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＶである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ２がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ３がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ３がＶである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１では、Ｘ３がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ２がＱである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ２がＮである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ３がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ３がＶである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２では、Ｘ３がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ２がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ２がＶである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ２がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ３がＦである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３では、Ｘ３がＷである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ１がＱである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ１がＮである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ３がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ３がＶである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１では、Ｘ３がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ２がＴである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ２がＹである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ２がＳである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ３がＩである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ３がＶである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２では、Ｘ３がＬである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ１がＰである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ１がＡである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ１がＧである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ２がＧＧである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３では、Ｘ２がＮである。
１つ又は複数の実施形態においては、各相補性決定領域の突然変異部位は、以下の突然変異組合せから選ばれるいずれかである。
Figure 0007339338000002
１つ又は複数の実施形態では、本開示に記載の結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域に出現するＸ１は、それぞれ独立して、本開示で限定されるアミノ酸を表し、本開示に記載の結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域に出現するＸ２は、それぞれ独立して、本開示で限定されるアミノ酸を表し、本開示に記載の結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域に出現するＸ３は、それぞれ独立して、本開示で限定されるアミノ酸を表す。
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は、少なくとも３つのＣＤＲｓ（例えば３つの軽鎖ＣＤＲ又は３つの重鎖ＣＤＲ）を含むか、又は、前記結合タンパク質は、少なくとも６つのＣＤＲｓを含む。
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は可変領域及び定常領域を含む完全な抗体である。
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は抗体の「機能断片」、例えば、ナノ抗体は、Ｆ(ａｂ’)2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体及び抗体最小識別単位のうちの１種である。
ｓｃＦｖ（ｓｃ＝一本鎖）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）。
本開示に記載の「機能断片」は、特に、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに対して母親由来抗体と同一特異性を有する抗体断片である。上記機能断片のほか、半減期に増加された任意の断片をさらに含む。
これらの機能断片は、通常、その由来抗体と同一の結合特異性を有する。当業者は、本開示の明細書に記載の内容に基づいて、本開示の抗体断片が、例えば、酵素消化の方法（ペプシン又はパパインを含む）及び／又はジスルフィド結合を化学還元して分割する方法により上記の機能断片を取得できることを推定することができる。
抗体断片は、さらに、当業者にとって既知の組換え遺伝学技術、又は、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓなどにより販売される自動ペプチドシンセサイザーなどの自動ペプチドシンセサイザーによって、ペプチドを合成することで取得されてもよい。
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は、配列が順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される軽鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４、及び／又は、配列が順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示される重鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含む。
なお、本願の上記に開示されているアミノ酸配列のほか、フレームワーク領域は、ヒト化抗体を構成するように、ヒトの物種に由来してもよい。
１つ又は複数の実施形態においては、前記結合タンパク質は、抗体の定常領域の配列をさらに含む。
１つ又は複数の実施形態においては、前記定常領域配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選ばれるいずれかの定常領域の配列である。
１つ又は複数の実施形態においては、前記定常領域は、牛、馬、乳牛、豚、綿羊、山羊、ラット、マウス、犬、猫、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、闘鶏又はヒトの物種に由来し、
１つ又は複数の実施形態においては、前記定常領域は羊に由来し、
軽鎖定常領域配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示され、
重鎖定常領域配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示される。
本開示の一態様によれば、本開示は、上記記載の結合タンパク質をコードし、ＤＮＡ又はＲＮＡである、分離される核酸分子にさらに関する。
本開示の一態様によれば、本開示は、上記記載の核酸分子を含むベクターにさらに関する。
本開示は、上記記載の核酸分子をコードする少なくとも１種の核酸構築体をさらに含み、例えばプラスミド、さらに発現プラスミドであり、本願の一実施例では、該ベクターの構築方法について説明する。
本開示の一態様によれば、本開示は、前記ベクターで形質転換される宿主細胞にさらに関する。
前記宿主細胞は、哺乳動物細胞などの真核細胞であってもよい。
１つ又は複数の実施形態においては、前記宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
本開示の一態様によれば、本開示は、上記記載の結合タンパク質の生産方法であって、
培地で適切な培養条件において上記記載の宿主細胞を培養し、培地又は培養された宿主細胞から、このように生じた結合タンパク質を回収するステップを含む、生産方法にさらに関する。
本開示の一態様によれば、本開示は、テストサンプル中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの検出方法であって、
ａ）十分に抗体／抗原結合反応が発生できる条件において、前記テストサンプル中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ抗原を上記記載の結合タンパク質と接触させて免疫複合体を形成するステップと、
ｂ）前記テストサンプル中の前記ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの存在を指示する前記免疫複合体の存在を検出するステップと、を含む、検出方法にさらに関する。
この実施形態では、信号強度を示す指示薬で前記結合タンパク質を標識することができ、前記複合体を容易に検出するようにする。
１つ又は複数の実施形態においては、ステップａ）では、前記免疫複合体は、前記結合タンパク質に結合される第２の抗体をさらに含む。
１つ又は複数の実施形態においては、ステップａ）では、前記免疫複合体は、前記ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに結合される第２の抗体をさらに含む。
この実施形態では、前記結合タンパク質は、第１の抗体の形態で前記第２の抗体とペア抗体を形成し、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの異なる抗原エピトープに結合するために用いられる。
信号強度を示す指示薬で前記の第２の抗体を標識することができ、前記複合体を容易に検出するようにする。
１つ又は複数の実施形態においては、ステップａ）では、前記免疫複合体は、前記ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ抗原に結合される第２の抗体をさらに含む。
この実施形態では、前記結合タンパク質が前記第２の抗体の抗原とされており、信号強度を示す指示薬で前記の第２の抗体を標識することができ、前記複合体を容易に検出するようにする。
１つ又は複数の実施形態では、前記信号強度を示す指示薬は、蛍光物質、量子ドット、ジゴキシゲニン標識プローブ、ビオチン、放射性同位体、放射性造影剤、常磁性イオン蛍光マイクロスフェア、高電子密度物質、化学発光マーカー、超音波造影剤、光増感剤、金コロイド又は酵素のうちのいずれかを含む。
１つ又は複数の実施形態では、前記蛍光物質は、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４０５、Ａｌｅｘａ４３０、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ６４７、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ－Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲＸ、５－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、５－カルボキシル基－２’，４’，５’，７’－テトラクロロフルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン、５－カルボキシローダミン、６－カルボキシローダミン、６－カルボキシテトラメチルローダミン、ＣａｓｃａｄｅＢｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、６－ＦＡＭ、ダンシルクロリド、フルオレセイン、ＨＥＸ、６－ＪＯＥ、ＮＢＤ（７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾール）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、オルソフタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレジルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメチン、アントシアン、キサンチン、サクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプタート、ユーロピウムトリスビピリジルジアミン、ユーロピウムクリプタート又はユーロピウムキレート、ジアミン、ジシアニン、ＬａＪｏｌｌａ青色色素、アロフィコシアニン、ａｌｌｏｃｏｃｙａｎｉｎ Ｂ、フィコシアニンＣ、フィコシアニンＲ、チアミン、フィコエリトロシアニン、フィコエリトリンＲ、ＲＥＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、ローダミンイソチオシアネート、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン及びテキサスレッドのうちのいずれかを含む。
１つ又は複数の実施形態では、前記放射性同位体は、110Ｉｎ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、18Ｆ、52Ｆｅ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｚｒ、94ｍＴｃ、94Ｔｃ、99ｍＴｃ、120Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、154-158Ｇｄ、32Ｐ、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、51Ｍｎ、52ｍＭｎ、55Ｃｏ、72Ａｓ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、82ｍＲｂ及び83Ｓｒのうちのいずれかを含む。
１つ又は複数の実施形態では、前記酵素は、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及びグルコースオキシダーゼのうちのいずれかを含む。
１つ又は複数の実施形態では、前記蛍光マイクロスフェアは、内部に希土類蛍光イオンユーロピウムが包まれるポリスチレン蛍光マイクロスフェアである。
本開示の一態様によれば、本開示は、上記記載の結合タンパク質を含むキットにさらに関する。
本開示は、本明細書に記載の結合タンパク質の、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに関連する疾患の診断における使用にさらに関する。
本明細書で使用されるとおり、用語「ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに関連する疾患」とは、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰをマーカー（そのタンパク質又はコード核酸を含む）とする疾病である。特に、本開示の１つ又は複数の実施形態では、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに関連する疾患とは、血液（例えば全血、血漿又は血清）中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルが高くなることを特徴とする疾患であってもよい。
本開示は、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに関連する疾患を診断する又は心臓機能を評価する方法であって、
Ａ）十分に結合反応が発生できる条件において、被験者からのサンプルを本開示に記載の結合タンパク質と接触させて結合反応させるステップと、
Ｂ）結合反応の生じた免疫複合体を検出するステップと、を含み、
前記免疫複合体の存在は、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに関連する疾患の存在を指示するか、又は、心臓機能レベルを指示する、方法にさらに関する。
１つ又は複数の実施形態においては、前記方法は、蛍光免疫技術、化学発光技術、金コロイド免疫技術、放射免疫分析及び／又は酵素結合免疫技術に基づくものである。
１つ又は複数の実施形態においては、前記サンプルは、全血、末梢血、血清、血漿又は心筋組織から選ばれる少なくとも１種である。
１つ又は複数の実施形態においては、前記被験者は、哺乳動物、好ましくは霊長類動物、さらに好ましくはヒトである。
１つ又は複数の実施形態においては、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに関連する前記疾患は心臓疾患である。
１つ又は複数の実施形態においては、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに関連する前記疾患は、心不全、心機能不全、心原性呼吸困難、肺性呼吸困難、急性冠症候群又はこれらの組合せで構成される群から選ばれる。
１つ又は複数の実施形態においては、前記心不全は、心原性心の不全又は非心原性の心不全である。
以下、実施例を組み合わせて、本開示の実施案について詳細に説明するが、以下の実施例は、本開示を説明するためのものに過ぎず、本開示の範囲を制限するものと見なすべきではないことを当業者が理解できる。実施例において具体的な条件が明記されていない限り、通常の条件又は製造商が推薦する条件に従って行う。使用される試薬又は器械について、生産メーカーが明記されていない限り、いずれも市販される一般的な製品である。
実施例１
本実施例は、抗ヒトＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの組換え抗体の例示的な製造方法を提供する。
Ｓ１．発現プラスミドの構築：
本実施例では、制限エンドヌクレアーゼ、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｋａｒａ社から購入された。
ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ－ＲＮＡ抽出キットは、ＴＯＹＯＢＯ社から購入された。
ＢＤ ＳＭＡＲＴTMＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔキットは、Ｔａｋａｒａ社から購入された。
ｐＭＤ－１８Ｔベクターは、Ｔａｋａｒａ社から購入された。
プラスミド抽出キットは、天根公司から購入された。
プライマー合成及び遺伝子の配列測定は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社で完了された。
Ａｎｔｉ－ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ ８Ｂ９モノクローナル抗体を分泌する従来のハイブリドーマ細胞株を復活しておいた。
Ｓ１１、プライマーの設計及び合成：
重鎖及び軽鎖の５’ＲＡＣＥ上流プライマーの増幅：
ＳＭＡＲＴＥＲ ＩＩ Ａオリゴヌクレオチド：
５’＞ ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＸＸＸＸＸ＜３’、
５’－ＲＡＣＥ ＣＤＳプライマー（５’－ＣＤＳ）：５’＞（Ｔ）２５ＶＮ＜３’（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ、Ｖ＝Ａ、Ｇ、又はＣ）、
ユニバーサルプライマーＡ混合物（ＵＰＭ）：
５’＞ ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ＜３’、
ネステッドユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）：
５’＞ ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ＜３’、
ｍｋＲ：５’＞ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧ＜３’、
ｍＨＲ：５’＞ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＡＧＡＴ＜３’。
Ｓ１２、抗体の可変領域遺伝子クローン及び序列測定：
Ａｎｔｉ－ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ ８Ｂ９モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株からＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴＥＲＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔキット及びキットにおけるＳＭＡＲＴＥＲ ＩＩ Ａオリゴヌクレオチド及び５’－ＣＤＳプライマーで第一鎖ｃＤＮＡの合成を行い、取得された第一鎖ｃＤＮＡ産物をＰＣＲ増幅テンプレートとした。軽鎖遺伝子をユニバーサルプライマーＡ混合物（ＵＰＭ）、ネステッドユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）及びｍｋＲで増幅させ、重鎖遺伝子をユニバーサルプライマーＡ混合物（ＵＰＭ）、ネステッドユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）及びｍＨＲで増幅させた。軽鎖のプライマーペアにより０.７ＫＢほどの目的バンドを増幅し出し、重鎖のプライマーペアにより１.４ＫＢほどの目的バンドを増幅し出した。アガロースゲル電気泳動で精製回収し、産物をｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼでＡ付加反応（Ａを付加する反応）を行ってｐＭＤ－１８Ｔベクターに挿入し、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、コロニが成長した後、それぞれ重鎖及び軽鎖遺伝子クローンの４つのクローンをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に送って序列測定を行った。
Ｓ１３、Ａｎｔｉ－ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ ８Ｂ９抗体の可変領域遺伝子の配列分析：
上記序列測定して得られた遺伝子配列をＩＭＧＴ抗体データベースに入れて分析し、ＶＮＴＩ１１.５ソフトウェアを利用して分析して、重鎖及び軽鎖プライマーペアの増幅した遺伝子が全て正確であると決定し、ここで、軽鎖の増幅した遺伝子断片では、ＶＬ遺伝子配列は４０２ｂｐであり、ＶｋＩＩ遺伝子ファミリに属し、その前に６０ｂｐのリーダーペプチド配列があり、重鎖プライマーペアの増幅した遺伝子断片では、ＶＨ遺伝子配列は４０２ｂｐであり、ＶＨ１遺伝子ファミリに属し、その前に５７ｂｐのリーダーペプチド配列があった。
Ｓ１４、組換え抗体発現プラスミドの構築：
ｐｃＤＮＡTM ３.４ ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターは、構築された組換え抗体の真核発現ベクターであり、該発現ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩなどのポリクローナル酵素切断部位が導入されており、ｐｃＤＮＡ ３.４Ａ発現ベクターとして命名され、以下、３.４Ａ発現ベクターと略称される。上記ｐＭＤ－１８Ｔにおける抗体の可変領域遺伝子の配列決定結果に基づき、Ａｎｔｉ－ＮＴ－ｐｒｏ ＢＮＰ ８Ｂ９抗体のＶＬ及びＶＨの遺伝子特異性プライマーを設計し、プライマーの両端にそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ酵素切断部位及び保護塩基を持ち、プライマーは、以下のとおりであった。
ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ ８Ｂ９－ＨＦ：
５’＞ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴ＜３’、
ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ ８Ｂ９－ＨＲ：
５’＞ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＡＧＡＴ＜３’、
ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ ８Ｂ９－ＬＦ：
５’＞ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣ＜３’、
ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ ８Ｂ９－ＬＲ：
５’＞ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＴＧ＜３’、
ＰＣＲ増幅方法により０.７ＫＢの軽鎖遺伝子断片及び１.４ｋＢの重鎖遺伝子断片を増幅させた。重鎖及び軽鎖遺伝子断片をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで二重酵素切断し、３.４ＡベクターをＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで二重酵素切断し、また、断片及びベクターを精製回収した後に、重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子をそれぞれ３.４Ａ発現ベクターに連結し、それぞれ重鎖及び軽鎖の組換え発現プラスミドを得た。
Ｓ２.安定細胞株のスクリーニング
Ｓ２１ 組換え抗体発現プラスミドでＣＨＯ細胞を一過性形質転換し、発現プラスミドの活性を確定すること
プラスミドを超純水で４００ng/mlに希釈し、遠心チューブにおいてＣＨＯ細胞を１.４３×１０7cells/mlに調整し、１００μlのプラスミドを７００μlの細胞と混合し、電気的形質転換用カップに移し、電気的形質転換を行い、３日目、５日目、７日目にサンプリングして計数し、７日目にサンプリングして検出した。
組換えＮＴ抗原（自社製、１６１２１３）を、コーティング液で指定された濃度に希釈し、１００μL/ウェルで４℃において一晩コーティングし、次の日に、洗浄液で２回洗浄し、たたいて乾かし、ブロッキング液（２０％のＢＳＡ＋８０％のＰＢＳ）を１２０μL/ウェルで加え、３７℃において１ｈたたいて乾かし、希釈された細胞上清を１００μL/ウェルで加え、３７℃において３０ｍｉｎ放置し（一部の上清が１ｈである）、洗浄液で５回洗浄し、たたいて乾かし、ウサギ抗ヒツジ－ＨＲＰを１００μL/ウェルで加え、３７℃において３０ｍｉｎ放置し、洗浄液で５回洗浄し、たたいて乾かし、発色液Ａ液（５０μL/ウェル）を加え、発色液Ｂ液（５０μL/ウェル）を加え、１０min発色し、ストップバッファーを５０μL/ウェルで加え、マイクロプレートリーダーの４５０nm（参照として６３０nm）でＯＤ値を読み取った。結果によれば、細胞上清を１０００倍希釈した後に反応しても、ＯＤが依然として１.０より大きく、細胞上清を加えずに反応すると、ＯＤが０.１より小さく、プラスミドを一過性形質転換した後に生じた抗体が組換えＮＴタンパク質に対して活性を有することが示された。
Ｓ２２ 組換え抗体発現プラスミドの線形化
Ｂｕｆｆｅｒ ５０μl、ＤＮＡ １００μg/チューブ、Ｐｕｖ Ｉ酵素 １０μlという試薬を用意し、無菌水で５００μlに補充し、３７℃で一晩水浴しながら酵素切断し、まず等体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（下層）２５：２４：１で抽出し、次にクロロホルム（水相）で抽出し、０．１倍の体積（水相）の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２倍の体積のエタノールで氷において沈殿させ、７０％のエタノールで沈殿を洗浄し、有機溶剤を除去し、エタノールが完全に揮発した後に、適量の滅菌水で再び溶かし、最後に濃度を測定した。
Ｓ２３ 組換え抗体発現プラスミドを安定して導入させること、及び安定した細胞株を加圧してスクリーニングすること
プラスミドを超純水で４００ng/mlに希釈し、遠心チューブにおいてＣＨＯ細胞を１.４３×１０7cells/mlに調整し、１００μlのプラスミドを７００μlの細胞と混合し、電気的形質転換用カップに移し、電気的形質転換を行い、次の日に計数し、２５μmol/Lのメチオニンスルホキシミンを９６ウェルに入れて約２５日加圧培養した。
細胞が成長したクローンウェルを顕微鏡で観察して標識し、合流度を記録し、培養された上清をサンプリングして検出し、抗体の濃度、相対濃度が高い細胞株を選択して２４ウェルに移し、３日ほど後に、６ウェルに移し、３日後に保存してバッチ培養し、細胞密度を０.５×１０6cells/mlに調整し、２.２mlバッチ培養を行い、細胞密度０.３×１０6cells/mlで２ml保存し、また、７日間、６ウェルのバッチ培養された上清をサンプリングして検出し、抗体濃度及び細胞直径が小さい細胞株を選択してＴＰＰに移して保存して継代培養を行った。
Ｓ３.組換え抗体の生産
Ｓ３１ 細胞の拡大培養
細胞を復活させた後に、まず１２５ml仕様の振とうフラスコにおいて培養し、接種体積が３０mlであり、培地が１００％のＤｙｎａｍｉｓ培地であり、回転数が１２０r/minで、温度が３７℃で、二酸化炭素が８％である揺とう器に置いた。７２ｈ培養し、５０万cells/mlの接種密度で接種して拡大培養を行い、拡大培養体積を生産需要に応じて計算し、培地が１００％のＤｙｎａｍｉｓ培地であった。次に７２ｈおきに１回拡大培養した。細胞量が生産ニーズを満たすとき、接種密度を５０万cells/mlほどに厳密に制御して生産した。
Ｓ３２ 振とうフラスコ生産及び精製
振とうフラスコパラメータは、回転数１２０r/min、温度３７℃、二酸化炭素８％であった。材料の流加供給：振とうフラスコにおいて７２ｈ培養してから、毎日に供給し、ＨｙＣｌｏｎｅＴＭ Ｃｅｌｌ ＢｏｏｓｔＴＭ Ｆｅｅｄ ７ａは、毎日に初期培養体積の３％を流加し、Ｆｅｅｄ ７ｂの毎日の流加量は、初期培養体積の千分の一であり、１２日目まで補充した（１２日目に供給した）。グルコース３g/Lを６日目に供給した。１３日目にサンプリングした。ｐｒｏｔｅｉｎＡ親和クロマトグラフィーカラムで親和精製を行った。４μｇの精製された抗体に対して還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、４μｇの外部の対照抗体を対照とし、電気泳動図は図１に示された。還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後に２本のバンドが示され、一方のＭｒが５０ＫＤ（重鎖）であり、他方のＭｒが２８ＫＤ（軽鎖）であった。
実施例２
抗体の親和性分析及び活性同定
実施例１で得られた抗体は、分析によれば、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示される軽鎖及び１２で示される重鎖を有する。
分析によれば、重鎖の相補性決定領域（ＷＴ）：
ＣＤＲ－ＶＨ１はＧ－Ｐ（Ｘ１）－Ｓ－Ｉ（Ｘ２）－Ｔ－Ｔ－Ｙ－Ｙ－Ｉ（Ｘ３）－Ｄであり、
ＣＤＲ－ＶＨ２はＭ－Ｔ－Ｋ－Ｄ－Ａ（Ｘ１）－Ｎ－Ａ－Ｖ－Ｈ－Ｑ（Ｘ２）－Ｐ－Ｔ－Ｉ（Ｘ３）－Ｒ－Ｓであり、
ＣＤＲ－ＶＨ３はＶ－Ｋ（Ｘ１）－Ｇ－Ｉ（Ｘ２）－Ｉ－Ｄ－Ｗ（Ｘ３）－Ｇであり、
軽鎖の相補性決定領域：
ＣＤＲ－ＶＬ１はＧ－Ｓ－Ｓ－Ｄ－Ｑ（Ｘ１）－Ｖ－Ｇ－Ｐ（Ｘ２）－Ｇ－Ｄ－Ｙ－Ｖ（Ｘ３）－Ｎであり、
ＣＤＲ－ＶＬ２はＩ－Ｆ－Ａ（Ｘ１）－Ａ－Ｔ（Ｘ２）－Ｓ－Ｒ－Ｉ（Ｘ３）－Ｒ－Ｇであり、
ＣＤＲ－ＶＬ３はＧ－Ｓ－Ｐ（Ｘ１）－Ｎ－Ｓ－Ｒ－ＧＧ（Ｘ２）－Ｙ－Ｖ－Ｗ（Ｘ３）－Ｇであり、
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、いずれも突然変異対象の部位である。
Figure 0007339338000003
発明者は、ＷＴ中のＣＤＲ部位に対して上記突然変異を行い、活性がより高い抗体を取得する。
コーティング液で組換えＮＴ抗原を１μg/mlに希釈してマイクロプレートコーディングを行い、１００μL/ウェルで４℃において一晩コーティングし、次の日に、洗浄液で２回洗浄し、たたいて乾かし、ブロッキング液（２０％のＢＳＡ＋８０％のＰＢＳ）を１２０μL/ウェルで加え、３７℃において１ｈ後にたたいて乾かし、希釈されたＮＴモノクローナル抗体を１００μL/ウェルで加え、３７℃において３０min放置し（一部の上清が１ｈである）、洗浄液で５回洗浄し、たたいて乾かし、ウサギ抗ヒツジ－ＨＲＰを１００μL/ウェルで加え、３７℃において３０min放置し、洗浄液で５回洗浄し、たたいて乾かし、発色液Ａ液（５０μL/ウェル）を加え、発色液Ｂ液（５０μL/ウェル）を加え、１０min発色し、ストップバッファーを５０μL/ウェルで加え、マイクロプレートリーダーから４５０nm（参照として６３０nm）でＯＤ値を読み取った。
Figure 0007339338000004
以上の表から分かるように、突然変異１の活性効果が最適であるため、突然変異１をフレームワーク配列として力価が高い突然変異部位をスクリーニングし（スクリーニングして得られた抗体活性が突然変異１に類似し、抗体活性が±１０％であることを確保する）、一部の結果は以下のとおりであった。
Figure 0007339338000005
親和性分析
活性同定と同じ方法の酵素免疫測定法でデータを作成し、３μg/ml、１.５μg/ml、０.７５μg/ml、０.３７５μg/mlの４つの勾配でコーディングし、抗体を１０００ng/mlから開始し、０.９７７ng/mlまでに２倍勾配希釈してロードした。異なるコーディング濃度で異なる抗体濃度に対応するＯＤ値を得た。同じコーディング濃度で、抗体濃度を横座標とし、ＯＤ値を縦座標とし、データを用いて図を構築し、フィッティング方程に基づき、最大ＯＤ値の５０％での抗体濃度を計算し、式Ｋ＝(ｎ－１)/(２×(ｎ×Ａｂ｀－Ａｂ))に代入して親和性定数の逆数を計算し、但し、Ａｂ及びＡｂ｀は、それぞれ、対応するコーディング濃度(Ａｇ、Ａｇ｀)において最大ＯＤ値の５０％での抗体濃度を表し、ｎ＝Ａｇ/Ａｇ｀、２つずつのコーディング濃度を組合せて１つのＫ値を計算することができ、最後に６つのＫ値を得ることができ、これらの平均数値を求め、その逆数を親和性定数ＫDとして計算した。
Figure 0007339338000006
表４から分かるように、表３にリストされた突然変異部位が、抗体の親和性への影響が大きくなかったことが分かった。
上記結果を検証するために、ＷＴをフレームワーク配列として上記実験を繰り返し、突然変異部位の親和性検証を行い、一部の結果は以下のとおりであった。
Figure 0007339338000007
Figure 0007339338000008
表５及び表６から分析すれば、抗体活性を有することを確保する前提で、上記突然変異部位と、他の部位との関連性は高くなかった。
実施例３ 安定性分析
抗体を４℃（冷蔵庫）、－８０℃（冷蔵庫）、３７℃（恒温器）において２１日放置し、７日目、１４日目、２１日目にサンプリングして状態観察を行い、２１日目のサンプルに対して活性テストを行い、結果により、３つの観察条件において抗体を２１日放置しても、いずれも、タンパク質の顕著な状態変化が見られず、活性が観察温度の上昇とともに低下傾向を呈せしないことが示され、自社製の抗体が安定することが示された。以下の表は突然変異１を２１日目に観察した酵素免疫の活性テストのＯＤ結果である。
Figure 0007339338000009
さらに、ランダムに抽出される８つの突然変異抗体に対して安定性検出を行い、上記抗体を３７℃において７２時間保存し、取り出した後、４℃において７２時間保存された同じロットの抗体と同じ検出条件において同じ陽性コントロール及び陰性コントロールサンプルにて検出を行い、検出方法は、以上の実施例で用いられた抗体活性分析方法と同様であり、各群の抗体の線形がいずれも９９.５０％以上に達することができ、かつＣＶ値が１０％より低く、上記抗体がいずれも優れた安定性を有することが示された。
実施例４ ペア性能評価
出願者は、表４における上記抗体及び自社の他の抗体（元のＷＴ配列の抗体とペアされる抗体）に対してペア抗体の実験検証を行い、二重抗体サンドイッチ法のペア実験により検証した結果、特異性がいずれも原の高いレベルを維持したが、突然変異抗体の活性及び親和性が高くなるため、より高い感度が示された。
突然変異１抗体及びＷＴ抗体をコーディング抗体として、それぞれマーカーとされた他のＮＴ－ｏｒｏＢＮＰ抗体と組み合わせて使用し、化学発光プラットホームにおいて性能差異を比較し、具体的な性能が以下に示される。
Figure 0007339338000010
なお、以上の各実施例は、本開示の技術的解決手段を説明するためのものに過ぎず、制限するものではなく、前述した各実施例を参照しながら本開示について詳細に説明するが、当業者であれば、前述した各実施例に記載の技術的解決手段を修正することができ、又は、その一部の又は全部の技術特徴に対して等価置換を行うことができ、これらの修正や置換により、対応する技術的解決手段の実質が本開示の各実施例の技術的解決手段の範囲から逸脱することないことを理解すべきである。
本開示に記載の結合タンパク質は、活性が高く、ヒトＮＴ－ｐｒｏＢＮＰとは非常に高い親和性を有する。本開示に記載の結合タンパク質は、心不全など、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに関連する疾患を診断するために用いられ、かつ心臓機能を評価するために用いられ、高い感度及び特異性を有する。

Claims (19)

  1. Ｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質であって、
    前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列から選ばれる６つの相補性決定領域を含み、
    相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１はＧ－Ｘ１－Ｓ－Ｘ２－Ｔ－Ｔ－Ｙ－Ｙ－Ｘ３－Ｄであり、ここで、
    Ｘ１がＦであり、Ｘ２がＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３がＩ、Ｖ又はＬであり、
    相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２はＭ－Ｔ－Ｋ－Ｄ－Ｘ１－Ｎ－Ａ－Ｖ－Ｈ－Ｘ２－Ｐ－Ｔ－Ｘ３－Ｒ－Ｓであり、ここで、
    Ｘ１がＧであり、Ｘ２がＱ又はＮであり、Ｘ３がＩ、Ｖ又はＬであり、
    相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３はＶ－Ｘ１－Ｇ－Ｘ２－Ｉ－Ｄ－Ｘ３－Ｇであり、ここで、
    Ｘ１がＲであり、Ｘ２がＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３がＦ又はＷであり、
    相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１はＧ－Ｓ－Ｓ－Ｄ－Ｘ１－Ｖ－Ｇ－Ｘ２－Ｇ－Ｄ－Ｙ－Ｘ３－Ｎであり、ここで、
    Ｘ１がＱ又はＮであり、Ｘ２がＦであり、Ｘ３がＩ、Ｖ又はＬであり、
    相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２はＩ－Ｆ－Ｘ１－Ａ－Ｘ２－Ｓ－Ｒ－Ｘ３－Ｒ－Ｇであり、ここで、
    Ｘ１がＧであり、Ｘ２がＴ、Ｙ又はＳであり、Ｘ３がＩ、Ｖ又はＬであり、
    相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３はＧ－Ｓ－Ｘ１－Ｎ－Ｓ－Ｒ－Ｘ２－Ｙ－Ｖ－Ｘ３－Ｇであり、ここで、
    Ｘ１がＰ、Ａ又はＧであり、Ｘ２がＧＧ又はＮであり、Ｘ３がＦであり、
    ６つの前記相補性決定領域の突然変異部位は、以下の突然変異組合せから選ばれるいずれかである、ことを特徴とする分離される結合タンパク質。
    Figure 0007339338000011
  2. Ｆ(ａｂ’)２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体及び抗体最小識別単位のうちの１つである、ことを特徴とする請求項１に記載のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。
  3. 配列が順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ｌ乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される軽鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４、及び／又は、配列が順にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示される重鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。
  4. 抗体の定常領域の配列をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。
  5. 前記定常領域の配列は、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選ばれるいずれかの定常領域の配列である、ことを特徴とする請求項４に記載のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。
  6. 前記定常領域は、牛、馬、乳牛、豚、綿羊、山羊、ラット、マウス、犬、猫、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、闘鶏又はヒトの物種に由来する、ことを特徴とする請求項４に記載のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。
  7. 前記定常領域は羊に由来し、
    軽鎖定常領域配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示され、
    重鎖定常領域配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示される、ことを特徴とする請求項６に記載のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。
  8. 信号強度を示す指示薬で標識された、ことを特徴とする請求項６に記載のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質。
  9. ＤＮＡ又はＲＮＡであり、請求項１～８のいずれかに記載の結合タンパク質をコードする、ことを特徴とする分離される核酸分子。
  10. 請求項９に記載の核酸分子を含むベクター。
  11. 請求項１０に記載のベクターで形質転換される、宿主細胞。
  12. 培地で適切な培養条件において請求項１１に記載の宿主細胞を培養し、培地又は培養された宿主細胞から、このように生じた結合タンパク質を回収するステップを含む、ことを特徴とする請求項１～８のいずれかに記載の結合タンパク質の生産方法。
  13. 請求項１～８のいずれかに記載の結合タンパク質の、心不全を診断する及び心臓機能を評価するための診断剤の製造における使用。
  14. テストサンプル中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの検出方法であって、
    ａ）十分に抗体／抗原結合反応が発生できる条件において、前記テストサンプル中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ抗原を請求項１～８に記載の結合タンパク質と接触させて免疫複合体を形成するステップと
    ｂ）前記テストサンプル中の前記ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの存在を指示する前記免疫複合体の存在を検出するステップと、を含む、検出方法。
  15. ステップａ）では、前記免疫複合体は、前記結合タンパク質に結合される第２の抗体をさらに含む、ことを特徴とする請求項１４に記載のテストサンプル中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの検出方法。
  16. ステップａ）では、前記免疫複合体は、前記ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰに結合される第２の抗体をさらに含む、ことを特徴とする請求項１４に記載のテストサンプル中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの検出方法。
  17. 蛍光免疫技術、化学発光技術、金コロイド免疫技術、放射免疫分析及び／又は酵素結合免疫技術に基づくものである、ことを特徴とする請求項１４に記載のテストサンプル中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの検出方法。
  18. 前記サンプルは、全血、末梢血、血清、血漿又は心筋組織から選ばれる少なくとも１種である、ことを特徴とする請求項１４に記載のテストサンプル中のＮＴ－ｐｒｏＢＮＰの検出方法。
  19. 請求項１～８のいずれかに記載の結合タンパク質を含むキット。
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