CN112979811A

CN112979811A - 一种鳞状细胞癌抗原的结合蛋白

Info

Publication number: CN112979811A
Application number: CN201911312715.XA
Authority: CN
Inventors: 何志强; 崔鹏; 孟媛; 钟冬梅; 季红斌; 游辉
Original assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2039-12-18
Also published as: CN112979811B

Abstract

本发明涉及一种鳞状细胞癌抗原的分离的结合蛋白，其包含鳞状细胞癌抗原结合结构域，所述结合蛋白活性强，与鳞状细胞癌抗原具有很高的亲和力，能够有效用于鳞状细胞癌抗原的检测。

Description

一种鳞状细胞癌抗原的结合蛋白

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，具体而言，涉及一种鳞状细胞癌抗原的分离的结合蛋白。

背景技术

鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)常发生在身体原有鳞状上皮覆盖的部位，如皮肤、口腔、唇、子宫颈、阴道、食管、喉、阴茎等处，也可发生在有鳞状上皮化生的其他非鳞状上皮覆盖部位，如支气管、胆囊、肾盂等处。肉眼观察，鳞状细胞癌多呈菜花状。此类肿瘤恶性程度较基底细胞深，发展快，破坏大，既可破坏眼部组织，侵入副鼻窦或颅内，又可以通过淋巴管转移至耳前或颌下淋巴结，甚至引起全身性转移。

鳞状细胞癌相关抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)是一种特异性好且最早用于诊断和监测鳞状上皮细胞癌的肿瘤标志物。SCCA是肿瘤相关抗原TA-4(TumorAssociated-Antigen 4)的亚片段，由10个以上的蛋白组成，分子量约为45KD，等电点为5.9-6.6。根据其等电点可以分为两类：酸性SCCA和中性SCCA，中性SCCA一般在鳞状细胞内部，酸性SCCA则大量表达于鳞状细胞癌并外泌出细胞。目前，两个属酸性SCCA的蛋白：SCCA-1和SCCA-2的基因已鉴别得到，其中SCCA-1抑制糜蛋白酶和组织蛋白酶L的活性，发挥抗凋亡效应；SCCA-2能够抑制组织蛋白酶G和巨细胞糜酶的活性，因而使得上皮细胞免受这些蛋白酶所导致的炎症损伤。出现在病人血清中的SCCA抗原可能是因为肿瘤细胞核的正常更新引起SCCA过渡生产的作用。

在癌症患者体内，鳞状细胞癌的癌细胞释放SCCA增多，故SCCA的血清水平检测常应用于多种器官鳞状细胞癌包括宫颈癌、头颈癌、食道癌、肺癌和气管癌、泌尿生殖道和肛管部位的鳞状上皮细胞癌的诊断、预后、病情监测、疗效评价等。有研究表明，有28％～88％的宫颈鳞状上皮细胞癌患者的血清SCCA水平升高。经过治愈的癌症患者中，46％～92％的患者在复发之前2～8个月，即可检测到SCCA的水平升高,这些研究表明对癌症的检测及对其预后可以进行正确评估。

目前，临床上对于鳞状细胞癌的辅助诊断大多是通过测定血清中鳞状细胞癌抗原(SCCA)的浓度，同时对于癌症患者，可通过对于血清SCCA浓度的动态监测，来辅助判断疾病进程、治疗效果和复发。相关的检测手段包括酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光分析法、胶体金分析法等等，均涉及针对SCCA的特异性单克隆抗体的使用。

单克隆抗体多为通过杂交瘤细胞生产，特异性强，但单克隆抗体在制备过程中，成本较高，且容易丢失表位，同时由于从小鼠腹腔产生，受小鼠个体影响大，不同批次间的产品差异较大，另外现有的抗SCCA抗体亲和力和活性都不够理想，无法满足临床检测的要求。因此，本领域对于成本低、活性强、亲和力高、稳定性高的检测用抗体存在着强烈地需求。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种新颖的鳞状细胞癌抗原的分离的结合蛋白，其包含鳞状细胞癌抗原结合结构域，并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。

其中所述抗原结合结构域包含选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与SCCA具有K_D≤8.65×10^- ⁹mol/L的亲和力；

互补决定区CDR-VH1为G-F-X1-F-T-D-X2-Y-M-X3，其中，

X1是S或T，X2是Q、N或H，X3是T或S；

互补决定区CDR-VH2为L-X1-R-N-K-X2-N-G-Y-T-T-X3-Y-S-A-S-X4-K-G，其中，

X1是I或L，X2是P或A，X3是D或E，X4是I、V或L；

互补决定区CDR-VH3为A-X1-E-H-X2-D-Y-X3-R，其中，

X1是K或R，X2是N或Q，X3是E或D；

互补决定区CDR-VL1为R-X1-S-X2-N-I-X3-N-Y-L-A，其中，

X1是A或P，X2是A或G，X3是Q、H或N；

互补决定区CDR-VL2为N-X1-K-T-X2-T-D，其中，

X1是G或A，X2是I、V或L；

互补决定区CDR-VL3为Q-H-X1-W-F-X2-P-X3-T，其中，

X1是F或Y，X2是T或S，X3是K或R；

在一些实施方式中：

所述互补决定区CDR-VH1中，X1是T；

所述互补决定区CDR-VH2中，X2是A；

所述互补决定区CDR-VH3中，X1是R；

所述互补决定区CDR-VL1中，X1是A；

所述互补决定区CDR-VL2中，X1是A；

所述互补决定区CDR-VL3中，X2是T；

在一些实施方式中：

所述互补决定区CDR-VH1中，X1是S；

所述互补决定区CDR-VH2中，X2是P；

所述互补决定区CDR-VH3中，X1是K；

所述互补决定区CDR-VL1中，X1是P；

所述互补决定区CDR-VL2中，X1是G；

所述互补决定区CDR-VL3中，X2是S；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是Q；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是N；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是H；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是T；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是S；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是I；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是L；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是D；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是E；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X4是I；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X4是V；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X4是L；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是N；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是Q；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是E；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是D；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是A；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是G；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是Q；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是H；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是N；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是I；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是V；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是L；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是F；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Y；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是K；

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是R；

在一些实施方式中，各互补决定区的突变位点选自下述序列中的任一种：

在一些实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs，如3个轻链CDR或3个重链CDR。

在一些实施方式中，所述结合蛋白包括至少6个CDR。

在一些实施方式中，所述结合蛋白为抗体的“功能片段”，例如纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv(单链Fv)、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。

本领域技术人员熟知，上述功能性片段还可以通过重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。

在一些实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。

在一些实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。

在一些实施方式中，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。

在一些实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在一些实施方式中，所述恒定区来源于鼠；

在一些实施方式中，所述恒定区来源于人；

在另一些实施方案中，所述

轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；

重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

在一些实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种分离的核酸分子，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码如上所述的结合蛋白。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种载体，其包含如上所述的核酸分子。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种宿主细胞，其被如上所述的载体转化。

所述宿主细胞包括原核细胞、真核细胞、酵母或杆状病毒系统。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种制备如上所述的结合蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

在培养基中和合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的结合蛋白在制备用于癌症诊断的SCCA检测试剂中的应用。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测测试样品中SCCA的方法，其包括：

a)将所述结合蛋白固定在载体表面，加入含有SCCA抗原的待测样品与所述结合蛋白接触

b)加入第二抗体，形成所述结合蛋白-SCCA抗原-第二抗体的免疫复合物

c)检测所述结合蛋白-SCCA抗原-第二抗体的免疫复合物的存在，所述免疫复合物的存在指示所述测试样品中所述SCCA的存在。

在此实施方式中，所述结合蛋白可以由能够直接显示信号强度或能够间接协助显示信号强度的标记物标记，以使得所述复合物容易被检测。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包括如上所述的结合蛋白。

本发明的技术方案与现有技术相比，所述结合蛋白活性强，与SCCA具有很高的亲和力，且与目前市面上常见的SCCA抗体相比，具有较优的亲和力和活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中抗SCCA的重组单克隆抗体电泳图。

具体实施方式

本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。

在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。

术语定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践和/或测试，但本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，以下定义应当根据其如何定义，定义在何处提供而使用。

还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不意图为限制性的。

“包含抗体结合结构域的分离的结合蛋白”、“包含抗体结合结构域的结合蛋白”、“分离的结合蛋白”、“结合蛋白”泛指包含至少一个互补决定区的一切蛋白或蛋白片段，所述蛋白片段保持至少一种与存在于完整抗体中时该部分通常相关的功能。所述蛋白或蛋白片段包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体、线性抗体、抗体最小识别单位、抗体本身，以及这些抗体和片段的单链衍生物。

“功能片段”特别地指对于SCCA具有与母体抗体相同特异性的抗体片段。除上述功能片段外，还包括半衰期延长的任何片段。这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的抗体片段可以通过多种方法获得，包括经蛋白酶消化(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。

“抗体”泛指一切抗原化合物结合片段或包括抗原化合物结合片段的蛋白，包括多克隆抗体、单克隆抗体(例如，全长的或完整的单克隆抗体)、多价抗体(例如，具有相同特异性的两个或两个以上抗原结合位点的抗体，以允许与两个或两个以上抗原缔合)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们展现了期望的生物学活性即可)，并还可以包括某些抗体片段。抗体可以是人类的、人源化的、亲和成熟的和/或合成的。抗体可以通过本领域已知的任何方法，例如，在动物中、在组织或细胞培养物中体内地，或通过酶学或化学合成方法在体外蛋白质合成系统等中生产。可以在抗体生产中使用重组技术，所产生的抗体可以认为是重组抗体。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如人源化抗体(如嵌合抗体)及相关的合成异构形式。

“互补决定区(complementary determining region,CDR)”指抗体分子和抗原表位发生特异性结合的部位，主要由抗体可变区(variable region,V区)中重链和轻链各自的3个高变区(hypervariable region,HVR)组成的3个环形结构形成。所述CDR主要负责抗体与抗原的结合。“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端(N端)结构域。重链的可变区可以被称为“VH”。轻链的可变区可以被称为“VL”。

“骨架区(framework region,FR)”指可变区中非高变区部位，作为支架，稳定可变区的空间结构，与高变区交替出现，3个高变区被4个骨架区隔开。包括FR1、FR2、FR3和FR4。轻链和重链各自具有骨架区，称为“轻链骨架区”和“重链骨架区”。“骨架区”此用语可和“构架区”、“框架区”或“FR区”互换使用。

通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由CDR与FR按如下组合排列连接而成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

“Fab”指Fab片段，为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；“F(ab’)₂”指F(ab’)2片段，指包含通过铰链区上的二硫键连接的两个Fab片段的抗体片段；“Fv”指Fv片段，为由VL和VH结构域组成的抗体的单体抗原结合片段；“scFv”指scFv片段，为重组多肽的抗体的抗原结合片段，其中VL和VH彼此通过接头连接。

“恒定区”指抗体羧基端(C端)的结构域，轻链的恒定区称为CL，重链的恒定区称为CH。轻链由2个功能区组成，1个N端的可变区与1个C端的恒定区。重链由1个N端的可变区和3～4个C端的恒定区组成，称为CH1、CH2、CH3和CH4。

“双特异抗体”指具有两种不同特异性的抗体，其中一个特异性指向体内的效应系统，另一个特异性结合靶抗原；“人源化抗体”指抗体的可变区部分由人类抗体基因所编码的抗体，所述人源化抗体包括嵌合抗体；“嵌合抗体”指抗体抗原结合区由非人类抗体基因(如小鼠基因)所编码，而抗体恒定区由人类基因所编码的抗体，嵌合抗体具有非人抗体分子的抗原结合特异性以及由人抗体分子提供的效应物功能。

当在本文中使用时，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境取出，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽、纯化或部分纯化形式的所述多肽、重组多肽、被细胞表达或分泌的所述多肽、以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。

“亲和力”或“亲和度”指抗原与抗体结合的强度，通常指抗体的一个结合部位与一个抗原决定簇之间相互作用的强度，在本发明中使用的术语“亲和力”表示2种试剂的可逆结合的平衡常数，并表示为K_D。

“同源性”、“同一性”或“相似性”指两个肽分子序列或两个核酸分子序列之间的序列相似性。比较两个分子的同源性时，通常逐一比较两个分子序列中的位置，当所比较的序列中的等同位置为相同或相似的氨基酸或碱基时，所述分子可称作在此位置同源(相同或相似)。同源性、同一性或相似性的百分比指在所比较的序列中相同或相似的位置的数目占整个序列的数目的百分比。

本发明的示例性实施方案

在一些实施方式中，所述抗原结合结构域与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％、85％，或90％，或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％的序列同一性且与鳞状细胞癌抗原具有K_D≤1.74×10-9mol/L，K_D值也可以选择1×10^-9mol/L、2×10^-9mol/L、3×10^-9mol/L、4×10^-9mol/L、4.5×10^-9mol/L、5×10^-9mol/L、6×10^- ⁹mol/L、7×10^-9mol/L、8×10^-9mol/L、1×10^-10mol/L、2×10^-10mol/L、3×10^-10mol/L、4×10^- ¹⁰mol/L、5×10^-10mol/L、6×10^-10mol/L、7×10^-10mol/L、8×10^-10mol/L、或9×10^-10mol/L；

或者1.01×10^-10mol/L≤K_D≤8.65×10^-9mol/L；

其中，亲和力按照本发明说明书实施例中的方法测定。

本发明进一步包含至少一种编码如上所述的核酸分子的核构建体，例如质粒，进一步为表达质粒，在本申请的一个实施例中会介绍该载体的构建方法。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞，进一步的，所述原核细胞为细菌，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌或克雷伯氏菌。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为真核细胞，进一步的，所述真核细胞为哺乳动物细胞。

在本领域中，可用于表达的哺乳动物细胞系包括CHO细胞、HeLa细胞、或小鼠骨髓瘤细胞。

在一些实施方式中，所述癌症包括急性淋巴母细胞性白血病、急性骨髓源性白血病、胆管癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓源性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和尿路膀胱癌。

在一些实施方式中，所述第二抗体与所述结合蛋白结合。在一些实施方式中，所述第二抗体与所述SCCA结合；在此实施方式中，所述结合蛋白以第一抗体的形式与所述第二抗体形成配对抗体，用于结合SCCA的不同抗原表位；所述的第二抗体可以由能够直接显示信号强度或能够间接协助显示信号强度的标记物标记，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，所述免疫复合物中，所述第二抗体与所述SCCA抗原结合；在此实施方式中，所述结合蛋白作为所述第二抗体的抗原，所述的第二抗体可以由能够直接显示信号强度或能够间接协助显示信号强度的标记物标记，使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，所述标记物包括荧光物质、量子点、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、胶体金。

在一些实施方式中，所述荧光物质包括5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧10PA18059875基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、OregonGreen514、PacificBlue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、琥珀酰荧光素、双花青苷、LaJolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyaninB、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红。

在一些实施方式中，所述放射性同位素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr。

在一些实施方式中，所述化学发光标记物包括酶，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、酵母醇脱氢酶，α-甘油磷酸酯脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡糖淀粉酶或乙酰胆碱酯酶。

在一些实施方式中，所述荧光微球为聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了一种抗SCCA的重组抗体的示例性制备方法。

S1.表达质粒的构建：

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶来源于Takara公司；

MagExtractor-RNA提取试剂盒来源于TOYOBO公司；

BD SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒来源于Takara公司；

pMD-18T载体来源于Takara公司；

质粒提取试剂盒来源于天根公司；

引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成；

分泌Anti-SCCA单克隆抗体的杂交瘤细胞株为申请人已有的杂交瘤细胞株，复苏备用。

S11.引物的设计与合成：

设计扩增重链和轻链的5’RACE引物如下：

SMARTER II A Oligonucleotide：

5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3’；

5'-RACE CDS Primer(5'-CDS)：5’>(T)₂₅VN<3’(N＝A,C,G,or T；V＝A,G,or C)；

Universal Primer A Mix(UPM):5’>CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’；

Nested Universal Primer A(NUP):5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’；

mIgG CKR：5’>CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT<3’；

mIgG CHR：5’>TCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC<3’。

S12.单克隆抗体基因的克隆及测序；

从分泌Anti-SCCA单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取RNA，用SMARTER^TM RACE cDNAAmplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II A Oligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。Light Chain基因以上述Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CKR引物进行扩增，Heavy Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CHR为引物进行扩增。其中Light Chain的引物对扩增出0.73KB左右的目的条带，Heavy Chain的引物对扩增出1.42KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆4个克隆送Invitrogen公司进行测序。

S13.Anti-SCCA抗体基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为324bp，属于VkII基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；HeavyChain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为363bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

S14.重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM3.4

vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体基因测序结果，设计Anti-SCCA抗体的轻链和重链基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：

SCCA-HF：

5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTC<3’；

SCCA-HR:

5’>CCCGAATTCTCATTATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGCTCTTCTC<3’；

SCCA-LF:

5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTA<3’；

SCCA-LR:

5’>CCCGAATTCTCATTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAA<3’；

通过PCR扩增方法扩出0.73KB的Light Chain基因片段和1.42kb的Heavy Chain基因片段。Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light C hain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

S2.稳定细胞株筛选

S21.重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

包被液稀释重组SCCA抗原(自产，170926)到1μg/ml，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μl/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔)，加入显色液B液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对重组SCCA抗原都有活性。

S22.重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：Buffer 50μl、DNA 100μg/管、PuvⅠ酶10μl、无菌水补至500μl，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

S23.重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25μmol/L MSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×10⁶cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

S3.重组抗体生产

S31.细胞扩培

细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

S32.摇瓶生产及纯化

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyClone^TM Cell Boost^TM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，4μg外来对照抗体作为对照，电泳图如图1所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。

实施例2

抗体亲和力分析及活性鉴定

实施例1中得到的抗体经分析具有如SEQ ID NO:11所示序列的轻链，以及如SEQID NO:12所示的重链。

经分析，重链的互补决定区(WT)：

CDR-VH1为G-F-S(X1)-F-T-D-Q(X2)-Y-M-T(X3)；

CDR-VH2为L-I(X1)-R-N-K-P(X2)-N-G-Y-T-T-D(X3)-Y-S-A-S-I(X4)-K-G；

CDR-VH3为A-K(X1)-E-H-N(X2)-D-Y-E(X3)-R；

轻链的互补决定区(WT)：

CDR-VL1为R-P(X1)-S-A(X2)-N-I-Q(X3)-N-Y-L-A；

CDR-VL2为N-G(X1)-K-T-I(X2)-T-D；

CDR-VL3为Q-H-F(X1)-W-F-S(X2)-P-K(X3)-T；

其中，X1、X2、X3、X4均为待突变位点。

表1与抗体活性有关的突变位点

发明人将WT中的CDR位点进行上述突变，以获得活性更好的抗体。

包被液稀释重组SCCA抗原(自产，170926)到1μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的SCCA单克隆抗体，100μl/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，100μl/孔，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔)，加入显色液B液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。

表2抗体活性分析数据

从上表可知，突变1的活性效果最佳，因而以突变1作为骨架序列进一步进行突变，并对其亲和力进行检测，部分结果如下。

表3与抗体亲和力有关的突变位点

亲和力分析

利用AMC传感器，纯化出来的抗体用PBST稀释到10μg/ml，重组SCCA抗原(自产，170926)用PBST进行梯度稀释：500nmol/ml、250nmol/ml、125nmol/ml、62.5nmol/ml、31.3nmol/ml、15.6nmol/ml、7.81nmol/ml、0nmol/ml；在缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据，计算得到不同包被浓度下不同抗体浓度对应的OD值。

在同一包被浓度下，以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标，对数作图，根据拟合方程计算出50％最大OD值时的抗体浓度；带入公式：K＝(n-1)/(2×(n×Ab’-Ab))计算出亲和力常数的倒数，其中Ab和Ab’分别表示对应包被浓度(Ag、Ag’)下50％最大OD值时的抗体浓度，n＝Ag/Ag’；每两个包被浓度可以组合计算出一个K值，最后可得六个K值，取其平均数值，再求其倒数则为亲和力常数K_D，具体检测和计算结果如表4所示。

表4亲和力分析数据

从表4可以看出，表3中所述的突变序列均具有较好的亲和力，能够有效与SCCA抗原结合。为验证上述结果，以WT作为骨架序列重复上述实验，进行突变位点的亲和力验证，部分结果如下。

表5以WT为骨架进行的突变

表6亲和力分析数据

从表5和表6分析，上述突变后的序列也均具有一定的亲和力，均能够特异性与SCCA抗原结合。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞市朋志生物科技有限公司

<120> 一种鳞状细胞癌抗原的结合蛋白

<130> 2019.12.16

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr

1 5 10 15

<210> 3

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Leu Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Val Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

1 5 10 15

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

35 40 45

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

65 70 75 80

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

85 90 95

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 10

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly

<210> 11

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Ala Asn Ile Gln Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Gly Lys Thr Ile Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Leu Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Phe Ser Pro Lys

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 12

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Asp Gln

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Leu Ile Arg Asn Lys Pro Asn Gly Tyr Thr Thr Asp Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Val

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Lys Glu His Asn Asp Tyr Glu Arg Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

115 120 125

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

130 135 140

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

195 200 205

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

210 215 220

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

290 295 300

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

305 310 315 320

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

340 345 350

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

355 360 365

Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

385 390 395 400

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

405 410 415

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

420 425 430

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly

435 440

Claims

1.一种鳞状细胞癌抗原的分离的结合蛋白，包含鳞状细胞癌抗原结合结构域，其特征在于，其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：

互补决定区CDR-VH1为G-F-X1-F-T-D-X2-Y-M-X3，其中，

X1是S或T，X2是Q、N或H，X3是T或S；

互补决定区CDR-VH2为L-X1-R-N-K-X2-N-G-Y-T-T-X3-Y-S-A-S-X4-K-G，其中，

X1是I或L，X2是P或A，X3是D或E，X4是I、V或L；

互补决定区CDR-VH3为A-X1-E-H-X2-D-Y-X3-R，其中，

X1是K或R，X2是N或Q，X3是E或D；

互补决定区CDR-VL1为R-X1-S-X2-N-I-X3-N-Y-L-A，其中，

X1是A或P，X2是A或G，X3是Q、H或N；

互补决定区CDR-VL2为N-X1-K-T-X2-T-D，其中，

X1是G或A，X2是I、V或L；

互补决定区CDR-VL3为Q-H-X1-W-F-X2-P-X3-T，其中，

X1是F或Y，X2是T或S，X3是K或R；

优选的：

所述互补决定区CDR-VH1中，X1是T；

所述互补决定区CDR-VH2中，X2是A；

所述互补决定区CDR-VH3中，X1是R；

所述互补决定区CDR-VL1中，X1是A；

所述互补决定区CDR-VL2中，X1是A；

所述互补决定区CDR-VL3中，X2是T；

可选的：

所述互补决定区CDR-VH1中，X1是S；

所述互补决定区CDR-VH2中，X2是P；

所述互补决定区CDR-VH3中，X1是K；

所述互补决定区CDR-VL1中，X1是P；

所述互补决定区CDR-VL2中，X1是G；

所述互补决定区CDR-VL3中，X2是S；

优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是Q；

优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是N；

优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是H；

优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是T；

优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是S；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是I；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是L；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是D；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是E；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X4是I；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X4是V；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X4是L；

优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是N；

优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是Q；

优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是E；

优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是D；

优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是A；

优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是G；

优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是Q；

优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是H；

优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是N；

优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是I；

优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是V；

优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是L；

优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是F；

优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Y；

优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是K；

优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是R；

优选的，各互补决定区的突变位点选自下述序列中的任一种：

可选的，各互补决定区的突变位点选自下述序列中的任一种：

优选的，所述结合蛋白与上述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与鳞状细胞癌抗原具有K_D≤8.65×10^-9mol/L的亲和力。

2.如权利要求1所述鳞状细胞癌抗原的分离的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs；或者，所述结合蛋白包括至少6个CDRs；

优选的，所述结合蛋白为纳米抗体、F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种；

优选的，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3、FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4。

3.如权利要求1或2所述鳞状细胞癌抗原的分离的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列；

优选的，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgE、IgD任一恒定区的序列；

优选的，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人；

优选的，所述恒定区来源于鼠；

优选的，所述恒定区来源于人；

优选的，

所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；

所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

4.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码权利要求1～3任一项所述的结合蛋白。

5.一种载体，其包含权利要求4所述的核酸分子。

6.一种宿主细胞，其被权利要求5所述的载体转化。

7.一种生产权利要求1～3任一项所述的结合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

在合适的培养条件下培养权利要求6所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的结合蛋白。

8.权利要求1～3任一项所述的结合蛋白在制备SCCA检测试剂中的应用。

9.一种检测测试样品中的SCCA的方法，其包括：

a)将所述结合蛋白固定在载体表面，加入含有SCCA抗原的待测样品与权利要求1～3中任一项所述的结合蛋白接触；

b)加入第二抗体，形成所述结合蛋白-SCCA抗原-第二抗体的免疫复合物；

c)检测所述结合蛋白-SCCA抗原-第二抗体的免疫复合物；

优选的，在步骤a)中，所述第二抗体与所述结合蛋白结合；

优选的，在步骤a)中，所述第二抗体与所述SCCA结合。

10.一种试剂或试剂盒，其包括权利要求1～3任一项所述的结合蛋白；

优选的，所述试剂或试剂盒还包含缓冲剂、稳定剂、稀释剂或载体中的一种或多种。