KR20210114922A - 항-인간 n-말단 프로 뇌 나트륨 이뇨 펩티드의 재조합 항체 - Google Patents

항-인간 n-말단 프로 뇌 나트륨 이뇨 펩티드의 재조합 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NT-proBNP 항원 결합 도메인을 포함하는 새로운 분리된 결합 단백질에 관한 것이고, 또한 상기 결합 단백질의 제조, 응용 등 측면을 연구한다. 상기 항원 결합 도메인은 본 발명에서 한정한 아미노산 서열로부터 선택된 적어도 하나의 상보적 결정 영역을 포함하거나, 또는 하기 아미노산 서열의 상보적 결정 영역과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지고 NT-proBNP와 KD≤2.26Х10-8의 친화력을 가진다. 상기 결합 단백질은 활성이 강하고 인간 NT-proBNP 단백질과 높은 친화력을 가져 NT-proBNP 단백질 검출 분야에 널리 응용될 수 있다.

Description

항-인간 N-말단 프로 뇌 나트륨 이뇨 펩티드의 재조합 항체
본 출원은 2018년 12월 19일 중국 특허청에 출원된 출원번호가 201811557468.5이고, 발명의 명칭이 "항-인간 N-말단 프로 뇌 나트륨 이뇨 펩티드의 재조합 항체"인 중국 특허 출원의 우선권을 주장하는 바, 상술한 출원의 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
본 발명은 면역 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로는 항-인간 N-말단 프로 뇌 나트륨 이뇨 펩티드의 재조합 항체에 관한 것이다.
1988년 일본 학자 Sudoh는 처음으로 돼지 뇌에서 강력한 이뇨, 혈관 확장 및 강압 기능이 있는 폴리펩티드를 분리하여 이를 뇌 나트륨 이뇨 펩티드(Brain Natriuretic Peptide, BNP)로 명명했다. BNP의 함량은 심장에 가장 많지만 심근 세포는 108개의 아미노산을 함유하는 proBNP(프로 뇌 나트륨 이뇨 펩티드)를 먼저 합성한다. 심근 세포가 자극을 받으면, proBNP는 엔도뉴클레아제의 작용에 의해 76개의 아미노산을 함유하고 생물학적 활성이 없는 N-말단 B형 나트륨 이뇨 펩티드(NT-proBNP)와 32개의 아미노산을 함유하고 활성이 있는 B형 나트륨 이뇨 펩티드(BNP)로 분해되는데, 양자는 유래가 동일하고 동몰 분비 및 방출되어 혈액 순환에 유입된다.
심장 부피 부하가 증가하거나 심장 기능이 손상되면, N-말단 프로 뇌 나트륨 이뇨 펩티드(NT-proBNP)와 BNP의 지표 농도는 비정상적으로 증가하게 된다. 여기서 NT-proBNP는 BNP에 비해 생물학적 안정성이 우수하고, 반감기가 길며(120min), 농도가 상대적으로 안정적이고, 유효 검출 시간이 길며, 혈액 내 함량이 BNP보다 약 16~20배 높으므로, 검출이 상대적으로 용이하다. 또한 혈장 샘플은 체외에서의 안정성이 긴 시간(>48h) 유지될 수 있어서 심부전 진단 및 심장 기능 평가에 가장 적합한 심근 마커이다.
정상인의 혈액 내 NT-proBNP 함량은 일반적으로 0.3ng/mL 미만이다. 심장 기능이 손상되고 심근이 확장되면, NT-proBNP는 빠르게 합성되어 대량으로 분비 및 방출되어 인체 혈액 내로 유입된다. 관련 초기 증상이 발견되면, 혈액 내 NT-proBNP의 양을 정확하고 원활하게, 효율적이고 안정적으로 측정하여 초기 심부전, 심장 쇠약, 호흡 곤란을 동반한 심인성 및 비 심인성 심장 쇠약 치료 및 예후 모니터링, 급성 관상동맥 증후군의 분류 등에 빠르고 정확한 초기 진단 증거를 제공한다. 현재 NT-proBNP의 함량을 검출하는데 사용되는 방법은 주로 금 보정 테스트, 형광 면역 분석, 효소 면역 분석법(ELISA) 및 화학 발광 미세입자 면역 분석법(CMIA)을 포함하나, 이러한 측정 방법은 NT-proBNP에 대한 특이성 모노클로날 항체가 필요하나, 현재 국내의 NT-proBNP를 검출하기 위한 모노클로날 항체의 감도와 특이성은 모두 이상적이지 못하다.
본 발명은 N-말단 프로 뇌 나트륨 이뇨 펩티드(NT-proBNP) 항원 결합 도메인을 포함하는 새로운 분리된 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 결합 단백질의 제조, 응용 등 측면을 연구한다.
여기서, 상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열로부터 선택된 적어도 하나의 상보적 결정 영역을 포함하거나, 또는 하기 아미노산 서열의 상보적 결정 영역과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지고 NT-proBNP와 KD≤2.26Х10-8의 친화력을 가지는데,
상보적 결정 영역 CDR-VH1은 G-X1-S-X2-T-T-Y-Y-X3-D이고, 여기서,
X1은 P 또는 F이고, X2는 I, V 또는 L이며, X3은 I, V 또는 L임;
상보적 결정 영역 CDR-VH2는 M-T-K-D-X1-N-A-V-H-X2-P-T-X3-R-S이고, 여기서,
X1은 G 또는 A이고, X2는 Q 또는 N이며, X3은 I, V 또는 L임;
상보적 결정 영역 CDR-VH3은 V-X1-G-X2-I-D-X3-G이고, 여기서,
X1은 K 또는 R이고, X2는 I, V 또는 L이며, X3은 F 또는 W임;
상보적 결정 영역 CDR-VL1은 G-S-S-D-X1-V-G-X2-G-D-Y-X3-N이고, 여기서,
X1은 Q 또는 N이고, X2는 F 또는 P이며, X3은 I, V 또는 L임;
상보적 결정 영역 CDR-VL2는 I-F-X1-A-X2-S-R-X3-R-G이고, 여기서,
X1은 A 또는 G이고, X2는 T, Y 또는 S이며, X3은 I, V 또는 L임;
상보적 결정 영역 CDR-VL3은 G-S-X1-N-S-R-X2-Y-V-X3-G이고, 여기서,
X1은 P, A 또는 G이고, X2는 GG 또는 N이며, X3은 W 또는 F이다.
중요한 이점은 상기 결합 단백질이 활성이 강하고 인간 NT-proBNP와 높은 친화력을 구비한다는 것이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서:
상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 F이고;
상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X1은 G이며;
상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 R이고;
상기 상보적 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 F이며;
상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 G이고;
상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X3은 F이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 I이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 V이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 L이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 I이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 V이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 L이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 Q이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 N이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 I이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 V이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 L이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 I이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 V이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 L이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 F이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 W이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 Q이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 N이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-V L1에서, X3은 I이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-V L1에서, X3은 V이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-V L1에서, X3은 L이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 T이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 Y이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 S이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X3은 I이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X3은 V이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X3은 L이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 P이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 A이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 G이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 GG이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 N이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 각 상보적 결정 영역의 돌연변이 부위는 아래 돌연변이 조합 중의 어느 하나로부터 선택된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDRs(예를 들어, 3개의 경쇄 CDR 또는 3개의 중쇄 CDR)을 포함하거나, 또는 적어도 6개의 CDRs를 포함한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 결합 단백질은 가변 영역과 불변 영역을 포함하는 완전한 항체이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 결합 단백질은 서열이 순차적으로 SEQ ID NO:1-4로 표시되는 경쇄 골격 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4를 포함하고, 및/또는 서열이 순차적으로 SEQ ID NO:5-8로 표시되는 중쇄 골격 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 결합 단백질은 항체의 불변 영역 서열을 더 포함한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중의 어느 하나의 불변 영역 서열로부터 선택된다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 불변 영역의 종은 소, 말, 젖소, 돼지, 양, 염소, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 밍크, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 싸움닭 또는 인간에서 유래된다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 불변 영역은 양에서 유래되며;
경쇄 불변 영역 서열은 SEQ ID NO:9로 표시되고;
중쇄 불변 영역 서열은 SEQ ID NO:10으로 표시된다.
본 발명은 또한 상기와 같은 결합 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기와 같은 벡터에 의해 전환되는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 배지에서 적절한 배양 조건 하에서 상기와 같은 숙주 세포를 배양하고, 배지 또는 배양된 숙주 세포에서 상기와 같이 생성된 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 상기와 같은 결합 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 또한 심부전 진단 및 심장 기능 평가용 진단제의 제조에 있어서 상기와 같은 결합 단백질의 응용에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 또한,
a) 항체/항원 결합 반응이 일어나기에 충분한 조건 하에서, 상기 테스트 샘플의 NT-proBNP 항원을 상기와 같은 결합 단백질과 접촉시켜 면역 복합물을 형성하는 단계; 및
b) 상기 테스트 샘플 중 상기 NT-proBNP의 존재를 지시하는 상기 면역 복합물의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 테스트 샘플 중의 NT-proBNP의 검출 방법에 관한 것이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, a)단계에서, 상기 면역 복합물은 제2 항체를 더 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 결합 단백질과 결합한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, a)단계에서, 상기 면역 복합물은 제2 항체를 더 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 NT-proBNP와 결합한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 또한 상기와 같은 결합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 NT-proBNP 관련 질병의 진단에 있어서 상술한 결합 단백질의 응용에 관한 것이다.
본 발명은 또한,
A) 결합 반응이 일어나기에 충분한 조건 하에서, 피험자로부터의 샘플과 상기와 같은 결합 단백질을 접촉시켜 결합 반응을 수행하는 단계; 및
B) 결합 반응에 의해 생성된 면역 복합물을 검출하는 단계; 를 포함하고,
상기 면역 복합물의 존재는 NT-proBNP 관련 질병의 존재를 지시하거나 심장 기능 수준을 지시하는 NT-proBNP 관련 질병을 진단하거나 심장 기능을 평가하는 방법에 관한 것이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 방법은 형광 면역 기술, 화학 발광 기술, 콜로이드 금 면역 기술, 방사성 면역 분석 및/또는 효소 면역 기술을 기반으로 한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 샘플은 전혈, 말초 혈액, 혈청, 혈장 또는 심근 조직 중 적어도 하나로부터 선택된다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 피험자는 포유 동물, 바람직하게는 영장류 동물, 보다 바람직하게는 인류이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 NT-proBNP 관련 질병은 심장 질병이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 NT-proBNP 관련 질병은 심장 쇠약, 심부전, 심인성 호흡 곤란, 폐인성 호흡 곤란, 급성 관상동맥 증후군 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 심부전은 심인성 심부전 또는 비 심인성 심부전이다.
본 발명의 구체적인 실시형태 또는 종래 기술의 기술적 해결수단을 보다 명확하게 설명하기 위해, 이하, 발명의 구체적인 실시형태 또는 종래 기술의 설명에 사용될 도면을 간략하게 설명한다. 이하의 설명에서 도면은 본 발명의 일부 실시형태이고, 당업자에게 있어서, 창조성 작업을 진행하지 않는 전제하에, 이러한 도면으로부터 다른 도면을 얻을 수 있음이 자명하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 항-인간 NT-proBNP의 모노클로날 항체의 전기 영동도이다.
본 발명은 본 발명의 일부 실시형태에 대한 이하의 설명 및 이에 포함된 실시예의 상세한 내용을 통해 보다 쉽게 이해될 수 있다.
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 상기 특정 실시형태에 한정되지 않음을 이해해야 한다. 그 이유는 이러한 실시형태는 반드시 다양하기 때문이다. 또한 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시형태을 설명하기 위한 것일뿐, 한정하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 그 이유는 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 정의되기 때문이다.
명사의 정의
"항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질"은 일반적으로 CDR 영역을 포함하는 모든 단백질/ 단백질 조각을 말한다. 용어 "항체"는 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 및 이러한 항체의 항원 화합물 결합 조각을 포함하고, Fab, F(ab')2, Fd, Fv, scFv, 이중 특이성 항체 및 항체 최소 인식 단위, 및 이러한 항체와 조각의 단일 사슬 유도체를 포함한다, 항체의 유형은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD를 선택할 수 있다. 또한, 용어 "항체"는 천연 발생 항체 및 비 천연 발생 항체를 포함하고, 예를 들어, 키메릭(chimeric), 이작용성(bifunctional) 및 인간화(humanized) 항체 및 관련 합성 이소폼(isoforms)을 포함한다. 용어 "항체"는 "면역 글로불린"과 상호 교환하여 사용될 수 있다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄 아미노 말단 도메인을 말한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있고, 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 지칭될 수 있다. 이러한 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분으로서, 항원 결합 부위를 포함한다. 경쇄 또는 중쇄 가변 영역(VL 또는 VH)은 "상보적 결정 영역" 또는 "CDR"로 불리우는 3개의 골격 영영으로 구성되며, 3개의 상보적 결정 영역은 이격된다. 골격 영역 및 CDR의 범위는 예를 들어, Kabat("면역학적 관심 단백질 서열" (Sequences of Proteins of Immunological Interest), E.Kabat 등, 미국 보건 복지부(U.S.Department of Health and Human Services), (1983)) 및 Chothia에 이미 정확하게 정의되어 있다. 항체의 골격 영역은 주로 항원과의 결합을 담당하는 CDR의 위치를 정하고 정렬하는 역할을 수행한다.
본 명세서에 사용되는 경우, "골격 영역", "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 항체 가변 도메인의 CDR로 정의된 영역 이외의 영역을 의미한다. 각 항체 가변 도메인 프레임워크 영역은 CDR에 의해 분할된 인접 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 더 세분화될 수 있다.
일반적으로, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 VL/VH는 하기와 같이 넘버링된 CDR과 FR의 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 조합으로 배열 및 연결되어 얻을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 경우, 폴리펩티드 또는 핵산 관련 용어 "정제된" 또는 "분리된"은 폴리펩티드 또는 핵산이 천연 배지 또는 천연 형태가 아님을 의미한다. 따라서, 용어 "분리된"은 원래 환경, 예를 들어 자연적으로 존재하는 경우에 자연 환경으로부터 추출된 폴리펩티드 또는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 분리된 폴리펩티드는 일반적으로 이에 결합되거나 이와 혼합되거나 용액 내의 적어도 일부 단백질 또는 기타 세포 성분을 포함하지 않는다. 분리된 폴리펩티드는 세포 분해물에 포함된 자연적으로 존재하는 상기 폴리펩티드, 정제 또는 부분 정제 형태의 상기 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드, 세포에 의해 발현되거나 분비되는 상기 폴리펩티드, 및 이종 숙주 세포 또는 배양물 중의 상기 폴리펩티드를 포함한다. 핵산과 관련하여, 용어 "분리된" 또는 "정제된"은 예를 들어, 상기 핵산이 천연 게놈 맥락에 있지 않음을 나타낸다(예를 들어, 벡터에서, 발현 카세트로서 프로모터에 연결되거나 이종 숙주 세포에 인위적으로 도입됨).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "이중 특이성 항체" 또는 "이중 기능성 항체"는 2쌍의 상이한 중쇄/경쇄 및 2개의 상이한 결합 부위를 구비한 인공 하이브리드 결합 단백질을 말한다. 이중 특이성 결합 단백질은 하이브리도마 또는 Fab' 조각 연결을 포함하는 다양한 방법을 통해 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성"은 적어도 2개의 상이한 서열 간의 유사성을 말한다. 해당 백분율 동일성은 예를 들어 기본 지역 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST); Needleman 등의 알고리즘; 또는 Meyers 등의 알고리즘과 같은 표준 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 하나의 파라미터 세트는 Blosum(62) 스코어링 매트릭스 및 갭 페널티(12), 갭 확장 페널티(4), 프레임시프트 갭 페널티(5)일 수 있다. 하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 간의 백분율 동일성은 Meyers 및 Miller((1989)CABIOS 4: 11-17) 알고리즘을 사용하여 결정할 수도 있는데, 상기 알고리즘은 PAM120 가중치 잔류 테이블, 갭 길이 페널티(12), 및 갭 페널티(4)를 사용하여 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합되었다. 백분율 동일성은 일반적으로 유사한 길이의 서열을 비교하여 계산된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화력"은 결합 단백질 또는 항체의 항원 결합 도메인과 항원 또는 항원 에피토프의 결합 강도를 말한다. 친화력은 KD값으로 가늠할 수 있고, KD값이 작을 수록 친화력이 커진다.
본 발명의 예시적인 실시형태
본 발명은 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열로부터 선택된 적어도 하나의 상보적 결정 영역을 포함하거나, 또는 하기 아미노산 서열의 상보적 결정 영역과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지고 NT-proBNP와 KD≤2.26Х10-8의 친화력을 가지며;
상보적 결정 영역 CDR-VH1은 G-X1-S-X2-T-T-Y-Y-X3-D이고, 여기서,
X1은 P 또는 F이고, X2는 I, V 또는 L이며, X3은 I, V 또는 L임;
상보적 결정 영역 CDR-VH2는 M-T-K-D-X1-N-A-V-H-X2-P-T-X3-R-S이고, 여기서,
X1은 G 또는 A이고, X2는 Q 또는 N이며, X3은 I, V 또는 L임;
상보적 결정 영역 CDR-VH3은 V-X1-G-X2-I-D-X3-G이고, 여기서,
X1은 K 또는 R이고, X2는 I, V 또는 L이며, X3은 F 또는 W임;
상보적 결정 영역 CDR-VL1은 G-S-S-D-X1-V-G-X2-G-D-Y-X3-N이고, 여기서,
X1은 Q 또는 N이고, X2는 F 또는 P이며, X3은 I, V 또는 L임;
상보적 결정 영역 CDR-VL2는 I-F-X1-A-X2-S-R-X3-R-G이고, 여기서,
X1은 A 또는 G이고, X2는 T, Y 또는 S이며, X3은 I, V 또는 L임;
상보적 결정 영역 CDR-VL3은 G-S-X1-N-S-R-X2-Y-V-X3-G이고, 여기서,
X1은 P, A 또는 G이고, X2는 GG 또는 N이며, X3은 W 또는 F이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "N-말단 프로 뇌 나트륨 이뇨 펩티드(NT-proBNP)" 및 "N-말단 B형 나트륨 이뇨 펩티드"가 상호 교환적으로 사용될 수 있다는 것은 프로 뇌 나트륨 이뇨 펩티드 또는 B형 나트륨 이뇨 펩티드가 효소적 절단된 후, 예를 들어, 엔도뉴클레아제에 의해 효소적 절단된 후 생성된 비 생물학적 활성 N-말단 조각을 말한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 항원 결합 도메인과 하기 아미노산 서열의 상보적 결정 영역은 적어도 50%, 또는 적어도 55%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 65%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지며, 또한 NT-proBNP와 KD≤2.26Х10-8mol/L의 친화력을 갖되, KD값은 1Х10-9mol/L, 2Х10-9mol/L, 3Х10-9mol/L, 4Х10-9mol/L, 4.5Х10-9mol/L, 5Х10-9mol/L, 6Х10-9mol/L, 7Х10-9mol/L, 8Х10-9mol/L, 9Х10-9mol/L, 1Х10-10mol/L, 3Х10-10mol/L, 5Х10-10mol/L, 7Х10-10mol/L, 9Х10-10mol/L 또는 1Х10-8mol/L의 친화력을 선택할 수도 있으며;
또는 8.10Х10-10mol/L≤KD≤2.26Х10-8mol/L이거나;
또는 KD는 1Х10-9mol/L, 2Х10-9mol/L, 3Х10-9mol/L, 4Х10-9mol/L, 4.5Х10-9mol/L, 5Х10-9mol/L, 6Х10-9mol/L, 7Х10-9mol/L, 8Х10-9mol/L, 9Х10-9mol/L, 1Х10-10mol/L, 3Х10-10mol/L, 5Х10-10mol/L, 7Х10-10mol/L, 9Х10-10mol/L 또는 1Х10-8mol/L보다 작거나 같고;
여기서, 친화력은 본 발명의 명세서의 방법에 따라 측정된다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서:
상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 F이며;
상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X1은 G이고;
상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 R이며;
상기 상보적 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 F이고;
상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 G이며;
상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X3은 F이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 I이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 V이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 L이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 I이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 V이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 L이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 Q이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 N이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 I이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 V이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 L이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 I이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 V이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 L이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 F이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 W이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 Q이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 N이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-V L1에서, X3은 I이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-V L1에서, X3은 V이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-V L1에서, X3은 L이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 T이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 Y이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 S이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X3은 I이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X3은 V이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X3은 L이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 P이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 A이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 G이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 GG이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 N이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 각 상보적 결정 영역의 돌연변이 부위는 아래 돌연변이 조합 중의 어느 하나로부터 선택된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 본 발명에 기재된 결합 단백질의 6개의 CDR 영역에 나타난 X1은 각각 독립적으로 본 발명에서 한정한 아미노산을 표시하고; 본 발명에 기재된 결합 단백질의 6개의 CDR 영역에 나타난 X2는 각각 독립적으로 본 발명에서 한정한 아미노산을 표시하며; 본 발명에 기재된 결합 단백질의 6개의 CDR 영역에 나타난 X3은 각각 독립적으로 본 발명에서 한정한 아미노산을 표시한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDRs(예를 들어, 3개의 경쇄 CDR 또는 3개의 중쇄 CDR)을 포함하거나, 또는 적어도 6개의 CDRs를 포함한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 결합 단백질은 가변 영역과 불변 영역을 포함하는 완전한 항체이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 결합 단백질은 항체의 "기능적 조각", 예를 들어, 나노바디, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중 특이성 항체 및 항체 최소 인식 단위 중의 하나이다.
scFv(sc=단일 사슬), 이중 특이성 항체(diabodies).
본 발명에 기재된 "기능적 조각"은 특히 NT-proBNP에 대해 모 항체와 동일한 특이성을 구비한 항체 조각을 말하며, 상기 기능적 조각 이외에 반감기가 증가한 임의의 조각을 더 포함한다.
이러한 기능적 조각은 일반적으로 이의 유래 항체와 동일한 결합 특이성을 구비한다. 당업자는 본 발명의 명세서에 기재된 내용으로부터 본 발명의 항체 조각이 효소적 소화와 같은 방법(펩신 또는 파파인 포함) 및/또는 화학적 환원에 의해 이황화 결합을 분렬하는 방법으로 상기 기능적 조각을 얻을 수 있음을 유추할 수 있다.
항체 조각은 또한 당업자에게 공지된 재조합 유전학 기술에 의해 획득될 수 있거나, 예를 들어, Applied BioSystems 등에서 판매하는 자동 펩타이드 합성기와 같은 자동 펩타이드 합성기를 통한 펩타이드 합성에 의해 획득될 수 있다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 결합 단백질은 서열이 순차적으로 SEQ ID NO:1-4로 표시되는 경쇄 골격 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4를 포함하고, 및/또는 서열이 순차적으로 SEQ ID NO:5-8로 표시되는 중쇄 골격 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함한다.
인간화 항체를 구성하기 위해, 본원 발명에서 상기 개시된 아미노산 서열 이외에, 골격 영역의 종은 인간에서 유래될 수 있음에 유의해야 한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 결합 단백질은 항체의 불변 영역 서열을 더 포함한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중의 어느 하나의 불변 영역 서열로부터 선택된다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 불변 영역의 종은 소, 말, 젖소, 돼지, 양, 염소, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 밍크, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 싸움닭 또는 인간에서 유래된다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 불변 영역은 양에서 유래되고;
경쇄 불변 영역 서열은 SEQ ID NO:9로 표시되며;
중쇄 불변 영역 서열은 SEQ ID NO:10으로 표시된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 또한 상기와 같은 결합 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자에 관한 것으로, 상기 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 또한 상기와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 플라스미드와 같은 상기 핵산 분자를 코딩하는 적어도 하나의 핵 구축물을 더 포함한다, 나아가 플라스미드를 발현시키기 위해, 상기 벡터의 구축 방법은 본원 발명의 일 실시예에 소개된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 또한 상기와 같은 벡터에 의해 전환되는 숙주 세포에 관한 것이다.
상기 숙주 세포는 포유 동물 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 또한 배지에서 적절한 배양 조건 하에서 상기와 같은 숙주 세포를 배양하고, 배지 또는 배양된 숙주 세포에서 상기와 같이 생성된 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 상기와 같은 결합 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 또한 심부전 진단 및 심장 기능 평가용 진단제의 제조에 있어서 상기와 같은 결합 단백질의 응용에 관한 것이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 암에는 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담관암, 유방암, 자궁 경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 대장암, 자궁 내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 호지킨 림프종, 폐암, 갑상선 수질암, 비 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신장암, 난소암, 췌장암, 신경교종, 흑색종, 간암, 전립선암 및 방광암이 포함된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 또한,
a) 항체/항원 결합 반응이 일어나기에 충분한 조건 하에서, 상기 테스트 샘플의 NT-proBNP 항원을 상기와 같은 결합 단백질과 접촉시켜 면역 복합물을 형성하는 단계; 및
b) 상기 테스트 샘플 중 상기 NT-proBNP의 존재를 지시하는 상기 면역 복합물의 존재를 검출하는 단계; 를 포함하는 테스트 샘플 중의 NT-proBNP의 검출 방법에 관한 것이다.
해당 실시형태에서, 상기 복합물이 용이하게 검출되도록, 상기 결합 단백질은 신호 강도를 표시하는 지시제로 라벨링할 수 있다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, a)단계에서, 상기 면역 복합물은 제2 항체를 더 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 결합 단백질과 결합한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, a)단계에서, 상기 면역 복합물은 제2 항체를 더 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 NT-proBNP와 결합한다.
해당 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 NT-proBNP의 상이한 항원 에피토프에 결합하기 위한 제1 항체의 형태로 상기 제2 항체와 페어링 항체를 형성하고;
상기 제2 항체는 상기 복합물이 용이하게 검출되도록, 신호 강도를 표시하는 지시제로 라벨링할 수 있다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, a)단계에서, 상기 면역 복합물은 제2 항체를 더 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 NT-proBNP 항원과 결합하며;
해당 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 상기 제2 항체의 항원으로서, 상기 복합물이 용이하게 검출되도록, 상기 제2 항체는 신호 강도를 표시하는 지시제로 라벨링할 수 있다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 신호 강도를 표시하는 지시제는 형광 물질, 양자점, 디곡시제닌 표지 프로브, 비오틴, 방사성 동위원소, 방사성 조영제, 상자성 이온 형광 마이크로 스피어, 전자 밀도 물질, 화학 발광 마커, 초음파 조영제, 감광제, 콜로이드 금 또는 효소 중의 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 형광 물질은 Alexa 350, Alexa 405, Alexa 430, Alexa 488, Alexa 555, Alexa 647, AMCA, 아미노아크리딘, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 5-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시 플루오레세인, 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로 플루오레세인, 5-카르복시 플루오레세인, 5-카르복시 로다민, 6-카르복시 로다민, 6-카르복시테트라메닐 로다민, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 6-FAM, 단실클로라이드, 플루오레세인, HEX, 6-JOE, NBD(7-니트로벤조-2-옥사-1, 3-디아졸), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green514, Pacific Blue, 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레졸솔리드바이올렛, 크레졸블루바이올렛, 브릴리언트크레졸블루, P-아미노벤조산, 에리트로신, 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 숙시닐 플루오레세인, 희토류 금속 크립 화합물 , 트리스-비스피리딜디아민유로퓸, 유로퓸 크립 화합물 또는 킬레이트, 디아민, 디안토시아닌, La Jolla 블루염료, 알로피코시아닌, allococyanin B, 피코시아닌 C, 피코시아닌 R, 티아민, 피코에리트린, 피코에리트린 R, REG, 로다민 그린, 로다민 이소티오시아네이트, 로다민 레드, ROX, TAMRA, TET, TRIT(테트라메틸 로다민 이소티올), 테트라메틸 로다민 및 텍사스 레드 중의 어느 하나이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154- 158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb 및 83Sr 중의 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 효소는 겨자무과 산화효소, 알칼리인산 분해효소 및 포도당 산화효소 중의 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 형광 마이크로 스피어는 폴리스티렌 형광 마이크로 스피어이고, 내부에 희토류 형광 이온 유로퓸이 감싸져 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 또한 상기와 같은 결합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 NT-proBNP 관련 질병의 진단에 있어서 본 명세서에 기재된 결합 단백질의 응용에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "NT-proBNP 관련 질병"은 단백질 또는 코딩 핵산을 포함하는 NT-proBNP를 마커로 하는 질병을 말한다. 특히, 본 발명의 하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, NT-proBNP 관련 질병은 전혈, 혈장 또는 혈청과 같은 혈액에서 NT-proBNP 수준의 증가를 특징으로 하는 질병을 말할 수 있다.
본 발명은 또한,
A) 결합 반응이 일어나기에 충분한 조건 하에서, 피험자로부터의 샘플과 본 발명에 기재된 결합 단백질을 접촉시켜 결합 반응을 수행하는 단계; 및
B) 결합 반응에 의해 생성된 면역 복합물을 검출하는 단계; 를 포함하고,
상기 면역 복합물의 존재는 NT-proBNP 관련 질병의 존재를 지시하거나 심장 기능 수준을 지시하는 NT-proBNP 관련 질병을 진단하거나 심장 기능을 평가하는 방법에 관한 것이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 방법은 형광 면역 기술, 화학 발광 기술, 콜로이드 금 면역 기술, 방사성 면역 분석 및/또는 효소 면역 기술을 기반으로 한다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 샘플은 전혈, 말초 혈액, 혈청, 혈장 또는 심근 조직 중 적어도 하나로부터 선택된다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 피험자는 포유 동물, 바람직하게는 영장류 동물, 보다 바람직하게는 인류이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 NT-proBNP 관련 질병은 심장 질병이다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 NT-proBNP 관련 질병은 심장 쇠약, 심부전, 심인성 호흡 곤란, 폐인성 호흡 곤란, 급성 관상동맥 증후군 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나 또는 복수 개의 실시형태에 있어서, 상기 심부전은 심인성 심부전 또는 비 심인성 심부전이다.
본 발명의 실시형태는 이하 실시예를 통해 자세히 설명될 것이나 당업자는 하기 실시예가 본 발명을 설명하기 위해서만 사용될 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 이해할수 있을 것이다. 실시예에 구체적 조건이 표시되지 않은 경우, 기존 조건 또는 제조업체가 권장하는 조건에 따라 수행한다. 제조업체의 표시 없이 사용되는 시약 또는 기기는 모두 상업적으로 구입할 수 있는 기존 제품이다.
실시예 1
본 실시예는 항-인간 NT-proBNP 재조합 항체의 예시적인 제조 방법을 제공한다.
S1. 발현 플라스미드의 구축:
본 실시예에서, 제한성 엔도뉴클레아제, Prime Star DNA 중합 효소는 Takara사에서 구입하고;
MagExtractor -RNA 추출 키트는 TOYOBO사에서 구입하였으며;
BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit는 Takara사에서 구입하고;
pMD-18T 벡터는 Takara사에서 구입하였으며;
플라스미드 추출 키트는 Tiangen사에서 구입하고;
프라이머 합성 및 유전자 시퀀싱은 Invitrogen사에서 완료하였으며;
Anti-NT-proBNP 8B9 모노클로날 항체 분비는 기존 하이브리도마 세포주를 소생시키기 위해 준비한다.
S11, 프라이머의 설계 및 합성:
중쇄 및 경쇄의 증폭을 위한 5'RACE 업스트림 프라이머:
SMARTER II A 올리고 뉴클레오티드:
5' >AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3';
5'-RACE CDS 프라이머(5'-CDS): 5' >(T)25VN<3' (N=A,C,G,orT;V=A,G,orC);
범용 프라이머 A 혼합물(UPM):
5' >CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3';
중첩 범용 프라이머A(NUP):
5' >AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3';
mkR: 5' > CCCGAATTCCTAAGAACACTCTGAGGGCTTCACTG <3';
mHR: 5' > CCCGAATTCTCATTTACCCGGAGGCTTAGAGAT <3'.
S12, 항체 가변 영역 유전자의 클로닝 및 시퀀싱:
Anti-NT-proBNP 8B9 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주에서 RNA를 추출하고, SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit 및 키트 내의 SMARTER II A 올리고 뉴클레오티드와 5'-CDS 프라이머를 사용하여 첫번째 가닥의 cDNA 합성을 수행하여 획득한 첫번째 가닥의 cDNA 결과물을 PCR 증폭 주형으로 한다. 경쇄 유전자는 범용 프라이머 A 혼합물(UPM), 중첩 범용 프라이머 A(NUP) 및 mkR로 증폭하고, 중쇄 유전자는 범용 프라이머 A 혼합물(UPM), 중첩 범용 프라이머 A(NUP) 및 mHR로 증폭한다. 여기서 경쇄의 프라이머쌍은 약 0.7KB의 표적 밴드를 증폭하고, 중쇄의 프라이머쌍은 약 1.4KB의 표적 밴드를 증폭한다. 아가로스겔 전기 영동으로 정제 및 회수한 결과물을 rTaq DNA 중합 효소와 A 반응시킨 후 pMD-18T 벡터에 삽입하여 DH5α 컴피턴트 세포에 전환하고, 다음 균총이 성장한 후 중쇄 및 경쇄 유전자 클론에서 각각 4개의 클론을 취하여 Invitrogen사에 보내 시퀀싱을 수행한다.
S13, Anti-NT-proBNP 8B9 항체 가변 영역 유전자의 서열 분석:
상기 시퀀싱을 통해 얻은 유전자 서열을 IMGT 항체 데이터베이스에 넣고 분석을 수행하였으며, VNTI11.5 소프트웨어를 사용하여 분석을 통해 중쇄 및 경쇄 프라이머쌍에 의해 증폭된 유전자가 모두 정확한지 여부를 결정한다. 여기서 경쇄에서 증폭된 유전자 조각 중 VL 유전자 서열은 VkII유전자 패밀리에 속하는 402bp이고, 이의 앞에는 60bp의 리더 펩타이드 서열이 존재하며; 중쇄 프라이머쌍에 의해 증폭된 유전자 조각 중 VH유전자 서열은 VH1유전자 패밀리에 속하는 402bp이고, 이의 앞에는 57bp의 리더 펩타이드 서열이 존재한다.
S14, 재조합 항체 발현 플라스미드의 구축:
pcDNATM 3.4 TOPO® 벡터는 구축된 재조합 항체 진핵 발현 벡터로서, 상기 발현 벡터는 HindIII, BamHI, EcoRI 등 폴리클로날 효소적 절단 부위를 도입하여 pcDNA3.4A 발현 벡터로 명명되고 이는 하기에서 3.4A 발현 벡터로 약칭되며; 상기 pMD-18T 중 항체 가변 영역 유전자의 시퀀싱 결과에 따라 Anti-NT-proBNP 8B9 항체의 VL 및 VH 유전자 특이성 프라이머를 설계하였으며, 양단에 각각 HindIII, EcoRI 효소적 절단 부위 및 보호 염기가 구비된다. 프라이머는 하기와 같다.
NT-proBNP 8B9-HF:
5' > CCCAAGCTTGCCACCATGAACCCACTGTGGACCCTCCTCTTT <3';
NT-proBNP 8B9-HR:
5' > CCCGAATTCTCATTTACCCGGAGGCTTAGAGAT <3';
NT-proBNP 8B9-LF:
5' > CCCAAGCTTGCCACCATGGCCTGGTCCCCTCTGCTCCTCAC <3';
NT-proBNP 8B9-LR:
5' > CCCGAATTCCTAAGAACACTCTGAGGGCTTCACTG <3';
PCR 증폭 방법으로 0.7KB의 경쇄 유전자 조각 및 1.4kb의 중쇄 유전자 조각을 증폭시켰다. 중쇄 및 경쇄 유전자 조각은 각각 HindIII/EcoRI 이중 효소적 절단으로 절단되고, 3.4A 벡터는 HindIII/EcoRI 이중 효소적 절단으로 절단되었으며, 조각과 벡터를 정제 및 회수한 후 중쇄 유전자와 경쇄 유전자를 각각 3.4A 발현 벡터에 연결하여 각각 중쇄와 경쇄의 재조합 발현 플라스미드를 획득한다.
S2. 안정한 세포주를 스크리닝한다.
S21. 재조합 항체 발현 플라스미드를 CHO 세포에 일시적으로 감염시켜 발현 플라스미드 활성을 결정한다.
플라스미드를 초순수로 400ng/ml로 희석하고, 원심분리 튜브에서 CHO 세포를 1.43Х107cells/ml로 조절하였으며, 100ul 플라스미드를 700ul 세포와 혼합하고 전기 천공 컵으로 옮겨 전기 천공하였으며, 3일째, 5일째, 7일째에 샘플링 및 카운트하고, 7일째에 샘플을 받아 검출을 수행한다.
코팅액으로 재조합 NT 항원(자체 생산, 161213)을 지정된 농도로 희석하고, 웰당 100uL, 4℃에서 밤을 보낸 후; 다음날, 세척액으로 2회 세척한 후 두드려 건조시켰으며; 차단 용액(20%BSA+80%PBS)을 첨가하고 웰당 120uL, 37℃에서 1h 동안 두드려 건조시켰으며; 희석된 세포 상청액을 100uL/well, 37℃에서 30min(일부 상청액의 경우, 1h) 동안 첨가하였으며; 세척액으로 5회 세척한 후 두드려 건조시켰으며; IgG-HRP를 웰당 100uL, 37℃, 30min 동안 첨가하고; 세척액으로 5회 세척한 후 두드려 건조시켰으며; 발색액 A(50uL/well)를 첨가하고, 발색액 B(50uL/well)를 10min 동안 첨가하였으며; 정지액을 50uL/well로 첨가하고; 마이크로 플레이트 리더 중 450nm(630nm 참조)에서 OD값을 판독한다. 그 결과, 세포 상청액을 100배 희석한 후에도 반응 OD가 여전히 1.0 보다 크고, 세포 상청액이 첨가되지 않은 웰 반응 OD는 0.1 미만으로, 이는 플라스미드 일시적 전환 후 생성된 항체가 재조합 NT 단백질에 대해 모두 활성을 가짐을 나타낸다.
S22. 재조합 항체 발현 플라스미드 선형화
하기와 같이 시약을 준비한다: Buffer 50ul, DNA 100ug/tube, Puv I 효소 10ul, 멸균수를 500ul로 보충하고, 37℃ 수욕 효소적 절단하여 밤을 보냈으며; 먼저 동일한 부피의 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(하층)을 25:24:1로 사용한 후, 클로로포름(수상)으로 순차적으로 추출하고; 0.1배 부피(수상)의 3M 아세트산나트륨 및 2배 부피의 에탄올을 얼음에 침전시켜 70%의 에탄올로 침전물을 헹구어 유기용매를 제거하였으며, 에탄올이 완전히 휘발된 후 적당량의 멸균수로 재용해하고 마지막으로 농도를 측정한다.
S23. 재조합 항체 발현 플라스미드를 안정적으로 감염시키고 가압하여 안정한 세포주를 스크리닝함.
플라스미드를 초순수로 400ng/ml로 희석하고, 원심분리 튜브에서 CHO 세포를 1.43Х107cells /ml로 조절하였으며, 100ul 플라스미드를 700ul 세포와 혼합하고 전기 천공 컵으로 옮겨 전기 천공하여 다음날 카운트하고; 25 umol/L MSX 96웰에서 약 25일 동안 가압 배양한다.
현미경으로 라벨링된 세포가 있는 클론 웰을 관찰하고 회합도를 기록하였으며; 배양 상청액을 취하여 검출을 위해 샘플을 보내고; 항체 농도 및 상대적 농도가 높은 세포주를 선택하여 24웰로 옮긴 후 3일 정도에 6웰로 옮기고; 3일 후 종자 보존 및 배치로 배양을 수행하였으며 세포 밀도를 0.5Х106cells/ml로 조정하고, 2.2ml는 배치로 배양하고, 세포 밀도는 0.3Х106cells/ml이고, 2ml는 종자 보존하며; 7일째에 6웰 배치 배양 상청액을 취하여 검출을 위해 샘플을 보냈으며, 항체 농도 및 세포 직경이 작은 세포주를 선택하여 TPP로 옮겨 종자 보존 및 계대한다.
S3. 재조합 항체 생산
S31. 세포 확장 배양
세포를 소생시킨 후, 먼저 규격이 125ml인 쉐이크 플라스크에서 배양하고, 접종 부피가 30ml이고, 배지가 100% Dynamis 배지이며, 회전 속도가 120r/min이고 온도가 37℃이며 이산화탄소 8%인 쉐이크에 방치한다. 72h 동안 배양하고, 500000 cells/ml의 접종 밀도로 접종 및 확장 배양하여, 생산 수요에 따라 확장 배양 부피를 계산한다. 다음 72h 마다 1회 확장 배양하고, 세포량이 생산 수요를 충족하면 접종 밀도를 약 500000 cells/ml로 엄격하게 제어하여 생산한다.
S32. 쉐이크 플라스크 생산 및 정제
쉐이크 플라스크 파라미터: 회전 속도 120r/min, 온도 37℃, 이산화탄소 8%. 유가 보충: 쉐이크 플라스크에서 72h까지 배양한 후 매일 보충을 시작한다. HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a에는 매일 초기 배양 부피의 3%를 유가하고, Feed 7b에는 매일 배양 부피의 1/1000을 유가하여 12일째(12번째 날 공급)까지 보충한다. 6일째에 포도당을 3g/L 보충하고 13일째에 샘플을 받았다. proteinA 친화력 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 친화력 정제를 수행하고, 4μg의 정제된 항체를 취하여 환원성 SDS-PAGE를 수행하되 대조군으로 4μg의 외래 대조군 항체를 취하였으며, 전기 영동도는 도 1에 도시된 바와 같다. 환원성 SDS-PAGE를 수행한 후 두개의 밴드가 표시되는데 그 중 하나는 Mr이 50KD(중쇄)였고 다른 하나는 Mr이 28KD(경쇄)였다.
실시예 2
항체 친화력 분석 및 활성 검증
실시예 1에서 얻은 항체는 서열 SEQ ID NO:11로 표시되는 경쇄 및 12로 표시되는 중쇄를 구비한 것으로 분석되었다.
중쇄의 상보적 결정 영역(WT) 분석 결과는 아래와 같다.
CDR-VH1은 G-P(X1)-S-I(X2)-T-T-Y-Y-I(X3)-D이고;
CDR-VH2는 M-T-K-D-A(X1)-N-A-V-H-Q(X2)-P-T-I(X3)-R-S이며;
CDR-VH3은 V-K(X1)-G-I(X2)-I-D-W(X3)-G이다.
경쇄의 상보적 결정 영역 분석 결과는 아래와 같다.
CDR-VL1은 G-S-S-D-Q(X1)-V-G-P(X2)-G-D-Y-V(X3)-N이고;
CDR-VL2는 I-F-A(X1)-A-T(X2)-S-R-I(X3)-R-G이며;
CDR-VL3은 G-S-P(X1)-N-S-R-GG(X2)-Y-V-W(X3)-G이다.
여기서, X1, X2, X3은 모두 돌연변이될 부위이다.
항체 활성과 관련된 돌연변이 부위
부위 CDR-VH1
X1		 CDR-VH2
X1		 CDR-VH3
X1		 CDR-VL1
X2		 CDR-VL2
X1		 CDR-VL3
X3
WT P A K P A W
돌연변이1 F G R F G F
돌연변이2 P G R P G F
돌연변이3 F A R F A F
돌연변이4 P G K F G W
발명인은 더 우수한 활성을 구비한 항체를 얻기 위해 WT 중의 CDR 부위를 상기와 같이 돌연변이시켰다.
코팅액으로 재조합 NT 항원을 1ug/ml로 희석하여 마이크로 플레이트 코팅을 수행하고, 웰당 100uL, 4℃에서 밤을 보낸 후; 다음날, 세척액으로 2회 세척한 후 두드려 건조시켰으며; 차단 용액(20%BSA+80%PBS)을 첨가하고 웰당 120uL, 37℃에서 1h 동안 두드려 건조시켰으며; 희석된 NT 모노클로날 항체를 100uL/well, 37℃에서 30min(일부 상청액의 경우, 1h) 동안 첨가하고; 세척액으로 5회 세척한 후 두드려 건조시켰으며; IgG-HRP을 웰당 100uL, 37℃, 30min 동안 첨가하고; 세척액으로 5회 세척한 후 두드려 건조시켰으며; 발색액 A(50uL/well)를 첨가한 후 발색액 B(50uL/well)를 10min 동안 첨가하였으며; 정지액을 50uL/well로 첨가하고; 마이크로 플레이트 리더 중 450nm(630nm 참조)에서 OD값을 판독한다.
항체 활성 분석 데이터
샘플 농도 ng/ml WT 돌연변이1 돌연변이2 돌연변이3 돌연변이4
111.11 1.528 1.827 1.772 1.764 1.724
37.04 1.236 1.568 1.526 1.533 1.501
12.35 0.732 1.110 1.031 1.022 0.959
4.12 0.312 0.564 0.523 0.520 0.489
1.37 0.218 0.355 0.353 0.347 0.300
0 0.067 0.121 0.089 0.076 0.115
상기 표로부터 돌연변이1의 활성 효과가 가장 우수하므로 돌연변이1을 백본 서열로 사용하여 역가가 우수한 돌연변이 부위를 스크리닝한다(스크리닝을 통해 얻은 항체의 활성이 돌연변이1과 유사하고 항체 활성±10% 보장). 부분적 결과는 다음과 같다.
항체 친화력과 관련된 돌연변이 부위
부위 CDR-VH1
X2/X3		 CDR-VH2
X2/X3		 CDR-VH3
X2/X3		 CDR-VL1
X1/X3		 CDR-VL2
X2/X3		 CDR-VL3
X1/X2
돌연변이1 I/I Q/I I/W Q/V T/I P/GG
돌연변이1-1 I/L N/I I/F Q/L T/L P/N
돌연변이1-2 I/V Q/L L/W Q/I T/V A/GG
돌연변이1-3 L/I N/L L/F N/V Y/I A/N
돌연변이1-4 L/L Q/V V/W N/L Y/L G/GG
돌연변이1-5 L/V N/V V/F N/I Y/V G/N
돌연변이1-6 V/I N/V I/W N/I S/I P/N
돌연변이1-7 V/L Q/V I/F N/L S/L G/N
돌연변이1-8 V/V N/L L/W N/V S/V G/GG
돌연변이1-9 I/I Q/L L/F Q/I S/I A/GG
돌연변이1-10 I/L N/I V/W Q/L S/L A/N
돌연변이1-11 I/V Q/I V/F Q/V S/V P/GG
돌연변이1-12 L/I Q/I I/W Q/V Y/I P/GG
돌연변이1-13 L/L N/I I/F Q/L Y/L P/N
돌연변이1-14 L/V Q/L L/W Q/I Y/V A/GG
돌연변이1-15 V/I N/L L/F N/V T/I A/N
돌연변이1-16 V/L Q/V V/W N/L T/L G/GG
돌연변이1-17 V/V N/V V/F N/I T/V G/N
돌연변이1-18 I/I N/V I/W N/I T/I P/N
돌연변이1-19 I/L Q/V I/F N/L T/L G/N
돌연변이1-20 I/V N/L L/W N/V T/V G/GG
돌연변이1-21 L/I Q/L L/F Q/I Y/I A/GG
돌연변이1-22 L/L N/I V/W Q/L Y/L A/N
돌연변이1-23 L/V Q/I V/F Q/V Y/V P/GG
돌연변이1-24 V/I Q/I I/W Q/V S/I P/GG
돌연변이1-25 V/L N/I I/F Q/L S/L P/N
돌연변이1-26 V/V Q/L L/W Q/V S/V A/GG
돌연변이1-27 I/I N/L L/F N/V S/I A/N
돌연변이1-28 I/L Q/V V/W N/L S/L G/GG
돌연변이1-29 I/V N/V V/F N/I S/V G/N
돌연변이1-30 L/I N/V I/W N/I T/I P/N
돌연변이1-31 L/L Q/V I/F N/L T/L G/N
돌연변이1-32 L/V N/L L/W N/V T/V G/GG
돌연변이1-33 V/I Q/L L/F Q/I Y/I A/GG
돌연변이1-34 V/L N/I V/W Q/L Y/L A/N
돌연변이1-35 V/V Q/I V/F Q/V Y/V P/GG
돌연변이1-36 I/I Q/I I/W Q/V T/I P/GG
돌연변이1-37 I/L N/I I/F Q/L T/L A/N
돌연변이1-38 I/V Q/L L/W Q/I T/V G/GG
돌연변이1-39 L/I N/L L/F N/V Y/I G/N
돌연변이1-40 L/L Q/V V/W N/L Y/L P/N
돌연변이1-41 V/I N/V I/W N/I Y/V G/N
돌연변이1-42 V/I N/V I/W N/I S/I G/GG
돌연변이1-43 V/L Q/V I/F N/L S/L A/GG
돌연변이1-44 V/V N/L L/W N/V S/V A/N
돌연변이1-45 I/I Q/L L/F Q/I S/I P/GG
돌연변이1-46 I/L N/I V/W Q/L S/L P/GG
돌연변이1-47 I/V Q/I V/F Q/V S/V P/N
돌연변이1-48 L/I Q/I I/W Q/V T/I P/GG
돌연변이1-49 L/L N/I I/F Q/L T/L P/N
돌연변이1-50 L/V Q/L L/W Q/I T/V A/GG
돌연변이1-51 V/I N/L L/F N/V Y/I A/N
돌연변이1-52 V/L Q/V V/W N/L Y/L G/GG
돌연변이1-53 V/V N/V V/F N/I Y/V G/N
친화력 분석
효소 면역 분석 간접 방법을 사용하여 활성 검증과 동일한 방식으로 데이터를 작성하고 코팅은 4가지 구배 3ug/ml, 1.5ug/ml, 0.75ug/ml, 0.375ug/ml를 작성하며; 항체는 1000ng/ml로부터 시작하여 2배 구배로 0.977ng/ml로 희석되여 샘플을 로딩하여 코팅 농도 필요 없이 다른 항체 농도에 대응되는 OD값을 얻는다. 동일한 코팅 농도에서 항체 농도를 횡좌표로 하고 OD값을 종좌표로 하여 로그 플롯하고, 피팅 방정식에 따라 최대 OD값의 50%일 때의 항체 농도를 계산하고; 공식 K=(n-1)/(2Х(nХAb'-Ab))에 대입하여 친화력 상수의 역수를 계산한다. 여기서 Ab 및 Ab'는 각각 대응되는 코팅 농도(Ag, Ag')에서 최대 OD값 50%일 때의 항체 농도를 나타내고, n=Ag/Ag'이며; 두개의 코팅 농도를 조합하여 하나의 K값을 계산할 수 있고, 최종 6개의 K값을 얻을 수 있으며, 평균값을 취한 후 그 역수를 구하면 바로 친화력 상수 KD이다.
친화력 분석 데이터
번호 KD (M) 번호 KD (M)
돌연변이1 1.73E-09 돌연변이1-28 2.25E-09
돌연변이1-1 2.51E-09 돌연변이1-29 1.49E-09
돌연변이1-2 2.61E-09 돌연변이1-30 2.66E-09
돌연변이1-3 1.52E-09 돌연변이1-31 1.84E-09
돌연변이1-4 2.07E-09 돌연변이1-32 1.52E-09
돌연변이1-5 6.10E-09 돌연변이1-33 2.60E-09
돌연변이1-6 1.17E-09 돌연변이1-34 3.12E-09
돌연변이1-7 1.53E-09 돌연변이1-35 1.51E-09
돌연변이1-8 2.22E-09 돌연변이1-36 5.64E-09
돌연변이1-9 1.56E-09 돌연변이1-37 1.57E-09
돌연변이1-10 3.20E-09 돌연변이1-38 1.82E-09
돌연변이1-11 1.52E-09 돌연변이1-39 2.45E-09
돌연변이1-12 2.75E-09 돌연변이1-40 3.47E-09
돌연변이1-13 2.09E-09 돌연변이1-41 2.82E-09
돌연변이1-14 8.75E-10 돌연변이1-42 2.22E-09
돌연변이1-15 1.76E-09 돌연변이1-43 2.93E-09
돌연변이1-16 3.27E-09 돌연변이1-44 1.26E-09
돌연변이1-17 3.39E-09 돌연변이1-45 1.53E-09
돌연변이1-18 1.73E-09 돌연변이1-46 3.49E-09
돌연변이1-19 1.51E-09 돌연변이1-47 2.79E-09
돌연변이1-20 2.61E-09 돌연변이1-48 2.02E-09
돌연변이1-21 2.53E-09 돌연변이1-49 6.83E-09
돌연변이1-22 2.07E-09 돌연변이1-50 2.16E-09
돌연변이1-23 8.10E-10 돌연변이1-51 9.44E-10
돌연변이1-24 1.17E-09 돌연변이1-52 2.71E-09
돌연변이1-25 2.16E-09 돌연변이1-53 2.06E-09
돌연변이1-26 1.51E-09
돌연변이1-27 8.55E-10
표 4로부터, 표 3에 열거된 돌연변이 부위는 항체의 친화력에 거의 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
상기 결과를 검증하기 위해 WT를 백본 서열로 하여 상기 실험을 반복하여 돌연변이 부위의 친화력을 검증하였고, 그 일부 결과는 아래와 같다.
WT를 백본으로 진행한 돌연변이
부위 CDR-VH1
X2/X3		 CDR-VH2
X2/X3		 CDR-VH3
X2/X3		 CDR-VL1
X1/X3		 CDR-VL2
X2/X3		 CDR-VL3
X1/X2
WT I/I Q/I I/F Q/V T/I P/GG
WT 1-1 V/I N/I V/W N/I Y/I A/N
WT 1-2 L/I Q/L V/W N/L S/I P/N
WT 1-3 I/L Q/I L/F N/V T/I A/N
WT 1-4 V/V Q/L V/F Q/V T/I G/GG
WT 1-5 L/L N/V L/F Q/L S/I A/N
WT 1-6 I/V Q/I L/W Q/L S/L A/GG
WT 1-7 V/L Q/V V/W N/I Y/L G/GG
WT 1-8 L/V Q/V I/W N/I Y/V P/N
WT 1-9 V/I Q/L L/W N/V Y/L G/GG
친화력 분석 데이터
번호 KD (M) 번호 KD (M)
WT 1 3.02E-09 WT 1-5 2.26E-08
WT 1-1 1.78E-08 WT 1-6 6.14E-09
WT 1-2 3.48E-09 WT 1-7 5.05E-09
WT 1-3 2.53E-09 WT 1-8 4.78E-09
WT 1-4 3.02E-09 WT 1-9 2.47E-09
표 5 및 표 6으로부터 항체 활성을 보장하는 전제하에 상기 돌연변이 부위와 기타 부위의 관련도는 크지 않음을 알 수 있다.
실시예 3 안정성 분석
항체를 4℃(냉장고), -80℃(냉장고), 37℃(인큐베이터)에 21일 동안 방치하고, 7일, 14일, 21일 샘플을 취하여 상태 관찰을 수행하였으며, 21일 샘플에 대해 활성 검출을 수행한다. 그 결과 3가지 테스트 조건에서 21일 동안 항체를 방치한 후 단백질 상태에 큰 변화가 없었으며, 테스트 온도 상승에 따라 활성이 감소하지도 않아 자체 생산 항체가 안정적임을 나타냈다. 하기 표는 돌연변이1에 대한 21일 동안 효소 면역 활성 검출 테스트의 OD 결과이다.
Figure pct00005
나아가, 랜덤으로 추출한 8개의 돌연변이 항체에 대해 안정성 검출을 수행한다. 상기 항체를 37℃에서 72시간 동안 보관하고 꺼낸 후 동일한 조건에서 동일한 배치의 72시간 동안 4℃에서 보관된 항체와 함께 동일한 음성 및 양성 품질 관리 샘플을 검출한다. 검출 방법은 상기 실시예에서 사용된 항체 활성 분석 방법과 동일하며, 각 그룹 항체의 선형성은 모두 99.50% 이상에 도달할 수 있고, CV값은 10% 미만이다. 이는 상기 항체가 모두 우수한 안정성을 가짐을 나타낸다.
실시예 4 페어링 성능 평가
출원인은 표 4에서 언급한 상기 항체를 내부의 다른 항체(원래 WT 서열 항체와 페어링된 항체)와 함께 페어링 항체 실험 검증을 수행한다. 이중 항체 샌드위치 방법에 의한 페어링 실험 검증 결과, 특이성은 모두 원래 높은 수준을 유지하는 것으로 확인되었으나 돌연변이 항체의 활성 및 친화력이 증가되어 더 높은 감도를 나타내었다.
돌연변이1 항체와 WT 항체를 코팅 항체로 하고, 각각 다른 라벨인 NT-oroBNP 항체와 조합 사용하여 화학 발광 평가 플랫폼에서 성능 차이를 비교한다. 구체적인 성능은 아래 표와 같다.
Figure pct00006
마지막으로, 상기 각 실시예는 본 발명의 기술적 해결수단을 설명하기 위한 것일뿐 이를 한정하지 않는다는 점에 유의해야 한다. 본 발명에 대해 전술한 각 실시예를 통하여 상세하게 설명되었으나 당업자는 전술한 각 실시예에 기재된 기술적 해결수단을 수정하거나 그 중 일부 또는 전부 기술특징을 균등 교체할 수 있으며, 이러한 수정 또는 교체로 인해 대응하는 기술적 해결수단의 본질이 본 발명의 각 실시예의 기술적 해결수단 범위를 벗어나지 않음을 이해해야 한다.
[산업상 이용가능성]
본 발명에 기재된 결합 단백질은 활성이 강하고 인간 NT-proBNP와 높은 친화력을 구비한다. 본 발명에 기재된 결합 단백질은 심부전과 같은 NT-proBNP 관련 질병의 진단에 사용될 수 있고, 심장 기능 평가에도 사용될 수 있으며, 높은 감도와 특이성을 구비한다.
SEQUENCE LISTING <110> 동관시펑지생물과학주식회사 <120> 항-인간 N-말단 프로 뇌 나트륨 이뇨 펩티드의 재조합 항체 <130> PI19035802 <150> CN2018115574685 <151> 2018-12-19 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> 마우스（Mus musculus） <400> 1 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Arg Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Ser Ile Thr Cys Ser 20 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> 마우스（Mus musculus） <400> 2 Trp Phe Gln Leu Ile Pro Gly Ser Ala Pro Lys Thr Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> 마우스（Mus musculus） <400> 3 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu 1 5 10 15 Thr Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> 마우스（Mus musculus） <400> 4 Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro Lys Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> 마우스（Mus musculus） <400> 5 Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Gln Val Lys Pro Ala Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser 20 25 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> 마우스（Mus musculus） 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Gly Gln 210 215 220 Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu 225 230 235 240 Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu 260 265 270 Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr 275 280 285 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly 290 295 300 Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 305 310 315 320 Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys 325 330 <210> 11 <211> 216 <212> PRT <213> 인공서열 <220> <223> 경쇄 <400> 11 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Arg Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Asp Gln Val Gly Phe Gly 20 25 30 Asp Tyr Ile Asn Trp Phe Gln Leu Ile Pro Gly Ser Ala Pro Lys Thr 35 40 45 Leu Ile Phe Gly Ala Tyr Ser Arg Ile Arg Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Pro Asn Ser Arg 85 90 95 Gly Gly Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Ser Gln 100 105 110 Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Lys Glu Glu 115 120 125 Leu Asp Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile Asn 145 150 155 160 Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser Lys 180 185 190 Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr Lys 195 200 205 Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser 210 215 <210> 12 <211> 443 <212> PRT <213> 인공서열 <220> <223> 중쇄 <400> 12 Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Gln Val Lys Pro Ala Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Phe Ser Ile Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Leu Asp Trp Val Arg His Thr Pro Gly Lys Pro Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Gln Met Thr Lys Asp Gly Asn Ala Val His Gln Pro Thr Val Arg 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Leu Thr Gly Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Gly Val Ile Asp Phe Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Thr Pro Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly 115 120 125 Asp Thr Ser Ser Ser Ile Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr 130 135 140 Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr 180 185 190 Phe Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Arg Val Glu Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro 210 215 220 Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 225 230 235 240 Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 245 250 255 Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe 260 265 270 Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu 275 280 285 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His 290 295 300 Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu 305 310 315 320 Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln 325 330 335 Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu 340 345 350 Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro 355 360 365 Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu 370 375 380 Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly 405 410 415 Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys 435 440

Claims (18)

  1. 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질로서,
    상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열로부터 선택된 적어도 하나의 상보적 결정 영역을 포함하거나, 또는 하기 아미노산 서열의 상보적 결정 영역과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지고 NT-proBNP와 KD≤2.26Х10-8의 친화력을 가지는데,
    상보적 결정 영역 CDR-VH1은 G-X1-S-X2-T-T-Y-Y-X3-D이고, 여기서,
    X1은 P 또는 F이고, X2는 I, V 또는 L이며, X3은 I, V 또는 L임;
    상보적 결정 영역 CDR-VH2는 M-T-K-D-X1-N-A-V-H-X2-P-T-X3-R-S이고, 여기서,
    X1은 G 또는 A이고, X2는 Q 또는 N이며, X3은 I, V 또는 L임;
    상보적 결정 영역 CDR-VH3은 V-X1-G-X2-I-D-X3-G이고, 여기서,
    X1은 K 또는 R이고, X2는 I, V 또는 L이며, X3은 F 또는 W임;
    상보적 결정 영역 CDR-VL1은 G-S-S-D-X1-V-G-X2-G-D-Y-X3-N이고, 여기서,
    X1은 Q 또는 N이고, X2는 F 또는 P이며, X3은 I, V 또는 L임;
    상보적 결정 영역 CDR-VL2는 I-F-X1-A-X2-S-R-X3-R-G이고, 여기서,
    X1은 A 또는 G이고, X2는 T, Y 또는 S이며, X3은 I, V 또는 L임;
    상보적 결정 영역 CDR-VL3은 G-S-X1-N-S-R-X2-Y-V-X3-G이고, 여기서,
    X1은 P, A 또는 G이고, X2는 GG 또는 N이며, X3은 W 또는 F임;
    바람직하게는:
    상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 F이고;
    상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X1은 G이며;
    상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 R이고;
    상기 상보적 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 F이며;
    상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 G이고;
    상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X3은 F이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 I이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 V이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 L이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 I이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 V이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH1에서, X3은 L이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 Q이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 N이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 I이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 V이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 L이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 I이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 V이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 L이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 F이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 W이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 Q이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 N이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-V L1에서, X3은 I이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-V L1에서, X3은 V이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-V L1에서, X3은 L이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 T이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 Y이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 S이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X3은 I이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X3은 V이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL2에서, X3은 L이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 P이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 A이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 G이며;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 GG이고;
    바람직하게는, 상기 상보적 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 N이며;
    바람직하게는, 각 상보적 결정 영역의 돌연변이 부위는 아래 돌연변이 조합 중의 어느 하나로부터 선택된는 것을 특징으로 하는, 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질.
    Figure pct00007

    Figure pct00008
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDRs를 포함하거나, 또는 적어도 6개의 CDRs를 포함하고;
    바람직하게는, 상기 결합 단백질은 나노바디, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중 특이성 항체 및 항체 최소 인식 단위 중의 하나이며;
    바람직하게는, 상기 결합 단백질은 서열이 순차적으로 SEQ ID NO:1-4로 표시되는 경쇄 골격 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4를 포함하고, 및/또는 서열이 순차적으로 SEQ ID NO:5-8로 표시되는 중쇄 골격 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
    상기 결합 단백질은 항체의 불변 영역 서열을 더 포함하고;
    바람직하게는, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중의 어느 하나의 불변 영역 서열로부터 선택되며;
    바람직하게는, 상기 불변 영역의 종은 소, 말, 젖소, 돼지, 양, 염소, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 밍크, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 싸움닭 또는 인간에서 유래되고;
    바람직하게는, 상기 불변 영역은 마우스에서 유래되며;
    경쇄 불변 영역 서열은 SEQ ID NO:9로 표시되고;
    중쇄 불변 영역 서열은 SEQ ID NO:10으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질.
  4. 분리된 핵산 분자로서,
    상기 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이고, 제1 항 내지 제3 항 중의 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는, 분리된 핵산 분자.
  5. 제4 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  6. 제5 항에 따른 벡터에 의해 전환되는 숙주 세포.
  7. 제1 항 내지 제3 항 중의 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 생산 방법으로서,
    배지에서 적절한 배양 조건 하에서 제6 항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 배지 또는 배양된 숙주 세포에서 상기와 같이 생성된 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1 항 내지 제3 항 중의 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 생산 방법.
  8. 심부전 진단 및 심장 기능 평가용 진단제의 제조에 있어서 제1 항 내지 제3 항 중의 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 응용.
  9. 테스트 샘플 중의 NT-proBNP의 검출 방법으로서,
    a) 항체/항원 결합 반응이 일어나기에 충분한 조건 하에서, 상기 테스트 샘플의 NT-proBNP 항원을 제3 항에 따른 결합 단백질과 접촉시켜 면역 복합물을 형성하는 단계; 및
    b) 상기 테스트 샘플 중 상기 NT-proBNP의 존재를 지시하는 상기 면역 복합물의 존재를 검출하는 단계; 를 포함하고,
    바람직하게는, a)단계에서, 상기 면역 복합물은 제2 항체를 더 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 결합 단백질과 결합하며;
    바람직하게는, a)단계에서, 상기 면역 복합물은 제2 항체를 더 포함하고, 상기 제2 항체는 상기 NT-proBNP와 결합하는, 테스트 샘플 중의 NT-proBNP의 검출 방법.
  10. 제1 항 내지 제3 항 중의 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 포함하는 키트.
  11. NT-proBNP 관련 질병의 진단에 있어서 제1 항 내지 제3 항 중의 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 응용.
  12. NT-proBNP 관련 질병을 진단하거나 심장 기능을 평가하는 방법으로서,
    A) 결합 반응이 일어나기에 충분한 조건 하에서, 피험자로부터의 샘플과 제1 항 내지 제3 항 중의 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 접촉시켜 결합 반응을 수행하는 단계; 및
    B) 결합 반응에 의해 생성된 면역 복합물을 검출하는 단계; 를 포함하고,
    상기 면역 복합물의 존재는 NT-proBNP 관련 질병의 존재를 지시하거나 심장 기능 수준을 지시하는, NT-proBNP 관련 질병을 진단하거나 심장 기능을 평가하는 방법.
  13. 제12 항에 있어서,
    상기 방법은 형광 면역 기술, 화학 발광 기술, 콜로이드 금 면역 기술, 방사성 면역 분석 및/또는 효소 면역 기술을 기반으로 하는 방법.
  14. 제12 항 또는 제13 항에 있어서,
    상기 샘플은 전혈, 말초 혈액, 혈청, 혈장 또는 심근 조직 중 적어도 하나로부터 선택되는 방법.
  15. 제12 항 내지 제14 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험자는 포유 동물, 바람직하게는 영장류 동물, 보다 바람직하게는 인류인 방법.
  16. 제11 항 또는 제12 항 내지 제15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 NT-proBNP 관련 질병은 심장 질병인 응용 또는 방법.
  17. 제11 항 또는 제12 항 내지 제15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 NT-proBNP 관련 질병은 심장 쇠약, 심부전, 심인성 호흡 곤란, 폐인성 호흡 곤란, 급성 관상동맥 증후군 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 응용 또는 방법.
  18. 제11 항 또는 제17 항에 있어서,
    상기 심부전은 심인성 심부전 또는 비 심인성 심부전인 응용 또는 방법.
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