CN111333727A

CN111333727A - 一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的结合蛋白

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Publication number: CN111333727A
Application number: CN201910909813.5A
Authority: CN
Inventors: 孟媛; 钟冬梅; 叶庆妮; 梁碧; 游辉; 马秋燕; 李蔚芝
Original assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2039-09-25
Also published as: US20220025008A1; CN111333727B; EP3901170A4; JP7339338B2; EP3901170A1; WO2020125136A1; KR20210114922A; JP2022507466A

Abstract

本发明涉及一种新颖的包含NT‑proBNP抗原结合结构域的结合蛋白，并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。所述结合蛋白活性强，与人NT‑proBNP蛋白具有很高的亲和力，可广泛应用于NT‑proBNP蛋白的检测领域。

Description

一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的结合蛋白

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，具体而言，涉及一种一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的结合蛋白。

背景技术

1988年日本学者Sudoh首次从猪脑内分离得到一种具有强有力的利尿、扩血管和降压作用的多肽，将其命名为脑钠肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)。BNP分布在心脏含量最高，但心肌细胞首先合成的是含有108个氨基酸的proBNP(BNP前体)，当心肌细胞受到刺激后，proBNP在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)和含有32个氨基酸、具有活性的B型利钠肽(BNP)，两者来源相同并且等摩尔分泌释放进入血循环。

当心脏容量负荷增加或心脏功能受损时，N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)与BNP的指标浓度会异常升高，其中NT-proBNP相对BNP生物稳定性较好，半衰期较长(120min)，浓度相对较稳定，有效检测时间长，血液中含量相对比BNP高约16～20倍，因此检测相对容易，并且血浆标本在体外的稳定性长(>48h)，是诊断心力衰竭和评价心脏功能的最佳心肌标志物。

正常的人血液中NT-proBNP含量一般低于0.3ng/mL。当心脏功能受损，心肌扩张时，NT-proBNP会快速合成并大量分泌释放进入到人体血液中。在发现一些相关早期病症的时候，准确、灵敏、高效稳定地测定血液中NT-proBNP的量，能给早期心功能不全、心衰、呼吸困难的心源性及非心源性心衰治疗及预后监测、急性冠状动脉综合征的分级等方面提供快速、准确的早期诊断依据。目前用于检NT-proBNP含量的方法主要有金标定性试验、荧光免疫法、酶联免疫吸附试验(ELISA)和磁微粒化学发光法(CMIA)，但是这些测量方法都需要针对于NT-proBNP的特异性单克隆抗体，目前国内用于检测NT-proBNP的单克隆抗体灵敏度、特异性上都不够理想。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种新颖的包含NT-proBNP抗原结合结构域的结合蛋白，并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。

其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与NT-proBNP具有K_D≤2.26×10^-8的亲和力；

互补决定区CDR-VH1为G-X1-S-X2-T-T-Y-Y-X3-D，其中，

X1是P或F，X2是I、V或L，X3是I、V或L；

互补决定区CDR-VH2为M-T-K-D-X1-N-A-V-H-X2-P-T-X3-R-S，其中，

X1是G或A，X2是Q或N，X3是I、V或L；

互补决定区CDR-VH3为V-X1-G-X2-I-D-X3-G，其中，

X1是K或R，X2是I、V或L，X3是F或W；

互补决定区CDR-VL1为G-S-S-D-X1-V-G-X2-G-D-Y-X3-N，其中，

X1是Q或N，X2是F或P，X3是I、V或L；

互补决定区CDR-VL2为I-F-X1-A-X2-S-R-X3-R-G，其中，

X1是A或G，X2是T、Y或S，X3是I、V或L；

互补决定区CDR-VL3为G-S-X1-N-S-R-X2-Y-V-X3-G，其中，

X1是P、A或G，X2是GG或N，X3是W或F。

一个重要优点在于，所述结合蛋白活性强，与人NT-proBNP具有很高的亲和力，且与目前市面上常见的NT-proBNP抗体相比，具有较优的亲和力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中抗人NT-proBNP的单克隆抗体电泳图。

具体实施方式

本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。

在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。

名词定义

“包含抗原结合结构域的结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。

抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。构架区和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，E.Kabat等，美国卫生与人类服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)，(1983))和Chothia中。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。

当在本文中使用时，“构架”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。

通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

当在本文中使用时，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。

本发明的示例性实施方案

本发明涉及一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与NT-proBNP具有K_D≤2.26×10^-8的亲和力；

互补决定区CDR-VH1为G-X1-S-X2-T-T-Y-Y-X3-D，其中，

X1是P或F，X2是I、V或L，X3是I、V或L；

互补决定区CDR-VH2为M-T-K-D-X1-N-A-V-H-X2-P-T-X3-R-S，其中，

X1是G或A，X2是Q或N，X3是I、V或L；

互补决定区CDR-VH3为V-X1-G-X2-I-D-X3-G，其中，

X1是K或R，X2是I、V或L，X3是F或W；

互补决定区CDR-VL1为G-S-S-D-X1-V-G-X2-G-D-Y-X3-N，其中，

X1是Q或N，X2是F或P，X3是I、V或L；

互补决定区CDR-VL2为I-F-X1-A-X2-S-R-X3-R-G，其中，

X1是A或G，X2是T、Y或S，X3是I、V或L；

互补决定区CDR-VL3为G-S-X1-N-S-R-X2-Y-V-X3-G，其中，

X1是P、A或G，X2是GG或N，X3是W或F。

在一些实施方式中，所述抗原结合结构域与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少85％，或90％，或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％的序列同一性且与NT-proBNP具有K_D≤2.26×10^-8mol/L，K_D值也可以选择1×10^-9mol/L、2×10^-9mol/L、3×10^-9mol/L、4×10^-9mol/L、4.5×10^-9mol/L、5×10^-9mol/L、6×10^-9mol/L、7×10^-9mol/L、8×10^-9mol/L、9×10^-9mol/L、1×10^-10mol/L、3×10^-10mol/L、5×10^-10mol/L、7×10^-10mol/L、9×10^-10mol/L或1×10^-8mol/L；

或者8.10×10^-10mol/L≤K_D≤2.26×10^-8mol/L；

其中，亲和力按照本发明说明书中的方法测定。

在一些实施方式中：

所述互补决定区CDR-VH1中，X1是F；

所述互补决定区CDR-VH2中，X1是G；

所述互补决定区CDR-VH3中，X1是R；

所述互补决定区CDR-VL1中，X2是F；

所述互补决定区CDR-VL2中，X1是G；

所述互补决定区CDR-VL3中，X3是F。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是V。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是V。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是Q。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是N。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是V。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是V。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是F。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是W。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是Q。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是N。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是V。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是T。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是Y。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是S。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X3是I。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X3是V。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X3是L。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是P。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是A。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是G。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是GG。

在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是N。

在一些实施方式中，各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：

在一些实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs(例如3个轻链CDR或3个重链CDR)；或者，所述结合蛋白包括至少6个CDRs。

在一些实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。

在一些实施方式中，所述结合蛋白为抗体的“功能片段”，例如纳米抗体、F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。

scFv(sc＝单链)，双特异抗体(diabodies)。

本发明所述的“功能片段”特别地指对于NT-proBNP具有与母体抗体相同特异性的抗体片段。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。

这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的抗体片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。

抗体片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。

在一些实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。

需要说明的是，除本申请上述公开的氨基酸序列外，骨架区的种属来源可以为人，以构成人源化抗体。

在一些实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。

在一些实施方式中，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。

在一些实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在一些实施方式中，所述恒定区来源于羊；

轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；

重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种分离的核酸分子，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码如上所述的结合蛋白。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种载体，其包含如上所述的核酸分子。

本发明进一步包含至少一种编码如上所述的核酸分子的核构建体，例如质粒，进一步为表达质粒，在本申请的一个实施例中会介绍该载体的构建方法。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种宿主细胞，其被如上所述的载体转化。

所述宿主细胞可以为真核细胞，比如哺乳动物细胞。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为CHO细胞。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种生产如上所述的结合蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

在培养基中和合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的结合蛋白在制备用于诊断心力衰竭和评价心脏功能的诊断剂中的应用。

在一些实施方式中，所述癌症包括急性淋巴母细胞性白血病、急性骨髓源性白血病、胆管癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓源性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和尿路膀胱癌。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测测试样品中NT-proBNP的方法，其包括：

a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的NT-proBNP抗原与如上所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和

b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述NT-proBNP的存在。

在此实施方式中，所述结合蛋白可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合。

在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述NT-proBNP结合；

在此实施方式中，所述结合蛋白以第一抗体的形式与所述第二抗体形成配对抗体，用于结合NT-proBNP的不同抗原表位；

所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述NT-proBNP抗原结合；

在此实施方式中，所述结合蛋白作为所述第二抗体的抗原，所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。

在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。

在一些实施方式中，所述放射性同位素包括¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr中的任一种。

在一些实施方式中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包括如上所述的结合蛋白。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了一种抗人NT-proBNP的重组抗体的示例性制备方法。

S1.构建表达质粒：

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司；

MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司；

BD SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Takara公司；

pMD-18T载体购自Takara公司；

质粒提取试剂盒购自天根公司；

引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成；

分泌Anti-NT-proBNP 8B9单克隆抗体为已有的杂交瘤细胞株，复苏备用。

S11，引物的设计与合成：

扩增重链和轻链的5’RACE上游引物：

SMARTER II A Oligonucleotide：

5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3’；

5'-RACE CDS Primer(5'-CDS)：5’>(T)₂₅VN<3’(N＝A,C,G,orT；V＝A,G,orC)；

Universal Primer A Mix(UPM):

5’>CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’；

Nested Universal Primer A(NUP):

5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’；

mkR：5’>CCCGAATTCCTAAGAACACTCTGAGGGCTTCACTG<3’；

mHR：5’>CCCGAATTCTCATTTACCCGGAGGCTTAGAGAT<3’。

S12，抗体可变区基因克隆及测序：

从分泌Anti-NT-proBNP 8B9单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA，用SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II AOligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。Light Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mkR进行扩增，Heavy Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、NestedUniversal Primer A(NUP)和mHR进行扩增。其中Light Chain的引物对扩增出0.7KB左右的目的条带，Heavy Chain的引物对扩增出1.4KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆各4个克隆送Invitrogen公司进行测序。

S13，Anti-NT-proBNP 8B9抗体可变区基因的序列分析：

将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为402bp，属于VkII基因家族，其前方有60bp的前导肽序列；HeavyChain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为402bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

S14，重组抗体表达质粒的构建：

pcDNA^TM3.4

vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计Anti-NT-proBNP 8B9抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：

NT-proBNP 8B9-HF：

5’>CCCAAGCTTGCCACCATGAACCCACTGTGGACCCTCCTCTTT<3’；

NT-proBNP 8B9-HR:

5’>CCCGAATTCTCATTTACCCGGAGGCTTAGAGAT<3’；

NT-proBNP 8B9-LF:

5’>CCCAAGCTTGCCACCATGGCCTGGTCCCCTCTGCTCCTCAC<3’；

NT-proBNP 8B9-LR:

5’>CCCGAATTCCTAAGAACACTCTGAGGGCTTCACTG<3’；

通过PCR扩增方法扩出0.7KB的Light Chain基因片段和1.4kb的Heavy Chain基因片段。Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

S2.稳定细胞株筛选

S21重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

包被液稀释重组NT抗原(自产，161213)到指定浓度，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100uL/孔，37℃,30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入兔抗羊-HRP，每孔100uL，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对重组NT蛋白都有活性。

S22重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：Buffer 50ul、DNA 100ug/管、PuvⅠ酶10ul、无菌水补至500ul，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

S23重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株

质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/L MSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×10⁶cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

S3.重组抗体生产

S31细胞扩培

胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

S32摇瓶生产及纯化

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，4μg外来对照抗体作为对照，电泳图如图1所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。

实施例2

抗体亲和力分析及活性鉴定

实施例1中得到的抗体经分析具有序列如SEQ ID NO:11所示的轻链以及12所示的重链。

经分析，重链的互补决定区(WT)：

CDR-VH1为G-P(X1)-S-I(X2)-T-T-Y-Y-I(X3)-D；

CDR-VH2为M-T-K-D-A(X1)-N-A-V-H-Q(X2)-P-T-I(X3)-R-S；

CDR-VH3为V-K(X1)-G-I(X2)-I-D-W(X3)-G；

轻链的互补决定区：

CDR-VL1为G-S-S-D-Q(X1)-V-G-P(X2)-G-D-Y-V(X3)-N；

CDR-VL2为I-F-A(X1)-A-T(X2)-S-R-I(X3)-R-G；

CDR-VL3为G-S-P(X1)-N-S-R-GG(X2)-Y-V-W(X3)-G；

其中，X1、X2、X3均为待突变位点。

表1与抗体活性有关的突变位点

发明人将WT中的CDR位点进行上述突变，以获得活性更好的抗体。

包被液稀释重组NT抗原(自产，161213)到1ug/ml进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的NT单克隆抗体，100uL/孔，37℃,30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入兔抗羊-HRP，每孔100uL，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。

表2抗体活性分析数据

样品浓度ng/ml	WT	突变1	突变2	突变3	突变4
						111.11	1.528	1.827	1.772	1.764	1.724
37.04	1.236	1.568	1.526	1.533	1.501
						12.35	0.732	1.110	1.031	1.022	0.959
4.12	0.312	0.564	0.523	0.520	0.489
						1.37	0.218	0.355	0.353	0.347	0.300
0	0.067	0.121	0.089	0.076	0.115

从上表可知，突变1的活性效果最佳，因而以突变1作为骨架序列筛选效价较好的突变位点，部分结果如下。

表3与抗体亲和力有关的突变位点

亲和力分析

以活性鉴定相同方式酶免间接法做数据，包被做四个梯度3ug/ml、1.5ug/ml、0.75ug/ml、0.375ug/ml；抗体从1000ng/ml开始2倍梯度稀释至0.977ng/ml上样。得出不用包被浓度下不同抗体浓度对应的OD值。在同一包被浓度下，以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标，对数作图，根据拟合方程计算出50％最大OD值时的抗体浓度；带入公式：K＝(n-1)/(2×(n×Ab`-Ab))计算出亲和力常数的倒数，其中Ab和Ab`分别表示对应包被浓度(Ag、Ag`)下50％最大OD值时的抗体浓度，n＝Ag/Ag`；每两个包被浓度可以组合计算出一个K值，最后可得六个K值，取其平均数值，再求其倒数则为亲和力常数KD。

表4亲和力分析数据

从表4可以看出，表3中列出的突变位点对应的突变序列都具有较好的亲和力。

为验证上述结果，以WT作为骨架序列重复上述实验，进行突变位点的亲和力验证，部分结果如下。

表5以WT为骨架进行的突变

表6亲和力分析数据

	K<sub>D</sub>(M)		K<sub>D</sub>(M)
				WT	3.02E-09	WT1-5	2.26E-08
WT1-1	1.78E-08	WT1-6	6.14E-09
				WT1-2	3.48E-09	WT1-7	5.05E-09
WT1-3	2.53E-09	WT1-8	4.78E-09
				WT1-4	3.02E-09	WT1-9	2.47E-09

从表5和表6分析，基于WT进行突变后的抗体序列也具有一定的亲和力。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞市朋志生物科技有限公司

<120> 一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的结合蛋白

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Arg Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Ser Ile Thr Cys Ser

20

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Trp Phe Gln Leu Ile Pro Gly Ser Ala Pro Lys Thr Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 31

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu

1 5 10 15

Thr Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro Lys Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Gln Val Lys Pro Ala Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser

20 25

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Trp Val Arg His Thr Pro Gly Lys Pro Pro Glu Trp Leu Ala Gln

1 5 10 15

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

1 5 10 15

Leu Thr Gly Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5

<210> 9

<211> 101

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Lys Glu Glu Leu Asp Thr

1 5 10 15

Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ser

20 25 30

Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile Asn Gln Asn Val

35 40 45

Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys Tyr Ala Ala Ser

50 55 60

Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser Lys Ser Ser Tyr

65 70 75 80

Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr Lys Thr Val Lys

85 90 95

Pro Ser Glu Cys Ser

100

<210> 10

<211> 331

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Ala Ser Thr Thr Pro Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ser Ser Ser Ile Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr

65 70 75 80

Phe Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro

100 105 110

Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

115 120 125

Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

130 135 140

Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe

145 150 155 160

Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu

165 170 175

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His

180 185 190

Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu

195 200 205

Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln

210 215 220

Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu

225 230 235 240

Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu

260 265 270

Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr

275 280 285

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly

290 295 300

Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

305 310 315 320

Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys

325 330

<210> 11

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Arg Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Asp Gln Val Gly Phe Gly

20 25 30

Asp Tyr Ile Asn Trp Phe Gln Leu Ile Pro Gly Ser Ala Pro Lys Thr

35 40 45

Leu Ile Phe Gly Ala Tyr Ser Arg Ile Arg Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Pro Asn Ser Arg

85 90 95

Gly Gly Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Ser Gln

100 105 110

Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Lys Glu Glu

115 120 125

Leu Asp Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile Asn

145 150 155 160

Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser Lys

180 185 190

Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr Lys

195 200 205

Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

210 215

<210> 12

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Gln Val Lys Pro Ala Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Phe Ser Ile Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Leu Asp Trp Val Arg His Thr Pro Gly Lys Pro Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Gln Met Thr Lys Asp Gly Asn Ala Val His Gln Pro Thr Val Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Leu Thr Gly Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Gly Val Ile Asp Phe Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Thr Pro Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly

115 120 125

Asp Thr Ser Ser Ser Ile Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

130 135 140

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr

180 185 190

Phe Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Arg Val Glu Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro

210 215 220

Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

225 230 235 240

Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

245 250 255

Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe

260 265 270

Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu

275 280 285

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His

290 295 300

Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu

305 310 315 320

Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln

325 330 335

Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu

340 345 350

Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro

355 360 365

Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu

370 375 380

Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys

435 440

Claims

1.一种包含NT-proBNP抗原结合结构域的结合蛋白，其特征在于，其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与NT-proBNP具有K_D≤2.26×10^-8的亲和力；

互补决定区CDR-VH1为G-X1-S-X2-T-T-Y-Y-X3-D，其中，

X1是P或F，X2是I、V或L，X3是I、V或L；

互补决定区CDR-VH2为M-T-K-D-X1-N-A-V-H-X2-P-T-X3-R-S，其中，

X1是G或A，X2是Q或N，X3是I、V或L；

互补决定区CDR-VH3为V-X1-G-X2-I-D-X3-G，其中，

X1是K或R，X2是I、V或L，X3是F或W；

互补决定区CDR-VL1为G-S-S-D-X1-V-G-X2-G-D-Y-X3-N，其中，

X1是Q或N，X2是F或P，X3是I、V或L；

互补决定区CDR-VL2为I-F-X1-A-X2-S-R-X3-R-G，其中，

X1是A或G，X2是T、Y或S，X3是I、V或L；

互补决定区CDR-VL3为G-S-X1-N-S-R-X2-Y-V-X3-G，其中，

X1是P、A或G，X2是GG或N，X3是W或F；

优选的：

所述互补决定区CDR-VH1中，X1是F；

所述互补决定区CDR-VH2中，X1是G；

所述互补决定区CDR-VH3中，X1是R；

所述互补决定区CDR-VL1中，X2是F；

所述互补决定区CDR-VL2中，X1是G；

所述互补决定区CDR-VL3中，X3是F；

优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是I；

优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是V；

优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是L；

优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是I；

优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是V；

优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是L；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是Q；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是N；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是I；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是V；

优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是L；

优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是I；

优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是V；

优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是L；

优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是F；

优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是W；

优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是Q；

优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是N；

优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是I；

优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是V；

优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是L；

优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是T；

优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是Y；

优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是S；

优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X3是I；

优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X3是V；

优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X3是L；

优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是P；

优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是A；

优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X1是G；

优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是GG；

优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是N；

优选的，各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：

2.如权利要求1所述包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs；或者，所述结合蛋白包括至少6个CDRs；

优选的，所述结合蛋白为纳米抗体、F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种；

优选的，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。

3.如权利要求1或2所述包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列；

优选的，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列；

优选的，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人；

优选的，所述恒定区来源于小鼠；

轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；

重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

4.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码权利要求1～3任一项所述的结合蛋白。

5.一种载体，其包含权利要求4所述的核酸分子。

6.一种宿主细胞，其被权利要求5所述的载体转化。

7.一种生产权利要求1～3任一项所述的结合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

在培养基中和合适的培养条件下培养权利要求6所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。

8.权利要求1～3任一项所述的结合蛋白在制备用于诊断心力衰竭和评价心脏功能的诊断剂中的应用。

9.一种检测测试样品中的NT-proBNP的方法，其包括：

a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的NT-proBNP抗原与权利要求3所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和

b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述NT-proBNP的存在；

优选的，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合；

优选的，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述NT-proBNP结合。

10.一种试剂盒，其包括权利要求1～3任一项所述的结合蛋白。