CN112867394A - 具有降低的效应功能的抗vla-4抗体 - Google Patents

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约瑟夫·沃尔特·阿恩特
卡尔·约翰·莫特利·汉夫
T·O·卡梅伦
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Abstract

本发明涉及抗VLA‑4抗体和其结合片段。本发明还包括编码所述抗体和其结合片段的多聚核苷酸以及制造所述抗体和其结合片段的方法。本发明还包括通过施用所述抗体和其结合片段来治疗患有多发性硬化症和/或癫痫症的患者的方法。本发明还包括降低重组抗α4抗体或其结合片段对扰乱的易感性的方法。

Description

具有降低的效应功能的抗VLA-4抗体
技术领域
本发明涉及α4结合抗体和其片段。
序列表
本申请含有已经由EFS-Web提交并且通过引用整体并入本文的序列表。所述序列表创建于2019年4月12日，命名为Anti_VLASequence PatentIN_ST25并且大小为208千字节。
发明背景
整合素是介导细胞-细胞和细胞-基质相互作用的细胞表面受体大家族的成员。它们以α链与β链的不同组合的非共价αβ异二聚体形式存在并且共有广泛的结构同源性。整合素介导广泛多种生理过程并且与广泛多种病理学疾患有关。α4链主要局限于白细胞并且可与两种β链即β1和β7缔合。
VLA-4(也称为α4β1)和α4β7在发炎性疾病的病理生理学中起重要作用。VLA-4是β1整合素细胞表面受体家族的成员。VLA-4含有α4链和β1链并且参与细胞-细胞相互作用。其表达主要局限于淋巴细胞，包括T淋巴细胞，以及骨髓细胞，包括小胶质细胞和巨噬细胞。VLA-4结合内皮细胞配体VCAM-1(血管细胞粘附分子-1)，并且可介导T淋巴细胞和B淋巴细胞附连到人类血浆纤维连接蛋白的肝素II结合片段。VLA-4调控正常白细胞运输(Lobb和Hemler,J.Clin.Invest.94(5):1722-1728,1994)并且提供支持细胞活化的关键共刺激信号(Clark和Brugge,Science 268(5208):233-9,1995)。在炎性反应期间，VLA-4调控白细胞向受损组织中迁移，并且因而已被公认为有吸引力的治疗靶标。使用阻断性单克隆抗体(Lobb和Hemler,同上；Enders等人,Brain 121(Pt 7):1257-66,1998；Ramos-Barbon等人,Am J Respir Crit Care Med.163(1):101-8.2001)、抑制性肽(Molossi等人,J ClinInvest.95(6):2601-10,1995；Abraham,1997；van der Laan等人,JNeurosci Res.2002年1月15日；67(2):191-9,2002)和小分子拮抗剂(Kudlacz等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.301(2):747-52,2002)进行的体内研究已验证α4β1整合素在白细胞介导的炎症中的关键作用。
α4β1通过结合到两种蛋白质配体即VCAM-1或纤维连接蛋白(例如，含有交替剪接的连接区段1(CS1)的纤维连接蛋白变体)中的任一者来介导细胞粘附(Osborn等人,Cell59(6):1203-11,1989；Wayner等人,J.Cell Biol.109(3):1321-30,1989)。已鉴定其他潜在配体(Bayless等人,J.Cell Sci.111(Pt 9):1165-74,1998)；然而，这些相互作用的生物学意义尚不太清楚。α4β1与其配体之间的相互作用具有低亲和力，并且有可能经由多价相互作用来调节结合。尽管α4β1的表达是组成性的，但其与配体的相互作用在可由包括抗原、抗T细胞受体mAb、伏波醇酯、二价阳离子Mn2+和某些β1特异性抗体的各种刺激诱导的活化状态下强烈增强。这些亲和力和/或亲合力的变化最终决定相互作用是否有效并且使配体/整合素复合物稳定(Humphries,Curr Opin Cell Biol.8(5):632-40,1996)。α4β7由更局限的一组白细胞表达，并且在某种程度上负责通过结合粘膜地址素MadCAM而使淋巴细胞归巢至粘膜淋巴组织，但其也结合VCAM-1和纤维连接蛋白。某些针对α4的单克隆抗体(mAb)可阻断VLA4和α4β7二者的粘附功能。
可使用人源化抗体代替鼠类抗体作为治疗剂来避免在人类中出现称为HAMA(人类抗小鼠抗体)反应的不理想免疫反应。一般通过将人类抗体的互补决定区(CDR)置换为另一物种(通常是小鼠抗体)的CDR来构建人源化抗体。
抗体能够经由其可变区结合抗原。抗体一旦结合抗原后，就靶向抗原以进行破坏，该过程通常至少部分由所述抗体的恒定区或Fc区介导。存在若干种由抗体Fc区介导的效应功能或活性。一种效应功能是能够结合可在称为补体依赖性细胞毒性(CDC)的过程中辅助溶解靶抗原，例如细胞病原体的补体蛋白。Fc区的另一个效应活性是结合到免疫细胞或能够触发其他免疫效应的所谓效应细胞表面上的Fc受体(例如FcγR)。这些免疫效应(例如，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP))通过例如释放免疫活化因子和调控抗体产生、内吞作用、吞噬作用和细胞杀伤而在移除病原体/抗原方面起作用。在一些临床应用中，这些反应对抗体的功效至关重要，而在其他情况下，其会激起不需要的副作用。效应因子介导的副作用的一个实例是释放引起急性发热反应的炎性细胞因子。另一个实例是携带抗原的细胞的长期耗竭。
可通过使用缺乏Fc区的抗体片段(例如，如Fab、F(ab')2或单链Fv(scFv))来避免抗体的效应功能。然而，这些片段由于通过肾脏快速清除而具有降低的半衰期。Fab和scFv片段仅具有一个抗原结合位点而不是两个，从而可能牺牲由于结合亲合力而具有的任何优势并在制造方面带来潜在挑战。替代方法旨在降低全长抗体的效应功能，而保留Fc区的其他有价值属性(例如，延长的半衰期和异二聚化)。一种降低效应功能的方法是通过消除与Fc区中特定残基连接的糖来产生所谓的无糖基化抗体。无糖基化抗体可通过例如缺失或改变糖附连的残基、在酶作用下移除糖、在糖基化抑制剂存在下培养的细胞中产生抗体或通过在不能使蛋白质糖基化的细胞(例如，细菌宿主细胞)中表达抗体来产生。另一种方法是采用来自IgG4抗体而非IgG1的Fc区。众所周知，IgG4抗体的特征在于补体活化和抗体依赖性细胞毒性的水平低于IgG1。
针对人类α4的单克隆抗体结合到三种功能不同的形貌表位A、B和C(Pulido等人,J.Biol.Chem.266:10241-10245,1991；Schiffer等人,J.Biol.Chem.270:14270-14273,1995)。表位B再分为B1表位和B2表位，它们在形貌上不可区分但可由mAb诱导细胞聚集的能力来定义。针对表位A和B2的抗α4mAb可诱导同型细胞聚集，但针对表位B1和C的那些抗α4mAb则不然。
发明内容
本发明涉及包含种系可变区框架的抗VLA-4抗体和其结合片段，其可使CDR移植α4结合抗体，如抗VLA-4抗体优化。因此，本发明包含抗VLA-4可变重(VH)链和可变轻(VL)链以及包括这些框架的抗体分子。在一些实施方案中，所述VLA-4是人类VLA-4。在一些实施方案中，所述VLA-4包含α4链(例如，人类α4链)。
所述抗体还可含有被修饰的Fc区，所述被修饰的Fc区改变或降低效应功能并且改进稳定性。具有被修饰的Fc区的抗体可改进在缺乏低聚糖的抗体中所观测的显著不利影响，特别是对构象和稳定性的不利影响。具有被修饰的Fc区的抗体也可具有改变或降低的效应功能和改进的稳定性。本发明还涉及制造本文中所描述的分子的方法。
所述抗体可通过提供用于增强Fc区稳定性的改进方法来改善现有技术“无效应因子”抗体的问题。举例来说，本发明提供稳定性工程化的Fc多肽，例如稳定化IgG抗体或其他含Fc的结合分子，其包含多肽Fc区中的稳定化氨基酸。在一个实施方案中，本发明提供用于在亲本Fc多肽的Fc区中的特定氨基酸残基位置引入使Fc区稳定性增强的突变的方法。在一些实施方案中，稳定化Fc多肽具有改变或降低的效应功能(相较于不包含稳定化氨基酸的多肽)并且展现增强的稳定性(相较于亲本Fc多肽)。在一些实施方案中，所述亲本Fc多肽是人类IgG1(例如，具有SEQ ID NO:83的序列)。在一些实施方案中，所述亲本Fc多肽是人类IgG4(例如，具有SEQ ID NO:84的序列)。
因此，本文中所公开的抗体可提供若干优势，包括但不限于以下：
-提供由于其降低的效应功能而适合作为治疗剂的包含稳定化无糖基化Fc区的稳定化无糖基化Fc多肽，例如稳定化融合蛋白或无糖基化IgG抗体；
-提供由于其降低的效应功能而适合作为治疗剂的包含来源于IgG4抗体的Fc区的稳定化Fc多肽，例如稳定化糖基化或无糖基化融合蛋白或IgG4抗体；
-在对多肽进行最小变化的情况下产生稳定化Fc多肽的有效方法(例如，通过向非稳定化亲本多肽中引入变化或通过表达编码稳定化Fc多肽的核酸分子)；
-增强Fc多肽的稳定性同时避免免疫原性和/或效应功能的任何增加的方法；
-用于增强Fc多肽的可调性、制造和/或长期稳定性的方法；和
-用本发明的稳定化Fc多肽治疗需要治疗的受试者的方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗α4抗体VH链，其具有来自供体抗α4抗体，例如本文中所描述的抗α4抗体的CDR以及具有来自VH链种系可变区序列的序列的区域1、2、3和4或相对于VH链种系可变区序列具有不超过5、10或15个差异的VH框架。在一个实施方案中，可变框架区4(FR4)是人类共有序列。在一个实施方案中，存在完整VH链框架区FR1、FR2、FR3和FR4。在另一个实施方案中，所述链是VH区的抗原结合片段。
在一个实施方案中，所述种系序列是图1中所描绘的人类IGHV1-f(SEQ ID NO:2)。在某些实施方案中，所述VH框架序列相对于种系序列例如SEQ ID NO:2可能有至少一个但不超过2、3、4、5、10或15个氨基酸残基不同。在一个实施方案中，所述VH框架还包括除相应人类残基以外的残基。举例来说，所述VH链在SEQ ID NO:2的框架位置24、67、76、80和94(Kabat编号)中的一者或多者处包括非典型残基。
在一个实施方案中，可变域的互补决定区(CDR)中的至少一者或多者来源于供体非人类α4结合抗体(即，特异性结合到α4的非人类抗体)。在一个实施方案中，CDR移植重链可变域的抗原结合区包括对应于位置26-34(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)(Kabat编号)的CDR。
因而，在一个实施方案中，所述可变重链(VH)框架具有来源于人类抗体种系序列IGHV1-f的受体序列。
在另一个实施方案中，VH的FR1区中的至少一个氨基酸并且少于2、3、4、5或10个氨基酸残基不是相应人类种系残基。举例来说，所述残基中的一者或多者可与CDR序列所来源的非人类抗体框架区同一。在一个实施方案中，使Kabat位置24处的氨基酸残基突变以便与非人类抗体框架区同一。
在另一个实施方案中，VH的FR2区中的至少一个氨基酸并且少于2、3、4、5或10个氨基酸残基不是相应人类种系残基。举例来说，所述残基中的一者或多者可与CDR序列所来源的非人类抗体框架区同一。
在另一个实施方案中，VH链的FR3中的至少一个氨基酸并且少于2、3、4、5或10个氨基酸残基不是相应人类种系残基。举例来说，所述残基中的一者或多者可与CDR序列所来源的非人类抗体框架区同一。在一个实施方案中，Kabat位置94处的氨基酸残基与非人类抗体框架区同一。在另一个实施方案中，Kabat位置67、76、80和94处的氨基酸残基与非人类抗体框架区同一。
在某些实施方案中，所述抗体的VH链具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的序列。
在一个方面，本发明提供一种抗VLA-4VL链，其具有来自供体抗VLA-4抗体，例如本文中所描述的抗VLA-4抗体的CDR以及具有来自VL链种系可变区序列的序列的区域1、2、3和4或相对于VL链种系可变区序列具有不超过5、10或15个差异(每个区域或总共)的VL框架。在一个实施方案中，可变框架区4(FR4)是人类共有序列。在一个实施方案中，存在完整VL链框架区FR1、FR2、FR3和FR4。在另一个实施方案中，所述链是VL区的抗原结合片段。
在另一个实施方案中，所述种系序列是图2中所描绘的IGKV4-1(SEQ ID NO:7)。在其他实施方案中，所述VL框架序列相对于种系框架序列，例如SEQ ID NO:7可能有至少一个但不超过2、3、4、5、10或15个氨基酸残基不同。在另一个实施方案中，所述VL还包括除相应人类氨基酸残基以外的残基。举例来说，所述VL链进一步在SEQ ID NO:7的框架位置1、73和87(Kabat编号)中的一者或多者处包括非人类残基。
在一个实施方案中，所述序列是图2中所描绘的AAH7035.1(SEQ ID NO:12)或其种系工程化型式(SEQ ID NO:13)。在一些实施方案中，所述VL框架序列相对于种系工程化框架序列例如SEQ ID NO:13可能有至少一个但不超过5、10、15、20或25个氨基酸残基不同。在一个实施方案中，所述VL链包括除相应人类残基以外的残基。举例来说，所述VL链在SEQ IDNO:12的框架位置1和87(Kabat编号)中的一者或多者处包括非人类残基。在另一个实施方案中，所述VL在框架区中包括氨基酸取代以类似于不同的人类种系框架序列，例如种系序列IGKV4-1。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:12的位置1-3、5-23、35-37、39-42、45-49、57、59-61、63-64、70-72、74-84、86-88、99-106(Kabat编号)处对所述VL框架序列进行改变以便与IGKV4-1种系序列同一。
在一个实施方案中，可变域的互补决定区(CDR)中的至少一者或多者来源于供体非人类α4结合抗体。在另一个实施方案中，CDR移植重链可变域的抗原结合区包括对应于位置24-31(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)(Kabat编号)的CDR。因而，在一个实施方案中，所述VL框架具有由IGKV4-1种系序列、由抗体AAH70335.1或由种系工程化抗体AAH70335.1构建的受体序列。
在另一个实施方案中，VL链的FR1中的至少一个氨基酸并且少于2、3、4、5、10或15个残基不是相应人类残基。举例来说，所述残基中的一者或多者可与CDR序列所来源的非人类抗体框架区同一。在一个实施方案中，使FR1的N端位置处的氨基酸残基突变以便与非人类抗体框架区同一。
在另一个实施方案中，VL链的FR2中的至少一个氨基酸并且少于2、3、4、5、10或15个残基不是相应人类残基。举例来说，所述残基中的一者或多者可与CDR序列所来源的非人类抗体框架区同一。
在另一个实施方案中，VL链的FR3中的至少一个氨基酸并且少于2、3、4、5、10或15个残基不是相应人类残基。举例来说，所述残基中的一者或多者可与CDR序列所来源的非人类抗体框架区同一。在另一个实施方案中，使Kabat位置87处的氨基酸残基突变以便与非人类抗体框架区同一。在另一个实施方案中，使Kabat位置67和87处的氨基酸残基突变以便与非人类抗体框架序列同一。在另一个实施方案中，使SEQ ID NO:7的Kabat位置67、73和87处的氨基酸残基突变以便与非人类抗体框架序列同一。
在其他实施方案中，所述抗体的VL链具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列。
在一个实施方案中，所述抗体的VH链具有SEQ ID NO:4的序列并且所述抗体的VL链具有SEQ ID NO:11的序列。
在一个实施方案中，对VH和VL受体框架序列的CDR进行选择以类似于非人类(例如鼠类)抗体序列的CDR序列，其中所述非人类抗体结合整合素α4或其片段。在另一个实施方案中，对CDR的序列进行选择以类似于结合VLA-4α4链的B1表位的非人类抗体的CDR的序列。在一个实施方案中，对CDR进行选择以类似于鼠类单克隆抗体，例如HP1/2、HP2/1、HP2/4、L25、P4C2或21.6(Pulido等人,J.Biol.Chem.266:10241-10245,1991；美国专利第6,033,665号)。修饰可意指例如切割和插入或变化，例如通过定向突变诱发。
在另一方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，其包括：
-本文中所描述的抗VLA-4VL链，例如具有来自供体抗VLA-4抗体，例如本文中所描述的抗VLA-4抗体的CDR以及具有来自VL链种系可变区序列的序列的LC框架区1、2和3或相对于VL链种系可变区序列具有不超过5、10或15个差异的VL框架的抗VLA-4VL链。在一个实施方案中，可变区4是人类共有序列；以及
-本文中所描述的抗VLA-4VH链，例如具有来自供体抗VLA-4抗体，例如本文中所描述的抗VLA-4抗体的CDR以及具有来自VL链种系可变区序列的序列的LC框架区1、2和3或相对于VL链种系可变区序列具有不超过5、10或15个差异的VL框架的抗VLA-4VL链。在一个实施方案中，可变区4是人类共有序列。
在一个实施方案中，所述抗体结合α4β1和α4β7中的一者或两者。
在另一方面，本文中所描述的VL或VH链或抗体或其片段被可检测地标记。
在另一方面，本发明提供一种重组抗α4抗体或其α4结合片段，其包含：(a)含有SEQID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQID NO:82)的恒定轻链；和(d)人类IgG1的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自以下的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S或K478缺失。
在一些实施方案中，人类IgG1的恒定重链包含至少两个突变，由至少两个突变组成或基本上由至少两个突变组成，所述突变选自：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S或K478缺失。
在一些实施方案中，人类IgG1的恒定重链包含至少三个突变，由至少三个突变组成或基本上由至少三个突变组成，所述突变选自：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S或K478缺失。
在一些实施方案中，人类IgG1的恒定重链包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个、或至少十个、或至少十一个、或至少十二个、或至少十三个、或至少十四个、或至少十五个、或至少十六个、或至少十七个、或至少十八个、或至少十九个、或至少二十个、或至少二十一个、或至少二十二个、或至少二十三个、或至少二十四个突变，所述突变选自以下：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S或K478缺失。
在一些实施方案中，人类IgG1的恒定重链包含以下突变，由以下突变组成，或基本上由以下突变组成：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
在另一方面，本发明提供一种重组抗α4抗体或其α4结合片段，其包含：(a)含有SEQID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQID NO:82)的恒定轻链；和(d)人类IgG4的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
在一些实施方案中，人类IgG4的恒定重链包含至少两个突变，由至少两个突变组成或基本上由至少两个突变组成，所述突变选自由以下组成的组：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
在一些实施方案中，人类IgG4的恒定重链包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个突变，所述突变选自由以下组成的组：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
在一些实施方案中，人类IgG4的恒定重链包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：下列突变中的一者或多者：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
注意，C端赖氨酸残基(在根据Kabat编号方案的478位)通常在翻译后或通过手段缺失。因而，在一些实施方案中，本文中所描述的抗体的重链(或其结构域的Fc部分)缺乏C端赖氨酸。换句话说，在一些实施方案中，本文中所描述的抗体的重链(或其结构域的Fc部分)中478位(Kabat编号)的赖氨酸缺失。
在一些实施方案中，无突变或取代的人类IgG1的恒定重链具有SEQ ID NO:83的序列。
在一些实施方案中，无突变或取代的人类IgG4的恒定重链具有SEQ ID NO:84的序列。
在另一方面，本发明提供一种载体，其含有编码本文中所描述的抗体重链或其α4结合片段的DNA。在一些实施方案中，所述载体的DNA编码具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列的VH。
在另一方面，本发明提供一种载体，其含有编码本文中所描述的抗体轻链或其α4结合片段的DNA。在一些实施方案中，所述载体的DNA编码具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列的VL链。
在另一方面，本发明提供一种载体，其含有编码本文中所描述的抗体重链或其α4结合片段和本文中所描述的抗体轻链或其α4结合片段的DNA。
在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其含有本文中所描述的载体，例如能够表达本文中所描述的重链和/或轻链抗体或抗体片段的载体。在某些实施方案中，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在一个方面，本发明提供一种制造重组抗α4抗体或其α4结合片段的方法，所述方法是通过以下实现：提供用(a)编码本文中所描述的抗体重链或其α4结合片段的DNA序列和(b)编码抗体轻链或其α4结合片段的DNA序列转染的宿主细胞，以及培养经转染的细胞以产生所述重组抗α4抗体分子或其α4结合片段。编码抗体重链和轻链的DNA可处于同一载体上或处于不同载体上。
在一个方面，本发明提供一种制造重组抗α4抗体或其α4结合片段的方法，所述方法是通过以下实现：提供用(a)编码抗体重链或其α4结合片段的DNA序列(其中所述DNA序列具有SEQ ID NO:4的序列)和(b)编码抗体轻链或其α4结合片段的DNA序列(其中所述DNA序列具有SEQ ID NO:11的序列)转染的宿主细胞，以及培养经转染的细胞系以产生所述重组抗α4抗体分子或其α4结合片段。编码抗体重链和轻链的DNA可处于同一载体上或处于不同载体上。
在另一方面，本发明提供一种治疗由α4整合素例如α4β1(VLA-4)或α4β7整合素介导的疾病或病症的方法，所述方法是通过向需要这种治疗的受试者施用本文中所描述的α4抗体或抗体片段或者含有所述抗体或片段的药物组合物来实现。所述受试者可能患有或处在患上例如以下疾病的风险下：发炎性、免疫性或自身免疫性病症(例如，中枢神经系统炎症，例如多发性硬化症、脑膜炎、视神经脊髓炎、神经结节病、CNS血管炎、脑炎和横贯性脊髓炎)、组织或器官移植物排斥反应或移植物抗宿主病；急性CNS损伤，例如中风、创伤性脑损伤(TBI)或脊髓损伤(SCI)；慢性肾病；过敏，例如过敏性哮喘；1型糖尿病；发炎性肠病，例如克罗恩病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎；重症肌无力；纤维肌痛；关节炎性病症，例如类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎；发炎性/免疫性皮肤病症，例如牛皮癣、白癜风、皮炎、扁平苔藓；全身性红斑狼疮；修格连氏综合征(Sjogren's Syndrome)；血液学癌症，例如多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤；实体癌，例如肉瘤或癌瘤，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌；和纤维化病症，例如肺纤维化、骨髓纤维化、肝硬化、肾小球膜增生性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、糖尿病性肾病和肾间质性纤维化。在一个优选实施方案中，本发明提供一种治疗患有多发性硬化症的患者或减轻患有多发性硬化症的患者的症状的方法，所述多发性硬化症是例如临床孤立综合征、复发性缓解性多发性硬化症或活动性继发性进行性多发性硬化症。在某些实施方案中，所述多发性硬化症是多发性硬化症的复发形式。在一个优选实施方案中，本发明提供一种治疗患有癫痫症(包括耐药性癫痫症)或处于患上癫痫症(包括耐药性癫痫症)的风险下的患者的方法。在某些实施方案中，所述受试者或患者是人类。
在另一方面，本发明提供一种通过向患者施用α4结合抗体或抗体片段来治疗患者的方法。在一个实施方案中，所述患者患有癌症，例如实体肿瘤或血液学恶性病。举例来说，用α4结合抗体或抗体片段治疗的患者可能患有急性骨髓性白血病(AML)或多发性骨髓瘤(MM)。
在另一个实施方案中，所述患者患有发炎性病症，例如多发性硬化症、哮喘(例如中度至重度哮喘)、类风湿性关节炎、糖尿病或克罗恩病。在另一个实施方案中，所述组合物依据方案施用。在另一个实施方案中，所述方法还包括选择适合用所述组合物治疗的患者。举例来说，适合治疗的患者已显示指示疾病发作的征象或症状，例如指示MS的征象或症状。在一个优选实施方案中，所述患者患有癫痫症。
在某些实施方案中，向所述患者施用治疗有效量的α4结合抗体或抗体片段。在某些实施方案中，向所述患者施用约0.0003mg/kg、0.0004mg/kg、0.0005mg/kg、0.0006mg/kg、0.0007mg/kg、0.0008mg/kg、0.0009mg/kg、0.0010mg/kg、0.0015mg/kg或0.0020mg/kg至约0.0025mg/kg、0.003mg/kg、0.005mg/kg、0.010mg/kg、0.0125mg/kg、0.025mg/kg、0.050mg/kg、0.0625mg/kg、0.080mg/kg、0.100mg/kg、0.200mg/kg、0.300mg/kg、0.3125mg/kg、0.40mg/kg、0.50mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg范围内的量的α4结合抗体或抗体片段。在一些实施方案中，向所述患者施用约0.025mg/kg至约10mg/kg的量的α4结合抗体或抗体片段。在一些实施方案中，向所述患者施用约0.0625mg/kg至约8.0mg/kg的量的α4结合抗体或抗体片段。在一些实施方案中，向所述患者施用约0.3mg/kg至约6.0mg/kg的量的α4结合抗体或抗体片段。在一些实施方案中，向所述患者施用约0.5mg/kg至约5.0mg/kg的量的α4结合抗体或抗体片段。
在另一个实施方案中，所述方法还包括向所述患者施用第二治疗剂，例如化学治疗剂、血栓溶解剂、神经保护剂、抗炎剂、类固醇、细胞因子或生长因子。
在一个实施方案中，向所述患者施用本文中所描述的人源化抗VLA-4抗体或其片段，例如HuHP1/2、H1L1、H1L2或H1L3。
在一个实施方案中，含有α4结合抗体的组合物依据方案，例如以有规律的时间间隔施用。举例来说，所述组合物可每日一次、每周一次或每月一次；每周一次、每周两次、每周三次、每周四次或更多次；或者每两周一次、每三周一次、每四周一次或更长时间间隔施用。
在一个实施方案中，可根据患者的先前施用抗α4抗体的清除率来调节剂量。举例来说，在一个实施方案中，在患者系统中的抗α4抗体水平降至预定水平以下之前，将不向患者施用第二或后续剂量。在一个实施方案中，测定来自患者的样品(例如，血浆、血清、血液或尿液样品)中抗α4抗体的存在，并且如果抗α4抗体水平高于预定水平，则将不向所述患者施用第二或后续剂量。如果患者系统中的抗α4抗体水平低于预定水平，则向所述患者施用第二或后续剂量。
在一个实施方案中，连续施用所述组合物，例如，在超过30分钟但少于1、2、4或12小时的时段内。含有抗体和第二剂的组合物可通过任何适当的方法例如经皮下、肌肉内或静脉内施用。
在一些实施方案中，所述抗体和所述第二剂各自以与各自用于单一疗法时的处方剂量相同的剂量施用。在其他实施方案中，以等于或小于单独施用时实现功效所需的量的剂量施用所述抗体。同样，可以等于或小于单独施用时实现功效所需的量的剂量施用所述第二剂。
本公开中所提供的另一方面是一种评估患者的方法，所述方法是通过以下实现：确定所述患者是否满足预选标准，以及如果所述患者满足所述预选标准，则对所述患者批准、提供、开具或施用本文中所描述的VLA-4结合抗体制剂。在一个实施方案中，所述预选标准是患者未能充分响应于例如用于治疗MS的先前替代治疗性治疗或方案。在另一个实施方案中，所述预选标准是不存在进行性多灶性白质脑病(PML)的任何征象或症状，或者不存在PML的任何诊断。在一些情况下，选择是基于不存在PML的风险因素，例如，受试者未检验为JC病毒DNA阳性或未检验为JC病毒抗体阳性。在另一个实施方案中，所述标准如PCT/US07/75577(公布为WO2008/021954)中所描述，所述文献通过引用并入本文，其描述用于药物分布和用于向患者提供药物的方法和系统。
在另一方面，提供一种分布本文中所描述的组合物的方法。所述组合物含有α4结合抗体。所述方法包括向接受者(例如，最终使用者、患者、医师、零售或批发药房、经销商或医院药房部门、疗养院诊所或HMO)提供含有足够单位剂量的药物的包装以治疗患者至少6、12、24、36或48个月。在另一方面，本发明提供一种评估本文中所描述的含有α4结合抗体的组合物的包装或包装批次的质量(例如，以确定其是否已到期)的方法。所述方法包括评估包装是否已到期。到期日是距预选事件(例如制造、测定或包装)至少6、12、24、36或48个月，例如超过24或36个月。在一些实施方案中，作为分析的结果，做出决定或步骤。举例来说，取决于正确分析，对包装中的抗体加以使用或丢弃、分类、选择、发布或保留、运输、移至新位置、准入市面、销售或要约销售、退出市面或不再要约销售，视产品是否已到期而定。
在另一方面，本发明提供一种包装，其含有至少两个单位剂量的含有α4结合抗体的水性组合物。在一个实施方案中，所有单位剂量均含有相同量的抗体，并且在其他实施方案中，存在具有两种或更多种强度或者两种或更多种不同制剂，例如具有不同的强度或释放性质的单位剂量。
在另一方面，本发明包括指导接受者施用含有α4结合抗体的制剂的方法。所述方法包括指导接受者(例如，最终使用者、患者、医师、零售或批发药房、经销商或医院药房部门、疗养院诊所或HMO)应根据本文中所描述的方案将抗体施用于患者。所述方法还可包括指导接受者应在到期日之前施用抗体。到期日是距预选事件(例如制造、测定或包装)至少6、12、24、36或48个月，例如超过24或36个月。在一个实施方案中，所述接受者也接受抗体供应，例如抗体单位剂量供应。
在一个实施方案中，稳定多肽包含嵌合Fc区，其中所述稳定化多肽包含至少一个来源于人类IgG4抗体的恒定域和至少一个来源于人类IgG1抗体的恒定域。
在一个实施方案中，所述Fc区是糖基化Fc区。
在一个实施方案中，所述Fc区是无糖基化Fc区。
在一个实施方案中，所述Fc区是在Fc区第297位(EU编号)、第314位(Kabat编号)包含谷氨酰胺(Q)的无糖基化Fc区。
在一个实施方案中，所述嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2结构域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域。在一些实施方案中，包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2结构域和来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域的嵌合Fc区进一步在Fc区第297位(EU编号)、第314位(Kabat编号)包含谷氨酰胺(Q)残基而非天然存在的精氨酸(N)残基。
在一个实施方案中，所述嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CH1和CH2结构域以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域，并且其中所述抗体在氨基酸第228位(EU编号)、第241位(Kabat编号)处包含脯氨酸。在一些实施方案中，所述嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CH1和CH2结构域以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域，并且其中所述抗体在氨基酸第228位(EU编号)、第241位(Kabat编号)处包含脯氨酸，进一步在Fc区第297位(EU编号)、第314位(Kabat编号)处包含谷氨酰胺(Q)残基而非天然存在的精氨酸(N)残基。
在一个实施方案中，所述IgG抗体是人类抗体。
在一个实施方案中，所述无糖基化Fc区包含嵌合铰链结构域。
在一个实施方案中，所述嵌合铰链结构域包含在氨基酸第228位(EU编号)、第241位(Kabat编号)被脯氨酸残基取代。
在一个实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:4的序列的VH链，具有SEQ IDNO:11的序列的VL链，包含来自IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CH1和CH2结构域以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域的嵌合Fc区，并且其中所述抗体包含对CH2区中第297位(EU编号)、第314位(Kabat编号)的谷氨酰胺残基(Q)的取代；对铰链区中氨基酸第228位(EU编号)、第241位(Kabat编号)的脯氨酸残基(P)的取代；以及CH3区中第447位(EU编号)(第478位，Kabat编号)的赖氨酸(K)的缺失。
在一个实施方案中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:80的序列的重链和具有SEQ IDNO:81的序列的轻链。
在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:86的重链，即IgG4 HP1/2 H1重链(野生型；糖基化)。
在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:87的重链，即IgG4 HP1/2重链S228P(EU编号)(也称为IgG4P；糖基化)。
在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:88的重链，即IgG4 HP1/2 H1重链S228P L235E(EU编号)(也称为IgG4PE；糖基化)。
在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:89的重链，即IgG4 HP1/2 H1重链S228P T299A(EU编号)(无糖基)。
在一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:90的重链，即IgG1 HP1/2 H1重链N297Q(EU编号)(无糖基)。
在某些治疗性抗体，例如具有IgG4恒定区的抗体中，扰乱可能产生对治疗性抗体靶标(例如VLA4)是单价的并且对另一个抗原是单价的双特异性单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体可消除扰乱或降低抗体对扰乱的易感性，从而降低PK/PD变异性。在某些实施方案中，所述抗体可增加二价单克隆抗体的效能并消除由于扰乱所致的双特异性。在某些实施方案中，所述抗体可展现比其未突变对应物更高的结合亲和力和/或显示更高的持续受体占用率。
根据以下实施方式和权利要求书，本发明的其他特征和优势将显而易见。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一个以彩色制作的附图。在需要时并且支付必需费用后将由专利局提供含彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1示出HP1/2重链(SEQ ID NO:1)至人类重种系IGHV1-f(SEQ ID NO:2)的三种序列变体。序列上方的小写字母表示根据Kabat编号方案的插入。
图2示出HP1/2轻链(SEQ ID NO:6)至种系IGKV4-1抗体序列(SEQ ID NO:7)(设计L0-SEQ ID NO:8、L1-SEQ ID NO:9和L2-SEQ ID NO:10)或人类κ种系工程化AAH7033.1抗体序列(SEQ ID NO:12)(设计L3-SEQ ID NO:11)的四种序列变体。序列上方的小写字母表示根据Kabat编号方案的插入。
图3是描绘ELISA测定结果的图。
图4是描绘ELISA测定结果的图。
图5是IgG4 Fc(铰链+CH2+CH3结构域)的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)。铰链区以粗体描绘，并且CH3结构域加有下划线。加框的“S”是Ser228(EU编号，即Kabat编号中的Ser241)。加圈的“N”是Kabat编号中的Asn314(EU编号中的Asn297)。
图6是描绘来自HuHP1/2与各种肿瘤细胞系结合的流式细胞术数据的图。“HP1/2”是指人源化HP1/2。
图7A至图7C是描绘HuHP1/2对AML细胞系与被纤维连接蛋白或VCAM1-Ig涂布的孔结合的抑制的一组图。图7A描绘对HL60和KG1细胞与被FN涂布的孔结合的抑制。图7B描绘对KG1细胞与被VCAM1-Ig涂布的孔结合的抑制。图7C描绘当与20μg/mL HuHP1/2一起温育时对HL60细胞与被FN和VCAM1-Ig涂布的孔结合的抑制(实心条柱)。空心条柱指示在同种型对照存在下的细胞粘附百分比。“HP1/2”是指人源化HP1/2。
图8A至图8C组成描绘HuHP1/2对MM细胞系与被纤维连接蛋白或VCAM1-Ig涂布的孔结合的抑制的一组图。图8A描绘对U266和H929细胞与被FN涂布的孔结合的抑制。图8B描绘对U266和H929细胞与被VCAM1-Ig涂布的孔结合的抑制。图8C描绘当与20μg/mL HuHP1/2一起温育时对U266细胞与被FN和VCAM1-Ig涂布的孔结合的抑制(实心条柱)。空心条柱指示在同种型对照存在下的细胞粘附百分比。“HP1/2”是指人源化HP1/2。
图9A至图9C组成描绘HuHP1/2对CLL细胞系与被纤维连接蛋白或VCAM1-Ig涂布的孔结合的抑制的一组图。图9A描绘对Mec1和JM1细胞与被FN涂布的孔结合的抑制。图9B描绘对Mec1和JM1细胞与被VCAM1-Ig涂布的孔结合的抑制。图9C描绘当与20μg/mL HuHP1/2一起温育时对Mec1细胞与被FN和VCAM1-Ig涂布的孔结合的抑制(实心条柱)。空心条柱指示在同种型对照存在下的细胞粘附百分比。“HP1/2”是指人源化HP1/2。
图10描绘典型抗原结合多肽(IgG抗体)的结构以及抗体的抗原结合和效应功能(例如Fc受体(FcR)结合)的功能特性。也显示抗体CH2结构域中存在糖(糖基化)如何改变效应功能(FcR结合)而不影响抗原结合。
图11描绘来自IgG1 X射线晶体结构(pdb码1hzh)的两个相互作用CH3结构域(图A)。突出显示IgG1残基K409/K440(EU编号/Kabat编号)和D399/D427(EU编号/Kabat编号)。图2B描绘使用基于结构的HMM对人类IgG1/κ恒定域序列的比对(Wang等人,2009,Proteins76:99,2009.)。CL、CH1和CH3中参与结构域间相互作用的残基位置以及跟与碳水化合物直接接触的那些氨基酸存在强共价作用的氨基酸位置以灰色突出显示。比对下方提供Kabat和EU编号。图2C描绘IgG1-CH2结构域的结构的带状图(Sondermann等人,406(6793):267-73,2000)。CH2结构域内被N连接的碳水化合物埋藏的缬氨酸残基以及独特6氨基酸环被标记。图2D描绘天然IgG1-CH2序列与被完全修饰的IgG1-CH2序列的比对。被修饰的残基位置以黑色显示。被修饰的位置的EU编号示于比对上方。
图12描绘本发明的示例性IgG Fc构建体在搅拌后的浊度(图A)和单体含量％(图B)。
图13描绘IgG Fc构建体保持在低pH(pH 3.1)下时随时间变化的相对峰高。
图14描绘如通过溶液亲和表面等离子体共振所测量的本发明的示例性IgG1和IgG4 Fc构建体对Fcγ受体的初始结合率。
图15描绘用于计算本发明的示例性IgG1和IgG4 Fc构建体结合到CD64(FcγRI)(图6A)和CD16(FcγRIIIa V158)(图6B)的IC50的滴定曲线。
图16描绘突出显示IgG1 T318K(Kabat编号)(T299K，EU编号)相较于IgG1 T318A(Kabat编号)(T299A，EU编号)和IgG1野生型对CD64(FcγRI)的结合有所降低(图7A)和并入T318K(Kabat编号)(T299K，EU编号)突变的示例性IgG4 Fc构建体相较于并入T318A(Kabat编号)(T299A，EU编号)突变的其他示例性IgG4 Fc构建体和IgG1野生型对CD64(FcγRI)的结合有所降低(图7B)的滴定曲线。
图17描绘并入T299K突变的示例性IgG4 Fc构建体相较于并入T299A突变的其他示例性IgG4 Fc构建体和IgG1野生型对CD16(FcγRIIIa V158)的结合。
图18描绘用于评估本发明的示例性IgG1和IgG4 Fc构建体与补体因子C1q的结合的滴定曲线。
图19的图A和图B分别示出用于评估各种Fc构建体与CD64和CD16的结合的滴定曲线。图C示出N314Q(Kabat编号)(N297Q，EU编号)IgG4-CH2/IgG1-CH3与T318A(Kabat编号)(T299A，EU编号)抗体具有相同的半衰期(比无糖基化IgG1稍短)。
图20的图A示出用于评估T318X(Kabat编号)(T299X，EU编号)构建体与CD64的结合的滴定曲线以及带正电侧链T318R(Kabat编号)(T299R，EU编号)和T318KA(Kabat编号)(T299K，EU编号)赋予CD64低亲和力。图B示出用于评估CD64与各种替代构建体的结合的滴定曲线。图C和图D示出用于评估构建体与CD32aR的结合的滴定曲线，并且图E和图F示出构建体与CD16的结合。图G和图H示出C1q ELISA的结果。
图21的图A示出用于评估构建体与CD64的结合的滴定曲线，并且图B示出用于评估构建体与CD16的结合的滴定曲线。
图22A包括HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1κ轻链(H1L3)的核苷酸和氨基酸序列。显示核苷酸序列(显示对应于SEQ ID NO:91的DNA)和轻链序列的氨基酸1-233(SEQ IDNO:92)。以粗斜体显示的氨基酸1-19(和编码DNA序列)含有合成LC信号肽。成熟N端以第20位氨基酸(S)开始。
图22B包括HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1重链(H1L3)的核苷酸和氨基酸序列。显示核苷酸序列(显示DNA并且其对应于SEQ ID NO:93)和重链的氨基酸1-469(SEQ IDNO:94)。氨基酸1-22(DNA序列以斜体显示)含有重新编码的合成信号肽。成熟N端以第23位氨基酸(E)开始。
图23A包括包含HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1κ轻链(H1L3)的信号序列(加下划线)的氨基酸序列。
图23B包括具有SEQ ID NO:81的成熟轻链和SEQ ID NO:80的成熟重链的HP1/2hG4P agly(N297Q，EU编号)G1κ轻链(H1L3)的氨基酸序列。
图24提供具有SEQ ID NO:81的成熟轻链(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1H1L3 ND001的成熟轻链)和SEQ ID NO:80的成熟重链(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1H1L3 ND004/ND006的成熟重链)的蛋白质的UV光谱。
图25示出具有SEQ ID NO:81的成熟轻链(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1H1L3 ND001的成熟轻链)和SEQ ID NO:80的成熟重链(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1H1L3 ND004/ND006的成熟重链)的蛋白质的SDS-PAGE结果。非还原条件示于左侧两个泳道(第1行和第2行)中，并且还原条件示于右侧两个泳道(第3行和第4行)中。泳道1是非还原条件下的HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1 H1L3 ND001)；泳道2是非还原条件下的分子量标志物；泳道3是还原条件下的HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1 H1L3 ND001)，并且泳道4是还原条件下的分子量标志物。
图26示出具有SEQ ID NO:81的成熟轻链(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1H1L3 ND001的成熟轻链)和SEQ ID NO:80的成熟重链(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1H1L3 ND004/ND006的成熟重链)的蛋白质的IEF结果。
图27示出具有SEQ ID NO:81的成熟轻链(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1H1L3 ND001的成熟轻链)和SEQ ID NO:80的成熟重链(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1H1L3 ND004/ND006的成熟重链)的蛋白质的分析型尺寸排阻色谱法结果。
图28至图30示出具有SEQ ID NO:81的成熟轻链(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1 H1L3 ND001的成熟轻链)和SEQ ID NO:80的成熟重链(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1 H1L3 ND004/ND006的成熟重链)的蛋白质的DSC结果。HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1 H1L3完整抗体、Fc和Fab2片段的熔融曲线分别示于图28、图29和图30中。
图31示出在非还原条件下对HP1/2样品进行SDS-PAGE分析的结果。以6和3μg/泳道装载每个样品。分子量标志物示于图左侧。在来自Invitrogen的4-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶上进行SDS-PAGE，并且用Simply Blue染色剂(Invitrogen)将凝胶染色并用蒸馏水脱色。泳道1是6ug/泳道的HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1 H1L3；泳道2是6ug/泳道的HP1/2hG4P agly(T299A)；泳道3是6ug/泳道的那他珠单抗G4P agly；泳道4是6ug/泳道的那他珠单抗G4P；泳道5是3ug/泳道的HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1 H1L3；泳道6是3ug/泳道的HP1/2 hG4P agly(T299A)；泳道7是3ug/泳道的那他珠单抗G4P agly；泳道8是3ug/泳道的那他珠单抗G4P。
图32A示出HP1/2样品的SEC分析结果。在Superdex Increase 5/150 GL柱(GE 28-9909-45)上以0.2ml/min的流速在PBS(10mM磷酸钠、0.15M NaCl，pH 7.5)中操作样品。
图32B示出HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1 H1L3、HP1/2 hG4P agly(T299A)、那他珠单抗G4P agly和那他珠单抗G4P的SEC分析结果。在Superdex 200 Increase 5/150GL柱(GE 28-9909-45)上以0.2ml/min的流速在PBS(10mM磷酸钠、0.15M NaCl，pH 7.5)中操作样品。
图33a和图33b分别示出人源化HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q，EU编号)/IgG1嵌合体(GP1/2 GrP agly/G1)和人源化HP1/2 G1/L3 huIgG4P agly(T299A，EU编号)(HP1/2hG4P)的DSC结果。
图34是显示单次静脉内团注施用3mg/kg HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q，EU编号)/IgG1嵌合体(GP1/2 GrP agly/G1)(图中称为HP12；空心圆圈)、30mg/kg HP12(实心圆圈)和3mg/kg那他珠单抗(Tysabri，闭合三角形)后食蟹猴的药物动力学时程的线图。
图35是显示单次静脉内团注施用3mg/kg HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q，EU编号)/IgG1嵌合体(GP1/2 GrP agly/G1)(图中称为HP12；空心圆圈)、30mg/kg HP12(实心圆圈)和3mg/kg那他珠单抗(Tysabri，闭合三角形)后食蟹猴的游离受体时程的线图。
图36是显示人类(人类1和人类2)和食蟹猴(食蟹猴1和食蟹猴2)中CD49(α4整合素)表达水平的条形图。
图37A至图37D是显示以指定剂量单次静脉内给与那他珠单抗(红色线)和HP1/2(黑色线)之后的预计受体占用率时程的线图。
图38提供描绘在施用特定剂量的HP1/2(图中称为HP12，空心圆圈)和那他珠单抗(实心三角形)后在Cmax下的预计受体占用率的图。
具体实施方式
已证实针对VLA-4的抗体可用于治疗疾病。举例来说，抗VLA-4抗体那他珠单抗
Figure GDA0003031568410000251
用于治疗复发性多发性硬化症和克罗恩病。然而，对于某些疾患，例如急性疾患如脊髓损伤(SCI)或创伤性脑损伤(TBI)的治疗，或者以有限次数施用的治疗，例如癌症的治疗来说，可能适宜用以不同于那他珠单抗的亲和力的亲和力，例如较高亲和力结合和/或具有不同的药理学概况(例如，具有较低体内药物动力学/药效学变异性)的抗VLA-4抗体进行治疗。这些抗体还可用于治疗例如多发性硬化症的疾患，因为可能需要不太频繁的治疗或通过除输注以外的手段施用可能更有效。能够用较低剂量进行治疗还可降低例如PML的不良事件的风险。因此，本发明提供具有这些理想性质的抗体。
本文中公开的某些本发明抗体已展现新设计的人源化α4结合抗体的出乎意料的特征，其对α4的结合亲和力比抗α4抗体那他珠单抗的结合亲和力高出10倍。
所述抗体也具有例如因在Fc多肽的Fc区中包括一个或多个稳定化氨基酸而具有降低的效应功能的稳定化Fc区。在一些实施方案中，所述稳定化氨基酸使多肽的Fc区稳定而不影响多肽的糖基化和/或效应功能，并且不显著改变多肽的其他所需功能(例如，抗原结合亲和力或半衰期)。
为了清楚理解本说明书和权利要求书，下文便利地提供以下定义。
定义
如本文中所用，术语“效应功能”是指Fc区或其部分结合免疫系统的蛋白质和/或细胞并介导各种生物学效应的功能能力。效应功能可为抗原依赖性或抗原非依赖性的。效应功能降低是指在维持抗体(或其片段)的可变区的抗原结合活性的同时降低一种或多种效应功能。效应功能(例如Fc与Fc受体或补体蛋白结合)增加或减少可用变化倍数表示(例如，改变1倍、2倍等)，并且可基于例如使用本领域中众所周知的测定法确定的结合活性变化百分比来计算。如本文中所用，术语“抗原依赖性效应功能”是指正常情况下在抗体与相应抗原结合后诱导的效应功能。典型的抗原依赖性效应功能包括结合补体蛋白(例如C1q)的能力。举例来说，补体C1组分与Fc区结合可活化经典补体系统，从而调理并溶解细胞病原体，所述过程称为补体依赖性细胞毒性(CDCC)。补体活化也刺激炎性反应，并且也可能涉及自身免疫性超敏反应。
其他抗原依赖性效应功能由抗体经由其Fc区结合到细胞上的某些Fc受体(“FcR”)来介导。存在许多对不同类别的抗体具特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体或IgγR)、IgE(ε受体或IgεR)、IgA(α受体或IgαR)和IgM(μ受体或IgμR)。抗体结合到细胞表面上的Fc受体触发许多重要且多样化的生物学反应，包括免疫复合物的内噬、对抗体包被的粒子或微生物的吞噬和破坏(也称为抗体依赖性吞噬或ADCP)、免疫复合物的清除、抗体包被的靶细胞被杀手细胞溶解(称为抗体依赖性细胞毒性或ADCC)、炎性介体的释放、对免疫系统细胞活化的调控、胎盘转移和对免疫球蛋白产生的控制。某些Fc受体、Fcγ受体(FcγR)在消除或增强免疫募集方面起关键作用。FcγR表达于白细胞上并且由三种不同的类别组成：FcγRI、FcγRII和FcγRIII(Gessner等人,Ann.Hematol.,(1998),76:231-48)。在结构上，FcγR是免疫球蛋白超家族中具有IgG结合α链并且细胞外部分由二或三个Ig样结构域组成的所有成员。人类FcγRI(CD64)表达于人类单核细胞上，展现高亲和力结合(Ka＝108-109M-1)至单体IgG1、IgG3和IgG4。人类FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)对IgG1和IgG3(Ka<107M-1)具有低亲和力，并且可仅结合这些IgG同种型的复合形式或聚合形式。此外，FcγRII和FcγRIII类别包含“A”和“B”形式。FcγRIIa(CD32a)和FcγRIIIa(CD16a)通过跨膜结构域结合到巨噬细胞、NK细胞和一些T细胞的表面，而FcγRIIb(CD32b)和FcγRIIIb(CD16b)经由磷脂酰肌醇聚糖(GPI)锚选择性地结合到粒细胞(例如嗜中性白细胞)的细胞表面。人类FcγRI、FcγRII和FcγRIII的个别鼠类同源物是FcγRIIa、FcγRIIb/1和FcγR1o。
如本文中所用，术语“抗原非依赖性效应功能”是指可由抗体(无论其是否已结合其相应抗原)诱导的效应功能。典型抗原非依赖性效应功能包括细胞转运、循环半衰期和免疫球蛋白清除率，以及促进纯化。结构独特的Fc受体“新生儿Fc受体”或“FcRn”，也称为救助受体，在调控半衰期和细胞转运方面起关键作用。从微生物细胞(例如葡萄球菌蛋白A或G)纯化的其他Fc受体能够以高亲和力结合到Fc区，并且可用于促进含Fc多肽的纯化。
与属于免疫球蛋白超家族的FcγR不同，人类FcRn在结构上类似于I类主要组织相容性复合体(MHC)的多肽(Ghetie和Ward,Immunology Today,(1997),18(12):592-8)。FcRn通常表达为由跨膜α或重链与可溶性β或轻链(β2微球蛋白)的复合物组成的异二聚体。FcRn与I类MHC分子共有22-29％序列同一性，并且具有MHC肽结合沟的无功能型式(Simister和Mostov,Nature,(1989),337:184-7)。如同MHC，FcRn的α链由三个细胞外结构域(α1、α2、α3)组成，并且短胞质尾将所述蛋白质锚定至细胞表面。α1和α2结构域与抗体Fc区中的FcR结合位点相互作用(Raghavan等人,Immunity,(1994),1:303-15)。FcRn表达于哺乳动物的母体胎盘或卵黄囊中，并且其涉及IgG从母体转移至胎儿。FcRn也表达于啮齿动物新生儿的小肠中，在其中涉及将母体IgG从所摄入的初乳或乳汁中转移至刷状缘上皮中。FcRn也表达于众多物种的许多其他组织中以及各种内皮细胞系中。它也表达于人类成人血管内皮、肌肉血管和肝窦状隙中。认为FcRn通过结合IgG并将其再循环至血清而在维持其循环半衰期或血清水平方面发挥额外作用。FcRn结合到IgG分子具严格pH依赖性，在pH小于7.0时具有最佳结合。
如本文中所用，术语“半衰期”是指特定结合多肽的体内生物半衰期。半衰期可由施用于受试者的量的一半从动物的循环和/或其他组织中清除所需的时间来表示。当指定结合多肽的清除曲线构建为时间的函数时，所述曲线通常是双阶段的，具有快速α阶段和更久β阶段。α阶段通常表示所施用的Fc多肽在血管内空间与血管外空间之间实现平衡并且部分由多肽的大小决定。β阶段通常表示结合多肽在血管内空间中分解代谢。因此，在一个非限制性实施方案中，如本文中所用的术语半衰期是指结合多肽在β阶段中的半衰期。人类抗体在人类中的典型β阶段半衰期是21天。如本文中所用，术语“多肽”是指两种或更多种天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物。术语“Fc多肽”是指包含Fc区或其部分(例如Fc部分)的多肽。在一些实施方案中，根据本发明的方法使Fc多肽稳定化。在任选的实施方案中，所述Fc多肽还包含可操作地连接或融合至Fc多肽的Fc区(或其部分)的结合位点。
如本文中所用，术语“蛋白质”是指多肽(例如Fc多肽)或包含超过一种多肽的组合物。因此，蛋白质可为单体(例如单一Fc多肽)或多聚体。举例来说，在一个实施方案中，本发明的蛋白质是二聚体。在一个实施方案中，本发明的二聚体是同二聚体，包含两个同一的单体亚单元或多肽(例如，两个同一的Fc多肽)。在另一个实施方案中，本发明的二聚体是异二聚体，其包含两个非同一的单体亚单元或多肽(例如，两个非同一的Fc多肽或一个Fc多肽和除Fc多肽以外的第二多肽)。二聚体的亚单元可包含一个或多个多肽链，其中所述多肽链中的至少一者是Fc多肽。举例来说，在一个实施方案中，所述二聚体包含至少两个多肽链(例如，至少两个Fc多肽链)。在一个实施方案中，所述二聚体包含两个多肽链，其中所述链中的一者或两者都是Fc多肽链。在另一个实施方案中，所述二聚体包含三个多肽链，其中所述多肽链中的一者、两者或全部是Fc多肽链。在另一个实施方案中，所述二聚体包含四个多肽链，其中所述多肽链的一者、两者、三者或全部是Fc多肽链。
如本文中所用，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指通过任何手段，包括化学缀合或重组手段将两个或更多个元件或组件接合在一起。化学缀合方法(例如，使用异双官能交联剂)在本领域中是已知的。如本文中所用，术语“基因融合的”或“基因融合”是指两个或更多个蛋白质、多肽或其片段经由其个别肽主链，通过编码那些蛋白质、多肽或片段的单一多聚核苷酸分子的基因表达而共线、共价连接或附连。这种基因融合引起单一连续基因序列的表达。在一些实施方案中，基因融合是同框的，即，两个或更多个开放阅读框(ORF)以维持原始ORF的正确阅读框的方式融合以形成更长的连续ORF。因此，所得重组融合蛋白是含有两个或更多个对应于由原始ORF编码的多肽的蛋白质区段(所述区段在自然界中在正常情况下不如此接合)的单一多肽。尽管阅读框因而在整个融合基因区段中连续，但蛋白质区段可通过例如同框多肽接头而在物理上或空间上隔开。
如本文中所用，术语“Fc区”应定义为由两个或更多个抗体重链Fc部分形成的免疫球蛋白部分。在某些实施方案中，Fc区是二聚Fc区。“二聚Fc区”或“dcFc”是指由两个单独免疫球蛋白重链的Fc部分形成的二聚体。二聚Fc区可为两个同一Fc部分(例如，天然存在的免疫球蛋白的Fc区)的同二聚体或两个非同一Fc部分的异二聚体。在其他实施方案中，Fc区是单体或“单链”Fc区(即，scFc区)。单链Fc区由基因连接于单一多肽链内(即，编码于单一连续基因序列中)的Fc部分组成。示例性scFc区公开于2008年5月14日提交的PCT申请第PCT/US2008/006260号中，所述PCT申请通过引用并入本文。
如本文中所用，术语“Fc部分”是指来源于在刚好处于木瓜蛋白酶裂解位点(即，将重链恒定区的第一个残基视为114时，IgG中的残基226(Kabat编号)/残基216(EU编号))上游的铰链区起始并且在免疫球蛋白重链C端结束的免疫球蛋白重链部分的序列。因此，Fc部分可为完整Fc部分或其部分(例如，结构域)。完整Fc部分至少包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域(即，Kabat氨基酸位置226-477；EU氨基酸位置216-446)。额外赖氨酸残基(K)有时存在于Fc部分的极C端，但通常从成熟抗体裂解。除非另外规定，否则Fc区内每个氨基酸位置已根据业内公认的EU编号系统进行编号。在某些实施方案中，Fc部分包含以下至少一者：铰链(例如上铰链区、中铰链区和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体、部分或片段。在一些实施方案中，Fc部分至少包含CH2结构域或CH3结构域。在某些实施方案中，Fc部分是完整Fc部分。在其他实施方案中，Fc部分相对于天然存在的Fc部分包含一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。举例来说，铰链结构域、CH2结构域或CH3结构域(或其部分)中的至少一者可能缺失。举例来说，Fc部分可包含以下或由以下组成：(i)与CH2结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)；(ii)与CH3结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)；(iii)与CH3结构域(或其部分)融合的CH2结构域(或其部分)；(iv)CH2结构域(或其部分)；和(v)CH3结构域或其部分。
应注意，抗体中的氨基酸残基有其自身的编号方案。出版物Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,第4卷,1991,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH,USA阐述一种编号方案，有时称为EU索引编号，如Kabat等人中。然而，随时间推移，已出现一种新编号系统，称为Kabat编号。
在一个非限制性实例中，下表阐述人类IgG1的重链CH1、CH2和CH3结构域的EU编号与Kabat编号的比较。注意，人类IgG1恒定区的序列提供于SEQ ID NO:83中。
Figure GDA0003031568410000311
Figure GDA0003031568410000321
Figure GDA0003031568410000331
Figure GDA0003031568410000341
注意，上表中的氨基酸残基是人类IgG1中天然存在或典型的氨基酸残基。因此，第297位(EU编号)(其在Kabat编号中为第314位)的典型残基是天冬酰胺(N)。氨基酸残基相对于典型残基的任何变化将称为取代或突变。
注意，由于人类IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的相似性，所有IgG分子的恒定区均以第118位(EU编号)(第114位，Kabat编号)的丙氨酸残基起始并且以第447位(EU编号)(第478位，Kabat编号)的C端赖氨酸残基结束。
下表显示以EU编号中第216位(Kabat编号中第226位)的谷氨酸残基起始的人类IgG1铰链中的EU编号与Kabat编号的相关性。
Figure GDA0003031568410000342
下表显示以EU编号中第216位(Kabat编号中第226位)的谷氨酸残基起始的人类IgG4铰链中的EU编号与Kabat编号的相关性。
Figure GDA0003031568410000343
在一些实施方案中，在本文中所提及的取代处于天然存在的IgG1或IgG4中时，指示取代的EU或Kabat编号将指天然存在的亲本分子(或其结构域)的编号。举例来说，如果IgG4铰链中第228位的丝氨酸突变是例如脯氨酸，则突变将在EU编号中表示为S228P并且在Kabat编号中表示为S241P。
天然存在的人类IgG1重链的全长序列由此作为以第118位(EU编号)，即第114位(Kabat编号)的典型丙氨酸残基起始的SEQ ID NO:83提供。
天然存在的人类IgG1重链的全长序列由此作为以第118位(EU编号)，即第114位(Kabat编号)的典型丙氨酸残基起始的SEQ ID NO:84提供。
如本文中所阐述，本领域的普通技术人员应理解，Fc部分可被修饰以使其相对于天然存在的免疫球蛋白分子的完整Fc部分在氨基酸序列方面不同，同时保留由天然存在的Fc部分赋予的理想功能中的至少一种。举例来说，Fc部分可至少包含Fc部分的本领域中已知为FcRn结合或延长半衰期所需的部分或由其组成。在另一个实施方案中，Fc部分至少包含本领域中已知为FcγR结合所需的部分。在一个实施方案中，本发明的Fc区至少包含本领域中已知为蛋白A结合所需的部分。在一个实施方案中，本发明的Fc部分至少包含Fc分子的本领域中已知为蛋白G结合所需的部分。在某些实施方案中，Fc区的Fc部分属于同一同种型。
举例来说，Fc部分可来源于IgG1或IgG4同种型的免疫球蛋白(例如，人类免疫球蛋白)。然而，Fc区(或Fc区的一个或多个Fc部分)也可为嵌合的。嵌合Fc区可包含来源于不同的免疫球蛋白同种型的Fc部分。在某些实施方案中，二聚或单链Fc区的Fc部分中的至少两个可来自于不同的免疫球蛋白同种型。在额外或替代实施方案中，嵌合Fc区可包含一个或多个嵌合Fc部分。举例来说，嵌合Fc区或部分可包含一个或多个来源于第一同种型的免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2或IgG3同种型)的部分，而其余Fc区或部分属于不同的同种型。举例来说，Fc多肽的Fc区或部分可包含来源于第一同种型(例如，IgG1、IgG2或IgG4同种型)的免疫球蛋白的CH2和/或CH3结构域以及来源于第二同种型(例如，IgG3同种型)的免疫球蛋白的铰链区。在另一个实施方案中，Fc区或部分包含来源于第一同种型(例如，IgG4同种型)的免疫球蛋白的铰链和/或CH2结构域以及来源于第二同种型(例如，IgG1、IgG2或IgG3同种型)的免疫球蛋白的CH3结构域。在另一个实施方案中，嵌合Fc区包含来自第一同种型(例如，IgG4同种型)的免疫球蛋白的Fc部分(例如，完整Fc部分)和来自第二同种型(例如，IgG1、IgG2或IgG3同种型)的免疫球蛋白的Fc部分。在一个示例性实施方案中，Fc区或部分包含来自IgG4免疫球蛋白的CH2结构域和来自IgG1免疫球蛋白的CH3结构域。在另一个实施方案中，Fc区或部分包含来自IgG4分子的CH1结构域和CH2结构域以及来自IgG1分子的CH3结构域。在另一个实施方案中，Fc区或部分包含来自特定抗体同种型的CH2结构域的一部分，例如CH2结构域的Kabat第309-360位、EU第292-340位。举例来说，在一个实施方案中，Fc区或部分包含CH2的第292-340位(EU编号)、第309-360位(Kabat编号)氨基酸来源于IgG4部分并且CH2的其余部分来源于IgG1部分(或者，CH2的292-340(EU编号)、309-360(Kabat编号)可来源于IgG1部分并且CH2的其余部分来源于IgG4部分)。
在其他实施方案中，Fc区或部分可包含嵌合铰链区。嵌合铰链可部分来源于IgG1、IgG2或IgG4分子(例如，上中铰链序列和下中铰链序列)并且部分来源于IgG3分子(例如，中铰链序列)。在另一个实例中，Fc区或部分可包含部分来源于IgG1分子并且部分来源于IgG4分子的嵌合铰链。在一个特定实施方案中，所述嵌合铰链可包含来自IgG4分子的上铰链结构域和下铰链结构域以及来自IgG1分子的中铰链结构域。这种嵌合铰链可通过在IgG4铰链区的中铰链结构域中EU第228位、Kabat第241位引入脯氨酸取代(Ser228Pro(EU编号)；Ser241Pro(Kabat编号))来制备。在另一个实施方案中，嵌合铰链可在Kabat第246-249位处包含来自IgG2抗体的氨基酸和/或Ser228Pro(EU编号)、Ser241Pro(Kabat编号)突变，其中铰链的其余氨基酸来自于IgG4(例如，序列ESKYGPPCPPCPAPPVAGP的嵌合铰链)。其他嵌合铰链描述于美国专利申请第10/880,320号中，所述美国专利申请通过引用整体并入本文。
“Fc区”的定义内明确包括“无糖基化Fc区”。如本文中所用，“无糖基化Fc区”是例如在其一个或多个Fc部分中在EU第297位、Kabat第314位的N-糖基化位点处缺乏共价连接的低聚糖或聚糖的Fc区。在某些实施方案中，无糖基化Fc区完全无糖基化，即，其所有Fc部分均缺乏碳水化合物。在其他实施方案中，无糖基化是部分无糖基化(即，半糖基化)。无糖基化Fc区可为去糖基化Fc区，即，已例如通过化学手段或酶促手段移除Fc碳水化合物的Fc区。或者，无糖基化Fc区可为非糖基化或未糖基化的，即，例如通过使例如EU第297位或第299位、Kabat第314位或第318位的N-糖基化位点(例如，Asn-X-Ser或Asn-X-Thr)处编码糖基化模式的一个或多个残基突变，通过在天然情况下不将碳水化合物附连到蛋白质的生物体(例如，细菌)中表达，或者通过在通过基因操纵或通过添加糖基化抑制剂(例如，糖基转移酶抑制剂)致使其糖基化机制缺乏的宿主细胞或生物体中表达而在无Fc碳水化合物的情况下表达的抗体。在替代实施方案中，Fc区是“糖基化Fc区”，即，其在所有可利用糖基化位点处均完全糖基化。
术语“亲本Fc多肽”包括含有需要稳定化的Fc区的多肽(例如IgG抗体)。在一些实施方案中，亲本Fc多肽是无效应因子Fc多肽。已描述具有降低的效应功能的稳定化Fc多肽(参见例如PCT公开第WO2010/085682号，所述公开通过引用整体并入本文)。因而，亲本Fc多肽表示对其进行本发明方法或可用作稳定性比较的参考点的原始Fc多肽。亲本多肽可包含天然(即，天然存在的)Fc区或部分(例如，人类IgG4 Fc区或部分)或者具有天然存在的序列的预先存在的氨基酸序列修饰(例如插入、缺失和/或其他变化)但缺乏一个或多个稳定化氨基酸的Fc区。
术语“突变(mutation)”或“突变(mutating)”应理解为包括以物理手段在亲本Fc多肽中进行突变(例如，通过改变(例如通过定点突变诱发)核酸分子的编码一个氨基酸的密码子以产生编码不同的氨基酸的密码子)或合成具有亲本Fc区中未发现的氨基酸的变异Fc区(例如，通过获悉编码亲本Fc区的核酸分子的核苷酸序列并且通过设计在不需要使编码本发明的稳定化多肽的核酸分子的一个或多个核苷酸突变的情况下合成包含编码亲本Fc区变体的核苷酸序列的核酸分子)。
在一个示例性实施方案中，亲本Fc多肽包含来自无效应因子Fc多肽的Fc区。如本文中所用，术语“无效应因子Fc多肽”是指与IgG1同种型的野生型无糖基化抗体相比具有改变或降低的效应功能的Fc多肽。在一些实施方案中，降低或改变的效应功能是抗体依赖性效应功能，例如ADCC和/或ADCP。在一个实施方案中，无效应因子Fc多肽由于Fc多肽的Fc区，例如无糖基化Fc区中的糖基化被修饰或降低而具有降低的效应功能。在另一个实施方案中，无效应因子Fc多肽由于并入IgG4 Fc区或其部分(例如，IgG4抗体的CH2和/或CH3结构域)而具有降低的效应功能。
术语“变异Fc多肽”或“Fc变体”包括来源于亲本Fc多肽的Fc多肽。Fc变体与亲本Fc多肽的不同之处在于其例如由于引入至少一个Fc稳定化突变而包含一个或多个稳定化氨基酸残基。在某些实施方案中，本发明的Fc变体包含在序列上与亲本多肽的序列同一但存在一个或多个稳定化Fc氨基酸的Fc区(或Fc部分)。在一些实施方案中，Fc变体与亲本Fc多肽相比将具有增强的稳定性，并且与亲本Fc多肽相比任选地具有等效或降低的效应功能。
“来源于”指定多肽或蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。在一些实施方案中，来源于特定序列的多肽或氨基酸序列具有与所述序列或其部分(其中所述部分由至少10-20个氨基酸、或至少20-30个氨基酸、或至少30-50个氨基酸组成)基本同一或者可由本领域的普通技术人员鉴定为在序列中具有其起源的氨基酸序列。在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是氨基酸在多肽中在氨基至羧基末端方向上的顺序，其中序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。来源于另一多肽(例如，亲本Fc多肽)的多肽(例如，变异Fc多肽)相对于起始或亲本多肽可具有一个或多个突变，例如，一个或多个氨基酸残基已被另一氨基酸残基取代或具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失。在一些实施方案中，所述多肽包含非天然存在的氨基酸序列。这些变体必需与起始多肽具有低于100％序列同一性或相似性。在一个非限制性实施方案中，变体与起始多肽的氨基酸序列将具有约75％至低于100％氨基酸序列同一性或相似性、或约80％至低于100％、或约85％至低于100％、或约90％至低于100％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)或约95％至低于100％，例如在变体分子的整个长度或其部分(例如，Fc区或Fc部分)上。在一个实施方案中，起始多肽序列(例如，亲本Fc多肽的Fc区)与来源于其的序列(例如，变异Fc多肽的Fc区)之间存在一个氨基酸差异。在其他实施方案中，起始多肽序列与变异多肽之间存在二至十个氨基酸差异(例如，约2-20、约2-15、约2-10、约5-20、约5-15、约5-10个氨基酸差异)。举例来说，可能存在少于约10个氨基酸差异(例如，二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸差异)。关于该序列的同一性或相似性在本文中定义为将序列比对并且在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后候选序列中与起始氨基酸残基同一的氨基酸残基(即，相同残基)的百分比。
本发明的Fc多肽可包含来源于人类免疫球蛋白序列的氨基酸序列(例如，至少一个Fc区或Fc部分)(例如，来自人类IgG分子的Fc区或Fc部分)。然而，多肽可包含来自另一哺乳动物物种的一个或多个氨基酸。举例来说，主题多肽中可包括灵长类动物Fc部分或灵长类动物结合位点。或者，Fc多肽中可存在一个或多个鼠类氨基酸。在一些实施方案中，本发明的Fc多肽不具免疫原性。
本领域的普通技术人员还将理解，可改变本发明的Fc多肽，以使其在氨基酸序列方面不同于其所来源的亲本多肽，同时保留亲本多肽的一种或多种所需活性(例如，降低的效应功能)。在特定实施方案中，进行使Fc多肽稳定化的核苷酸或氨基酸取代。在一个实施方案中，可通过将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入亲本Fc多肽的核苷酸序列中来产生编码Fc变体的经分离核酸分子，从而将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入所编码的蛋白质中。可通过标准技术，例如定点突变诱发和PCR介导的突变诱发来引入突变(例如，稳定化突变)。
如本文中所用，术语“蛋白质稳定性”是指响应于环境条件(例如升高或降低的温度)维持蛋白质的一种或多种物理性质的业内公认量度。在一个实施方案中，物理性质是维持蛋白质的共价结构(例如不存在蛋白水解裂解、不需要的氧化或脱酰胺化)。在另一个实施方案中，物理性质是存在呈适当折叠状态的蛋白质(例如，不存在可溶性或不溶性聚集物或沉淀物)。在一个实施方案中，通过测定蛋白质的生物物理学性质，例如热稳定性、pH去折叠概况、糖基化的稳定移除、溶解性、生物化学功能(例如，结合到蛋白质(例如，配体、受体、抗原等)或化学部分的能力等)和/或其组合来测量蛋白质的稳定性。在另一个实施方案中，通过相互作用的结合亲和力来证实生物化学功能。在一个实施方案中，蛋白质稳定性的量度是热稳定性，即，对热攻击的抗性。可使用本领域中已知的和/或本文中描述的方法来测量稳定性。举例来说，可测量“Tm”，也称为“转变温度”。Tm是50％大分子(例如结合分子)变性的温度，并且被视为描述蛋白质的热稳定性的标准参数。
术语“氨基酸”包括丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(He或I)；亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；和缬氨酸(Val或V)。非传统氨基酸也在本发明的范围内，并且包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物，例如Ellman等人,Meth.Enzym.202:301-336(1991)中所描述的那些氨基酸残基类似物。为了产生这些非天然存在的氨基酸残基，可使用Noren等人,Science 244:182(1989)和Ellman等人,同上的程序。简言之，这些程序涉及用非天然存在的氨基酸残基以化学手段活化抑制型tRNA，接着进行RNA的体外转录和翻译。也可使用本领域中已知的肽化学反应来实现非传统氨基酸的引入。如本文中所用，术语“极性氨基酸”包括具有净零电荷但在其侧链的不同部分中具有非零部分电荷的氨基酸(例如M、F、W、S、Y、N、Q、C)。这些氨基酸可参与疏水性相互作用和静电相互作用。如本文中所用，术语“带电氨基酸”包括可在其侧链上具有非零净电荷的氨基酸(例如R、K、H、E、D)。这些氨基酸可参与疏水性相互作用和静电相互作用。如本文中所用，术语“具有足够空间体积的氨基酸”包括具有占据较大3维空间的侧链的那些氨基酸。具有足够空间体积的侧链化学性质的示例性氨基酸包括酪氨酸、色氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸或其类似物或模拟物。
“氨基酸取代”是指将预定氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中的至少一个现有氨基酸残基置换为第二不同的“置换”氨基酸残基。“氨基酸插入”是指将至少一个额外氨基酸并入预定氨基酸序列中。尽管插入通常将由一或两个氨基酸残基的插入组成，但可进行本发明的较大“肽插入”，例如约三至约五或甚至多达约十、十五或二十个氨基酸残基的插入。插入的残基可为天然存在的或非天然存在的，如以上所公开。“氨基酸缺失”是指从预定氨基酸序列移除至少一个氨基酸残基。如以上所阐述，这些术语包括对现有物理核酸分子的实际变化或在设计过程中(例如，在纸上或在计算机上)对现有核酸序列进行的变化。在某些实施方案中，本发明的多肽是结合多肽。如本文中所用，术语“结合多肽”(例如，结合抗体)是指包含至少一个特异性结合到所指示的靶分子(例如抗原或结合伴侣)的靶结合位点或结合结构域的多肽(例如，Fc多肽)。举例来说，在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含免疫球蛋白抗原结合位点或负责配体结合的受体分子部分或负责受体结合的配体分子部分。本发明的结合多肽包含至少一个结合位点。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含至少两个结合位点。在一个实施方案中，所述结合多肽包含两个结合位点。在另一个实施方案中，所述结合多肽包含三个结合位点。在另一个实施方案中，所述结合多肽包含四个结合位点。在一个实施方案中，结合位点彼此串联连接。在其他实施方案中，结合位点位于结合多肽的不同位置，例如，位于Fc多肽Fc区的N端或C端中的一者或多者处。举例来说，在Fc区为scFc区的情况下，结合位点可连接到scFc区的N端、C端或两端。在Fc区为二聚Fc区的情况下，结合位点可连接到一或两个N端和/或一或两个C端。
如本文中所用，术语“结合结构域”、“结合位点”或“结合部分”是指结合多肽的具有例如介导与靶分子(例如抗原、配体、受体、底物或抑制剂)的特异性结合的生物活性(Fc介导的生物活性除外)的部分、区域或位点。示例性结合结构域包括生物活性蛋白质或部分、抗原结合位点、配体的受体结合结构域、受体的配体结合结构域或酶结构域。在另一个实例中，术语“结合部分”是指结合到生物系统的组分(例如，血清中或细胞表面上或细胞基质中的蛋白质)并且所述结合引起生物效应(例如，如通过活性部分和/或其结合的组分的变化(例如，活性部分和/或其结合的组分的裂解、信号传递、或者对细胞中或受试者中生物反应的增强或抑制)所测量)的生物活性分子或其部分。
如本文中所用的术语“配体结合结构域”是指天然受体(例如，细胞表面受体)或其至少保留相应天然受体的定性配体结合能力和/或至少一些(或大部分)生物活性的区域或衍生物。如本文中所用的术语“受体结合结构域”是指天然配体或其至少保留相应天然配体的定性受体结合能力和/或至少一些生物活性的区域或衍生物。在一个实施方案中，本发明的结合多肽具有至少一个对靶向以便减少或消除的分子例如细胞表面抗原或可溶性抗原具特异性的结合结构域。在一些实施方案中，结合结构域包含抗原结合位点(例如，包含置于交替框架区(例如，任选地包含一个或多个氨基酸取代的人类框架区)中的来自抗体的可变重链序列和可变轻链序列或六个CDR)或由其组成。如本文中所用，术语“结合亲和力”包括结合相互作用的强度并因此包括实际结合亲和力以及表观结合亲和力二者。实际结合亲和力是缔合速率相对于解离速率的比率。因此，赋予或优化结合亲和力包括改变这些分量中的任一者或二者以实现所需结合亲和力水平。表观亲和力可包括例如相互作用的亲合力。
如本文中所用，术语“结合自由能”或“结合的自由能”包括其业内公认的含义，并且特别是，如应用于溶剂中结合位点-配体或Fc-FcR相互作用时。结合自由能降低使亲和力增强，而结合自由能增加使亲和力降低。
术语“特异性”包括与给定靶标特异性地结合(例如，免疫反应)的潜在结合位点的数目。结合多肽可为单特异性的并且含有一个或多个特异性结合相同靶标(例如，相同表位)的结合位点，或结合多肽可为多特异性的并且含有两个或更多个特异性结合相同靶标的不同区域(例如，不同的表位)或不同靶标的结合位点。在一个实施方案中，可制造对多于一个靶分子(例如，多于一个抗原或相同抗原上的多于一个表位)具有结合特异性的多特异性结合多肽(例如，双特异性多肽)。在另一个实施方案中，多特异性结合多肽具有至少一个对靶向以便减少或消除的分子具特异性的结合结构域和至少一个对细胞上的靶分子具特异性的结合结构域。在另一个实施方案中，多特异性结合多肽具有至少一个对靶向以便减少或消除的分子具特异性的结合结构域和至少一个对药物具特异性的结合结构域。在另一个实施方案中，多特异性结合多肽具有至少一个对靶向以便减少或消除的分子具特异性的结合结构域和至少一个对前药具特异性的结合结构域。在另一个实施方案中，多特异性结合多肽是具有两个对一个靶分子具特异性的结合结构域和两个对第二靶分子具特异性的结合位点的四价抗体。
如本文中所用，术语“价”是指结合多肽或蛋白质中的潜在结合结构域数目。每个结合结构域特异性地结合一个靶分子。当结合多肽包含多于一个结合结构域时，每个结合结构域可特异性地结合相同或不同的分子(例如，可结合到不同的配体或不同的抗原，或相同抗原上的不同表位)。在一个实施方案中，本发明的结合多肽是单价的。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽是多价的。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽是二价的。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽是三价的。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽是四价的。在某些方面中，本发明的结合多肽采用多肽接头。如本文中所用，术语“多肽接头”是指连接多肽链的线性氨基酸序列中的两个结构域的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。举例来说，多肽接头可用于将结合位点连接到本发明的Fc多肽的Fc区(或Fc部分)。在一些实施方案中，这些多肽接头为多肽分子提供柔性。举例来说，在一个实施方案中，VH结构域或VL结构域融合或连接到多肽接头，并且多肽接头的N端或C端附连到Fc区(或Fc部分)的C端或N端并且多肽接头的N端附连到VH或VL结构域的N端或C端)。在某些实施方案中，多肽接头用于连接(例如，基因融合)scFc多肽的两个Fc部分或结构域。这些多肽接头在本文中也称为Fc连接多肽。如本文中所用，术语“Fc连接多肽”尤其是指连接(例如，基因融合)两个Fc部分或结构域的连接多肽。本发明的结合分子可包含多于一个肽接头。
如本文中所用，术语“适当折叠的多肽”包括构成多肽的所有功能结构域均具有独特活性的多肽(例如，本发明的结合多肽)。如本文中所用，术语“不当折叠的多肽”包括多肽的至少一个功能结构域不具活性的多肽。如本文中所用，“适当折叠的Fc多肽”或“适当折叠的Fc区”包含至少两个组分Fc部分被适当折叠，使得所得Fc区包含至少一种效应功能的Fc区(例如，scFc区)。
如本文中所用，术语“免疫球蛋白”包括具有两个重链与两个轻链的组合的多肽，无论其是否具有任何相关特异性免疫反应性。
如本文中所用，术语“抗体”是指对相关抗原(例如肿瘤相关抗原)具有显著已知特异性免疫反应活性的组装体(例如，完整抗体分子、抗体片段或其变体)。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，它们之间存在或不存在链间共价连接。相对充分理解了脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构。
如下文将更详细论述，通用术语“抗体”包括生物化学上可区分的五个不同类别的抗体。来自每个抗体类别的Fc部分显然在本发明的范围内，以下论述将大体上针对IgG类免疫球蛋白分子。关于IgG，免疫球蛋白包含两个分子量约23,000道尔顿的同一轻多肽链和两个分子量53,000-70,000的同一重链。所述四个链通过二硫键呈“Y”构型接合，其中轻链括住重链，重链起始于“Y”的开口处并且延续穿过可变域。
免疫球蛋白轻链分类为κ或λ(kappa，lambda)。每个重链类别可与κ或λ轻链结合。一般来说，轻链与重链彼此共价键结，并且当免疫球蛋白是由杂交瘤、B细胞或基因工程化宿主细胞产生时，两个重链的“尾部”部分通过共价二硫键或非共价键彼此键结。在重链中，氨基酸序列从Y构型叉形端的N端延伸到每个链底部的C端。本领域技术人员应理解，重链分类为γ、μ、α、δ或ε(gamma、mu、alpha、delta、epsilon)，其中一些具有亚类(例如，γ1-γ4)。该链的性质决定抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等受到充分表征并且已知可赋予功能专门化。鉴于本公开内容，这些类别和同种型中的每一者的修饰型式对本领域技术人员来说可容易辨别并且因此处于本发明的范围内。
轻链和重链二者都分成具有结构和功能同源性的区域。术语“区域”是指单一免疫球蛋白(如术语“Fc区”的情况)或单一抗体链的部件或部分，并且包括恒定区或可变区，以及所述结构域的更多离散部件或部分。举例来说，轻链可变域包括散布在“框架区”或“FR”间的“互补决定区”或“CDR”，如本文中所定义。免疫球蛋白的某些区域可基于在“恒定区”的情况下不同类别成员的所述区域内相对缺乏序列变异或在“可变区”的情况下不同类别成员的所述区域内存在显著变异而定义为“恒定”(C)区或“可变”(V)区。术语“恒定区”和“可变区”也可功能性地使用。就此而言，应了解免疫球蛋白或抗体的可变区决定抗原识别和特异性。相反，免疫球蛋白或抗体的恒定区赋予重要效应功能，例如分泌、经胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。不同免疫球蛋白类别的恒定区的亚单元结构和三维构型是众所周知的。
将免疫球蛋白重链和轻链的恒定区和可变区折叠至结构域中。术语“结构域”是指重链或轻链多肽的包含例如通过β折叠片和/或链内二硫键加以稳定化的肽环(例如，包含3至4个肽环)的独立折叠球形区域。免疫球蛋白轻链上的恒定区结构域可互换地称为“轻链恒定区结构域”、“CL区”或“CL结构域”。重链上的恒定结构域(例如铰链、CH1、CH2或CH3结构域)可互换地称为“重链恒定区结构域”、“CH”区结构域或“CH结构域”。轻链上的可变域可互换地称为“轻链可变区结构域”、“VL区结构域”或“VL结构域”。重链上的可变域可互换地称为“重链可变区结构域”、“VH区结构域”或“VH结构域”。
按照惯例，可变区和恒定区结构域的编号随其更远离免疫球蛋白或抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。每个重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链的N端是可变区并且在C端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。因此，轻链免疫球蛋白的结构域按VL-CL方向排列，而重链的结构域按VH-CH1-铰链-CH2-CH3方向排列。除非另外陈述，否则重链恒定区中的氨基酸位置，包括CH1、铰链、CH2和CH3结构域中的氨基酸位置在本文中根据EU索引编号系统进行编号。相反，轻链恒定区(例如CL结构域)中的氨基酸位置在本文中根据Kabat索引编号系统进行编号(参见Kabat等人,如上)。
如本文中所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变域，而术语“VL结构域”包括免疫球蛋白轻链的氨基末端可变域，根据Kabat索引编号系统。
如本文中所用，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的例如从约EU第118位延伸至第215位的第一(最氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻，并且氨基末端与免疫球蛋白重链分子的铰链区相邻，并且不形成免疫球蛋白重链Fc区的一部分。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含来源于免疫球蛋白重链分子(例如人类IgG1或IgG4分子)的CH1结构域。
如本文中所用，术语“铰链区”包括将CH1结构域接合至CH2结构域的重链分子部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因而允许两个N端抗原结合区独立地移动。铰链区可再分为三个不同的结构域：上铰链结构域、中铰链结构域和下铰链结构域(Roux等人,J.Immunol.1998,161:4083)。
如本文中所用，术语“CH2结构域”包括例如从约EU第231位延伸至第340位的重链免疫球蛋白分子部分。CH2结构域的独特之处在于其不与另一结构域紧密配对。相反，两个N连接的分支碳水化合物链插入在完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含来源于IgG1分子(例如人类IgG1分子)的CH2结构域。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含来源于IgG4分子(例如人类IgG4分子)的CH2结构域。在一个示例性实施方案中，本发明的多肽包含CH2结构域(EU第231-340位)或其部分。
如本文中所用，术语“CH3结构域”包括从CH2结构域的N端延伸约110个残基，例如从约第341位至第446b位(EU编号系统)的重链免疫球蛋白分子部分。额外赖氨酸残基(K)有时存在于CH3结构域的极C端，但通常从成熟抗体裂解。CH3结构域通常形成抗体的C端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，额外结构域可从CH3结构域延伸以形成分子的C端部分(例如IgM的μ链和IgE的ε链中的CH4结构域)。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含来源于IgG1分子(例如人类IgG1分子)的CH3结构域。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含来源于IgG4分子(例如人类IgG4分子)的CH3结构域。
如本文中所用，术语“CL结构域”包括免疫球蛋白轻链的例如从约Kabat第107A位延伸至第216位的第一(最氨基末端)恒定区结构域。CL结构域与VL结构域相邻。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含来源于κ轻链(例如人类κ轻链)的CL结构域。
如以上所指示，抗体的可变区允许其选择性地识别并因而特异性地结合到抗原上的表位。特异性地结合到靶标的抗体可称为靶结合抗体(例如，α4结合抗体是特异性地结合到α4的抗体)。“特异性地结合”意指抗体(或其可变区)特异性地结合到其靶标(例如，α4整合素上的表位)，其中平衡解离常数(KD)小于约5×10-5(即50uM)、或小于约1×10-5(即10uM)、或小于约5×10-6(即5uM)、或小于约1×10-6(即1uM)、或小于约5×10-7(即500nM)、或小于约1×10-7(即100nM)、或小于约5×10-8(即50nM)、或小于约1×10-8(即10nM)、或小于约5×10-9(即5nM)、或小于约1×10-9(即1nM)、或小于约5×10-10(即500pM)、或小于约1×10-10(即100pM)、或小于约5×10-11(50pM)、或小于约1×10-11(10pM)、或小于约5×10-12(5pM)、或小于约1×10-12(1pm)、或小于约5×10-13(500fM)、或小于约1×10-13(100fM)、或小于约5×10-14(50fM)、或小于约1×10-14(10fM)、或小于约5×10-15(5fM)、或小于约1×10-15(1fM)。也就是说，抗体的VL结构域与VH结构域组合以形成限定三维抗原结合位点的可变区(Fv)。该四级抗体结构形成存在于Y各臂末端的抗原结合位点。更具体来说，抗原结合位点由各重链和轻链可变区上的三个互补决定区(CDR)限定。
如本文中所用，术语“抗原结合位点”包括与抗原(例如细胞表面或可溶性抗原)特异性地结合(免疫反应)的位点。在一个实施方案中，结合位点包括免疫球蛋白重链和轻链可变区，并且由这些可变区形成的结合位点决定抗体的特异性。抗原结合位点由因多肽而各异的可变区形成。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有抗体分子(例如，其序列是本领域中已知的或本文中所描述的)的至少一个重链或轻链CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有来自抗体分子的六个CDR的抗原结合位点。包含至少一个可包括在主题结合多肽中的CDR的示例性抗体分子是本领域中已知的，并且示例性分子描述于本文中。
如本文中所用，术语“CDR”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽二者的可变区内发现的非连续抗原组合位点。以下文献已描述这些特定区域：Kabat等人,J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等人,Sequences of protein ofimmunological interest.(1991)；以及Chothia等人,J.MoI.Biol.196:901-917(1987)和MacCallum等人,J.MoI.Biol.262:732-745(1996)，其中所述定义包括当与彼此比较时的氨基酸残基重叠或子集。显示涵盖如由以上引用的各参考文献所定义的CDR的氨基酸残基用于比较。在一些实施方案中，术语“CDR”是如Kabat基于序列比较所定义的CDR。
Figure GDA0003031568410000491
Figure GDA0003031568410000501
1残基编号遵循Kabat等人,同上的命名法。
2残基编号遵循Chothia等人,同上的命名法
3残基编号遵循MacCallum等人,同上的命名法
如本文中所用的术语“框架区”或“FR区”包括作为可变区的一部分但并非CDR的一部分的氨基酸残基(例如，使用CDR的Kabat定义)。因此，可变区框架的长度在约100-120个氨基酸之间，但仅包括在CDR外部的那些氨基酸。关于重链可变区的特定实例并且关于如Kabat等人所定义的CDR，框架区1对应于涵盖氨基酸1-30的可变区结构域；框架区2对应于涵盖氨基酸36-49的可变区结构域；框架区3对应于涵盖氨基酸66-94的可变区结构域，并且框架区4对应于从氨基酸103至可变区末端的可变区结构域。轻链的框架区类似地由各轻链可变区CDR隔开。类似地，使用Chothia等人或McCallum等人的CDR定义时，框架区边界由个别CDR末端隔开，如以上所描述。在一些实施方案中，CDR如Kabat所定义。
在天然存在的抗体中，各单体抗体上存在的六个CDR是短的非连续氨基酸序列，其被特异性地定位以便在抗体于水性环境中呈现其三维构型时形成抗原结合位点。重链和轻链可变域的其余部分在氨基酸序列中显示较低分子间变异性并且称为框架区。框架区主要采用β-折叠构象，并且CDR形成连接β-折叠结构并且在一些情况下形成其一部分的环。因而，这些框架区起形成支架作用，所述支架提供通过链间非共价相互作用将六个CDR定位于正确取向。由经定位的CDR形成的抗原结合位点定义与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与免疫反应性表位的非共价结合。本领域的普通技术人员可容易地鉴定CDR的位置。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽包含至少两个抗原结合结构域(例如，在相同结合多肽内(例如，在单一多肽的N端和C端)或连接到本发明的多聚结合蛋白质的各组分结合多肽)，从而提供结合多肽与所选抗原的缔合。抗原结合结构域不需要来源于相同免疫球蛋白分子。就此而言，可变区可能或可能并非来源于任何类型的可被诱导以建立体液反应并且产生针对所需抗原的免疫球蛋白的动物。因而，可变区可为例如哺乳动物来源，例如，可为人类、鼠类、非人类灵长动物(例如食蟹猴、猕猴等)、狼、骆驼科动物(例如，来自骆驼、美洲驼和相关物种)。
术语“抗体变体”或“被修饰的抗体”包括自然界中不存在并且氨基酸序列或氨基酸侧链化学性质相对于天然来源的抗体的氨基酸序列或氨基酸侧链化学性质相差至少一个如本文中所描述的氨基酸或氨基酸修饰的抗体。如本文中所用，术语“抗体变体”包括经改变以使其不为天然存在形式的合成抗体形式，例如，包含至少两个重链部分而非两个完整重链的抗体(例如，结构域缺失抗体或迷你抗体)；经改变以结合到两个或更多个不同的抗原或单一抗原上的不同表位的多特异抗体形式(例如，双特异性、三特异性等))；与scFv分子接合的重链分子；单链抗体；双功能抗体；三功能抗体；和具有改变的效应功能的抗体等。
如本文中所用，术语“scFv分子”包括由一个轻链可变域(VL)或其部分和一个重链可变域(VH)或其部分组成的结合分子，其中每个可变域(或其部分)来源于相同或不同的抗体。scFv分子可包含插入在VH结构域与VL结构域之间的scFv接头。ScFv分子在本领域中是已知的并且描述于例如以下文献中：美国专利5,892,019；Ho等人,1989.Gene 77:51；Bird等人,1988Science 242:423；Pantoliano等人,1991.Biochemistry 30:10117；Milenic等人,1991.Cancer Research 51:6363；Takkinen等人,1991.Protein Engineering 4:837。
如本文中所用的“scFv接头”是指插入在scFv的VL与VH结构域之间的部分。在一些实施方案中，scFv接头可维持scFv分子呈抗原结合构象。在一个实施方案中，scFv接头包含scFv接头肽或由其组成。在某些实施方案中，scFv接头肽包含gly-ser多肽接头或由其组成。在其他实施方案中，scFv接头包含二硫键。
如本文中所用，术语“gly-ser多肽接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性gly/ser多肽接头包含氨基酸序列(Gly4Ser)n。在一个实施方案中，n＝1。在一个实施方案中，n＝2。在另一个实施方案中，n＝3，即(Gly4Ser)3。在另一个实施方案中，n＝4，即(Gly4Ser)4。
在另一个实施方案中，n＝5。在另一个实施方案中，n＝6。在另一个实施方案中，n＝7。在另一个实施方案中，n＝8。在另一个实施方案中，n＝9。在另一个实施方案中，n＝10。另一个示例性gly/ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在一个实施方案中，n＝1。在一个实施方案中，n＝2。在某一实施方案中，n＝3。在另一个实施方案中，n＝4。
在另一个实施方案中，n＝5。在另一个实施方案中，n＝6。
如本文中所用，术语“天然半胱氨酸”应是指天然存在于多肽的特定氨基酸位置并且未经人工修饰、引入或改变的半胱氨酸氨基酸。术语“工程化半胱氨酸残基或其类似物”或“工程化半胱氨酸或其类似物”应是指非天然半胱氨酸残基或半胱氨酸类似物(例如含硫醇的类似物，例如噻唑啉-4-甲酸和噻唑烷-4-甲酸(硫代脯氨酸，Th))，其是通过合成手段(例如通过重组技术、体外肽合成、通过对肽进行酶促或化学偶联或者这些技术的某种组合)而引入多肽的氨基酸位置，所述位置在天然情况下不含半胱氨酸残基或其类似物。
如本文中所用，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与第二硫醇基形成二硫键或二硫桥的硫醇基。在大部分天然存在的IgG分子中，CH1和CL区由天然二硫键连接，并且两个重链在使用Kabat编号系统时在对应于239和242的位置(EU编号系统的第226位或第229位)由两个天然二硫键连接。
如本文中所用，术语“键结半胱氨酸”应是指多肽内与相同或不同多肽内所存在的第二天然或工程化半胱氨酸或者其他残基形成二硫键或其他共价键的天然或工程化半胱氨酸残基。“链内键结半胱氨酸”应是指共价键结至相同多肽内所存在的第二半胱氨酸的键结半胱氨酸(即，链内二硫键)。“链间键结半胱氨酸”应是指共价键结至不同多肽内所存在的第二半胱氨酸的键结半胱氨酸(即，链间二硫键)。
如本文中所用，术语“游离半胱氨酸”是指多肽序列内以基本上还原形式存在的天然或工程化半胱氨酸氨基酸残基(和其类似物或模拟物，例如噻唑啉-4-甲酸和噻唑烷-4-甲酸(硫代脯氨酸，Th))。在一些实施方案中，游离半胱氨酸能够用本发明的效应部分加以修饰。
术语“硫醇修饰试剂”应是指能够选择性地与结合多肽中(例如，结合多肽的多肽接头内)的工程化半胱氨酸残基或其类似物的硫醇基团反应并且从而提供对结合多肽进行效应部分的位点特异性化学添加或交联，由此形成被修饰的结合多肽的手段的化学试剂。在一些实施方案中，硫醇修饰试剂利用游离半胱氨酸残基中所存在的硫醇或巯基官能团。示例性硫醇修饰试剂包括马来酰亚胺、烷基和芳基卤化物、α-卤代酰基和吡啶基二硫化物。
术语“功能部分”包括在一些实施方案中添加理想功能至结合多肽的部分。在一些实施方案中，在不显著改变多肽的固有理想活性，例如所述分子的抗原结合活性的情况下添加功能。本发明的结合多肽可包含一个或多个可能相同或不同的功能部分。可用功能部分的实例包括但不限于效应部分、亲和部分和阻断部分。示例性阻断部分包括具有足以降低糖基化(例如通过阻断糖苷酶使多肽糖基化的能力)的空间体积和/或电荷的部分。阻断部分可另外地或可替代地降低效应功能，例如，通过抑制Fc区结合受体或补体蛋白质的能力。非限制性阻断部分包括半胱氨酸加合物、半胱氨酸、混合二硫化物加合物和PEG部分。示例性可检测部分包括荧光部分、放射性同位素部分、不透射线部分等。关于化学部分的缀合，术语“连接部分”包括能够将功能部分连接到结合多肽的其余部分的部分。可选择连接部分以使其可裂解或不可裂解。不可裂解的连接部分一般具有高系统稳定性，但还可能具有不利的药物动力学性质。
术语“间隔部分”是设计用于向分子中引入间隔的非蛋白质部分。在一个实施方案中，间隔部分可为具有0至100个选自碳、氧、氮、硫等的原子的任选被取代的链。在一个实施方案中，选择间隔部分以使其为水溶性的。在另一个实施方案中，间隔部分是聚烷二醇，例如聚乙二醇或聚丙二醇。
术语“PEG化部分”或“PEG部分”包括聚烷二醇化合物或其衍生物，存在或不存在偶联剂或者用偶联或活化部分(例如用硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯、环氧乙烷或用马来酰亚胺部分，例如PEG-马来酰亚胺)进行衍生化。其他适当聚烷二醇化合物包括马来酰亚胺基单甲氧基PEG、活化PEG聚丙二醇，以及以下类型的带电或中性聚合物：聚葡萄糖、聚唾液酸或其他基于碳水化合物的聚合物、氨基酸聚合物和生物素衍生物。如本文中所用，术语“效应部分”(E)可包含具有生物学或其他功能活性的诊断和治疗剂(例如蛋白质、核酸、脂质、药物部分和其片段)。举例来说，包含与结合多肽缀合的效应部分的结合多肽与未缀合的多肽相比具有至少一种额外功能或性质。举例来说，细胞毒性药物部分(例如，效应部分)与结合多肽(例如，经由其多肽接头)缀合导致形成具有药物细胞毒性作为第二功能(即，除抗原结合以外)的被修饰多肽。在另一个实例中，第二结合多肽与第一结合多肽缀合可赋予额外结合性质。在一个方面，其中效应部分是基因编码的治疗或诊断蛋白质或核酸，可通过本领域中众所周知的肽合成或重组DNA方法来合成或表达效应部分。在另一方面，其中效应因子是非基因编码的肽或药物部分，效应部分可人工合成或从天然来源纯化。
如本文中所用，术语“药物部分”包括抗炎剂、抗癌剂、抗感染剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生物剂、抗病毒剂等)和麻醉治疗剂。在另一个实施方案中，药物部分是抗癌剂或细胞毒性剂。相容的药物部分还可包含前药。
如本文中所用，术语“前药”是指医药活性剂的前体或衍生物形式，其与母体药物相比具有较低活性、反应性或副作用倾向性并且能够在体内酶促活化或以其他方式转化为更具活性的形式。与本发明相容的前药包括但不限于可转化为更具活性的无细胞毒性药物的含磷酸盐的前药、含氨基酸的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、含β-内酰胺的前药、含任选被取代的苯氧基乙酰胺的前药或含任选被取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿苷前药。本领域技术人员可对所需药物部分或其前药进行化学修饰，以使所述化合物的反应更适宜用于制备本发明的被修饰结合蛋白质的目的。药物部分还包括本文中所描述的药物部分的衍生物、药学上可接受的盐、酯、酰胺和醚。
“亲和树脂”是能够以高亲和力结合亲和结构域从而有助于分离结合到亲和结构域的蛋白质与反应混合物的其他组分的化学表面。亲和树脂可涂覆在固体载体或其部分的表面上。或者，亲和树脂可包含固体载体。所述固体载体可包括被适当改性的色谱柱、微量滴定板、珠粒或生物芯片(例如玻璃晶片)。示例性亲和树脂由镍、几丁质、淀粉酶等组成。术语“载体”或“表达载体”在本文中用于意指根据本发明用作供在细胞中引入并表达所需多聚核苷酸用的媒介物的载体。如本领域技术人员已知，这些载体可容易地选自由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组。一般来说，与本发明相容的载体将包含选择标志物、适当限制位点以有助于克隆所需基因以及进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。
本领域的普通技术人员应理解，如果编码本文中所描述的抗体(或其片段或链)的多聚核苷酸(例如，DNA序列)包含在也包括调控元件(例如启动子、增强子和/或聚A尾)的表达载体内，则所述多聚核苷酸将在已引入所述载体的宿主细胞中表达为蛋白质。因而，这种插入表达载体中的多聚核苷酸可称为“被定位以表达”于载体中并且因而表达于引入所述载体的宿主细胞中。然而，多聚核苷酸(例如，DNA序列)不需要插入表达载体中以便被定位以表达于宿主细胞中。众所周知的用于使多聚核苷酸被定位以表达于细胞中的方法是已知的。举例来说，可使用例如同源重组将DNA序列插入宿主细胞的基因组中，使得所插入的DNA序列的表达受宿主细胞的内源启动子和其他调控元件调控。这些同源重组技术是众所周知的。
出于本发明的目的，可使用众多表达载体系统。举例来说，一类载体利用来源于动物病毒，例如牛乳头瘤病毒、多形瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其他载体涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。示例性载体包括美国专利第6,159,730号和第6,413,777号以及美国专利申请第2003 0157641 Al号中所描述的那些载体。另外，可通过引入一个或多个标志物从而允许选择经转染的宿主细胞来选择已将DNA整合至其染色体中的细胞。标志物可向营养缺陷型宿主提供原营养、杀生物剂(例如抗生素)抗性或对重金属如铜的抗性。可选择标志物基因可直接连接到要表达的DNA序列，或通过共转化引入相同细胞中。在一个实施方案中，可采用诱导型表达系统。还可能需要额外元件来进行mRNA的最佳合成。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。在一个实施方案中，可将分泌信号，例如若干充分表征的细菌前导肽(例如，pelB、phoA或ompA)中的任一种同框融合至本发明多肽的N端以获得所述多肽的最佳分泌。(Lei等人,(1988),Nature,331:543；Better等人,(1988)Science,240:1041；Mullinax等人,(1990).PNAS,87:8095)。
术语“宿主细胞”是指已用使用重组DNA技术构建并且编码至少一个异源基因的载体转化的细胞。在从重组宿主分离蛋白质的方法的描述中，除非另外明确说明，否则术语“细胞”和“细胞培养物”可互换用于表示蛋白质的来源。换句话说，从“细胞”回收蛋白质可能意指从经低速离心的全细胞或从含有培养基和悬浮细胞二者的细胞培养物回收。用于蛋白质表达的宿主细胞系具有例如哺乳动物来源。认为本领域技术人员能够优先确定最适于在其中表达所需基因产物的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXBII(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR-)、HELA(人类宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40 T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠纤维母细胞)、BALBC/3T3(小鼠纤维母细胞)、HAK(仓鼠肾脏细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-IcIBPT(牛内皮细胞系)、RAJI(人类淋巴细胞)和293(人类肾)。CHO细胞(以及其变体，包括缺乏DHFR活性的CHO-K1细胞)是适用的宿主细胞。宿主细胞系通常可得自商业服务、美国组织培养物保藏中心或已公开的文献。本发明的多肽还可表达于非哺乳动物细胞，例如细菌或酵母或植物细胞中。就此而言，应了解，还可对各种单细胞非哺乳动物微生物例如细菌进行转化；即，能够在培养物中生长或发酵的那些单细胞非哺乳动物微生物。易于转化的细菌包括肠杆菌科的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌属(Salmonella)菌株；芽孢杆菌属(Bacillaceae)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌属(Pneumococcus)；链球菌属(Streptococcus)；和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。应进一步了解，当表达于细菌中时，多肽通常变成包涵体的一部分。必须分离所述多肽，加以纯化，随后组装成功能分子。
除原核生物以外，还可使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通烘焙用酵母是最常用的真核微生物，但通常可利用许多其他菌株，包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。为了表达于酵母中，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等人,(1979),Nature,282:39；Kingsman等人,(1979),Gene,7:141；Tschemper等人,(1980),Gene,10:157)。这种质粒已含有TRP1基因，其为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株例如ATCC第44076号或PEP4-1提供选择标志物(Jones,(1977),Genetics,85:12)。作为酵母宿主细胞基因组的特征的存在trp1病变则对于通过在不存在色氨酸的情况下生长来检测转化提供了有效环境。
体外产生允许按比例放大以产生大量所需被改变的本发明结合多肽。在组织培养条件下进行哺乳动物细胞培养的技术在本领域中是已知的，并且包括均质悬浮液培养，例如在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中，或者固定或包埋型细胞培养，例如在中空纤维中、微胶囊中、琼脂糖微珠粒上或陶瓷滤筒中。如果有必要和/或需要，可通过常规色谱方法，例如凝胶过滤、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱(HIC)、DEAE-纤维素上色谱或亲和色谱来纯化多肽溶液。
如本文中所用，短语“将受益于施用结合多肽的受试者”包括将受益于施用所用结合多肽以用于例如检测本发明的结合多肽所识别并特异性地结合的抗原(例如，用于诊断程序)和/或受益于用结合多肽进行处理以减少或消除所述结合多肽所识别并特异性地结合的靶标的受试者，例如哺乳动物受试者。举例来说，在一个实施方案中，受试者可受益于从循环或血清中减少或消除可溶性或颗粒状分子(例如毒素或病原体)或受益于减少或消除表达靶标的细胞群体(例如，肿瘤细胞)。如以上所论述，结合多肽可呈未缀合形式使用，或者可缀合到例如药物、前药或同位素，以形成被修饰的结合多肽以供施用于所述受试者。
术语“聚乙二醇化”、“聚乙二醇”或“PEG”包括聚烷二醇化合物或其衍生物，存在或不存在偶联剂或者用偶联或活化部分(例如用硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯、氮丙啶、环氧乙烷或用马来酰亚胺部分，例如PEG-马来酰亚胺)进行衍生化。其他适当的聚烷二醇化合物包括但不限于马来酰亚氨基单甲氧基PEG、活化PEG聚丙二醇，以及以下类型的带电或中性聚合物：聚葡萄糖、聚唾液酸或其他基于碳水化合物的聚合物、氨基酸聚合物和生物素衍生物。
I.可变区
本发明提供α4结合抗体和其片段，其中可变轻链(VL)和可变重链(VH)框架具有由种系或种系工程化抗体序列，例如IGKV4-1或geAAH70335.1或IGHV1-f抗体构建的受体序列。CDR序列来源于非人类抗α4结合抗体，例如抗VLA-4抗体HP1/2。参见PCT公开第WO2011/130603号，其通过引用整体并入本文。本文中所描述的抗体可具有至少1.5、2.0、2.5、3.0倍的亲和力增加，例如相对于其鼠类亲本。在一个实施方案中，所述亲和力增加是至少1.5、2.0、2.5、3.0倍，但分别低于25、20或15倍。
鼠类单克隆抗体(mAb)HP1/2是α4mAb的B1亚类的成员，并且抑制体外细胞粘附至VCAM1和纤维连接蛋白，效能为约0.1nM。HP1/2Fab的cryo-EM结构解析为与α4β1细胞外域的复合物。HP1/2结合到配体结合沟外的α4β螺桨结构域并且非竞争性地拮抗配体结合。由HP1/2识别并特异性地结合的α4整合素的表位和构象与在那他珠单抗α4整合素晶体结构中观测到的表位和构象相似。
针对α4整合素的mAb是淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞渗出至组织中的有效阻断剂并且在体内显示疾病缓解作用。特别是，已证明mAb HP1/2在绵羊过敏性过度反应性(Lobb等人,Ann.N.Y.Acad.Sci 796:113-123,1996)、豚鼠支气管气道过度反应性(Pretolani等人,J.Ex.Med.180(3):795-805,1994；Kraneveld等人,J.AllergyClin.Immunol.100(2):242-50,1997)、灵长类动物的溃疡性结肠炎(Podolsky等人,J.ClinInvest.92(1):372-380,1993)、NHP动脉内切除后膜颈动脉内膜增生(Lumsden等人,J.Vasc.Surg.26(1):87-93,1997)的动物模型中有效，减少气球损伤后的新外膜形成和后续管腔狭窄(Labinaz等人,Can J.Cardiol.16(2):187-96,2000)、兔中支架植入的炎性反应(Ma等人,2004)，并预防兔中的心脏移植物排斥反应(Sadahiro等人,Am.J.Pathol.142(3):675-683,1993)。另外，HP1/2刺激来自狒狒骨髓基质的造血祖细胞的外周化(Papayannopoulou和Nakamoto,Proc.Natl.Acad.Sci 90(20):9374-9378,1993)。
在注射JM(不成熟T细胞白血病)细胞系的Balb/c小鼠中产生HP1/2抗体(Sanchez-Madrid等人,Eur.J.Immunol.16:1343-1349,1986)。将来自两只小鼠的脾细胞与SP2或P3-X63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞融合。所述抗体于1993年人源化，但随后于2010年重新人源化以利用人源化设计进步的优势。
α4结合抗体或其片段可包含具有SEQ ID NO:8、9、10或11的序列的可变轻链。α4结合抗体或其片段可包含SEQ ID NO:3、4或5的可变重链。
在某些实施方案中，所述α4结合抗体包含具有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链和具有SEQ ID NO:4的序列的可变重链。
所述α4结合抗体还可包含如本文中更详细论述的变异Fc区。
II.亲本Fc多肽
变异Fc多肽可来源于本领域中已知的亲本或起始Fc多肽。在一个实施方案中，亲本Fc多肽是抗体，例如IgG免疫球蛋白，其包括IgG的所有亚型和其组合。在一些实施方案中，IgG抗体的亲本Fc多肽属于IgG亚型，或者两种或更多种IgG亚型的Fc区的不同部分的组合。在人类中，IgG亚型包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。亲本Fc多肽包含来源于免疫球蛋白的Fc区，但可任选地还包含可操作地连接或融合至Fc区的结合位点。在一些实施方案中，前述多肽结合到例如配体、细胞因子、受体、细胞表面抗原或癌细胞抗原的抗原。尽管本文中的实例采用IgG抗体，但应理解所述方法可同样应用于任何Fc多肽内的Fc区。当Fc多肽是抗体时，所述抗体可为合成的、天然来源的(例如，来自血清)，由细胞系(例如，杂交瘤)产生，或在转基因生物中产生。
在某些实施方案中，本发明的Fc多肽包含Fc区的单一Fc部分。在其他实施方案中，Fc多肽是dcFc多肽。dcFc多肽是指包含二聚Fc(或dcFc)区的多肽。在其他实施方案中，本发明的Fc多肽是scFc多肽。如本文中所用，术语scFc多肽是指包含单链Fc(scFc)区的多肽，例如，包含例如经由插入在至少两个Fc部分之间的柔性多肽接头而基因融合的至少两个Fc部分的scFc多肽。示例性scFc区公开于2008年5月14日提交的PCT申请第PCT/US2008/006260号中，所述PCT申请通过引用并入本文。
在某些实施方案中，本发明的多肽可包含含有具有相同或基本上相同的序列组成的Fc部分的Fc区(本文中称为“同聚Fc区”)。在其他实施方案中，本发明的多肽可包含含有至少两个具有不同的序列组成的Fc部分的Fc区(即，本文中称为“异聚Fc区”)。在某些实施方案中，本发明的结合多肽包含含有至少一个插入或氨基酸取代的Fc区。在一个示例性实施方案中，异聚Fc区在第一Fc部分中而非在第二Fc部分中包含氨基酸取代。
在一个实施方案中，本发明的结合多肽可包含有两个或更多个组成Fc部分独立地选自本文中所描述的Fc部分的Fc区。在一个实施方案中，Fc部分是相同的。在另一个实施方案中，至少两个Fc部分是不同的。举例来说，本发明的Fc多肽的Fc部分包含相同数目的氨基酸残基，或者其长度可相差一个或多个氨基酸残基(例如，约5个氨基酸残基(例如1、2、3、4或5个氨基酸残基)、约10个残基、约15个残基、约20个残基、约30个残基、约40个残基或约50个残基)。在其他实施方案中，Fc部分可在一个或多个氨基酸位置处在序列方面不同。举例来说，至少两个Fc部分可在约5个氨基酸位置(例如，1、2、3、4或5个氨基酸位置)、约10个位置、约15个位置、约20个位置、约30个位置、约40个位置或约50个位置)上不同。
亲本Fc多肽可组装在一起或与其他多肽一起形成多聚Fc多肽或蛋白质(本文中也称为“多聚体”)。本发明的多聚Fc多肽或蛋白质包含至少一个本发明的亲本Fc多肽。因此，亲本多肽包括但不限于单体以及多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体和六聚体)Fc多肽或蛋白质等。在某些实施方案中，所述多聚体的组成Fc多肽是相同的(即，同聚多聚体，例如同二聚体、同三聚体、同四聚体)。在其他实施方案中，本发明的多聚蛋白质的至少两个组成Fc多肽是不同的(即异聚多聚体，例如异二聚体、异三聚体、异四聚体)。在某些实施方案中，至少两个Fc多肽能够形成二聚体。
在另一个实施方案中，本发明的Fc多肽包含二聚Fc区(形成二聚体的单链多肽或形成二聚体的双链多肽)并且就所述分子中存在的生物活性部分来说是单体。举例来说，这种Fc构建体可包含仅一个生物活性部分。一个或两个链稳定化Fc单体构建体是理想的，例如，当不需要靶分子交联时(例如，在某些抗体，例如抗CD40抗体的情况下)。在另一个实施方案中，这种Fc构建体可包含两个不同的生物活性部分。在另一个实施方案中，这种Fc构建体可包含两个相同的生物活性部分。在另一个实施方案中，这种Fc构建体可包含超过两个相同的生物活性部分。
A.Fc部分
适用于产生本发明的亲本Fc多肽的Fc部分可获自许多不同的来源。在一些实施方案中，结合多肽的Fc部分来源于人类免疫球蛋白。然而，应理解，Fc部分可来源于另一哺乳动物物种，包括例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人类灵长类动物(例如黑猩猩、猕猴)物种的免疫球蛋白。此外，Fc可来源于任何免疫球蛋白类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何免疫球蛋白同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。举例来说，Fc可来自于IgG1，但在序列中具有特定突变。在一些实施方案中，使用人类同种型IgG1或IgG4。在一些实施方案中，Fc可为含有取自一种Ig免疫球蛋白类型的部分(例如来自IgG1的CH3结构域)和来自另一Ig免疫球蛋白类型的其他部分(例如来自IgG4的CH1结构域)的嵌合体。
多种Fc部分基因序列(例如人类恒定区基因序列)可呈公开可存取寄存物的形式获得。包含Fc部分序列的恒定区结构域可选择为具有特定效应功能(或缺乏特定效应功能)或具有特定修饰以降低免疫原性。已公布许多抗体和抗体编码基因的序列，并且可使用本领域公认的技术由合适的Fc部分序列(例如铰链、CH2和/或CH3序列或其部分)获得这些序列。随后可改变或合成使用上述方法中的任一种获得的基因物质以获得本发明的Fc多肽。应进一步了解，本发明的范围涵盖恒定区DNA序列的等位基因、变体和突变。
可例如使用聚合酶链式反应和选择用于扩增相关结构域的引物来克隆Fc部分序列。为了从抗体克隆Fc部分序列，可从杂交瘤、脾脏或淋巴细胞分离mRNA，逆转录成DNA，并且通过PCR扩增抗体基因。PCR扩增方法详细描述于以下：美国专利第4,683,195号；第4,683,202号；第4,800,159号；第4,965,188号；和例如“PCR Protocols:A Guide to Methodsand Applications”Innis等人编,Academic Press,San Diego,CA(1990)；Ho等人,1989.Gene 77:51；Horton等人,1993.Methods Enzymol.217:270)。可通过共有恒定区引物或通过基于公布的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更具特异性引物来引发PCR。如以上所论述，PCR还可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，可通过共有引物或较大同源探针(例如小鼠恒定区探针)对文库进行筛选。许多适用于扩增抗体基因的引物集在本领域中是已知的(例如，基于经纯化抗体的N端序列的5'引物(Benhar和Pastan.1994.Protein Engineering 7:1509)；cDNA末端的快速扩增(Ruberti,F.等人,1994.J.Immunol.Methods 173:33)；抗体前导序列(Larrick等人,1989Biochem.Biophys.Res.Commun.160:1250)。抗体序列的克隆进一步描述于Newman等人于1995年1月25日提交的美国专利第5,658,570号中，所述专利通过引用并入本文。
本发明的亲本Fc多肽可包含单一Fc部分或多个Fc部分。当存在两个或更多个Fc部分(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个Fc部分)时，至少两个Fc部分缔合以形成适当折叠的Fc区(例如，二聚Fc区或单链Fc区(scFc))。在一个实施方案中，Fc部分可属于不同的类型。在一个实施方案中，亲本Fc多肽中所存在的至少一个Fc部分包含铰链结构域或其部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分，所述Fc部分包含至少一个CH2结构域或其部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分，所述Fc部分包含至少一个CH3结构域或其部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分，所述Fc部分包含至少一个CH4结构域或其部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分，所述Fc部分包含至少一个铰链结构域或其部分和至少一个CH2结构域或其部分(例如，呈铰链-CH2取向)。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分，所述Fc部分包含至少一个CH2结构域或其部分和至少一个CH3结构域或其部分(例如，呈CH2-CH3取向)。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分，所述Fc部分包含至少一个铰链结构域或其部分、至少一个CH2结构域或其部分和至少一个CH3结构域或其部分，例如呈铰链-CH2-CH3、铰链-CH3-CH2或CH2-CH3-铰链取向。
在某些实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个来源于一个或多个免疫球蛋白重链的完整Fc区(例如，包括铰链、CH2和CH3结构域的Fc部分，但这些结构域不必来源于相同抗体)。在其他实施方案中，亲本Fc多肽包含至少两个来源于一个或多个免疫球蛋白重链的完整Fc区。在一些实施方案中，完整Fc部分来源于人类IgG免疫球蛋白重链(例如人类IgG1或人类IgG4)。
在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分，所述Fc部分包含完整CH3结构域(根据EU编号，抗体Fc区的约氨基酸341-438)。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分，所述Fc部分包含完整CH2结构域(根据EU编号，抗体Fc区的约氨基酸231-340)。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分，所述Fc部分至少包含CH3结构域，和至少一个铰链区(根据EU编号，抗体Fc区的约氨基酸216-230)，和CH2结构域。在一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分，所述Fc部分包含铰链和CH3结构域。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分，所述Fc部分包含铰链、CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，Fc部分来源于人类IgG免疫球蛋白重链。
组成Fc部分的恒定区结构域或其部分可来源于不同的免疫球蛋白分子。举例来说，亲本Fc多肽可包含来源于IgG4分子的铰链和/或CH2结构域或其部分以及来源于IgG1分子的CH3区或其部分。在另一个实施方案中，亲本Fc多肽可包含嵌合铰链结构域。举例来说，嵌合铰链可包含部分来源于IgG1分子并且部分来源于IgG3分子的铰链结构域。在另一个实施方案中，嵌合铰链包含来自IgG1分子的中铰链结构域以及来自IgG4分子的上和下铰链结构域。
如本文中所阐述，本领域的普通技术人员应理解，亲本Fc部分可与天然存在的免疫球蛋白的相应Fc部分同一，或者可经改变以使其氨基酸序列发生变化。在某些实施方案中，例如通过氨基酸突变(例如，添加、缺失或取代)来改变亲本Fc多肽。举例来说，亲本Fc多肽可为与Fc部分所来源的野生型Fc相比具有至少一个氨基酸取代的Fc部分。举例来说，其中Fc部分来源于人类IgG1抗体，与人类IgG1Fc区的相应位置的野生型氨基酸相比，变体包含至少一个氨基酸突变(例如，取代)。
一个或多个氨基酸取代可位于Fc部分内称为“对应”于抗体Fc区中将给与所述残基的位置编号的位置上(如使用EU编号惯例所阐述)。本领域技术人员可容易地产生比对以确定将“对应”于Fc部分中的位置的EU编号。
在一个实施方案中，取代处在位于铰链结构域或其部分中的氨基酸位置上。在另一个实施方案中，取代处在位于CH2结构域或其部分中的氨基酸位置上。在另一个实施方案中，取代处在位于CH3结构域或其部分中的氨基酸位置上。在另一个实施方案中，取代处在位于CH4结构域或其部分中的氨基酸位置上。
在某些实施方案中，亲本Fc多肽包含多于一个氨基酸取代。亲本Fc多肽相对于野生型Fc区可包含例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代经空间定位而彼此相距至少1个或更多个氨基酸位置，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸位置的间隔。在一些实施方案中，工程化氨基酸经空间定位而彼此相隔至少5、10、15、20或25个或更多个氨基酸位置的间隔。
在某些实施方案中，所述取代改变包含野生型Fc部分的Fc区所赋予的至少一种效应功能(例如，降低Fc区结合到Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或补体蛋白(例如C1q)或者触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、吞噬作用或补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力)。
亲本Fc多肽可采用业内公认的已知可改变效应功能的取代。具体来说，本发明的亲本Fc多肽可包括例如以下文献中所公开的一个或多个氨基酸位置上的变化(例如取代)：国际PCT公开WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2和WO06/085967A2；美国专利公开第US2007/0231329号、第US2007/0231329号、第US2007/0237765号、第US2007/0237766号、第US2007/0237767号、第US2007/0243188号、第US20070248603号、第US20070286859号、第US20080057056号；或美国专利5,648,260、5,739,277、5,834,250、5,869,046、6,096,871、6,121,022、6,194,551、6,242,195、6,277,375、6,528,624、6,538,124、6,737,056、6,821,505、6,998,253、7,083,784和7,317,091，各文献中关于Fc突变的部分通过引用并入本文。在一个实施方案中，可在一个或多个所公开的氨基酸位置上进行特定变化(例如，本领域中所公开的一个或多个氨基酸的特定取代)。在另一个实施方案中，可在一个或多个所公开的氨基酸位置上进行不同的变化(例如，本领域中所公开的一个或多个氨基酸位置的不同取代)。
在一些实施方案中，亲本Fc多肽可包含在对应于Fc部分的“15埃接触区”内的EU氨基酸位置的氨基酸位置上包含氨基酸取代的Fc部分。15埃区包括位于全长野生型Fc部分的EU位置243至261、275至280、282至293、302至319、336至348、367、369、372至389、391、393、408和424至440上的残基。
在另一个实施方案中，亲本Fc多肽包含Fc区，所述Fc区包含一个或多个仍足以赋予Fc区以一种或多种功能的截短Fc部分。举例来说，Fc部分中结合到FcRn的部分(即，FcRn结合部分)包含约氨基酸282-438(EU编号)。因而，亲本Fc多肽的Fc部分可包含FcRn结合部分或由其组成。FcRn结合部分可来源于任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链。在一个实施方案中，使用来自人类同种型IgG1的抗体的FcRn结合部分。在另一个实施方案中，使用来自人类同种型IgG4的抗体的FcRn结合部分。在某些实施方案中，FcRn结合部分被无糖基化。在其他实施方案中，FcRn结合部分被糖基化。
在某些实施方案中，亲本Fc多肽包含对Fc部分的氨基酸取代，其改变抗体的抗原非依赖性效应功能，特别是抗体的循环半衰期。这些多肽当与缺乏这些取代的多肽相比时展现增加或减少的FcRn结合，并且因此具有分别增加或减少的血清半衰期。预期具有提高的FcRn亲和力的亲本Fc多肽具有较长血清半衰期，并且这些分子在需要所施用的多肽具有长半衰期，例如以治疗慢性疾病或病症的情况下适用于治疗哺乳动物的方法中。相反，预期具有降低的FcRn结合亲和力的亲本Fc多肽具有较短半衰期，并且这些分子还可用于例如在缩短循环时间可能有利(例如，对于体内诊断成像)的情况下或在起始多肽长期存在于循环中时具有毒性副作用的情形下施用于哺乳动物。具有降低的FcRn结合亲和力的亲本Fc多肽也不太可能越过胎盘，并且因而也适用于治疗孕妇的疾病或病症。另外，可能需要降低FcRn结合亲和力的其他应用包括需要定位脑、肾脏和/或肝脏的那些应用。在一个示例性实施方案中，亲本Fc多肽展现从血管越过肾小球上皮细胞的转运减少。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽展现越过血脑屏障(BBB)从脑进入血管空间的转运减少。在一个实施方案中，具有改变的FcRn结合的亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分(例如，一或两个Fc部分)，所述至少一个Fc部分在Fc部分的“FcRn结合环”内具有一个或多个氨基酸取代。FcRn结合环包含野生型全长Fc部分的氨基酸残基280-299(根据EU编号)。在其他实施方案中，具有改变的FcRn结合亲和力的亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分(例如，一或两个Fc部分)，所述至少一个Fc部分在15A FcRn“接触区”内具有一个或多个氨基酸取代。
如本文中所用，术语15A FcRn“接触区”包括野生型全长Fc部分的以下位置处的残基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424、425-440(EU编号)。在一些实施方案中，具有改变的FcRn结合亲和力的亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分(例如，一或两个Fc部分)，所述至少一个Fc部分在对应于以下任一EU位置的氨基酸位置上具有一个或多个氨基酸取代：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如，N434A或N434K)和438。改变FcRn结合活性的示例性氨基酸取代公开于国际PCT公开第WO05/047327号中，所述国际PCT公开通过引用并入本文。在其他实施方案中，亲本Fc多肽包含至少一个Fc部分，所述至少一个Fc部分具有位于溶剂暴露表面上的工程化半胱氨酸残基或其类似物。在一些实施方案中，工程化半胱氨酸残基或其类似物不干扰由Fc区赋予的效应功能。在一些实施方案中，Fc多肽包含Fc部分，所述Fc部分包含至少一个基本上不含与第二半胱氨酸残基的二硫键结的工程化游离半胱氨酸残基或其类似物。在一些实施方案中，Fc多肽可包含Fc部分，所述Fc部分在一个或多个以下CH3结构域位置上具有工程化半胱氨酸残基或其类似物：349-371、390、392、394-423、441-446和446b(EU编号)。在更多一些实施方案中，Fc多肽包含在以下任一位置上具有工程化半胱氨酸残基或其类似物的Fc变体：350、355、359、360、361、389、413、415、418、422、441、443和EU第446b位(EU编号)。随后可使用业内公认的技术(例如，与硫醇反应性异双官能接头缀合)使以上任一工程化半胱氨酸残基或其类似物缀合到功能部分。
B.无效应因子Fc多肽
在某些实施方案中，亲本Fc多肽是具有改变或降低的效应功能的“无效应因子”Fc多肽。在一些实施方案中，减少或改变的效应功能是抗原依赖性效应功能。举例来说，亲本Fc多肽可包含例如使多肽的抗原依赖性效应功能，特别是ADCC或补体活化与野生型Fc多肽相比有所降低的序列变异(例如，氨基酸取代)。令人遗憾的是，这些亲本Fc多肽通常具有降低的稳定性，使其成为根据本发明方法进行稳定化的理想候选物。
预期具有降低的FcγR结合亲和力的Fc多肽降低效应功能，并且这些分子也适用于例如治疗不需要靶细胞破坏的病症，例如，在正常细胞可能表达靶分子的情况下，或在长期施用多肽可能引起不需要的免疫系统活化的情况下。在一个实施方案中，Fc多肽展现选自由调理作用、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或效应细胞调节组成的组的至少一种抗原依赖性效应功能与包含野生型Fc区的Fc多肽相比有所降低。在一个实施方案中，Fc多肽展现与活化FcγR(例如FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)的结合有所改变。在另一个实施方案中，Fc多肽展现对抑制性FcγR(例如FcγRIIb)的结合亲和力有所改变。在其他实施方案中，具有降低的FcγR结合亲和力(例如降低的FcγRI、FcγRII或FcγRIIIa结合亲和力)的Fc多肽包含至少一个Fc部分(例如，一或两个Fc部分)，所述至少一个Fc部分在对应于以下一个或多个位置的氨基酸位置上具有氨基酸取代：234、236、239、241、251、252、261、265、268、293、294、296、298、299、301、326、328、332、334、338、376、378和435(EU编号)。在其他实施方案中，具有降低的补体结合亲和力(例如降低的C1q结合亲和力)的Fc多肽包含Fc部分(例如，一或两个Fc部分)，所述Fc部分在对应于以下一个或多个位置的氨基酸位置上具有氨基酸取代：239、294、296、301、328、333和376(EU编号)。
改变FcγR或补体结合活性的示例性氨基酸取代公开于国际PCT公开第WO05/063815号中，所述国际PCT公开通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的结合多肽可包含一个或多个以下特定取代：S239D、S239E、M252T、H268D、H268E、I332D、I332E、N434A和N434K(即，在对应于抗体Fc区中的一个或多个这些EU编号位置的氨基酸位置上的一个或多个这些取代)。
在某些示例性实施方案中，亲本“无效应因子”多肽的效应功能可能由于亲本Fc多肽内的无糖基化Fc区而改变或降低。在某些实施方案中，无糖基化Fc区由改变Fc区的糖基化的氨基酸取代产生。举例来说，可改变Fc区内EU位置297处的天冬酰胺(例如通过取代、插入、缺失或通过化学修饰)以抑制其糖基化。在另一个示例性实施方案中，EU第299位的氨基酸残基(例如，苏氨酸(T))被(例如，被丙氨酸(A))取代以降低相邻残基297处的糖基化。减少或改变糖基化的示例性氨基酸取代公开于国际PCT公开第WO05/018572号和美国专利公开第2007/0111281号中，所述文献通过引用并入本文。在其他实施方案中，通过酶促或化学移除低聚糖或在不能使Fc区糖基化的宿主细胞(例如，具有受损糖基化机制的细菌宿主细胞或哺乳动物宿主细胞)中表达Fc多肽来产生无糖基化Fc区。
在某些实施方案中，无糖基化Fc区是部分无糖基化或半糖基化。举例来说，Fc区可包含第一糖基化Fc部分(例如，糖基化CH2区)和第二无糖基化Fc部分(例如，无糖基化CH2区)。在其他实施方案中，Fc区可完全无糖基化，即，其Fc部分中无一被糖基化。
“无效应因子”多肽的无糖基化Fc区可属于任何IgG同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一个示例性实施方案中，亲本Fc多肽可包含IgG4抗体例如“agly IgG4.P”的无糖基化Fc区。agly IgG4.P是IgG4抗体的工程化形式，其包括处于铰链区中的脯氨酸取代(Ser228Pro)和处于CH2结构域中的Thr299Ala突变以产生无糖基化Fc区(EU编号)。已证明agly IgG4.P在体外不具有可测量的免疫效应功能。在另一个示例性实施方案中，亲本Fc多肽包含IgG1抗体例如“agly IgG1”的无糖基化Fc区。agly IgG1是IgG免疫球蛋白IgG1的无糖基化形式，其具有赋予低效应功能概况的Thr299Ala突变(EU编号)。agly IgG4.P和aglyIgG1抗体两者都代表一类重要治疗试剂，其中不需要免疫效应功能。
在某些示例性实施方案中，“无效应因子”亲本Fc多肽包含来源于IgG4抗体的Fc区。IgG4 Fc区可与野生型Fc区一致，或其对野生型IgG4序列可能具有一个或多个修饰。这些IgG4样Fc多肽由于IgG4抗体结合到补体和/或Fc受体的能力固有地降低而具有降低的效应功能。IgG4同种型的亲本Fc多肽可被糖基化或无糖基化。此外，IgG4样Fc多肽的Fc区可包含IgG4抗体的完整Fc部分，或其可包含嵌合Fc部分，其中Fc部分的一部分来自于IgG4抗体并且其余部分来自于另一同种型的抗体。在一个示例性实施方案中，嵌合Fc部分包含来自IgG1抗体的CH3结构域和来自IgG4抗体的CH2结构域。在另一个实施方案中，IgG4抗体包含嵌合铰链，其中上铰链结构域和下铰链结构域来自IgG4抗体，但由于铰链区中的脯氨酸取代(Ser228Pro)，中铰链结构域来自IgG1抗体。在另一个实施方案中，亲本嵌合IgG4抗体包含嵌合铰链，其中上铰链结构域和下铰链结构域来自IgG4抗体，但由于铰链区中的脯氨酸取代(Ser228Pro)，中铰链结构域来自IgG1抗体，CH1结构域来自IgG1或IgG4抗体，CH2结构域(或EU编号第292-340位)来自IgG4抗体，并且CH1和/或CH3结构域来自IgG1抗体。
在某些实施方案中，“无效应因子”Fc多肽的效应功能降低是与Fc受体(FcR)，例如FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIIIb受体或补体蛋白(例如，补体蛋白C1q)的结合降低。这种结合变化可达约1倍或更多倍，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、50或100倍或更多倍，或其任何间隔或范围。效应功能(例如Fc与Fc受体或补体蛋白的结合)的这些降低容易基于例如使用本文中所描述的测定法或本领域中已知的测定法确定的结合活性的降低百分比来计算。
在本发明的一个实施方案中，稳定化Fc多肽包含单链Fc区。这些单链Fc区是本领域中已知的(参见例如WO200801243、WO2008131242、WO2008153954)，并且可使用已知的方法制造。如本文中所教导的稳定化氨基酸可使用本领域技术人员已知的方法并入这些构建体的一个或多个Fc部分中。这些单链Fc区或基因融合Fc区是包含基因连接于单一多肽链内(即，编码于单一连续基因序列中)的Fc结构域(或Fc部分)的合成Fc区。因此，基因融合Fc区(即，scFc区)是单体，因为其包含一个多肽链，但所述分子的适当部分二聚化而形成n Fc区。应理解，本文中关于Fc部分的教导适用于双链Fc二聚体和单链Fc二聚体。举例来说，任一类型的Fc区构建体均可来源于例如IgG1或IgG4抗体，或者可为嵌合的(例如，包含嵌合铰链和/或包含来自IgG4抗体的CH2结构域和来自IgG1抗体的CH3结构域)。
III.具有稳定化Fc区的变异Fc多肽
在某些方面中，本发明提供包含作为上文所描述的任一亲本Fc多肽的变体的氨基酸序列的变异Fc多肽。特别是，本发明的变异Fc多肽包含具有来源于亲本Fc多肽的Fc区(或Fc部分)的氨基酸序列的Fc区(或Fc部分)。在一些实施方案中，变异Fc多肽与亲本Fc多肽的不同之处在于存在至少一个本文中所描述的稳定化Fc突变。在某些实施方案中，Fc变体可包含其他氨基酸序列变化。在一些实施方案中，Fc变体与亲本Fc多肽相比将具有增强的稳定性，并且与亲本Fc多肽相比任选地具有改变的效应功能。举例来说，变异Fc多肽可具有与亲本Fc多肽的抗原依赖性效应功能(例如，ADCC和/或CDC)等效或更低的抗原依赖性效应功能。另外地或可替代地，变异Fc多肽相对于亲本Fc多肽可具有抗原非依赖性效应功能(例如，延长的半衰期)。
在某些实施方案中，变异Fc多肽包含与亲本Fc多肽的Fc区(Fc部分)基本上同一但相对于起始或亲本多肽存在约一个或多个突变(例如，约1至约20、约1至约15、约1至约10、约1至约5、约1至约4、约1至约3、约2至约20、约2至约15、约2至约10、约5至约20、或约5至约10)个突变，例如一个或多个氨基酸残基已被另一氨基酸残基取代或具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失的Fc区(或Fc部分)。在某些实施方案中，变异Fc多肽相对于起始多肽具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个突变。在一些实施方案中，变异多肽包含非天然存在的氨基酸序列。
这些变体必需与起始多肽具有低于100％序列同一性或相似性。在一些实施方案中，变体将具有例如在变体分子或其部分(例如，Fc区或Fc部分)的整个长度上与起始多肽的氨基酸序列具有约75％至低于100％氨基酸序列同一性或相似性，例如约80％至低于100％、或约85％至低于100％、或约90％至低于100％(例如，91-99％、92-99％、93-99％、94-99％、95-99％、96-99％、97-99％、98-99％或99％)或约95％至低于100％的氨基酸序列。在一个实施方案中，起始多肽序列(例如，亲本Fc多肽的Fc区)与来源于其的序列(例如，变异Fc多肽的Fc区)之间存在一个氨基酸差异。
在某些实施方案中，本发明的变异Fc多肽是稳定化Fc多肽。也就是说，稳定化多肽包含至少一个作为稳定化Fc突变的序列变异或突变。如本文中所用，术语“稳定化Fc突变”包括变异Fc多肽的Fc区内的突变，其与其所来源的亲本Fc多肽相比赋予变异Fc多肽以增强的蛋白质稳定性(例如热稳定性)。在一些实施方案中，稳定化突变包含用赋予Fc区以增强的蛋白质稳定性的置换氨基酸(本文中的“稳定化氨基酸”)取代Fc区中的去稳定化氨基酸。在一个实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽包含一个或多个氨基酸稳定化Fc突变(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个稳定化突变)。稳定化Fc突变可引入例如Fc区的CH2结构域、CH3结构域或CH2结构域和CH3结构域二者中。
在某些示例性实施方案中，本发明的变异Fc多肽是上文所描述的“无效应因子”亲本Fc多肽的稳定化变体。也就是说，稳定化变体相对于“无效应因子亲本Fc多肽”具有增强的稳定性。在一个示例性实施方案中，变异Fc多肽是亲本Fc多肽的稳定化变体，其包含IgG1抗体的无糖基化Fc区，例如包含T299A突变(EU编号)的无糖基化IgG1 Fc区。在另一个示例性实施方案中，变异Fc多肽是亲本Fc多肽的稳定化变体，其包含糖基化或无糖基化IgG4抗体的Fc区。举例来说，变异Fc多肽可包含处于来源于“agly IgG4.P”抗体的Fc区中的稳定化突变。
在一些实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽与变异Fc多肽相比在相同测量条件下展现增强的稳定性。然而，应认识到，Fc变异多肽的稳定性相对于其亲本Fc多肽的增强程度在所选择的测量条件下可能变化。举例来说，可在特定pH，例如酸性、中性或碱性pH下观测稳定性的增强。在一个实施方案中，在低于约6.0(例如，约6.0、约5.5、约5.0、约4.5或约4.0)的酸性pH下观测到稳定性增强。在另一个实施方案中，在约6.0至约8.0(例如，约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0)的中性pH下观测到稳定性增强。在另一个实施方案中，在约8.0至约10.0(例如，约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10.0)的碱性pH下观测到稳定性增强。
可例如使用以下所描述的任何方法来评估变异Fc多肽的热稳定性增强。在某些实施方案中，稳定化Fc多肽具有热稳定性(例如，熔融温度或Tm)比其所来源的亲本多肽高出约0.1、约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约1.75、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约25、约30、约40或约50摄氏度的Fc区(或Fc部分)。在某些实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽变体表达为单体可溶性蛋白质，其中二聚、四聚或其他聚集形式不超过25％(例如，少于约25％、约20％、约15％、约10％或约5％)。
在另一个实施方案中，稳定化Fc多肽在热攻击测定中具有高于40℃(例如40、41、42、43、44、45、46、47、48、49℃或更高)的T50(参见美国专利申请第11/725,970号，所述美国专利申请通过引用并入本文以及以下实施例4中)。在一些实施方案中，本发明的稳定化Fc分子具有高于50℃(例如，50、51、52、53、54、55、56、57、58℃或更高)的T50。在一些实施方案中，本发明的稳定化Fc分子具有高于60℃(例如，60、61、62、63、64、65℃或更高)的T50。在其他实施方案中，本发明的稳定化Fc分子具有高于65℃(例如，65、66、67、68、69、70℃或更高)的T50。在其他实施方案中，本发明的稳定化Fc分子具有高于70℃(例如，70、71、73、74、75℃或更高)的T50。
在某些实施方案中，本发明的稳定化Fc分子具有Tm值高于约60℃(例如，约61、62、63、64、65℃或更高)、高于65℃(例如，65、66、67、68、69℃或更高)或高于约70℃(例如，71、72、73、74、75℃或更高)的CH2结构域。在其他实施方案中，本发明的稳定化Fc分子具有Tm值高于约70℃(例如，约71、72、73、74、75℃或更高)、高于约75℃(例如，76、77、78、79、80℃或更高)或高于80℃(例如，81、82、83、84、85℃或更高)的CH3结构域。在特定实施方案中，所述稳定化Fc多肽是亲本Fc多肽的变体，其包含IgG4抗体的无糖基化或糖基化Fc区(例如，aglyIgG4.P)。在其他实施方案中，所述稳定化Fc多肽是亲本Fc多肽的变体，其包含IgG1抗体的无糖基化Fc区(例如，agly IgG1)。在其他实施方案中，本发明的稳定化Fc分子具有Fc区或Fc部分(例如，CH2和/或CH3结构域)，其热稳定性基本上等于或大于糖基化IgG1抗体的热稳定性。
在某些实施方案中，本发明的变异Fc多肽与其所来源的亲本Fc多肽相比引起聚集减少。在一个实施方案中，通过本发明的方法产生的稳定化Fc分子相对于亲本Fc分子在聚集方面减少至少1％。在其他实施方案中，稳定化Fc多肽相对于亲本分子在聚集方面减少至少2％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％或至少100％。
在其他实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽与其所来源的亲本Fc多肽相比引起长期稳定性或保质期增加。在一个实施方案中，通过本发明的方法产生的稳定化Fc分子相对于未稳定化结合分子在保质期方面增加至少1天。这意指稳定化Fc多肽制剂具有与前一天所存在的量基本上相同量的生物学活性变异Fc多肽，并且所述制剂不具有任何明显的变异多肽聚集或分解。在其他实施方案中，稳定化Fc分子的保质期相对于未稳定化Fc分子增加至少2天、至少5天、至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月或至少1年。
在某些实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽与其亲本Fc多肽相比以增加的产率表达。在一个实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽的产率相对于亲本Fc分子增加至少1％。在其他实施方案中，稳定化Fc多肽的产率相对于亲本Fc分子增加至少2％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少100％。
在示例性实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽在宿主细胞，例如细菌或真核生物(例如酵母或哺乳动物)宿主细胞中以增加的产率(与其亲本Fc多肽相比)表达。可用于表达编码本发明的稳定化Fc多肽的核酸分子的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HELA(人类宫颈癌)细胞、CVI(猴肾细胞系)细胞、COS(具有SV40 T抗原的CVI衍生物)细胞、R1610(中国仓鼠纤维母细胞)细胞、BALBC/3T3(小鼠纤维母细胞)细胞、HAK(仓鼠肾细胞系)细胞、SP2/O(小鼠骨髓瘤)细胞、BFA-1c1BPT细胞(牛内皮细胞)、RAJI(人类淋巴细胞)细胞、
Figure GDA0003031568410000771
(人类视网膜来源细胞系，Crucell，荷兰)和293细胞(人类肾脏)。
在其他实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽在大规模(例如，工业规模)条件下在宿主细胞中以增加的产率(相对于其亲本Fc多肽)表达。在示例性实施方案中，当在至少10升培养基中表达时，稳定化Fc分子具有增加的产率。在其他实施方案中，当由宿主细胞在至少20升、至少50升、至少75升、至少100升、至少200升、至少500升、至少1000升、至少2000升、至少5,000升或至少10,000升的培养基中表达时，稳定化Fc结合分子具有增加的产率。在一个示例性实施方案中，每升培养基产生至少10mg(例如，10mg、20mg、50mg或100mg)稳定化Fc分子。
(i)稳定化Fc氨基酸
在某些实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽包含IgG4分子的CH2结构域(或其氨基酸292-340)和来自IgG1分子的CH3结构域，在第297位具有Gln(Q)残基。在另一个实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽包含IgG1分子的CH2和CH3结构域以及处于第299位的Lys(K)残基，其单独存在或与第297位的Asp(D)残基组合。
(ii)示例性稳定化Fc部分
在整个本申请、实施例和序列表中，可发现本发明的示例性稳定化Fc部分。
在某些示例性实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽包含含有以下表1.1中所示的一个、两个或更多个Fc氨基酸序列的稳定化IgG4 Fc区。稳定化Fc突变以粗体加下划线显示。
表1.1：稳定化IgG4 Fc部分
Figure GDA0003031568410000781
Figure GDA0003031568410000791
Figure GDA0003031568410000801
Figure GDA0003031568410000811
Figure GDA0003031568410000821
在某些示例性实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽包含具有以下表1.2中所示的一个、两个或更多个嵌合Fc部分氨基酸序列的稳定化嵌合Fc区。
表1.2：稳定化嵌合Fc部分
Figure GDA0003031568410000822
Figure GDA0003031568410000831
在其他示例性实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽包含具有以下表1.3中所示的一个、两个或更多个IgG1 Fc部分氨基酸序列的稳定化无糖基化IgG1 Fc区。
表1.3：稳定化无糖基化IgG1 Fc部分
Figure GDA0003031568410000841
Figure GDA0003031568410000851
IV.用于稳定变异Fc多肽的方法
在某些方面，本发明涉及一种使包含Fc区(例如，无糖基化Fc区)的多肽稳定的方法，所述方法包括：(a)选择起始Fc区的至少一个Fc部分内的一个或多个氨基酸位置用于突变；以及(b)使选择用于突变的一个或多个氨基酸位置突变，从而使多肽稳定。
在一个实施方案中，起始Fc区是IgG1 Fc区。在另一个实施方案中，起始Fc区是IgG4 Fc区。在另一个实施方案中，起始Fc区是嵌合Fc区。在一个实施方案中，起始Fc区是无糖基化IgG1 Fc区。在另一个实施方案中，起始Fc区是无糖基化IgG4 Fc区。
在一些实施方案中，如本文中所描述的抗体(或其片段)的Fc区具有SEQ ID NO:85中所示的序列。
在一个实施方案中，选择用于突变的氨基酸位置在起始IgG分子(例如IgG4分子)的Fc区中的延伸环中。在另一个实施方案中，选择用于突变的氨基酸位置存在于CH3结构域之间的界面中。在另一个实施方案中，选择用于突变的氨基酸位置在与1hzh晶体结构中的碳水化合物的接触位点(例如，V264、R292或V303)附近。在其他实施方案中，所述氨基酸位置可在CH3/CH2界面附近，或在CH3/CH2界面附近(例如H310)。在另一个实施方案中，可例如在一组表面暴露谷氨酰胺残基(Q268、Q274或Q355)中的一者或多者中进行改变Fc区的总体表面电荷的一个或多个突变。在另一个实施方案中，所述氨基酸位置是在CH2和CH3的“缬氨酸核心”中发现的缬氨酸残基。CH2中的“缬氨酸核心”是全部定向至CH2结构域的相同近端内部核心中的五个缬氨酸残基(V240、V255、V263、V302和V323)。对于CH3，观测到类似“缬氨酸核心”(V348、V369、V379、V397、V412和V427)。在另一个实施方案中，选择用于突变的氨基酸位置是预计与氨基酸297处N连接的碳水化合物相互作用或接触的位置。所述氨基酸位置可通过检查与同源Fc受体(例如FcγRIIIa)结合的Fc区的晶体结构来鉴定。与N297形成相互作用的示例性氨基酸包括由残基262-270形成的环。
示例性氨基酸位置包括根据EU编号惯例的氨基酸位置240、255、262-266、267-271、292-299、302-309、379、397-399、409、412和427。在某些实施方案中，选择用于突变的一个或多个氨基酸位置是选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸位置：240、255、262、263、264、266、268、274、292、299、302、303、307、309、323、348、355、369、379、397、399、409、412和427。在某些实施方案中，选择用于突变的一个或多个氨基酸位置是选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸位置：240、262、264、266、297、299、307、309、399、409和427。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸位置是选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸位置：297、299、307、309、409和427。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸位置选自氨基酸残基240、262、264和266。在另一个实施方案中，至少一个氨基酸位置是EU第297位。在另一个实施方案中，至少一个氨基酸位置是EU第299位。在另一个实施方案中，至少一个氨基酸位置是EU第307位。在另一个实施方案中，至少一个氨基酸位置是EU第309位。在另一个实施方案中，至少一个氨基酸位置是EU第399位。在另一个实施方案中，至少一个氨基酸位置是EU第409位。在另一个实施方案中，至少一个氨基酸位置是EU第427位。
在某些实施方案中，所述Fc区是IgG1 Fc区。在某些实施方案中，其中Fc区是IgG1Fc区，一个或多个氨基酸位置选自根据EU编号的氨基酸残基240、262、264、299、297和266。在其他实施方案中，其中Fc区是IgG4 Fc区，一个或多个氨基酸位置选自根据EU编号的氨基酸残基297、299、307、309、399、409和427。
在一个实施方案中，突变减少所述氨基酸位置处氨基酸侧链的大小(例如，用丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)取代)。在另一个实施方案中，突变是用具有非极性侧链的氨基酸进行取代(例如，用甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)进行取代)。在另一个实施方案中，突变增加CH3界面的疏水性，例如，增加两个相互作用结构域(例如Y349F、T350V和T394V)之间的缔合或增加界面侧链(例如F405Y)的体积。在另一个实施方案中，“缬氨酸核心”的一个或多个氨基酸被异亮氨酸或苯丙氨酸取代，以增加其稳定性。在另一个实施方案中，使氨基酸(例如L351和/或L368)突变为更高度分支化的疏水性侧链。
在一个实施方案中，所述突变是用丙氨酸(A)取代。在一个实施方案中，所述突变是用苯丙氨酸(F)取代。在另一个实施方案中，所述突变是用亮氨酸(L)取代。在一个实施方案中，所述突变是用苏氨酸(T)取代。在另一个实施方案中，所述突变是用赖氨酸(K)取代。在一个实施方案中，所述突变是用脯氨酸(P)取代。在一个实施方案中，所述突变是用苯丙氨酸(F)取代。
在一个实施方案中，突变包含以下表5.1、表5.2、表5.3和/或表5.4中所示的一个或多个突变或取代。
在某些实施方案中，突变包含一个或多个选自由以下组成的组的取代：240F、262L、264T、266F、297Q、297S、297D、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399S、409M和427F(EU编号惯例)。在另一个实施方案中，所述突变包含一个或多个选自由以下组成的组的取代：299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399E、399S、409K、409M和427F。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸位置选自氨基酸残基240F、262L、264T和266F。在另一个实施方案中，至少一个取代是299A。在另一个实施方案中，至少一个取代是299K。在另一个实施方案中，至少一个取代是307P。在另一个实施方案中，至少一个取代是309K。在另一个实施方案中，至少一个取代是309M。在另一个实施方案中，至少一个取代是309P。在另一个实施方案中，至少一个取代是323F。在另一个实施方案中，至少一个取代是399S。在另一个实施方案中，至少一个取代是399E。在另一个实施方案中，至少一个取代是409K。在另一个实施方案中，至少一个取代是409M。在另一个实施方案中，至少一个取代是427F。
在另一个实施方案中，所述突变包含两个或更多个取代(例如2、3、4或5个)。在另一个实施方案中，所述突变包含三个或更多个取代(例如3、4、5或6个)。在另一个实施方案中，稳定化Fc区包含四个或更多个取代(例如4、5、6或7个)。
在另一方面，本发明涉及一种制造包含稳定化Fc区的稳定化结合分子的方法，所述方法包括将包含本发明的稳定化Fc区的多肽基因融合至结合部分的氨基末端或羧基末端。在某些实施方案中，根据本发明的方法使稳定化Fc区稳定。
在另一个实施方案中，治疗抗体可消除扰乱或降低抗体对扰乱的易感性。某些抗体，例如具有野生型IgG4恒定区(例如，包括铰链区)的抗体可能易于扰乱内源IgG4抗体从而产生功能单价产物的两个拷贝(参见例如Aalberse和Schuurman,Immunology 105:9-19,2002)。扰乱率可取决于内源IgG4水平并且这是可变的。因此，具有野生型人类IgG4恒定区的治疗性抗体具有可变药物动力学/药效学(PK/PD)概况。具有野生型IgG4恒定区的抗体扰乱可产生就VLA4来说是单价并且就另一抗原来说是单价的双特异性抗体。因而，在一些实施方案中，本文中所描述的治疗性抗体与具有相同特异性(例如，特异性结合到α4)但具有野生型IgG4恒定区的抗体相比具有更一致的PK概况。在一些实施方案中，与具有相同特异性(例如，特异性结合到α4)但具有野生型IgG4恒定区的抗体相比，本文中所描述的治疗性抗体的更一致PK概况可增加本文中所描述的抗体的安全性，增加其纯度和/或增加其效能。
在一些实施方案中，作为人类IgG1与人类IgG4抗体之间的嵌合物或杂合体的包含重链铰链和Fc区的治疗性抗体可降低或消除包含来自人类IgG4分子的铰链和Fc区的抗体的扰乱。在一个实施方案中，本文中所描述的具有嵌合或杂合重链恒定区的抗体可消除扰乱或降低抗体对扰乱的易感性，从而降低PK/PD变异性。在一些实施方案中，本文中所描述的治疗性抗体与具有相同特异性(例如，特异性结合到α4)但具有野生型IgG4恒定区的抗体相比具有较低PK/PD变异性。在某些实施方案中，本文中所描述的抗体可增加二价单克隆抗体的效能和/或消除由于扰乱所致的双特异性。在某些实施方案中，本文所描述的抗体与其未突变对应物相比或与具有相同特异性(例如，特异性结合到α4)但具有野生型IgG4恒定区和/或显示较高持续受体占用率的抗体相比可展现较高结合亲和力。在一些实施方案中，本文中所描述的具有较低PK/PK变异性和/或较高结合亲和力和/或减少或消除的扰乱的治疗性抗体与具有相同特异性(例如，特异性结合到α4)但具有野生型IgG4恒定区的抗体相比可增加本文中所描述的抗体的安全性，增加其纯度和/或增加其效能。在一个优选实施方案中，消除扰乱或降低抗体对扰乱的易感性的抗体是重组抗α4抗体，所述抗体包含：(a)含有SEQ ID NO:80的序列、基本上由其组成或由其组成的重链；和(b)含有SEQ ID NO:81的序列、基本上由其组成或由其组成的轻链。
V.评估蛋白质稳定性的方法
可使用本领域中已知的方法来分析本发明组合物的稳定性。可采用对本领域技术人员可接受的稳定性参数。以下更详细地描述示例性参数。在示例性实施方案中，评估热稳定性。在一些实施方案中，评估本发明组合物的表达水平(例如，如由产率％所量度)。在一些实施方案中，评估本发明组合物的聚集水平。
在某些实施方案中，将Fc多肽的稳定性与合适对照的稳定性相比较。示例性对照包括亲本Fc多肽，例如野生型Fc多肽、野生型(糖基化)IgG1或IgG4抗体。另一个示例性对照是无糖基化Fc多肽、无糖基化IgG1或IgG4抗体。在一个实施方案中，测量以下所描述的一个或多个参数。
在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中表达后测量这些参数中的一者或多者。在一个实施方案中，在大规模制造条件下测量以下所描述的一个或多个参数(例如，Fc多肽或包含Fc多肽的分子在生物反应器中的表达)。
A.热稳定性
可使用本领域中已知的许多非限制性生物物理或生物化学技术分析本发明组合物的热稳定性。在某些实施方案中，通过分析光谱法评估热稳定性。示例性分析光谱法是差示扫描量热法(DSC)。DSC采用对热吸收伴随大部分蛋白质或蛋白质结构域去折叠敏感的热量计(参见例如Sanchez-Ruiz等人,Biochemistry,27:1648-52,1988)。为了测定蛋白质的热稳定性，将蛋白质样品插入热量计中并使温度升高直至Fc多肽(或其CH2或CH3结构域)去折叠。蛋白质去折叠时的温度指示总体蛋白质稳定性。
另一个示例性分析光谱法是圆二色性(CD)光谱法。CD光谱法测量组合物的光学活性随温度增加而变化。圆二色性(CD)光谱法测量由于结构不对称而引起的左偏振光相对于右偏振光的吸收差异。无序或去折叠结构引起CD光谱非常不同于有序或折叠结构的光谱。CD光谱体现蛋白质对温度增高的变性作用的敏感性，并且因此指示蛋白质的热稳定性(参见van Mierlo和Steemsma,J.Biotechnol,79(3):281-98,2000)。
用于测量热稳定性的另一个示例性分析光谱法是荧光发射光谱法(参见vanMierlo和Steemsma,同上)。用于测量热稳定性的另一个示例性分析光谱法是核磁共振(NMR)光谱法(参见例如van Mierlo和Steemsma,同上)。
在其他实施方案中，以生物化学手段测量本发明组合物的热稳定性。用于评定热稳定性的示例性生物化学方法是热攻击测定法。在“热攻击测定法”中，使本发明的组合物经受一定范围的升高温度持续设定时间段。举例来说，在一个实施方案中，包含Fc区的测试Fc多肽经受一定范围的升高温度，例如持续1-1.5小时。随后通过相关生物化学测定法(例如，ELISA或DELFIA)测定Fc区结合Fc受体(例如，FcγR、蛋白A或蛋白G)的能力。示例性热攻击测定法描述于以下实施例4中。
在一个实施方案中，这种测定法可以高通量形式进行。在另一个实施方案中，可使用本领域中已知的方法来建立Fc变体文库。可诱导Fc表达并且可对Fc进行热攻击。可测定受攻击的测试样品的结合并且可按比例放大那些稳定Fc多肽并进一步表征。
在某些实施方案中，通过使用任一以上技术(例如分析光谱技术)测量本发明组合物的熔融温度(Tm)来评估热稳定性。熔融温度是热转变曲线中点处的温度，其中组合物的50％分子处于折叠状态。
在其他实施方案中，通过使用分析量热技术(例如DSC)测量本发明组合物的比热或热容(Cp)来评估热稳定性。组合物的比热是使1mol水的温度升高1℃所需的能量(例如以kcal/mol计)。因为大Cp是变性或无活性蛋白质组合物的标志。在某些实施方案中，通过在组合物热转移前后测定其比热来测量组合物的热容变化(ΔCp)。在其他实施方案中，可通过测量或测定其他热力学稳定性参数来评估热稳定性，包括去折叠的吉布斯自由能(ΔG)、去折叠的焓(ΔH)或去折叠的熵(ΔS)。
在其他实施方案中，使用一种或多种以上生物化学测定法(例如热攻击测定法)来测定50％组合物保留其活性(例如结合活性)的温度(即，Tc值)。
B.聚集％
在某些实施方案中，通过测量本发明组合物的聚集倾向来测定其稳定性。可通过许多非限制性生物化学或生物物理学技术来测量聚集。举例来说，可使用色谱法，例如尺寸排阻色谱法(SEC)来评估本发明组合物的聚集。SEC基于尺寸分离分子。柱填充有聚合物凝胶的半固体珠粒，从而将允许离子和小分子但不允许大分子进入其内部。当蛋白质组合物施加至柱顶部时，紧密折叠的蛋白质(即，非聚集蛋白质)分布至比大蛋白质聚集物可利用的体积更大体积的溶剂。因此，大聚集物更快速地移动通过柱，并且可以这种方式将混合物分离或分级成其组分。各级分可在其从凝胶洗脱时分别定量(例如通过光散射)。因此，可通过比较级分的浓度与施加至凝胶的蛋白质的总浓度来确定本发明组合物的聚集％。稳定组合物从柱中洗脱为基本单一级分，并且在洗脱曲线或色谱图中呈现为基本单峰。
在一些实施方案中，SEC与串联光散射(例如经典或动态光散射)联合用于测定组合物的聚集％。在某些实施方案中，采用静态光散射测量各级分或峰的质量，与分子形状或洗脱位置无关。在一些实施方案中，采用动态光散射来测量组合物的流体动力学大小。用于评估蛋白质稳定性的其他示例性方法包括高速SEC(参见例如Corbett等人,Biochemistry.23(8):1888-94,1984)。
在一个非限制性实施方案中，通过测量蛋白质样品内蛋白质聚集物的分数来确定聚集％。在一些实施方案中，通过测定蛋白质样品内折叠蛋白质的分数来测量组合物的聚集％。
C.产率％
在其他实施方案中，通过在蛋白质表达(例如重组表达)后测量所回收的蛋白质的量(本文中为“产率％”)来评估本发明组合物的稳定性。举例来说，可通过测定每ml宿主培养基回收的蛋白质的毫克数(即，mg/ml蛋白质)来测量产率％。在一些实施方案中，在哺乳动物宿主细胞(例如CHO细胞)中表达后评估产率％。
D.损失％
在其他实施方案中，通过监测在一定范围的温度(例如-80℃至25℃)下储存限定时间段后的蛋白质损失来评估本发明组合物的稳定性。可使用本领域中已知的任何蛋白质定量方法来测定所回收的蛋白质的量或浓度，并且与蛋白质的初始浓度相比较。示例性蛋白质定量方法包括SDS-PAGE分析或Bradford测定法(Bradford等人,Anal.Biochem.72,248,(1976))。用于评估损失％的非限制性方法采用上文所描述的任何分析型SEC方法。应了解，可在任何所需储存条件或储存制剂，包括例如冻干蛋白质制剂下测定损失％测量。
E.蛋白水解％
在其他实施方案中，通过测定在标准条件下储存后发生蛋白水解的蛋白质的量来评估本发明组合物的稳定性。在一个示例性实施方案中，通过SDS-PAGE测定蛋白质样品的蛋白水解，其中将完整蛋白质的量与SDS-PAGE凝胶上出现的低分子量片段的量相比较。在另一个示例性实施方案中，通过质谱法(MS)测定蛋白水解，其中将具有预期分子量的蛋白质的量与样品内低分子量蛋白质片段的量相比较。
F.结合亲和力
在其他实施方案中，可通过测定本发明组合物的靶结合亲和力来评定其稳定性。用于测定结合亲和力的多种方法是本领域中已知的。用于测定结合亲和力的示例性方法采用表面等离子体共振。表面等离子体共振是一种光学现象，其允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)。关于进一步描述，参见Jonsson,U.等人,(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；Jonsson,U.等人,(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson,B.等人,(1995)/.MoI.Recognit.8:125-131；和Johnnson,B.等人,(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
G.其他结合研究
在其他实施方案中，可通过对经标记化合物与结合分子的已变性或去折叠部分的结合进行定量来评定本发明组合物的稳定性。这些分子可为疏水性的，因为其可能会与正常情况下埋藏在天然蛋白质内部但在变性或去折叠结合分子中得以暴露的大疏水性氨基酸补丁结合或相互作用。示例性经标记化合物是疏水性荧光染料1-苯胺基-8-萘磺酸盐(ANS)。
VI.包含稳定化Fc区的稳定化结合多肽
在一个实施方案中，本发明的多肽包含来自IgG4抗体的CH1结构域、来自IgG4抗体的CH2结构域和来自IgG1抗体的CH3结构域。在一个实施方案中，所述多肽还包含Ser228Pro取代。所述多肽还可包含氨基酸297和/或299处的突变，例如297Q和/或299K或297S和/或299K。所述多肽还可包含来自IgG1或IgG4抗体的CH1结构域、来自IgG4抗体的CH2结构域和来自IgG1抗体的CH3结构域；所述多肽可包含Ser228Pro、297Q或299K取代中的一者或多者。由来自IgG4分子的CH1结构域(具有Ser228Pro取代)、来自IgG4抗体的CH2结构域和来自IgG1抗体的CH3结构域组成的Fc区的氨基酸序列以SEQ ID NO:43提供。在一个实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽包含以SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽包含以SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽包含以SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽包含以SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的稳定化Fc多肽包含以SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明多肽的Fc区是单链(scFc)。在一个实施方案中，包含该段落中所描述的Fc区的分子是单价的。在一个实施方案中，包含该段落中所描述的Fc区的分子是单价的并且所述Fc区是scFc。包含本文中所描述的Fc区的分子还可包含scFv。
VII.包含功能部分的稳定化含Fc多肽
可进一步修饰本发明的变异含Fc多肽以提供所需效果。举例来说，变异Fc多肽的Fc区可连接例如共价连接到额外部分，即功能部分，例如阻断部分、可检测部分、诊断部分和/或治疗部分。下面首先描述示例性功能部分，接着是用于将这些功能部分与不同的氨基酸侧链化学反应相关联的适用化学反应。
适用功能部分的实例包括但不限于阻断部分、可检测部分、诊断部分和治疗部分。示例性阻断部分包括具有足以降低效应功能(例如通过抑制Fc区结合受体或补体蛋白质的能力)的空间体积和/或电荷的部分。非限制性阻断部分包括聚烷二醇部分，例如PEG部分或PEG-马来酰亚胺部分。非限制性聚乙二醇化部分(或相关聚合物)可为例如聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇(“PPG”)、聚氧乙基化甘油(“POG”)和其他聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇(“PVA”)和其他聚环氧烷、聚氧乙基化山梨醇或聚氧乙基化葡萄糖。聚合物可为均聚物、无规或嵌段共聚物、基于以上列出的单体的三元共聚物、直链或支链、被取代或未被取代，只要其具有至少一个活性砜部分即可。聚合物部分可具有任何长度或分子量，但这些特征可能影响生物学性质。特别适用于在医药应用中降低清除率的聚合物平均分子量在2,000至35,000道尔顿的范围内。另外，如果两个基团连接到聚合物，每一端一个，则聚合物的长度可影响两个基团之间的有效距离和其他空间关系。因而，本领域技术人员可改变聚合物的长度以优化或赋予所需生物活性。PEG出于若干原因而适用于生物学应用。PEG通常透明、无色、无味、可溶于水、对热稳定、对许多化学试剂呈惰性、不水解并且无毒。聚乙二醇化可通过增加分子的表观分子量来改进分子的药物动力学性能。表观分子量增加降低了皮下或全身施用后从体内清除的速率。在许多情况下，聚乙二醇化可降低抗原性和免疫原性。此外，聚乙二醇化可增加生物活性分子的溶解度。
聚乙二醇化抗体和抗体片段一般可用于治疗可通过施用本文中所描述的抗体和抗体片段来缓解或调节的疾患。一般来说，聚乙二醇化无糖基化抗体和抗体片段与非聚乙二醇化无糖基化抗体和抗体片段相比具有增加的半衰期。聚乙二醇化无糖基化抗体和抗体片段可单独、共同或与其他药物组合物组合使用。适用于本发明的方法和多肽中的可检测部分的实例包括荧光部分、放射性同位素部分、不透射线部分等，例如可检测标记，例如生物素、荧光团、发色团、自旋共振探针或放射性标记。示例性荧光团包括荧光染料(例如荧光素、罗丹明等)和其他发光分子(例如鲁米那(luminal))。荧光团可具环境敏感性，使得如果其位于接近被修饰蛋白质中在结合底物(例如丹酰探针)后发生结构变化的一个或多个残基处，则其荧光发生变化。示例性放射性标记包括含有具有一个或多个低敏感性核的原子(13C、15N、2H、125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga、111In等)的小分子。其他适用的部分是本领域中已知的。
适用于本发明的方法和多肽中的诊断部分的实例包括适于揭示疾病或病症的存在的可检测部分。通常，诊断部分允许确定与疾病或病症相关的分子(例如，靶肽、一种或多种蛋白质)的存在、不存在或水平。这些诊断剂也适用于预后和/或诊断疾病或病症和其进展。
适用于本发明的方法和多肽的治疗部分的实例包括例如抗炎剂、抗癌剂、抗神经退化剂和抗感染剂。功能部分还可具有一种或多种上述功能。
示例性治疗剂包括能够在核DNA中引起多链断裂并且因此适用于诱导细胞死亡(例如，癌症)的具有高能电离辐射的放射性核种。示例性高能放射性核种包括：90Y、125I、1311、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。这些同位素通常产生具有短路径长度的高能OC粒子或β粒子。这些放射性核种杀伤其紧密邻近的细胞，例如缀合物已连接或进入的赘生细胞。它们对非定位细胞几乎无影响或无影响并且是基本上非免疫原性的。
示例性治疗剂还包括细胞毒性剂，例如细胞抑制剂(例如烷基化剂、DNA合成抑制剂、DNA插入剂或交联剂、或DNA-RNA转录调控剂)、酶抑制剂、基因调控剂、细胞毒性核苷、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、抗血管生成剂等。
示例性治疗剂还包括烷基化剂，例如蒽环族药物(例如阿德力霉素、洋红霉素、环孢菌素A、氯喹、甲基蝶呤、光神霉素、泊非霉素(porfiromycin)、链霉素、泊非霉素、蒽二酮和氮丙啶)。在另一个实施方案中，化学治疗部分是细胞抑制剂，例如DNA合成抑制剂。DNA合成抑制剂的实例包括但不限于甲氨蝶呤和二氯甲氨蝶呤、3-氨基-1,2,4-苯并三嗪1,4-二氧化物、氨基蝶呤、胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷、5-氟-5'-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、更昔洛韦(ganciclovir)、羟基脲、放线菌素D和丝裂霉素C。示例性DNA插入剂或交联剂包括但不限于博来霉素(bleomycin)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺、顺二胺二氯化铂(II)(顺铂(cisplatin))、美法仑(melphalan)、米托蒽醌(mitoxantrone)和奥沙利铂(oxaliplatin)。示例性治疗剂还包括转录调控剂，例如放线菌素D、道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、高三尖杉酯碱(homoharringtonine)和伊达比星(idarubicin)。与本发明相容的其他示例性细胞抑制剂包括安莎霉素(ansamycin)苯醌、类醌衍生物(例如喹诺酮、染料木素(genistein)、细菌周期素(bactacyclin))、白消安(busulfan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、三嗪酮(triaziquone)、地吖醌(diaziquone)、咔唑醌(carbazilquinone)、吲哚醌(indoloquinone)EO9、二氮杂环丙基-苯醌甲基DZQ、三亚乙基磷酰胺和亚硝基脲化合物(例如卡莫司汀、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine))。
示例性治疗剂还包括细胞毒性核苷，例如阿糖腺苷、阿糖胞苷、阿糖胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿苷(floxuridine)、呋氟尿嘧啶(ftorafur)和6-巯基嘌呤；微管蛋白结合剂，例如紫杉醇(taxoid)(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、欧洲紫杉醇(docetaxel)、紫杉烷(taxane))、诺考达唑(nocodazole)、根霉素、多拉司他汀(dolastatin)(例如多拉司他汀-10、多拉司他汀-11或多拉司他汀-15)、秋水仙碱和秋水仙素(例如ZD6126)、考布他汀(Combretastatin)(例如考布他汀A-4、AVE-6032)和长春花生物碱(例如长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)(诺维本(navelbine)))；抗血管生成化合物，例如血管抑制素Kl-3、DL-α-二氟甲基-鸟氨酸、内皮抑素、烟曲霉素(fumagillin)、染料木素、米诺环素(minocycline)、星孢菌素(staurosporine)和(±)-沙利度胺(thalidomide)。示例性治疗剂还包括激素和激素拮抗剂，例如皮质类固醇(例如泼尼松(prednisone))、孕酮(例如羟孕酮(hydroxyprogesterone)或甲羟孕酮(medroprogesterone))、雌激素(例如己烯雌酚)、抗雌激素药(例如他莫昔芬(tamoxifen))、雄激素(例如睾酮(testosterone))、芳香酶抑制剂(例如胺鲁米特(aminogluthetimide))、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺、芹菜素(apigenin)、布雷菲尔德菌素(brefeldin)A、希美替定(cimetidine)、二氯亚甲基二膦酸、亮丙利德(leuprolide)(亮丙瑞林(leuprorelin))、黄体生成素释放激素、皮斐松(pifithrin)-α、雷帕霉素(rapamycin)、性激素结合球蛋白和毒胡萝卜素(thapsigargin)。
示例性治疗剂还包括酶抑制剂，例如S(+)-喜树碱、姜黄素、(-)-鱼藤素、5,6-二氯苯并咪唑1-β-D-呋喃核糖苷、伊妥普赛、福美坦、福司曲星、硬毛素、2-亚氨基-1-咪唑烷乙酸(环肌酸)、麦维诺素(mevinolin)、曲古抑菌素A、酪氨酸磷酸化抑素AG 34和酪氨酸磷酸化抑素AG 879。示例性治疗剂还包括基因调控剂，例如5-氮杂-2'-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、胆钙化醇(维生素D3)、4-羟基他莫昔芬、褪黑激素、米非司酮、雷洛昔芬、反式视黄醛(维生素A醛)、视黄酸、维生素A酸、9-顺-视黄酸、13-顺-视黄酸、视黄醇(维生素A)、他莫昔芬和曲格列酮。
示例性治疗剂还包括细胞毒性剂，例如蝶啶族药物、二炔类和鬼臼毒素类。那些类别中尤其适用的成员包括例如甲基蝶呤、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，例如伊妥普赛或磷酸伊妥普赛、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱等。
与本文中的教导相容的其他细胞毒素包括奥里斯他汀(auristatin)(例如奥里斯他汀E和单甲基奥里斯他汀E)、卡奇霉素(calicheamicin)、短杆菌肽D、类美登素(例如美登素)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、拓扑替康(topotecan)、紫杉烷、细胞分裂抑素B、溴化乙锭(ethidium bromide)、吐根碱(emetine)、替诺泊苷(tenoposide)、秋水仙碱、二羟基蒽二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)，以及其类似物或同源物。其他类型的功能部分是本领域中已知的，并且可基于本文中所包含的教导容易地用于本发明的方法和组合物中。
用于将上述功能部分、小分子、核酸、聚合物、肽、蛋白质、化学治疗剂或其他类型分子连接到特定氨基酸侧链的化学反应是本领域中已知的(关于特定接头的详细综述，参见例如Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press(1996))。
VIII.药物组合物
可将α4结合剂(例如具有稳定化Fc区的VLA-4结合抗体)配制为药物组合物。通常，药物组合物包括药学上可接受的载体。如本文中所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何不希望的毒理学作用的盐(参见例如Berge,S.M.等人,(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这些盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自以下酸的那些酸加成盐：无毒无机酸，例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸等；以及无毒有机酸，例如脂族单羧酸和二羧酸、被苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等。碱加成盐包括衍生自以下碱的那些碱加成盐：碱土金属，例如钠、钾、镁、钙等；以及无毒有机胺，例如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。
可根据本领域中已知的方法配制本文中所描述的抗体组合物。药物制剂是确立的技术，并且进一步描述于以下文献中：Gennaro(编),Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第20版,Lippincott,Williams&Wilkins(2000)(ISBN:0683306472)；Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版,Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN:0683305727)；和Kibbe(编),Handbook of Pharmaceutical Excipients American PharmaceuticalAssociation,第3版(2000)(ISBN:091733096X)。
在一个实施方案中，α4抗体可与例如氯化钠、七水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和聚山梨醇酯80的赋形剂材料一起配制。在另一个实施方案中，α4抗体可配制于柠檬酸盐缓冲液中，例如以pH 5、5.5、6、6.5、7或7.5。在另一个实施方案中，α4抗体可配制于包括2％、4％、5％、6％、8％、10％、12％、14％或15％蔗糖的溶液中。其可例如以约20mg/ml的浓度于缓冲溶液中提供，并且可储存在2-8℃下。
药物组合物还可呈多种其他形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如可注射溶液和可输注溶液)、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。所述形式可取决于预定施用模式和治疗应用。通常，本文所描述的剂的组合物呈可注射或可输注溶液形式。
这些组合物可通过肠胃外模式(例如，静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射)施用。如本文中所用的短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”意指除经肠和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
药物组合物在制造和储存条件下通常必须是无菌并且稳定的。还可测试药物组合物以确保其满足关于施用的法规和行业标准。
所述组合物可配制为溶液、微乳液、分散液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可通过将本文中所描述的剂以所需量视需要与以上所列举的成分中的一者或组合一起并入适当溶剂中，接着进行过滤灭菌来制备。一般来说，通过将本文中所描述的剂并入含有基础分散介质和来自以上列举的那些成分的其他所需成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，典型制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从而由其先前无菌过滤的溶液产生本文中所描述的剂加上任何其他所需成分的粉末。可例如通过使用例如卵磷脂的包覆剂、在分散液的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持溶液的适当流动性。可通过在组合物中包括吸收延迟剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来延长可注射组合物的吸收。
IX.施用
可通过多种方法将具有稳定化Fc区的α4结合抗体施用于受试者，例如人类受试者。对于许多应用，施用途径是以下之一：静脉内注射或输注、皮下注射或肌肉内注射。α4结合抗体可作为固定剂量或呈mg/kg剂量形式施用。抗体可经静脉内(IV)或皮下(SC)施用。举例来说，抗体可以约50-600mg IV之间(例如每4周)或约50-100mg SC(例如75mg)之间的固定单位剂量施用，例如，每周至少一次(例如每周两次)。在一个实施方案中，抗体以50mg、60mg、80mg、100mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、180mg、200mg、300mg、400mg、500mg或600mg或更大固定单位剂量经静脉内施用。静脉内剂量的施用可为每周一次或两次或三次或更多次，或者每两周、三周、四周或五周一次，或更低频率。
在一个实施方案中，抗体是以50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、100mg或120mg或更大固定单位剂量经皮下施用。皮下剂量的施用可为每周一次或两次或三次或更多次，或者每两周、三周、四周或五周一次，或更低频率。
具有稳定化Fc区的抗α4抗体还可以约1与10mg/kg之间，例如约6.0mg/kg、4.0mg/kg、3.0mg/kg、2.0mg/kg、1.0mg/kg的剂量呈药团形式施用。改进的剂量范围包括小于约600mg/受试者、约400mg/受试者、约300mg/受试者、约250mg/受试者、约200mg/受试者或约150mg/受试者的剂量，通常用于每第四周或每月施用一次。α4结合抗体可例如每三至五周，例如每四周或每个月施用。
可根据患者先前施用抗α4抗体的清除率来调节剂量。举例来说，在患者系统中的抗α4抗体水平降至预定水平以下之前，不能向患者施用第二或后续剂量。在一个实施方案中，测定来自患者的样品(例如，血浆、血清、血液、尿液或脑脊髓液(CSF))中抗α4抗体的存在，并且如果抗α4抗体水平高于预定水平，则将不向患者施用第二或后续剂量。如果患者系统中的抗α4抗体水平低于预定水平，则向患者施用第二或后续剂量。被测定抗α4水平过高(高于预定水平)的患者可在一天或二天或三天或一周之后再次测试，并且如果患者样品中的抗α4抗体水平已降至预定水平以下，则可向患者施用抗体的第二或后续剂量。
还可选择剂量以减少或避免产生针对α4结合抗体的抗体，以实现超过40％、50％、70％、75％或80％的α4亚单元饱和度，以实现低于80％、70％、60％、50％或40％的α4亚单元饱和度，或防止循环白细胞水平增高。
在某些实施方案中，活性剂可用将防止化合物快速释放的载体制备，例如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用生物可降解型生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备这些制剂的方法已取得专利或一般是已知的。参见例如Controlled Drug Delivery(Drugs and thePharmaceutical Sciences),第二版,J.Robinson和V.H.L.Lee编,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987。
药物组合物可用医疗装置施用。举例来说，药物组合物可用无针皮下注射装置，例如美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号、或第4,596,556号中所公开的装置来施用。众所周知的植入物和模块的实例论述于例如以下文献中：美国专利第4,487,603号，所述专利公开了一种用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利第4,486,194号，所述专利公开了一种经由皮肤施用药物的治疗装置；美国专利第4,447,233号，所述专利公开了一种用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，所述专利公开了一种用于连续药物递送的可变流量可植入输注装置；美国专利第4,439,196号，所述专利公开了一种具有多腔隔室的渗透性药物递送系统；和美国专利第4,475,196号，所述专利公开了一种渗透性药物递送系统。当然，许多其他的这种植入物、递送系统和模块也是已知的。
本发明还提供一种用于施用第一剂和第二剂的装置。所述装置可包括例如一个或多个用于储存药物制剂的外壳，并且可被配置成递送所述第一剂和第二剂的单位剂量。第一剂和第二剂可储存在相同或单独的隔室中。举例来说，所述装置可在施用之前将所述剂组合。也有可能使用不同的装置来施用第一剂和第二剂。
调节剂量方案以提供所需反应，例如治疗反应或组合治疗效果。一般来说，可使用VLA-4结合剂和第二剂的任何剂量组合(单独的或共同配制的)以便以生物可利用的量向受试者提供两种剂。
如本文中所用的剂量单位形式或“固定剂量”是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理离散单元；各单元含有经计算可与所需药物载体联合并且任选地与其他剂联合以产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。
药物组合物可包括“治疗有效量”的本文中所描述的剂。可基于所施用的第一剂和第二剂的组合效果来确定这些有效量。剂的治疗有效量还可根据例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及化合物在个体中引发所需反应(例如改善至少一个病症参数，例如多发性硬化症参数，或改善病症的至少一种症状，例如多发性硬化症的症状，例如肌肉萎缩、共济失调和震颤)的能力等因素而变化。治疗有效量也是组合物的治疗有益作用胜过任何毒性或不利作用的量。
X.装置和试剂盒
含有本文中所描述的抗体的制剂可用医疗装置施用。所述装置可设计为具有轻便性、室温储存和容易使用的特征，因此其可在紧急情况下使用，例如由未经训练的受试者或由现场应急人员移至医疗设施和其他医疗设备。所述装置可包括例如一个或多个用于储存包括α4结合抗体的药物制剂的外壳，并且可被配置以递送所述剂的一个或多个单位剂量。
举例来说，药物组合物可用透皮递送装置，例如注射器，包括皮下注射器或多腔注射器来施用。其他合适的递送装置包括支架、导管、微针和可植入控制释放装置。所述组合物可用有或无串联过滤器的标准静脉内设备，包括例如静脉内管而经静脉内施用。在某些实施方案中，所述装置将是用于皮下或肌肉内施用的注射器。
药物组合物可用医疗装置施用。举例来说，药物组合物可用无针皮下注射装置，例如美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号、或第4,596,556号中所公开的装置来施用。众所周知的植入物和模块的实例描述于例如以下文献中：美国专利第4,487,603号，所述专利公开了一种用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利第4,486,194号，所述专利公开了一种经由皮肤施用药物的治疗装置；美国专利第4,447,233号，所述专利公开了一种用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，所述专利公开了一种用于连续药物递送的可变流量可植入输注装置；美国专利第4,439,196号，所述专利公开了一种具有多腔隔室的渗透性药物递送系统；和美国专利第4,475,196号，所述专利公开了一种渗透性药物递送系统。治疗组合物还可呈生物可降解或非生物可降解型持续释放制剂形式用于皮下或肌肉内施用。用于这些组合物的方法是本领域中已知的。还可使用可植入泵或外部泵来实现连续施用。施用还可间歇性地进行，例如每日注射一次，或以低剂量持续进行，例如呈持续释放制剂形式。可改进递送装置以最佳地适于施用α4结合抗体。举例来说，注射器可被硅化至对抗体储存和递送来说最佳的程度。当然，许多其他的这类植入物、递送系统和模块也是已知的。
本发明还提供一种用于施用第一剂和第二剂(例如，抗体和第二剂)的装置。所述装置可包括例如一个或多个用于储存药物制剂的外壳，并且可被配置以递送所述第一剂和第二剂的单位剂量。第一剂和第二剂可储存在相同或单独的隔室中。在一个实施方案中，所述装置可在施用之前将所述剂组合。在一些实施方案中，第一剂和第二剂是通过不同的装置施用。
α4结合抗体可提供于试剂盒中。在一个实施方案中，所述试剂盒包括(a)含有包括高浓度VLA-4结合抗体的组合物的容器，任选地(b)含有包括第二剂的组合物的容器，和任选地(c)信息材料。信息材料可为描述材料、指导材料、营销材料或与本文中所描述的方法有关的其他材料和/或所述剂用于治疗益处的用法。在一个实施方案中，所述试剂盒还包括第二剂。举例来说，所述试剂盒包括含有包括α4结合抗体的组合物的第一容器和包括第二剂的第二容器。
试剂盒的信息材料在其形式方面不受限制。在一个实施方案中，信息材料可包括关于抗体产生、浓度、到期日、批次或生产现场信息等的信息。在一个实施方案中，信息材料涉及施用α4结合抗体的方法，例如以合适的剂量、剂型或施用模式(例如，本文中所描述的剂量、剂型或施用模式)进行，治疗患有急性病症(例如脊髓损伤或创伤性脑损伤)或发炎性疾病(例如，MS)或处在经历与发炎性疾病相关的急性发作风险下的受试者。信息可以各种形式提供，包括印刷文字、计算机可读材料、视频记录或音频记录，或提供真实材料的链接或地址的信息。
除剂以外，试剂盒中的组合物可包括其他成分，例如溶剂或缓冲剂、稳定剂或防腐剂。所述剂可以任何形式提供，例如液体、干燥或冻干形式，并且是基本上纯和/或无菌的。当剂以液体溶液形式提供时，液体溶液通常是水溶液。当剂以干燥形式提供时，一般通过添加合适的溶剂来重构。可任选地在试剂盒中提供溶剂，例如无菌水或缓冲液。
试剂盒可包括针对含有所述剂的一种或多种组合物的一个或多个容器。在一些实施方案中，所述试剂盒含有针对组合物和信息材料的单独容器、分配器或隔室。举例来说，组合物可容纳于瓶、小瓶或注射器中，而信息材料可包含在塑料套管或包装中。在其他实施方案中，试剂盒的单独元件包含在单个未分开容器内。举例来说，组合物包含在贴有呈卷标形式的信息材料的瓶、小瓶或注射器中。在一些实施方案中，所述试剂盒包括多个(例如，一包)单独的容器，各容器含有所述剂的一个或多个单位剂型(例如，本文中所描述的剂型)。所述容器可包括组合单位剂量，例如包括α4结合抗体和第二剂的单元，例如以所需比率。举例来说，所述试剂盒可包括多个注射器、安瓿、箔包、泡罩包装或医疗装置，各自含有例如单一组合单位剂量。试剂盒的容器可为气密性、防水(例如，不透水分变化或蒸发)和/或不透光。
试剂盒任选地包括适于施用组合物的装置，例如注射器或其他合适的递送装置。所述装置可预装所述剂的一者或两者，或者可为空的但适于装载。
XI.肿瘤学
本文中所描述的α4结合抗体和方法可用于治疗癌症，包括实体癌和血液学恶性病。示例性实体癌包括肉瘤和癌瘤，例如肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌和脑癌。血液学恶性病包括癌症，例如多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。
提供用含有α4结合抗体，例如本文中所描述的抗VLA-4抗体的组合物治疗患有血液学恶性病的患者的方法。血液学恶性病是体内血液形成和免疫系统癌症。这种类型的癌症影响血液、骨髓和/或淋巴结。血液学恶性病包括白血病，例如急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性前骨髓细胞性白血病、急性红白血病和毛细胞白血病(HCL)；淋巴瘤，例如霍奇金氏病和非霍奇金氏淋巴瘤；和多发性骨髓瘤；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroblobulinemia)；骨髓发育不良综合征(MDS)(其最终导致AML)；骨髓增生性疾病，例如真性红血球增多症(也称为PV、PCV或真性红血球增多症(PRV))、原生性血小板增多症(ET)、骨髓纤维化、重链病；由轻链病引起的淀粉样病变。
可通过以例如可用于鉴定恶性细胞的光学显微术分析血球计数和血膜来鉴定患有血液学恶性病的患者。还可使用例如来自骨髓的活组织切片来鉴定恶性细胞，并且来自淋巴结的活组织切片可用于鉴定淋巴结病。
α4结合抗体(例如，人源化抗VLA-4抗体，例如HuHP1/2、H1L0、H1L1、H1L2或H1L3)可用于治疗白血病，例如AML。白血病是起源于骨髓的癌症，其中恶性细胞是白细胞(白血球)。AML(也称为急性髓细胞性白血病、急性髓母细胞性白血病、急性粒细胞性白血病和急性非淋巴细胞性白血病)是粒细胞或单核细胞中发生的恶性病。AML的特征为不能发挥正常血细胞的功能并且阻断正常骨髓细胞的产生，从而导致血液中缺乏红细胞(贫血)和血小板(血小板减少症)和正常白细胞(尤其嗜中性白细胞，即嗜中性白细胞减少症)的细胞(被称为白血病母细胞)的不受控制性过度生长和积聚。
所有AML亚型均适于用VLA-4结合抗体进行治疗。AML亚型是基于诊断时骨髓母细胞已达到的发育阶段进行分类。类别和子集允许医师决定何种治疗最适合所述细胞类型以及疾病发展的快速程度。所述子集为：M0，骨髓母细胞，进行特殊分析；M1，骨髓母细胞，未成熟；M2，骨髓母细胞，成熟；M3，前髓细胞；M4，骨髓单核细胞；M5，单核细胞；M6，红白血病；和M7，巨核细胞。VLA-4抗体可与特别适于AML亚型的第二剂一起施用。举例来说，急性前骨髓细胞性白血病(APL)和急性单核细胞性白血病是需要与其他AML亚型不同的治疗的AML亚型。用于治疗APL的第二剂可包括全反式视黄酸(ATRA)或抗代谢物，例如阿糖胞苷。用于治疗急性单核细胞性白血病的第二剂可包括脱氧腺苷类似物，例如2-氯-2'-脱氧腺苷(2-CDA)。
AML的风险因素包括存在某些遗传性病症，例如唐氏综合征(Down syndrome)、范可尼贫血症(Fanconi anemia)、舒-戴二氏综合征(Shwachman-Diamond syndrome)和其他病症。患有AML和遗传性病症的患者可被施用VLA-4结合抗体和第二剂以治疗所述遗传性病症的症状。举例来说，患有AML和范可尼贫血症的患者可被施用VLA-4结合抗体和抗生素。
AML的其他风险因素包括用于治疗不同癌症的化学疗法或放射疗法、抽烟和暴露于大量苯。
适合用α4结合抗体治疗的其他癌症包括实体肿瘤，例如肉瘤和癌瘤(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤)、尤文氏肿瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏瘤(Wilm's tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、小细胞肺癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、骨髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、寡突神经胶质瘤、许旺氏细胞瘤(schwannoma)、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
XII.其他病症
本文中所描述的制剂和方法还可用于治疗其他发炎性、免疫性或自身免疫性病症，例如中枢神经系统炎症(例如，除多发性硬化症、脑膜炎、视神经脊髓炎、神经结节病、CNS血管炎、脑炎和横贯性脊髓炎以外)；组织或器官移植物排斥反应或移植物抗宿主病；急性CNS损伤，例如中风或脊髓损伤(SCI)；慢性肾病；过敏症，例如过敏性哮喘、中度至重度过敏性鼻炎、眼部过敏；1型糖尿病；发炎性肠病，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎(例如，用于治疗或维持缓解)；癫痫症；嗜酸性细胞性胃肠炎；重症肌无力；纤维肌痛；与风湿病学/免疫学相关的病症，例如关节炎性病症，例如类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎；皮肤病学病症，例如发炎性/免疫性皮肤病症，例如牛皮癣、白癜风、皮炎(例如异位性皮炎)、扁平苔癣、中度至重度慢性荨麻疹；系统性红斑狼疮(SLE；例如，狼疮性肾炎)；硬皮病(例如，进行性全身性硬化(PSS)，例如肺PSS)；急性或慢性原发性嗜酸性细胞性肺炎；休格伦氏综合征(Sjogren's Syndrome)；急性冠状动脉综合征(ACS)；急性心肌梗塞；动脉粥样硬化；和纤维化病症，例如肺纤维化(例如，特发性肺纤维化)、肺部纤维化(例如，XRT诱导型)、骨髓纤维化、肝硬化、肾小球膜增生性肾小球性肾炎、新月体性肾小球肾炎、糖尿病性肾病和肾间质纤维化。在一个优选实施方案中，所述制剂可用于治疗癫痫症。
本文中所描述的制剂和方法还可用于治疗神经系统病症，例如大脑局部缺血，包括在患者中预防短暂性局部缺血性发作和/或动脉狭窄。其他示例性神经系统病症包括慢性发炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)；格林-巴利综合征(Guillian-Barre Syndrome，GBS)；眼部疾病，例如黄斑变性(例如，湿性黄斑变性)和前部缺血性视神经病变；神经性疼痛(例如，症状性神经性疼痛)；阿尔茨海默病；肌萎缩性侧索硬化症(ALS)(例如，疾病调节性ALS)和帕金森病。
本文中所描述的制剂和方法还可用于治疗已进行移植，例如肾、心脏或骨髓移植的患者。
XIII.多发性硬化症
含有本文中所描述的α4结合抗体的制剂可用于治疗发炎性疾病，例如多发性硬化症(MS)。多发性硬化症是以炎症和髓鞘丧失为特征的中枢神经系统疾病。
可通过如MS诊断研讨会所定义的确定临床确定性MS的诊断的标准来鉴定患有MS的患者(Poser等人,Ann.Neurol.13:227,1983)。举例来说，患有临床确定性MS的个体必须具有两次发作和两个病变的临床证据或一个病变的临床证据和另一独立病变的近似临床证据。确定性MS还可通过两次发作和脑脊髓液中IgG低聚克隆带的证据或通过发作、两个病变的临床证据和脑脊髓液中IgG低聚克隆带的组合来诊断。还可使用McDonald标准来诊断MS。(McDonald等人,2001,“Recommended diagnostic criteria for multiplesclerosis:guidelines from the International Panel on the Diagnosis ofMultiple Sclerosis,”Ann.Neurol.50:121-127)。McDonald标准包括在不存在多次临床发作的情况下使用要用于诊断MS的一定时间内CNS损伤的MRI证据来诊断MS。可用若干种不同的方式评估多发性硬化症的有效治疗。可使用以下参数衡量治疗有效性。两个示例性标准包括：EDSS(扩展型失能状态量表)以及MRI(磁共振成像)上出现恶化。EDSS是用于对由于MS引起的临床损伤进行分级的方法(Kurtzke,Neurology 33:1444,1983)。评估八种功能系统的神经损伤类型和严重程度。简言之，在治疗之前，评估患者在以下系统中的损伤：锥体、小脑、脑干、感觉、肠和膀胱、视觉、大脑和其他。在限定间隔进行随访。量表在0(正常)至10(由于MS导致死亡)的范围内。减少一个完整步骤指示有效治疗(Kurtzke,Ann.Neurol.36:573-79,1994)。还可使用本领域技术人员使用的其他标准来诊断患者。
恶化定义为出现可归因于MS的新症状并且伴有适当新神经异常(IFNB MS研究组,同上)。另外，恶化必须持续至少24小时，并且在稳定或改进之前持续至少30天。简言之，由临床医师对患者进行标准神经系统检查。根据神经学分级量表的变化，恶化为轻度、中度或重度(Sipe等人,Neurology 34:1368,1984)。确定年度恶化率和无恶化患者的比例。
对于这些测量中的任一者，如果治疗组与安慰剂组之间在无恶化或无复发患者的比率或比例方面存在统计上显著的差异，则可认为治疗是有效的。另外，还可测量首次恶化的时间以及恶化持续时间和严重程度。就此而言，治疗有效性的量度是治疗组与对照组相比在首次恶化时间或持续时间和严重程度方面存在统计上显著的差异。无恶化或无复发时段超过一年、18个月或20个月尤其值得注意。还可使用本领域中使用的任何方法来评定功效，例如以评定MS的症状，包括使用单独或与其他标准组合使用的计时步行测试评定活动性改进。
还可基于以下标准中的一者或多者来评估施用第一剂和任选地第二剂的功效：通过有限稀释测定的MBP反应性T细胞的频率、MBP反应性T细胞系和克隆的增殖反应、从患者建立的T细胞系和克隆对MBP的细胞因子概况。通过反应细胞频率降低、与天然细胞相比存在胸苷并入减少与肽改变以及TNF和IFN-α减少来指示功效。
临床测量结果包括一年和两年间隔内的复发率，以及EDSS的变化，包括持续六个月的EDSS从基线进展1.0单位的时间。在Kaplan-Meier曲线上，失能持续进展的延迟显示功效。其他标准包括MRI上T2影像的面积和体积的变化，以及由钆增强影像确定的病变数目和体积。
MRI可用于使用钆-DTPA增强成像测量活动性病变(McDonald等人,Ann.Neurol.36:14,1994)或使用T2加权技术测量病变位置和程度。简言之，获得基线MRI。各后续研究使用相同成像平面和患者位置。可选择定位和成像序列以使病变检测优化并有助于病变追踪。相同定位和成像序列可用于后续研究。放射科医师可确定MS病变的存在、位置和程度。可概述病变区域并针对总病变区域逐片求和。可进行三种分析：新病变证据、活动性病变出现率、病变区域变化百分比(Paty等人,Neurology 43:665,1993)。由于治疗实现的改进可由个别患者中与基线相比或治疗组相对于安慰剂组中存在统计学上显著的改进来确定。
可用本文中所描述的方法治疗的与多发性硬化症相关的示例性症状包括：视神经炎、复视、眼球震颤、眼辨距不良、核间性眼肌麻痹、动作和声音光幻视、瞳孔传入缺陷、局部麻痹、单肢轻瘫、下肢轻瘫、轻偏瘫、四肢轻瘫、瘫痪、截瘫、偏瘫、四肢瘫痪、四肢麻痹、痉挛、构音障碍、肌肉萎缩、肌痉挛、抽筋、肌张力低下、阵挛、肌阵挛、肌纤维震颤、不宁腿综合征、足下垂、反射功能障碍、感觉异常、麻木、神经痛、神经病理性和神经原性疼痛、拉赫米特氏病征(l'hermitte's)、本体感受性功能障碍、三叉神经痛、运动失调、意向性震颤、辨距不良、前庭性共济失调、眩晕、语言共济失调、张力障碍、轮替运动障碍、频繁排尿、膀胱痉挛、弛缓性膀胱、逼尿肌-括约肌协同失调、勃起功能障碍、性快感缺乏、性冷淡、便秘、便急、大便失禁、抑郁、认知功能障碍、痴呆、情绪起伏、情绪不稳、欣快症、双极性综合征、焦虑、失语症、语言障碍、疲劳、乌特霍夫氏症状、胃食道回流和睡眠障碍。
各MS病例显示若干呈递模式和后续过程之一。最通常地，MS首先将自身体现为一系列发作，接着是完全或部分缓解，因为症状会神秘地减轻，仅在稳定一段时间后方能恢复。这称为复发性缓解性(RR)MS。临床孤立综合征(CIS)是MS的另一种复发形式。CIS是指首先急性发作持续至少24小时的神经系统症状并且由中枢神经系统(CNS)中的炎症或脱髓鞘(覆盖神经细胞的髓鞘脱落)引起。原发性进行性(PP)MS的特征在于平缓临床减轻而无明显缓解，但可能存在暂时性平台期或轻微症状缓解。当患者经历偶发性复发或MRI上有新病变的证据时发生活动性原发性进行性MS。“不活动”或“有进展”意指有证据表明症状随时间而恶化，有或无复发或MRI上显示有或无新病变。继发性进行性(SP)MS开始于复发性缓解性过程，接着是稍后原发性进行性过程。活动性继发性进行性MS被视为MS的复发形式之一。少数情况下，患者可存在进行性复发性(PR)过程，其中所述疾病采取进行性途径间杂急性发作。PP、SP和PR有时归并在一起并且称为慢性进行性MS。
因而，多发性硬化症的复发形式(或简称为复发性多发性硬化症)包括但不限于临床孤立综合征(CIS)、复发性缓解性多发性硬化症(RRMS)和活动性继发性进行性多发性硬化症(活动性SPMS)。
少数患者经历恶性MS，定义为迅速不间断衰退，从而引起疾病发作后不久便严重失能或甚至死亡。可通过施用本文中所描述的疗法而使这种衰退停滞或减速。
施用本文中所提供的抗α4抗体可有效缓解MS的一种或多种症状，例如以上所描述的一种或多种症状。举例来说，施用本文中所描述的抗α4抗体可用于治疗原发性或继发性进行性多发性硬化症(分别为PPMS或SPMS)，并且用抗α4抗体治疗可对预防复发有效。
除人类研究以外或在进行人类研究之前，可使用动物模型来评估使用两种剂的功效。用于多发性硬化症的示例性动物模型是实验性自身免疫性脑炎(EAE)小鼠模型，例如，如(Tuohy等人,(J.Immunol.(1988)141:1126-1130)、Sobel等人,(J.Immunol.(1984)132:2393-2401)和Traugott(Cell Immunol.(1989)119:114-129)中所描述。在EAE诱导之前，可向小鼠施用本文中所描述的第一剂和第二剂。随后针对特征标准对小鼠进行评估以确定在模型中使用两种剂的功效。
XIV.癫痫症
含有本文中所描述的α4结合抗体的制剂适用于治疗癫痫症。
癫痫发作是由可通过脑电图或临床手段检测的异常放电神经元引起的阵发性发作，其中脑中受影响的特定部位影响临床表达。癫痫发作根本上起因于神经元的基本兴奋性不平衡，这可能与神经元膜或兴奋性和抑制性过程有关。也参见Holmes等人,Epilepsia45(12):1568-1579,2004)。癫痫症在概念上定义为脑病症，其特征在于产生癫痫发作的持久素因以及这种疾患的神经生物学、认知、心理学和社会后果(Fisher R.S.,Curr OpinNeurol.28(2):130-5,2015)。最近对癫痫症盛行率和发病率的综述报道终生盛行率是每1000人有7.6人，并且年度累积发病率是每100,000人中67.77人(Fiest等人,Neurology 88(3):296-303,2017)。
在本发明之前，用于癫痫症患者的常用疗法是抗癫痫症药物(AED)，并且估计大约70％的患者利用AED疗法实现良好癫痫发作控制。将未能耐受2次(或更多次)充分试验并且适当地选择并使用AED的患者定义为患有耐药性癫痫症(参见Kwan等人,Epilepsia.51(6):1069-77,2010；和erratum in Epilepsia.51(9):1922,2010)。对于这些患者，考虑其他疗法，包括癫痫症手术、神经刺激装置、专门化饮食、行为疗法和其他实验性治疗。AED通常通过调节电压依赖性或配体闸控离子通道或通过对抑制性或兴奋性神经递质系统的作用来起作用。目前，存在超过20种可购得的AED。尽管近年已推出许多更新的AED，但新老药物在控制癫痫症方面大体上同样有效，并且仍然很少有先前耐药性癫痫症患者因利用更新的疗法而变得无癫痫发作。
对开发可在耐药性癫痫症中改进癫痫发作控制或消除癫痫发作的疗法的需要仍然亟待满足。靶向免疫系统和炎症在癫痫症发病机制中的潜在作用代表AED开发和临床研究中未充分研究的领域。来自癫痫症实验模型和人类癫痫症患者的证据表明对炎症的作用。
本文中所公开的制剂可用于治疗癫痫症。举例来说，可向患有癫痫症的患者施用包含重组抗α4抗体或其α4结合片段的制剂，所述抗体或其片段包含：(a)含有SEQ ID NO:80的序列的重链；和(b)含有SEQ ID NO:81的序列的轻链。假定阻断α4整合素将减少白细胞-血管相互作用并且使BBB完整性稳定。另外，假设由癫痫发作诱导的癫痫症减轻白细胞-血管相互作用将降低癫痫发作频率和严重程度。
XV.抗体产生
可通过体内或体外方法，例如噬菌体展示来产生结合到α4的重组抗体。所述方法可用于提供抗α4CDR以用于本文中所描述的CDR移植抗体中。另外，在本文中所公开的种系框架的情况下可使用例如噬菌体展示的方法来选择这些CDR，例如通过使用框架为种系框架的文库。
EP 239 400(Winter等人)描述通过将一个物种的互补决定区(CDR)取代(在给定可变区内)为另一物种的互补决定区来改变抗体。CDR取代抗体与真嵌合抗体相比不太可能在人类中引发免疫反应，因为CDR取代抗体含有显著较少的非人类组分。(Riechmann等人,1988,Nature 332,323-327；Verhoeyen等人,1988,Science 239,1534-1536)。通常，通过使用重组核酸技术将鼠类抗体的CDR取代至人类抗体中的相应区域中以产生编码所需被取代抗体的序列。可添加所需同种型(通常，对于CH为γI并且对于CL为κ)的人类恒定区基因区段，并且可在哺乳动物细胞中共表达重链和轻链基因以产生可溶性抗体。大型非免疫噬菌体展示文库还可用于分离高亲和力抗体，可使用标准噬菌体技术将其开发为人类治疗剂(参见例如Hoogenboom等人,(1998)Immunotechnology 4:1-20；和Hoogenboom等人,(2000)Immunol Today 2:371-8；U.S.2003-0232333)。
本文中所描述的抗α4抗体或抗体片段可识别并特异性地结合到α4亚单元中参与结合到同源配体例如VCAM-1或纤维连接蛋白的抗原。在一些实施方案中，抗α4抗体或其抗体片段识别并特异性地结合到α4整合素的B表位。本文中所描述的抗体的结合可抑制α4整合素结合到一个或多个同源配体(例如VCAM-1和纤维连接蛋白)。
在一些实施方案中，本文中所提供的抗体可与细胞(例如淋巴细胞)上的VLA-4相互作用，但不会引起细胞聚集。
示例性α4结合抗体具有一个或多个CDR，例如，本文中所公开的特定抗体的所有三个重链(HC)CDR和/或所有三个轻链(LC)CDR，或者总体上与这种抗体具有至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的CDR。在一个实施方案中，H1和H2高变环具有与本文中所描述的抗体相同的典型结构。在一个实施方案中，L1和L2高变环具有与本文中所描述的抗体相同的典型结构。
在一个实施方案中，HC和/或LC可变域序列的氨基酸序列与本文中所描述的抗体的HC和/或LC可变域的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。HC和/或LC可变域序列的氨基酸序列可与本文中所描述的抗体的相应序列相差至少一个氨基酸，但不超过十、八、六、五、四、三或二个氨基酸。举例来说，差异可能主要或完全在框架区中。
HC和LC可变域序列的氨基酸序列可由在高严格度条件下与本文中所描述的核酸序列杂交的核酸序列或者编码本文中所描述的可变域或氨基酸序列的核酸序列编码。在一个实施方案中，HC和/或LC可变域的一个或多个框架区(例如，FR1、FR2、FR3和/或FR4)的氨基酸序列与本文中所描述的抗体的HC和LC可变域的相应框架区具有至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。在一个实施方案中，一个或多个重链或轻链框架区(例如，HC FR1、FR2和FR3)与来自人类种系抗体的相应框架区的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或100％同一性。
如下计算两个序列之间的“同源性”或“序列同一性”(所述术语在本文中可互换使用)。出于最佳比较目的将序列比对(例如，可在第一和第二氨基酸或核酸序列的一者或两者中引入空位以实现最佳比对，并且出于比较目的，可忽略非同源序列)。使用GCG软件包中的GAP程序以Blossum 62评分矩阵将最佳比对确定为最佳评分，其中空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且框移空位罚分为5。随后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占用时，则所述分子在所述位置上同一(如本文中所用，氨基酸或核酸“同一性”等效于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是所述序列共有的同一位置数目的函数。
如本文中所用，术语“在高严格度条件下杂交”描述杂交和洗涤的条件。关于进行杂交反应的指导可见于Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中，所述参考文献通过引用并入。所述参考文献中描述水性和非水性方法，并且可使用任一种。高严格度杂交条件包括在约45℃下在6X SSC中杂交，接着在65℃下在0.2X SSC、0.1％SDS中或基本上相似的条件下进行一次或多次洗涤。
XVI.抗体产生
可在原核生物和真核生物细胞中产生抗体。在一个实施方案中，抗体(例如scFv)表达于例如毕赤酵母(Pichia)(参见例如Powers等人,(2001)J.Immunol.Methods 251:123-35)、汉逊酵母(Hanseula)或酵母菌(Saccharomyces)的酵母细胞中。
在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中产生抗体，特别是全长抗体，例如IgG。用于重组表达的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中，与DHFR可选择标志物一起使用，例如，如Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中所描述)，淋巴细胞系，例如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞、K562，和来自转基因动物例如转基因哺乳动物的细胞。举例来说，所述细胞是乳房上皮细胞。
除编码免疫球蛋白结构域的核酸序列以外，重组表达载体还可携带额外核酸序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和可选择标记基因。可选择标记基因有助于选择已引入载体的宿主细胞(参见例如美国专利第4,399,216号、第4,634,665号和第5,179,017号)。示例性可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中用于甲氨蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
在用于重组表达抗体(例如，全长抗体或其抗原结合部分)的示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链二者的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接到增强子/启动子调控元件(例如，来源于SV40、CMV、腺病毒等，例如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)以驱动所述基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已转染有所述载体的CHO细胞。培养所选择的转化宿主细胞以允许表达抗体重链和轻链，并且从培养基中回收完整抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化株，培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。举例来说，一些抗体可通过用蛋白A或蛋白G进行亲和色谱来分离。举例来说，可使用本领域中已知的蛋白质浓缩技术将纯化的α4结合抗体浓缩至约100mg/mL至约200mg/mL。
抗体还可包括修饰，例如改变Fc功能的修饰，例如以减少或移除与Fc受体或与C1q或两者的相互作用。举例来说，人类IgG4恒定区可在残基228处具有Ser至Pro突变以固定铰链区。IgG4 Fc(铰链+CH2+CH3结构域)的氨基酸序列提供于图5中。
在另一个实例中，人类IgG1恒定区可在一个或多个残基，例如残基234和237中的一者或多者处突变，例如，根据美国专利第5,648,260号的编号。其他示例性修饰包括美国专利第5,648,260号中所描述的修饰。
对于包括Fc结构域的一些抗体，可设计抗体产生系统以合成Fc区被糖基化的抗体。在另一个实例中，IgG分子的Fc结构域在CH2结构域中的天冬酰胺297处被糖基化(参见图5)。这个天冬酰胺是用双触角型低聚糖修饰的位点。该糖基化参与由Fcγ受体和补体C1q介导的效应功能(Burton和Woof,(1992)Adv.Immunol.51:1-84；Jefferis等人,(1998)Immunol.Rev.163:59-76)。可在适当地使对应于天冬酰胺297的残基糖基化的哺乳动物表达系统中产生Fc结构域。Fc结构域还可包括其他真核翻译后修饰。
其他合适的Fc结构域修饰包括WO2004/029207中所描述的那些修饰。举例来说，Fc结构域可为
Figure GDA0003031568410001201
Fc(Xencor，Monrovia，CA)。Fc结构域或其片段可在Fcγ受体(FcγR)结合区中具有取代，例如WO05/063815中所描述的结构域和片段。在一些实施方案中，Fc结构域或其片段在新生儿Fc受体(FcRn)结合区中具有取代，例如WO05047327中所描述的结构域和片段。在其他实施方案中，Fc结构域是单链或其片段，或其修饰形式，例如WO2008143954中所描述的那些。其他合适的Fc修饰是已知的并且描述于本领域中。
还可由转基因动物产生抗体。举例来说，美国专利第5,849,992号描述了一种在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建包括乳汁特异性启动子和编码相关抗体(例如本文中所描述的抗体)的核酸序列以及分泌信号序列的转基因。由这些转基因哺乳动物中的雌性产生的乳汁包括其中分泌的相关抗体，例如本文中所描述的抗体。可从乳汁中纯化抗体，或对于一些应用，直接使用。
抗体可被修饰，例如，具有使其稳定化和/或在循环中例如在血液、血清、淋巴、支气管肺泡灌洗液或其他组织中的保留时间提高例如至少1.5、2、5、10或50倍的部分。
举例来说，VLA-4结合抗体可与聚合物缔合，例如基本上非抗原性聚合物，例如聚环氧烷或聚氧化乙烯。合适的聚合物将基本上按重量而变化。可使用数目平均分子量在约200至约35,000道尔顿(或约1,000至约15,000和2,000至约12,500)范围内的聚合物。
举例来说，VLA-4结合抗体可缀合到水溶性聚合物，例如亲水性聚乙烯聚合物，例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。这些聚合物的非限制性列表包括聚环氧烷均聚物，例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，条件为维持嵌段共聚物的水溶解性。其他适用聚合物包括聚氧化烯，例如聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧乙烯与聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆(carbomer)；支链或无支链多糖，包含糖单体D-甘露糖、D-半乳糖和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如，聚甘露糖酸或海藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经胺糖酸，包括同多糖和异多糖，例如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸葡聚糖、聚葡萄糖、糊精、糖原或酸性粘多糖的多糖亚单元，例如透明质酸；糖醇聚合物，例如聚山梨糖醇和聚甘露糖醇；肝素或类肝素(heparon)。
XVII.示例性第二剂
在一些情况下，本文中所描述的制剂，例如含有α4结合抗体的制剂，包括第二剂，或与含第二剂的制剂组合施用。
在一个实施方式中，将α4结合抗体和第二剂以共制剂形式提供，并且将所述共制剂施用于受试者。此外有可能例如在施用共制剂前后至少24小时分别施用一个剂量的α4结合抗体制剂，然后施用一个剂量的含第二剂的制剂。在另一个实施方式中，将抗体和第二剂以单独制剂形式提供，并且施用步骤包括依序施用抗体和第二剂。依序施用可在同一天(例如，彼此相隔一小时内或相隔至少3、6或12小时)或在不同的日期提供。
一般来说，所述抗体和所述第二剂各自以时间上分开的多个剂量施用。所述抗体和所述第二剂一般各自根据方案施用。用于一者或二者的方案可具有规律周期性。用于抗体的方案可具有与用于第二剂的方案不同的周期性，例如，一者可比另一者更频繁地施用。在一种实现方式中，所述抗体和所述第二剂中的一者每周施用一次并且另一者每个月施用一次。在另一个实施方式中，所述抗体和所述第二剂中的一者连续施用，例如，在超过30分钟但不足1、2、4或12小时的时段内，并且另一者呈药团形式施用。所述抗体和所述第二剂可通过任何适当的方法，例如皮下、肌肉内或静脉内施用。
在一些实施方案中，所述抗体和所述第二剂各自以与各自用于单一疗法时的处方剂量相同的剂量施用。在其他实施方案中，以等于或小于单独施用时实现功效所需的量的剂量施用所述抗体。同样，可以等于或小于单独施用时实现功效所需的量的剂量施用所述第二剂。
与α4结合抗体组合用于治疗多发性硬化症的第二剂的非限制性实例包括：
■干扰素，例如人类干扰素β-1a(例如
Figure GDA0003031568410001221
或
Figure GDA0003031568410001222
))和干扰素β-1b(BETASERONTM；在第17位被取代的人类干扰素β；Berlex/Chiron)；
■醋酸格拉替雷(也称为共聚物1、Cop-1；COPAXONETM；Teva PharmaceuticalIndustries,Inc.)；
■
Figure GDA0003031568410001238
(利妥昔单抗(rituximab))或另一抗CD20抗体，包括与利妥昔单抗竞争或结合重叠表位的抗体；
■米托蒽醌(mixtoxantrone)(
Figure GDA0003031568410001231
Lederle)；
■髓鞘再生剂，例如奥匹奴单抗(opicinumab)；
■化学治疗剂，例如克拉屈滨(clabribine)
Figure GDA0003031568410001232
硫唑嘌呤
Figure GDA0003031568410001233
环磷酰胺
Figure GDA0003031568410001234
环孢霉素-A、甲氨蝶呤、4-氨基吡啶和替扎尼定(tizanidine)；
■皮质类固醇，例如，甲基泼尼松龙(
Figure GDA0003031568410001235
Pfizer)、泼尼松；
■免疫球蛋白，例如
Figure GDA0003031568410001236
(利妥昔单抗)；CTLA4Ig；阿仑单抗
Figure GDA0003031568410001237
或达利珠单抗(结合CD25的抗体)；
■他汀类药物；和
■TNF拮抗剂。
醋酸格拉替雷是由氨基酸谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸和酪氨酸的无规链形成的蛋白质(因此为GLATiramer)。醋酸格拉替雷可使用N-羧基氨基酸酐由这些氨基酸以约5份丙氨酸对3份赖氨酸、1.5份谷氨酸和1份酪氨酸的比率在溶液中合成。
额外第二剂包括其他人类细胞因子或生长因子，例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-11、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体或拮抗剂。其他示例性第二剂包括针对例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配体的细胞表面分子的抗体。举例来说，达利珠单抗是可改善多发性硬化症的抗CD25抗体。
其他示例性抗体包括提供本文中所描述的剂的活性的抗体，例如接合干扰素受体，例如干扰素β受体的抗体。通常，在第二剂包括抗体的实现方式中，其特异性结合到除VLA-4以外或除α4整合素以外的靶蛋白，或至少特异性结合到VLA-4上的表位而非由第一剂识别并特异性地结合的表位。
其他额外示例性第二剂包括：FK506、雷帕霉素、霉酚酸、来氟米特；非类固醇抗炎药(NSAID)，例如磷酸二酯酶抑制剂；腺苷激动剂、抗血栓剂、补体抑制剂、肾上腺素激导剂、干扰如本文中所描述的促炎性细胞因子的信号传导的剂、IL-1β转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7、PSGL、TACE抑制剂；T细胞信号传导抑制剂，例如本文中所描述的激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体和其衍生物；抗炎性细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13和TGF)。
在一些实施方案中，第二剂可用于治疗MS的一种或多种症状或副作用。所述剂包括例如金刚胺、巴氯芬(baclofen)、罂粟碱(papaverine)、氯苯甲嗪(meclizine)、羟嗪、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、环丙沙星(ciprofloxacin)、多库酯(docusate)、佩默林(pemoline)、丹曲林(dantrolene)、去胺加压素(desmopressin)、地塞米松(dexamethasone)、托特罗定(tolterodine)、苯妥英(phenyloin)、奥昔布宁(oxybutynin)、比沙可啶(bisacodyl)、文拉法辛(venlafaxine)、阿米替林(amitriptyline)、六亚甲基四胺(methenamine)、氯硝西泮(clonazepam)、异烟肼(isoniazid)、伐地那非(vardenafil)、硝化呋喃妥英(nitrofurantoin)、车前子亲水胶浆(psyllium hydrophilic mucilloid)、前列地尔(alprostadil)、加巴喷丁(gabapentin)、去甲替林(nortriptyline)、帕罗西汀(paroxetine)、溴丙胺太林(propantheline bromide)、莫待芬宁(modafinil)、费洛克汀(fluoxetine)、非那吡啶(phenazopyridine)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、卡马西平(carbamazepine)、伊米胺(imipramine)、二氮平(diazepam)、西地那非(sildenafil)、安非他酮(bupropion)和舍曲林(sertraline)。许多作为小分子的第二剂具有介于150与5000道尔顿之间的分子量。
TNF拮抗剂的实例包括针对TNF(例如人类TNFα)的嵌合、人源化、人类或体外产生抗体(或其抗原结合片段)，例如D2E7(人类TNFα抗体，美国专利第6,258,562号；BASF)、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗体；Celltech/Pharmacia)、cA2(嵌合抗TNFα抗体；REMICADETM，Centocor)；抗TNF抗体片段(例如CPD870)；TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人类TNF受体或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBRELTM；Immunex；参见例如Arthritis&Rheumatism(1994)第37卷,S295；J.Invest.Med.(1996)第44卷,235A)、p55 kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白(LENERCEPTTM))；酶拮抗剂，例如TNFα转化酶(TACE)抑制剂(例如，α-磺酰基异羟肟酸衍生物，WO 01/55112和N-羟基甲酰胺TACE抑制剂GW 3333、GW-005或GW-022)；和TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白；参见例如Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷,第9期(增刊),S284；Amer.J.Physiol.-Heart andCirculatory Physiology(1995)第268卷,第37-42页)。
除第二剂以外，还有可能向所述受试者递送其他剂。然而，在一些实施方案中，除α4结合抗体和第二剂以外，未向所述受试者施用呈药物组合物形式的蛋白质或生物剂。α4结合抗体和第二剂可为通过注射递送的仅有剂。在第二剂为重组蛋白的实施方案中，α4结合抗体和第二剂可为施用于受试者的仅有重组剂，或至少是调节免疫或炎性反应的仅有重组剂。在其他实施方案中，单独α4结合抗体是施用于受试者的仅有重组剂或仅有生物剂。
除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文中所描述的方法和材料类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明，但以下描述合适的方法和材料。本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的而并非旨在具有限制性。
实施例
除非另外指示，否则这些实施例中的所有氨基酸编号均使用EU编号。
实施例1.变异抗VLA-4抗体比人源化HP1/2更有效。
对于VL链使用种系框架IGKV4-1(针对设计L1和L2)或种系工程化AAH7033.1(针对设计L3)并且对于VH使用种系框架IGHV1-f来构建抗VLA-4抗体。这些抗体与美国专利第6,602,503号中所描述的人源化HP1/2抗体相比具有较少回复突变。
重链变异
重链的三种变异的序列作为设计H0、设计H1和设计H2示于图1中。各设计将鼠类HP1/2的CDR移植至IGHV1-f框架中。设计H0不包括框架区的回复突变，而设计H1和H2在框架区序列中具有不同程度的回复突变以使人源化抗体的亲和力优化。
轻链变异
轻链的四种变异的序列作为设计L0、设计L1、设计L2和设计L3示于图2中(也称为L0、L1、L2、L3)。各设计将鼠类HP1/2的CDR移植至种系框架中。IGKV4-1种系框架用于设计L0、L1和L2，而AAH70335种系工程化框架用于设计L3。设计L0不包括框架区的回复突变，而设计L1、L2和L3在框架区序列中具有不同程度的回复突变以使人源化抗体的亲和力优化。
竞争ELISA测定的结果示于表2和图3中。在该实验中，将α4β1与测试mAb一起预温育，然后使用鼠类HP1/2作为竞争试剂。该实验的结果指示具有轻链L2或L3的抗体比美国专利第6,602,503号中所描述的抗体更有效。结果示于以下表2中和图3中。用于该测定的抗体中的重链(H1)具有图1中所示的“设计H1”序列，而L1是指图2中的设计L1。
表2.通过ELISA进行的竞争测定
mAb IC50 nM
嵌合HP1/2 1.06
H1L0 1.87
H1L1 1.67
H1L2 0.9
H1L3 0.49
HuHP1/2 1.05
在表2中，嵌合mAb是嵌合HP1/2抗体，其中鼠类可变重链和轻链基因融合至人类IgG1恒定区。该抗体在结合亲和力方面与原始鼠类HP1/2抗体基本上相同(Sanchez-Madrid等人,Eur.J.Immunol.16:1343-1349,1996)。实验结果指示通过对种系工程化受体框架进行人源化有可能使单克隆抗体的亲和力相对于其鼠类亲本序列有所提高。
另一种竞争测定法比较新抗体与U.S.5,840,299中所描述的人源化21.6抗α4抗体(
Figure GDA0003031568410001271
(那他珠单抗))的结合亲和力。在该实验中，测定小鼠HP1/2与测试mAb的混合物与α4β1的结合。该实验的结果如图4中和下表3中所示，并且指示新设计的抗体的效能比那他珠单抗高约10倍。
表3.通过ELISA进行的竞争测定
Figure GDA0003031568410001281
实施例2.人源化HP1/2(HuHP1/2)结合肿瘤细胞系上的VLA-4。
通过流式细胞术测试抗VLA-4抗体HuHP1/2与多种细胞系的结合。对于CLL(慢性淋巴细胞性白血病)细胞系Mec1和JM1；MM(多发性骨髓瘤)细胞系U266和H929；以及AML(急性骨髓性白血病)细胞系HL60和KG1测试结合。HuHP1/2结合所有测试肿瘤细胞系(图6)。使用流式细胞术数据计算抗体与每个不同细胞系结合的EC50值。该信息示于下表4中。
还发现HuHP1/2阻断AML细胞系粘附至纤维连接蛋白(FN)和VCAM1-Ig融合蛋白。为了测试抗体是否可阻断粘附，在增加浓度的HP1/2或同种型对照抗体存在下使AML细胞系HL60或KG1粘附至被FN包被的孔(图7A)或被VCAM1-Ig包被的孔(图7B)。HuHP1/2阻断两种细胞类型粘附至被FN包被的孔和被VCAM1-Ig包被的孔。用20ug/ml HuHP1/2实现对HL60细胞与两种配体结合的最大抑制(图7C)。
还发现HuHP1/2阻断MM细胞系粘附至FN和VCAM1-Ig融合蛋白。在增加浓度的HP1/2或同种型对照抗体存在下使MM细胞系U266和H929粘附至被FN包被的孔(图8A)或被VCAM1-Ig包被的孔(图8B)。HuHP1/2阻断两种细胞系类型粘附至被FN包被的孔和被VCAM1-Ig包被的孔。用20μg/mL HuHP1/2实现对U266细胞与两种配体结合的最大抑制(图8C)。
还发现HuHP1/2阻断CLL细胞系粘附至FN和VCAM1-Ig融合蛋白。在增加浓度的HP1/2或同种型对照抗体存在下使CLL细胞系Mec1和JM1粘附至被FN包被的孔(图9A)或被VCAM1-Ig包被的孔(图9B)。HuHP1/2阻断两种细胞系类型粘附至被FN包被的孔和被VCAM1-Ig包被的孔。用20μg/ml HuHP1/2实现对Mec1细胞与两种配体结合的最大抑制(图9C)。
由图7至图9中所示的数据计算HuHP1/2与肿瘤细胞系结合的IC50值。这些数据示于表4中。
表4.肿瘤细胞系上的HuHP1/2的定量
Figure GDA0003031568410001291
用于实施例3至实施例13的材料和方法
在整个实施例3至实施例13中，除非另外阐述，否则使用以下材料和方法。
一般来说，除非另外指示，否则本发明的实践采用常规化学技术、分子生物学技术、重组DNA技术、免疫学技术(尤其是，例如抗体技术)和标准电泳技术。参见例如Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,Humana Pr(1996)；Antibody Engineering:APractical Approach(PracticalApproach Series,169),McCafferty编,IrI Pr(1996)；Antibodies:ALaboratory Manual,Harlow等人,C.S.H.L.Press,Pub.(1999)；和Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人编,John Wiley&Sons(1992)。
亲本抗体
为了产生本文中所公开的稳定化抗体，将编码模型人类抗体(例如hu5c8)、其变异抗体或相应Fc区的多聚核苷酸引入标准表达载体中。人类抗体hu5c8和其变体描述于例如美国专利第5,474,771号和第6,331,615号中。以下分别提供hu5c8 IgG4重链(SEQ ID NO:52)、hu5c8轻链(SEQ ID NO:53)、hu5c8 Fab(SEQ ID NO:54)、来自亲本IgG4抗体的完整Fc部分(SEQ ID NO:55)、具有S228P突变的亲本IgG4 Fc部分(SEQ ID NO:56)和具有S228P/T299A突变的亲本无糖基化IgG4 Fc部分(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列。重链的前导序列是MDWTWRVFCLLAVAPGAHS。也提供亲本IgG1无糖基化hu5c8抗体的重链(SEQ ID NO:58)和Fc部分(SEQ ID NO:59)序列。
Hu 5c8 IgG4重链(EAG1807)(SEQ ID NO:52)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYYMYWVK QAPGQGLEWIGEINPSNGDTNFNEKFKSKATLTVDKSAS TAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSDGRNDMDSWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL
HNHYTQKSLSLSLG
Hu 5c8轻链(SEQ ID NO:53)
DIVLTQSPATLSVSPGERATISCRASQRVSSSTYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFATYYCQHSWEIPPTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Hu 5c8 VH/CH1结构域(SEQ ID NO:54)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYYMYWVK QAPGQGLEWIGEINPSNGDTNFNEKFKSKATLTVDKSAS TAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSDGRNDMDSWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV
亲本IgG4 Fc部分(SEQ ID NO:55)
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
具有S228P突变的亲本IgG4 Fc部分(SEQ ID NO:56)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
具有S228P/T299A突变的亲本IgG4无糖基化Fc部分(YC407)(SEQ ID NO:57)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSAYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
亲本IgG1无糖基化Fc部分(SEQ ID NO:58)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
具有S228P/N297Q突变的亲本IgG4无糖基化Fc(EAG2412)(SEQ ID NO:59)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
亲本IgG1(SEQ ID NO:60)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
实施例3.稳定性增加的IgG Fc突变的合理设计
无糖基化抗体代表一类重要的治疗试剂，其中不需要免疫效应功能。然而，已充分确定移除IgG1和IgG4中的CH2相关低聚糖影响抗体构象和稳定性。抗体稳定性丧失可能会带来不利地影响计划时间线和资源的方法开发挑战。我们在本文中详细描述用于设计CH2和CH3中的氨基酸位置文库以增加IgG Fc的稳定性的许多方法。该实施例中所指示的所有编号都是EU编号。
A.无效应因子IgG的协同变异和残基频率设计：IgG4 CH2结构域
如先前所描述用不同的Cl类Ig折叠序列数据库进行协同变异分析(参见例如PCT公开第WO2007109254号；Wang等人,2009,Proteins 76:99,2009)。也如先前所描述进行Cl类Ig折叠序列的编译和基于结构/HMM的比对(PCT公开第WO2007109254号，其通过引用整体并入本文)。协同变异分析由关于发现一对氨基酸如何共同保守或不共同保守于特定蛋白质序列内的相关系数
Figure GDA0003031568410001331
值的数据集组成，
Figure GDA0003031568410001332
值在-1.0至1.0的范围内。
Figure GDA0003031568410001333
值为1.0指示当发现一个氨基酸处于序列子集内的一个位置时，发现不同残基位置的另一个氨基酸也始终存在于所述子集中。
Figure GDA0003031568410001334
值为-1.0指示当发现一个氨基酸处于序列子集内的一个位置时，发现不同残基位置的另一个氨基酸决不存在于所述序列子集中。发现绝对
Figure GDA0003031568410001335
值大于0.2对于所分析的数据集有统计意义(PCT公开第WO2007109254号；Wang等人,2009,同上)。基于在所述数据集情况下的经验，
Figure GDA0003031568410001336
值>0.25被认为有意义(即，氨基酸配对共存可能有物理原因)，而
Figure GDA0003031568410001337
值>0.5被认为极强并且可能由于重要功能或结构原因而共同保守。
对于该研究，使用来自IgG4的CH2序列作为查询序列，并且使用
Figure GDA0003031568410001342
值>0.3作为用于依据协同变异鉴定突变的截止值。由协同变异分析鉴定的残基列于表5.1中(在整个实施例3其余部分详细描述的所有后续残基都列于表5.1中)。在表5.1中，参考各残基提供所述位置处的所需氨基酸取代，根据EU编号系统。“基本原理”是指所采用的设计方法。协同变异和残基频率详细描述于美国专利申请第11/725,970号中。额外协同变异关联数目是指由突变至指定位置处的所列出氨基酸类型而形成的额外协同变异关系减去由进行该取代而损失的协同变异关系数目。额外协同变异关联数目意在为建议协同变异突变的质量的另一量度。在不存在占优相关额外协同变异关联数目时建议多个氨基酸取代的情况下，在该位置使用文库方法，其中使用Delphia热攻击测试(详细描述于实施例4中)筛选所有20个氨基酸。使用这种方法，鉴定六个氨基酸位置具有所建议的特定协同变异突变：L242P(意指第242位的L变成P)、Q268D、N286T、T307P、Y319F和S330A。另外，鉴定五个残基位置具有多个所需(正额外协同变异关联)取代，并且利用文库方法。这些位置是：D270、P271、E294、A299和N315。
已成功使用基于蛋白质折叠内个别位置的残基频率分析来改进稳定性的方法(Steipe,2004；Demarest等人,2006)，并且先前描述于关于抗LTβR抗体BHA10 VH和VL结构域内的文库位置的鉴定的专利申请BGNA242-1“STABILIZED POLYPEPTIDES AND METHODSFOR EVALUATING AND INCREASING THE STABILITY OF SAME”中。使用残基频率分析来鉴定稳定性增加突变的五个残基位置：N276S、K288R、V308I、S324N和G327A。另外，在协同变异产生和残基频率突变中由PCR误差产生两个残基：L309和N325。
表5.1.稳定性增加突变的残基和基本原理
Figure GDA0003031568410001341
Figure GDA0003031568410001351
Figure GDA0003031568410001361
B.用于无效应因子IgG的结构分析设计
除通过协同变异和残基频率分析设计突变以外，完整人类IgG b.12抗体的公开晶体结构的结构分析(pdb码：1hzh；参考文献：Saphire,E.O.等人,(2001)Crystal structureof a neutralizing human IGG against HIV-I:a template for vaccinedesign.Science 293:1155-1159)。结构分析鉴定可加以调节以改进IgG分子的稳定性的特定结构质量。为了改变IgG4分子的稳定性以更接近IgG1的稳定性，进行许多突变以补偿IgG1与IgG4分子之间的结构差异。一个这种突变位于IgG4中的延伸环中，E269。使用文库方法来筛选可能补偿该环的额外长度的残基。该环也经受如该实施例部分C中详细描述的其他变化。
CH3结构域之间的界面构成IgG分子的Fc结构域中的最大蛋白质-蛋白质接触区。介于IgG1与IgG4之间的该界面中的单一取代差异位于残基409处。在IgG1中，赖氨酸位于第409位，并且在IgG4分子中，精氨酸位于第409位。设计IgG4中的R409取代为IgG1 K409以引入IgG1 CH3的所观测的优越稳定性质量。还设计了R409M和R409I以检验该理论。为了更好地适应IgG4 CH3界面中所添加的精氨酸的体积，在来自相对CH3结构域的接触残基D399处进行许多突变：D399E和D399S(图11A)。通过取代该位置的较小侧链，相对CH3结构域可更好地适应所添加的精氨酸的体积并增加CH3结构域的总体稳定性。使用另一方法设计增加CH3界面的疏水性以增加两个相互作用结构域之间的缔合(Y349F、T350V和T394V)以及增加界面侧链的体积(F405Y)的突变。还设计了突变以测试位于与1hzh晶体结构中碳水化合物的接触位点附近的残基(V264、R292、V303)以及CH3/CH2界面附近的H310的稳定性。一组表面暴露的谷氨酰胺残基(Q268、Q274和Q355)也是许多改变总体表面电荷的突变的焦点。将相同方法用于E419。
最后，用于解释嗜热性蛋白质的热稳定性增加的最常用机制之一涉及蛋白质内部核心的更紧密堆叠(参考文献：Jaenicke,R.和Zavodszky,P.1990.Proteins underextreme physical conditions.FEBS Lett.268:344-349)。为了概括这种现象，用异亮氨酸或苯丙氨酸取代在CH2和CH3的“缬氨酸核心”中存在的缬氨酸残基。根据额外分支侧链和较大相关体积预计稳定性增加。CH2中的“缬氨酸核心”是全部定向至CH2结构域的相同近端内部核心中的五个缬氨酸残基(V240、V255、V263、V302和V323)。对于CH3，观测到类似“缬氨酸核心”(V348、V369、V379、V397、V412和V427)。另外，使L351和L368突变至更高度分支化的疏水性侧链。
C.无效应因子IgG的协同变异设计：基于在其他C类Ig结构域中观测的协同变异模式在CH2糖基化位点附近进行协同突变。
IgG CH2结构域共同保守许多残基以维持与EU第N297位处N连接的碳水化合物的相互作用以及与CD16、CD32和CD64的各种FcγR形式的相互作用。移除碳水化合物引起IgG-Fc显著减少FcγR结合(Taylor和Garber,2005)。关于本文中所描述的设计，通过用发现在其他C类Ig折叠结构域中共同保守的氨基酸进行取代来研究IgG-Fc内在N连接的碳水化合物附近的残基的共同突变性。研究这些共同突变在存在和不存在N连接的碳水化合物的情况下对FcγR结合和对CH2结构域稳定性的影响，因为有可能这些修饰在无糖基Fc内可特别良好地耐受并且可减少无糖基Fc部分和糖基化Fc部分中与FcγR的相互作用。
对于可能与N连接的碳水化合物相互作用重要的残基是该研究的焦点。使用与FcγRIIIa结合的IgG1-Fc的已公布晶体结构和程序MOLMOL鉴定与N297处的碳水化合物直接接触的IgG1-C^残基(Sondermann,P.,Huber,R.,Oosthuizen,V.,Jacob,U.(2000)The
Figure GDA0003031568410001381
crystal structure of the human IgG1 Fc fragment-FcgRIII complex.Nature,406:267-273；Koradi,R.,Billeter,M.和Wuthrich,K.(1996)MOLMOL:a program fordisplay and analysis of macromolecular structures.J.Mol.Graph.14:51-55)。这些氨基酸是协同变异分析和设计的焦点。
如先前所描述进行Cl类Ig折叠序列的编译和基于结构/HMM的比对(PCT公开第WO2007109254号)。也如先前所描述用不同的Cl类Ig折叠序列数据库进行协同变异分析(PCT公开第WO2007109254号；Wang等人,2009,同上)。协同变异分析由关于发现一对氨基酸如何共同保守或不共同保守于特定蛋白质序列内的相关系数
Figure GDA0003031568410001382
值的数据集组成，
Figure GDA0003031568410001383
值在-1.0至1.0的范围内。
Figure GDA0003031568410001384
值为1.0指示当发现一个氨基酸处于序列子集内的一个位置时，发现不同残基位置的另一个氨基酸也始终存在于所述子集中。
Figure GDA0003031568410001385
值为-1.0指示当发现一个氨基酸处于序列子集内的一个位置时，发现不同残基位置的另一个氨基酸决不存在于所述序列子集中。发现绝对
Figure GDA0003031568410001391
值大于0.2对于所分析的数据集有统计意义(PCT公开第WO2007109254号；Wang等人,2009,同上)。基于在所述数据集情况下的经验，
Figure GDA0003031568410001392
值>0.25被认为有意义(即，氨基酸配对共存可能有物理原因)，而
Figure GDA0003031568410001393
值>0.5被认为极强并且可能由于重要功能或结构原因而共同保守。
基于结构分析，发现疏水性残基V262和V264在CH2结构域表面上形成通过N连接的碳水化合物与溶剂螯合的疏水补丁。另外，V266是V262和V264附近的残基，并且是CH2结构域所特有的，但其存在于环中并且自身埋入结构域内部。发现V262、V264和V266在IgG-C^结构域内高度共同保守，彼此之间具有高度显著的相关系数(
Figure GDA0003031568410001394
值：V262-V264＝0.44；V262-V26＝0.40；V264-V266＝0.54)。在基于结构的IgG恒定域序列比对中突出显示所述残基(图11B)。
所述三个缬氨酸残基(262、264和266)也与CR2结构域中形成独特环结构的残基(残基267-271)具有强相关系数。该环比由其他IgG恒定域CL、CHI和CH3形成的共有环长两个氨基酸。特定相关性在V262与E269和D270之间(分别
Figure GDA0003031568410001395
值＝0.38和0.31)、V264与S267、D268和E269之间(
Figure GDA0003031568410001396
值分别＝0.27、0.44和0.52)以及V266与S267之间(
Figure GDA0003031568410001397
值＝0.30)。基于这些相关性，我们推测该环可能对定位含有N297和其碳水化合物的环以及定位已知对与FcγR相互作用重要的含有残基325-330的环来说是重要的(Sondermann等人,2000；Shields等人,2001)。
基于这些观测结果，我们生成设计来研究这些位置对其他氨基酸类型的耐受性(即，对CH2结构域的折叠和稳定性的影响)，特别是在无糖基-IgG中。我们希望观测的另一方面是这些位点处的修饰可能对IgG的FcγR结合性质产生的影响。基于这些观察结果在CH2结构域内进行的氨基酸变化列于表5.2中，并且示于图11C中的IgG-Fc结构上(Sondermann,P.,Huber,R.,Oosthuizen,V.,Jacob,U.(2000)The3.2A crystal structureof the human IgG1 Fc fragment-FcgRIII complex.Nature,406:267-273)。天然序列相对于含有所有突变的序列(SDE9)的比对示于图11D中。
表5.2.对无糖基-IgG1 CH2结构域的突变。
Figure GDA0003031568410001401
a进行A299K突变以中断N连接的糖基化基序，从而产生无糖基-IgG。
b天然序列相对于完全修饰序列的比对示于图10D中。
D.支持突变
为了测试指定残基位置处特定突变类型的特异性，我们设计了一系列额外突变。这些包括在显示增加的稳定性的残基位置测试不同的氨基酸类型(极性、疏水性和带电)。我们还将测试所有稳定性增加突变对各种IgG同种型和糖基化状态的应用。这些突变列于表5.3中。
表5.3.支持突变
Figure GDA0003031568410001402
Figure GDA0003031568410001411
E.额外多突变构建体
为了降低由具有稳定性突变T299K的肽产生的潜在T细胞表位和利用T307P和D399S稳定性突变与产生无糖基化IgG1和IgG4的其他突变的组合，我们也将产生以下构建体(表5.4)。
表5.4额外的多突变构建体
Figure GDA0003031568410001421
实施例4.在大肠杆菌中产生的IgG Fc抗体结构域的热稳定性筛选
采用美国专利申请第11/725,970号中所描述的改进型热攻击测定法作为稳定性筛选，以测定在40℃下在pH 4.5下进行热攻击事件后保留的可溶性IgG Fc蛋白的量。
在诱导性ara C启动子控制下用编码pBRM012(IgG1)和pBRM013(具有S228P、T299A突变的IgG4)Fc的质粒加C端组氨酸标签对大肠杆菌菌株W3110(ATCC，Manassas，Va.，目录号27325)进行转化。使转化株在30℃下在由补充有0.6％甘氨酸、0.6％Triton X100、0.02％阿拉伯糖和50μg/ml羧苄青霉素的SB(Teknova，Half Moon Bay，Ca.，目录号S0140)组成的表达培养基中生长过夜。通过离心使细菌成团，并且收集上清液以进行进一步处理。
在热攻击之后，通过离心除去聚集的材料，并且通过DELFIA测定法来测定经处理的澄清上清液中剩余的可溶性Fc样品与蛋白A(Sigma P7837)的结合。在37℃下将两个96孔板(MaxiSorp，Nalge Nunc，Rochester，NY，目录号437111)用含0.5μg/ml蛋白A的PBS包被一小时，然后在室温下在振摇下用DELFIA测定缓冲液(DAB，10mM Tris HCl、150mM NaCl、20μMEDTA、0.5％BSA、0.02％Tween 20、0.01％NaN3，pH 7.4)封闭一小时。用不含BSA的DAB(洗涤缓冲液)将板洗涤3次，并且将10μl上清液添加至90μl DAB中以达到100μl的最终体积(参考板)。接下来将10μl 10％HOAc添加至聚丙烯板中的各上清液以达到样品pH 4.5。在40℃下将板温育90分钟，并且通过以1400×g离心来除去变性蛋白质。将10μl酸和经热处理的上清液添加至含有90μl补充有100mM Tris pH 8.0的DAB的另一DELFIA板(攻击板)中。在室温下在振摇下将DELFIA板温育一小时，并且如前洗涤3次。通过每孔添加100μl含有250ng/ml经Eu标记的抗His6抗体(Perkin Elmer，Boston，MA，目录号AD0109)的DAB来检测结合的Fc，并且在室温下在振摇下温育一小时。将板用洗涤缓冲液洗涤3次，并且每孔添加100μl DELFIA增强溶液(Perkin Elmer，Boston，MA，目录号4001-0010)。温育15分钟后，使用铕方法在Victor 2(Perkin Elmer，Boston，MA)上对板进行读取。通过在40℃下对各种构建体的参考板与攻击板之间的Eu荧光比进行分级来分析数据。荧光值大于pBRM013值解释为在稳定性方面相对于靶构建体(IgG4.Pagly)有所增加。数据示于表6.1中。
表6.1.Delphia热攻击测定结果
Figure GDA0003031568410001431
Figure GDA0003031568410001441
实施例5.稳定化IgG Fc抗体的产生
A.突变诱发、稳定化IgG Fc部分在大肠杆菌中的瞬时表达和纯化
通过使用Stratagene Quik-Change Lightning突变诱发试剂盒进行定点突变诱发将稳定性突变并入先前于实施例4中详细描述的BRM13构建体中。引物设计为长度在36-40个碱基之间，中间有突变，两侧上有10-15个碱基的正确序列，GC含量为至少40％，起始并终止于一个或多个C/G碱基。所有突变构建体都列于下表7.1中。
表7.1.由大肠杆菌表达并纯化的IgG-Fc构建体
使用EU编号的最终氨基酸取代
BRM013 IgG4.P S228P,T299A
BRM023 S228P,T299A,T307P
BRM030 S228P,T299K
CR103 S228P,T299A,R409K
CR104 S228P,T299A,R409M
CR105 S228P,T299A,R409L
CR106 S228P,T299A,R409I
CR107 S228P,T299A,D399S
CR108 S228P,T299A,D399N
CR109 S228P,T299A,D399E
CR110 S228P,T299A,V369I
CR111 S228P,T299A,V379I
CR112 S228P,T299A,V397I
CR113 S228P,T299A,V427I
CR114 S228P,T299A,V427F
CR115 S228P,T299A,V240I
CR116 S228P,T299A,V263I
CR117 S228P,T299A,V273I
CR118 S228P,T299A,V302I
CR119 S228P,T299A,V323I
使用将会引入突变的引物进行PCR后，在37℃下用Dpn I限制酶将各突变诱发消化5分钟以便完全消化亲本质粒。然后将突变诱发反应转化至XL1-Blue大肠杆菌超胜任细胞中。对氨苄青霉素抗性菌落进行筛选，并使用DNA测序证实来自突变诱发反应的正确序列。
通过电穿孔使用EC3方案将序列经证实的DNA转化至3110细胞中。拣选独特菌落并且在含菌原培养物的10ml LB-amp中生长过夜。将该预培养物转移至1L表达培养基[SB+0.02％阿拉伯糖+amp/carb 50mg/L]，并在32℃下生长过夜。在离心机中对细胞进行低速离心并完全重悬于100ml球形质体缓冲液(20％蔗糖、1mM EDTA、10mM Tris-HCl pH 8.0和溶菌酶(0.01％w/v))中。对细胞进行低速离心，并且所得蛋白质在上清液中。
使用蛋白A琼脂糖FF(GE Healthcare)通过分批纯化对IgG-Fc构建体进行纯化。使用0.1M甘氨酸pH 3.0从蛋白A琼脂糖洗脱Fc分子，用Tris碱中和，并且最后使用Pierce10ml透析卡匣(10,000MWCO截止值)透析至PBS中。
B.突变诱发、稳定化抗体在CHO细胞中的瞬时表达、抗体纯化和表征
使用Stratagene Quik-Change Lightning突变诱发试剂盒通过定点突变诱发将稳定性突变并入IgG4.P抗体(氨基酸228处已含有脯氨酸铰链突变的VH构建体)中。抗原识别Fab来自抗CD40抗体5c8。引物设计为长度在36-40个碱基之间，中间有突变，两侧上有10-15个碱基的正确序列，GC含量为至少40％，起始并终止于一个或多个C/G碱基。所有糖基化和无糖基化突变构建体都列于表7.2中。
表7.2.如通过分析型尺寸排阻色谱法测量的IL培养物蛋白质产量和单体％(IgG1构建体呈斜体)
Figure GDA0003031568410001461
Figure GDA0003031568410001471
使用将会引入突变的引物进行PCR后，在37℃下用Dpn I限制酶将各突变诱发消化5分钟以便完全消化亲本质粒。然后将突变诱发反应转化至XL10-Gold大肠杆菌超胜任细胞中。对氨苄青霉素抗性菌落进行筛选，并使用DNA测序证实来自突变诱发反应的正确序列。
将来自经证实序列的DNA按比例放大并转化至TOP10大肠杆菌胜任细胞(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中。针对插入物的存在对转化至氨苄青霉素耐药性的大肠杆菌菌落进行筛选。然后将菌落培养成250ml大规模培养物。使用Qiagen HiSpeedMaxiprep试剂盒从细菌培养物提取并纯化DNA以用于瞬时转染。使用ε280对DNA进行定量以测量用于转染的DNA浓度。
然后将突变质粒与等量5c8 VL质粒一起用于共转染CHO-S细胞以便瞬时表达抗体蛋白质。用于转染的DNA的量是0.5mg/L VH和0.5mg/L VL。在5％转染体积下用1mg/ml PEI(Polysciences，目录号23966)以3mg PEI:1mg DNA的比率制备转染培养基(来自Invitrogen的CHO-S-SFMII，含来自SAFC的LONG R4IGF-1)。将DNA添加至转染培养基/PEI溶液并涡旋，然后在室温下静置5分钟。然后将混合物以1×106个细胞/ml添加至500ml CHO-S细胞。在37℃、5％CO2下4小时之后，添加1倍体积的扩增培养基(CHOM37+20g/l PDSF+青霉素链霉素/两性霉素)，最终培养体积为1L。在第1天，添加10ml200g/L棉花水解物并且将温度降至28℃。监测培养物活力直至活力降至70％以下(8-12天)。此时也使用Octet(ForteBio)检查蛋白质表达滴定度，以测量与抗IgG尖端的结合。通过以2400rpm将培养物离心10分钟来收集细胞，然后使上清液通过0.2um超滤器进行过滤。
在AKTA(Amersham Biosciences)上使用蛋白A琼脂糖FF(GE Healthcare)从上清液俘获5C8抗体。使用pH 3.0的0.1M甘氨酸从蛋白A洗脱抗体分子，用Tris碱中和，使用Pierce 10ml透析卡匣(10,000MWCO截止值)透析至PBS中，浓缩至1ml最终体积，并且使用制备型尺寸排阻色谱法(TOSOHASS，TOSOH Biosciences)进行进一步纯化。将5C8分子透析至pH 6.0的20mmol柠檬酸盐、150mmol NaCl溶液中。分别通过4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE和分析型尺寸排阻HPLC评定单体抗体产物的纯度和百分比。
C.使用质谱分析证实稳定性工程化抗体的蛋白质序列和翻译后修饰
在还原条件下分析样品。在37℃下，在4M盐酸胍存在下，在100mM DTT中进行还原1小时。在注射之前，将样品用PBS进行1:1稀释。向混合物中添加冰醋酸至最终浓度为2％(v/v)。将5μg各样品注射至苯基柱上并通过ESI-TOF加以分析。使用结合-洗脱方法。缓冲液A含有0.03％TFA水溶液，并且缓冲液B含有0.025％TFA乙腈溶液。流速保持恒定在100μl/min。由Analyst软件获得光谱并使用MaxEntl进行解卷积。还原型分析之后，有3个样品检测为糖型，因此，对所述3个样品进行去糖基化：EC323、EC326和EAG2300。在还原条件下进行去糖基化：1mU N-聚糖酶/2μg蛋白质，存在20mM DTT、10mM Tris pH 7.0。在37℃下对样品进行去糖基化。2小时之后，在2.7M盐酸胍存在下再向样品中添加30mM DTT，并且在37℃下再温育30分钟。将5μg各还原去糖基化样品注射至苯基柱上并且如以上详细描述加以分析。
结果证实所有13个样品的身份，其中重链N端谷氨酰胺(Q)转化为焦谷氨酸(PE)。表7.3列出针对所有糖基化和去糖基化样品获得的质量。所有轻链和重链都含有1％或更低的低水平糖化。在-20％-40％的相对强度下，在各样品中观测到对应于未修饰N端谷氨酰胺的质量。所有轻链解卷积光谱均与预期一致。
表7.3.检测质量
Figure GDA0003031568410001491
Figure GDA0003031568410001501
应注意，在本文中所描述的抗体中，翻译后修饰可广泛变化。举例来说，例行检测蛋白质中的糖化(由蛋白质上的氨基与葡萄糖反应而引起的非酶促修饰)，并且其水平根据细胞培养条件而广泛变化。当然，各重链和轻链上的糖化水平可远高于以上所描述的1％。举例来说，如本文中所描述的完整抗体的糖化水平可为10％、或20％、或30％、或40％、或高于40％。同样，其他翻译后修饰，例如脱氨基和糖基化，可根据本文中所描述的抗体的产生和纯化方法而变化。
样品EC323、EC326和EAG2300含有常见GOF、GIF、G2F双触角聚糖，其中GOF是最丰富的物质，接着是GIF，然后是G2F。样品EC323和EC326在-146Da处含有来自GOF峰的峰，其对应于缺失核心岩藻糖(GO)的GOF聚糖。对于EC323，GO(减去岩藻糖)的相对强度百分比为2％，而EC326样品的相对强度百分比为23％。所有3种糖基化样品在G2F聚糖上都含有低水平(<1％)的唾液酸。
所有样品链都含有-18Da峰，其已证明是与ESI-TOF的气体温度升高有关的仪器伪影。使用350℃的温度来消除TFA加合物。
实施例6.无糖基化IgG Fc抗体的热稳定性
蛋白质稳定性是蛋白质治疗剂的开发和按比例扩大的核心问题。稳定性不足可能导致许多开发问题，包括不适合在生物反应器中扩大生产、蛋白质纯化困难以及不适合医药制备和使用。为了产生效应功能缺陷性Fc主链，将突变引入agly IgG4.P(S228P)中以增加CH2和CH3结构域的总体稳定性。该研究的目标是研究所设计的突变是否使热稳定性增加。因此，使用差示扫描量热法(DSC)评定各构建体的热稳定性。通过DSC评定大肠杆菌产生的Fc结构域构建体和全长抗体构建体。大肠杆菌产生的Fc结构域构建体和全长抗体构建体的表达和纯化方法详细描述于实施例5中。
将抗体针对pH 6.0的25mM柠檬酸钠、150mM NaCl缓冲液进行透析。将抗体浓缩至1mg/mL并且通过UV吸光度加以测量。使用自动化毛细管DSC(MicroCal，LLC，Northampton，MA)进行扫描。进行两次缓冲液扫描以减去基线。使用中等反馈模式，以1℃/min从20℃至105℃操作扫描。然后使用软件Origin(MicroCal LLC，Northampton，MA)对扫描进行分析。使用三阶多项式校正非零基线，并使用非双态去折叠模型拟合各抗体的去折叠转变。为了进一步评定这些构建体的稳定性，将全长抗体相对于pH 4.5的25mM磷酸钠、25mM柠檬酸钠、150nM NaCl缓冲液进行透析。使用与以上详细描述相同的DSC方案。使用缺乏Fab结构域的大肠杆菌表达的Fc结构域构建体来测试如实施例2中详细描述的Delphia热攻击分析中所鉴定的突变的稳定性增强。将构建体BRM023、BRM030和CR103-119与其熔融温度一起列于表8.1中。
表8.1.如通过DSC所测量的大肠杆菌表达的IgG Fc构建体的熔融温度。
Figure GDA0003031568410001521
Figure GDA0003031568410001531
如表8.1中所描绘，agly IgG1和IgG4.P(S228P,T299A)Fc部分对照就CH2来说分别具有65.9℃和62.3℃的熔融温度并且就CH3来说分别具有82.6℃和71.2℃的熔融温度。在单位点突变中，BRM023(T307P)和BRM030(T299K)显示CH2熔融温度相对于agly IgG4.P(S228P,T299A)对照增加3.4-3.9℃。在位置R409处用赖氨酸或甲硫氨酸取代显示CH3熔融温度增加12℃和6.6℃。取代至较小疏水性侧链(Leu和He)不增加CH3的稳定性。该位置表示IgG1与IgG4之间的CH3界面中的单一差异。在D399位进行突变以补偿IgG4 CH3界面中第409位的精氨酸侧链的体积增加(如实施例3中详细描述)。较小侧链(Ser)的取代促使熔融温度增加约4℃。取代至具有相同大小但缺乏电荷的侧链(Asp)或具有相同电荷的较大侧链(Glu)均未显示稳定性增加。如实施例3中详细描述的疏水性缬氨酸核心中的取代显示对熔融温度无效或使其降低，但V427F除外，其显示CH3熔融温度增加约4℃。
为了评估单一突变和多个突变的组合，利用全长IgG分子。如实施例5中详细描述将突变并入全长5c8抗体中。如在pH 6.0和pH 4.5下通过DSC测量的突变对CH2和CH3结构域的熔融温度的影响汇总于以下表8.2中。
表8.2.如通过DSC测量的全长IgG构建体的熔融温度
Figure GDA0003031568410001541
Figure GDA0003031568410001551
如表8.2中所描绘，D399S突变使agly IgG4.P中CH3结构域的热稳定性在pH 6.0下平均增高2℃并且在pH 4.5下平均增高多达10℃。使用突变T299K来产生无糖基化CH2。第299位的赖氨酸取代相对于该位置的丙氨酸取代使IgG4.P分子的熔融温度在pH 6.0下增高5℃并且在pH 4.5下增高11℃。T299K突变也使IgG1 CH2的Tm在pH 6.0下增高6℃。T307P突变当与D399S组合使用时显示糖基化IgG4.P CH2结构域增高4℃。T307P本身不使糖基化IgG4.P形式的熔融温度增高。在无糖基化形式中，T307P突变使CH2 Tm增高6℃。当与T299K突变组合时，CH2的Tm增高8℃。L309K突变当与T307P和T299A组合时使无糖基化IgG4.P稳定性增高1℃。然而，在组合T307P和T299K时，L309K突变致使增高3℃。在IgG4.P的糖基化形式中，L309K突变使CH2的Tm增高2℃。L309K突变当与T307P和T299A组合时使无糖基化IgG4.P稳定性增高1℃。然而，在组合T307P和T299K时，L309K突变致使在pH 4.5下增高3℃。CH2中的V323F突变显示对CH2结构域的熔融温度无影响，而V240F突变使熔融温度降低13℃。另外，V427F突变也显示CH2的Tm降低13℃。
在IgG4.P中，在T299K、T307P、L309K和D399S组合时观测到熔融温度最显著增高。这种构建体与T299A IgG4.P相比显示CH2的Tm增高11℃(pH 6.0)和12℃(pH 4.5)。实际上，T299K突变当与T307P、L309K和D399S组合时相对于T299A突变使Tm增加2-3℃。另外，T299K引入IgG4.P CH2中与IgG4.P同种型的CH3转化至IgG1的CH3组合引起CH2和CH3结构域相对于agly IgG4.P分别增高6℃和15℃。
CH2糖基化协同变异研究中鉴定的突变显示对IgG1 CH2的Tm无影响至几乎无影响(V262L，和V264T与V262L组合，环置换)，或显示存在降低7℃的影响(V266F、V264T和V266F、环和V264T和V266F)。对于V262L、V264T和V266F的组合观测到熔融Tm大幅降低10-12℃。
总之，T299K、T307P、L309K作为单一突变或与彼此组合时显示能够增加CH2结构域的热稳定性。D399S赋予IgG4.P的CH3结构域以稳定性。
实施例7：IgG Fc抗体的搅拌和pH保持步骤研究
非常需要蛋白质治疗剂具有长保质期，蛋白质的物理或化学性质在制造生产和储存期间发生最低限度的变化。评估相关应力是制剂开发的重要部分，并且评估IgG Fc突变体的两种相关应力类型。
A.搅拌应力
搅拌模仿在制造和加工期间遭遇的应力以及模拟实际运输(即，将药物产品小瓶运输至测试场所)期间的应力。因此，分析48小时的时程内的搅拌稳定性，并且使用分析型尺寸排阻色谱法(SEC)监测蛋白质聚集或沉淀，并通过在320nM下监测吸光度来测量浊度。浊度是由于使蛋白质/缓冲溶液混浊或甚至在极端情况下不透光的聚集和沉淀物形成导致的光散射量度。在各组实验中一致使用以下方法：在3ml制剂管中以650rpm振摇1ml各样品(0.5mg/ml)，用橡胶塞密封，并用石蜡膜再次密封。在必需时间点(0、6、24和48小时)提取100μl样品，并且以14,000rpm低速离心5分钟来对所形成的聚集物或沉淀物进行低速离心。然后操作样品并且在分析型SEC柱上加以分析。在SEC洗脱曲线中，聚集的蛋白质以较短保留时间洗脱并且蛋白质降解产物以较长保留时间洗脱。因此，使用单体物质的百分比来监测给定时间点的蛋白质总体稳定性。
选择具有最高热稳定性的构建体(参见实施例6)用于搅拌研究。对于无糖基化IgG4分子，选择YC401至YC403(都是无糖基化IgG4.P T299A和D399S[分别加上T307P、L309K和T307P/L309K])、YC404至YC406(都是无糖基化IgG4.P T299K和D399S[分别加上T307P、L309K和T307P/L309K])、呈野生型IgG4.P无糖基化(T299A)对照形式的YC407、CN578(无糖基化IgG1 A299K)、EC331(具有IgG1 CH3结构域的无糖基化IgG4.P T299K和T307P)、无糖基化IgG1(T299A)、无糖基化IgG4.P(T299A)和无糖基化IgG1(T299A)用于研究。对于糖基化分子，选择EC304(糖基化IgG4.P T307P、D399S)、EC323(糖基化IgG4.P D399S、L309K)、EC326(糖基化IgG4.P T307P、D399S、L309K)、糖基化IgG4.P T299A和糖基化IgG1用于研究。
在就浊度对无糖基化突变体进行比较时(参见下表9.1和图12A)，YC403(无糖基化IgG4.P T299A、T307P、L309K和D399S)和YC406(无糖基化IgG4.P T299K、T307P、L309K和D399S)与野生型YC407(无糖基化IgG4.P T299A)相比显示最低量的浊度。两种构建体在每个时间点始终显示相较于野生型为三分之一的浊度。两种构建体之间仅有的差异是T299A(YC403)和T299K(YC406)。
表9.1：构建体在搅拌过程中各时间点的浊度
时间 0小时 6小时 24小时 48小时
EC304 0 0.232 0.584 0.89
EC323 0 0.333 0.672 1.139
EC326 0 0.088 0.316 0.595
EC331 0 0.157 0.343 0.54
YC401 0 0.51 1.406 1.49
YC402 0 0.717 1.331 1.54
YC403 0 0.221 0.675 0.892
YC404 0 0.334 0.884 0.977
YC405 0 0.885 1.94 1.841
YC406 0 0.29 0.838 0.993
YC407 0 0.772 2.5 2.709
CN578 0 0.029 0.078 0.072
IgG1 T299A 0 0.019 0.144 0.348
IgG4.P T299K 0 1.322 1.51 1.657
IgG1 299T 0 0.009 0.01 0.008
IgG4 299T 0 0.009 0.0465 0.0185
在比较单体％时(参见下表9.2和图12B，所有突变构建体都显示聚集随时间减少。在24小时时间点，所有突变构建体都优于野生型，并且在48小时时间点，大部分构建体优良至少2倍。然而，保留最高单体％的构建体是YC403，接着是YC402(无糖基化IgG4.P T299A、L309K和D399S)，然后是YC406(无糖基化IgG4.P T299K、T307P、L309K和D399S)。这些构建体随时间显示最不平缓的单体％损失。在最佳排序构建体中所见的常见突变是L309K突变。该数据显示所选择的突变在机械应力情形下改进总体稳定性。比较所述无糖基化IgG4.P构建体的两种搅拌测量，YC403(无糖基化IgG4.P T299A、T307P、L309K和D399S)和YC406(无糖基化IgG4.P T299K、T307P、L309K和D399S)构建体随时间最佳地抵抗机械应力。两种分子都显示能够改进热稳定性和结构稳定性的添加突变(T307P/L309K)。
表9.2：构建体在搅拌过程中各时间点的单体％
时间 0小时 6小时 24小时 48小时
EC304 100 96.5 90.52 87.22
EC323 100 98.16 96.29 94.37
EC326 100 98.11 95.89 93.35
EC331 100 100 100 100
YC401 96.5 90.17 73.63 71.07
YC402 96.6 89.45 85.49 80.88
YC403 95 95.382 90.03 84.75
YC404 97 95.45 83.78 73.5
YC405 92.7 87.46 76.72 72.1
YC406 95.5 94.12 83.89 74.8
YC407 97 95.88 72.3 33.4
CN578 99.73 100 100 99.3
IgG1 T299A 100 100 100 100
IgG4.P T299K 96.7 100 0 0
IgG1 299T 100 99.01 98.85 99
IgG4 299T 80.51 80.2 80.35 78.06
对于IgG1无糖基化分子，CN578(无糖基化IgG1 A299K)显示最低限度的浊度，并且其在整个实验中也基本上不显示聚集。CN578的表现优于IgG1 T299A以及野生型IgG1 299T分子，因而证明对于无糖基化IgG1分子，A299K突变对搅拌具有最小影响。CN578在浊度研究中比IgG1 T299A优良5倍。CN578分子在48小时的时间跨度内也不显示聚集，所述结果与无糖基化IgG1 T299A和糖基化IgG1 299T相同。EC331(其为具有IgG1 CH3结构域的无糖基化IgG4.P T299K和T307P)的表现与其他构建体相比非常优良，因为其在整个搅拌研究中也维持100％单体。其与IgG4.P agly构建体(YC系列)相比显示浊度改进2倍。该数据表明IgG1CH3部分大大有助于所述分子的热稳定性和结构稳定性。
在糖基化分子EC304(糖基化IgG4.P T307P、D399S)、EC323(糖基化IgG4.P D399S、L309K)、EC326(糖基化IgG4.P T307P、D399S、L309K)中，聚集研究过程中的单体％与野生型糖基化IgG4.P分子相比有所改进(参见表9.2和图12B)。然而，浊度在每个时间点均大大增加，甚至高达75倍。一致地，每个分子含有D399S，因此，如数据所显示，这种突变可能破坏结构稳定性。
B.低pH保持步骤研究
非常需要蛋白质治疗剂具有可制造性和可扩大性。进行pH保持步骤研究对工艺开发必不可少。pH保持研究模拟蛋白质生产和纯化阶段期间的工艺开发。在生产阶段，蛋白质的可再现性和一致性对于质量保证必不可少。这种方法可用于测量蛋白质在高pH或低pH下的稳定性。对于所述研究，使用AKTA(Pharmacia Biotech，现为GE Healthcare)将1mg蛋白质装载至蛋白A柱上，并用pH 3.1的乙酸盐缓冲液洗脱。将蛋白质保持在低pH下持续2小时间隔至多达6小时。获取100μl等分试样，然后在分析型SEC上操作以测量由于降解和聚集所致的蛋白质损失。结果汇总于表9.3(参见下文)和图13中。
表9.3：在低pH保持下IgG Fc随时间变化的相对峰高
时间 0小时 2小时 4小时 6小时 24小时
EC304 100 100.74 100.53 100.18 98.82
EC323 100 99.66 99.99 60.8 53.47
EC326 100 100.83 99.8 100.16 101.27
EC331 100 99.22 99.09 100.82 97.79
IgG1299T 100 95.15 95.12 96.76 94.08
IgG1 T299A 100 100.39 100.5 100.91 99.01
IgG4.P T299A 100 101.68 103.33 54.84 52.53
对于该研究，选择EC304(糖基化IgG4.P T307P、D399S)、EC323(糖基化IgG4.PD399S、L309K)、EC326(糖基化IgG4.P T307P、D399S、L309K)、糖基化IgG4.P T299A、EC331(其为具有IgG1 CH3结构域的无糖基化IgG4.P T299K和T307P)、无糖基化IgG1(T299A)、无糖基化IgG4.P(T299A)和糖基化IgG1用于研究。根据所述数据，证实EC331能够承受低pH保持至少6小时而不损失很多产量。这与所操作的无糖基化IgG4野生型对照相比有所改进。据预计，其他无糖基化构建体不会由于降解而损失任何蛋白质，因为这种构建体能够承受低pH保持。在两者都被糖基化的情况下，EC304和EC326也维持其产量，这也与糖基化IgG1野生型相当。也被糖基化的EC323随时间推移进展不佳。假定单独L309K突变需要与T307P突变一起稳定化，这可见于更稳定化EC326构建体中。
实施例8.稳定性工程化IgG Fc抗体的Fc受体结合
本发明的无糖基化变异抗体的效应功能的特征在于其能够结合Fc受体或补体分子，例如C1q。
A.溶液相竞争Biacore实验
使用溶液亲和表面等离子体共振来分析与Fcγ受体的结合(参考Day ES,CacheroTG,Qian F,Sun Y,Wen D,Pelletier M,Hsu YM,Whitty A.Selectivity of BAFF/BLySand APRIL for binding to the TNF family receptors BAFFR/BR3 andBCMA.Biochemistry.2005年2月15日；44(6):1919-31)。所述方法利用所谓“质量传输限制”结合条件，其中配体结合(蛋白质结合到传感器芯片)的初始速率与溶液中的配体浓度成比例(参考BIApplications Handbook(1994)第6章:Concentration measurement,第6-1-6-10页,Pharmacia Biosensor AB)。在这些条件下，可溶性分析物(在芯片表面上流动的蛋白质)与芯片上的经固定蛋白质的结合与分析物扩散至芯片表面上的聚葡萄糖基质中相比是快速的。因此，分析物的扩散性质和流过芯片表面的溶液中的分析物浓度决定分析物结合到芯片的速率。在该实验中，溶液中游离Fc受体的浓度是通过与含有经固定IgG1 MAb的CM5Biacore芯片的初始结合速率来确定。向这些Fc受体溶液中滴加稳定性工程化构建体(参见下表10.1)。这些构建体的半最大(50％)抑制浓度(IC50)是通过其抑制Fc受体结合到固定于传感器芯片表面上的经固定IgG1抗体的能力来显示。初始结合速率获自原始感测图数据(图14)。用于计算IC50的滴定曲线示于图15A(CD64(FcγRI))和图15B(CD16(FcγRIIIaV158))中。结果示于表10.1中并且报告为两次滴定的平均值。
表10.1.Fc变体的FcγR亲和力表征
Figure GDA0003031568410001621
在CD64结合测定中，IgG1对照抗体的IC50为9.6μM，而IgG1 T299A(agly)和IgG4.PT299A(agly)的IC50分别为205μM和739μM。如所预期，IgG1分子对CD64的亲和力大于IgG4分子，并且无糖基化IgG1与糖基化IgG1相比显示降低的亲和力。稳定性工程化糖基化IgG4.P分子(EC300和EC326)具有约8μM的IC50值，相比之下，稳定性工程化无糖基化IgG4.P分子(EC331和YC400系列)在440至>5000μM的范围内。稳定性工程化IgG4.P糖基化分子(EC300、EC326)的IC50与糖基化IgG1对照等效，并且具有T299A的稳定性工程化无糖基化IgG4.P(YC401、YC403)与无糖基化IgG4.P T299A对照具有对数等效IC50。然而，具有T299K的稳定性工程化无糖基化IgG4.P与具有T299A取代的等效分子相比显示高出1至2个对数的亲和力降低(图7A)。对于与无糖基化IgG1 T299A对照相比显示对数亲和力降低的稳定性工程化无糖基化IgG1 T299K(CN578)也观测到这种结果(图16B)。实际上，T299K取代使无糖基化IgG1(T299A)分子从与无糖基化IgG4.P T299A对照相比对CD64具有更大亲和力变至与无糖基化IgG4.P对照相比对无糖基化IgG1(T299K)具有降低的亲和力(图16B)。总之，T299K突变降低了IgG1和IgG4分子二者对CD64的亲和力。
对于CD16测定，IgG1对照具有105μM的IC50，而无糖基化IgG4.P T299A和IgG1T299A二者都具有>1000μM的IC50。糖基化稳定性工程化IgG4.P分子具有与IgG1对照对数相当的IC50值，并且所有稳定性工程化无糖基化分子(IgG4.P和IgG1二者)都具有>1000μM的IC50。为了研究T299K是否进一步降低对CD16的亲和力，在高抗体浓度(5μM)下测试以T299K取代作为仅有差异的两组构建体(YC401、YC404和YC403、YC406)。结合曲线显示T299K突变在高浓度下引起对CD16的亲和力降低(图17)。总之，T299K突变降低IgG分子中对CD16的亲和力。
B.C1q结合ELISA
通过在4℃下用以10ug/ml处于PBS中的50μl重组可溶性人类CD40配体包被96孔Maxisorb ELISA板(Nalge-Nunc Rochester，NY，USA)过夜来进行C1q结合测定。对孔抽吸并用洗涤缓冲液(PBS、0.05％Tween 20)洗涤三次，并用200μl/孔的封闭/稀释缓冲液(0.1MNa2HPO4 pH 7.0、1M NaCl、0.05％Tween 20、1％明胶)封闭1小时。将抗体以3倍稀释度稀释于封闭/稀释缓冲液中，并在室温下温育2小时。
如上抽吸并洗涤之后，添加50J.孔的稀释于封闭/稀释缓冲液中的Sigma人类C1q(C0660)的2J.凝胶并在室温下温育1.5小时。
如上抽吸并洗涤之后，添加50pll/孔的于封闭/稀释缓冲液中稀释3,560倍的绵羊抗C1q(Serotec AHP033)。在室温下温育1小时之后，如上对各孔抽吸并洗涤。然后添加50pll/孔的于封闭/稀释剂中稀释至1:10,000的驴抗绵羊IgG HRP缀合物(JacksonImmunoResearch 713-035-147)，并在室温下将孔温育1小时。
如上抽吸并洗涤之后，添加100all TMB底物(420plM TMB、含0.004％H2O2的0.1M乙酸钠/柠檬酸缓冲液，pH 4.9)并温育2分钟，然后用100ul 2N硫酸终止反应。用SoftmaxPRO仪器在450nm处读取吸光度，并且使用Softmax软件以4参数拟合确定相对结合亲和力(C值)。
实验结果显示CN578(IgG1 T299K)和YC406(无糖基化IgG4.PT299K、T307P、L309K和D399S)都不具有可测量的C1q结合(图17)，而IgG1 T299A具有一定的残余结合。
实施例9.IgG1 CH3使无效应功能的无糖基化IgG4 CH2稳定化
该部分中所描述的蛋白质来源于5c8抗体，并且除非另外指示，否则包含来自IgG4的CH1区域、来自IgG4的CH2结构域和来自IgG1或IgG4抗体的CH3结构域(如所指示)。如实施例3中所描述来产生并纯化蛋白质。在pH 6.0和pH 4.5下通过DSC测量被修饰抗体的CH2和CH3结构域的热稳定性(详细描述于实施例6中)。通过分析型SEC和通过在A320 nm下进行浊度测量来测量搅拌应力的影响(实施例7)。本发明的无糖基化变异抗体的效应功能的特征在于其能够结合Fc受体或补体分子，例如C1q。使用溶液亲和表面等离子体共振来分析与Fcγ受体的结合，并且通过ELISA来分析与补体因子C1q的结合(实施例6)。最后，通过在Sprague-Dawley大鼠中进行药物动力学研究来测定血清半衰期(实施例9)。
如实施例5中详细描述，在CHO中表达IgG4-CH2/IgG1-CH3无糖基化构建体，其中产量在每1升培养物7至14mg的范围内。与具有来自IgG4的CH3的相同构建体相比，引入IgG1-CH3似乎赋予更高产量(约1.5倍)(表8.1)。另外，与野生型无糖基IgG4的CH3结构域的稳定性(Tm＝74℃)相比，IgG1无糖基IgG4-CH2/IgG1-CH3在CH3结构域中具有增加的热稳定性(Tm＝85℃)(表12.2和表8.2)。令人感兴趣地观测到IgG1 CH3是搅拌稳定性的决定性特征(表12.3)，因为先前已认为CH2结构域中的聚糖损失将是稳定性的支配因素。
观测到EAG2412构建体(N297Q IgG4-CH2/IgG1-，即，5c8可变区(IgG1框架)、IgG4CH1、IgG4 CH2、具有N297Q和Ser228Pro取代的IgG1 CH3)显示更佳的效应功能概况，与T299A和T299K IgG4-CH2/IgG1-CH3相比对CD64和CD32的结合最低。发现IgG1-CH3对与Fcγ受体结合无影响。所有含无糖基IgG4-CH2结构域的构建体都不结合于C1q。
在Sprague-Dawley大鼠中进行药物动力学研究以解决稳定性工程化IgG4/IgG1分子的稳定性和血清半衰期。根据Biogen Idec实验动物照护和使用委员会以及市、州和联邦政府关于实验室动物人道处理和照护的指导方针来养护大鼠。将稀释于磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中的1mg/kg(1mg/ml)抗体的单次药团注射经静脉内施用于雄性Sprague-Dawley大鼠中。在注射后0、0.25、0.5、1、2、6、24、48、96、168、216、264和336小时将大鼠处死。制备分析用血清样品以便对抗体水平进行定量。将样品稀释于补充有5％正常小鼠血清的DAB(Jackson ImmunoResearch 015-000-120)中，并且检测试剂为以250ng/ml的最终浓度使用的经Eu标记的小鼠抗人类Fc抗体(Perkin Elmer 1244-330)。通过使用Excel的TREND函数与经纯化抗体的标准曲线相比较来进行定量。
N297Q IgG4-CH2/IgG1-CH3与T299A IgG4抗体具有相同的半衰期，如所预期，其稍短于无糖基化IgG1(表12.5)。数据标绘于图19C中。
表12.1：如通过分析型尺寸排阻色谱法测量的IL培养物蛋白质产量和单体％
最终氨基酸取代 产量(mg) 单体％
pEAG2296 S228P/T299A/IgG1-CH3 7.24 98％
pEAG2287 S228P/T299K/lgG1-CH3 14.2 100％
EAG2412 S228P/N297Q/IgG1-CH3 13.75 99.30％
YC407 S228P,T299A 4.07 96.90％
CN579 S228P,T299K 11.55 90％
EAG2391 N297Q 7.8 100％
表12.2：如所测量的IgG4-CH2/IgG1-CH3构建体的熔融温度
Figure GDA0003031568410001661
表12.3：构建体在搅拌期间各时间点的浊度和单体％
Figure GDA0003031568410001662
表12.4：IgG4/IgG1变体的FcyR亲和力表征(NB指示无结合)
Figure GDA0003031568410001663
a未观测到结合
表12.5：稳定性工程化构建体在大鼠中的药物动力学
Figure GDA0003031568410001671
实施例10.T299是稳定性和效应功能的决定因素
该部分中所描述的蛋白质都来源于5c8抗体，并且除非另外指示，否则包含IgG1抗体的CH1、CH2和CH3结构域。如实施例5中所描述来产生并纯化蛋白质。在pH 6.0和pH 4.5下通过DSC测量突变对CH2和CH3结构域的熔融温度的影响(详细描述于实施例6中)。本发明的无糖基化变异抗体的效应功能的特征在于其能够结合Fc受体或补体分子，例如C1q。使用溶液亲和表面等离子体共振来分析与Fcγ受体的结合，并且通过ELISA来分析与补体因子C1q的结合(实施例8)。
如实施例5中详细描述，在CHO中表达IgG1 T299X和N297X/T299K无糖基化构建体，其中产量在每1升培养物7至30mg的范围内(表13.1)。在位置N297处与T299K组合添加二级突变确实使CH2结构域的热稳定性降低1.5至4.4℃(表13.2)。另外，T299X突变相对于Arg(T299R)和Lys(T299K)的带正电侧链显示最大程度的稳定性增加(表13.2)。两个极性侧链Asn(T299N)和Gln(T299Q)与T299A相比都显示更高稳定性，但不如带正电侧链那么高。脯氨酸(T299P)显示稳定性与T299A相比小幅降低，并且较大疏水性侧链Phe(T299F)使CH2结构域的热稳定性降低2.4℃。最后，带负电侧链Glu(T299E)对CH2热稳定性具有极小影响。这些结果显示取代位置T299处的带正电侧链以增加CH2结构域中的热稳定性的新颖性质。
观测到N297X、T299K突变(CN645、CN646和CN647)都略增加对CD64的亲和力，同时维持对CD32a和CD16的极低亲和力(图20B、图20D和图20F)。T299X突变显示对CD16的亲和力始终较低，然而，在T299E的情况下，对CD32a的低亲和力得以增加(表13.3和图20C、图18E)。此外值得注意的是，仅带正电侧链T299R和T299K赋予CD64低亲和力(表13.3和图20A)。最后，T299K、T299P和T299Q对追踪C1q结合无反应；T299N、T299E、T299F显示与C1q的结合略有升高但仍极低(图20G和图20H)。N297P/T299K、N297D/T299K和N297S/T299K未显示与C1q结合(图20H)。
表13.1：如通过分析型尺寸排阻色谱法测量的IL培养物蛋白质产量和单体％
最终氨基酸取代 产量(mg) 单体％
CN647 N297D,T299K 7.4 100％
CN646 N297S,T299K 30.47 98.50％
CN645 N297P,T299K 9.3 100％
EAG2389 T299Q 12.6 100％
EAG2390 T299P 22.3 100％
EAG2377 T299N 8.7 100％
EAG2378 T299R 14.1 100.00％
EAG2379 T299E 10.1 100％
EAG2380 T299F 12.6 100％
表13.2：如通过DSC所测量的T299X构建体的熔融温度
Figure GDA0003031568410001691
表13.3：T299X变体的FcyR亲和力表征(NB指示无结合)
Figure GDA0003031568410001692
Figure GDA0003031568410001701
实施例11.稳定化Fc构建体显示稳定性突变体的应用与Fab无关
该部分中所描述的蛋白质包含来源于5c8抗体的结合位点。EAG2476构建体包含来自IgG4免疫球蛋白分子的Fc部分，并且EAG2478包含来自IgG1分子的Fc部分(EAG2476和EAG2478分别是YC406和CN578构建体的Fc型式(无Fab))。
如实施例5中所描述来产生并纯化蛋白质。在pH 6.0下通过DSC测量突变对CH2和CH3结构域的熔融温度的影响(详细描述于实施例6中)。本发明的无糖基化变异抗体的效应功能如图21所示。抗体的特征在于其能够结合Fc受体。使用溶液亲和表面等离子体共振来分析与Fcγ受体的结合(实施例8)。
如实施例5中详细描述在CHO中表达稳定化Fc无糖基化构建体，产量详细描述于(表14.1)中。CH2结构域中的突变(T299K、T307P和L309K)在存在或不存在Fab的情况下显示相同的热稳定性(表14.2)以及具有相同的Fcγ受体结合亲和力(表14.3)。总之，如所预期，本发明中详细描述的稳定化突变不依赖Fab并且适用于稳定化Fc结构域而不考虑Fab贡献。
表10.1：如通过分析型尺寸排阻色谱法所测量的4L培养物的蛋白质产量和单体％
Figure GDA0003031568410001702
Figure GDA0003031568410001711
表10.2：如通过DSC所测量的Fc构建体的熔融温度
Figure GDA0003031568410001712
表10.3：T299X变体的FcyR亲和力表征(NB指示无结合)
Figure GDA0003031568410001713
实施例12
为了产生具有所需性质，包括热稳定性、纯化时沉淀较少以及由抗体分泌细胞产生的抗体的效价提高的本发明抗体，用包含SEQ ID NO:11的可变轻链序列附连到人类κ轻链恒定区的轻链和包含SEQ ID NO:4的可变重链序列附连到不同的重链恒定区的重链产生众多抗体构建体。在所测试的各种重链恒定区中，序列变化导致令人惊讶的重大结果。
举例来说，SEQ ID NO:4的可变重链偶联至包含CH1、具有S228P突变(EU编号)的铰链、人类IgG4的CH2和CH3区的Fc区，其中IgG4已通过消除N连接的糖基化基序NXS/T而无糖基化，其中天冬酰胺残基297或苏氨酸残基299(EU编号)处的氨基酸变化导致抗体具有不良热稳定性并且倾向于在蛋白A洗脱期间暴露于低pH后沉淀。令人惊讶的是，当使用包含CH1、具有S228P突变(EU编号)的铰链和人类IgG4的CH2和偶联至人类IgG1的CH3区的CH2结构域中的N297Q突变(EU编号)的嵌合Fc区来制造包含SEQ ID NO:4的可变重链序列的抗体重链和包含SEQ ID NO:11的可变轻链序列附连到人类κ轻链恒定区的轻链时，所得抗体具有增加的热稳定性，这与纯化时沉淀较少和抗体产生细胞的抗体产生增加相关。换句话说，含有包含SEQ ID NO:11序列的可变轻链(其附连到人类κ轻链恒定区)和包含SEQ ID NO:4序列的可变重链(其附连到包含CH1、具有S228P突变(EU编号)的铰链和人类IgG4的具有N297Q突变(EU编号)的CH2(其偶联至人类IgG1的CH3区)的嵌合Fc区)的抗体令人惊讶地具有较高热稳定性、抗体纯化时沉淀较少和抗体产生细胞的抗体产量较高，特别是当与具有S228P(EU索引编号)的无糖基化人类IgG4相比时。
实施例13.如通过氢/氘交换质谱和X射线晶体学测定的稳定化无效应因子抗体的 蛋白质构象、动力学和结构
结构和动力学显著有助于蛋白质的功能。理解基础结构机制对解释所观测的功能作用至关重要。为此，我们已通过氢/氘交换质谱(HfDX MS)和x射线晶体学检查先前详细描述的稳定性增加突变对蛋白质结构和动力学的影响。
A.氢/氘交换质谱
通过质谱检测氢/氘交换是表征蛋白质动力学和构象的方法。蛋白质动力学/构象影响蛋白质中氘对氢的交换率，因此，当蛋白质结构被修饰(例如具有突变)时，测量蛋白质氘化随时间变化可说明构象变化。因此，我们检查稳定化突变对我们的无糖基化抗体Fc主链的氢/氘交换的影响。
用pD 6.0的50mM磷酸钠、100mM氯化钠、D2O将抗体(在pH 6.0的50mM磷酸钠、100mM氯化钠、H2O中)稀释20倍，并且在室温下温育不同量的时间(10秒、1分钟、10分钟、60分钟和240分钟)。通过用pH 2.4的200mM磷酸钠、0.5M TCEP和4M盐酸胍、H2O，以1:1稀释度将pH降至2.6来淬灭交换反应。使用基于nanoACQUITY平台的Waters UPLC系统在线对已淬灭的样品进行消化、脱盐和分离。将约20pmol的已交换并淬灭的抗体注入经固定的胃蛋白酶柱中。在15℃下，在含有0.05％甲酸的水中以0.1nL/min的流速进行在线消化2分钟。将所得消化性肽捕获于维持在0℃的ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm肽捕获器(Waters，Milford，MA)上并且用水、0.05％甲酸脱盐。通过切换阀转换流体，并且以40μL/min将所捕获的肽从捕获器洗脱至保持在0℃的Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm,1mm×100mm柱上(平均背压为约9000psi)。使用含0.05％甲酸的6分钟线性乙腈梯度(8-40％)来分离肽。将洗脱液导入Waters Synapt质谱仪中，进行电喷雾电离和锁定质量校正(使用Glu-纤维蛋白原肽)。获取m/z范围260-1800内的质谱。使用精确质量与MS/MS的组合，在Waters IdentityE软件的帮助下鉴定胃蛋白酶片段。如Weis等人所描述，使用基于Excel的程序HX-Express来确定肽氘水平。
如以上所描述来收集完整IgG4.P相对于N297Q IgG4.P、N297Q IgG4.P相对于N297Q IgG4.P-CH2/IgG1-CH3和T299A IgG4.P相对于YC406(T299K、T207P、L309K、D399S)的H/DX-MS数据。完整(糖基化)IgG4与无糖基化N297Q IgG4的比较显示无糖基化形式显示更大交换的序列区域。在肽L235-F241、F241-D249、1253-V262、V263-F275和H310-E318中观测到更多H/D交换。IgG4肽M358-L365、T411-V422和A431-S442相较于N297Q IgG4.P-CH2/IgG1-CH3构建体中的相同肽的更高交换显示IgG1-CH3与N297Q IgG4-CH2组合产生稳定性增加。在这种情况下，与IgG1-CH3相比，来自IgG4的CH3结构域在CH3的3个不同区域中显示更大交换。最后，肽L235-F241、F241-M252、V263-F275、V266-F275和V282-F296显示突变构建体YC406与由于去糖基化而尤其更倾向于交换的序列区域中的无糖基化IgG4(T299A)相比存在稳定性增加。令人感兴趣的是，CH3结构域中的D399S突变尽管产生热稳定性的轻微增加，但赋予比野生型序列更大的交换。总体言之，H/D交换MS显示由于去糖基化引起的构象变化被稳定性突变部分或完全恢复。
B.稳定性增强Fc构建体的X射线晶体学
使EAG2476构建体(agly IgG4-Fc T299K、T307P、L309K、D399S)结晶并收集数据达至2.8A分辨率(数据完整性总体为92％；高分辨率壳层为66％)。将所述结构构建成电子密度并且分别精化至R/R游离为27.7/33.9％。所述结构揭示不对称单元(ASU)中的两个Fc链可重叠，两个链之间存在极小偏差。环V266-E272并且特别是P291-V302与野生型IgG4晶体结构(pdb IADQ)中所观测者相当不同。这可能是突变T299K的直接结果。
EAG2478构建体(agly IgG1 Fc T299K)的晶体结构解析至
Figure GDA0003031568410001741
分辨率(数据完整性总体为92％；高分辨率壳层为66％)。构建所述结构并且分别精化至R/R游离为27.4/35.8％。不同于EAG2476的结构，ASU中的两个Fc链在EAG2478结构方面不一致。观测到链A更类似于酶促去糖基化的IgG1 Fc(pdb 3DNK)的结构。EAG2478结构中的CH2结构域比在酶促去糖基化的IgG1 Fc(pdb 3DNK)和鼠类无糖基化IgG1 Fc(pdb 3HKF)中所观测者更靠近在一起。CH2结构域在EAG2476结构中比在EAG2478结构中观测到的更开放。结构显示在两种情况下，T299K突变都指向对接FcγIII受体的Y129侧链，由此将解释针对该突变所观测的对受体的亲和力降低。
实施例14.蛋白质纯化。
在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中稳定表达具有SEQ ID NO:81的成熟轻链(HP1/2hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND001的成熟轻链)和SEQ ID NO:80的成熟重链(HP1/2 hG4Pagly(N297Q)G1 H1L3 ND004/ND006的成熟重链)的蛋白质并纯化。所得分子称为HP1/2H1L3无糖基IgG4P/IgG1嵌合体S228P N297Q(Kabat编号)或HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1H1L3。
图22A显示轻链HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1κ轻链(H1L3)的核苷酸序列(SEQ ID NO:91)和氨基酸序列(SEQ ID NO:92)，包括信号肽序列(信号肽序列和编码DNA在图22A中以加粗斜体字体显示)。
图22B显示轻链HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU编号)G1重链(H1L3)的核苷酸序列(SEQ ID NO:93)和氨基酸序列(SEQ ID NO:94)，包括信号肽序列(信号肽序列和编码DNA在图22B中以加粗斜体字体显示)。
图23A包括HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1κ轻链(H1L3)的氨基酸序列，包括轻链(上部)和重链(下部)二者的信号序列(加下划线文字)。
图23B包括具有SEQ ID NO:81的成熟轻链和SEQ ID NO:80的成熟重链的HP1/2hG4P agly(N297Q)G1κ轻链(H1L3)的氨基酸序列。在图23B中，将轻链中(氨基酸残基24-34、50-56和89-97)和重链中(残基28-35、50-66和99-110)的互补决定区(CDR)序列加下划线。
纯化工艺全程使用无热原容器和溶液。在室温下进行纯化工艺。
在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中稳定表达HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3并纯化。
关于纯化，简言之，将7.5L含有约10g HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3(通过Octet得到的估计滴度：1310mg/L)的CHO培养基于25mM磷酸钠pH 7.0、0.1M NaCl中以40-120mL/h装载至400mL rProtein A Sepharose Fast Flow柱(GE 17-1279-04，内径50mm)上。用4×400mL相同缓冲液，然后用3×400mL 25mM Na2HPO4 pH 5.5、0.1M NaCl洗涤柱。用1000mL 25mM磷酸钠pH 2.8、0.1M NaCl洗脱HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3，用25mM磷酸钠pH 8.6中和pH。用Thermo Scientific Nalgene过滤器对样品进行0.2μ过滤并储存在4℃下。根据使用NonoDrop 2000光谱仪(其报告280nm下的值)获得的吸收光谱估计洗脱样品的蛋白质含量(1mg/mL HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3的计算消光系数＝1.49)。
将rProtein A洗脱库装载至150mL TMAE柱(EMD 1.16881.0500，内径50mm)上的10mM磷酸钠pH 7.0、0.1M NaCl中。收集流过物并通过SDS-PAGE进行检查。浓缩样品，使用Millipore Pellicon-2超滤装置将缓冲液交换至25mM磷酸钠pH 7.0、25mM NaCl，并且再装载至相同TMAE柱上的25mM磷酸钠pH 7.0、25mM NaCl中。收集流过物并通过向514mL样品中添加15.24mL的4M NaCl而调节至140mM NaCl，然后用Thermo Scientific Nalgene过滤器进行0.2μ过滤，等分试样并储存在-80℃。产生9,384mg HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3，占理论产率的96％。
实施例15.蛋白质表征。
经由如以下所论述的若干种不同的方法来表征实施例14中所描述的蛋白质。
A.紫外光谱
图24提供具有SEQ ID NO:81的成熟轻链(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3ND001的成熟轻链)和SEQ ID NO:80的成熟重链(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND004/ND006的成熟重链)的蛋白质的紫外光谱。在NonoDrop 2000光谱仪上直接由25mM磷酸钠、140mM NaCl pH 7.0中的未稀释样品测量HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3(RS)的紫外光谱。使用计算消光系数ε280 0.1％＝1.49/cm，测定蛋白质浓度为17.74mg/mL。
B.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
图25示出具有SEQ ID NO:81的成熟轻链(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3ND001的成熟轻链)和SEQ ID NO:80的成熟重链(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND004/ND006的成熟重链)的蛋白质的SDS-PAGE结果。在用于还原样品的含DTT的样品缓冲液或用于非还原样品的不含DTT的样品缓冲液中制备HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3的等分试样。在来自Invitrogen的4-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶上进行SDS-PAGE，并且用Simply Blue染色剂(Invitrogen)将凝胶染色并用蒸馏水脱色。图25显示HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1H1L3(RS)的分析结果。在还原条件下，所述凝胶显示两个谱带，分别表示HP1/2 hG4Pagly(N297Q)G1 H1L3的重链和轻链的预期分子量50和25kDa。在非还原条件下，对于抗体的HC2LC2四聚体结构，主要谱带具有150kDa的预期分子量。样品含有<0.5％的较高分子量形式。
C.等电聚焦(IEF)
图26说明具有SEQ ID NO:81的成熟轻链(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3ND001的成熟轻链)和SEQ ID NO:80的成熟重链(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND004/ND006的成熟重链)的蛋白质的IEF结果。在IEF样品缓冲液3-10中制备样品，并且在NovexpH 3-10IEF凝胶(Thermo Fisher EC66552BOX)上在130V恒值下操作92分钟。将凝胶用12％TCA固定10分钟，用Simply Blue染色剂(Invitrogen)染色并用蒸馏水脱色。HP1/2 hG4Pagly(N297Q)G1 H1L3 RS操作为单一主要谱带和若干次要更醋化变体。HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3的计算pI是6.22。图26也显示CHO DG44i细胞中表达的相同构建体，两个其他HP1/2 H1L3构建体融合至野生型IgG4P Fc和IgG4PE Fc。所述分子的凝胶迁移率与所述分子的不同的pI值一致。注意泳道中指示所有样品的计算pI。
D.分析型尺寸排阻色谱法
图27示出具有SEQ ID NO:81的成熟轻链(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3ND001的成熟轻链)和SEQ ID NO:80的成熟重链(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND004/ND006的成熟重链)的蛋白质的分析型尺寸排阻色谱法结果。在Superdex 200Increase 5/150 GL柱(GE 28-9909-45)上使用Agilent 1200系列HPLC系统以0.2ml/min的流速在从20×PBS(Thermo Scientific 28348)稀释的PBS(10mM磷酸钠、0.15M NaCl，pH 7.5)中操作20μg研究标准物。在280nm下监测洗脱液的吸光度并示于图27中。HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1H1L3在7.8分钟时洗脱为单峰，不存在可检测的聚集物或低分子量组分。
E.内毒素
使用Charles River Endosafe PTS20药筒(0.05-5EU/ml)根据制造商的说明书测定内毒素。研究标准物中发现的内毒素水平<0.06EU/mg，适于NHP注射。
F.差示扫描量热法(DSC)
图28至图30示出具有SEQ ID NO:81的成熟轻链(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1H1L3 ND001的成熟轻链)和SEQ ID NO:80的成熟重链(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3ND004/ND006的成熟重链)的蛋白质的DSC结果。将HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3研究标准物在PBS中稀释至约1mg/mL，然后在4℃下相对于PBS透析约20小时。将约400μg(400μL)每种样品添加至96孔板中。使用中等反馈模式，以2℃/min从20℃至120℃进行扫描，以提高峰分辨率。使用MicroCal DSC仪器测量各结构域的Tm值(50％蛋白质分子在动态不可逆双态平衡中去折叠的相转变温度)。进行两次缓冲液扫描以定义基线以供减去，并且使用Origin软件分析数据。为了比较，也分析了HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 Fc片段(批次BJG2018-1-3-0088-E2)的样品。作为Fab结构域指定的验证，产生并分析研究标准物的Fab2片段。HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3完整抗体、Fc和Fab2片段的熔融曲线分别示于图28、图29和图30中，并且结构域熔融温度(Tm)汇总于表11中。基于Tm值，抗体的G4P CH2结构域最不稳定(相转变温度为59.6℃)，接着是完整抗体的Fab结构域(69.1℃)和G1 CH3结构域(85.9℃)。抗体的G4P CH2结构域的Tm值为57.4℃，并且经分离的Fc片段中G1 CH3结构域的Tm值为84.5℃。对于Fab2片段，Fab结构域的Tm为69.4℃。
表11.图28至图30中所测量的HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3完整抗体、Fc结构域和Fab2片段的熔融温度
Figure GDA0003031568410001791
实施例16.蛋白质的其他实验分析。
研究两种不同HP1/2蛋白质的产品属性。第一种构建体，人源化HP1/2 H1/L3huIgG4P agly(N297Q，EU编号)/IgG1嵌合体或HP1/2 G4P agly/G1，包含SEQ ID NO:81的成熟轻链和SEQ ID NO:80的成熟重链。第二种构建体，人源化HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(T299A，EU编号)或HP1/2 G4P agly，包含SEQ ID NO:81的成熟轻链和SEQ ID NO:89的成熟重链。设计、表达、纯化并表征HP1/2的两种工程化型式。所述构建体瞬时表达于CHO细胞中。
表12.两种工程化构建体的概述
Figure GDA0003031568410001792
Figure GDA0003031568410001801
将900mL如上表中所指出含有72-122mg/L构建体(通过Octet得到的估计滴度)的CHO培养基由重力装载至9mL rProtein A Sepharose Fast Flow柱(GE 17-1279-04)上。用6×5mL 25mM磷酸钠pH 7.0、0.1M NaCl，然后用6×4mL 25mM磷酸钠pH 5.5、0.1M NaCl洗涤柱。用7×5mL 25mM磷酸钠pH 2.8、0.1M NaCl洗脱mAb。通过添加磷酸钠pH 8.6将pH中和至最终浓度20mM。观测到不同量的沉淀物。将样品以3000rpm离心5分钟并且过滤上清液，等分试样，并储存在-70℃。在中和之前和中和-离心-过滤步骤之后使用NonoDrop 2000光谱仪(其报告280nm下的值)由吸收光谱估计洗脱样品的蛋白质含量。
当中和ProA步骤后的四种抗体制剂时，由于沉淀而损失的蛋白质的量存在很大差异(参见下表13)。HP1/2 G4P agly G1型式是性质更佳的构建体，仅3％产物由于沉淀而损失。
表13.四种工程化构建体的沉淀百分比
Figure GDA0003031568410001802
如以上表13中所示，最显著是当那他珠单抗G4P agly样品被中和时可见39％产物损失。相比之下，仅为所述量三分之一(13％)的相应HP1/2构建体(HP1/2 G4P agly)由于沉淀而损失。HP1/2 G4P agly G1型式为性质最佳的构建体，仅3％产物由于沉淀而损失。
通过SDS-PAGE和尺寸排阻色谱法(SEC)表征四种构建体样品在离心和过滤之后的可溶性级分。SDS-PAGE(图31)揭示所有四个样品的单一显著谱带的分子质量为约150kDa，与IgG抗体所特有的四聚2重链2轻链复合物的存在一致。HP1/2与那他珠单抗样品之间的明显差异是那他珠单抗样品中存在较高分子量加合物的弥漫性污迹，其从显著谱带延伸至凝胶顶部，表明存在可溶性聚集物。
图32A示出HP1/2样品的SEC分析结果。图32B示出所有四种构建体的SEC分析结果。在Superdex Increase 5/150GL柱(GE 28-9909-45)上以0.2ml/min的流速在PBS(10mM磷酸钠、0.15M NaCl，pH 7.5)中操作样品。四个样品的SEC分析揭示所有样品中具有约150kDa的表观分子质量的单一主峰(图32A和图32B)。
因此，与SDS-PAGE数据一致，SEC分析揭示在主峰之前洗脱的那他珠单抗样品中的较高分子量可溶性聚集物在HP1/2样品中未检测到或大大降低。这些分析共同揭示那他珠单抗样品含有可溶性和不溶性聚集物，从而导致不良产率和比HP1/2样品下所见纯度低的纯度。
还通过差示扫描量热法(DSC)表征两种HP1/2样品的稳定性。图33a和图33b分别示出人源化HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q)/IgG1嵌合体(HP1/2 G4P agly G1，左)和人源化HP1/2 G1/L3 huIgG4P agly(T299A)(HP1/2 G4P agly，右)的DSC结果。通过差示扫描量热法(DSC)表征两种HP1/2样品的稳定性。使用MicroCal DSC仪器测定各结构域的Tm值。以2℃/min从20℃至120℃进行扫描。测量各结构域的Tm值(50％蛋白质分子在动态不可逆双态平衡中去折叠的相转变温度)。如所预期，许多热转变是相同的，因为所述两种构建体含有相同Fab区(69℃)和无糖基CH2结构域(约60℃)。
HP1/2 G4P agly G1型式的CH3结构域非常稳定，如从其Tm为约85℃显而易见，而HP1/2 G4P agly型式的CH3结构域的Tm仅为约69℃。
换句话说，HP1/2 G4P agly G1(即，具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的重链)具有优于HP1/2 G4P agly抗体的稳定性。
实施例17：HP1/2的临床药物动力学和首次用于人类的剂量预测
临床输入的反向转化整合可用于增强与临床药物动力学和药效学相关的预测的信赖度。在该实施例中，所述技术用于告知重组人源化抗α4整合素抗体HP1/2 H1/L3huIgG4P agly(N297Q，EU编号)/IgG1嵌合体(在该实施例中称为“HP1/2”或“BIIB107”)的临床药物动力学和药效学性质，其与那他珠单抗(NTZ)来自相同α4表位子类。使用整体数据整合来增加HP1/2人类药物动力学(PK)和有效剂量预测的可预测性和信赖度。
在食蟹猴(n＝18)中施用HP1/2(3和30mg/kg)和NTZ(3mg/kg)的单次静脉内剂量。来自18只食蟹猴的总计180个血清浓度(60个NTZ，120个HP1/2)和252个PD(RO)测量值(84个NTZ，168个HP1/2)可用于PKPD分析。在食蟹猴中单次静脉内药团施用3-30mg/kg HP1/2和3mg/kg那他珠单抗(Tysabri)之后的观测PK平均时程示于图34中。施用抗VLA之后，游离受体减至少于基线的10％，表明Tysabri和BIIB107在食蟹猴中的受体占用率超过90％(参见图35)。游离VLA受体在约500小时(21天)内逐渐恢复至给药前水平。HP1/2与相同剂量(3mg/kg)的那他珠单抗(100h)相比似乎使VLA受体饱和(>＝90％)持续更长时间(多达300小时)，表明HP1/2的功效相对于那他珠单抗更强。值得注意的是，较高HP1/2剂量(30mg/kg)引起受体接合时间延长约2倍，超过800小时之后水平恢复至基线水平。
HP1/2(4.73ug/mL)形成药物结合VLA的EC50(参见表14)当与Tysabri(6.40ug/mL)相比时相对较低，表明HP1/2的效能更高。
表14.Tysabri和BIIB107在猴中的模型估计PKPD参数
Figure GDA0003031568410001831
内嵌表a动物间变异性表示为变异系数。标准误差(SE)表示为相对标准误差(百分比)。
bE0＝100-E0；Emax＝100–Emax。
这些数据指示HP1/2结合到食蟹猴α4整合素的亲和力比与人类受体结合的亲和力弱约5倍(完整HP1/2)和约6倍(Fab片段)。完整那他珠单抗与食蟹猴α4整合素的结合比与人类α4整合素弱约2倍，而Fab结合在所述两个物种之间相同。这些数据也指示HP1/2与人类α4整合素结合的亲和力高于那他珠单抗。换句话说，相较于完整抗体存在约5倍差异；相较于Fab片段存在约6倍差异；并且HP1/2与那他珠单抗Fab片段之间存在超过19倍差异。这最后一项比较是重要的，因为那他珠单抗是野生型IgG4，已知其在体内进行Fab臂交换(扰乱)并且其变为功能单价的。相比之下，HP1/2在体内保持二价，因为其含有可使铰链稳定化并防止扰乱的点突变(S228P，EU编号)。出于对PD反应进行建模的目的，因此在以下所示的方程式中使用那他珠单抗Fab片段的Kd和完整HP1/2的Kd是适当的。
如图36中所示，发现α4整合素在人类和食蟹猴淋巴细胞上的表达在2倍差异内，并且不需要调节便可用于人类HP1/2预测。
使用具有线性和Michaelis-Menten消除的双隔室模型和直接Emax模型在猴子中表征NTZ和HP1/2血清浓度与α4整合素饱和度(受体占用率(RO))之间的PKPD关系。通过对猴PK参数(k10、k12、k21和V1)进行异速生长定标来预测HP1/2人类PK。参见Singh,A.P等人,TheAAPS Journal,17(2),389-399。为了确保所述方法的适当性，使用通过获取人类和猴参数相对于其个别体重的比率的对数而在猴子和人类中获得的NTZ PK参数来进行敏感性分析。将固有猴参数直接应用于人类，包括Km、Vmax和PD参数(Emax、EC50、E0和V1)。基于在猴子中进行的比较PKPD研究中收集的数据，使用在人类中的体外结合亲和力(Kd)和NTZ EC50来预测HP1/2在人类中的EC50。参见Muralidharan,K.K.等人,Journal of ClinicalPharmacology,57(8),1017-1030。在调节跨物种效能(Kd)差异之后，使用组合在猴子(m)和人类(h)中获得的EC50参数值的经验定标方法来整合数据：
Figure GDA0003031568410001841
来自最终“人源化”模型的PKPD参数值呈由多变量常态分布产生的分布的形式传递，其中平均向量设定至来自PKPD模型的估计值的群体参数估计值和共变异数矩阵。选择在Cmax下产生<＝10％的平均RO的剂量来定义HP1/2的最低预期生物有效水平(MABEL)剂量。
在单次静脉内施用后模拟HP1/2和那他珠单抗的受体占用率相对于时间的曲线(图37A至图37D)。预期每4周施用0.5mg/kg的单次剂量是有效的，在给药后约1个月之后次治疗占用率水平(<70％)开始恢复至基线。HP1/2和NTZ都展现具有靶介导的药物处置的PK曲线，并且在猴子中显示剂量依赖性RO。预计HP1/2(0.62ug/mL)形成药物结合α4的EC50值当与NTZ(2.51ug/mL)相比时较低。参见Muralidharan,K.K.等人,Journal of ClinicalPharmacology,57(8),1017-1030。预测与观测NTZ人类PK曲线之间存在总体良好的一致性，从而支持异速生长定标方法足以预测HP1/2临床PK。预计HP1/2在人类中的MABEL为0.0004mg/kg(相比之下，NTZ为约0.003mg/kg，参见图38)。
鉴于该实施例17，跨两种人源化抗α4整合素抗体整合可利用PKPD数据使得能够使用反向转化建模方法来估计受体占用率和人类药物动力学，以便鉴定最低预期生物有效水平剂量。
以上所描述的本发明的实施方案旨在仅为示例性的；众多变化和修改对本领域技术人员将是显而易见的。所有这些变化和修饰都旨在处于如任何所附权利要求中所限定的本发明范围内。
序列表
<110> 马萨诸塞州渤健公司(Biogen MA Inc.)
<120> 具有降低的效应功能的抗VLA-4抗体
<130> 2790-211
<160> 94
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 地中海小家鼠(Mus spretus)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Val Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Trp
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
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1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
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1 5 10 15
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Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
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65 70 75 80
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
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Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
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Gln Val Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
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<212> PRT
<213> 地中海小家鼠(Mus spretus)
<400> 6
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
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<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Ser Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成多肽
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成多肽
<400> 11
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
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1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Lys Thr Tyr
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
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210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 15
<211> 235
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<210> 31
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Thr Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 48
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Thr Asp Phe Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser Pro Asp Pro Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
65 70 75 80
Ser Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
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115 120 125
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Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
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1 5 10 15
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Ser Lys Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
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195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly
225
<210> 51
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Leu Val
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
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Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
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130 135 140
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
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Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
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Leu Ser Leu Gly
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<210> 56
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
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Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
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Leu Ser Leu Gly
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<211> 228
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Leu Ser Leu Gly
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<211> 231
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
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Leu Ser Pro
225
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<211> 231
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
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<211> 447
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<210> 62
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 63
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<400> 64
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225
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<400> 67
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<400> 69
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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Gln Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 72
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
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Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
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290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
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420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 73
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1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 74
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
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Ser Pro Gly
225
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 75
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 76
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 77
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<211> 231
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 78
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<210> 79
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 79
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Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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<210> 80
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 80
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
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435 440 445
<210> 81
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 81
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1 5 10 15
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210
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 82
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50 55 60
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<210> 83
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 83
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1 5 10 15
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
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<210> 84
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 84
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
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85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 85
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 85
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 86
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 86
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 87
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 88
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 88
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
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290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
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385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 89
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Ala Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 90
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 90
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 91
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 91
atggacttcg gcctgtccct ggtgttcctg gtgctgatcc tgaagggcgt gcagtgcagc 60
atcgtgatga cccagagccc cgacagcctg gccgtgagcc tgggcgagcg cgccaccatc 120
aactgcaagg ccagccagag cgtgaccaac gacgtggcct ggtatcagca gaagcccggc 180
cagcccccca agctgctgat ctactacgcc agcaaccgct acaccggcgt gcccgaccgc 240
ttcagcggca gcggctacgg caccgacttc accttcacca tcagcagcct ccaggccgag 300
gacgtggcca cctacttctg ccagcaagac tacagcagcc cctacacctt cggccagggc 360
accaaggtgg agatcaagcg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggcaa ctcccaggag 540
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagctccac cctgacgctg 600
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660
tcctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt aa 702
<210> 92
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 92
Met Asp Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Ser Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val
20 25 30
Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val
35 40 45
Thr Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser
100 105 110
Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 93
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 93
atggatatgc gcgtgcctgc ccaacttctc ggacttctcc tcctttggct gcctggagcc 60
cgatgtgagg tgcagctggt gcagagcggc gccgaggtga agaagcccgg cgccaccgtg 120
aagatcagct gcaaggccag cggcttcaac atcaaggaca cctacatgca ctgggtgcag 180
caggcccccg gcaagggcct ggagtggatg ggccgcatcg accccgccag cggcgacacc 240
aaatacgacc ccaagttcca agtccgggtg accatcaccg ccgacaccag caccgacacc 300
gcctacatgg agctgagcag cctgcgcagc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccgac 360
ggcatgtggg tcagcaccgg ctacgccctg gacttctggg gccagggcac cctggtgacc 420
gtctcgagcg ctagtaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcgccctg ctcccggagc 480
acctccgaga gcacagccgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaacctgtg 540
acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600
caatcctcag gactctactc cctctcttcc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660
acgaagacct acacctgtaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 720
gttgagtcca aatatggtcc cccatgccca ccttgcccag cacctgagtt cctgggggga 780
ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcactt gcgtggtggt ggatgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gtttaactgg 900
tacgtggatg gcgtggaagt ccacaatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttccaa 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aagactggct gaacggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaaggc ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc gcgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtctc gctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc ctccgacatt 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ttggactccg acggctcctt ctttctctac tccaaactca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
caaaaaagcc tctccctcag cccgggctga 1410
<210> 94
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成氨基酸序列
<400> 94
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
20 25 30
Val Lys Lys Pro Gly Ala Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr
65 70 75 80
Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr
85 90 95
Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr
115 120 125
Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
145 150 155 160
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr
210 215 220
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
225 230 235 240
Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
340 345 350
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly
465

Claims (65)

1.一种重组抗α4抗体或其α4结合片段，所述重组抗α4抗体或其α4结合片段包含：
(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；
(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；
(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和
(d)人类IgG1的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
2.如权利要求1所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述人类IgG1的恒定重链包含至少两个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
3.如权利要求1所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述人类IgG1的恒定重链包含至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个、或至少十个、或至少十一个、或至少十二个、或至少十三个、或至少十四个、或至少十五个、或至少十六个、或至少十七个、或至少十八个、或至少十九个、或至少二十个、或至少二十一个、或至少二十二个、或至少二十三个、或至少二十四个、或至少二十五个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
4.如权利要求1所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述人类IgG1的恒定重链包含选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
5.一种重组抗α4抗体或其α4结合片段，所述重组抗α4抗体或其α4结合片段包含：
(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；
(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；
(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和
(d)嵌合Fc区，所述嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CH1结构域和CH2结构域以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域，所述嵌合Fc区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：对所述CH2区中EU编号第297位(Kabat编号第314位)的谷氨酰胺(Q)的取代；对所述铰链区中EU编号氨基酸第228位(Kabat编号第241位)的脯氨酸(P)的取代；和所述CH3区中EU编号第447位(Kabat编号第478位)的赖氨酸(K)的缺失。
6.如权利要求5所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述抗体或片段与包含以下的抗体相比具有增加的热稳定性：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和(d)包含IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域的Fc区，所述Fc区包含对EU编号第297位(Kabat编号第314位)的非天冬酰胺残基的取代或由其组成。
7.一种重组抗α4抗体或其α4结合片段，所述重组抗α4抗体或其α4结合片段包含：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和(d)人类IgG4的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
8.如权利要求7所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述人类IgG4的恒定重链包含至少两个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
9.如权利要求7所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述人类IgG4的恒定重链包含至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
10.如权利要求7所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述人类IgG4的恒定重链包含以下突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
11.一种重组抗α4抗体或其α4结合片段，所述重组抗α4抗体或其α4结合片段包含：
(a)含有SEQ ID NO:80的序列的重链；和
(b)含有SEQ ID NO:81的序列的轻链。
12.一种编码蛋白质的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含：
(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；
(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；
(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和
(d)人类IgG1的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
13.一种编码蛋白质的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含：
(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；
(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；
(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和
(d)人类IgG1的恒定重链，所述恒定区包含至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个、或至少十个、或至少十一个、或至少十二个、或至少十三个、或至少十四个、或至少十五个、或至少十六个、或至少十七个、或至少十八个、或至少十九个、或至少二十个、或至少二十一个、或至少二十二个、或至少二十三个、或至少二十四个、或至少二十五个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
14.一种编码蛋白质的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含：
(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；
(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；
(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和
(d)嵌合Fc区，所述嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CH1和CH2结构域以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域，所述嵌合Fc区包含对所述CH2区中EU编号第297位(Kabat编号第314位)的谷氨酰胺(Q)的取代；对所述铰链区中EU编号氨基酸第228位(Kabat编号第241位)的脯氨酸(P)的取代；和所述CH3区中EU编号第447位(Kabat编号第478位)的赖氨酸(K)的缺失。
15.一种编码蛋白质的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和(d)人类IgG4的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
16.一种编码蛋白质的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和(d)人类IgG4的恒定重链，所述恒定区包含至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
17.一种编码蛋白质的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含：
(a)含有SEQ ID NO:80的序列的重链；和
(b)含有SEQ ID NO:81的序列的轻链。
18.一种减轻患有多发性硬化症的患者的症状的方法，所述方法包括：
向所述患者施用治疗有效量的重组抗α4抗体，所述抗体包含：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和(d)人类IgG1的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
19.一种减轻患有多发性硬化症的患者的症状的方法，所述方法包括：
向所述患者施用治疗有效量的重组抗α4抗体，所述抗体包含：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和(d)人类IgG1的恒定重链，所述恒定区包含至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个、或至少十个、或至少十一个、或至少十二个、或至少十三个、或至少十四个、或至少十五个、或至少十六个、或至少十七个、或至少十八个、或至少十九个、或至少二十个、或至少二十一个、或至少二十二个、或至少二十三个、或至少二十四个、或至少二十五个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
20.一种减轻患有多发性硬化症的患者的症状的方法，所述方法包括：
向所述患者施用治疗有效量的重组抗α4抗体，所述抗体包含：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和(d)嵌合Fc区，所述嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CH1和CH2结构域以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域，所述嵌合Fc区包含对所述CH2区中EU编号第297位(Kabat编号第314位)的谷氨酰胺(Q)的取代；对所述铰链区中EU编号氨基酸第228位(Kabat编号第241位)的脯氨酸(P)的取代；和所述CH3区中EU编号第447位(Kabat编号第478位)的赖氨酸(K)的缺失。
21.一种减轻患有多发性硬化症的患者的症状的方法，所述方法包括：
向所述患者施用治疗有效量的重组抗α4抗体，所述抗体包含：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和(d)人类IgG4的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
22.一种减轻患有多发性硬化症的患者的症状的方法，所述方法包括：
向所述患者施用治疗有效量的重组抗α4抗体，所述抗体包含：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和(d)人类IgG4的恒定重链，所述恒定区包含至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
23.一种减轻患有多发性硬化症的患者的症状的方法，所述方法包括：
向所述患者施用治疗有效量的重组抗α4抗体，所述抗体包含：(a)含有SEQ ID NO:80的序列、基本上由所述序列组成或由所述序列组成的重链；和(b)含有SEQ ID NO:81的序列、基本上由所述序列组成或由所述序列组成的轻链。
24.如权利要求18、19、20、21、22或23所述的方法，其中所述多发性硬化症是多发性硬化症的复发形式。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述多发性硬化症的复发形式是临床孤立综合征、复发性缓解性多发性硬化症或活动性继发性进行性多发性硬化症。
26.如权利要求18、19、20、21、22或23所述的方法，其中所述多发性硬化症是原发性进行性多发性硬化症或进行性复发性多发性硬化症。
27.如权利要求18、19、20、21、22或23所述的方法，其中所述多发性硬化症是多发性硬化症的活动性形式，包括多发性硬化症的活动性复发形式。
28.如权利要求18、19、20、21、22或23所述的方法，其中所述患者是人类。
29.一种宿主细胞，所述宿主细胞用以下多聚核苷酸转染：(a)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；和人类IgG1的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失；以及
(b)编码抗体轻链的多聚核苷酸，所述抗体轻链包含含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链和人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链。
30.一种宿主细胞，所述宿主细胞用以下多聚核苷酸转染：(a)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；和人类IgG1的恒定重链，所述恒定区包含至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个、或至少十个、或至少十一个、或至少十二个、或至少十三个、或至少十四个、或至少十五个、或至少十六个、或至少十七个、或至少十八个、或至少十九个、或至少二十个、或至少二十一个、或至少二十二个、或至少二十三个、或至少二十四个、或至少二十五个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失；以及
(b)编码抗体轻链的多聚核苷酸，所述抗体轻链包含含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链和人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链。
31.一种宿主细胞，所述宿主细胞用以下多聚核苷酸转染：(a)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；和嵌合Fc区，所述嵌合Fc区含有来自IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CH1和CH2结构域以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域，所述嵌合Fc区包含对所述CH2区中EU编号第297位(Kabat编号第314位)的谷氨酰胺(Q)的取代；对所述铰链区中EU编号氨基酸第228位(Kabat编号第241位)的脯氨酸(P)的取代；和所述CH3区中EU编号第447位(Kabat编号第478位)的赖氨酸(K)的缺失；以及
(b)编码抗体轻链的多聚核苷酸，所述抗体轻链包含含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链和人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链。
32.一种宿主细胞，所述宿主细胞用以下多聚核苷酸转染：(a)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链和人类IgG4的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失；以及
(b)编码抗体轻链的多聚核苷酸，所述抗体轻链包含含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链和人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链。
33.一种宿主细胞，所述宿主细胞用以下多聚核苷酸转染：(a)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链和人类IgG4的恒定重链，所述恒定区包含至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失；以及
(b)编码抗体轻链的多聚核苷酸，所述抗体轻链包含含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链和人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链。
34.一种宿主细胞，所述宿主细胞用以下多聚核苷酸转染：(a)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含SEQ ID NO:80的序列；和(b)编码轻链的多聚核苷酸，所述轻链包含SEQ ID NO:81的序列。
35.如权利要求29、30、31、32、33或34所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
36.一种制造重组抗α4抗体或其α4结合片段的方法，所述方法是通过以下实现：提供用以下多聚核苷酸转染的宿主细胞：(a)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；和人类IgG1的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达；以及(b)编码抗体轻链的多聚核苷酸，所述抗体轻链包含含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链和人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达。
37.一种制造重组抗α4抗体或其α4结合片段的方法，所述方法是通过以下实现：提供用以下多聚核苷酸转染的宿主细胞：(a)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；和人类IgG1的恒定重链，所述恒定区包含至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个、或至少十个、或至少十一个、或至少十二个、或至少十三个、或至少十四个、或至少十五个、或至少十六个、或至少十七个、或至少十八个、或至少十九个、或至少二十个、或至少二十一个、或至少二十二个、或至少二十三个、或至少二十四个、或至少二十五个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达；以及(b)编码抗体轻链的多聚核苷酸，所述抗体轻链包含含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链和人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达。
38.一种制造重组抗α4抗体或其α4结合片段的方法，所述方法是通过以下实现：提供用以下多聚核苷酸转染的宿主细胞：(a)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；和嵌合Fc区，所述嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CH1和CH2结构域以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域，所述嵌合Fc区包含对所述CH2区中EU编号第297位(Kabat编号第314位)的谷氨酰胺(Q)的取代；对所述铰链区中EU编号氨基酸第228位(Kabat编号第241位)的脯氨酸(P)的取代；和所述CH3区中EU编号第447位(Kabat编号第478位)的赖氨酸(K)的缺失，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达；以及
(b)编码抗体轻链的多聚核苷酸，所述抗体轻链包含含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链和人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达。
39.一种制造重组抗α4抗体或其α4结合片段的方法，所述方法是通过以下实现：提供用以下多聚核苷酸转染的宿主细胞：(a)编码抗体轻链的多聚核苷酸，所述抗体轻链包含含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链和人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达；以及(b)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；和人类IgG4的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达。
40.一种制造重组抗α4抗体或其α4结合片段的方法，所述方法是通过以下实现：提供用以下多聚核苷酸转染的宿主细胞：(a)编码抗体轻链的多聚核苷酸，所述抗体轻链包含含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链和人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达；以及(b)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；和人类IgG4的恒定重链，所述恒定区包含至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达。
41.一种制造重组抗α4抗体或其α4结合片段的方法，所述方法是通过以下实现：
提供用以下多聚核苷酸转染的宿主细胞：(a)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含SEQ ID NO:80的序列，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达；和
(b)编码轻链的多聚核苷酸，所述轻链包含SEQ ID NO:81的序列，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达；以及
培养所述经转染的宿主细胞以产生所述重组抗α4抗体分子或其α4结合片段。
42.如权利要求36、37、38、39、40或41所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
43.一种重组抗α4抗体或其α4结合片段，所述重组抗α4抗体或其α4结合片段包含：
(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；
(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；
(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；
(d)人类IgG1的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失；以及
(e)所述重组抗α4抗体或其α4结合片段相对于包含野生型IgG4恒定区的抗体或结合片段对扰乱具有降低的易感性。
44.如权利要求43所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述人类IgG1的恒定重链包含至少两个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
45.如权利要求43所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述人类IgG1的恒定重链包含至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个、或至少十个、或至少十一个、或至少十二个、或至少十三个、或至少十四个、或至少十五个、或至少十六个、或至少十七个、或至少十八个、或至少十九个、或至少二十个、或至少二十一个、或至少二十二个、或至少二十三个、或至少二十四个、或至少二十五个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
46.如权利要求43所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述人类IgG1的恒定重链包含选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
47.一种重组抗α4抗体或其α4结合片段，所述重组抗α4抗体或其α4结合片段包含：
(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；
(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；
(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；
(d)嵌合Fc区，所述嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CH1结构域和CH2结构域以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域，所述嵌合Fc区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：对所述CH2区中EU编号第297位(Kabat编号第314位)的谷氨酰胺(Q)的取代；对所述铰链区中EU编号氨基酸第228位(Kabat编号第241位)的脯氨酸(P)的取代；和所述CH3区中EU编号第447位(Kabat编号第478位)的赖氨酸(K)的缺失；并且
(e)所述重组抗α4抗体或其α4结合片段相对于包含野生型IgG4恒定区的抗体或结合片段对扰乱具有降低的易感性。
48.如权利要求47所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述抗体或片段与包含以下的抗体相比具有增加的热稳定性：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和(d)包含IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域的Fc区，所述Fc区包含对EU编号第297位(Kabat编号第314位)的非天冬酰胺残基的取代或由其组成。
49.一种重组抗α4抗体或其α4结合片段，所述重组抗α4抗体或其α4结合片段包含：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；(d)人类IgG4的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失；并且(e)所述重组抗α4抗体或其α4结合片段相对于包含野生型IgG4恒定区的抗体或结合片段对扰乱具有降低的易感性。
50.如权利要求49所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述人类IgG4的恒定重链包含至少两个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
51.如权利要求49所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述人类IgG4的恒定重链包含至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
52.如权利要求49所述的重组抗α4抗体或α4结合片段，其中所述人类IgG4的恒定重链包含以下突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
53.一种重组抗α4抗体或其α4结合片段，所述重组抗α4抗体或其α4结合片段包含：
(a)含有SEQ ID NO:80的序列的重链；
(b)含有SEQ ID NO:81的序列的轻链；和
(c)所述重组抗α4抗体或其α4结合片段相对于包含野生型IgG4恒定区的抗体或结合片段对扰乱具有降低的易感性。
54.一种使重组抗α4抗体或其α4结合片段对扰乱的易感性相对于包含野生型IgG4恒定区的抗体或结合片段降低的方法，所述方法包括：
提供用以下多聚核苷酸转染的宿主细胞：(a)编码抗体轻链的多聚核苷酸，所述抗体轻链包含含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链和人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达；以及(b)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；和人类IgG4的恒定重链，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达；以及
向所述人类IgG4的恒定重链中引入至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
55.一种使重组抗α4抗体或其α4结合片段对扰乱的易感性相对于包含野生型IgG4恒定区的抗体或结合片段降低的方法，所述方法包括：
提供用以下多聚核苷酸转染的宿主细胞：(a)编码抗体轻链的多聚核苷酸，所述抗体轻链包含含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链和人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达；以及(b)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；和人类IgG4的恒定重链，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达；以及
向所述人类IgG4的恒定重链中引入至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
56.一种产生相对于包含野生型IgG4恒定区的抗体或结合片段对扰乱具有降低的易感性的重组抗α4抗体或其α4结合片段的方法，所述方法包括：
提供用以下多聚核苷酸转染的宿主细胞：(a)编码抗体重链的多聚核苷酸，所述抗体重链包含SEQ ID NO:80的序列，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达；以及(b)编码轻链的多聚核苷酸，所述轻链包含SEQ ID NO:81的序列，所述多聚核苷酸定位以在所述细胞中表达；以及
培养所述经转染的宿主细胞以产生所述重组抗α4抗体分子或其α4结合片段。
57.如权利要求53、54、55或56所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
58.一种治疗患有癫痫症的患者的方法，所述方法包括：
向所述患者施用治疗有效量的重组抗α4抗体，所述抗体包含：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和(d)人类IgG1的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
59.一种治疗患有癫痫症的患者的方法，所述方法包括：
向所述患者施用治疗有效量的重组抗α4抗体，所述重组抗α4抗体包含：(a)含有SEQ IDNO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ IDNO:82)的恒定轻链；和(d)人类IgG1的恒定重链，所述恒定区包含至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个、或至少十个、或至少十一个、或至少十二个、或至少十三个、或至少十四个、或至少十五个、或至少十六个、或至少十七个、或至少十八个、或至少十九个、或至少二十个、或至少二十一个、或至少二十二个、或至少二十三个、或至少二十四个、或至少二十五个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S和K478缺失。
60.一种治疗患有癫痫症的患者的方法，所述方法包括：
向所述患者施用治疗有效量的重组抗α4抗体，所述抗体包含：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和(d)嵌合Fc区，所述嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CH1和CH2结构域以及来自IgG1同种型的IgG抗体的CH3结构域，所述嵌合Fc区包含对所述CH2区中EU编号第297位(Kabat编号第314位)的谷氨酰胺(Q)的取代；对所述铰链区中EU编号氨基酸第228位(Kabat编号第241位)的脯氨酸(P)的取代；和所述CH3区中EU编号第447位(Kabat编号第478位)的赖氨酸(K)的缺失。
61.一种治疗患有癫痫症的患者的方法，所述方法包括：
向所述患者施用治疗有效量的重组抗α4抗体，所述抗体包含：(a)含有SEQ ID NO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ ID NO:82)的恒定轻链；和(d)人类IgG4的恒定重链，所述恒定区包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
62.一种治疗患有癫痫症的患者的方法，所述方法包括：
向所述患者施用治疗有效量的重组抗α4抗体，所述重组抗α4抗体包含：(a)含有SEQ IDNO:11的序列的可变轻链；(b)含有SEQ ID NO:4的序列的可变重链；(c)人类κ轻链(SEQ IDNO:82)的恒定轻链；和(d)人类IgG4的恒定重链，所述恒定区包含至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个选自由以下组成的组的突变：根据Kabat编号方案的S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P和K478缺失。
63.一种治疗患有癫痫症的患者的方法，所述方法包括：
向所述患者施用治疗有效量的重组抗α4抗体，所述抗体包含：(a)含有SEQ ID NO:80的序列、基本上由所述序列组成或由所述序列组成的重链；和(b)含有SEQ ID NO:81的序列、基本上由所述序列组成或由所述序列组成的轻链。
64.如权利要求58、59、60、61、62或63所述的方法，其中所述癫痫症是耐药性癫痫症。
65.如权利要求58、59、60、61、62或63所述的方法，其中所述患者是人类。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101874041A (zh) * 2007-09-26 2010-10-27 中外制药株式会社 抗体恒定区修饰体
CN102369291A (zh) * 2009-01-23 2012-03-07 比奥根艾迪克Ma公司 效应子功能降低的稳定Fc多肽及使用方法
CN103038257A (zh) * 2010-04-16 2013-04-10 比奥根艾迪克Ma公司 抗vla-4抗体
WO2014150973A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Methods for producing fabs and bi-specific antibodies
CN105452295A (zh) * 2012-12-10 2016-03-30 比奥根Ma公司 抗血液树突细胞抗原2抗体及其用途

Family Cites Families (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US6033665A (en) 1989-09-27 2000-03-07 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating leukocyte adhesion to brain endothelial cells
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5474771A (en) 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
ES2088838T3 (es) 1992-11-13 2004-01-01 Idec Pharmaceuticals Corporation Secuencias kozak de consenso totalmente alteradas destinadas a la expresion en los mamiferos.
DK0678122T3 (da) 1993-01-12 2000-03-06 Biogen Inc Rekombinante anti-VLA4 antistofmolekyler
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5840299A (en) 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
BRPI9707379B8 (pt) 1996-02-09 2015-07-07 Abbvie Biotechnology Ltd Composições farmacêuticas compreendendo anticorpo humano recombinante geneticamente engenheirado, e anticorpo humano recombinante geneticamente engenheirado.
ATE386809T1 (de) 1996-08-02 2008-03-15 Bristol Myers Squibb Co Ein verfahren zur inhibierung immunglobulininduzierter toxizität aufgrund von der verwendung von immunoglobinen in therapie und in vivo diagnostik
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
AU737155B2 (en) 1997-03-14 2001-08-09 Biogen Idec Inc. Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
PT1068241E (pt) 1998-04-02 2007-11-19 Genentech Inc Variantes de anticorpos e respectivos fragmentos
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
CA2398561A1 (en) 2000-01-27 2001-08-02 American Cyanamid Company Method for preparing alpha-sulfonyl hydroxamic acid derivatives
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
DE60143544D1 (de) 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
US20030157641A1 (en) 2001-11-16 2003-08-21 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
AU2003209446B2 (en) 2002-03-01 2008-09-25 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
DK1534335T4 (en) 2002-08-14 2015-10-05 Macrogenics Inc FCGAMMARIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
EP3502133A1 (en) 2002-09-27 2019-06-26 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
SI1562972T1 (sl) 2002-10-15 2010-12-31 Facet Biotech Corp ALTERACIJA FcRn VEZANIH AFINITET ALI SERUMSKIH RAZPOLOVNIH DOB ANTITELESC Z MUTAGENEZO
GB2395337B (en) 2002-11-14 2005-12-28 Gary Michael Wilson Warning Unit
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
EP1664116A4 (en) 2003-08-22 2009-06-03 Biogen Idec Inc IMPROVED ANTIBODIES WITH CHANGED EFFECTOR FUNCTION AND MANUFACTURING METHOD THEREFOR
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
WO2005063815A2 (en) 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
EP1697520A2 (en) 2003-12-22 2006-09-06 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites
EP2154157A3 (en) 2004-01-12 2010-04-28 Applied Molecular Evolution Inc. FC region variants
CA2561264A1 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
SI2471813T1 (sl) 2004-07-15 2015-03-31 Xencor, Inc. Optimirane Fc variante
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
MX2007013924A (es) 2005-05-09 2008-01-28 Glycart Biotechnology Ag Moleculas que unen antigeno que tienen regiones fc modificadas y union alterada a receptores fc.
KR101516823B1 (ko) 2006-03-17 2015-05-07 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 안정화된 폴리펩티드 조성물
WO2008001243A2 (en) 2006-06-06 2008-01-03 Koninklijke Philips Electronics N.V. Device and method for generating a random number and random element for use in the same
WO2008021954A2 (en) 2006-08-09 2008-02-21 Biogen Idec Ma Inc. Method for distribution of a drug
WO2008131242A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
CN101802197A (zh) 2007-05-14 2010-08-11 比奥根艾迪克Ma公司 单链FC（ScFc）区、包含其的结合多肽及与其相关的方法
WO2008153954A1 (en) 2007-06-07 2008-12-18 Cadbury Adams Usa Llc Flip open package with tiered compartments

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101874041A (zh) * 2007-09-26 2010-10-27 中外制药株式会社 抗体恒定区修饰体
CN102369291A (zh) * 2009-01-23 2012-03-07 比奥根艾迪克Ma公司 效应子功能降低的稳定Fc多肽及使用方法
CN103038257A (zh) * 2010-04-16 2013-04-10 比奥根艾迪克Ma公司 抗vla-4抗体
CN105452295A (zh) * 2012-12-10 2016-03-30 比奥根Ma公司 抗血液树突细胞抗原2抗体及其用途
WO2014150973A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Methods for producing fabs and bi-specific antibodies

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