CN103038257A - 抗vla-4抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及α-4结合抗体及其片段。

Description

抗VLA-4抗体
相关申请
本申请要求2010年4月16日提交的美国临时申请No.61/324,944的权益，其通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及α-4结合抗体及其片段。
发明背景
人源化抗体可代替鼠抗体用作治疗剂以避免人体中的称为HAMA(人抗小鼠抗体)反应的不良免疫反应。通常通过用另一物种(通常为小鼠抗体)的CDR置换人抗体的互补决定区(CDR)来构建人源化抗体。
VLA-4(也称为α4β1)是细胞表面受体的β1整联蛋白家族的成员。VLA-4含有α4链和β1链并且牵涉于细胞间的相互作用中。其表达主要限于淋巴和骨髓细胞。VLA-4结合内皮细胞配体VCAM-1(血管细胞粘附分子-1)，并且可介导T和B淋巴细胞附着于人血浆纤连蛋白的肝素II结合片段。
发明概要
发明人已经发现种系可变区骨架可用于优化CDR移植α-4结合抗体，例如抗VLA-4抗体。因此，本发明特写了抗VLA-4可变重(VH)和可变轻(VL)链和包括此类骨架的抗体分子。
一方面，本发明特写了具有来自供体抗α4抗体(例如，本文所述抗α4抗体)的CDR的抗α4抗体VH链，和具有来自VH链的序列的区域1、2、3和4或对于VH链而言与种系可变区序列具有不超过5、10或15个差异的VH骨架。在一个实施方案中，可变骨架区4(FR4)为人共有序列。在一个实施方案中，存在完整的VH链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4。在另一个实施方案中，链为VH区的抗原结合片段。
在一个实施方案中，种系序列为图1中描绘的人IGHV1-f(SEQ IDNO:2)。在某些实施方案中，VH骨架序列可与种系序列(例如，SEQ ID NO:2)有至少一个但不超过2、3、4、5、10或15个氨基酸残基不同。在一个实施方案中，除相应人残基外，VH骨架进一步包括其它残基。例如，VH链包括在SEQ ID NO:2的骨架位置24、67、76、80和94(Kabat编号)的一处或多处的非人残基。
在一个实施方案中，可变结构域的至少一个或多个互补决定区(CDR)源自供体非人α4-结合抗体。在一个实施方案中，CDR移植重链可变结构域的抗原结合区包括与位置26-34(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)相对应的CDR(Kabat编号；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，第4卷，1991,U.S.Department of Health and Human Services,NIH,USA)。
因此，在一个实施方案中，可变重链(VH)骨架具有源自人抗体种系序列IGHV1-f的受体序列。
在另一个实施方案中，在VH的FR1区中，至少一个氨基酸和少于2、3、4、5或10个氨基酸残基不同于相应的人种系残基。例如，一个或多个此类残基可与CDR序列源自其中的非人抗体骨架区相同。在一个实施方案中，Kabat位置24处的氨基酸残基突变为与非人抗体骨架区相同。
在另一个实施方案中，在VH的FR2区中，至少一个氨基酸和少于2、3、4、5或10个氨基酸残基不同于相应的人种系残基。例如，一个或多个此类残基可与CDR序列源自其中的非人抗体骨架区相同。
在又一个实施方案中，在VH链的FR3中，至少一个氨基酸和少于2、3、4、5或10个氨基酸残基不同于相应的人种系残基。例如，一个或多个此类残基可与CDR序列源自其中的非人抗体骨架区相同。在一个实施方案中，Kabat位置94处的氨基酸残基与非人抗体骨架区相同。在又一个实施方案中，Kabat位置67、76、80和94处的氨基酸残基与非人抗体骨架区相同。
在某些实施方案中，抗体的VH链具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列。
一方面，本发明特写了具有来自供体抗VLA-4抗体(例如，本文所述抗VLA-4抗体)的CDR的抗VLA-4VL链，和具有来自VL链的序列的区域1、2、3和4或对于VL链而言与种系可变区序列具有不超过5、10或15个差异(每个区域或总共)的VL骨架。在一个实施方案中，可变骨架区4(FR4)为人共有序列。在一个实施方案中，存在完整的VL链骨架区FR1、FR2、FR3和FR4。在另一个实施方案中，链为VL区的抗原结合片段。
在另一个实施方案中，种系序列为图2中描绘的IGKV4-1(SEQ IDNO:7)。在又一个实施方案中，VL骨架序列可与种系骨架序列(例如，SEQ IDNO:7)有至少一个但不超过2、3、4、5、10或15个氨基残基不同。在另一个实施方案中，除相应人氨基酸残基外，VL进一步包括其它残基。例如，VL链进一步包括在SEQ ID NO:7的骨架位置1、73和87(Kabat编号)的一处或多处的非人残基。
在一个实施方案中，序列为图2中描绘的AAH7035.1(SEQ ID NO:12)或其种系工程化形式(SEQ ID NO:13)。在一些实施方案中，VL骨架序列可与种系工程化骨架序列(例如，SEQ ID NO:13)有至少一个但不超过5、10、15、20或25个氨基酸残基不同。在一个实施方案中，除相应人残基外，VL链包括其它残基。例如，VL链包括在SEQ ID NO:12的骨架位置1和87(Kabat编号)的一处或多处的非人残基。在另一个实施方案中，VL在骨架区包括氨基酸取代以类似于不同人种系骨架序列，例如来自种系序列IGKV4-1。在某些实施方案中，将VL骨架序列改变为与在SEQ ID NO:12的位置1-3、5-23、35-37、39-42、45-49、57、59-61、63-64、70-72、74-84、86-88、99-106(Kabat编号)处的IGKV4-1种系序列相同。
在一个实施方案中，可变结构域的至少一个或多个互补决定区(CDR)源自供体非人α4-结合抗体。在另一个实施方案中，CDR移植重链可变结构域的抗原结合区包括与位置24-31(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)(Kabat编号)相对应的CDR。因此，在一个实施方案中，VL骨架具有由IGKV4-1种系序列、抗体AAH70335.1或由种系工程化抗体AAH70335.1构建的受体序列。
在又一个实施方案中，在VL链的FR1中，至少一个氨基酸和少于2、3、4、5、10或15个残基不同于相应的人残基。例如，一个或多个此类残基可与CDR序列源自其中的非人抗体骨架区相同。在一个实施方案中，FR1的N端位置的氨基酸残基突变为与非人抗体骨架区相同。
在另一个实施方案中，在VL链的FR2中，至少一个氨基酸和少于2、3、4、5、10或15个残基不同于相应的人残基。例如，一个或多个此类残基可与CDR序列源自其中的非人抗体骨架区相同。
在又一个实施方案中，在VL的FR3中，至少一个氨基酸和少于2、3、4、5、10或15个残基不同于相应的人残基。例如，一个或多个此类残基可与CDR序列源自其中的非人抗体骨架区相同。在另一个实施方案中，Kabat位置87处的氨基酸残基突变为与非人抗体骨架区相同。在又一个实施方案中，Kabat位置67和87处的氨基酸残基突变为与非人抗体骨架序列相同。在又一个实施方案中，在SEQ ID NO:7的Kabat位置67、73和87处的氨基酸残基突变为与非人抗体骨架序列相同。
在其它实施方案中，抗体的VL链具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列。
在一个实施方案中，选择VH和VL受体骨架序列与非人(例如，鼠)抗体序列的CDR序列类似的CDR，其中非人抗体结合整联蛋白α-4或其片段。在另一个实施方案中，选择与结合VLA-4α4链的B1表位的非人抗体的CDR序列类似的CDR序列。在一个实施方案中，选择与鼠单克隆抗体，例如HP1/2、HP2/1、HP2/4、L25、P4C2或21.6类似的CDR(Pulido等，J.Biol.Chem.266:10241-10245,1991；美国专利No.6,033,665)。修饰可指(例如)切除和插入或改变，例如通过定点诱变。
另一方面，本发明特写了抗体或其抗原结合片段，其包括：
-本文所述抗VLA-4VL链，例如，具有来自供体抗VLA-4抗体(例如，本文所述抗VLA-4抗体)的CDR的抗VLA-4VL链，和具有来自VL链的序列的LC骨架区1、2和3或对于VL链而言与种系可变区序列具有不超过5、10或15个差异的VL骨架。在一个实施方案中，可变区4为人共有序列；和
-本文所述抗VLA-4VH链，例如具有来自供体抗VLA-4抗体(例如，本文所述抗VLA-4抗体)的CDR的抗VLA-4VL链，和具有来自VL链的序列的LC骨架区1、2和3或对于VL链而言与种系可变区序列具有不超过5、10或15个差异的VL骨架。在一个实施方案中，可变区4为人共有序列。
在一个实施方案中，抗体结合α4β1和α4β7的其中一者或两者。
另一方面，可检测地标记本文所述VL或VH链或抗体或其片段。
又一方面，本发明特写了含有编码本文所述抗体重链或其α4结合片段的DNA的载体。在一些实施方案中，载体的DNA编码具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列的VH。
又一方面，本发明特写了含有编码本文所述抗体轻链或其α4结合片段的DNA的载体。在一些实施方案中，载体的DNA编码具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列的VL链。
又一方面，本发明特写了含有编码本文所述抗体重链或其α4结合片段和本文所述抗体轻链或其α4结合片段的DNA的载体。
另一方面，本发明特写了含有本文所述载体的宿主细胞，例如能够表达本文所述重和/或轻链抗体或抗体片段的宿主细胞。
一方面，本发明特写了制备重组抗α4抗体或其α4-结合片段的方法，所述方法通过提供用(a)编码本文所述抗体重链或其α4-结合片段的DNA序列，和(b)编码抗体轻链或其α4-结合片段的DNA序列转染的宿主细胞，并且培养转染细胞以产生重组抗α4抗体分子或其α4-结合片段。编码抗体重链和轻链的DNA可在相同载体或不同载体上产生。
一方面，本发明特写了制备重组抗α4抗体或其α4-结合片段的方法，所述方法通过提供用(a)编码抗体重链或其α4-结合片段的DNA序列(例如，其中DNA序列具有SEQ ID NO:3、4或5的序列)，和(b)编码抗体轻链或其α4-结合片段的DNA序列(例如，其中DNA序列具有SEQ ID NO:8、9、10或11的序列)转染的宿主细胞，并且培养转染细胞以产生重组抗α4抗体分子或其α4-结合片段。编码抗体重链和轻链的DNA可在相同载体或不同载体上产生。
另一方面，本发明特写了通过向需要此类治疗的受试者施用本文所述的α4抗体或抗体片段或含有抗体或片段的药物组合物治疗由α4整联蛋白，例如α4β1(VLA-4)或α4β7整联蛋白介导的疾病或病症的方法。受试者可患有以下疾病或处于发展以下疾病的风险中，例如炎症性、免疫性或自身免疫性病症(例如，中枢神经系统炎症，诸如多发性硬化、脑膜炎、视神经脊髓炎、神经系统结节病、CNS脉管炎、脑炎和横贯性脊髓炎)、组织或器官移植排斥或移植物抗宿主病、急性CNS损伤(例如中风、外伤性脑损伤(TBI)或脊椎损伤(SCI))；慢性肾病；过敏症，例如变应性哮喘；1型糖尿病；炎症性肠病，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎；重症肌无力；纤维肌痛；关节炎病症，例如风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎；炎症性/免疫性皮肤病症，例如牛皮癣、白癫风、皮炎、扁平苔癣；全身性红斑狼疮；干燥综合征(Sjogren′s Syndrome)；血液学癌症，例如多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤；实体癌，例如如肺、乳房、前列腺、大脑的肉瘤或癌；和纤维化病症，例如肺纤维化、骨髓纤维化、肝硬化、系膜增生性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、糖尿病性肾病和肾间质纤维化。
另一方面，本发明特写了通过向患者施用α4结合抗体或抗体片段治疗患者的方法。在一个实施方案中，患者患有癌症，例如实体瘤或血液恶性肿瘤。例如，用α4结合抗体或抗体片段治疗的患者可患有急性骨髓性白血病(AML)或多发性骨髓瘤(MM)。
在另一个实施方案中，患者患有炎症，例如多发性硬化、哮喘(例如，中度至重度哮喘)、风湿性关节炎、糖尿病或克罗恩病。在另一个实施方案中，按一种方案施用所述组合物。在又一个实施方案中，所述方法进一步包括选择适合用组合物治疗的患者。例如，适合治疗的患者已证实了表明疾病发作的迹象或症状，例如表明MS的迹象或症状。
在又一个实施方案中，所述方法进一步包括向患者施用第二治疗剂，例如化学治疗剂、血栓溶解剂、神经保护剂、抗炎剂、类固醇、细胞因子或生长因子。
在一个实施方案中，向患者施用本文所述的人源化抗VLA-4抗体或其片段，例如HuHP1/2、H1L1、H1L2或H1L3。
在一个实施方案中，按一种方案，例如定期施用含有α4结合抗体的组合物。例如，可每天、每周或每月施用1次组合物；每周1次、每周2次、每周3次、每周4次或更多；或每2周1次、每3周1次、每4周1次或更多。
在一个实施方案中，可根据患者对先前施用的抗α4抗体的清除率调整剂量。例如，在一个实施方案中，在患者体内的抗α4抗体的水平降至预定水平以下之前将不会向患者施用第二或后续剂量。在一个实施方案中，测定来自患者的样品(例如，血浆、血清、血液或尿样品)是否存在抗α4抗体，并且如果抗α4抗体的水平高于预定水平，将不会向患者施用第二或后续剂量。如果患者体内的α4抗体的水平低于预定水平，则向患者施用第二或后续剂量。
在一个实施方案中，连续使用组合物，例如在30min以上但小于1、2、4或12小时的期间。可通过适当方法，例如经皮下、肌肉内或静脉内施用含有抗体和第二药剂的组合物。
在一些实施方案中，抗体和第二药剂的每一种均按相同剂量施用，如同每一种均开处方用于单一疗法一样。在其它实施方案中，按等于或小于如果单独施用的疗效所需的量施用抗体。同样，按等于或小于如果单独施用的疗效所需的量施用第二药剂。
本公开中特写的另一方面是通过确定患者是否满足预选标准和患者是否满足向患者批准、提供、开处方或施用本文所述VLA-4结合抗体制剂的预选标准来评估患者的方法。在一个实施方案中，预选标准为患者不能对先前的交替治疗或方案(例如，用于MS的治疗)充分反应。在另一个实施方案中，预选标准为缺乏进行性多灶性脑白质病(PML)的任何迹象或症状，或缺乏PML的任何诊断。在一些情况下，基于PML风险因素的缺乏进行选择，例如受试者对于JC病毒DNA测试不呈阳性或对于JC病毒抗体测试不呈阳性。在另一个实施方案中，标准如通过引用特此并入的PCT/US07/75577(作为WO2008/021954公开)中所述，其描述了用于药物分配和向患者提供药物的方法和系统。
另一方面，提供了分配本文所述组合物的方法。组合物含有α-4结合抗体。所述方法包括为受者(例如，最终使用者、患者、医师、零售或批发药房、经销商或医院、疗养院诊所或HMO的药剂科)提供装有治疗患者至少6、12、24、36或48个月的足够单位剂量的药物的包。另一方面，本发明特写了评估一包或许多包的本文所述含有α-4结合抗体的组合物的质量(例如，确定其是否已经过期)的方法。所述方法包括评估所述包是否已经过期。有效期为从预选事件，例如生产、化验或包装开始，至少6、12、24、36或48个月，例如大于24或36个月。在一些实施方案中，根据分析的结果采取决定或步骤。例如，根据正确分析，根据产品是否已经过期来使用或丢弃、分类、选择、放出或扣留、运输、移动至新地点、投放到市场中、销售或提供以出售、退出市场或不再提供以出售包装的抗体。
另一方面，本发明特写了装有至少2个单位剂量的含有α4结合抗体的水性组合物的包。在一个实施方案中，所有单位剂量均含有相同量的抗体，并且在其它实施方案中存在两种或更多种强度的单位剂量，或两种或更多种不同制剂，例如具有不同强度或释放性质。
另一方面，本发明包括指导受者施用含有α4结合抗体的制剂。所述方法包括指导受者(例如，最终使用者、患者、医师、零售或批发药房、经销商或医院、疗养院诊所或HMO的药剂科)，应根据本文所述的方案向患者施用抗体。所述方法还可包括指导受者，应在有效期之前施用抗体。有效期为从预选事件，例如生产、化验或包装开始，至少6、12、24、36或48个月，例如大于24或36个月。在一个实施方案中，受者也接受抗体的供给，例如单位剂量的抗体的供给。
另一方面，本发明特写了制备抗体的方法，所述抗体包括来自供体抗体例如非人(例如，鼠)抗体的CDR，和源自人种系可变区骨架区或区域的一条或两条重链和轻链可变区骨架。所述方法包括1和2的其中一项或两项，其中1和2如下：
1.鉴定或选择在a)、b)和c)的一项或多项中的一个或多个残基处具有与非人供体重链相同的残基的稳定人受体重链可变骨架：
a)VH Kabat#2、4、24、26、27、29、36、38、46、47、48、49、66、67、69、71、78、93和94，不受理论约束，据信对维持CDR构象非常重要；
b)VH Kabat#1、2、27、28、30、43、66、68、70、72、73、74和75，不受理论约束，据信能与抗原相互作用；和
c)VH Kabat#37、39、44、45、47、91、93和103，不受理论约束，据信对于VH/VL界面完整性非常重要；和
2.鉴定或选择在a)、b)和c)的一项或多项中的一个或多个残基处具有与供体轻链相同的残基的稳定受体轻链可变骨架：
a)VL Kabat#2、4、38、43、44、48、58、64、71和73，不受理论约束，据信对维持CDR构象非常重要；
b)VL Kabat#1、2、49、57、60、63、65、66、67、68、69和70，不受理论约束，据信能与抗原相互作用；和
c)VL Kabat#36、38、43、44、46、49、87和98，不受理论约束，据信对于VH/VL界面完整性非常重要；
3.提供具有供体CDR的可变区和具有在1或2中鉴定的匹配残基的所选种系骨架，例如通过选择种系序列并进一步使在1或2中鉴定的种系的另外的残基突变回鼠序列以进一步最大化在1或2中鉴定的匹配；和
4.例如通过3D结构分析或建模，评估每个匹配位置，并评估位置是否满足(例如)干扰CDR构象、抗原相互作用或VH/VL界面完整性的风险的预定标准，然后再引入与抗体结构相容的等效鼠残基或常见人抗体残基。
在一个实施方案中，(1.a)中鉴定的至少3、4或5个残基匹配。例如，在一个实施方案中，残基24、29或94匹配。
在一个实施方案中，(1.b)中鉴定的至少3、4、或5个残基匹配。例如，在一个实施方案中，残基1、73或75匹配。
在一个实施方案中，(1.c)中鉴定的至少3、4、或5个残基匹配。例如，在一个实施方案中，残基37、93或103匹配。
在一个实施方案中，(2.a)中鉴定的至少3、4、或5个残基匹配。例如，在一个实施方案中，残基2、71和73匹配。
在一个实施方案中，(2.b)中鉴定的至少3、4、或5个残基匹配。例如，在一个实施方案中，残基1、68或70匹配。
在一个实施方案中，(2.c)中鉴定的至少3、4、或5个残基匹配。例如，在一个实施方案中，残基46、87或98匹配。
在一个实施方案中，(1.a)中的残基6、(1.b)中的残基2和(1.c)中的残基4匹配。
在另一个实施方案中，(2.a)中的残基4、(2.b)中的残基2和(2.c)中的残基4匹配。
在一个实施方案中，重链种系序列为VH3、VH1和VH5种系类。在另一个实施方案中，轻链种系序列为Vkappa或Vlambda序列。
术语“治疗”指按改善与病症相关的病状、症状或参数或防止病症进展至统计上显著的程度或本领域的技术人员可检测的程度有效的量、方式和/或模式施用疗法。有效的量、方式或模式可根据受试者而改变并且可为受试者定制。
“α4结合抗体”指与VLA-4(α4β1)整联蛋白的α4亚单位结合，并且至少部分抑制VLA-4的活性，尤其是VLA-4整联蛋白的结合活性或信号转导活性（例如转导VLA-4介导的信号的能力）的抗体。例如，VLA-4结合抗体可抑制VLA-4与VLA-4的同源配体，例如诸如VCAM-1(血管细胞粘附分子-1)的表面蛋白，或与诸如纤连蛋白或骨桥蛋白的细胞外基质组分结合。α-4结合抗体可能与α4β1或α4β7结合。通常，抗体与α4的B1表位结合。α4结合抗体可能以低于约10-6、10-7、10-8、10-9、10-10或10-11M的Kd与VLA-4结合。
如本文所使用，术语“抗体”指包括至少一个提供免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列的免疫球蛋白可变区，例如氨基酸序列。例如，抗体可包括1个重(H)链可变区(本文缩写为VH)和1个轻(L)链可变区(本文缩写为VL)。在另一个实例中，抗体包括2个重(H)链可变区和2个轻(L)链可变区。免疫球蛋白的轻链可为κ或λ型。在一个实施方案中，抗体糖基化。抗体可对抗体依赖性细胞毒性和/或补体介导的细胞毒性起作用，或对于这些活性的一种或两种无作用。
VH和VL区可进一步细分为称为“互补决定区”(“CDR”)，散布有更保守的称为“骨架区”(FR)的区域的超变区。已精确限定了FR和CDR的范围(见，Kabat、E.A.等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、Fifth  Edition、U.S.Department of Health and Human Services、NIH公布No.91-3242；和Chothia、C.等(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。本文使用Kabat定义。每个VH和VL通常由3个CDR和4个FR构成，按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
“免疫球蛋白结构域”指来自免疫球蛋白分子的可变或恒定结构域的结构域。免疫球蛋白结构域通常含有由约7条β链和保守二硫键形成的2个β折叠(见，例如A.F.Williams和A.N.Barclay(1988)Ann.Rev.Immunol.6:381-405)。
如本文所使用，“免疫球蛋白可变结构域序列”指可形成免疫球蛋白可变结构域的结构的氨基酸序列。例如，序列可包括天然存在的可变结构域的所有或部分氨基酸序列。例如，序列可能遗漏1、2个或更多个N或C端氨基酸、内部氨基酸，可能包括一个或多个插入或附加的末端氨基酸，或可能包括其它改变。在一个实施方案中，包括免疫球蛋白可变结构域序列的多肽可与另一免疫球蛋白可变结构域序列结合以形成靶结合结构(或“抗原结合位点”)，例如与VLA-4相互作用的结构。
抗体的VH或VL链可进一步包括整个或部分重链或轻链恒定区，从而分别形成免疫球蛋白重链或轻链。在一个实施方案中，抗体为2条免疫球蛋白重链和2条免疫球蛋白轻链的四聚物。免疫球蛋白重链和轻链可通过二硫键连接。重链恒定区通常包括3个恒定结构域CH1、CH2和CH3。轻链恒定区通常包括一个CL结构域。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和典型补体系统的第一组分(Clq)。
术语“免疫球蛋白”包括各种广泛类别的可从生物化学上区别的多肽。本领域的技术人员将意识到，重链分类为γ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些亚类(例如，γ1-γ4)。将抗体的“类别”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的是这条链的特性。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等，表征清楚并且已知赋予了功能特化。鉴于本公开，这些类别和同种型的每一个的修饰形式易于为技术人员辨别，并且因此，在本发明的范围之内。所有免疫球蛋白类别明显在本发明的范围之内。轻链分类为κ或λ(κ、λ)。每条重链类别均可与κ或λ轻链结合。
术语全长抗体的“抗原结合片段”指全长抗体保持与所关注靶标(例如，VLA-4)特异性结合的能力的一个或多个片段。涵盖于术语全长抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括通过铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-546)；和(vi)保持功能性的分离互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但是使用重组方法，通过能够使其制备为蛋白质单链的合成连接子连接两个结构域，其中VL和VH区配对形成称为单链Fv(scFv)的单价分子。见例如，Bird等(1988)Science 242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883。
在一些实施方案中，上述抗体被聚乙二醇化。
在一些实施方案中，上述抗体或其片段为多特异性的。在更多实施方案中，上述抗体或其片段为单价或双特异性的。
以下的附图和描述中提出了本发明一个或多个实施方案的详情。从描述和附图以及从权利要求将显而易见本发明的其它特征、目的和优点。
附图简述
图1展示了HP1/2重链向人重链种系IGHV1-f的3种序列变体。序列上方的小写字母表示根据Kabat编号方案的插入。
图2展示了HP1/2轻链向种系IGKV4-1抗体序列(设计L0、L1和L2)或人κ种系工程化AAH7033.1抗体序列(设计L3)的4种序列变体。序列上方的小写字母表示根据Kabat编号方案的插入。
图3为描绘ELISA试验的结果的曲线图。
图4为描绘ELISA试验的结果的曲线图。
图5为IgG4Fc(铰链+CH2+CH3结构域)的氨基酸序列。用粗体描绘铰链区，并且为CH3结构域加下划线。加框的“S”为Ser228。画圈的“N”为Asn297。
图6为描绘来自HuHP1/2与各种肿瘤细胞系结合的流式细胞仪数据的曲线图。“HP1/2”指人源化HP1/2。
图7A-7C为一组描绘HuHP1/2对AML细胞系与涂覆纤连蛋白或VCAM1-Ig的孔的结合的抑制的曲线图。图7A描绘了对HL60和KG1细胞与涂覆FN的孔的结合的抑制。图7B描绘了对KG1细胞与涂覆VCAM1-Ig的孔的结合的抑制。图7C描绘了当与20μg/mL HuHP1/2孵育时对HL60细胞与涂覆FN和VCAM1-Ig的孔的结合的抑制(实体柱)。空白柱表示在同种型对照存在下的细胞粘着百分比。“HP1/2”指人源化HP1/2。
图8A-8C组成一组描绘HuHP1/2对MM细胞系与涂覆纤连蛋白或VCAM1-Ig的孔的结合的抑制的曲线图。图8A描绘了对U266和H929细胞与涂覆FN的孔的结合的抑制。图8B描绘了对U266和H929细胞与涂覆VCAM1-Ig的孔的结合的抑制。图8C描绘了当与20μg/mL HuHP1/2孵育时对U266细胞与涂覆FN和VCAM1-Ig的孔的结合的抑制(实体柱)。空白柱表示在同种型对照存在下的细胞粘着百分比。“HP1/2”指人源化HP1/2。
图9A-9C组成一组描绘HuHP1/2对CLL细胞系与涂覆纤连蛋白或VCAM1-Ig的孔的结合的抑制的曲线图。图9A描绘了对Mec1和JM1细胞与涂覆FN的孔的结合的抑制。图9B描绘了对Mec1和JM1细胞与涂覆VCAM1-Ig的孔的结合的抑制。图9C描绘了当与20μg/mL HuHP1/2孵育时对Mec1细胞与涂覆FN和VCAM1-Ig的孔的结合的抑制(实体柱)。空白柱表示在同种型对照存在下的细胞粘着百分比。“HP1/2”指人源化HP1/2。
发明详述
已经证实抗VLA-4抗体在治疗疾病中有用。例如，那他珠单抗(Tysabri
Figure BDA00002596835000121
)，抗VLA-4抗体，用于治疗复发性多发性硬化和克罗恩病。然而，对于某些病状，例如急性病状诸如脊椎损伤(SCI)或外伤性脑损伤(TBI)的治疗，或施用有限次数的治疗例如癌症的治疗，用以不同于那他珠单抗的亲和力(例如，较高亲和力)结合的抗VLA-4抗体治疗可能有利。另外，用抗VLA-4抗体治疗与罕见但是有时致死的病症进行性多灶性白质脑病(PML)相关，对于所述病症而言，部分治疗需要(例如)使用血浆交换或免疫吸附从受治受试者中去除抗体。由于需要去除抗体，也期望平衡对VLA-4具有增加亲和力的抗体的优点和结合非常紧密以致使得难以去除或产生低周转率相关的风险的抗体的缺点。此类抗体也可用于治疗诸如多发性硬化的病状，因为可能需要不那么频繁的治疗或通过除输注之外的方式施用可能更有效。以较低剂量使治疗可能也可降低不良事件(例如PML)的风险。因此，本发明提供了具有所需性质的抗体。
本发明至少部分基于新设计的对α4的结合亲和力是抗α4抗体那他珠单抗的结合亲和力的10倍的人源化α4结合抗体的非预期特征。
提供了α4结合抗体及其片段，其中可变轻链(VL)和可变重链(VH)骨架具有由种系或种系工程化抗体序列构建的受体序列，例如IGKV4-1或geAAH70335.1或IGHV1-f抗体。CDR序列源自非人抗α4结合抗体，例如抗VLA-4抗体HP1/2。本文所述的抗体(例如)相对于其鼠亲本的亲和力增强至少1.5、2.0、2.5、3.0倍。在一个实施方案中，亲和力增强至少1.5、2.0、2.5、3.0倍，但是分别低于25、20或15倍。
药物组合物
α4结合剂，例如VLA-4结合抗体，可配制为药物组合物。通常，药物组合物包括药学上可接受的载体。如本文所使用，“药学上可接受的载体”包括所有任何生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸附延缓剂等。
“药学上可接受的盐”指保持亲本化合物的所需生物学活性并且不赋予任何不良毒理学效应的盐(见例如，Berge,S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括源自无毒无机酸，例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸等，以及源自无毒有机酸，例如脂肪族一元羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等的酸加成盐。碱加成盐包括源自碱金属，例如钠、钾、镁、钙等，以及源自无毒有机胺，例如N,N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的碱加成盐。
可根据本领域中已知的方法配制本文所述的抗体组合物。药物制剂是得到确认的技术，并且在Gennaro(编)，Remington:The Science and Practice of  Pharmacy，第20版，Lippincott,Williams&Wilkins(2000)(ISBN:0683306472)；Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery  Systems，第7版，Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN:0683305727)；和Kibbe(编)，Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association，第3版(2000)(ISBN:091733096X)中进一步描述。
在一个实施方案中，可用赋形剂材料，例如氯化钠、磷酸氢二钠七水合物、磷酸二氢钠和聚山梨醇酯80配制α4抗体。在另一个实施方案中，可将α4抗体配制于例如在pH 5、5.5、6、6.5、7或7.5下的柠檬酸盐缓冲液中。在又一个实施方案中，可将α4抗体配制于包括2、4、5、6、8、10、12、14或15%蔗糖的溶液中。例如，可在浓度为约20mg/ml的缓冲溶液中提供并且可储存在2-8℃下。
药物组合物也可呈各种其它形式。这些包括(例如)液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注的溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。形式可取决于预期的施用模式和治疗应用。通常，本文所述药剂的组合物呈可注射或可输注溶液的形式。
此类组合物可通过肠胃外方式(例如，静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射)施用。如本文所使用的短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”指除肠内和局部施用之外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在生产和储存条件下药物组合物通常必须无菌且稳定。也可测试药物组合物以确保其满足施用的监管和行业标准。
可将组合物配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。根据需要，可通过在具有上面列举的成分的一种或组合的适当溶剂中并入所需量的本文所述药剂，接着过滤灭菌制备无菌注射液。通常，通过将本文所述药剂并入含有基础分散介质和所需来自上面列举的其它成分的无菌媒介物中制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，典型制备方法是真空干燥和冷冻干燥，获得本文所述药剂的粉剂加上来自其先前无菌过滤溶液的任何附加所需成分。例如，可通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散体的情况下通过保持所需粒度和通过使用表面活性剂来保持溶液的适当流动性。可通过使延缓吸收的药剂，例如单硬脂酸盐和明胶包括在组合物内使可注射组合物的吸收延长。
施用
可通过多种方法向受试者，例如人受试者，施用α4结合抗体。对于许多应用而言，施用途径为以下的一种：静脉内注射或输注、皮下注射或肌肉内注射。可按固定剂量或按mg/kg剂量施用α4结合抗体。可经静脉内(IV)或经皮下(SC)施用抗体。例如，可按约50-600mg IV之间的固定单位剂量，例如每4周施用一次抗体，或按约50-100mg SC之间的固定单位剂量(例如，75mg)，例如至少每周施用一次抗体(例如，每周2次)。在一个实施方案中，按50mg、60mg、80mg、100mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、180mg、200mg、300mg、400mg、500mg或600mg或更高的固定单位剂量IV施用抗体。IV剂量的施用可为每周1次或2次或3次或更多次，或每2、3、4或5周一次或更长时间一次。
在一个实施方案中，按50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、100mg或120mg或更高的固定单位剂量SC施用抗体。SC剂量的施用可为每周1次或2次或3次或更多次，或每2、3、4或5周一次或更长时间一次。
也可按约1至10mg/kg之间的剂量，例如约6.0mg/kg、4.0mg/kg、3.0mg/kg、2.0mg/kg、1.0mg/kg的大药丸施用抗α4抗体。剂量变更范围包括低于约600mg/受试者的剂量，约400mg/受试者、约300mg/受试者、约250mg/受试者、约200mg/受试者或约150mg/受试者，通常用于每4周或每月施用一次。例如，可每3-5周，例如每4周或每月施用α4结合抗体一次。
可根据患者对先前施用的抗α4抗体的清除率调整剂量。例如，在患者体内的抗α4抗体的水平降至预定水平以下之前可能不向患者施用第二或后续剂量。在一个实施方案中，测定来自患者的样本(例如，血浆、血清、血液、尿液或脑脊液(CSF))是否存在抗α4抗体，并且如果抗α4抗体的水平高于预定水平，将不会向患者施用第二或后续剂量。如果患者体内的α4抗体的水平低于预定水平，则向患者施用第二或后续剂量。1或2或3天或一周后可再次测试确定抗α4水平太高(高于预定水平)的患者，并且如果患者样本中抗α4抗体的水平降至预定水平以下，可向患者施用第二或后续剂量的抗体。
也可选择剂量以减少或避免抗α4结合抗体的抗体产生，以达到高于40、50、70、75或80%的α4亚单位饱和，以达到低于80、70、60、50或40%的α4亚单位饱和，或以防止循环白血细胞的水平升高。
在某些实施方案中，可用会防止化合物迅速释放的载体，例如包括植入物和微胶囊化递送系统的控释制剂制备活性剂。可使用生物可降解、生物相容聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的许多方法申请了专利或通常已知。见例如，Controlled  Drug Delivery(Drugs and the Pharmaceutical Sciences)，第2版，J.Robinson 和V.H.L.Lee编，Marcel Dekker,Inc.,New York,1987。
可用医疗装置施用药物组合物。例如，可用皮下无针注射装置，例如美国专利No.5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公开的装置施用药物组合物。例如，在美国专利No.4,487,603、美国专利No.4,486,194、美国专利No.4,447,233、美国专利No.4,447,224、美国专利No.4,439,196和美国专利No.4,475,196中讨论了众所周知的植入物和组件的实例，美国专利No.4,487,603公开了用于按受控速率分散药物的可植入微型输注泵；美国专利No.4,486,194公开了用于通过皮肤施用药剂的治疗设备；美国专利No.4,447,233公开了用于按精确输注速率递送药物的药物输注泵；No.4,447,224公开了用于持续药物递送的可植入式变流量输注装置；美国专利No.4,439,196公开了具有多室隔间的渗透药物递送系统；并且美国专利No.4,475,196公开了渗透药物递送系统。当然，许多其它此类植入物、递送系统和组件也已知。
本公开还特写了用于施用第一和第二药剂的装置。所述装置可(例如)包括一个或多个用于储存药物制剂的外壳，并且可构造为递送单位剂量的第一和第二药剂。第一和第二药剂可储存在同一或单独隔间中。例如，在施用之前所述装置可合并药剂。也可能使用不同装置来施用第一和第二药剂。
调整剂量方案以提供所需反应，例如治疗反应或组合疗效。通常，可使用VLA-4结合剂和第二药剂的剂量(单独或共同配制的)的任何组合以便为受试者提供生物可用量的两种药剂。
如本文所使用的剂量单位形式或“固定剂量”指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算以产生预期疗效的预定量的活性化合物连同所需药物载体并且任选地连同其它药剂。
药物组合物可包括“治疗有效量”的本文所述药剂。可根据施用的第一和第二药剂的组合效果确定此有效量。药剂的治疗有效量也可能根据以下因素改变，例如病情、年龄、性别和个体的体重和化合物在个体中引起预期反应的能力，例如改善至少一种病症参数例如多发性硬化参数，或改善病症的至少一种症状例如多发性硬化的症状(例如肌肉萎缩、共济失调和震颤)。治疗有效量也是治疗有益作用比组合物的任何毒性或有害作用更重要的量。
装置和试剂盒
可用医疗装置施用含有本文所述抗体的制剂。所述装置可设计为具有诸如轻便、室温储存和易于使用的特征，以致可在紧急情况下，例如由未经训练的受试者或在场的紧急救援人员使用，移动到医疗设施和其它医疗设备上。所述装置可包括(例如)一个或多个用于储存包括α4结合抗体的药物制剂的外壳，并且可构造为递送一个或多个单位剂量的药剂。
例如，可用经皮递送装置，例如注射器，包括皮下或多室注射器，施用药物组合物。其它适合递送装置包括支架、导管、显微操作针和可植入的控释装置。可用标准IV设备，包括(例如)IV管，用或不用串联过滤器经静脉内施用组合物。在某些实施方案中，所述设备将为用于SC或IM施用的注射器。
可用医疗设备施用药物组合物。例如，可用皮下无针注射装置，例如美国专利No.5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公开的装置施用药物组合物。例如，在美国专利No.4,487,603、美国专利No.4,486,194、美国专利No.4,447,233、美国专利No.4,447,224、美国专利No.4,439,196和美国专利No.4,475,196中讨论了众所周知的植入物和组件的实例，美国专利No.4,487,603公开了用于按受控速率分散药物的可植入微型输注泵；美国专利No.4,486,194公开了用于通过皮肤施用药剂的治疗设备；美国专利No.4,447,233公开了用于按精确输注速率递送药物的药物输注泵；No.4,447,224公开了用于持续药物递送的可植入式变流量输注装置；美国专利No.4,439,196公开了具有多室隔间的渗透药物递送系统；并且美国专利No.4,475,196公开了渗透药物递送系统。治疗性组合物也可呈用于皮下或肌肉内施用的生物可降解或非生物可降解的缓释制剂形式。用于此类组合物的方法在本领域中已知。也可使用可植入或外用泵实现持续施用。也可(例如)通过每天注射间歇性进行施用，或按低剂量，例如以缓释制剂持续进行施用。递送装置可改进为最佳适于施用α4结合抗体。例如，可将注射器硅化至对于储存和递送抗体最佳的程度。当然，许多其它此类植入物、递送系统和组件也已知。
本公开还特写了用于施用第一和第二药剂(例如，抗体和第二药剂)的装置。所述装置可包括(例如)一个或多个用于储存药物制剂的外壳，并且可构造为递送单位剂量的第一和第二药剂。第一和第二药剂可储存在同一或单独隔间中。在一个实施方案中，在施用之前所述装置合并药剂。在一些实施方案中，用不同装置施用第一和第二药剂。
可在试剂盒中提供α4结合抗体。在一个实施方案中，试剂盒包括(a)装有包括高浓度的VLA-4结合抗体的组合物的容器，任选地(b)装有包括第二药剂的组合物的容器，和任选地(c)信息材料。信息材料可为涉及本文所述方法和/或药剂对于治疗利益的用途的描述性、指导性营销材料或其它材料。在一个实施方案中，试剂盒还包括第二药剂。例如，试剂盒包括装有包括α4结合抗体的组合物的第一容器和包括第二药剂的第二容器。
试剂盒的信息材料形式不限。在一个实施方案中，信息材料可包括关于抗体的生产、浓度、有效期、批次和生产地点的信息等。在一个实施方案中，信息材料涉及(例如)以适合剂量、剂型或施用模式(例如，本文所述的剂量、剂型或施用模式)施用α4结合抗体，以治疗患有急性病症(例如脊椎损伤或外伤性脑损伤)或炎症性疾病(例如，MS)的受试者，或有处于与炎症性疾病相关的阶段的风险的受试者的方法。信息可以各种格式提供，包括印刷文本、计算机可读材料、录象或录音或提供实质性材料的链接或地址的信息。
除药剂外，试剂盒中的组合物可包括其它成分，例如溶剂或缓冲液、稳定剂或防腐剂。药剂可以任何形式提供，例如液体、干燥或冻干形式，并且大体上纯净和/或无菌。当于液体溶液中提供药剂时，液体溶液通常为水溶液。当作为干燥形式提供药剂时，通常通过添加适合溶剂复溶。可任选在试剂盒中提供溶剂，例如无菌水或缓冲液。
试剂盒可包括一个或多个用于组合物或含有药剂的组合物的容器。在一些实施方案中，试剂盒装有用于组合物和信息材料的单独容器、分配器或隔间。例如，组合物可装在瓶、小瓶或注射器中，而信息材料可装在塑料套管或塑料袋中。在其它实施方案中，试剂盒的单独元件可装在单个未分割容器中。例如，组合物装在以标签形式贴有信息材料的瓶、小瓶或注射器中。在一些实施方案中，试剂盒包括若干(一盒)单独容器，每个容器装有一种或多种单位剂型(例如，本文所述剂型)的药剂。容器可包括组合单位剂量，例如包括例如呈所需比例的α4结合抗体和第二药剂的单位。例如，试剂盒可包括若干注射器、安瓿、铝箔包、泡板包装或医疗设备，每一个均装有(例如)单次组合单位剂量。试剂盒的容器可为气密性、防水(例如，不受水分或蒸发改变)和/或不透光。
试剂盒任选地包括适于施用组合物的设备，例如注射器或其它适合的递送装置。提供预先装载一种或两种药剂的装置或可为空的但是适合装载。
肿瘤学
本文所述的α4结合抗体和方法可用于治疗癌症，包括实体癌和血液恶性肿瘤。示例性实体癌包括例如肺、乳房、胰腺、结肠、前列腺、膀胱和大脑的肉瘤和癌。血液恶性肿瘤包括癌症，例如多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。
提供了用于用含有α4结合抗体例如本文所述抗VLA-4抗体的组合物治疗患有血液恶性肿瘤的患者的方法。血液恶性肿瘤是身体造血和免疫系统的癌症。这种类型的癌症影响血液、骨髓和/或淋巴结。血液恶性肿瘤包括白血病，例如急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性早幼粒细胞白血病、急性红白血病和毛细胞白血病(HCL)；淋巴瘤，例如霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤；和多发性骨髓瘤；原发性巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroblobulinemia)；骨髓增生异常综合征(MDS)(可以AML告终)；骨髓增生性疾病，例如真性红细胞增多(也称为PV、PCV或红细胞增多(PRV))、原发性血小板增多症(ET)、骨髓纤维化、重链病；和由于轻链病引起的淀粉体。
可通过用(例如)可用于鉴定恶性肿瘤细胞的光学显微镜分析血细胞计数和血涂片鉴定患有血液恶性肿瘤的患者。例如来自骨髓的活组织检查也可用于鉴定恶性肿瘤细胞，并且来自淋巴结的活组织检查可用于鉴定淋巴结病。
α4结合抗体(例如，人源化抗VLA-4抗体例如HuHP1/2、H1L0、H1L1、H1L2或H1L3)用于治疗白血病，例如AML。白血病是起源于骨髓的癌症，其中恶性肿瘤细胞为白血细胞(白细胞)。AML(也称为急性骨髓性白血病、急性成髓细胞白血病、急性粒细胞白血病和急性非淋巴细胞白血病)是在粒细胞或单核细胞中出现的恶性肿瘤。AML特征在于不能起正常血细胞的作用，称为白血病原始细胞的细胞不受控制、夸大的增长和积累，并且阻断正常骨髓细胞的生成，导致血液中缺乏红细胞(贫血)和血小板(血小板减少)和正常白细胞(尤其是嗜中性粒细胞，即嗜中性白血球减少症)。
所有子类型的AML均适合用VLA-4结合抗体治疗。根据诊断时成髓细胞已经达到的发育阶段来为AML的子类型分类。种类和亚类使医师决定对于细胞类型而言哪种治疗效果最好和疾病发展可能多快。亚类为：M0，成髓细胞性，特殊分析时；M1，成髓细胞性，未成熟；M2，成髓细胞性，成熟；M3，早幼粒细胞性；M4，髓单核细胞性；M5，单核细胞性；M6，红白血病；和M7，巨核细胞性。VLA-4抗体可与特别适合AML亚类的第二药剂一起使用。例如，急性早幼粒细胞白血病(APL)和急性单核细胞白血病是需要不同于AML亚类的治疗的AML亚类。用于治疗APL的第二药剂包括全反式视黄酸(ATRA)或抗代谢物，例如阿糖胞苷。用于治疗急性单核细胞白血病的第二药剂可包括脱氧腺苷类似物，例如2-氯-2′-脱氧腺苷(2-CDA)。
AML的风险因素包括某些遗传病的存在，例如唐氏综合征、范科尼贫血(Fanconi anemia)、Shwachman-Diamond综合征等。可向患有AML和遗传病的患者施用VLA-4结合抗体和第二药剂以治疗遗传病的症状。例如，可向患有AML和范科尼贫血的患者施用VLA-4结合抗体和抗生素。
AML的其它风险因素包括用于治疗不同癌症的化学疗法或放射疗法、烟草烟雾和暴露于大量苯中。
其它适合用α4结合抗体治疗的癌症包括实体瘤，例如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮细胞肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维耳姆斯瘤(Wilm’s tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、小细胞肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
其它病症
本文所述制剂和方法也可用于治疗其它炎症性、免疫性或自身免疫性病症，例如中枢神经系统的炎症(例如，除多发性硬化、脑膜炎、神经脊髓炎、神经系统结节病、CNS脉管炎、脑炎和横贯性脊髓炎外)；组织或器官移植物排斥或移植物抗宿主病；急性CNS损伤，例如中风或脊椎损伤(SCI)；慢性肾病；过敏症，例如变应性哮喘、中度至重度过敏性鼻炎、眼部过敏；1型糖尿病；炎症性肠病，例如克罗恩病、溃疡性结肠炎(例如，用于治疗或保持缓解)；嗜酸细胞性胃肠炎；重症肌无力；纤维肌痛；风湿病学/免疫学相关病症，例如关节炎，例如风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎；皮肤病症，例如炎症性/免疫性皮肤病，例如牛皮癣、白癫风、皮炎(例如，特应性皮炎)、扁平苔癣、中度至重度慢性荨麻疹；全身性红斑狼疮(SLE；例如狼疮性肾炎)；硬皮病(例如，进行性全身性硬化(PSS)，例如肺的PSS)；急性或慢性原发嗜酸细胞性肺炎；干燥综合征；急性冠脉综合征(ACS)；急性心肌梗塞；动脉粥样硬化；和纤维化病症，例如肺纤维化(例如，先天性肺纤维化)、肺部纤维化(例如，XRT诱导的)、骨髓纤维化、肝硬化、系膜增生性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、糖尿病肾病和肾间质纤维化。
本文所述制剂和方法也可用于治疗神经障碍，例如脑缺血，包括防止患者短暂性脑缺血发作和/或动脉狭窄。其它示例性神经障碍包括慢性炎症性脱髓鞘性多神经病(CIDP)；格林-巴利综合征(GBS)；眼病，例如黄斑变性(例如，湿性黄斑变性)和前部缺血性视神经病变；神经性疼痛(例如，有症状的神经性疼痛)；阿尔茨海默病；肌萎缩性侧索硬化(ALS)(例如改善ALS的疾病)和帕金森氏病。
本文所述制剂和方法也可用于治疗经历了移植，例如肾脏、心脏或骨髓移植的患者。
多发性硬化
含有本文所述α-4结合抗体的制剂用于治疗炎症性疾病，例如多发性硬化(MS)。多发性硬化是特征在于髓鞘发炎和丢失的中枢神经系统疾病。
可通过建立如通过关于MS诊断的学术讨论会定义的临床确诊MS的诊断的标准来鉴定患有MS的患者(Poser等，Ann.Neurol.13:227,1983)。例如，患有临床确诊MS的个体已经发作两次并且具有两种病变的证据或一种病变的临床证据和另一种单独病变的近似临床证据。也可通过两次发作的证据和脑脊髓液中IgG的寡克隆带或通过发作、两种病变的临床证据和脑脊髓液中IgG的寡克隆带的组合来诊断确诊MS。McDonald标准也可用于诊断MS。(McDonald等，2001,“Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosiss:guidelines from the International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosiss,”Ann.Neurol.50:121-127)。McDonald标准包括在无多次临床发作时使用随着时间推移CNS损伤的MRI证据以用于诊断MS。可用若干不同方式评估多发性硬化的有效治疗。以下参数可用于测量治疗的有效性。2个示例性标准包括：EDSS(残疾状态扩展评分)和MRI(磁共振成象)上出现恶化。EDSS是用于对由于MS引起的临床损伤进行分级的方法(Kurtzke,Neurology 33:1444,1983)。评估8个功能系统的神经功能损伤的类型和严重程度。简言之，治疗之前，评估患者以下系统的损伤：锥体、小脑、脑干、感官、肠和膀胱、视觉、大脑等。按确定的时间间隔进行随访。评分范围从0(正常)到10(由于MS死亡)。一个完整步骤的减少表明治疗有效(Kurtzke,Ann.Neurol.36:573-79,1994)。也可使用本领域人员使用的其它标准诊断患者。
将恶化定义为可归因于MS并且伴有适当的新神经系统异常的新症状的出现(上述IFNB MS研究组)。另外，恶化必须持续至少24小时并且先于稳定或改善至少30天。简言之，由临床医师给予患者标准的神经学检查。根据神经病测定等级的变化，恶化为轻度、中度或重度(Sipe等，Neurology34:1368,1984)。确定年恶化率和未恶化患者的比例。
如果用于这些测量的任一项的治疗组和安慰剂组之间未恶化或未复发患者的比率或比例存在统计上的显著差异，认为疗法有效。另外，也可测量到第一次恶化的时间和恶化持续时间和严重程度。在这点上作为疗法的有效性的测量方法是与对照组相比，治疗组中到第一次恶化的时间或持续时间和严重程度的统计上的显著差异。大于1年、18个月或20个月的无恶化或无复发期尤其显著。也可使用本领域的任何方法估定功效，例如以估定MS的症状，包括使用单独使用的定时步行测试或与其它标准的组合估定活动性改善。
也可基于以下一个或多个标准评估施用第一药剂和任选第二药剂的功效：通过有限稀释确定的MBP反应T细胞的频率，MBP反应T细胞系和克隆的增殖反应，T细胞系和克隆对从患者确定的MBP的细胞因子性质。通过反应细胞的频率降低、与天然胸苷相比并入改变肽的胸苷减少和TNF和IFN-α减少来表明功效。
临床测量包括1和2年间隔中的复发率，EDSS的变化，包括EDSS上从1.0单位的基线持续6个月进展。在卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier)上，持续失能进展的延迟表示有效。其它标准包括MRI上T2图像的面积和体积变化和通过钆增强图像确定的病变次数和量。
MRI可用于使用钆-DTPA-增强成像来测量活性病变(McDonald等Ann.Neurol.36:14,1994)或使用T2-加权技术来测量病变的位置和程度。简言之，获得基线MRI。将相同成像平面和患者位置用于每个后续研究。可选择定位和成像顺序以最大化病变检测并促进病变跟踪。相同定位和成像顺序可用于后续研究。MS病变的存在、位置和程度可由放射学家确定。可概述病变的面积并且逐片地加和病变的面积得出病变总面积。可进行3次分析：新病变的证据、活性病变的出现率、病变面积的变化百分比(Paty等，Neurology43:665,1993)。可通过与基线相比的个体患者或与安慰剂组相比的治疗组的统计上的显著改善来确定由于治疗的改善。
可用本文所述方法治疗的与多发性硬化相关的示例性症状包括：视神经炎、复视、眼球震颤、视辨距不良、核间性眼肌麻痹、运动和声音光幻视、幢孔传入缺陷、轻瘫、单肢轻瘫、下肢轻瘫、轻偏瘫、四肢轻瘫、麻痹、截瘫、偏瘫、四肢瘫痪、四肢麻痹、强直、构音障碍、肌肉萎缩、痉挛、抽筋、张力减退、阵挛、肌阵挛、肌纤维颤搐、下肢不宁综合征、足下垂、功能障碍性反射、感觉异常、麻木、神经痛、神经病和神经源性疼痛、莱尔米特氏征(l′hermitte′s)、本体感受功能障碍、三叉神经痛、共济失调、意向震颤、辨距不良、前庭共济失调、眩晕、语言共济失调、肌张力障碍、轮替运动障碍、尿频、膀胱痉挛、弛缓性膀胱、逼尿肌-括约肌不协调、勃起功能障碍、性快感缺失、性冷淡、便秘、大便紧迫、大便失禁、抑郁、认知功能障碍、痴呆、情绪波动、情绪不稳、欣快、复极综合征、焦虑、失语症、言语障碍症、疲劳、uhthoff综合征、胃食管反流和睡眠障碍。
MS的每种情况展示了陈述和后续过程的若干模式的一种。最常见的是，MS首先自身表现为一系列发作，接着完全或部分缓解，如症状不可思议地减轻，只有在一段稳定期后恢复。这称为复发缓解型(RR)MS。虽然症状存在临时停滞或轻微减轻，但是原发进展型(PP)MS特征在于临床逐渐减退，无明显缓解。继发进展型(SP)MS从复发缓解过程开始，接着是后期原发进展过程。罕见的是，患者可能有进展复发型(PR)过程，其中疾病采取受急性发作打断的渐进式途径。PP、SP和PR有时集中在一起并且称为慢性进展型MS。
少数患者经历恶性MS，定义为迅速且持续衰退，在疾病发作不久之后导致重大残疾或甚至死亡。可通过施用本文所述的组合疗法阻止或减速这种衰退。
施用本文特写的抗α4抗体对于减轻MS的一种或多种症状，例如上述一种或多种症状有效。例如，施用本文所述的抗α4抗体可用于治疗原发或继发进展型多发性硬化(分别为PPMS或SPMS)，并且用抗α4抗体治疗可对防止复发有效。
除人类研究外或在人类研究之前，可使用动物模型以评估使用两种药剂的功效。多发性硬化的示例性动物模型为实验性自身免疫性脑炎(EAE)小鼠模型，例如(Tuohy等(J.Immunol.(1988)141:1126-1130)，Sobel等(J.Immunol.(1984)132:2393-2401)，和Traugott(Cell Immunol.(1989)119:114-129)中描述的(EAE)小鼠模型。在EAE诱导之前，可向小鼠施用本文所述的第一和第二药剂。然后评估小鼠的特征标准以确定在模型中使用两种药剂的功效。
抗体生成
可通过体内或体外方法，例如噬菌体展示生成与α-4结合的重组抗体。所述方法可用于供给抗α4CDR以用于本文所述CDR移植抗体中。另外，诸如噬菌体展示的方法可用于在本文公开的种系骨架的情况下，例如通过骨架为种系骨架的库选择此类CDR。
EP 239 400(Winter等)描述了通过用来自另一物种的互补决定区取代一种物种的互补决定区(CDR)(在指定可变区内)来改变抗体。与真正的嵌合抗体相比，CDR取代的抗体不太可能在人体内引起免疫反应，因为CDR取代的抗体含有相当少的非人组分。(Riechmann等，1988,Nature 332,323-327；Verhoeyen等，1988,Science 239,1534-1536)。通常，通过使用重组核酸技术将鼠抗体的CDR取代至人抗体中的相应区域以产生编码所需经取代抗体的序列。可添加所需同种型(通常对于CH而言为γI并且对于CL而言为κ)的人恒定区基因片段并且重链和轻链基因可在哺乳动物细胞中共同表达以生成可溶性抗体。大型非免疫噬菌体展示库也可用于分离可使用标准噬菌体技术开发为人治疗剂的高亲和力抗体(见，例如，Hoogenboom等(1998)Immunotechnology 4:1-20；和Hoogenboom等(2000)Immunol Today 2:371-8；U.S.2003-0232333)。
本文所述抗α4抗体或抗体片段可识别在与同源配体(例如，VCAM-1或纤连蛋白)的结合中牵涉的α4亚单位的表位。本文所述抗体可抑制与一种或多种同源配体(例如，VCAM-1和纤连蛋白)的结合。
在一些实施方案中，本文特写的抗体可与细胞(例如，淋巴细胞)上的VLA-4相互作用，但不引起细胞聚集。
示例性的α4结合抗体具有一个或多个CDR，例如本文公开的特殊抗体的3个重链(HC)CDR和/或所有这3个轻链(LC)CDR，或总计与此类抗体至少80、85、90、92、94、95、96、97、98、99%相同的CDR。在一个实施方案中，H1和H2超变环具有与本文所述抗体相同的正则结构。在一个实施方案中，L1和L2超变环具有与本文所述抗体相同的正则结构。
在一个实施方案中，HC和/或LC可变结构域序列的氨基酸序列与本文所述抗体的HC和/或LC可变结构域至少有70、80、85、90、92、95、97、98、99或100%同一性。HC和/或LC可变结构域序列的氨基酸序列可与本文所述抗体的相应序列有至少一个氨基酸，但不超过10、8、6、5、4、3或2个氨基酸不同。例如，差异可能主要或全部在骨架区内。
HC和LC可变结构域序列的氨基酸序列可由在高严格性条件下与本文所述核酸序列杂交的核酸序列或编码本文所述可变结构域或氨基酸序列的核酸序列编码。在一个实施方案中，HC和/或LC可变结构域的一个或多个骨架区(例如，FR1、FR2、FR3和/或FR4)的氨基酸序列与本文所述抗体的HC和LC可变结构域的相应骨架区至少有70、80、85、90、92、95、97、98、99或100%同一性。在一个实施方案中，一个或多个重链或轻链骨架区(例如，HC FR1、FR2和FR3)与来自人种系抗体的相应骨架区的序列至少有70、80、85、90、95、96、97、98或100%同一性。
两个个序列之间的“同源性”或“序列同一性”(在本文中术语可交换使用)的计算如以下进行。为了最佳比较目的，比对序列(例如，可在第一和第二氨基酸的一个或两个或核酸序列中引入空位以进行最佳比对并且为了比较可忽略非同源序列)。使用具有Blossum 62打分矩阵的GCG软件包中的GAP程序将最佳比对确定为最高分，空位罚分为12，空位拓展罚分为4和移码空位罚分为5。然后比较相应氨基酸位置或核酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则在该位置分子相同(如本文所使用的氨基酸或核酸“同一性”与氨基酸或核酸“同源性”等效)。2个序列之间的同一性百分比是序列共有相同位置的数量的函数。
如本文所使用，术语“在高严格性条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。可在通过引用并入的Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到进行杂交反应的指导。在该参考中描述了水性和非水方法并且可使用任一种。高严格性杂交条件包括在约45℃下于6X SSC中杂交，接着在65℃下用0.2X SSC、0.1%SDS洗涤一次或多次，或大体上相似的条件。
抗体产生
抗体可在原核和真核细胞中产生。在一个实施方案中，抗体(例如，scFv)在酵母细胞中表达，例如毕赤酵母(Pichia)(见，例如，Powers等(2001)J.Immunol.Methods 251:123-35)、汉逊氏酵母(Hanseula)或酵母属(Saccharomyces)。
在一个实施方案中，尤其是全长抗体(例如，IgG)在哺乳动物细胞中产生。用于重组表达的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，与DHFR选择标记一起使用，例如，如Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中所述)、淋巴细胞系(例如，NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞)、COS细胞、K562和来自转基因动物(例如，转基因哺乳动物)的细胞。例如，细胞为哺乳动物上皮细胞。
除编码免疫球蛋白结构域的核酸序列外，重组表达载体可能携带另外的核酸序列，例如调控宿主细胞中载体的复制(例如，复制起点)和选择标记基因的序列。选择标记基因有助于对已经引入了载体的宿主细胞的选择(见例如，美国专利No.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。示例性的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
在用于抗体(例如，全长抗体或其抗原结合部分)的重组表达的示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因各自与增强子/启动子调控元件(例如，源自SV40、CMV、腺病毒等，例如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)操作性连接以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带了DHFR基因，允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已经用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许抗体重链和轻链表达并且从培养基中回收完整抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化珠，培养宿主细胞和从培养基中回收抗体。例如，可通过用蛋白质A或蛋白质G进行亲合色谱法分离一些抗体。例如，可使用本领域中已知的蛋白质浓缩技术将纯化α4结合抗体浓缩至约100mg/mL至约200mg/mL。
抗体也可包括修饰，例如改变Fc功能的修饰，(例如)以减少或去除与Fc受体或与C1q或二者的相互作用。例如，人IgG4恒定区可在残基228处具有Ser至Pro突变以固定铰链区。图5中提供了IgG4Fc的氨基酸序列(铰链+CH2+CH3结构域)。
在另一实例中，人IgG1恒定区可在一个或多个残基处，例如残基234和237的一处或多处(例如，根据美国专利No.5,648,260中的编号)突变。其它示例性修饰包括在美国专利No.5,648,260中描述的修饰。
对于包括Fc结构域的一些抗体而言，可将抗体产生系统设计为合成其中Fc区糖基化的抗体。在另一实例中，IgG分子的Fc结构域在CH2结构域中的天冬酰胺297处糖基化(见图5)。该天冬酰胺是用双触角型寡糖修饰的位点。这种糖基化参与Fcγ受体和补体C1q介导的效应功能(Burton和Woof(1992)Adv.Immunol.51:1-84；Jefferis等(1998)Immunol.Rev.163:59-76)。可在哺乳动物表达系统中产生Fc结构域，以适当糖基化与天冬酰胺297相对应的残基。Fc结构域也可包括其它真核翻译后修饰。
其它适合的Fc结构域修饰包括WO2004/029207中所述的修饰。例如，Fc结构域可为XmAb
Figure BDA00002596835000271
Fc(Xencor,Monrovia,CA)。Fc结构域或其片段可在Fcγ受体(FcγR)结合区中具有取代，例如WO05/063815中所述的结构域和片段。在一些实施方案中，Fc结构域或其片段在新生儿Fc受体(FcRn)结合区中具有取代，例如WO05047327中所述的结构域和片段。在其它实施方案中，Fc结构域为单链或其片段或其修饰形式，例如WO2008143954中所述的单链。在本领域中已知并描述了其它适合的Fc修饰。
抗体也可由转基因动物产生。例如，美国专利No.5,849,992描述了在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。将转基因构建为包括乳特异性启动子和编码所关注抗体(例如，本文所述抗体)的核酸序列和分泌信号序列。此类转基因雌性哺乳动物产生的乳包括其中分泌的所关注抗体，例如本所述抗体。可从乳中纯化抗体，或对于一些应用，直接使用。
例如，可用增强其在循环(例如，在血液、血清、淋巴、支气管肺泡灌洗或其它组织)中的稳定性和/或保持性(例如)至少1.5、2、5、10或50倍的部分修饰抗体。
例如，可使VLA-4结合抗体与聚合物连接，例如大体上非抗原性的聚合物(例如聚亚烷基氧化物或聚氧化乙烯)。适合的聚合物将大体上因重量而不同。可使用数均分子量范围为约200至约35,000道尔顿(或约1,000至约15,000和2,000至约12,500)的聚合物。
例如，VLA-4结合抗体可与水溶性聚合物，例如亲水性聚乙烯聚合物(例如，聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮)偶联。此类聚合物的非限制性列表包括聚亚烷基氧化物均聚物(例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇)、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的水溶性。另外的有用聚合物包括聚氧化烯，例如聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧乙烯与聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆(carbomers)；带支链或不带支链的多糖，包括糖单体D-甘露糖、D和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如，聚甘露糖醛酸或褐藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸，包括同多糖和杂多糖例如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖原或酸性粘多糖的多糖亚单位(例如透明质酸)；糖醇的聚合物，例如聚山梨糖醇和聚甘露醇；肝素或肝磷脂(heparon)。
示例性的第二药剂
在一些情况下，本文所述制剂，例如含有α-4结合抗体的制剂，包括第二药剂，或与含有第二药剂的制剂联合施用。
在一个实施方式中，α4结合抗体和第二药剂作为复合制剂提供，并且向受试者施用复合制剂。施用复合制剂前后，可能进一步单独施用一个剂量的α4结合抗体制剂，并且然后施用一个剂量的含有第二药剂的制剂，例如至少在施用复合制剂24小时前或24小时后。在另一实施方式中，抗体和第二药剂作为单独制剂提供，并且施用步骤包括序贯施用抗体和第二药剂。可在同一天(例如，相互间隔1小时或至少3、6或12小时之内)或在不同日子提供序贯施用。
通常，抗体和第二药剂各自作为若干在时间上分开的剂量施用。抗体和第二药剂各自根据一种方案施用。用于抗体和第二药剂的一种或两种的方案可能具有规律周期性。用于抗体的方案可具有不同于第二药剂的方案的周期性，例如其中一种可比另一种更频繁地施用。在一个实施方式中，抗体和第二药剂的其中一种可每周施用一次而另一种每月施用一次。在另一实施方式中，抗体和第二药剂的其中一种持续施用30分钟以上但少于1、2、4或12小时的时间段，而另一种作为大药丸施用。可通过任何适当方法，例如经皮下、肌肉内或静脉内施用抗体和第二药剂。
在一些实施方案中，抗体和第二药剂的每一种均按相同剂量施用，如同每一种均开处方用于单一疗法一样。在其它实施方案中，按等于或小于对于如果单独施用的疗效而言所需的量施用抗体。同样，按等于或小于对于如果单独施用的疗效而言所需的量施用第二药剂。
用于与α4结合抗体组合治疗多发性硬化的第二药剂的非限制性实例包括：
■干扰素，例如人干扰素β-1a(例如，AVONEX
Figure BDA00002596835000291
或Rebif
Figure BDA00002596835000292
))和干扰素β-1b(ΒETASERONTM；在位置17经取代的人干扰素β；Berlex/Chiron)；
■醋酸格拉替雷(也称为共聚物1、Cop-1;COPAXONETM；TevaPharmaceutical Industries,Inc.)；
■Rituxan(利妥昔单抗)或另一种抗CD20抗体，例如与利妥昔单抗竞争或结合重叠表位的抗CD20抗体；
■双羟蒽醌(mixtoxantrone)(NOVANTRONE
Figure BDA00002596835000294
Lederle)；
■化学治疗剂，例如克拉屈滨(clabribine)(LEUSTATIN
Figure BDA00002596835000295
)、硫唑嘌呤(IMURAN
Figure BDA00002596835000296
)、环磷酰胺(CYTOXAN
Figure BDA00002596835000297
)、环孢霉素-A、甲氨蝶呤、4-氨基吡啶和替扎尼定；
■皮质类固醇，例如甲基强的松龙(MEDRONE
Figure BDA00002596835000298
Pfizer)、强的松；
■免疫球蛋白，例如Rituxan
Figure BDA00002596835000299
(利妥昔单抗)；CTLA4Ig；阿仑单抗(MabCAMPATH
Figure BDA000025968350002910
)或达利珠单抗(结合CD25的抗体)；
■他汀类；和
■TNF拮抗剂。
醋酸格拉替雷是由随机的氨基酸链-谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸和酪氨酸(因此为GLATiramer)形成的蛋白质。可使用N-羧基氨基酸酐在溶液中按大约5份丙氨酸:3份赖氨酸、1.5份谷氨酸和1份酪氨酸的比例由这些氨基酸合成醋酸格拉替雷。
另外的第二药剂包括其它人细胞因子或生长因此的抗体或拮抗剂，例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-11、GM-CSF、FGF和PDGF。还有其它示例性的第二药剂包括细胞表面分子，例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配体的抗体。例如，达利珠单抗是可改善多发性硬化的抗CD25抗体。
还有其它示例性抗体包括提供本文所述药剂的活性的抗体，例如接合干扰素受体(例如，干扰素β受体)的抗体。通常，在第二药剂包括抗体的实施方式中，第二药剂与除VLA-4外或除α4整联蛋白外的靶蛋白或VLA-4上除由第一药剂识别的表位外的至少一个表位结合。
还有其它示例性的第二药剂包括：FK506、雷帕霉素、吗替麦考酚酯、来氟米特、非类固醇抗炎药物(NSAID)，例如磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓剂、补体抑制剂、肾上腺素能药剂、如本文所述干扰促炎性细胞因子的信号转导的药剂、IL-1β转化酶抑制剂(例如，Vx740)、抗P7、PSGL、TACE抑制剂、T细胞信号转导抑制剂(例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂)、柳氮磺胺吡淀、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、如本文所述的可溶性细胞因子受体及其衍生物、抗炎性细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13和TGF)。
在一些实施方案中，第二药剂可用于治疗MS的一种或多种症状或副作用。此类药剂包括(例如)金刚烷胺、巴氯芬、罂粟碱、美其敏(meclizine)、羟嗪、磺胺甲恶唑、环丙沙星、多库酯钠、匹莫林、丹曲林、去氨加压素、地塞米松、托特罗定、苯妥英、奥昔布宁、比沙可啶、文拉法辛、阿米替林、乌洛托品、氯硝安定、异烟肼、伐地那非、呋喃妥英、车前子亲水胶、前列地尔、加巴喷丁、去甲替林、帕罗西汀、溴丙胺太林、莫达非尼、氟西汀、非那吡啶、甲基强的松龙、氨甲酰氮草、丙咪嗪、安定、西地那非、安非他酮和舍曲林。为小分子的许多第二药剂的分子量在150至5000道尔顿之间。
TNF拮抗剂的实例包括TNF(例如，人TNFα)的嵌合、人源化、人或体外生成的抗体(或其抗原结合片段)，例如D2E7(人TNFα抗体，美国专利No.6,258,562；BASF)、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗体；Celltech/Pharmacia)、cA2(嵌合抗TNFα抗体；REMICADETM,Centocor)；抗TNF抗体片段(例如，CPD870)；TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其片段，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBRELTM；Immunex；见例如，Arthritis&Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.Med.(1996)第44卷，235A)、p55kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白(LENERCEPTTM))；酶拮抗剂，例如TNFα转化酶(TACE)抑制剂(例如，α-磺酰基异羟肟酸衍生物，WO 01/55112和N-羟基甲酰胺TACE抑制剂GW 3333、-005或-022)；和TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白；见例如，Arthritis&Rheumatism(1996)第39卷，No.9(附录)，S284；Amer.J.Physiol.-Heart and Circulatory Physiology(1995)第268卷，第37-42页)。
除第二药剂外，也可能向受试者递送其它药剂。然而，在一些实施方案中，除α4结合抗体和第二药剂外，未向受试者施用作为药物组合物的蛋白质或生物制剂。α4结合抗体和第二药剂可能是通过注射递送的唯一药剂。在第二药剂为重组蛋白的实施方案中，α4结合抗体和第二药剂可能是向受试者施用的唯一重组药剂，或至少是调节免疫或炎症性反应的唯一重组药剂。还有其它实施方案中，单独的α4结合抗体是向受试者施用的唯一重组药剂或唯一生物制剂。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述相似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但是以下描述了适合的方法和材料。本文提到的所有公布、专利申请、专利和其它参考通过引用整体并入。如有冲突，以本说明书，包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅为说明性并不旨在限制。
实施例
实施例1.变体抗VLA-4抗体比人源化HP1/2更有效。
对于VL链而言使用种系骨架IGKV4-1(或设计L1和L2)或种系工程化AAH7033.1(设计L3)而对于VH而言使用种系骨架IGHV1-f构建抗VLA-4抗体。这些抗体具有比美国专利No.6,602,503中所述人源化HP1/2抗体更少的回复突变。
重链变异
图1中将重链的3个变异序列显示为设计H0、设计H1和设计H2。每个设计的鼠HP1/2的CDR移植到IGHV1-f骨架中。设计H0不包括骨架区的回复突变，而设计H1和H2在骨架区序列中具有各种程度的回复突变以最优化人源化抗体的亲和力。
轻链变异
图2中将轻链的4个变异序列显示为设计L0、设计L1、设计L2和设计L3(也称为L0、L1、L2、L3)。每个设计的鼠HP1/2的CDR移植到种系骨架中。IGKV4-1种系骨架用于设计L0、L1和L2，并且AAH70335种系工程化骨架用于设计L3。设计L0不包括骨架区的回复突变，而设计L1、L2和L3在骨架区中具有各种程度的回复突变以最优化人源化抗体的亲和力。
竞争ELISA测定的结果示于表1和图3中。在该实验中，将α4β1与试验mAb预孵育并且鼠HP1/2用作竞争药剂。该实验的结果表示，具有轻链L2或L3的抗体比美国专利No.6,602,503中描述的人源化抗体HuHP1/2更有效。结果示于下表1和图3中。抗体中做该项测定的重链(H1)具有图1所示的“设计H1”序列，而L1指图2中的设计L1。
表1.通过ELISA进行的竞争测定
  mAb   IC50nM
  嵌合HP1/2   1.06
  H1L0   1.87
  H1L1   1.67
  H1L2   0.9
  H1L3   0.49
  HuHP1/2   1.05
在表1中，嵌合mAb为嵌合HP1/2抗体，其中鼠可变重链和轻链与人IgG1恒定区基因融合。这种抗体在与原有鼠HP1/2抗体的结合亲和力上基本上相同(Sanchez-Madrid等，Eur.J.Immunol.16:1343-1349,1996)。实验结果表示，通过对种系工程化受体骨架进行人源化，可能增强单克隆抗体相对于其鼠亲本序列的亲和力。
另一竞争测定比较了新抗体与U.S.5,840,299中描述的人源化21.6抗α4抗体(Tysabri
Figure BDA00002596835000321
(那他珠单抗))的结合亲合力。在该实验中测定了小鼠HP1/2和试验mAb的混合物与α4β1的结合。该实验的结果示于图4和下表2中，并且表示新设计的抗体比那他珠单抗有效约10倍。
表2.通过ELISA进行的竞争测定
Figure BDA00002596835000331
实施例2.人源化HP1/2(HuHP1/2)结合肿瘤细胞系上的VLA-4
用流式细胞仪测试抗VLA-4抗体HuHP1/2与多种细胞系的结合。对CLL(慢性淋巴细胞性白血病)细胞系Mec1和JM1；对MM(多发性骨髓瘤)细胞系U266和H929；并且对AML(急性骨髓性白血病)细胞系HL60和KG1测试结合。HuHP1/2结合测试的所有肿瘤细胞系(图6)。用流式细胞仪数据计算抗体与每种不同细胞系结合的EC50值。该信息示于下表3中。
发现HuHP1/2阻碍AML细胞系与纤连蛋白(FN)和VCAM1-Ig融合蛋白的粘着。为测试抗体是否可阻碍粘着，使AML细胞系HL60或KG1在递增浓度的HP1/2或同种型对照抗体存在下粘着于涂覆FN的孔(图7A)或涂覆VCAM1-Ig的孔(图7B)上。HuHP1/2阻碍两种类型的细胞粘着于涂覆FN的孔和涂覆VCAM1-Ig的孔上。用20μg/ml HuHP1/2实现对HL60细胞与两种配体结合的最大抑制(图7C)。
还发现HuHP1/2阻碍MM细胞系与FN和VCAM1-Ig融合蛋白的粘着。使MM细胞系U266和H929在递增浓度的HP1/2或同种型对照抗体存在下粘着于涂覆FN的孔(图8A)或涂覆VCAM1-Ig的孔(图8B)上。HuHP1/2阻碍两种类型的细胞系粘着于涂覆FN和VCAM1-Ig的孔上。用20μg/ml HuHP1/2实现对U266细胞与两种配体结合的最大抑制(图8C)。
还发现HuHP1/2阻碍CLL细胞系与FN和VCAM1-Ig融合蛋白的粘着。使CLL细胞系Mec1和JM1在递增浓度的HP1/2或同种型对照抗体存在下粘着于涂覆FN的孔(图9A)或涂覆VCAM1-Ig的孔(图9B)上。HuHP1/2阻碍两种类型的细胞系粘着于涂覆FN和VCAM1-Ig的孔上。用20μg/ml HuHP1/2实现对Mec1细胞与两种配体结合的最大抑制(图9C)。
由图7-9中所示数据计算HuHP1/2与肿瘤细胞系结合的IC50值。这些数据示于表3中。
表3.肿瘤细胞系上HuHP1/2的定量
Figure BDA00002596835000341
其它实施方案在权利要求中。

Claims (23)

1.一种重组抗体分子或其α4-结合片段，所述重组抗体分子或其α4-结合片段包含含有来自IGKV4-1的受体序列的可变轻链骨架和含有来自IGHV1-f的受体序列的可变重链骨架，并且具有源自鼠抗体HP1/2或源自鼠抗体21.6的重链和轻链CDR。
2.一种能够结合α4的重组抗体分子或其α4-结合片段，所述重组抗体分子或其α4-结合片段包含含有来自种系工程化AAH70335.1的受体序列的可变轻链骨架和含有来自IGHV1-f的受体序列的可变重链骨架。
3.根据权利要求1或2所述的重组抗体分子或其α4-结合片段，所述重组抗体分子或其α4-结合片段进一步包含源自鼠抗体HP1/2的CDR。
4.根据权利要求1或2所述的重组抗体分子或其α4-结合片段，所述重组抗体分子或其α4-结合片段进一步包含源自鼠抗体21.6的CDR。
5.根据权利要求1或2所述的重组抗体分子或其α4-结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列。
6.根据权利要求1所述的重组抗体分子或其α4-结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列。
7.根据权利要求2所述的重组抗体分子或其α4-结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11的序列。
8.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体结合VLA-4。
9.一种包含编码抗体重链或其α4-结合片段的DNA的载体，所述DNA包括SEQ ID NO:3、4或5的序列。
10.一种包含编码抗体轻链或其α4-结合片段的DNA的载体，所述DNA包括SEQ ID NO:8、9、10或11的序列。
11.一种制备重组抗α4抗体或其α4-结合片段的方法，所述方法包括：
(a)提供宿主细胞，所述宿主细胞包含(i)编码抗体重链或其α4-结合片段的DNA序列，其中所述DNA序列包括SEQ ID NO:3、4或5的序列，和(ii)编码抗体轻链或其α4-结合片段的DNA序列，其中所述DNA序列包括SEQID NO:8、9、10或11的序列，和
(b)培养所述细胞以产生所述重组抗α4抗体分子或其α4结合片段。
12.一种治疗患者的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求1或2所述的组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述患者患有癌症。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述患者患有实体瘤。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述患者患有血液恶性肿瘤。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述患者患有多发性骨髓瘤或急性骨髓性白血病(AML)。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述患者患有炎症性病症。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述患者患有多发性硬化、哮喘、风湿性关节炎、糖尿病、视神经炎或克罗恩氏病。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述患者患有急性病症。
20.根据权利要求12所述的方法，其中所述患者患有脊椎损伤或外伤性脑损伤。
21.根据权利要求12所述的方法，其中按一种方案施用所述组合物。
22.根据权利要求12所述的方法，所述方法进一步包括向所述患者施用第二治疗剂。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二治疗剂为血栓溶解剂、化学治疗剂、神经保护剂、抗炎剂、类固醇、细胞因子或生长因子。
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