TWI839360B - 具有降低之效應功能的抗ｖｌａ-４抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於抗VLA-4抗體及其結合片段。本發明進一步包括編碼該等抗體及其結合片段之聚核苷酸以及製造該等抗體及其結合片段之方法。本發明進一步包括藉由投與該等抗體及其結合片段來治療罹患多發性硬化症及/或癲癇症之患者的方法。本發明進一步包括降低重組抗α4抗體或其結合片段對擾亂之易感性的方法。

Description

具有降低之效應功能的抗VLA-4抗體
本發明係關於α4結合抗體及其片段。
整合素為介導細胞-細胞及細胞-基質相互作用之細胞表面受體大家族之成員。其呈α鏈與β鏈之不同組合的非共價αβ異二聚體形式存在且具有廣泛結構同源性。整合素介導多種生理過程且與多種病理學病狀有關。α4鏈主要侷限於白血球且可與兩種β鏈，即β1及β7締合。
VLA-4(亦稱為α4β1)及α4β7在炎症性病狀之病理生理學中起重要作用。VLA-4為β1整合素細胞表面受體家族之成員。VLA-4含有α4鏈及β1鏈且參與細胞-細胞相互作用。其表現主要侷限於淋巴細胞，包括T淋巴細胞，以及骨髓細胞，包括小膠質細胞及巨噬細胞。VLA-4結合內皮細胞配位體VCAM-1(血管細胞黏附分子-1)，且可介導T淋巴細胞及B淋巴細胞連接至人類血漿纖維連接蛋白之肝素II結合片段。VLA-4調控正常白血球運輸(Lobb及Hemler,J.Clin.Invest.94(5)：1722-1728,1994)且提供支持細胞活化之關鍵共刺激信號(Clark及Brugge,Science 268(5208)：233-9,1995)。在炎症性反應期間，VLA-4調控白血球向受損組織中遷移，且因而已被公認為有吸引力之治療標靶。使用阻斷性單株抗體(Lobb及Hemler，同上；Enders等人，Brain 121(Pt 7)：1257-66,1998；Ramos-Barbon等人，Am J Respir Crit Care Med.163(1)：101-8.2001)、抑制性肽(Molossi等人，J Clin Invest.95(6)：2601-10,1995；Abraham,1997；van der Laan等人，J Neurosci Res.2002年1月15日；67(2)：191-9,2002)及小分子拮抗劑(Kudlacz 等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.301(2)：747-52,2002)進行之活體內研究已驗證α4β1整合素在白血球介導之炎症中的關鍵作用。
α4β1藉由結合至兩種蛋白質配位體，即VCAM-1或纖維連接蛋白(例如，含有交替剪接之連接區段1(CS1)之纖維連接蛋白變異體)中之任一者來介導細胞黏附(Osborn等人，Cell 59(6)：1203-11,1989；Wayner等人，J.Cell Biol.109(3)：1321-30,1989)。已鑑定其他潛在配位體(Bayless等人，J.Cell Sci.111(Pt 9)：1165-74,1998)；然而，此等相互作用之生物學意義尚不太清楚。α4β1與其配位體之間的相互作用具有低親和力，而且有可能經由多價相互作用來調節結合。儘管α4β1之表現為組成性的，但其與配位體之相互作用在可由各種刺激，包括抗原、抗T細胞受體mAb、巴豆酯、二價陽離子Mn2+及某些β1特異性抗體誘導之活化狀態下受到強增強。此等親和力及/或親合力變化最終決定相互作用是否有效並且使配位體/整合素複合物穩定(Humphries,Curr Opin Cell Biol.8(5)：632-40,1996)。α4β7由更侷限之一組白血球表現，且部分負責藉由結合黏膜地址素MadCAM而使淋巴球歸巢至黏膜淋巴組織，但其亦結合VCAM-1及纖維連接蛋白。某些針對α4之單株抗體(mAb)可阻斷VLA4及α4β7二者之黏附功能。
可使用人類化抗體替代鼠類抗體作為治療劑來避免在人類中出現稱為HAMA(人類抗小鼠抗體)反應之不理想免疫反應。一般藉由將人類抗體之互補性決定區(CDR)置換為另一物種(通常為小鼠抗體)之CDR來構築人類化抗體。
抗體能夠經由其可變區結合抗原。抗體一旦結合抗原後，便靶向抗原以進行破壞，此過程通常至少部分由該抗體之恆定區或Fc區介導。存在若干種由抗體Fc區介導之效應功能或活性。一種效應功能為能夠結合可在稱為補體依賴性細胞毒性(CDC)之過程中輔助溶解靶抗原，例如細胞病原體的補體蛋白。Fc區之另一效應活性為結合至免疫細胞或能夠觸發其他免疫效應之所謂效應細胞表面上的Fc受體(例如FcγR)。此等免疫效應(例如，抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP))藉由例如釋放免疫活化因子及調控抗體產生、內吞作用、吞噬作用及細胞殺死而在移除病原體/抗原方面起作用。在一些臨床應用中，此等反應對抗體之效力至關重要，而在其他情況下，其會激起不需要之副作用。效應因子介導之副作用之一個實例為釋放引起急性發熱反應之炎症性細胞介素。另一實例為攜帶抗原之細胞的長期耗竭。
可藉由使用缺乏Fc區之抗體片段(例如，諸如Fab、F(ab')2或單鏈Fv(scFv))來避免抗體之效應功能。然而，此等片段由於經腎臟快速清除而具有降低之半衰期。Fab及scFv片段僅具有一個抗原結合位點而不是兩個，從而可能犧牲由於結合親合力而具有之任何優勢且在製造方面帶來潛在挑戰。替代方法旨在降低全長抗體之效應功能，而保留Fc區之其他有價值屬性(例如，延長之半衰期及異二聚化)。一種降低效應功能之方法為藉由消除與Fc區中特定殘基連接之糖來產生所謂的無糖基化抗體。無糖基化抗體可藉由例如缺失或改變糖連接之殘基、在酶作用下移除糖、在糖基化抑制劑存在下培養之細胞中產生抗體或藉由在不能使蛋白質糖基化之細胞(例如，細菌宿主細胞)中表現抗體來產生。另一方法為採用來自IgG4抗體而非IgG1之Fc區。眾所周知，IgG4抗體之特徵在於補體活化及抗體依賴性細胞毒性之水準低於IgG1。
針對人類α4之單株抗體結合至三種功能不同的形貌抗原決定基A、B及C(Pulido等人，J.Biol.Chem.266：10241-10245,1991；Schiffer等人，J.Biol.Chem.270：14270-14273,1995)。抗原決定基B再分為B1抗原決定基及B2抗原決定基，其在形貌上不可區分但可由mAb誘導細胞聚集之能力來定義。針對抗原決定基A及B2之抗α4 mAb可誘導同型細胞聚集，但針對抗原決定基B1及C之彼等抗α4 mAb則不然。
本發明係關於包含生殖系可變區構架之抗VLA-4抗體及其結合片 段，其可使CDR移植α4結合抗體，如抗VLA-4抗體最佳化。因此，本發明包含抗VLA-4可變重(VH)鏈及可變輕(VL)鏈以及包括此種構架之抗體分子。在一些實施例中，該VLA-4為人類VLA-4。在一些實施例中，該VLA-4包含α4鏈(例如，人類α4鏈)。
該等抗體亦可含有經修飾之Fc區，該等經修飾之Fc區改變或降低效應功能且改良穩定性。具有經修飾之Fc區的抗體可改良在缺乏寡糖之抗體中所觀測之顯著不利影響，尤其對構形及穩定性之不利影響。具有經修飾之Fc區的抗體亦可具有改變或降低之效應功能及改良之穩定性。本發明進一步係關於製造本文中所描述之分子的方法。
該等抗體可藉由提供用於增強Fc區穩定性之改良方法而改良先前技術「無效應因子」抗體之問題。舉例而言，本發明提供經穩定性工程化之Fc多肽，例如穩定IgG抗體或其他含Fc之結合分子，其包含多肽Fc區中之穩定性胺基酸。在一個實施例中，本發明提供用於在親本Fc多肽Fc區中之特定胺基酸殘基位置引入使Fc區穩定性得以增強之突變的方法。在一些實施例中，穩定Fc多肽具有改變或降低之效應功能(相較於不包含穩定性胺基酸之多肽)且展現增強之穩定性(相較於親本Fc多肽)。在一些實施例中，該親本Fc多肽為人類IgG1(例如，具有SEQ ID NO：83之序列)。在一些實施例中，該親本Fc多肽為人類IgG4(例如，具有SEQ ID NO：84之序列)。
因此，本文中所揭示之抗體可提供若干優勢，包括但不限於以下：-提供由於其降低之效應功能而適合作為治療劑的包含穩定無糖基化Fc區之穩定無糖基化Fc多肽，例如穩定融合蛋白質或無糖基化IgG抗體；-提供由於其降低之效應功能而適合作為治療劑的包含來源於IgG4抗體之Fc區的穩定Fc多肽，例如穩定糖基化或無糖基化融合蛋白質或IgG4抗體；-在對多肽進行最小變化之情況下產生穩定Fc多肽之有效方法(例如，藉由向不 穩定親本多肽中引入變化或藉由表現編碼穩定Fc多肽之核酸分子)；-增強Fc多肽之穩定性同時避免在免疫原性及/或效應功能方面出現任何增加之方法；-用於增強Fc多肽之可調性、製造及/或長期穩定性的方法；及-用本發明之穩定Fc多肽治療需要治療之個體的方法。
在一個實施例中，本發明提供一種抗α4抗體VH鏈，其具有來自供體抗α4抗體，例如本文中所描述之抗α4抗體的CDR以及具有來自VH鏈生殖系可變區序列之序列的區域1、2、3及4或相對於VH鏈生殖系可變區序列具有不超過5、10或15個差異的VH構架。在一個實施例中，可變構架區4(FR4)為人類一致序列。在一個實施例中，存在完整VH鏈構架區FR1、FR2、FR3及FR4。在另一實施例中，該鏈為VH區之抗原結合片段。
在一個實施例中，該生殖細胞系序列為圖1中所描繪之人類IGHV1-f(SEQ ID NO：2)。在某些實施例中，該VH構架序列相對於生殖系序列，例如SEQ ID NO：2可能有至少一個但不超過2、3、4、5、10或15個胺基酸殘基不同。在一個實施例中，該VH構架進一步包括除相應人類殘基以外之殘基。舉例而言，該VH鏈在SEQ ID NO：2之構架位置24、67、76、80及94(Kabat編號)中之一或多個處包括非典型殘基。
在一個實施例中，可變域之互補性決定區(CDR)中之至少一或多個來源於供體非人類α4結合抗體(亦即，特異性結合至α4之非人類抗體)。在一個實施例中，CDR移植重鏈可變域之抗原結合區包括對應於位置26-34(CDR1)、50-65(CDR2)及95-102(CDR3)(Kabat編號)之CDR。
因而，在一個實施例中，該可變重鏈(VH)構架具有來源於人類抗體生殖系序列IGHV1-f之受體序列。
在另一實施例中，VH之FR1區中之至少一個胺基酸且少於2、3、4、 5或10個胺基酸殘基不為相應人類生殖系殘基。舉例而言，該等殘基中之一或多個可與CDR序列所來源之非人類抗體構架區一致。在一個實施例中，使Kabat位置24處之胺基酸殘基突變以便與非人類抗體構架區一致。
在另一實施例中，VH之FR2區中之至少一個胺基酸且少於2、3、4、5或10個胺基酸殘基不為相應人類生殖系殘基。舉例而言，該等殘基中之一或多個可與CDR序列所來源之非人類抗體構架區一致。
在另一實施例中，VH鏈之FR3中之至少一個胺基酸且少於2、3、4、5或10個胺基酸殘基不為相應人類生殖系殘基。舉例而言，該等殘基中之一或多個可與CDR序列所來源之非人類抗體構架區一致。在一個實施例中，使Kabat位置94處之胺基酸殘基突變以便與非人類抗體構架區一致。在另一實施例中，Kabat位置67、76、80及94處之胺基酸殘基與非人類抗體構架區一致。
在某些實施例中，該抗體之VH鏈具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之序列。
在一個態樣中，本發明提供一種抗VLA-4 VL鏈，其具有來自供體抗VLA-4抗體，例如本文中所描述之抗VLA-4抗體的CDR以及具有來自VL鏈生殖系可變區序列之序列的區域1、2、3及4或相對於VL鏈生殖系可變區序列具有不超過5、10或15個差異(每個區域或總共)的VL構架。在一個實施例中，可變構架區4(FR4)為人類一致序列。在一個實施例中，存在完整VL鏈構架區FR1、FR2、FR3及FR4。在另一實施例中，該鏈為VL區之抗原結合片段。
在另一實施例中，該生殖系序列為圖2中所描繪之IGKV4-1(SEQ ID NO：7)。在其他實施例中，該VL構架序列相對於生殖系構架序列，例如SEQ ID NO：7可能有至少一個但不超過2、3、4、5、10或15個胺基酸殘基不同。在另一實施例中，該VL進一步包括除相應人類胺基酸殘基以外的殘基。舉例而言，該VL鏈進一步在SEQ ID NO：7之構架位置1、73及87(Kabat編號)中之一或多 個處包括非人類殘基。
在一個實施例中，該序列為圖2中所描繪之AAH7035.1(SEQ ID NO：12)或其生殖系工程化型式(SEQ ID NO：13)。在一些實施例中，該VL構架序列相對於生殖系工程化構架序列，例如SEQ ID NO：13可能有至少一個但不超過5、10、15、20或25個胺基酸殘基不同。在一個實施例中，該VL鏈包括除相應人類殘基以外之殘基。舉例而言，該VL鏈在SEQ ID NO：12之構架位置1及87(Kabat編號)中之一或多個處包括非人類殘基。在另一實施例中，該VL在構架區中包括胺基酸取代以類似於不同的人類生殖系構架序列，諸如生殖系序列IGKV4-1。在某些實施例中，在SEQ ID NO：12之位置1-3、5-23、35-37、39-42、45-49、57、59-61、63-64、70-72、74-84、86-88、99-106(Kabat編號)處對該VL構架序列進行改變以便與IGKV4-1生殖系序列一致。
在一個實施例中，可變域之互補性決定區(CDR)中之至少一或多個來源於供體非人類α4結合抗體。在另一實施例中，CDR移植重鏈可變域之抗原結合區包括對應於位置24-31(CDR1)、50-56(CDR2)及89-97(CDR3)(Kabat編號)之CDR。因而，在一個實施例中，該VL構架具有由IGKV4-1生殖系序列、由抗體AAH70335.1或由生殖系工程化抗體AAH70335.1構築之受體序列。
在另一實施例中，VL鏈之FR1中之至少一個胺基酸且少於2、3、4、5、10或15個殘基不為相應人類生殖系殘基。舉例而言，該等殘基中之一或多個可與CDR序列所來源之非人類抗體構架區一致。在一個實施例中，使FR1之N-末端位置處之胺基酸殘基突變以便與非人類抗體構架區一致。
在另一實施例中，VL鏈之FR2中之至少一個胺基酸且少於2、3、4、5、10或15個殘基不為相應人類生殖系殘基。舉例而言，該等殘基中之一或多個可與CDR序列所來源之非人類抗體構架區一致。
在另一實施例中，VL鏈之FR3中之至少一個胺基酸且少於2、3、4、 5、10或15個殘基不為相應人類生殖系殘基。舉例而言，該等殘基中之一或多個可與CDR序列所來源之非人類抗體構架區一致。在另一實施例中，使Kabat位置87處之胺基酸殘基突變以便與非人類抗體構架區一致。在另一實施例中，使Kabat位置67及87處之胺基酸殘基突變以便與非人類抗體構架序列一致。在另一實施例中，使SEQ ID NO：7之Kabat位置67、73及87處之胺基酸殘基突變以便與非人類抗體構架序列一致。
在其他實施例中，該抗體之VL鏈具有SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11之序列。
在一個實施例中，該抗體之VH鏈具有SEQ ID NO：4之序列且該抗體之VL鏈具有SEQ ID NO：11之序列。
在一個實施例中，對VH及VL受體構架序列之CDR加以選擇以類似於非人類(例如鼠類)抗體序列之CDR序列，其中該非人類抗體結合整合素α4或其片段。在另一實施例中，對CDR之序列進行選擇以類似於結合VLA-4 α4鏈之B1抗原決定基的非人類抗體之CDR之序列。在一個實施例中，對CDR進行選擇以類似於鼠類單株抗體，例如HP1/2、HP2/1、HP2/4、L25、P4C2或21.6(Pulido等人，J.Biol.Chem.266：10241-10245,1991；美國專利第6,033,665號)。修飾可意謂例如切割及插入或變化，例如藉由定向突變誘發。
在另一態樣中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其包括：-本文中所描述之抗VLA-4 VL鏈，例如具有來自供體抗VLA-4抗體，例如本文中所描述之抗VLA-4抗體的CDR以及具有來自VL鏈生殖系可變區序列之序列的LC構架區1、2及3或相對於VL鏈生殖系可變區序列具有不超過5、10或15個差異的VL構架的抗VLA-4 VL鏈。在一個實施例中，可變區4為人類一致序列；及-本文中所描述之抗VLA-4 VH鏈，例如具有來自供體抗VLA-4抗體，例如本 文中所描述之抗VLA-4抗體的CDR以及具有來自VL鏈生殖系可變區序列之序列的LC構架區1、2及3或相對於VL鏈生殖系可變區序列具有不超過5、10或15個差異的VL構架的抗VLA-4 VL鏈。在一個實施例中，可變區4為人類一致序列。
在一個實施例中，該抗體結合α4β1及α4β7之一或二者。
在另一態樣中，本文中所描述之VL或VH鏈或抗體或其片段經可偵測標記。
在另一態樣中，本發明提供一種重組抗α4抗體或其α4結合片段，其包含：(a)含有SEQ ID NO：11之序列的可變輕鏈；(b)含有SEQ ID NO：4之序列的可變重鏈；(c)人類κ輕鏈(SEQ ID NO：82)之恆定輕鏈；及(d)人類IgG1之恆定重鏈，該恆定區包含至少一個選自以下之突變：根據Kabat編號方案之S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S或K478缺失。
在一些實施例中，人類IgG1之恆定重鏈包含至少兩個選自以下之突變：根據Kabat編號方案之S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S或K478缺失，由該等突變組成或基本上由該等突變組成。
在一些實施例中，人類IgG1之恆定重鏈包含至少三個選自以下之突變：根據Kabat編號方案之S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S或K478缺失，由該等突變組成或基本上由該等突變組成。
在一些實施例中，人類IgG1之恆定重鏈包含至少四個、或至少五個、或至少六個、或至少七個、或至少八個、或至少九個、或至少十個、或至少十一個、或至少十二個、或至少十三個、或至少十四個、或至少十五個、或至少十六個、或至少十七個、或至少十八個、或至少十九個、或至少二十個、或至少二十一個、或至少二十二個、或至少二十三個、或至少二十四個選自以下之突變：根據Kabat編號方案之S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S或K478缺失，由該等突變組成或基本上由該等突變組成。
在一些實施例中，人類IgG1之恆定重鏈包含以下突變：根據Kabat編號方案之S127C、K129R、G135E、G136S、Q203K、I207T、N211D、K222R、P227S、S232Y、C233G、D234缺失、K235缺失、T236缺失、H237P、T238P、L247F、H281Q、K287Q、Y313F、N314Q、A346G、A349S、P350S及K478缺失，由該等突變組成或基本上由該等突變組成。
在另一態樣中，本發明提供一種重組抗α4抗體或其α4結合片段，其包含：(a)含有SEQ ID NO：11之序列的可變輕鏈；(b)含有SEQ ID NO：4之序列的可變重鏈；(c)人類κ輕鏈(SEQ ID NO：82)之恆定輕鏈；及(d)人類IgG4之恆定重鏈，該恆定區包含至少一個選自由以下組成之群的突變：根據Kabat編號方案之S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P及K478缺失。
在一些實施例中，人類IgG4之恆定重鏈包含至少兩個選自由以下組成之群的突變：根據Kabat編號方案之S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P及K478缺失，由該等突變組成或基本上由該等突變組成。
在一些實施例中，人類IgG4之恆定重鏈包含至少三個、或至少四個、或至少五個、或至少六個、或至少七個、或至少八個、或至少九個選自由以下組成之群的突變：根據Kabat編號方案之S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P及K478缺失，由該等突變組成或基本上由該等突變組成。
在一些實施例中，人類IgG4之恆定重鏈包含以下突變中之一或多個：根據Kabat編號方案之S241P、N314Q、Q376R、E377D、M381L、R440K、E450Q、L476P及K478缺失，由該一或多個突變組成或基本上由該一或多個突變組成。
注意，C-末端離胺酸殘基(根據Kabat編號方案，在478位)通常在轉譯後或藉由手段缺失。因而，在一些實施例中，本文中所描述之抗體之重鏈(或其結構域之Fc部分)缺乏C-末端離胺酸。換言之，在一些實施例中，本文中所描述之抗體之重鏈(或其結構域之Fc部分)中478位(Kabat編號)之離胺酸缺失。
在一些實施例中，無突變或取代之人類IgG1之恆定重鏈具有SEQ ID NO：83之序列。
在一些實施例中，無突變或取代之人類IgG4之恆定重鏈具有SEQ ID NO：84之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種載體，其含有編碼本文中所描述之抗體重鏈或其α4結合片段的DNA。在一些實施例中，該載體之DNA編碼具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之序列的VH。
在另一態樣中，本發明提供一種載體，其含有編碼本文中所描述之抗體輕鏈或其α4結合片段的DNA。在一些實施例中，該載體之DNA編碼具有SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11之序列的VL鏈。
在另一態樣中，本發明提供一種載體，其含有編碼本文中所描述之抗體重鏈或其α4結合片段及本文中所描述之抗體輕鏈或其α4結合片段的DNA。
在另一態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其含有本文中所描述之載體，例如能夠表現本文中所描述之重鏈及/或輕鏈抗體或抗體片段的載體。在某些實施例中，該宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
在一個態樣中，本發明提供一種製造重組抗α4抗體或其α4結合片段之方法，該方法係藉由提供經(a)編碼本文中所描述之抗體重鏈或其α4結合片段之DNA序列及(b)編碼抗體輕鏈或其α4結合片段之DNA序列轉染的宿主細胞，且培養經轉染之細胞以產生該重組抗α4抗體分子或其α4結合片段。編碼抗體重鏈及輕鏈之DNA可處於同一載體上或處於不同的載體上。
在一個態樣中，本發明提供一種製造重組抗α4抗體或其α4結合片段之方法，該方法係藉由提供經(a)編碼抗體重鏈或其α4結合片段之DNA序列(其中該DNA序列具有SEQ ID NO：4之序列)及(b)編碼抗體輕鏈或其α4結合片段之DNA序列(其中該DNA序列具有SEQ ID NO：11之序列)轉染的宿主細胞，且培養經轉染之細胞株以產生該重組抗α4抗體分子或其α4結合片段。編碼抗體重鏈及輕鏈之DNA可處於同一載體上或處於不同的載體上。
在另一態樣中，本發明提供一種治療由α4整合素，例如α4β1(VLA-4)或α4β7整合素介導之疾病或病症的方法，該方法係藉由向有需要之個體投與本文中所描述之α4抗體或抗體片段或者含有該抗體或片段之醫藥組合物。該個體可能患有或處在罹患例如炎症性、免疫性或自體免疫性病症(例如，中樞神經系統炎症，諸如多發性硬化症、腦膜炎、視神經脊髓炎、神經結節病、CNS血管炎、腦炎及橫貫性脊髓炎)、組織或器官移植物排斥反應或移植物對抗宿主病；急性CNS損傷，諸如中風、創傷性腦損傷(TBI)或脊髓損傷(SCI)；慢性腎病；過敏，例如過敏性哮喘；1型糖尿病；炎症性腸病，諸如克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎；重症肌無力；纖維肌痛；關節炎性病症，諸如類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎；炎症性/免疫性皮膚病，諸如牛皮癬、白癜風、皮炎、扁平苔蘚；全身性紅斑狼瘡；修格連氏症候群(Sjogren's Syndrome)；血液學癌症，諸如多發性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤；實體癌，諸如肉瘤或癌瘤，例如肺癌、乳癌、前列腺癌、腦癌；及纖維化性病症，諸如肺纖維化、骨髓纖維化、肝硬化、腎小球膜增生性腎小球腎炎、新月體性腎小球腎炎、糖尿病性腎病及腎間質性纖維化。在一較佳實施例中，本發明提供一種治療罹患多發性硬化症之患者或減輕罹患多發性硬化症之患者之症狀的方法，該多發性硬化症為諸如臨床孤立症候群、復發性緩解性多發性硬化症或活動性繼發性進行性多發性硬化症。在某些實施例中，該多發性硬化症為多發性硬化症之復發性形式。在一較佳實施例中，本發明提供一種治療患有癲癇症(包括抗藥性癲癇症)或處於罹患癲癇症之風險下之患者的方法。在某些實施例中，該個體或患者為人類。
在另一態樣中，本發明提供一種藉由向患者投與α4結合抗體或抗體片段來治療患者之方法。在一個實施例中，該患者患有癌症，諸如實體腫瘤或血液學惡性病。舉例而言，經α4結合抗體或抗體片段治療之患者可能患有急性髓性白血病(AML)或多發性骨髓瘤(MM)。
在另一實施例中，該患者患有炎症性病症，諸如多發性硬化症、哮喘(例如中度至重度哮喘)、類風濕性關節炎、糖尿病或克羅恩氏病。在另一實施例中，該組合物依據方案投與。在另一實施例中，該方法進一步包括選擇適合用該組合物治療之患者。舉例而言，適合治療之患者已顯示指示疾病發作之徵象或症狀，諸如指示MS之徵象或症狀。在一較佳實施例中，該患者患有癲癇症。
在某些實施例中，向該患者投與治療有效量之α4結合抗體或抗體片段。在某些實施例中，向該患者投與介於約0.0003mg/kg、0.0004mg/kg、0.0005mg/kg、0.0006mg/kg、0.0007mg/kg、0.0008mg/kg、0.0009mg/kg、0.0010mg/kg、 0.0015mg/kg或0.0020mg/kg至約0.0025mg/kg、0.003mg/kg、0.005mg/kg、0.010mg/kg、0.0125mg/kg、0.025mg/kg、0.050mg/kg、0.0625mg/kg、0.080mg/kg、0.100mg/kg、0.200mg/kg、0.300mg/kg、0.3125mg/kg、0.40mg/kg、0.50mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg範圍內之量的α4結合抗體或抗體片段。在一些實施例中，向該患者投與約0.025mg/kg至約10mg/kg之量的α4結合抗體或抗體片段。在一些實施例中，向該患者投與約0.0625mg/kg至約8.0mg/kg之量的α4結合抗體或抗體片段。在一些實施例中，向該患者投與約0.3mg/kg至約6.0mg/kg之量的α4結合抗體或抗體片段。在一些實施例中，向該患者投與約0.5mg/kg至約5.0mg/kg之量的α4結合抗體或抗體片段。
在另一實施例中，該方法進一步包括向該患者投與第二治療劑，諸如化學治療劑、血栓溶解劑、神經保護劑、消炎劑、類固醇、細胞介素或生長因子。
在一個實施例中，向該患者投與本文中所描述之人類化抗VLA-4抗體或其片段，諸如HuHP1/2、H1L1、H1L2或H1L3。
在一個實施例中，含有α4結合抗體之組合物依據方案，諸如以規則間隔投與。舉例而言，該組合物可每日、每週或每月投與一次；每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次或更多次；或者每兩週一次、每三週一次、每四週或更久一次。
在一個實施例中，可根據患者之先前投與抗α4抗體之清除率來調節劑量。舉例而言，在一個實施例中，在患者系統中之抗α4抗體水準降至預定水準以下之前，將不向患者投與第二或後續劑量。在一個實施例中，分析來自患者之樣品(例如，血漿、血清、血液或尿液樣品)中抗α4抗體之存在，且若抗α4 抗體水準高於預定水準，則將不向該患者投與第二或後續劑量。若患者系統中之抗α4抗體水準低於預定水準，則向該患者投與第二或後續劑量。
在一個實施例中，連續投與該組合物，例如，在超過30分鐘但少於1、2、4或12小時之時段內。含有抗體及第二劑之組合物可藉由任何適當之方法投與，例如經皮下、肌肉內或靜脈內。
在一些實施例中，該抗體及該第二劑各自以與各自用於單一療法時之處方劑量相同的劑量投與。在其他實施例中，以等於或低於單獨投與時達成效力所需之量的劑量投與該抗體。同樣，可以等於或低於單獨投與時達成效力所需之量的劑量投與該第二劑。
本發明中所提供之另一態樣為一種評估患者之方法，該方法係藉由確定該患者是否滿足預選準則，以及若該患者滿足該預選準則，則對該患者批准、提供、開具或投與本文中所描述之VLA-4結合抗體調配物。在一個實施例中，該預選準則為患者未能充分響應例如用於治療MS之先前替代治療性治療或方案。在另一實施例中，該預選準則為不存在進行性多灶性白質腦病(PML)之任何徵象或症狀，或者不存在PML之任何診斷。在一些情況下，選擇係基於不存在PML之風險因素，例如，個體未檢驗為JC病毒DNA陽性或未檢驗為JC病毒抗體陽性。在另一實施例中，該準則如PCT/US07/75577(公開為WO2008/021954)中所描述，該案以引用之方式併入本文，其描述用於藥物分佈及用於向患者提供藥物之方法及系統。
在另一態樣中，提供一種分佈本文中所描述之組合物的方法。該組合物含有α4結合抗體。該方法包括向接受者(例如，最終使用者、患者、醫生、零售或批發藥房、經銷商或醫院藥房部門、安養機構、診所或HMO)提供含有足夠單位劑量之藥物的包裝以治療患者至少6、12、24、36或48個月。在另一態樣中，本發明提供一種評估本文中所描述之含有α4結合抗體之組合物的包裝或 包裝批次之品質(例如，以確定其是否已到期)的方法。該方法包括評估包裝是否已到期。到期日期為距預選事件(諸如製造、分析或包裝)至少6、12、24、36或48個月，例如超過24或36個月。在一些實施例中，作為分析之結果，做出決定或步驟。舉例而言，依賴於正確分析，對包裝中之抗體加以使用或丟棄、分類、選擇、釋放或扣留、運輸、移至新位置、凖入市面、銷售或要約銷售、退出市面或不再要約銷售，視產品是否已到期而定。
在另一態樣中，本發明提供一種包裝，其含有至少兩個單位劑量之含有α4結合抗體之水性組合物。在一個實施例中，所有單位劑量均含有相同量之抗體，且在其他實施例中，存在具有兩種或更多種強度或者兩種或更多種不同的配方，例如具有不同的強度或釋放性質的單位劑量。
在另一態樣中，本發明包括指導接受者投與含有α4結合抗體之調配物的方法。該方法包括指導接受者(例如，最終使用者、患者、醫生、零售或批發藥房、經銷商或醫院藥房部門、安養機構、診所或HMO)應根據本文中所描述之方案將抗體投與患者。該方法亦可包括指導接受者應在到期日期之前投與抗體。到期日期為距預選事件(諸如製造、分析或包裝)至少6、12、24、36或48個月，例如超過24或36個月。在一個實施例中，，該接受者亦接受抗體供應，例如抗體單位劑量供應。
在一個實施例中，穩定多肽包含嵌合Fc區，其中該穩定多肽包含至少一個來源於人類IgG4抗體之恆定域及至少一個來源於人類IgG1抗體之恆定域。
在一個實施例中，該Fc區為糖基化Fc區。
在一個實施例中，該Fc區為無糖基化Fc區。
在一個實施例中，該Fc區為在Fc區第297位(EU編號)、第314位(Kabat編號)包含麩醯胺酸(Q)之無糖基化Fc區。
在一個實施例中，該嵌合Fc區包含來自IgG4同型之IgG抗體的CH2結構域及來自IgG1同型之IgG抗體的CH3結構域。在一些實施例中，包含來自IgG4同型之IgG抗體的CH2結構域及來自IgG1同型之IgG抗體的CH3結構域的嵌合Fc區進一步在Fc區第297位(EU編號)、第314位(Kabat編號)包含麩醯胺酸(Q)殘基而非天然存在之精胺酸(N)殘基。
在一個實施例中，該嵌合Fc區包含來自IgG4同型之IgG抗體的鉸鏈、CH1及CH2結構域以及來自IgG1同型之IgG抗體的CH3結構域，且其中該抗體在胺基酸第228位(EU編號)、第241位(Kabat編號)處包含脯胺酸。在一些實施例中，該嵌合Fc區包含來自IgG4同型之IgG抗體的鉸鏈、CH1及CH2結構域以及來自IgG1同型之IgG抗體的CH3結構域，且其中該抗體在胺基酸第228位(EU編號)、第241位(Kabat編號)處包含脯胺酸，進一步在Fc區第297位(EU編號)、第314位(Kabat編號)包含麩醯胺酸(Q)殘基而非天然存在之精胺酸(N)殘基。
在一個實施例中，該IgG抗體為人類抗體。
在一個實施例中，該無糖基化Fc區包含嵌合鉸鏈結構域。
在一個實施例中，該嵌合鉸鏈結構域包含在胺基酸第228位(EU編號)、第241位(Kabat編號)經脯胺酸殘基取代。
在一個實施例中，該抗體包含具有SEQ ID NO：4之序列的VH鏈、具有SEQ ID NO：11之序列的VL鏈、包含來自IgG4同型之IgG抗體之鉸鏈、CH1及CH2結構域以及來自IgG1同型之IgG抗體的CH3結構域的嵌合Fc區，且其中該抗體包含對CH2區中第297位(EU編號)、第314位(Kabat編號)之麩醯胺酸殘基(Q)之取代；對鉸鏈區中胺基酸第228位(EU編號)、第241位(Kabat編號)之脯胺酸殘基(P)之取代；以及CH3區中第447位(EU編號)(第478位，Kabat編號)之離胺酸(K)之缺失。
在一個實施例中，該抗體包含具有SEQ ID NO：80之序列的重鏈及具有SEQ ID NO：81之序列的輕鏈。
在一個實施例中，該抗體包含SEQ ID NO：86之重鏈，亦即IgG4 HP1/2 H1重鏈(野生型；糖基化)。
在一個實施例中，該抗體包含SEQ ID NO：87之重鏈，亦即IgG4 HP1/2重鏈S228P(EU編號)(又名IgG4P；糖基化)。
在一個實施例中，該抗體包含SEQ ID NO：88之重鏈，亦即IgG4 HP1/2 H1重鏈S228P L235E(EU編號)(又名IgG4PE；糖基化)。
在一個實施例中，該抗體包含SEQ ID NO：89之重鏈，亦即IgG4 HP1/2 H1重鏈S228P T299A(EU編號)(無糖基)。
在一個實施例中，該抗體包含SEQ ID NO：90之重鏈，亦即IgG1 HP1/2 H1重鏈N297Q(EU編號)(無糖基)。
在某些治療性抗體，例如具有IgG4恆定區之抗體中，擾亂可能產生對治療性抗體標靶(例如VLA4)為單價且對另一抗原為單價之雙特異性單株抗體。在一個實施例中，該抗體可消除擾亂或降低抗體對擾亂之易感性，從而降低PK/PD變異性。在某些實施例中，該抗體可增加二價單株抗體之效力且消除由於擾亂所致之雙特異性。在某些實施例中，該抗體可展現比其未突變對應物更高之結合親和力及/或顯示更高之持續受體佔用率。
本發明之其他特徵及優勢將由以下實施方式及申請專利範圍顯而易見。
本專利或申請案檔案含有至少一個以彩色製作之附圖。需要時且在支付必需費用後將由事務所提供含彩色圖式之本專利或專利申請公開案副本。
圖1說明HP1/2重鏈(SEQ ID NO：1)至人類重生殖系IGHV1-f(SEQ ID NO：2)之三種序列變異體。序列上方之小寫字母表示根據Kabat編號方案之插入。
圖2顯示HP1/2輕鏈(SEQ ID NO：6)至生殖系IGKV4-1抗體序列(SEQ ID NO：7)(設計L0-SEQ ID NO：8，L1-SEQ ID NO：9及L2-SEQ ID NO：10)或人類κ生殖系工程化AAH7033.1抗體序列(SEQ ID NO：12)(設計L3-SEQ ID NO：11)之四種序列變異體。序列上方之小寫字母表示根據Kabat編號方案之插入。
圖3為描繪ELISA分析結果之圖。
圖4為描繪ELISA分析結果之圖。
圖5為IgG4 Fc(鉸鏈+CH2+CH3結構域)之胺基酸序列(SEQ ID NO：14)。以粗體描繪鉸鏈區，且將CH3結構域加下劃線。加框之「S」為Ser228(EU編號，亦即Kabat編號中之Ser241)。加圈之「N」為Kabat編號中之Asn314(EU編號中之Asn297)。
圖6為描繪得自HuHP1/2與各種腫瘤細胞株結合之流式細胞術資料的圖。「HP1/2」係指人類化HP1/2。
圖7A至圖7C為描繪HuHP1/2對AML細胞株與經纖維連接蛋白或VCAM1-Ig塗佈之孔結合的抑制的一組圖。圖7A描繪對HL60及KG1細胞與經FN塗佈之孔結合的抑制。圖7B描繪對KG1細胞與經VCAM1-Ig塗佈之孔結合的抑制。圖7C描繪當與20μg/mL HuHP1/2(實心柱條)一起培育時對HL60細胞與經FN及VCAM1-Ig塗佈之孔結合的抑制。空心柱條指示在同型對照存在下之細胞黏附百分比。「HP1/2」係指人類化HP1/2。
圖8A至圖8C組成描繪HuHP1/2對MM細胞株與經纖維連接蛋白或VCAM1-Ig塗佈之孔結合的抑制的一組圖。圖8A描繪對U266及H929細胞與經FN塗佈之孔結合的抑制。圖8B描繪對U266及H929細胞與經VCAM1-Ig塗佈之孔結合的抑制。圖8C描繪當與20μg/mL HuHP1/2(實心柱條)一起培育時對 U266細胞與經FN及VCAM1-Ig塗佈之孔結合的抑制。空心柱條指示在同型對照存在下之細胞黏附百分比。「HP1/2」係指人類化HP1/2。
圖9A至圖9C組成描繪HuHP1/2對CLL細胞株與經纖維連接蛋白或VCAM1-Ig塗佈之孔結合的抑制的一組圖。圖9A描繪對Mec1及JM1細胞與經FN塗佈之孔結合的抑制。圖9B描繪對Mec1及JM1細胞與經VCAM1-Ig塗佈之孔結合的抑制。圖9C描繪當與20μg/mL HuHP1/2(實心柱條)一起培育時對Mec1細胞與經FN及VCAM1-Ig塗佈之孔結合的抑制。空心柱條指示在同型對照存在下之細胞黏附百分比。「HP1/2」係指人類化HP1/2。
圖10描繪典型抗原結合多肽(IgG抗體)之結構以及抗體之抗原結合及效應功能(例如Fc受體(FcR)結合)之功能特性。亦顯示抗體CH2結構域中存在糖(糖基化)如何改變效應功能(FcR結合)而不影響抗原結合。
圖11A至圖11D描繪來自IgG1 X射線晶體結構(pdb碼1hzh)之兩個相互作用CH3結構域(圖A)。突出顯示IgG1殘基K409/K440(EU編號/Kabat編號)及D399/D427(EU編號/Kabat編號)。圖11B描繪使用基於結構之HMM對人類IgG1/κ恆定域序列之比對(Wang等人，2009,Proteins 76：99,2009.)。CL、CH1及CH3中參與結構域間相互作用之殘基位置以及跟與碳水化合物直接接觸之彼等胺基酸存在強共價作用之胺基酸位置以灰色突出顯示。比對下方提供Kabat及EU編號。圖11C描繪IgG1-CH2結構域之結構的帶狀圖(Sondermann等人，406(6793)：267-73,2000)。標記CH2結構域內被N連接之碳水化合物埋藏之纈胺酸殘基以及獨特6胺基酸環。圖11D描繪天然IgG1-CH2序列與經完全修飾之IgG1-CH2序列的比對。經修飾之殘基位置以黑色顯示。經修飾之位置的EU編號示於比對上方。
圖12描繪本發明之例示性IgG Fc構築體在攪拌後之濁度(圖A)及單體含量%(圖B)。
圖13描繪IgG Fc構築體保持在低pH值(pH 3.1)下時隨時間變化之相對峰高。
圖14描繪如藉由溶液親和表面電漿子共振所量測之本發明之例示性IgG1及IgG4 Fc構築體對Fcγ受體之初始結合率。
圖15描繪用於計算本發明之例示性IgG1及IgG4 Fc構築體結合至CD64(FcγRI)(圖15A)及CD16(FcγRIIIa V158)(圖15B)之IC50的滴定曲線。
圖16描繪突出顯示IgG1 T318K(Kabat編號)(T299K，EU編號)相較於IgG1 T318A(Kabat編號)(T299A，EU編號)及IgG1野生型對CD64(FcγRI)之結合有所降低(圖16A)及併入T318K(Kabat編號)(T299K，EU編號)突變之例示性IgG4 Fc構築體相較於併入T318A(Kabat編號)(T299A，EU編號)突變之其他例示性IgG4 Fc構築體及IgG1野生型對CD64(FcγRI)之結合有所降低(圖16B)的滴定曲線。
圖17描繪併入T299K突變之例示性IgG4 Fc構築體相較於併入T299A突變之其他例示性IgG4 Fc構築體及IgG1野生型對CD16(FcγRIIIa V158)之結合。
圖18描繪用於評估本發明之例示性IgG1及IgG4 Fc構築體與補體因子C1q之結合的滴定曲線。
圖19之圖A及圖B分別說明用於評估各種Fc構築體與CD64及CD16之結合的滴定曲線。圖C說明N314Q(Kabat編號)(N297Q，EU編號)IgG4-CH2/IgG1-CH3與T318A(Kabat編號)(T299A，EU編號)抗體具有相同的半衰期(比無糖基化IgG1稍短)。
圖20之圖A說明用於評估T318X(Kabat編號)(T299X，EU編號)構築體與CD64之結合的滴定曲線以及帶正電側鏈T318R(Kabat編號)(T299R，EU編號)及T318KA(Kabat編號)(T299K，EU編號)賦予CD64低親和力。圖B 說明用於評估CD64與各種替代構築體之結合的滴定曲線。圖C及圖D說明用於評估構築體與CD32aR之結合的滴定曲線，且圖E及圖F說明構築體與CD16之結合。圖G及圖H說明C1q ELISA之結果。
圖21之圖A說明用於評估構築體與CD64之結合的滴定曲線，且圖B說明用於評估構築體與CD16之結合的滴定曲線。
圖22A包括HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 κ輕鏈(H1L3)之核苷酸及胺基酸序列。顯示核苷酸序列(顯示對應於SEQ ID NO：91之DNA)及輕鏈序列之胺基酸1-233(SEQ ID NO：92)。以粗斜體顯示之胺基酸1-19(及編碼DNA序列)含有合成LC信號肽。成熟N-末端以第20位胺基酸(S)開始。
圖22B包括HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1重鏈(H1L3)之核苷酸及胺基酸序列。顯示核苷酸序列(顯示DNA且其對應於SEQ ID NO：93)及重鏈之胺基酸1-469(SEQ ID NO：94)。胺基酸1-22(DNA序列以斜體顯示)含有重新編碼之合成信號肽。成熟N-末端以第23位胺基酸(E)開始。
圖23A包括胺基酸序列，包括HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 κ輕鏈(H1L3)之信號序列(加下劃線)。
圖23B包括具有SEQ ID NO：81之成熟輕鏈及SEQ ID NO：80之成熟重鏈的HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 κ輕鏈(H1L3)之胺基酸序列。
圖24提供具有SEQ ID NO：81之成熟輕鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3 ND001之成熟輕鏈)及SEQ ID NO：80之成熟重鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3 ND004/ND006之成熟重鏈)的蛋白質的紫外光譜。
圖25說明具有SEQ ID NO：81之成熟輕鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3 ND001之成熟輕鏈)及SEQ ID NO：80之成熟重鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3 ND004/ND006之成熟重鏈)的蛋白 質的SDS-PAGE結果。非還原條件示於左側兩個泳道(第1列及第2列)中，且還原條件示於右側兩個泳道(第3列及第4列)中。泳道1為非還原條件下之HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3 ND001)；泳道2為非還原條件下之分子量標記物；泳道3為還原條件下之HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3 ND001)，且泳道4為還原條件下之分子量標記物。
圖26說明具有SEQ ID NO：81之成熟輕鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3 ND001之成熟輕鏈)及SEQ ID NO：80之成熟重鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3 ND004/ND006之成熟重鏈)的蛋白質的IEF結果。
圖27說明具有SEQ ID NO：81之成熟輕鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3 ND001之成熟輕鏈)及SEQ ID NO：80之成熟重鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3 ND004/ND006之成熟重鏈)的蛋白質的分析型粒徑排阻層析法結果。
圖28至圖30說明具有SEQ ID NO：81之成熟輕鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3 ND001之成熟輕鏈)及SEQ ID NO：80之成熟重鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3 ND004/ND006之成熟重鏈)的蛋白質的DSC結果。HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3完整抗體、Fc及Fab2片段之熔融曲線分別示於圖28、圖29及圖30中。
圖31說明在非還原條件下對HP1/2樣品進行SDS-PAGE分析之結果。以6及3μg/泳道裝載各樣品。分子量標記物示於圖左側。在來自Invitrogen之4-20%聚丙烯醯胺梯度凝膠上進行SDS-PAGE，且用Simply Blue染色劑(Invitrogen)將凝膠染色並且用蒸餾水脫色。泳道1為6ug/泳道之HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3；泳道2為6ug/泳道之HP1/2 hG4P agly(T299A)；泳道3為6ug/泳道之那他珠單抗G4P agly；泳道4為6ug/泳道之那他珠單抗 G4P；泳道5為3ug/泳道之HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3；泳道6為3ug/泳道之HP1/2 hG4P agly(T299A)；泳道7為3ug/泳道之那他珠單抗G4P agly；泳道8為3ug/泳道之那他珠單抗G4P。
圖32A說明HP1/2樣品之SEC分析結果。在Superdex Increase 5/150 GL管柱(GE 28-9909-45)上以0.2ml/min之流速在PBS(10mM磷酸鈉、0.15M NaCl，pH 7.5)中運作樣品。
圖32B說明HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 H1L3、HP1/2 hG4P agly(T299A)、那他珠單抗G4P agly及那他珠單抗G4P之SEC分析結果。在Superdex 200 Increase 5/150 GL管柱(GE 28-9909-45)上以0.2ml/min之流速在PBS(10mM磷酸鈉、0.15M NaCl，pH 7.5)中運作樣品。
圖33a及圖33b分別說明人類化HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q，EU編號)/IgG1嵌合體(GP1/2 GrP agly/G1)及人類化HP1/2 G1/L3 huIgG4P agly(T299A，EU編號)(HP1/2 hG4P)之DSC結果。
圖34為顯示單次經靜脈內團注投與3mg/kg HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q，EU編號)/IgG1嵌合體(GP1/2 GrP agly/G1)(圖中稱為HP12；空心圓圈)、30mg/kg HP12(實心圓圈)及3mg/kg那他珠單抗(Tysabri，實心三角形)後食蟹獼猴之藥物動力學時程的線圖。
圖35為顯示單次經靜脈內團注投與3mg/kg HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q，EU編號)/IgG1嵌合體(GP1/2 GrP agly/G1)(圖中稱為HP12；空心圓圈)、30mg/kg HP12(實心圓圈)及3mg/kg那他珠單抗(Tysabri，實心三角形)之後食蟹獼猴之游離受體時程的線圖。
圖36為顯示人類(人類1及人類2)及食蟹獼猴(食蟹獼猴1及食蟹獼猴2)中CD49(α4整合素)表現水準之條形圖。
圖37A至圖37D為顯示以指定劑量單次經靜脈內給與那他珠單抗(紅 色線)及HP1/2(黑色線)之後的預計受體佔用率時程的線圖。
圖38提供描繪在投與某些劑量之HP1/2(圖中稱為HP12，空心圓圈)及那他珠單抗(實心三角形)後在Cmax下之預計受體佔用率的圖。
序列表
本申請案含有已經由EFS-Web提交且以引用之方式整體併入本文中的序列表。該序列表創建於2019年4月12日，命名為Anti_VLASequence PatentIN_ST25且大小為208千位元組。
已證明針對VLA-4之抗體可用於治療疾病。舉例而言，抗VLA-4抗體那他珠單抗(TYSABRI®)用於治療復發性多發性硬化症及克羅恩氏病。然而，對於某些病狀，例如急性病狀，諸如脊髓損傷(SCI)或創傷性腦損傷(TBI)之治療，或者以有限次數投與之治療，諸如癌症之治療而言，可能適宜用以不同於那他珠單抗之親和力的親和力，例如較高親和力結合及/或具有不同的藥理學概況(例如，具有較低活體內藥物動力學/藥效學變異性)的抗VLA-4抗體進行治療。該等抗體亦可用於治療諸如多發性硬化症之病狀，因為可能需要不太頻繁之治療或藉由除輸注以外之手段投與可能更有效。能夠用較低劑量進行治療亦可降低諸如PML之不良事件的風險。因此，本發明提供具有該等理想性質之抗體。
本文中揭示之某些本發明抗體已展現新設計之人類化α4結合抗體之出乎意料之特徵，其對α4之結合親和力比抗α4抗體那他珠單抗之結合親和力高出10倍。
該等抗體亦具有例如因在Fc多肽之Fc區中包括一或多個穩定胺基酸而具有降低之效應功能的穩定Fc區。在一些實施例中，該等穩定胺基酸使多肽之Fc區穩定而不影響多肽之糖基化及/或效應功能，並且不顯著改變多肽之其 他所要功能(例如，抗原結合親和力或半衰期)。
為了清楚理解本說明書及申請專利範圍，下文便利地提供以下定義。
定義
如本文中所使用，術語「效應功能」係指Fc區或其部分結合免疫系統之蛋白質及/或細胞並介導各種生物學效應之功能能力。效應功能可為抗原依賴性或非抗原依賴性的。效應功能降低係指在維持抗體(或其片段)之可變區之抗原結合活性的同時降低一或多種效應功能。效應功能(例如Fc與Fc受體或補體蛋白結合)增加或減少可用變化倍數表示(例如，改變1倍、2倍及其類似情況)，且可基於例如使用此項技術中熟知的分析法測定的結合活性變化百分比來計算。如本文中所使用，術語「抗原依賴性效應功能」係指正常情況下在抗體與相應抗原結合後誘導之效應功能。典型抗原依賴性效應功能包括結合補體蛋白(例如C1q)之能力。舉例而言，補體C1組分與Fc區結合可活化經典補體系統，從而調理並溶解細胞病原體，該過程稱為補體依賴性細胞毒性(CDCC)。補體活化亦刺激炎症性反應，且亦可能涉及自體免疫性超敏反應。
其他抗原依賴性效應功能由抗體經由其Fc區結合至細胞上之某些Fc受體(「FcR」)來介導。存在許多對不同類別之抗體具特異性的Fc受體，包括IgG(γ受體或IgγR)、IgE(ε受體或IgεR)、IgA(α受體或IgαR)及IgM(μ受體或IgμR)。抗體結合至細胞表面上之Fc受體觸發許多重要多樣化生物學反應，包括免疫複合物之內噬、對抗體塗覆之粒子或微生物之吞噬及破壞(亦稱為抗體依賴性吞噬或ADCP)、免疫複合物之清除、抗體塗覆之靶細胞被殺手細胞溶解(稱為抗體依賴性細胞毒性或ADCC)、炎症性介體之釋放、對免疫系統細胞活化之調控、胎盤轉移及對免疫球蛋白產生之控制。某些Fc受體、Fcγ受體(FcγR)在消除或增強免疫募集方面起關鍵作用。FcγR表現於白血球上且由三種不同的類別組成：FcγRI、FcγRII及FcγRIII(Gessner等人，Ann.Hematol.,(1998),76： 231-48)。在結構上，FcγR為免疫球蛋白超家族中具有IgG結合α鏈且細胞外部分由二或三個Ig樣結構域組成之所有成員。人類FcγRI(CD64)表現於人類單核球上，展現高親和力結合(Ka=108-109M-1)至單體IgG1、IgG3及IgG4。人類FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)對IgG1及IgG3(Ka<107M-1)具有低親和力，且可僅結合此等IgG同型之複合形式或聚合形式。此外，FcγRII及FcγRIII類別包含「A」及「B」形式。FcγRIIa(CD32a)及FcγRIIIa(CD16a)藉由跨膜結構域結合至巨噬細胞、NK細胞及一些T細胞之表面，而FcγRIIb(CD32b)及FcγRIIIb(CD16b)經由磷脂醯肌醇聚糖(GPI)錨選擇性地結合至顆粒球(例如嗜中性球)之細胞表面。人類FcγRI、FcγRII及FcγRIII之各別鼠類同系物為FcγRIIa、FcγRIIb/1及FcγR10。
如本文中所使用，術語「非抗原依賴性效應功能」係指可由抗體(無論其是否已結合其相應抗原)誘導之效應功能。典型非抗原依賴性效應功能包括細胞轉運、循環半衰期及免疫球蛋白清除率，以及促進純化。結構獨特之Fc受體「新生兒Fc受體」或「FcRn」，亦稱為救助受體，在調控半衰期及細胞轉運方面起關鍵作用。自微生物細胞(例如葡萄球菌蛋白A或G)純化之其他Fc受體能夠以高親和力結合至Fc區，且可用於促進含Fc多肽之純化。
與屬於免疫球蛋白超家族之FcγR不同，人類FcRn在結構上類似於I類主要組織相容性複合體(MHC)之多肽(Ghetie及Ward,Immunology Today,(1997),18(12)：592-8)。FcRn通常表現為由跨膜α或重鏈與可溶性β或輕鏈(β2微球蛋白)之複合物組成的異二聚體。FcRn與I類MHC分子具有22-29%序列一致性，且具有MHC肽結合溝之無功能型式(Simister及Mostov,Nature,(1989),337：184-7)。如同MHC，FcRn之α鏈由三個細胞外結構域(α1、α2、α3)組成，且短胞質尾將該蛋白質錨定至細胞表面。α1及α2結構域與抗體Fc區中之FcR結合位點相互作用(Raghavan等人，Immunity,(1994),1：303-15)。FcRn表現於哺 乳動物之母體胎盤或卵黃囊中，而且其涉及IgG自母體轉移至胎兒。FcRn亦表現於囓齒動物新生兒之小腸中，在其中參與將母體IgG自所攝入之初乳或乳汁中轉移至刷狀緣上皮中。FcRn亦表現於眾多物種之許多其他組織中以及各種內皮細胞株中。其亦表現於人類成人血管內皮、肌肉血管及肝竇狀隙中。認為FcRn藉由結合IgG並將其再循環至血清而在維持其循環半衰期或血清水準方面發揮額外作用。FcRn結合至IgG分子具嚴格pH值依賴性，在pH值小於7.0時具有最佳結合。
如本文中所使用，術語「半衰期」係指特定結合多肽之活體內生物半衰期。半衰期可由投與個體之量的一半自動物之循環及/或其他組織中清除所需的時間來表示。當指定結合多肽之清除曲線構築為時間之函數時，該曲線通常為雙階段的，具有快速α階段及更久β階段。α階段通常表示所投與之Fc多肽在血管內空間與血管外空間之間達成平衡且部分由多肽之大小決定。β階段通常表示結合多肽在血管內空間中分解代謝。因此，在一非限制性實施例中，如本文中所使用之術語半衰期係指結合多肽在β階段中之半衰期。人類抗體在人類中之典型β階段半衰期為21天。如本文中所使用，術語「多肽」係指兩種或更多種天然胺基酸或非天然胺基酸之聚合物。術語「Fc多肽」係指包含Fc區或其部分(例如Fc部分)之多肽。在一些實施例中，根據本發明之方法使Fc多肽穩定。在可選實施例中，該Fc多肽進一步包含可操作地連接或融合至Fc多肽之Fc區(或其部分)之結合位點。
如本文中所使用，術語「蛋白質」係指多肽(例如Fc多肽)或包含超過一種多肽之組合物。因此，蛋白質可為單體(例如單一Fc多肽)或多聚體。舉例而言，在一個實施例中，本發明之蛋白質為二聚體。在一個實施例中，本發明之二聚體為同二聚體，包含兩個一致單體次單元或多肽(例如，兩個一致Fc多肽)。在另一實施例中，本發明之二聚體為異二聚體，其包含兩個不相同的單 體次單元或多肽(例如，兩個不相同的Fc多肽或Fc多肽及除Fc多肽以外之第二多肽)。二聚體之次單元可包含一或多個多肽鏈，其中該等多肽鏈中至少一個為Fc多肽。舉例而言，在一個實施例中，該等二聚體包含至少兩個多肽鏈(例如，至少兩個Fc多肽鏈)。在一個實施例中，該等二聚體包含兩個多肽鏈，其中該等鏈之一或二者皆為Fc多肽鏈。在另一實施例中，該等二聚體包含三個多肽鏈，其中該等多肽鏈之一、二或全部為Fc多肽鏈。在另一實施例中，該等二聚體包含四個多肽鏈，其中該等多肽鏈之一、二、三或全部為Fc多肽鏈。
如本文中所使用，術語「連接(linked)」、「融合(fused)」或「融合(fusion)」可互換使用。此等術語係指藉由任何手段，包括化學結合或重組手段將兩個或更多個元件或組件接合在一起。化學結合之方法(例如，使用異雙官能交聯劑)在此項技術中為已知的。如本文中所使用，術語「基因融合」或「基因融合」係指兩個或更多個蛋白質、多肽或其片段經由其個別肽主鏈、經由編碼彼等蛋白質、多肽或片段之單一聚核苷酸分子之基因表現而共線、共價連接或連接。此種基因融合引起單一連續基因序列之表現。在一些實施例中，基因融合為同框的，亦即，兩個或更多個開放閱讀框(ORF)以維持原始ORF之正確閱讀框的方式融合以形成更長之連續ORF。因而，所得重組融合蛋白質為含有兩個或更多個對應於由原始ORF編碼之多肽的蛋白質區段(該等區段在自然界中在正常情況下不如此接合)的單一多肽。儘管閱讀框因而在整個融合基因區段中連續，但蛋白質區段可藉由例如同框多肽連接子而在物理上或空間上隔開。
如本文中所使用，術語「Fc區」應定義為由兩個或更多個抗體重鏈Fc部分形成之免疫球蛋白部分。在某些實施例中，Fc區為二聚Fc區。「二聚Fc區」或「dcFc」係指由兩個單獨免疫球蛋白重鏈之Fc部分形成之二聚體。二聚Fc區可為兩個一致Fc部分(例如，天然存在之免疫球蛋白之Fc區)之同二聚體或兩個不同Fc部分之異二聚體。在其他實施例中，Fc區為單體或「單鏈」Fc 區(亦即，scFc區)。單鏈Fc區由基因連接於單一多肽鏈內(亦即，編碼於單一連續基因序列中)之Fc部分組成。例示性scFc區揭示於2008年5月14日申請之PCT申請案第PCT/US2008/006260號中，該案係以引用之方式併入本文中。
如本文中所使用，術語「Fc部分」係指來源於在剛好處於木瓜蛋白酶裂解位點(亦即，將重鏈恆定區之第一個殘基視為114時，IgG中之殘基226(Kabat編號)/殘基216(EU編號))上游之鉸鏈區起始且在免疫球蛋白重鏈C-末端結束之免疫球蛋白重鏈部分的序列。因此，Fc部分可為完整Fc部分或其部分(例如，結構域)。完整Fc部分至少包含鉸鏈結構域、CH2結構域及CH3結構域(亦即，Kabat胺基酸位置226-477；EU胺基酸位置216-446)。額外離胺酸殘基(K)有時存在於Fc部分之極C-末端，但通常自成熟抗體裂解。除非另外規定，否則Fc區內各胺基酸位置已根據業內認可之EU編號系統進行編號。在某些實施例中，Fc部分包含以下至少一者：鉸鏈(例如上鉸鏈區、中鉸鏈區及/或下鉸鏈區)結構域、CH2結構域、CH3結構域或其變異體、部分或片段。在一些實施例中，Fc部分至少包含CH2結構域或CH3結構域。在某些實施例中，Fc部分為完整Fc部分。在其他實施例中，Fc部分相對於天然存在之Fc部分包含一或多個胺基酸插入、缺失或取代。舉例而言，鉸鏈結構域、CH2結構域或CH3結構域(或其部分)中之至少一個可能缺失。舉例而言，Fc部分可包含或由以下組成：(i)與CH2結構域(或其部分)融合之鉸鏈結構域(或其部分)；(ii)與CH3結構域(或其部分)融合之鉸鏈結構域(或其部分)；(iii)與CH3結構域(或其部分)融合之CH2結構域(或其部分)；(iv)CH2結構域(或其部分)；及(v)CH3結構域或其部分。
應注意，抗體中之胺基酸殘基有其自身之編號方案。出版物Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，第4卷，1991,U.S.Department of Health and Human Services,NIH,USA闡述一種編號方案，有時稱為EU索引編號，如Kabat等人中。然而，隨時間推移，已出現一種新編號系統， 稱為Kabat編號。
在一非限制性實例中，下表闡述人類IgG1之重鏈CH1、CH2及CH3結構域之EU編號與Kabat編號之比較。注意，人類IgG1恆定區之序列提供於SEQ ID NO：83中。
Figure 108119374-A0305-02-0032-282
Figure 108119374-A0305-02-0033-2
Figure 108119374-A0305-02-0034-3
注意，上表中之胺基酸殘基為人類IgG1中天然存在或典型的胺基酸殘基。因此，第297位(EU編號)(其在Kabat編號中為第314位)之典型殘基為天冬醯胺(N)。胺基酸殘基相對於典型殘基之任何變化將稱為取代或突變。
注意，由於人類IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之相似性，所有IgG分子之恆定區均以第118位(EU編號)(第114位，Kabat編號)之丙胺酸殘基起始且以第447位(EU編號)(第478位，Kabat編號)之C-末端離胺酸殘基結束。
下表顯示以EU編號中第216位(Kabat編號中第226位)之麩胺酸殘基起始的人類IgG1鉸鏈中的EU編號與Kabat編號之相關性。
Figure 108119374-A0305-02-0034-4
下表顯示以EU編號中第216位(Kabat編號中第226位)之麩胺酸殘基起始的人類IgG4鉸鏈中的EU編號與Kabat編號之相關性。
Figure 108119374-A0305-02-0034-283
Figure 108119374-A0305-02-0035-6
在一些實施例中，在本文中所提及之取代處於天然存在之IgG1或IgG4中時，指示取代之EU或Kabat編號將指天然存在之親本分子(或其結構域)之編號。舉例而言，若IgG4鉸鏈中第228位之絲胺酸突變為例如脯胺酸，則突變將在EU編號中表示為S228P且在Kabat編號中表示為S241P。
天然存在之人類IgG1重鏈之全長序列作為以第118位(EU編號)，亦即第114位(Kabat編號)之典型丙胺酸殘基起始的SEQ ID NO：83提供於本文中。
天然存在之人類IgG1重鏈之全長序列作為以第118位(EU編號)，亦即第114位(Kabat編號)之典型丙胺酸殘基起始之SEQ ID NO：84提供於本文中。
如本文中所闡述，熟習此項技術者應理解，Fc部分可經修飾以使其相對於天然存在之免疫球蛋白分子之完整Fc部分在胺基酸序列方面不同，同時保留由天然存在之Fc部分賦予之理想功能中的至少一種。舉例而言，Fc部分可至少包含Fc部分之此項技術中已知為FcRn結合或延長半衰期所需之部分或由其組成。在另一實施例中，Fc部分至少包含此項技術中已知為FcγR結合所需之部分。在一個實施例中，本發明之Fc區至少包含此項技術中已知為蛋白A結合所需之部分。在一個實施例中，本發明之Fc部分至少包含Fc分子之此項技術中已知為蛋白G結合所需之部分。在某些實施例中，Fc區之Fc部分屬於同一同型。
舉例而言，Fc部分可來源於IgG1或IgG4同型之免疫球蛋白(例如，人類免疫球蛋白)。然而，Fc區(或Fc區之一或多個Fc部分)亦可為嵌合的。嵌合Fc區可包含來源於不同的免疫球蛋白同型的Fc部分。在某些實施例中，二聚或單鏈Fc區之Fc部分中之至少兩個可來自於不同的免疫球蛋白同型。在額外或替代實施例中，嵌合Fc區可包含一或多個嵌合Fc部分。舉例而言，嵌合Fc區或部分可包含一或多個來源於第一同型之免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2或IgG3同型)之部分，而其餘Fc區或部分屬於不同的同型。舉例而言，Fc多肽之Fc區 或部分可包含來源於第一同型(例如，IgG1、IgG2或IgG4同型)之免疫球蛋白之CH2及/或CH3結構域以及來源於第二同型(例如，IgG3同型)之免疫球蛋白之鉸鏈區。在另一實施例中，Fc區或部分包含來源於第一同型(例如，IgG4同型)之免疫球蛋白之鉸鏈及/或CH2結構域以及來源於第二同型(例如，IgG1、IgG2或IgG3同型)之免疫球蛋白之CH3結構域。在另一實施例中，嵌合Fc區包含來自第一同型(例如，IgG4同型)之免疫球蛋白之Fc部分(例如，完整Fc部分)及來自第二同型(例如，IgG1、IgG2或IgG3同型)之免疫球蛋白之Fc部分。在一個例示性實施例中，Fc區或部分包含來自IgG4免疫球蛋白之CH2結構域及來自IgG1免疫球蛋白之CH3結構域。在另一實施例中，Fc區或部分包含來自IgG4分子之CH1結構域及CH2結構域以及來自IgG1分子之CH3結構域。在另一實施例中，Fc區或部分包含來自特定抗體同型之CH2結構域之一部分，例如CH2結構域之Kabat第309-360位、EU第292-340位。舉例而言，在一個實施例中，Fc區或部分包含CH2之第292-340位(EU編號)、第309-360位(Kabat編號)胺基酸來源於IgG4部分且CH2之其餘部分來源於IgG1部分(或者，CH2之292-340(EU編號)、309-360(Kabat編號)可來源於IgG1部分且CH2之其餘部分來源於IgG4部分)。
在其他實施例中，Fc區或部分可包含嵌合鉸鏈區。嵌合鉸鏈可部分來源於IgG1、IgG2或IgG4分子(例如，上中鉸鏈序列及下中鉸鏈序列)且部分來源於IgG3分子(例如，中鉸鏈序列)。在另一實例中，Fc區或部分可包含部分來源於IgG1分子且部分來源於IgG4分子之嵌合鉸鏈。在一特定實施例中，該嵌合鉸鏈可包含來自IgG4分子之上鉸鏈結構域及下鉸鏈結構域以及來自IgG1分子之中鉸鏈結構域。此種嵌合鉸鏈可藉由在IgG4鉸鏈區之中鉸鏈結構域中EU第228位、Kabat第241位引入脯胺酸取代(Ser228Pro(EU編號)；Ser241Pro(Kabat編號))來製備。在另一實施例中，嵌合鉸鏈可在Kabat第246-249位處包含來自 IgG2抗體之胺基酸及/或Ser228Pro(EU編號)、Ser241Pro(Kabat編號)突變，其中鉸鏈之其餘胺基酸來自於IgG4(例如，序列ESKYGPPCPPCPAPPVAGP之嵌合鉸鏈)。其他嵌合鉸鏈描述於美國專利申請案第10/880,320號中，其係以引用之方式整體併入本文中。
「Fc區」之定義內明確包括「無糖基化Fc區」。如本文中所使用，「無糖基化Fc區」為例如在其一或多個Fc部分中在EU第297位、Kabat第314位之N-糖基化位點處缺乏共價連接之寡糖或聚糖的Fc區。在某些實施例中，無糖基化Fc區完全無糖基化，亦即，其所有Fc部分均缺乏碳水化合物。在其他實施例中，無糖基化為部分無糖基化(亦即，半糖基化)。無糖基化Fc區可為去糖基化Fc區，亦即，已例如藉由化學手段或酶手段移除Fc碳水化合物之Fc區。替代地，無糖基化Fc區可為非糖基化或未糖基化的，亦即，例如藉由使例如EU第297位或第299位、Kabat第314位或第318位之N-糖基化位點(例如，Asn-X-Ser或Asn-X-Thr)處編碼糖基化模式之一或多個殘基突變，藉由在天然情況下不將碳水化合物連接至蛋白質之生物體(例如，細菌)中表現，或者藉由在藉由基因操縱或藉由添加糖基化抑制劑(例如，糖基轉移酶抑制劑)致使其糖基化機制缺乏之宿主細胞或生物體中表現而在無Fc碳水化合物之情況下表現之抗體。在替代實施例中，Fc區為「糖基化Fc區」，亦即，其在所有可利用糖基化位點處均完全糖基化。
術語「親本Fc多肽」包括含有需要穩定之Fc區的多肽(例如IgG抗體)。在一些實施例中，親本Fc多肽為無效應因子Fc多肽。已描述具有降低之效應功能的穩定Fc多肽(參見例如PCT公開案第WO2010/085682號，該案係以引用之方式整體併入本文中)。因而，親本Fc多肽表示對其進行本發明方法或可用作穩定性比較之參考點的原始Fc多肽。親本多肽可包含天然(亦即，天然存在之)Fc區或部分(例如，人類IgG4 Fc區或部分)或者具有天然存在之序列之現成 胺基酸序列修飾(諸如插入、缺失及/或其他變化)但缺乏一或多個穩定胺基酸的Fc區。
術語「突變(mutation)」或「突變(mutating)」應理解為包括以物理手段在親本Fc多肽中進行突變(例如，藉由改變(例如藉由定點突變誘發)核酸分子之編碼一個胺基酸之密碼子以產生編碼不同的胺基酸的密碼子)或合成具有親本Fc區中未發現之胺基酸的變異Fc區(例如，藉由獲悉編碼親本Fc區之核酸分子之核苷酸序列且藉由設計在不需要使編碼本發明之穩定多肽之核酸分子的一或多個核苷酸突變的情況下合成包含編碼親本Fc區變異體之核苷酸序列的核酸分子)。
在一個例示性實施例中，親本Fc多肽包含來自無效應因子Fc多肽之Fc區。如本文中所使用，術語「無效應因子Fc多肽」係指與IgG1同型之野生型無糖基化抗體相比具有改變或降低之效應功能的Fc多肽。在一些實施例中，降低或改變之效應功能為抗體依賴性效應功能，例如ADCC及/或ADCP。在一個實施例中，無效應因子Fc多肽由於Fc多肽之Fc區，例如無糖基化Fc區中之糖基化經修飾或降低而具有降低之效應功能。在另一實施例中，無效應因子Fc多肽由於併入IgG4 Fc區或其部分(例如，IgG4抗體之CH2及/或CH3結構域)而具有降低之效應功能。
術語「變異Fc多肽」或「Fc變異體」包括來源於親本Fc多肽之Fc多肽。Fc變異體與親本Fc多肽的不同之處在於其例如由於引入至少一個Fc穩定突變而包含一或多個穩定胺基酸殘基。在某些實施例中，本發明之Fc變異體包含在序列上與親本多肽之序列一致但存在一或多個穩定Fc胺基酸之Fc區(或Fc部分)。在一些實施例中，Fc變異體與親本Fc多肽相比將具有增強之穩定性，且與親本Fc多肽相比視情況具有等效或降低之效應功能。
「來源於」指定多肽或蛋白質之多肽或胺基酸序列係指多肽之來 源。在一些實施例中，來源於特定序列之多肽或胺基酸序列具有與該序列或其部分(其中該部分由至少10-20個胺基酸、或至少20-30個胺基酸、或至少30-50個胺基酸組成)基本一致或者對熟習此項技術者而言可鑑定為在序列中具有其起源的胺基酸序列。在多肽之上下文中，「線性序列」或「序列」為胺基酸在多肽中在胺基至羧基末端方向上之順序，其中序列中彼此相鄰之殘基在多肽之一級結構中為連續的。來源於另一多肽(例如，親本Fc多肽)之多肽(例如，變異Fc多肽)相對於起始或親本多肽可具有一或多個突變，例如，一或多個胺基酸殘基已被另一胺基酸殘基取代或具有一或多個胺基酸殘基插入或缺失。在一些實施例中，該多肽包含非天然存在之胺基酸序列。該等變異體必需與起始多肽具有低於100%序列一致性或相似性。在一非限制性實施例中，變異體與起始多肽之胺基酸序列將具有約75%至低於100%胺基酸序列一致性或相似性、或約80%至低於100%、或約85%至低於100%、或約90%至低於100%(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)或約95%至低於100%，例如在變異體分子之整個長度或其部分(例如，Fc區或Fc部分)上。在一個實施例中，起始多肽序列(例如，親本Fc多肽之Fc區)與來源於其之序列(例如，變異Fc多肽之Fc區)之間存在一個胺基酸差異。在其他實施例中，起始多肽序列與變異多肽之間存在二至十個胺基酸差異(例如，約2-20、約2-15、約2-10、約5-20、約5-15、約5-10個胺基酸差異)。舉例而言，可能存在少於約10個胺基酸差異(例如，二、三、四、五、六、七、八、九或十個胺基酸差異)。關於此序列之一致性或相似性在本文中定義為將序列對準且在必要時引入空位以達成最大序列一致性百分比之後候選序列中與起始胺基酸殘基一致之胺基酸殘基(亦即，相同的殘基)的百分比。
本發明之Fc多肽可包含來源於人類免疫球蛋白序列之胺基酸序列(例如，至少一個Fc區或Fc部分)(例如，來自人類IgG分子之Fc區或Fc部分)。 然而，多肽可包含來自另一哺乳動物物種之一或多個胺基酸。舉例而言，主題多肽中可包括靈長類動物Fc部分或靈長類動物結合位點。替代地，Fc多肽中可存在一或多個鼠類胺基酸。在一些實施例中，本發明之Fc多肽不具免疫原性。
熟習此項技術者亦將理解，可改變本發明之Fc多肽，以使其在胺基酸序列方面不同於其所來源之親本多肽，同時保留親本多肽之一或多種理想活性(例如，降低之效應功能)。在特定實施例中，進行使Fc多肽穩定之核苷酸或胺基酸取代。在一個實施例中，可藉由將一或多個核苷酸取代、添加或缺失引入親本Fc多肽之核苷酸序列中來產生編碼Fc變異體之經分離核酸分子，從而將一或多個胺基酸取代、添加或缺失引入所編碼之蛋白質中。可藉由標準技術，諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發來引入突變(例如，穩定突變)。
如本文中所使用，術語「蛋白質穩定性」係指響應於環境條件(例如升高或降低之溫度)維持蛋白質之一或多種物理性質的業內認可量度。在一個實施例中，物理性質為維持蛋白質之共價結構(例如不存在蛋白水解裂解、不需要之氧化或脫醯胺)。在另一實施例中，物理性質為存在呈適當摺疊狀態之蛋白質(例如，不存在可溶性或不溶性聚集物或沈澱物)。在一個實施例中，藉由分析蛋白質之生物物理學性質，例如熱穩定性、pH去摺疊概況、糖基化之穩定移除、溶解度、生物化學功能(例如，結合至蛋白質(例如，配位體、受體、抗原等)或化學部分之能力等)及/或其組合來量測蛋白質之穩定性。在另一實施例中，藉由相互作用之結合親和力來證明生物化學功能。在一個實施例中，蛋白質穩定性之量度為熱穩定性，亦即，對熱攻擊之抗性。可使用此項技術中已知的及/或本文中描述的方法來量測穩定性。舉例而言，可量測「Tm」，亦稱為「轉移溫度」。Tm為50%巨分子(例如結合分子)變性之溫度，且被視為描述蛋白質之熱穩定性的標準參數。
術語「胺基酸」包括丙胺酸(Ala或A)；精胺酸(Arg或R)；天冬醯胺 (Asn或N)；天冬胺酸(Asp或D)；半胱胺酸(Cys或C)；麩醯胺酸(Gln或Q)；麩胺酸(Glu或E)；甘胺酸(Gly或G)；組胺酸(His或H)；異白胺酸(He或I)；白胺酸(Leu或L)；離胺酸(Lys或K)；甲硫胺酸(Met或M)；苯丙胺酸(Phe或F)；脯胺酸(Pro或P)；絲胺酸(Ser或S)；蘇胺酸(Thr或T)；色胺酸(Trp或W)；酪胺酸(Tyr或Y)；及纈胺酸(Val或V)。非傳統胺基酸亦在本發明之範疇內，且包括正白胺酸、鳥胺酸、正纈胺酸、高絲胺酸及其他胺基酸殘基類似物，諸如Ellman等人，Meth.Enzym.202：301-336(1991)中所描述之彼等胺基酸殘基類似物。為了產生該等非天然存在之胺基酸殘基，可使用Noren等人，Science 244：182(1989)及Ellman等人，同上之程序。簡而言之，此等程序涉及用非天然存在之胺基酸殘基以化學手段活化抑制型tRNA，繼而進行RNA之活體外轉錄及轉譯。亦可使用此項技術中已知的肽化學反應來達成非傳統胺基酸之引入。如本文中所使用，術語「極性胺基酸」包括具有淨零電荷但在其側鏈之不同部分中具有非零部分電荷的胺基酸(例如M、F、W、S、Y、N、Q、C)。此等胺基酸可參與疏水性相互作用及靜電相互作用。如本文中所使用，術語「帶電胺基酸」包括可在其側鏈上具有非零淨電荷之胺基酸(例如R、K、H、E、D)。此等胺基酸可參與疏水性相互作用及靜電相互作用。如本文中所使用，術語「具有足夠空間體積之胺基酸」包括具有佔據較大3維空間之側鏈的彼等胺基酸。具有足夠空間體積之側鏈化學性質的例示性胺基酸包括酪胺酸、色胺酸、精胺酸、離胺酸、組胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸及甲硫胺酸或其類似物或模擬物。
「胺基酸取代」係指將預定胺基酸序列(起始多肽之胺基酸序列)中之至少一個現有胺基酸殘基置換為第二不同的「置換」胺基酸殘基。「胺基酸插入」係指將至少一個額外胺基酸併入預定胺基酸序列中。儘管插入通常將由一或兩個胺基酸殘基之插入組成，但可進行本發明之較大「肽插入」，例如約三至約五或甚至多達約十、十五或二十個胺基酸殘基之插入。插入之殘基可為天 然存在的或非天然存在的，如以上所揭示。「胺基酸缺失」係指自預定胺基酸序列移除至少一個胺基酸殘基。如以上所闡述，此等術語包括對現有物理核酸分子之實際變化或在設計過程中(例如，在紙上或在電腦上)對現有核酸序列進行之變化。在某些實施例中，本發明之多肽為結合多肽。如本文中所使用，術語「結合多肽」(例如，結合抗體)係指包含至少一個特異性結合至所指示之靶分子(諸如抗原或結合搭配物)的靶結合位點或結合結構域的多肽(例如，Fc多肽)。舉例而言，在一個實施例中，本發明之結合多肽包含免疫球蛋白抗原結合位點或負責配位體結合之受體分子部分或負責受體結合之配位體分子部分。本發明之結合多肽包含至少一個結合位點。在一個實施例中，本發明之結合多肽包含至少兩個結合位點。在一個實施例中，該等結合多肽包含兩個結合位點。在另一實施例中，該等結合多肽包含三個結合位點。在另一實施例中，該等結合多肽包含四個結合位點。在一個實施例中，結合位點彼此串聯連接。在其他實施例中，結合位點位於結合多肽之不同位置，例如，位於Fc多肽Fc區之N-末端或C-末端中之一或多者處。舉例而言，在Fc區為scFc區之情況下，結合位點可連接至scFc區之N-末端、C-末端或兩端。在Fc區為二聚Fc區之情況下，結合位點可連接至一或兩個N-末端及/或一或兩個C-末端。
如本文中所使用，術語「結合結構域」、「結合位點」或「結合部分」係指結合多肽之具有例如介導與靶分子(例如抗原、配位體、受體、受質或抑制劑)之特異性結合的生物活性(Fc介導之生物活性除外)的部分、區域或位點。例示性結合結構域包括生物活性蛋白質或部分、抗原結合位點、配位體之受體結合結構域、受體之配位體結合結構域或酶結構域。在另一實例中，術語「結合部分」係指結合至生物系統之組分(例如，血清中或細胞表面上或細胞基質中之蛋白質)且該結合引起生物效應(例如，如藉由活性部分及/或其結合之組分之變化(例如，活性部分及/或其結合之組分之裂解、信號傳遞、或者對細胞中 或個體中生物反應之增強或抑制)所量測)的生物活性分子或其部分。
如本文中所使用之術語「配位體結合結構域」係指天然受體(例如，細胞表面受體)或其至少保留相應天然受體之定性配位體結合能力及/或至少一些(或大部分)生物活性的區域或衍生物。如本文中所使用之術語「受體結合結構域」係指天然配位體或其至少保留相應天然配位體之定性受體結合能力及/或至少一些生物活性的區域或衍生物。在一個實施例中，本發明之結合多肽具有至少一個對靶向以便減少或消除之分子，例如細胞表面抗原或可溶性抗原具特異性的結合結構域。在一些實施例中，結合結構域包含抗原結合位點(例如，包含置於交替構架區(例如，視情況包含一或多個胺基酸取代之人類構架區)中之來自抗體之可變重鏈序列及可變輕鏈序列或六個CDR)或由其組成。如本文中所使用，術語「結合親和力」包括結合相互作用之強度且因此包括實際結合親和力以及表觀結合親和力二者。實際結合親和力為締合速率相對於解離速率之比率。因此，賦予或最佳化結合親和力包括改變此等分量中之任一者或二者以達成所要結合親和力水準。表觀親和力可包括例如相互作用之親合力。
如本文中所使用，術語「結合自由能」或「結合之自由能」包括其業內認可之含義，且特定言之，如應用於溶劑中結合位點-配位體或Fc-FcR相互作用時。結合自由能降低使親和力增強，而結合自由能增加使親和力降低。
術語「特異性」包括與指定標靶特異性地結合(例如，免疫反應)之潛在結合位點的數目。結合多肽可為單特異性的且含有一或多個特異性結合相同標靶(例如，相同抗原決定基)之結合位點，或結合多肽可為多特異性的且含有兩個或更多個特異性結合相同標靶之不同區域(例如，不同的抗原決定基)或不同靶標的結合位點。在一個實施例中，可製造對多於一個靶分子(例如，多於一個抗原或相同抗原上之多於一個抗原決定基)具有結合特異性的多特異性結合多肽(例如，雙特異性多肽)。在另一實施例中，多特異性結合多肽具有至少一個對靶 向以便減少或消除之分子具特異性的結合結構域及至少一個對細胞上之靶分子具特異性的結合結構域。在另一實施例中，多特異性結合多肽具有至少一個對靶向以便減少或消除之分子具特異性的結合結構域及至少一個對藥物具特異性的結合結構域。在另一實施例中，多特異性結合多肽具有至少一個對靶向以便減少或消除之分子具特異性的結合結構域及至少一個對前藥具特異性的結合結構域。在另一實施例中，多特異性結合多肽為具有兩個對一個靶分子具特異性之結合域及兩個對第二靶分子具特異性之結合位點的四價抗體。
如本文中所使用，術語「價」係指結合多肽或蛋白質中之潛在結合結構域數目。各結合結構域特異性地結合一個靶分子。當結合多肽包含多於一個結合結構域時，各結合結構域可特異性地結合相同或不同的分子(例如，可結合至不同的配位體或不同的抗原，或相同抗原上之不同抗原決定基)。在一個實施例中，本發明之結合多肽為單價的。在另一實施例中，本發明之結合多肽為多價的。在另一實施例中，本發明之結合多肽為二價的。在另一實施例中，本發明之結合多肽為三價的。在另一實施例中，本發明之結合多肽為四價的。在某些態樣中，本發明之結合多肽採用多肽連接子。如本文中所使用，術語「多肽連接子」係指連接多肽鏈之線性胺基酸序列中之兩個結構域的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。舉例而言，多肽連接子可用於將結合位點連接至本發明之Fc多肽之Fc區(或Fc部分)。在一些實施例中，該等多肽連接子為多肽分子提供可撓性。舉例而言，在一個實施例中，VH結構域或VL結構域融合或連接至多肽連接子，且多肽連接子之N-或C-末端連接至Fc區(或Fc部分)之C-或N-末端並且多肽連接子之N-末端連接至VH或VL結構域之N-或C-末端)。在某些實施例中，多肽連接子用於連接(例如，基因融合)scFc多肽之兩個Fc部分或結構域。該等多肽連接子在本文中亦稱為Fc連接多肽。如本文中所使用，術語「Fc連接多肽」尤其係指連接(例如，基因融合)兩個Fc部分或結構域之連 接多肽。本發明之結合分子可包含多於一個肽連接子。
如本文中所使用，術語「適當摺疊之多肽」包括構成多肽之所有功能結構域均具有獨特活性的多肽(例如，本發明之結合多肽)。如本文中所使用，術語「不當摺疊之多肽」包括多肽之至少一個功能結構域不具活性的多肽。如本文中所使用，「適當摺疊之Fc多肽」或「適當摺疊之Fc區」包含至少兩個組分Fc部分被適當摺疊，使得所得Fc區包含至少一種效應功能的Fc區(例如，scFc區)。
如本文中所使用，術語「免疫球蛋白」包括具有兩個重鏈與兩個輕鏈之組合的多肽，無論其具有任何相關特異性免疫反應性與否。
如本文中所使用，術語「抗體」係指對相關抗原(例如腫瘤相關抗原)具有顯著已知特異性免疫反應活性之組裝體(例如，完整抗體分子、抗體片段或其變異體)。抗體及免疫球蛋白包含輕鏈及重鏈，在其之間存在或不存在鏈間共價連接。相對充分理解脊椎動物系統中之基本免疫球蛋白結構。
如下文將更詳細論述，通用術語「抗體」包括生物化學上可區分之五個不同類別的抗體。來自各抗體類別之Fc部分顯然在本發明的範疇內，以下論述將大體上針對IgG類免疫球蛋白分子。就IgG而言，免疫球蛋白包含兩個分子量約23,000道爾頓之一致輕多肽鏈及兩個分子量53,000-70,000之一致重鏈。該四個鏈藉由二硫鍵呈「Y」構形接合，其中輕鏈括住重鏈，重鏈起始於「Y」之開口處且延續穿過可變域。
免疫球蛋白輕鏈分類為κ或λ(kappa，lambda)。各重鏈類別可與κ或λ輕鏈結合。一般而言，輕鏈與重鏈彼此共價鍵結，且當免疫球蛋白係由雜交瘤、B細胞或基因工程化宿主細胞產生時，兩個重鏈之「尾部」部分藉由共價二硫鍵或非共價鍵彼此鍵結。在重鏈中，胺基酸序列自Y構形叉形端之N-末端延伸至各鏈底部之C-末端。熟習此項技術者應理解，重鏈分類為γ、μ、α、δ或 ε(gamma、mu、alpha、delta、epsilon)，其中一些具有次群(例如，γ1-γ4)。此鏈之性質決定抗體之「類別」分別為IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白次群(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等受到充分表徵且已知可賦予功能專門化。在觀看本揭示內容後，此等類別及同型中之每一者的修飾型式對熟習此項技術者而言可容易辨別且因此處於本發明之範疇內。
輕鏈及重鏈二者皆分成具有結構及功能同源性之區域。術語「區域」係指單一免疫球蛋白(如術語「Fc區」之情況)或單一抗體鏈之部件或部分，且包括恆定區或可變區，以及該等結構域之更多離散部件或部分。舉例而言，輕鏈可變域包括散佈在「構架區」或「FR」間的「互補性決定區」或「CDR」，如本文中所定義。免疫球蛋白之某些區域可基於在「恆定區」之情況下不同類別成員之該等區域內相對缺乏序列變異或在「可變區」之情況下不同類別成員之該等區域內存在顯著變異而定義為「恆定」(C)區或「可變」(V)區。術語「恆定區」及「可變區」亦可功能性地使用。就此而言，應瞭解免疫球蛋白或抗體之可變區決定抗原識別及特異性。相反，免疫球蛋白或抗體之恆定區賦予重要效應功能，諸如分泌、經胎盤移動性、Fc受體結合、補體結合及其類似效應功能。不同免疫球蛋白類別之恆定區之次單元結構及三維構形為眾所周知的。
將免疫球蛋白重鏈及輕鏈之恆定區及可變區摺疊至結構域中。術語「結構域」係指重鏈或輕鏈多肽之包含例如藉由β摺疊片及/或鏈內二硫鍵加以穩定之肽環(例如，包含3至4個肽環)之獨立摺疊球形區域。免疫球蛋白輕鏈上之恆定區結構域可互換地稱為「輕鏈恆定區結構域」、「CL區」或「CL結構域」。重鏈上之恆定結構域(例如鉸鏈、CH1、CH2或CH3結構域)可互換地稱為「重鏈恆定區結構域」、「CH」區結構域或「CH結構域」。輕鏈上之可變域可互換地稱為「輕鏈可變區結構域」、「VL區結構域」或「VL結構域」。重鏈上之可變域可互換地稱為「重鏈可變區結構域」、「VH區結構域」或「VH 結構域」。
按照慣例，可變區及恆定區結構域之編號隨其更遠離免疫球蛋白或抗體之抗原結合位點或胺基末端而增加。各重免疫球蛋白鏈及輕免疫球蛋白鏈之N-末端為可變區且在C-末端為恆定區；CH3及CL結構域實際上分別包含重鏈及輕鏈之羧基末端。因此，輕鏈免疫球蛋白之結構域按VL-CL方向排列，而重鏈之結構域按VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3方向排列。除非另外陳述，否則重鏈恆定區中之胺基酸位置，包括CH1、鉸鏈、CH2及CH3結構域中之胺基酸位置在本文中根據EU索引編號系統進行編號。相反，輕鏈恆定區(例如CL結構域)中之胺基酸位置在本文中根據Kabat索引編號系統進行編號(參見Kabat等人，如上)。
如本文中所使用，術語「VH結構域」包括免疫球蛋白重鏈之胺基末端可變域，而術語「VL結構域」包括免疫球蛋白輕鏈之胺基末端可變域，根據Kabat索引編號系統。
如本文中所使用，術語「CH1結構域」包括免疫球蛋白重鏈之例如自約EU第118位延伸至第215位之第一(最胺基末端)恆定區結構域。CH1結構域與VH結構域相鄰，且胺基末端與免疫球蛋白重鏈分子之鉸鏈區相鄰，並且不形成免疫球蛋白重鏈Fc區之一部分。在一個實施例中，本發明之結合多肽包含來源於免疫球蛋白重鏈分子(例如人類IgG1或IgG4分子)之CH1結構域。
如本文中所使用，術語「鉸鏈區」包括將CH1結構域接合至CH2結構域之重鏈分子部分。此鉸鏈區包含約25個殘基且為可撓性的，因而允許兩個N-末端抗原結合區獨立地移動。鉸鏈區可再分為三個不同的結構域：上鉸鏈結構域、中鉸鏈結構域及下鉸鏈結構域(Roux等人，J.Immunol.1998,161：4083)。
如本文中所使用，術語「CH2結構域」包括例如自約EU第231位延伸至第340位之重鏈免疫球蛋白分子部分。CH2結構域之獨特之處在於其不 與另一結構域精密配對。相反，兩個N-連接之分支碳水化合物鏈插入在完整天然IgG分子之兩個CH2結構域之間。在一個實施例中，本發明之結合多肽包含來源於IgG1分子(例如人類IgG1分子)之CH2結構域。在另一實施例中，本發明之結合多肽包含來源於IgG4分子(例如人類IgG4分子)之CH2結構域。在一例示性實施例中，本發明之多肽包含CH2結構域(EU第231-340位)或其部分。
如本文中所使用，術語「CH3結構域」包括自CH2結構域之N-末端延伸約110個殘基，例如自約第341位至第446b位(EU編號系統)之重鏈免疫球蛋白分子部分。額外離胺酸殘基(K)有時存在於CH3結構域之極C-末端，但通常自成熟抗體裂解。CH3結構域通常形成抗體之C-末端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，額外結構域可自CH3結構域延伸以形成分子之C-末端部分(例如IgM之μ鏈及IgE之ε鏈中的CH4結構域)。在一個實施例中，本發明之結合多肽包含來源於IgG1分子(例如人類IgG1分子)之CH3結構域。在另一實施例中，本發明之結合多肽包含來源於IgG4分子(例如人類IgG4分子)之CH3結構域。
如本文中所使用，術語「CL結構域」包括免疫球蛋白輕鏈之例如自約Kabat第107A位延伸至第216位之第一(最胺基末端)恆定區結構域。CL結構域與VL結構域相鄰。在一個實施例中，本發明之結合多肽包含來源於κ輕鏈(例如人類κ輕鏈)之CL結構域。
如以上所指示，抗體之可變區允許其選擇性地識別並因而特異性地結合至抗原上之抗原決定基。特異性地結合至標靶之抗體可稱為靶結合抗體(例如，α4結合抗體為特異性地結合至α4之抗體)。「特異性地結合」意謂抗體(或其可變區)特異性地結合至其標靶(例如，α4整合素上之抗原決定基)，其中平衡解離常數(KD)小於約5×10-5(亦即，50uM)、或小於約1×10-5(亦即，10uM)、或小於約5×10-6(亦即，5uM)、或小於約1×10-6(亦即，1uM)、或小於約5×10-7(亦即，500nM)、或小於約1×10-7(亦即，100nM)、或小於約5×10-8(亦即，50nM)、 或小於約1×10-8(亦即，10nM)、或小於約5×10-9(亦即，5nM)、或小於約1×10-9(亦即，1nM)、或小於約5×10-10(亦即，500pM)、或小於約1×10-10(亦即，100pM)、或小於約5×10-11(50pM)、或小於約1×10-11(10pM)、或小於約5×10-12(5pM)、或小於約1×10-12(1pm)、或小於約5×10-13(500fM)、或小於約1×10-13(100fM)、或小於約5×10-14(50fM)、或小於約1×10-14(10fM)、或小於約5×10-15(5fM)、或小於約1×10-15(1fM)。亦即，抗體之VL結構域與VH結構域組合以形成定義三維抗原結合位點之可變區(Fv)。此四級抗體結構形成存在於Y各臂末端之抗原結合位點。更特定言之，抗原結合位點由各重鏈及輕鏈可變區上之三個互補性決定區(CDR)定義。
如本文中所使用，術語「抗原結合位點」包括與抗原(諸如細胞表面或可溶性抗原)特異性地結合(免疫反應)之位點。在一個實施例中，結合位點包括免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區，且由此等可變區形成之結合位點決定抗體之特異性。抗原結合位點由因多肽而各異之可變區形成。在一個實施例中，本發明之結合多肽包含含有抗體分子(例如，其序列為此項技術中已知的或本文中所描述的)之至少一個重鏈或輕鏈CDR的抗原結合位點。在另一實施例中，本發明之結合多肽包含含有來自一或多個抗體分子之至少兩個CDR的抗原結合位點。在另一實施例中，本發明之結合多肽包含含有來自一或多個抗體分子之至少三個CDR的抗原結合位點。在另一實施例中，本發明之結合多肽包含含有來自一或多個抗體分子之至少四個CDR的抗原結合位點。在另一實施例中，本發明之結合多肽包含含有來自一或多個抗體分子之至少五個CDR的抗原結合位點。在另一實施例中，本發明之結合多肽包含含有來自抗體分子之六個CDR的抗原結合位點。包含至少一個可包括在主題結合多肽中之CDR的例示性抗體分子為此項技術中已知的，且例示性分子描述於本文中。
如本文中所使用，術語「CDR」或「互補性決定區」意謂在重鏈及 輕鏈多肽二者之可變區內發現的非相連抗原組合位點。以下文獻已描述此等特定區域Kabat等人，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)及Kabat等人，Sequences of protein of immunological interest.(1991)；以及Chothia等人，J.MoI.Biol.196：901-917(1987)及MacCallum等人，J.MoI.Biol.262：732-745(1996)，其中該等定義包括當與彼此比較時之胺基酸殘基重疊或子集。顯示涵蓋如由以上引用之各參考文獻所定義之CDR的胺基酸殘基用於比較。在一些實施例中，術語「CDR」為如Kabat基於序列比較所定義之CDR。
Figure 108119374-A0305-02-0050-7
1殘基編號遵循Kabat等人，同上之命名法。
2殘基編號遵循Chothia等人，同上之命名法
3殘基編號遵循MacCallum等人，同上之命名法
如本文中所使用之術語「構架區」或「FR區」包括作為可變區之一部分但並非CDR之一部分的胺基酸殘基(例如，使用CDR之Kabat定義)。因此，可變區構架之長度在約100-120個胺基酸之間，但僅包括在CDR外部之彼等胺基酸。關於重鏈可變區之特定實例且關於如Kabat等人所定義之CDR，構架區1對應於涵蓋胺基酸1-30之可變區結構域；構架區2對應於涵蓋胺基酸36-49之可變區結構域；構架區3對應於涵蓋胺基酸66-94之可變區結構域，且構架區4對應於自胺基酸103至可變區末端之可變區結構域。輕鏈之構架區類似地由各輕鏈可變區CDR隔開。類似地，使用Chothia等人或McCallum等人之CDR定義時，構架區邊界由各別CDR末端隔開，如以上所描述。在一些實施例中，CDR如Kabat所定義。
在天然存在之抗體中，各單體抗體上存在之六個CDR為短非連續胺基酸序列，其經特異性地定位以便在抗體於水性環境中呈現其三維構型時形成抗原結合位點。重鏈及輕鏈可變域之其餘部分在胺基酸序列中顯示較低分子間變異性且稱為構架區。構架區主要採用β-片構形，且CDR形成連接β-片結構且在一些情況下形成其一部分的環。因而，此等構架區起形成支架作用，該支架提供藉由鏈間非共價相互作用將六個CDR定位於正確取向。由經定位之CDR形成之抗原結合位點定義與免疫反應性抗原上之抗原決定基互補的表面。此互補表面促進抗體與免疫反應性抗原決定基之非共價結合。一般熟習此項技術者可容易地鑑定CDR之位置。
在某些實施例中，本發明之結合多肽包含至少兩個抗原結合結構域(例如，在相同結合多肽內(例如，在單一多肽之N-末端及C-末端)或連接至本發明之多聚結合蛋白質之各組分結合多肽)，從而提供結合多肽與所選抗原之締合。抗原結合結構域不需要來源於相同免疫球蛋白分子。就此而言，可變區可能或可能並非來源於任何類型之可經誘導以建立體液反應且產生針對所要抗原之免疫球蛋白的動物。因而，可變區可為例如哺乳動物來源，例如，可為人類、鼠類、非人類靈長動物(諸如食蟹獼猴、獼猴等)、羽扇豆、駱駝科動物(例如，來自駱駝、美洲駝及相關物種)。
術語「抗體變異體」或「經修飾之抗體」包括自然界中不存在且胺基酸序列或胺基酸側鏈化學性質相對於天然來源之抗體之胺基酸序列或胺基酸側鏈化學性質相差至少一個如本文中所描述之胺基酸或胺基酸修飾的抗體。如本文中所使用，術語「抗體變異體」包括經改變以使其不為天然存在形式之合成抗體形式，例如，包含至少兩個重鏈部分而非兩個完整重鏈之抗體(諸如，結構域缺失抗體或迷你抗體)；經改變以結合至兩個或更多個不同的抗原或單一抗原上之不同抗原決定基的多特異抗體形式(例如，雙特異性、三特異性等))；與 scFv分子接合之重鏈分子；單鏈抗體；雙功能抗體；三功能抗體；及具有改變之效應功能的抗體及其類似物。
如本文中所使用，術語「scFv分子」包括由一個輕鏈可變域(VL)或其部分及一個重鏈可變域(VH)或其部分組成的結合分子，其中各可變域(或其部分)來源於相同或不同的抗體。scFv分子可包含插入在VH結構域與VL結構域之間的scFv連接子。ScFv分子在此項技術中為已知的且描述於例如以下文獻中：美國專利5,892,019；Ho等人，1989.Gene 77：51；Bird等人，1988 Science 242：423；Pantoliano等人，1991.Biochemistry 30：10117；Milenic等人，1991.Cancer Research 51：6363；Takkinen等人，1991.Protein Engineering 4：837。
如本文中所使用之「scFv連接子」係指插入在scFv之VL與VH結構域之間的部分。在一些實施例中，scFv連接子可維持scFv分子呈抗原結合構形。在一個實施例中，scFv連接子包含scFv連接子肽或由其組成。在某些實施例中，scFv連接子肽包含gly-ser多肽連接子或由其組成。在其他實施例中，scFv連接子包含二硫鍵。
如本文中所使用，術語「gly-ser多肽連接子」係指由甘胺酸及絲胺酸殘基組成之肽。例示性gly/ser多肽連接子包含胺基酸序列(Gly4Ser)n。在一個實施例中，n=1。在一個實施例中，n=2。在另一實施例中，n=3，亦即，(Gly4Ser)3。在另一實施例中，n=4，亦即，(Gly4Ser)4。在另一實施例中，n=5。在另一實施例中，n=6。在另一實施例中，n=7。在另一實施例中，n=8。在另一實施例中，n=9。在另一實施例中，n=10。另一例示性gly/ser多肽連接子包含胺基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在一個實施例中，n=1。在一個實施例中，n=2。在某一實施例中，n=3。在另一實施例中，n=4。在另一實施例中，n=5。在另一實施例中，n=6。
如本文中所使用，術語「天然半胱胺酸」應係指天然存在於多肽之特定胺基酸位置且未經人工修飾、引入或改變的半胱胺酸胺基酸。術語「工程 化半胱胺酸殘基或其類似物」或「工程化半胱胺酸或其類似物」應係指非天然半胱胺酸殘基或半胱胺酸類似物(例如含硫醇之類似物，諸如噻唑啉-4-甲酸及噻唑啶-4-甲酸(硫代脯胺酸，Th))，其係藉由合成手段(例如藉由重組技術、活體外肽合成、藉由對肽進行酶促或化學偶聯或者此等技術之某種組合)而引入多肽之胺基酸位置，該位置在天然情況下不含半胱胺酸殘基或其類似物。
如本文中所使用，術語「二硫鍵」包括兩個硫原子之間形成之共價鍵。胺基酸半胱胺酸包含可與第二硫醇基形成二硫鍵或二硫橋之硫醇基。在大部分天然存在之IgG分子中，CH1及CL區由天然二硫鍵連接，且兩個重鏈在使用Kabat編號系統時在對應於239及242之位置(EU編號系統之第226位或第229位)由兩個天然二硫鍵連接。
如本文中所使用，術語「鍵結半胱胺酸」應係指多肽內與相同或不同多肽內所存在之第二天然或工程化半胱胺酸或者其他殘基形成二硫鍵或其他共價鍵的天然或工程化半胱胺酸殘基。「鏈內鍵結半胱胺酸」應係指共價鍵結至相同多肽內所存在之第二半胱胺酸的鍵結半胱胺酸(亦即，鏈內二硫鍵)。「鏈間鍵結半胱胺酸」應係指共價鍵結至不同多肽內所存在之第二半胱胺酸的鍵結半胱胺酸(亦即，鏈間二硫鍵)。
如本文中所使用，術語「游離半胱胺酸」係指多肽序列內以實質上經還原形式存在之天然或工程化半胱胺酸胺基酸殘基(及其類似物或模擬物，例如噻唑啉-4-甲酸及噻唑啶-4-甲酸(硫代脯胺酸，Th))。在一些實施例中，游離半胱胺酸能夠用本發明之效應部分加以修飾。
術語「硫醇修飾試劑」應係指能夠選擇性地與結合多肽中(例如，結合多肽之多肽連接子內)之工程化半胱胺酸殘基或其類似物之硫醇基團反應且從而提供對結合多肽進行效應部分之位點特異性化學添加或交聯，由此形成經修飾之結合多肽的手段的化學試劑。在一些實施例中，硫醇修飾試劑利用游離半 胱胺酸殘基中所存在之硫醇或巰基官能基。例示性硫醇修飾試劑包括馬來醯亞胺、烷基及芳基鹵化物、α-鹵代醯基及吡啶基二硫化物。
術語「功能部分」包括在一些實施例中添加理想功能至結合多肽之部分。在一些實施例中，在不顯著改變多肽之固有理想活性，例如該分子之抗原結合活性的情況下添加功能。本發明之結合多肽可包含一或多個可能相同或不同的功能部分。可用功能部分之實例包括但不限於效應部分、親和部分及阻斷部分。例示性阻斷部分包括具有足以降低糖基化(例如藉由阻斷糖苷酶使多肽糖基化之能力)之空間體積及/或電荷的部分。阻斷部分可另外地或替代地降低效應功能，例如，藉由抑制Fc區結合受體或補體蛋白質之能力。非限制性阻斷部分包括半胱胺酸加合物、半胱胺酸、混合二硫化物加合物及PEG部分。例示性可偵測部分包括螢光部分、放射性同位素部分、不透射線部分及其類似物。關於化學部分之結合，術語「連接部分」包括能夠將功能部分連接至結合多肽之其餘部分的部分。可選擇連接部分以使其可裂解或不可裂解。不可裂解之連接部分一般具有高系統穩定性，但亦可能具有不利的藥物動力學性質。
術語「間隔部分」為設計用於向分子中引入間隔之非蛋白質部分。在一個實施例中，間隔部分可為具有0至100個選自碳、氧、氮、硫等之原子的視情況經取代之鏈。在一個實施例中，選擇間隔部分以使其為水溶性的。在另一實施例中，間隔部分為聚烷二醇，例如聚乙二醇或聚丙二醇。
術語「PEG化部分」或「PEG部分」包括聚烷二醇化合物或其衍生物，存在或不存在偶合劑或者用偶合或活化部分(例如用硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯、環氧乙烷或用馬來醯亞胺部分，例如PEG-馬來醯亞胺)進行衍生化。其他適當聚烷二醇化合物包括馬來醯亞胺基單甲氧基PEG、活化PEG聚丙二醇，以及以下類型之帶電或中性聚合物：聚葡萄糖、聚唾液酸或其他基於碳水化合物之聚合物、胺基酸聚合物及生物素衍生物。如本文中所使用，術語「效 應部分」(E)可包含具有生物學或其他功能活性之診斷及治療劑(例如蛋白質、核酸、脂質、藥物部分及其片段)。舉例而言，包含與結合多肽結合之效應部分的結合多肽與未結合之多肽相比具有至少一種額外功能或性質。舉例而言，細胞毒性藥物部分(例如，效應部分)與結合多肽(例如，經由其多肽連接子)結合形成具有藥物細胞毒性作為第二功能(亦即，除抗原結合以外)之經修飾多肽。在另一實例中，第二結合多肽與第一結合多肽結合可賦予額外結合性質。在一個態樣中，其中效應部分為基因編碼之治療或診斷蛋白質或核酸，可藉由此項技術中熟知的肽合成或重組DNA方法來合成或表現效應部分。在另一態樣中，其中效應因子為非基因編碼之肽或藥物部分，效應部分可人工合成或自天然來源純化。
如本文中所使用，術語「藥物部分」包括消炎劑、抗癌劑、抗感染劑(例如，抗真菌劑、抗細菌劑、抗寄生物劑、抗病毒劑等)及麻醉治療劑。在另一實施例中，藥物部分為抗癌劑或細胞毒性劑。相容之藥物部分亦可包含前藥。
如本文中所使用，術語「前藥」係指醫藥活性劑之前驅物或衍生物形式，其與母體藥物相比具有較低活性、反應性或副作用傾向性且能夠在活體內酶促活化或以其他方式轉化至更具活性之形式。與本發明相容之前藥包括但不限於可轉化至更具活性之無細胞毒性藥物的含磷酸鹽之前藥、含胺基酸之前藥、含硫代磷酸鹽之前藥、含硫酸鹽之前藥、含肽之前藥、含β-內醯胺之前藥、含視情況經取代之苯氧基乙醯胺的前藥或含視情況經取代之苯乙醯胺的前藥、5-氟胞嘧啶及其他5-氟尿苷前藥。熟習此項技術者可對所要藥物部分或其前藥進行化學修飾，以使該化合物之反應更適宜用於製備本發明之經修飾結合蛋白質的目的。藥物部分亦包括本文中所描述之藥物部分的衍生物、醫藥學上可接受之鹽、酯、醯胺及醚。
「親和樹脂」為能夠以高親和力結合親和結構域從而有助於分離結合至親和結構域之蛋白質與反應混合物之其他組分的化學表面。親和樹脂可塗 覆在固體載體或其部分之表面上。替代地，親和樹脂可包含固體載體。該等固體載體可包括經適當改性之層析管柱、微量滴定板、珠粒或生物晶片(例如玻璃晶圓)。例示性親和樹脂由鎳、幾丁質、澱粉酶及其類似物組成。術語「載體」或「表現載體」在本文中用於意謂根據本發明用作供在細胞中引入並表現所要聚核苷酸用之媒劑的載體。如熟習此項技術者已知，該等載體可容易地選自由質體、噬菌體、病毒及反轉錄病毒組成之群。一般而言，與本發明相容之載體將包含選擇標記物、適當限制位點以有助於選殖所要基因以及進入真核生物或原核生物細胞及/或在其中複製之能力。
一般熟習此項技術者應理解，若編碼本文中所描述之抗體(或其片段或鏈)之聚核苷酸(例如，DNA序列)包含在亦包括調控元件(諸如啟動子、增強子及/或聚A尾)之表現載體內，則該聚核苷酸將在已引入該載體之宿主細胞中表現為蛋白質。因而，此種插入表現載體中之聚核苷酸可稱為「經定位以供表現」於載體中且因而表現於引入該載體之宿主細胞中。然而，聚核苷酸(例如，DNA序列)不需要插入表現載體中以便經定位以供表現於宿主細胞中。眾所周知的用於使聚核苷酸經定位以供表現於細胞中的方法為已知的。舉例而言，可使用例如同源重組將DNA序列插入宿主細胞之基因組中，使得所插入之DNA序列之表現受宿主細胞之內源啟動子及其他調控元件調控。該等同源重組技術為眾所周知的。
出於本發明之目的，可使用眾多表現載體系統。舉例而言，一類載體利用來源於動物病毒，諸如牛乳頭瘤病毒、多形瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒之DNA元件。其他載體涉及使用具有內部核糖體結合位點之多順反子系統。例示性載體包括美國專利第6,159,730號及第6,413,777號以及美國專利申請案第2003 0157641 A1號中所描述之彼等載體。另外，可藉由引入一或多個標記物從而允許選擇經 轉染之宿主細胞來選擇已將DNA整合至其染色體中之細胞。標記物可向營養缺陷型宿主提供原營養、殺生物劑(例如抗生素)抗性或重金屬(諸如銅)抗性。可選擇標記基因可直接連接至欲表現之DNA序列，或藉由共同轉型引入相同細胞中。在一個實施例中，可採用誘導型表現系統。亦可能需要額外元件進行mRNA之最佳合成。此等元件可包括信號序列、剪接信號以及轉錄啟動子、增強子及終止信號。在一個實施例中，可將分泌信號，例如若干充分表徵之細菌前導肽(例如，pelB、phoA或ompA)中之任一種同框融合至本發明多肽之N-末端以獲得該多肽之最佳分泌。(Lei等人，(1988),Nature,331：543；Better等人，(1988)Science,240：1041；Mullinax等人，(1990).PNAS,87：8095)。
術語「宿主細胞」係指已用使用重組DNA技術構築且編碼至少一個異源基因之載體轉型的細胞。在自重組宿主分離蛋白質之方法的描述中，除非另外明確說明，否則術語「細胞」及「細胞培養物」可互換用於表示蛋白質之來源。換言之，自「細胞」回收蛋白質可能意謂自經低速離心之整細胞抑或自含有培養基及懸浮細胞二者之細胞培養物回收。用於蛋白質表現之宿主細胞株具有例如哺乳動物來源。咸信熟習此項技術者能夠優先確定最適於在其中表現所要基因產物之特定宿主細胞株。例示性宿主細胞株包括但不限於DG44及DUXBII(中國倉鼠卵巢細胞株，DHFR-)、HELA(人類子宮頸癌)、CVI(猴腎細胞株)、COS(具有SV40 T抗原之CVI衍生物)、R1610(中國倉鼠纖維母細胞)、BALBC/3T3(小鼠纖維母細胞)、HAK(倉鼠腎臟細胞株)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-IcIBPT(牛內皮細胞株)、RAJI(人類淋巴球)及293(人類腎)。CHO細胞(以及其變異體，包括缺乏DHFR活性之CHO-K1細胞)為適用之宿主細胞。宿主細胞株通常可得自商業服務、美國組織培養物保藏中心或已公開之文獻。本發明之多肽亦可表現於非哺乳動物細胞，諸如細菌或酵母或植物細胞中。就此而言，應瞭解，亦可對各種單細胞非哺乳動物微生物， 諸如細菌進行轉型；亦即，能夠在培養物中生長或醱酵之彼等單細胞非哺乳動物微生物。易於轉型之細菌包括腸桿菌科之成員，諸如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌屬(Salmonella)菌株；芽孢桿菌屬(Bacillaceae)，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌屬(Pneumococcus)；鏈球菌屬(Streptococcus)；及流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)。應進一步瞭解，當表現於細菌中時，多肽通常變成包涵體之一部分。必須分離該多肽，加以純化，隨後組裝成功能分子。
除原核生物以外，亦可使用真核微生物。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通烘焙用酵母為最常用之真核微生物，但通常可利用許多其他菌株，包括巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)。為了表現於酵母中，通常使用例如質體YRp7(Stinchcomb等人，(1979),Nature,282：39；Kingsman等人，(1979),Gene,7：141；Tschemper等人，(1980),Gene,10：157)。此質體已含有TRP1基因，由此為缺乏在色胺酸中生長之能力的酵母突變株，例如ATCC第44076號或PEP4-1提供選擇標記物(Jones,(1977),Genetics,85：12)。作為酵母宿主細胞基因組之特徵的存在trp1病變則為藉由在不存在色胺酸之情況下生長來偵測轉型提供了有效環境。
活體外產生允許按比例放大以產生大量所要經改變之本發明結合多肽。在組織培養條件下進行哺乳動物細胞培養之技術在此項技術中為已知的，且包括均質懸浮液培養，例如在氣升式反應器中或在連續攪拌反應器中，或者固定或包埋型細胞培養，例如在中空纖維中、微膠囊中、瓊脂糖微珠粒上或陶瓷卡匣中。若有必要及/或需要，可藉由習慣層析方法，例如凝膠過濾、離子交換層析、疏水性相互作用層析(HIC)、DEAE-纖維素上層析或親和層析來純化多肽溶液。
如本文中所使用，片語「將受益於投與結合多肽之個體」包括將受益於投與結合多肽以用於例如偵測本發明之結合多肽所識別並特異性地結合之 抗原(例如，用於診斷程序)及/或受益於用結合多肽進行處理以減少或消除該結合多肽所識別並特異性地結合之標靶的個體，諸如哺乳動物個體。舉例而言，在一個實施例中，個體可受益於自循環或血清中減少或消除可溶性或顆粒狀分子(例如毒素或病原體)或受益於減少或消除表現標靶之細胞群體(例如，腫瘤細胞)。如以上所論述，結合多肽可呈未結合形式使用，或者可結合至例如藥物、前藥或同位素，以形成經修飾之結合多肽以供投與該個體。
術語「聚乙二醇化」、「聚乙二醇」或「PEG」包括聚烷二醇化合物或其衍生物，存在或不存在偶合劑或者用偶合或活化部分(例如用硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯、環氧乙烷或用馬來醯亞胺部分，例如PEG-馬來醯亞胺)進行衍生化。其他適當聚烷二醇化合物包括但不限於馬來醯亞胺基單甲氧基PEG、活化PEG聚丙二醇，以及以下類型之帶電或中性聚合物：聚葡萄糖、聚唾液酸或其他基於碳水化合物之聚合物、胺基酸聚合物及生物素衍生物。
I.可變區
本發明提供α4結合抗體及其片段，其中可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)構架具有由生殖系或生殖系工程化抗體序列，諸如IGKV4-1或geAAH70335.1或IGHV1-f構築之受體序列。CDR序列來源於非人類抗α4結合抗體，諸如抗VLA-4抗體HP1/2。參見PCT公開案第WO2011/130603號，該案係以引用之方式整體併入本文中。本文中所描述之抗體可具有至少1.5、2.0、2.5、3.0倍之親和力增加，例如相對於其鼠類親本。在一個實施例中，該親和力增加為至少1.5、2.0、2.5、3.0倍，但分別低於25、20或15倍。
鼠類單株抗體(mAb)HP1/2為α4 mAb之B1亞類之成員，且抑制活體外細胞黏附至VCAM1及纖維連接蛋白，效力為約0.1nM。HP1/2 Fab之cryo-EM結構解出為與α4β1細胞外域之複合物。HP1/2結合至配位體結合溝外之α4β螺槳結構域且非競爭性地拮抗配位體結合。由HP1/2識別並特異性地結 合之α4整合素之抗原決定基及構形與在那他珠單抗α4整合素晶體結構中觀測到之抗原決定基及構形相似。
針對α4整合素之mAb為淋巴球、嗜酸性球及單核球滲出至組織中之有效阻斷劑且在活體內顯示疾病緩解作用。特定言之，已證明mAb HP1/2在綿羊過敏性過度反應性(Lobb等人，Ann.N.Y.Acad.Sci 796：113-123,1996)、豚鼠支氣管氣道過度反應性(Pretolani等人，J.Ex.Med.180(3)：795-805,1994；Kraneveld等人，J.Allergy Clin.Immunol.100(2)：242-50,1997)、靈長類動物潰瘍性結腸炎(Podolsky等人，J.Clin Invest.92(1)：372-380,1993)、NHP動脈內切除後膜頸動脈內膜增生(Lumsden等人，J.Vasc.Surg.26(1)：87-93,1997)之動物模型中有效，減少氣球損傷後之新外膜形成及後續管腔狹窄(Labinaz等人，Can J.Cardiol.16(2)：187-96,2000)、兔對支架植入之炎症性反應(Ma等人，2004)，且預防兔心臟移植物排斥反應(Sadahiro等人，Am.J.Pathol.142(3)：675-683,1993)。另外，HP1/2刺激來自狒狒骨髓基質之造血祖細胞之外周化(Papayannopoulou及Nakamoto,Proc.Natl.Acad.Sci 90(20)：9374-9378,1993)。
在注射JM(不成熟T細胞白血病)細胞株之Balb/c小鼠中產生HP1/2抗體(Sanchez-Madrid等人，Eur.J.Immunol.16：1343-1349,1986)。將來自兩隻小鼠之脾細胞與SP2或P3-X63Ag8.653小鼠骨髓瘤細胞融合。該抗體於1993年人類化，但隨後於2010年重新人類化以利用人類化設計進步之優勢。
α4結合抗體或其片段可包含具有SEQ ID NO：8、9、10或11之序列的可變輕鏈。α4結合抗體或其片段可包含SEQ ID NO：3、4或5之可變重鏈。
在某些實施例中，該α4結合抗體包含具有SEQ ID NO：11之序列的可變輕鏈及具有SEQ ID NO：4之可變重鏈。
該α4結合抗體可進一步包含如本文中更詳細論述之變異Fc區。
II.親本Fc多肽
變異Fc多肽可來源於此項技術中已知的親本或起始Fc多肽。在一個實施例中，親本Fc多肽為抗體，諸如IgG免疫球蛋白，其包括IgG之所有亞型及其組合。在一些實施例中，IgG抗體之親本Fc多肽屬於IgG亞型，或者兩種或更多種IgG亞型之Fc區之不同部分的組合。在人類中，IgG亞型包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。親本Fc多肽包含來源於免疫球蛋白之Fc區，但可視情況進一步包含可操作地連接或融合至Fc區之結合位點。在一些實施例中，前述多肽結合至諸如配位體、細胞介素、受體、細胞表面抗原或癌細胞抗原之抗原。儘管本文中之實例採用IgG抗體，但應理解該方法可同樣應用於任何Fc多肽內之Fc區。當Fc多肽為抗體時，該抗體可為合成的、天然來源的(例如，來自血清)、由細胞株(例如，雜交瘤)產生或在轉殖基因生物中產生。
在某些實施例中，本發明之Fc多肽包含Fc區之單一Fc部分。在其他實施例中，Fc多肽為dcFc多肽。dcFc多肽係指包含二聚Fc(或dcFc)區之多肽。在其他實施例中，本發明之Fc多肽為scFc多肽。如本文中所使用，術語scFc多肽係指包含單鏈Fc(scFc)區之多肽，例如，包含例如經由插入在至少兩個Fc部分之間的可撓性多肽連接子而基因融合之至少兩個Fc部分的scFc多肽。例示性scFc區揭示於2008年5月14日申請之PCT申請案第PCT/US2008/006260號中，該案係以引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，本發明之多肽可包含含有具有相同或實質上相同的序列組成之Fc部分的Fc區(本文中稱為「同價同作用Fc區」)。在其他實施例中，本發明之多肽可包含含有至少兩個具有不同的序列組成之Fc部分的Fc區(亦即，本文中稱為「異價同作用Fc區」)。在某些實施例中，本發明之結合多肽包含含有至少一個插入或胺基酸取代之Fc區。在一個例示性實施例中，異價同作用Fc區在第一Fc部分中而非在第二Fc部分中包含胺基酸取代。
在一個實施例中，本發明之結合多肽可包含有兩個或更多個組成Fc 部分獨立地選自本文中所描述之Fc部分的Fc區。在一個實施例中，Fc部分為相同的。在另一實施例中，至少兩個Fc部分為不同的。舉例而言，本發明之Fc多肽之Fc部分包含相同數目之胺基酸殘基，或其長度可相差一或多個胺基酸殘基(例如，約5個胺基酸殘基(例如1、2、3、4或5個胺基酸殘基)、約10個殘基、約15個殘基、約20個殘基、約30個殘基、約40個殘基或約50個殘基)。在其他實施例中，Fc部分可在一或多個胺基酸位置處在序列方面不同。舉例而言，至少兩個Fc部分可在約5個胺基酸位置(例如，1、2、3、4或5個胺基酸位置)、約10個位置、約15個位置、約20個位置、約30個位置、約40個位置或約50個位置)上不同。
親本Fc多肽可組裝在一起與其他多肽一起形成多聚Fc多肽或蛋白質(本文中亦稱為「多聚體」)。本發明之多聚Fc多肽或蛋白質包含至少一個本發明之親本Fc多肽。因此，親本多肽包括但不限於單體以及多聚體(例如二聚體、三聚體、四聚體及六聚體)Fc多肽或蛋白質及其類似物。在某些實施例中，該等多聚體之組成Fc多肽為相同的(亦即，同價同作用多聚體，例如同二聚體、同三聚體、同四聚體)。在其他實施例中，本發明之多聚蛋白質之至少兩個組成Fc多肽為不同的(亦即異價同作用多聚體，例如異二聚體、異三聚體、異四聚體)。在某些實施例中，至少兩個Fc多肽能夠形成二聚體。
在另一實施例中，本發明之Fc多肽包含二聚Fc區(形成二聚體之單鏈多肽抑或形成二聚體之雙鏈多肽)且就該分子中所存在之生物活性部分而言為單體。舉例而言，此種Fc構築體可包含僅一個生物活性部分。一或兩個鏈穩定Fc單體構築體為理想的，例如，當不需要靶分子交聯時(例如，在某些抗體，例如抗CD40抗體之情況下)。在另一實施例中，此種Fc構築體可包含兩個不同的生物活性部分。在另一實施例中，此種Fc構築體可包含兩個相同的生物活性部分。在另一實施例中，此種Fc構築體可包含超過兩個相同的生物活性部分。
A.Fc部分
適用於產生本發明之親本Fc多肽的Fc部分可獲自許多不同的來源。在一些實施例中，結合多肽之Fc部分來源於人類免疫球蛋白。然而，應理解，Fc部分可來源於另一哺乳動物物種，包括例如囓齒動物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人類靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種之免疫球蛋白。此外，Fc可來源於任何免疫球蛋白類別，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，以及任何免疫球蛋白同型，包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。舉例而言，Fc可來自於IgG1，但在序列中具有特定突變。在一些實施例中，使用人類同型IgG1或IgG4。在一些實施例中，Fc可為含有取自一種Ig免疫球蛋白類型之部分(例如來自IgG1之CH3結構域)及來自另一Ig免疫球蛋白類型之其他部分(例如來自IgG4之CH1結構域)的嵌合體。
多種Fc部分基因序列(例如人類恆定區基因序列)可呈公開可存取寄存物之形式獲得。包含Fc部分序列之恆定區結構域可選擇為具有特定效應功能(或缺乏特定效應功能)或具有特定修飾以降低免疫原性。已公開許多抗體及抗體編碼基因序列，且可使用本領域認可之技術由適合之Fc部分序列(例如鉸鏈、CH2及/或CH3序列或其部分)獲得此等序列。隨後可改變或合成使用上述方法中之任一種獲得的基因物質以獲得本發明之Fc多肽。應進一步瞭解，本發明之範疇涵蓋恆定區DNA序列之等位基因、變異體及突變。
可例如使用聚合酶鏈式反應及選擇用於擴增相關結構域之引子來選殖Fc部分序列。為了自抗體選殖Fc部分序列，可自雜交瘤、脾臟或淋巴細胞分離mRNA，反轉錄成DNA，且藉由PCR擴增抗體基因。PCR擴增方法詳細描述於以下方法中：美國專利第4,683,195號；第4,683,202號；第4,800,159號；第4,965,188號；及例如「PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications」Innis等人編，Academic Press,San Diego,CA(1990)；Ho等人，1989.Gene 77：51；Horton 等人，1993.Methods Enzymol.217：270)。可藉由一致恆定區引子或藉由基於公開重鏈及輕鏈DNA及胺基酸序列之更具特異性引子來引發PCR。如以上所論述，PCR亦可用於分離編碼抗體輕鏈及重鏈之DNA純系。在此情況下，可藉由一致引子或較大同源探針(諸如小鼠恆定區探針)對庫進行篩檢。許多適用於擴增抗體基因之引子集在此項技術中為已知的(例如，基於經純化抗體之N末端序列之5'引子(Benhar及Pastan.1994.Protein Engineering7：1509)；cDNA末端之快速擴增(Ruberti,F.等人，1994.J.Immunol.Methods 173：33)；抗體前導序列(Larrick等人，1989 Biochem.Biophys.Res.Commun.160：1250)。抗體序列之選殖進一步描述於Newman等人於1995年1月25日申請之美國專利第5,658,570號中，該專利係以引用之方式併入本文中。
本發明之親本Fc多肽可包含單一Fc部分或多個Fc部分。當存在兩個或更多個Fc部分(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個Fc部分)時，至少兩個Fc部分締合以形成適當摺疊之Fc區(例如，二聚Fc區或單鏈Fc區(scFc))。在一個實施例中，Fc部分可屬於不同的類型。在一個實施例中，親本Fc多肽中所存在之至少一個Fc部分包含鉸鏈結構域或其部分。在另一實施例中，親本Fc多肽包含至少一個Fc部分，該Fc部分包含至少一個CH2結構域或其部分。在另一實施例中，親本Fc多肽包含至少一個Fc部分，該Fc部分包含至少一個CH3結構域或其部分。在另一實施例中，親本Fc多肽包含至少一個Fc部分，該Fc部分包含至少一個CH4結構域或其部分。在另一實施例中，親本Fc多肽包含至少一個Fc部分，該Fc部分包含至少一個鉸鏈結構域或其部分及至少一個CH2結構域或其部分(例如，呈鉸鏈-CH2取向)。在另一實施例中，親本Fc多肽包含至少一個Fc部分，該Fc部分包含至少一個CH2結構域或其部分及至少一個CH3結構域或其部分(例如，呈CH2-CH3取向)。在另一實施例中，親本Fc多肽包含至少一個Fc部分，該Fc部分包含至少一個鉸鏈結構域或其部 分、至少一個CH2結構域或其部分及至少一個CH3結構域或其部分，例如呈鉸鏈-CH2-CH3、鉸鏈-CH3-CH2或CH2-CH3-鉸鏈取向。
在某些實施例中，親本Fc多肽包含至少一個來源於一或多個免疫球蛋白重鏈之完整Fc區(例如，包括鉸鏈、CH2及CH3結構域之Fc部分，但此等結構域不必來源於相同抗體)。在其他實施例中，親本Fc多肽包含至少兩個來源於一或多個免疫球蛋白重鏈之完整Fc區。在一些實施例中，完整Fc部分來源於人類IgG免疫球蛋白重鏈(例如人類IgG1或人類IgG4)。
在另一實施例中，親本Fc多肽包含至少一個Fc部分，該Fc部分包含完整CH3結構域(根據EU編號，抗體Fc區之約胺基酸341-438)。在另一實施例中，親本Fc多肽包含至少一個Fc部分，該Fc部分包含完整CH2結構域(根據EU編號，抗體Fc區之約胺基酸231-340)。在另一實施例中，親本Fc多肽包含至少一個Fc部分，該Fc部分至少包含CH3結構域以及鉸鏈區(根據EU編號，抗體Fc區之約胺基酸216-230)及CH2結構域中之至少一個。在一個實施例中，親本Fc多肽包含至少一個Fc部分，該Fc部分包含鉸鏈及CH3結構域。在另一實施例中，親本Fc多肽包含至少一個Fc部分，該Fc部分包含鉸鏈、CH2及CH3結構域。在一些實施例中，Fc部分來源於人類IgG免疫球蛋白重鏈。
組成Fc部分之恆定區結構域或其部分可來源於不同的免疫球蛋白分子。舉例而言，親本Fc多肽可包含來源於IgG4分子之鉸鏈及/或CH2結構域或其部分以及來源於IgG1分子之CH3區或其部分。在另一實施例中，親本Fc多肽可包含嵌合鉸鏈結構域。舉例而言，嵌合鉸鏈可包含部分來源於IgG1分子且部分來源於IgG3分子之鉸鏈結構域。在另一實施例中，嵌合鉸鏈包含來自IgG1分子之中鉸鏈結構域以及來自IgG4分子之上及下鉸鏈結構域。
如本文中所闡述，熟習此項技術者應理解，親本Fc部分可與天然存在之免疫球蛋白之相應Fc部分一致，或者可經改變以使其胺基酸序列發生變 化。在某些實施例中，例如藉由胺基酸突變(例如，添加、缺失或取代)來改變親本Fc多肽。舉例而言，親本Fc多肽可為與Fc部分所來源之野生型Fc相比具有至少一個胺基酸取代的Fc部分。舉例而言，其中Fc部分來源於人類IgG1抗體，與人類IgG1 Fc區之相應位置之野生型胺基酸相比，變異體包含至少一個胺基酸突變(例如，取代)。
胺基酸取代可位於Fc部分內稱為「對應」於抗體Fc區中將給與該殘基之位置編號的位置上(如使用EU編號準規所闡述)。熟習此項技術者可容易地產生比對以確定將「對應」於Fc部分中之位置的EU編號。
在一個實施例中，取代處在位於鉸鏈結構域或其部分中之胺基酸位置上。在另一實施例中，取代處在位於CH2結構域或其部分中之胺基酸位置上。在另一實施例中，取代處在位於CH3結構域或其部分中之胺基酸位置上。在另一實施例中，取代處在位於CH4結構域或其部分中之胺基酸位置上。
在某些實施例中，親本Fc多肽包含多於一個胺基酸取代。親本Fc多肽相對於野生型Fc區可包含例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸取代經空間定位而彼此相距至少1個或更多個胺基酸位置，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個胺基酸位置之間隔。在一些實施例中，工程化胺基酸經空間定位而彼此相隔至少5、10、15、20或25個或更多個胺基酸位置之間隔。
在某些實施例中，該取代改變包含野生型Fc部分之Fc區所賦予的至少一種效應功能(例如，降低Fc區結合至Fc受體(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或補體蛋白(例如C1q)或者觸發抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、吞噬作用或補體依賴性細胞毒性(CDC)之能力)。
親本Fc多肽可採用業內認可之已知可改變效應功能之取代。特定言之，本發明之親本Fc多肽可包括例如以下文獻中所揭示之一或多個胺基酸位置 上之變化(例如取代)：國際PCT公開案WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2及WO06/085967A2；美國專利公開案第US2007/0231329號、第US2007/0231329號、第US2007/0237765號、第US2007/0237766號、第US2007/0237767號、第US2007/0243188號、第US20070248603號、第US20070286859號、第US20080057056號；或美國專利5,648,260、5,739,277、5,834,250、5,869,046、6,096,871、6,121,022、6,194,551、6,242,195、6,277,375、6,528,624、6,538,124、6,737,056、6,821,505、6,998,253、7,083,784及7,317,091，各文獻中關於Fc突變之部分係以引用之方式併入本文中。在一個實施例中，可在一或多個所揭示之胺基酸位置上進行特定變化(例如，此項技術中所揭示之一或多個胺基酸之特定取代)。在另一實施例中，可在一或多個所揭示之胺基酸位置上進行不同的變化(例如，此項技術中所揭示之一或多個胺基酸位置之不同取代)。
在一些實施例中，親本Fc多肽可包含在對應於Fc部分之「15埃接觸區」內之EU胺基酸位置的胺基酸位置上包含胺基酸取代的Fc部分。15埃區包括位於全長野生型Fc部分之EU位置243至261、275至280、282至293、302至319、336至348、367、369、372至389、391、393、408及424至440上之殘基。
在另一實施例中，親本Fc多肽包含Fc區，該Fc區包含一或多個仍足以賦予Fc區以一或多種功能之截短Fc部分。舉例而言，Fc部分中結合至FcRn 之部分(亦即，FcRn結合部分)包含約胺基酸282-438，EU編號。因而，親本Fc多肽之Fc部分可包含FcRn結合部分或由其組成。FcRn結合部分可來源於任何同型，包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之重鏈。在一個實施例中，使用來自人類同型IgG1之抗體的FcRn結合部分。在另一實施例中，使用來自人類同型IgG4之抗體的FcRn結合部分。在某些實施例中，FcRn結合部分經無糖基化。在其他實施例中，FcRn結合部分經糖基化。
在某些實施例中，親本Fc多肽包含對Fc部分之胺基酸取代，由此改變抗體之非抗原依賴性效應功能，尤其是抗體之循環半衰期。該等多肽當與缺乏此等取代之多肽相比時展現增加或減少之FcRn結合，且因此具有分別增加或減少之血清半衰期。預期具有提高之FcRn親和力之親本Fc多肽具有較長血清半衰期，且該等分子在需要所投與之多肽具有長半衰期，例如以治療慢性疾病或病症的情況下適用於治療哺乳動物之方法中。相反，預期具有降低之FcRn結合親和力的親本Fc多肽具有較短半衰期，且該等分子亦可用於例如在縮短循環時間可能有利(例如，對於活體內診斷成像)之情況下或在起始多肽長期存在於循環中時具有毒性副作用之情形下投與哺乳動物。具有降低之FcRn結合親和力之親本Fc多肽亦不太可能越過胎盤，且因而亦適用於治療孕婦之疾病或病症。另外，可能需要降低FcRn結合親和力之其他應用包括需要定位腦、腎臟及/或肝臟之彼等應用。在一個例示性實施例中，親本Fc多肽展現自血管越過腎小球上皮細胞之轉運減少。在另一實施例中，本發明之結合多肽展現越過血腦屏障(BBB)自腦進入血管空間之轉運減少。在一個實施例中，具有改變之FcRn結合的親本Fc多肽包含至少一個Fc部分(例如，一或兩個Fc部分)，該至少一個Fc部分在Fc部分之「FcRn結合環」內具有一或多個胺基酸取代。FcRn結合環包含野生型全長Fc部分之胺基酸殘基280-299(根據EU編號)。在其他實施例中，具有改變之FcRn結合親和力的親本Fc多肽包含至少一個Fc部分(例如，一或兩 個Fc部分)，該至少一個Fc部分在15 A FcRn「接觸區」內具有一或多個胺基酸取代。
如本文中所使用，術語15 A FcRn「接觸區」包括野生型全長Fc部分之以下位置之殘基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424、425-440(EU編號)。在一些實施例中，具有改變之FcRn結合親和力的親本Fc多肽包含至少一個Fc部分(例如，一或兩個Fc部分)，該至少一個Fc部分在對應於以下任一EU位置之胺基酸位置上具有一或多個胺基酸取代：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如，N434A或N434K)及438。改變FcRn結合活性之例示性胺基酸取代揭示於國際PCT公開案第WO05/047327號中，該案係以引用之方式併入本文中。在其他實施例中，親本Fc多肽包含至少一個Fc部分，該至少一個Fc部分具有位於溶劑暴露表面上之工程化半胱胺酸殘基或其類似物。在一些實施例中，工程化半胱胺酸殘基或其類似物不干擾由Fc區賦予之效應功能。在一些實施例中，Fc多肽包含Fc部分，該Fc部分包含至少一個實質上不含與第二半胱胺酸殘基之二硫鍵結的工程化游離半胱胺酸殘基或其類似物。在一些實施例中，Fc多肽可包含Fc部分，該Fc部分在一或多個以下CH3結構域位置上具有工程化半胱胺酸殘基或其類似物：349-371、390、392、394-423、441-446及446b(EU編號)。在更多一些實施例中，Fc多肽包含在以下任一位置上具有工程化半胱胺酸殘基或其類似物之Fc變異體：350、355、359、360、361、389、413、415、418、422、441、443及EU第446b位(EU編號)。隨後可使用業內認可之技術(例如，與硫醇反應性異雙官能連接子結合)使以上任一工程化半胱胺酸殘基或其類似物結合至功能部分。
B.無效應因子Fc多肽
在某些實施例中，親本Fc多肽為具有改變或降低之效應功能的「無 效應因子」Fc多肽。在一些實施例中，減少或改變之效應功能為抗原依賴性效應功能。舉例而言，親本Fc多肽可包含例如使多肽之抗原依賴性效應功能，尤其是ADCC或補體活化與野生型Fc多肽相比有所降低的序列變異(例如，胺基酸取代)。令人遺憾的是，該等親本Fc多肽通常具有降低之穩定性，使其成為根據本發明方法進行穩定之理想候選物。
預期具有降低之FcγR結合親和力的Fc多肽降低效應功能，且該等分子亦適用於例如治療不需要靶細胞破壞之病症，例如，在正常細胞可能表現靶分子之情況下，或在長期投與多肽可能引起不需要之免疫系統活化的情況下。在一個實施例中，Fc多肽展現選自由調理作用、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或效應細胞調節組成之群的至少一種抗原依賴性效應功能與包含野生型Fc區之Fc多肽相比有所降低。在一個實施例中，Fc多肽展現與活化FcγR(例如FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)之結合有所改變。在另一實施例中，Fc多肽展現對抑制性FcγR(例如FcγRIIb)之結合親和力有所改變。在其他實施例中，具有降低之FcγR結合親和力(例如降低之FcγRI、FcγRII或FcγRIIIa結合親和力)的Fc多肽包含至少一個Fc部分(例如，一或兩個Fc部分)，該至少一個Fc部分在對應於以下一或多個位置之胺基酸位置上具有胺基酸取代：234、236、239、241、251、252、261、265、268、293、294、296、298、299、301、326、328、332、334、338、376、378及435(EU編號)。在其他實施例中，具有降低之補體結合親和力(例如降低之C1q結合親和力)的Fc多肽包含Fc部分(例如，一或兩個Fc部分)，該Fc部分在對應於以下一或多個位置之胺基酸位置上具有胺基酸取代：239、294、296、301、328、333及376(EU編號)。
改變FcγR或補體結合活性之例示性胺基酸取代揭示於國際PCT公開案第WO05/063815號中，該案係以引用之方式併入本文中。在某些實施例中，本發明之結合多肽可包含一或多個以下特定取代：S239D、S239E、M252T、 H268D、H268E、I332D、I332E、N434A及N434K(亦即，在對應於抗體Fc區中之一或多個此等EU編號位置之胺基酸位置上的一或多個此等取代)。
在某些例示性實施例中，親本「無效應因子」多肽之效應功能可能由於親本Fc多肽內之無糖基化Fc區而改變或降低。在某些實施例中，無糖基化Fc區由改變Fc區之糖基化的胺基酸取代產生。舉例而言，可改變Fc區內EU位置297處之天冬醯胺(例如藉由取代、插入、缺失或藉由化學修飾)以抑制其糖基化。在另一例示性實施例中，EU第299位之胺基酸殘基(例如，蘇胺酸(T))經(例如，經丙胺酸(A))取代以降低相鄰殘基297處之糖基化。減少或改變糖基化之例示性胺基酸取代揭示於國際PCT公開案第WO05/018572號及美國專利公開案第2007/0111281號中，諸案係以引用之方式併入本文中。在其他實施例中，藉由酶促或化學移除寡糖或在不能使Fc區糖基化之宿主細胞(例如，具有受損糖基化機制之細菌宿主細胞或哺乳動物宿主細胞)中表現Fc多肽來產生無糖基化Fc區。
在某些實施例中，無糖基化Fc區為部分無糖基化或半糖基化。舉例而言，Fc區可包含第一糖基化Fc部分(例如，糖基化CH2區)及第二無糖基化Fc部分(例如，無糖基化CH2區)。在其他實施例中，Fc區可完全無糖基化，亦即，其Fc部分中無一糖基化。
「無效應因子」多肽之無糖基化Fc區可屬於任何IgG同型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一個例示性實施例中，親本Fc多肽可包含IgG4抗體，諸如「agly IgG4.P」之無糖基化Fc區。agly IgG4.P為IgG4抗體之工程化形式，其包括處於鉸鏈區中之脯胺酸取代(Ser228Pro)及處於CH2結構域中之Thr299Ala突變以產生無糖基化Fc區(EU編號)。已證明agly IgG4.P在活體外不具有可量測之免疫效應功能。在另一例示性實施例中，親本Fc多肽包含IgG1抗體，諸如「agly IgG1」之無糖基化Fc區。agly IgG1為IgG免疫球蛋白IgG1 之無糖基化形式，其具有賦予低效應功能概況之Thr299Ala突變(EU編號)。agly IgG4.P及agly IgG1抗體二者皆代表一類重要治療試劑，其中不需要免疫效應功能。
在某些例示性實施例中，「無效應因子」親本Fc多肽包含來源於IgG4抗體之Fc區。IgG4 Fc區可與野生型Fc區一致，或其相對於對野生型IgG4序列可能具有一或多個修飾。該等IgG4樣Fc多肽由於IgG4抗體結合至補體及/或Fc受體之能力固有地降低而具有降低之效應功能。IgG4同型之親本Fc多肽可糖基化或無糖基化。此外，IgG4樣Fc多肽之Fc區可包含IgG4抗體之完整Fc部分，或其可包含嵌合Fc部分，其中Fc部分之一部分來自於IgG4抗體且其餘部分來自於另一同型之抗體。在一個例示性實施例中，嵌合Fc部分包含來自IgG1抗體之CH3結構域及來自IgG4抗體之CH2結構域。在另一實施例中，IgG4抗體包含嵌合鉸鏈，其中上鉸鏈結構域及下鉸鏈結構域來自IgG4抗體，但由於鉸鏈區中之脯胺酸取代(Ser228Pro)，中鉸鏈結構域來自IgG1抗體。在另一實施例中，親本嵌合IgG4抗體包含嵌合鉸鏈，其中上鉸鏈結構域及下鉸鏈結構域來自IgG4抗體，但由於鉸鏈區中之脯胺酸取代(Ser228Pro)，中鉸鏈結構域來自IgG1抗體，CH1結構域來自IgG1或IgG4抗體，CH2結構域(或EU編號第292-340位)來自IgG4抗體，且CH1及/或CH3結構域來自IgG1抗體。
在某些實施例中，「無效應因子」Fc多肽之效應功能降低為與Fc受體(FcR)，諸如FcγRI、FcγRII、FcγRIII及/或FcγRIIIb受體或補體蛋白(例如，補體蛋白C1q)之結合降低。此結合變化可達約1倍或更多倍，例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、50或100倍或更多倍，或其任何間隔或範圍。效應功能(例如Fc與Fc受體或補體蛋白之結合)之此等降低容易基於例如使用本文中所描述之分析法或此項技術中已知的分析法測定的結合活性的降低百分比來計算。
在本發明之一個實施例中，穩定Fc多肽包含單鏈Fc區。該等單鏈Fc區為此項技術中已知的(參見例如WO200801243、WO2008131242、WO2008153954)，且可使用已知的方法製造。如本文中所教示之穩定胺基酸可使用熟習此項技術者已知的方法併入該等構築體之一或多個Fc部分中。該等單鏈Fc區或基因融合Fc區為包含基因連接於單一多肽鏈內(亦即，編碼於單一連續基因序列中)之Fc結構域(或Fc部分)的合成Fc區。因此，基因融合Fc區(亦即，scFc區)為單體，因為其包含一個多肽鏈，但該分子之適當部分二聚化而形成n Fc區。應理解，本文中關於Fc部分之教示適用於雙鏈Fc二聚體及單鏈Fc二聚體。舉例而言，任一類型之Fc區構築體均可來源於例如IgG1或IgG4抗體，或可為嵌合的(例如，包含嵌合鉸鏈及/或包含來自IgG4抗體之CH2結構域及來自IgG1抗體之CH3結構域)。
III.具有穩定Fc區之變異Fc多肽
在某些態樣中，本發明提供包含作為上文所描述之任一親本Fc多肽之變異體的胺基酸序列的變異Fc多肽。特定言之，本發明之變異Fc多肽包含具有來源於親本Fc多肽之Fc區(或Fc部分)的胺基酸序列的Fc區(或Fc部分)。在一些實施例中，變異Fc多肽與親本Fc多肽的不同之處在於存在至少一個本文中所描述之穩定Fc突變。在某些實施例中，Fc變異體可包含其他胺基酸序列變化。在一些實施例中，Fc變異體與親本Fc多肽相比將具有增強之穩定性，且與親本Fc多肽相比視情況具有改變之效應功能。舉例而言，變異Fc多肽可具有與親本Fc多肽之抗原依賴性效應功能(例如，ADCC及/或CDC)等效或更低之抗原依賴性效應功能。另外地或替代地，變異Fc多肽相對於親本Fc多肽可具有非抗原依賴性效應功能(例如，延長之半衰期)。
在某些實施例中，變異Fc多肽包含與親本Fc多肽之Fc區(Fc部分)基本上一致但相對於起始或親本多肽存在約一或多個突變(例如，約1至約20、 約1至約15、約1至約10、約1至約5、約1至約4、約1至約3、約2至約20、約2至約15、約2至約10、約5至約20、或約5至約10)個突變，例如一或多個胺基酸殘基已經另一胺基酸殘基取代或具有一或多個胺基酸殘基插入或缺失的Fc區(或Fc部分)。在某些實施例中，變異Fc多肽相對於起始多肽具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個突變。在一些實施例中，變異多肽包含非天然存在之胺基酸序列。
該等變異體必需與起始多肽具有低於100%序列一致性或相似性。在一些實施例中，變異體將具有例如在變異體分子或其部分(例如，Fc區或Fc部分)之整個長度上與起始多肽之胺基酸序列具有約75%至低於100%胺基酸序列一致性或相似性，例如約80%至低於100%、或約85%至低於100%、或約90%至低於100%(例如，91-99%、92-99%、93-99%、94-99%、95-99%、96-99%、97-99%、98-99%或99%)或約95%至低於100%的胺基酸序列。在一個實施例中，起始多肽序列(例如，親本Fc多肽之Fc區)與來源於其之序列(例如，變異Fc多肽之Fc區)之間存在一個胺基酸差異。
在某些實施例中，本發明之變異Fc多肽為穩定Fc多肽。亦即，穩定多肽包含至少一個作為穩定Fc突變之序列變異或突變。如本文中所使用，術語「穩定Fc突變」包括變異Fc多肽之Fc區內的突變，其與其所來源之親本Fc多肽相比賦予變異Fc多肽以增強之蛋白質穩定性(例如熱穩定性)。在一些實施例中，穩定突變包含用賦予Fc區以增強之蛋白質穩定性的置換胺基酸(本文中之「穩定胺基酸」)取代Fc區中之去穩定胺基酸。在一個實施例中，本發明之穩定Fc多肽包含一或多個胺基酸穩定Fc突變(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個穩定突變)。穩定Fc突變可引入例如Fc區之CH2結構域、CH3結構域或CH2結構域及CH3結構域二者中。
在某些例示性實施例中，本發明之變異Fc多肽為上文所描述之「無 效應因子」親本Fc多肽之穩定變異體。亦即，穩定變異體相對於「無效應因子親本Fc多肽」具有增強之穩定性。在一個例示性實施例中，變異Fc多肽為親本Fc多肽之穩定變異體，其包含IgG1抗體之無糖基化Fc區，例如包含T299A突變(EU編號)之無糖基化IgG1 Fc區。在另一例示性實施例中，變異Fc多肽為親本Fc多肽之穩定變異體，其包含糖基化或無糖基化IgG4抗體之Fc區。舉例而言，變異Fc多肽可包含處於來源於「agly IgG4.P」抗體之Fc區中的穩定突變。
在一些實施例中，本發明之穩定Fc多肽與變異Fc多肽相比在相同量測條件下展現增強之穩定性。然而，應瞭解，Fc變異多肽之穩定性相對於其親本Fc多肽之增強程度在所選擇之量測條件下可能變化。舉例而言，可在特定pH值，例如酸性、中性或鹼性pH值下觀測穩定性之增強。在一個實施例中，在低於約6.0(例如，約6.0、約5.5、約5.0、約4.5或約4.0)之酸性pH值下觀測到穩定性增強。在另一實施例中，在約6.0至約8.0(例如，約6.0、約6.5、約7.0、約7.5、約8.0)之中性pH值下觀測到穩定性增強。在另一實施例中，在約8.0至約10.0(例如，約8.0、約8.5、約9.0、約9.5、約10.0)之鹼性pH值下觀測到穩定性增強。
可例如使用以下所描述之任何方法來評估變異Fc多肽之熱穩定性增強。在某些實施例中，穩定Fc多肽具有熱穩定性(例如，熔融溫度或Tm)比其所來源之親本多肽高出約0.1、約0.25、約0.5、約0.75、約1、約1.25、約1.5、約1.75、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約25、約30、約40或約50攝氏度的Fc區(或Fc部分)。在某些實施例中，本發明之穩定Fc多肽變異體表現為單體可溶性蛋白質，其中二聚、四聚或其他聚集形式不超過25%(例如，少於約25%、約20%、約15%、約10%或約5%)。
在另一實施例中，穩定Fc多肽在熱攻擊分析中具有高於40℃(例如 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49℃或更高)之T50(參見美國專利申請案第11/725,970號，該案係以引用之方式併入本文以及以下實例4中)。在一些實施例中，本發明之穩定Fc分子具有高於50℃(例如，50、51、52、53、54、55、56、57、58℃或更高)之T50。在一些實施例中，本發明之穩定Fc分子具有高於60℃(例如，60、61、62、63、64、65℃或更高)之T50。在其他實施例中，本發明之穩定Fc分子具有高於65℃(例如，65、66、67、68、69、70℃或更高)之T50。在其他實施例中，本發明之穩定Fc分子具有高於70℃(例如，70、71、73、74、75℃或更高)之T50。
在某些實施例中，本發明之穩定Fc分子具有Tm值高於約60℃(例如，約61、62、63、64、65℃或更高)、高於65℃(例如，65、66、67、68、69℃或更高)或高於約70℃(例如，71、72、73、74、75℃或更高)之CH2結構域。在其他實施例中，本發明之穩定Fc分子具有Tm值高於約70℃(例如，約71、72、73、74、75℃或更高)、高於約75℃(例如，76、77、78、79、80℃或更高)或高於80℃(例如，81、82、83、84、85℃或更高)之CH3結構域。在特定實施例中，該穩定Fc多肽為親本Fc多肽之變異體，其包含IgG4抗體之無糖基化或糖基化Fc區(例如，agly IgG4.P)。在其他實施例中，該穩定Fc多肽為親本Fc多肽之變異體，其包含IgG1抗體之無糖基化Fc區(例如，agly IgG1)。在其他實施例中，本發明之穩定Fc分子具有Fc區或Fc部分(例如，CH2及/或CH3結構域)，其熱穩定性實質上等於或大於糖基化IgG1抗體之熱穩定性。
在某些實施例中，本發明之變異Fc多肽與其所來源之親本Fc多肽相比引起聚集減少。在一個實施例中，藉由本發明之方法產生之穩定Fc分子相對於親本Fc分子在聚集方面減少至少1%。在其他實施例中，穩定Fc多肽相對於親本分子在聚集方面減少至少2%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少75%或至少100%。
在其他實施例中，本發明之穩定Fc多肽與其所來源之親本Fc多肽相比引起長期穩定性或貨架壽命增加。在一個實施例中，藉由本發明之方法產生之穩定Fc分子相對於不穩定結合分子在貨架壽命方面增加至少1天。此意謂穩定Fc多肽製劑具有與前一天所存在之量實質上相同的量的生物學活性變異Fc多肽，且該製劑不具有任何明顯的變異多肽聚集或分解。在其他實施例中，穩定Fc分子之貨架壽命相對於不穩定Fc分子增加至少2天、至少5天、至少1週、至少2週、至少1個月、至少2個月、至少6個月或至少1年。
在某些實施例中，本發明之穩定Fc多肽與其親本Fc多肽相比以增加之產率表現。在一個實施例中，本發明之穩定Fc多肽之產率相對於親本Fc分子增加至少1%。在其他實施例中，穩定Fc多肽之產率相對於親本Fc分子增加至少2%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少100%。
在例示性實施例中，本發明之穩定Fc多肽在宿主細胞，例如細菌或真核生物(例如酵母或哺乳動物)宿主細胞中以增加之產率(與其親本Fc多肽相比)表現。可用於表現編碼本發明之穩定Fc多肽之核酸分子的例示性哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HELA(人類子宮頸癌)細胞、CVI(猴腎細胞株)細胞、COS(具有SV40 T抗原之CVI衍生物)細胞、R1610(中國倉鼠纖維母細胞)細胞、BALBC/3T3(小鼠纖維母細胞)細胞、HAK(倉鼠腎細胞株)細胞、SP2/O(小鼠骨髓瘤)細胞、BFA-1c1BPT細胞(牛內皮細胞)、RAJI(人類淋巴球)細胞、PER.C6®(人類視網膜來源細胞株，Crucell，荷蘭)及293細胞(人類腎臟)。
在其他實施例中，本發明之穩定Fc多肽在大規模(例如，工業規模)條件下在宿主細胞中以增加之產率(相對於其親本Fc多肽)表現。在例示性實施例中，當在至少10公升培養基中表現時，穩定Fc分子具有增加之產率。在其他實施例中，當由宿主細胞在至少20公升、至少50公升、至少75公升、至少100 公升、至少200公升、至少500公升、至少1000公升、至少2000公升、至少5,000公升或至少10,000公升之培養基中表現時，穩定Fc結合分子具有增加之產率。在一例示性實施例中，每公升培養基產生至少10mg(例如，10mg、20mg、50mg或100mg)穩定Fc分子。
(i)穩定Fc胺基酸
在某些實施例中，本發明之穩定Fc多肽包含IgG4分子之CH2結構域(或其胺基酸292-340)及來自IgG1分子之CH3結構域，在第297位具有Gln(Q)殘基。在另一實施例中，本發明之穩定Fc多肽包含IgG1分子之CH2及CH3結構域以及處於第299位之Lys(K)殘基，其單獨存在或與第297位之Asp(D)殘基組合。
(ii)例示性穩定Fc部分
貫穿本申請案、實例及序列表，可發現本發明之例示性穩定Fc部分。
在某些例示性實施例中，本發明之穩定Fc多肽包含含有以下表1.1中所示之一個、兩個或更多個Fc胺基酸序列的穩定IgG4 Fc區。穩定Fc突變以粗體加下劃線顯示。
Figure 108119374-A0305-02-0078-9
Figure 108119374-A0305-02-0079-10
Figure 108119374-A0305-02-0080-11
Figure 108119374-A0305-02-0081-12
Figure 108119374-A0305-02-0082-13
在某些例示性實施例中，本發明之穩定Fc多肽包含具有以下表1.2中所示之一個、兩個或更多個嵌合Fc部分胺基酸序列之穩定嵌合Fc區。
Figure 108119374-A0305-02-0083-14
在其他例示性實施例中，本發明之穩定Fc多肽包含具有以下表1.3 中所示之一個、兩個或更多個IgG1 Fc部分胺基酸序列的穩定無糖基化IgG1 Fc區。
Figure 108119374-A0305-02-0084-15
Figure 108119374-A0305-02-0085-16
IV.用於穩定變異Fc多肽之方法
在某些態樣中，本發明有關於一種使包含Fc區(例如，無糖基化Fc區)之多肽穩定的方法，該方法包括：(a)選擇起始Fc區之至少一個Fc部分內的一或多個胺基酸位置用於突變；及(b)使選擇用於突變之一或多個胺基酸位置突變，從而使多肽穩定。
在一個實施例中，起始Fc區為IgG1 Fc區。在另一實施例中，起始Fc區為IgG4 Fc區。在另一實施例中，起始Fc區為嵌合Fc區。在一個實施例中，起始Fc區為無糖基化IgG1 Fc區。在另一實施例中，起始Fc區為無糖基化IgG4 Fc區。
在一些實施例中，如本文中所描述之抗體(或其片段)之Fc區具有SEQ ID NO：85中所示之序列。
在一個實施例中，選擇用於突變之胺基酸位置在起始IgG分子(例如IgG4分子)之Fc區中之延伸環中。在另一實施例中，選擇用於突變之胺基酸位置存在於CH3結構域之間的界面中。在另一實施例中，選擇用於突變之胺基酸位置在與1hzh晶體結構中之碳水化合物的接觸位點(例如，V264、R292或V303)附近。在其他實施例中，該胺基酸位置可在CH3/CH2界面附近，或在CH3/CH2界面附近(例如H310)。在另一實施例中，可例如在一組表面暴露麩醯胺酸殘基(Q268、Q274或Q355)中之一或多個中進行改變Fc區之總體表面電荷的一或多個突變。在另一實施例中，該胺基酸位置為在CH2及CH3之「纈胺酸核心」中發現之纈胺酸殘基。CH2中之「纈胺酸核心」為全部定向至CH2結構域之相同近端內部核心中的五個纈胺酸殘基(V240、V255、V263、V302及V323)。對於CH3，觀測到類似「纈胺酸核心」(V348、V369、V379、V397、V412及V427)。在另一實施例中，選擇用於突變之胺基酸位置為預計與胺基酸297處N連接之碳水化合物相互作用或接觸的位置。該等胺基酸位置可藉由檢查與同源Fc受體 (例如FcγRIIIa)結合之Fc區的晶體結構來鑑定。與N297形成相互作用之例示性胺基酸包括由殘基262-270形成之環。
例示性胺基酸位置包括根據EU編號準規之胺基酸位置240、255、262-266、267-271、292-299、302-309、379、397-399、409、412及427。在某些實施例中，選擇用於突變之一或多個胺基酸位置為選自由以下組成之群的一或多個胺基酸位置：240、255、262、263、264、266、268、274、292、299、302、303、307、309、323、348、355、369、379、397、399、409、412及427。在某些實施例中，選擇用於突變之一或多個胺基酸位置為選自由以下組成之群的一或多個胺基酸位置：240、262、264、266、297、299、307、309、399、409及427。在另一實施例中，該一或多個胺基酸位置為選自由以下組成之群的一或多個胺基酸位置：297、299、307、309、409及427。在另一實施例中，該一或多個胺基酸位置係選自胺基酸殘基240、262、264及266。在另一實施例中，至少一個胺基酸位置為EU第297位。在另一實施例中，至少一個胺基酸位置為EU第299位。在另一實施例中，至少一個胺基酸位置為EU第307位。在另一實施例中，至少一個胺基酸位置為EU第309位。在另一實施例中，至少一個胺基酸位置為EU第399位。在另一實施例中，至少一個胺基酸位置為EU第409位。在另一實施例中，至少一個胺基酸位置為EU第427位。
在某些實施例中，該Fc區為IgG1 Fc區。在某些實施例中，其中Fc區為IgG1 Fc區，一或多個胺基酸位置係選自根據EU編號之胺基酸殘基240、262、264、299、297及266。在其他實施例中，其中Fc區為IgG4 Fc區，一或多個胺基酸位置係選自根據EU編號之胺基酸殘基297、299、307、309、399、409及427。
在一個實施例中，突變減少該胺基酸位置處胺基酸側鏈之大小(例如，用丙胺酸(A)、絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)取代)。在另一實施例中，突變為用具 有非極性側鏈之胺基酸進行取代(例如，用甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)、異白胺酸(I)、甲硫胺酸(M)、脯胺酸(P)、苯丙胺酸(F)及色胺酸(W)進行取代)。在另一實施例中，突變增加CH3界面之疏水性，例如，增加兩個相互作用結構域(例如Y349F、T350V及T394V)之間的締合或增加界面側鏈(例如F405Y)之體積。在另一實施例中，「纈胺酸核心」之一或多個胺基酸經異白胺酸或苯丙胺酸取代，以增加其穩定性。在另一實施例中，使胺基酸(例如L351及/或L368)突變為更高度分支化之疏水性側鏈。
在一個實施例中，該突變為經丙胺酸(A)取代。在一個實施例中，該突變為經苯丙胺酸(F)取代。在另一實施例中，該突變為經白胺酸(L)取代。在一個實施例中，該突變為經蘇胺酸(T)取代。在另一實施例中，該突變為經離胺酸(K)取代。在一個實施例中，該突變為經脯胺酸(P)取代。在一個實施例中，該突變為經苯丙胺酸(F)取代。
在一個實施例中，突變包含以下表5.1、表5.2、表5.3及/或表5.4中所示之一或多個突變或取代。
在某些實施例中，突變包含一或多個選自由以下組成之群的取代：240F、262L、264T、266F、297Q、297S、297D、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399S、409M及427F(EU編號準規)。在另一實施例中，該突變包含一或多個選自由以下組成之群的取代：299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399E、399S、409K、409M及427F。在另一實施例中，該一或多個胺基酸位置係選自胺基酸殘基240F、262L、264T及266F。在另一實施例中，至少一個取代為299A。在另一實施例中，至少一個取代為299K。在另一實施例中，至少一個取代為307P。在另一實施例中，至少一個取代為309K。在另一實施例中，至少一個取代為309M。在另一實施例中，至少一個取代為309P。在另一實施例中，至少一個取代為323F。在另一實施例中，至少一個取 代為399S。在另一實施例中，至少一個取代為399E。在另一實施例中，至少一個取代為409K。在另一實施例中，至少一個取代為409M。在另一實施例中，至少一個取代為427F。
在另一實施例中，該突變包含兩個或更多個取代(例如2、3、4或5個)。在另一實施例中，該突變包含三個或更多個取代(例如3、4、5或6個)。在另一實施例中，穩定Fc區包含四個或更多個取代(例如4、5、6或7個)。
在另一態樣中，本發明有關於一種製造包含穩定Fc區之穩定結合分子的方法，該方法包括將包含本發明之穩定Fc區之多肽基因融合至結合部分之胺基末端或羧基末端。在某些實施例中，根據本發明之方法使穩定Fc區穩定。
在另一實施例中，治療抗體可消除擾亂或降低抗體對擾亂之易感性。某些抗體，例如具有野生型IgG4恆定區(例如，包括鉸鏈區)之抗體可能易於擾亂內源IgG4抗體從而產生功能單價產物之兩個複本(參見例如Aalberse及Schuurman,Immunology 105：9-19,2002)。擾亂率可視內源IgG4水準而定且此為可變的。因此，具有野生型人類IgG4恆定區之治療性抗體具有可變藥物動力學/藥效學(PK/PD)概況。具有野生型IgG4恆定區之抗體擾亂可產生就VLA4而言為單價且就另一抗原而言為單價之雙特異性抗體。因而，在一些實施例中，本文中所描述之治療性抗體與具有相同特異性(例如，特異性結合至α4)但具有野生型IgG4恆定區之抗體相比具有更連貫之PK概況。在一些實施例中，與具有相同特異性(例如，特異性結合至α4)但具有野生型IgG4恆定區之抗體相比，本文中所描述之治療性抗體之更連貫PK概況可增加本文中所描述之抗體的安全性，增加其純度及/或增加其效力。
在一些實施例中，作為人類IgG1與人類IgG4抗體之間的嵌合物或雜合體的包含重鏈鉸鏈及Fc區之治療性抗體可降低或消除包含來自人類IgG4分子之鉸鏈及Fc區之抗體的擾亂。在一個實施例中，本文中所描述之具有嵌合 或雜合重鏈恆定區之抗體可消除擾亂或降低抗體對擾亂之易感性，從而降低PK/PD變異性。在一些實施例中，本文中所描述之治療性抗體與具有相同特異性(例如，特異性結合至α4)但具有野生型IgG4恆定區之抗體相比具有較低PK/PD變異性。在某些實施例中，本文中所描述之抗體可增加二價單株抗體之效力及/或消除由於擾亂所致之雙特異性。在某些實施例中，本文所描述之抗體與其未突變對應物相比或與具有相同特異性(例如，特異性結合至α4)但具有野生型IgG4恆定區及/或顯示較高持續受體佔用率之抗體相比可展現較高結合親和力。在一些實施例中，本文中所描述之具有較低PK/PK變異性及/或較高結合親和力及/或減少或消除之擾亂的治療性抗體與具有相同特異性(例如，特異性結合至α4)但具有野生型IgG4恆定區之抗體相比可增加本文中所描述之抗體的安全性，增加其純度及/或增加其效力。在一較佳實施例中，消除擾亂或降低抗體對擾亂之易感性的抗體為重組抗α4抗體，該抗體包含：(a)含有SEQ ID NO：80之序列、基本上由其組成或由其組成之重鏈；及(b)含有SEQ ID NO：81之序列、基本上由其組成或由其組成之輕鏈。
V.評估蛋白質穩定性之方法
可使用此項技術中已知的方法來分析本發明組合物之穩定性。可採用對熟習此項技術者可接受的穩定性參數。以下更詳細地描述例示性參數。在例示性實施例中，評估熱穩定性。在一些實施例中，評估本發明組合物之表現水準(例如，如由產率%所量度)。在一些實施例中，評估本發明組合物之聚集水準。
在某些實施例中，將Fc多肽之穩定性與適合對照物之穩定性相比較。例示性對照物包括親本Fc多肽，諸如野生型Fc多肽、野生型(糖基化)IgG1或IgG4抗體。另一例示性對照物為無糖基化Fc多肽、無糖基化IgG1或IgG4抗體。在一個實施例中，量測以下所描述之一或多個參數。
在一個實施例中，在哺乳動物細胞中表現後量測此等參數中之一或多個。在一個實施例中，在大規模製造條件下量測以下所描述之一或多個參數(例如，Fc多肽或包含Fc多肽之分子在生物反應器中之表現)。
A.熱穩定性
可使用此項技術中已知的許多非限制性生物物理或生物化學技術分析本發明組合物之熱穩定性。在某些實施例中，藉由分析光譜法評估熱穩定性。例示性分析光譜法為差示掃描量熱術(DSC)。DSC採用對熱吸收伴隨大部分蛋白質或蛋白質結構域去摺疊敏感之熱量計(參見例如Sanchez-Ruiz等人，Biochemistry,27：1648-52,1988)。為了測定蛋白質之熱穩定性，將蛋白質樣品插入熱量計中並使溫度升高直至Fc多肽(或其CH2或CH3結構域)去摺疊。蛋白質去摺疊時之溫度指示總體蛋白質穩定性。
另一例示性分析光譜法為圓二色性(CD)光譜法。CD光譜法量測組合物之光學活性隨溫度增加而變化。圓二色性(CD)光譜法量測由於結構不對稱而引起的左偏振光相對於右偏振光之吸光度差異。無序或去摺疊結構引起CD光譜非常不同於有序或摺疊結構之光譜。CD光譜體現蛋白質對溫度增高之變性作用的敏感性，且因此指示蛋白質之熱穩定性(參見van Mierlo及Steemsma,J.Biotechnol,79(3)：281-98,2000)。
用於量測熱穩定性之另一例示性分析光譜法為螢光發射光譜法(參見van Mierlo及Steemsma，同上)。用於量測熱穩定性之另一例示性分析光譜法為核磁共振(NMR)光譜法(參見例如van Mierlo及Steemsma，同上)。
在其他實施例中，以生物化學手段量測本發明組合物之熱穩定性。用於評定熱穩定性之例示性生物化學方法為熱攻擊分析法。在「熱攻擊分析法」中，使本發明之組合物經受一定範圍之升高溫度持續設定時間段。舉例而言，在一個實施例中，包含Fc區之測試Fc多肽經受一定範圍之升高溫度，例如持續 1-1.5小時。隨後藉由相關生物化學分析法(例如，ELISA或DELFIA)分析Fc區結合Fc受體(例如，FcγR、蛋白A或蛋白G)之能力。例示性熱攻擊分析法描述於以下實例4中。
在一個實施例中，此種分析法可以高通量形式進行。在另一實施例中，可使用此項技術中已知的方法來建立Fc變異體庫。可誘導Fc表現且可對Fc進行熱攻擊。可分析受攻擊之測試樣品的結合且可按比例放大彼等穩定Fc多肽並進一步表徵。
在某些實施例中，藉由使用任一以上技術(例如分析光譜技術)量測本發明組合物之熔融溫度(Tm)來評估熱穩定性。熔融溫度為熱轉移曲線中點處之溫度，其中組合物之50%分子處於摺疊狀態。
在其他實施例中，藉由使用分析量熱技術(例如DSC)量測本發明組合物之比熱或熱容(Cp)來評估熱穩定性。組合物之比熱為使1mol水之溫度升高1℃所需之能量(例如以kcal/mol計)。因為大Cp為變性或無活性蛋白質組合物之標誌。在某些實施例中，藉由在組合物熱轉移前後測定其比熱來量測組合物之熱容變化(△Cp)。在其他實施例中，可藉由量測或測定其他熱力學穩定性參數來評估熱穩定性，包括去摺疊之吉布斯自由能(△G)、去摺疊之焓(△H)或去摺疊之熵(△S)。
在其他實施例中，使用一或多種以上生物化學分析法(例如熱攻擊分析法)來測定50%組合物保留其活性(例如結合活性)之溫度(亦即，Tc值)。
B.聚集%
在某些實施例中，藉由量測本發明組合物之聚集傾向來測定其穩定性。可藉由許多非限制性生物化學或生物物理學技術來量測聚集。舉例而言，可使用層析法，例如粒徑排阻層折法(SEC)來評估本發明組合物之聚集。SEC基於粒徑分離分子。管柱填充有聚合物凝膠之半固體珠粒，從而將允許離子及小 分子但不允許大分子進入其內部。當蛋白質組合物施加至管柱頂部時，緊密摺疊之蛋白質(亦即，非聚集蛋白質)分佈至比大蛋白質聚集物可利用之體積更大體積的溶劑。因此，大聚集物更快速地移動通過管柱，並且可以此種方式將混合物分離或分級成其組分。各級分可在其自凝膠溶析時分別定量(例如藉由光散射)。因此，可藉由比較級分之濃度與施加至凝膠之蛋白質之總濃度來確定本發明組合物之聚集%。穩定組合物自管柱中溶析為基本單一級分，且在溶析曲線或層析譜中呈現為基本單峰。
在一些實施例中，SEC與串聯光散射(例如經典或動態光散射)聯合用於測定組合物之聚集%。在某些實施例中，採用靜態光散射量測各級分或峰之質量，與分子形狀或溶析位置無關。在一些實施例中，採用動態光散射來量測組合物之流體動力學大小。用於評估蛋白質穩定性之其他例示性方法包括高速SEC(參見例如Corbett等人，Biochemistry.23(8)：1888-94,1984)。
在一非限制性實施例中，藉由量測蛋白質樣品內蛋白質聚集物之分數來確定聚集%。在一些實施例中，藉由測定蛋白質樣品內摺疊蛋白質之分數來量測組合物之聚集%。
C.產率%
在其他實施例中，藉由在蛋白質表現(例如重組表現)後量測所回收之蛋白質的量(本文中為「產率%」)來評估本發明組合物之穩定性。舉例而言，可藉由測定每ml宿主培養基回收之蛋白質之毫克數(亦即，mg/ml蛋白質)來測量產率%。在一些實施例中，在哺乳動物宿主細胞(例如CHO細胞)中表現後評估產率%。
D.損失%
在其他實施例中，藉由監測在一定範圍之溫度(例如-80℃至25℃)下儲存限定時間段後的蛋白質損失來評估本發明組合物之穩定性。可使用此項技 術中已知的任何蛋白質定量方法來測定所回收之蛋白質的量或濃度，並且與蛋白質之初始濃度相比較。例示性蛋白質定量方法包括SDS-PAGE分析或Bradford分析法(Bradford等人，Anal.Biochem.72,248,(1976))。用於評估損失%之非限制性方法採用上文所描述之任何分析型SEC方法。應瞭解，可在任何所要儲存條件或儲存調配物，包括例如凍乾蛋白質製劑下測定損失%量測。
E.蛋白水解%
在其他實施例中，藉由測定在標準條件下儲存後發生蛋白水解之蛋白質的量來評估本發明組合物之穩定性。在一例示性實施例中，藉由SDS-PAGE測定蛋白質樣品之蛋白質水解，其中將完整蛋白質之量與SDS-PAGE凝膠上出現之低分子量片段之量相比較。在另一例示性實施例中，藉由質譜法(MS)測定蛋白水解，其中將具有預期分子量之蛋白質的量與樣品內低分子量蛋白質片段的量相比較。
F.結合親和力
在其他實施例中，可藉由測定本發明組合物之靶結合親和力來評估其穩定性。用於測定結合親和力之多種方法為此項技術中已知的。用於測定結合親和力之例示性方法採用表面電漿子共振。表面電漿子共振為一種光學現象，其允許藉由偵測生物感測器基質內蛋白質濃度之變化來分析即時生物特異性相互作用，例如使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden及Piscataway，NJ)。關於進一步描述，參見Jonsson,U.等人，(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jonsson,U.等人，(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson,B.等人，(1995)/.MoI.Recognit.8：125-131；及Johnnson,B.等人，(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
G.其他結合研究
在其他實施例中，可藉由對經標記化合物與結合分子之已變性或去 摺疊部分之結合進行定量來評估本發明組合物之穩定性。該等分子可為疏水性的，因為其可能會與正常情況下埋藏在天然蛋白質內部但在變性或去摺疊結合分子中得以暴露之大疏水性胺基酸片段結合或相互作用。例示性經標記化合物為疏水性螢光染料1-苯胺基-8-萘磺酸鹽(ANS)。
VI.包含穩定Fc區之穩定結合多肽
在一個實施例中，本發明之多肽包含來自IgG4抗體之CH1結構域、來自IgG4抗體之CH2結構域及來自IgG1抗體之CH3結構域。在一個實施例中，該多肽進一步包含Ser228Pro取代。該多肽可進一步包含胺基酸297及/或299處之突變，例如297Q及/或299K或297S及/或299K。該多肽亦可包含來自IgG1或IgG4抗體之CH1結構域、來自IgG4抗體之CH2結構域及來自IgG1抗體之CH3結構域；該多肽可包含Ser228Pro、297Q或299K取代中之一或多個。由來自IgG4分子之CH1結構域(具有Ser228Pro取代)、來自IgG4抗體之CH2結構域及來自IgG1抗體之CH3結構域組成的Fc區之胺基酸序列提供於SEQ ID NO：43中。在一個實施例中，本發明之穩定Fc多肽包含SEQ ID NO：40中所示之胺基酸序列。在一個實施例中，本發明之穩定Fc多肽包含SEQ ID NO：74中所示之胺基酸序列。在一個實施例中，本發明之穩定Fc多肽包含SEQ ID NO：75中所示之胺基酸序列。在一個實施例中，本發明之穩定Fc多肽包含SEQ ID NO：76中所示之胺基酸序列。在一個實施例中，本發明之穩定Fc多肽包含SEQ ID NO：77中所示之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明多肽之Fc區為單鏈(scFc)。在一個實施例中，包含此段所描述之Fc區之分子為單價的。在一個實施例中，包含此段中所描述之Fc區之分子為單價的且該Fc區為scFc。包含本文中所描述之Fc區之分子亦可包含scFv。
VII.包含功能部分之穩定含Fc多肽
可進一步修飾本發明之變異含Fc多肽以提供所要效果。舉例而言，變異Fc多肽之Fc區可連接，例如共價連接至額外部分，亦即，功能部分，諸如阻斷部分、可偵測部分、診斷部分及/或治療部分。以下首先描述例示性功能部分，繼之以用於將此等功能部分與不同的胺基酸側鏈化學反應相關聯的適用化學反應。
適用功能部分之實例包括但不限於阻斷部分、可偵測部分、診斷部分及治療部分。例示性阻斷部分包括具有足以降低效應功能(例如藉由抑制Fc區結合受體或補體蛋白質之能力)之空間體積及/或電荷的部分。非限制性阻斷部分包括聚烷二醇部分，例如PEG部分或PEG-馬來醯亞胺部分。非限制性聚乙二醇化部分(或相關聚合物)可為例如聚乙二醇(「PEG」)、聚丙二醇(「PPG」)、聚氧乙烯化甘油(「POG」)及其他聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇(「PVA」)及其他聚環氧烷、聚氧乙烯化山梨醇或聚氧乙烯化葡萄糖。聚合物可為均聚物、無規或嵌段共聚物、基於以上列出之單體的三元共聚物、直鏈或支鏈、經取代或未經取代，只要其具有至少一個活性碸部分即可。聚合物部分可具有任何長度或分子量，但此等特徵可能影響生物學性質。尤其適用於在醫藥應用中降低清除率之聚合物平均分子量在2,000至35,000道爾頓之範圍內。另外，若兩個基團連接至聚合物，每一端一個，則聚合物之長度可影響兩個基團之間的有效距離及其他空間關係。因而，熟習此項技術者可改變聚合物之長度以優化或賦予所要生物活性。PEG出於若干原因而適用於生物學應用。PEG通常澄清、無色、無味、可溶於水、對熱穩定、對許多化學試劑呈惰性、不水解且無毒。聚乙二醇化可藉由增加分子之表觀分子量來改良分子之藥物動力學效能。表觀分子量增加降低經皮下或全身投與後自體內清除之速率。在許多情況下，聚乙二醇化可降低抗原性及免疫原性。此外，聚乙二醇化可增加生物活性分子之溶解度。
聚乙二醇化抗體及抗體片段一般可用於治療可藉由投與本文中所描 述之抗體及抗體片段來緩解或調節之病狀。一般而言，聚乙二醇化無糖基化抗體及抗體片段與非聚乙二醇化無糖基化抗體及抗體片段相比具有增加之半衰期。聚乙二醇化無糖基化抗體及抗體片段可單獨、共同或與其他醫藥組合物組合使用。適用於本發明之方法及多肽中之可偵測部分的實例包括螢光部分、放射性同位素部分、不透射線部分及其類似物，例如可偵測標記物，諸如生物素、螢光團、發色團、自旋共振探針或放射性標記物。例示性螢光團包括螢光染料(例如螢光素、羅丹明及其類似物)及其他發光分子(例如魯米那(luminal))。螢光團可具環境敏感性，使得若其位於接近經修飾蛋白質中在結合受質(例如丹醯探針)後發生結構變化之一或多個殘基處，則其螢光發生變化。例示性放射性標記物包括含有具有一或多個低敏感性核之原子(13C、15N、2H、125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga、111In及其類似物)之小分子。其他適用之部分為此項技術中已知的。
適用於本發明之方法及多肽中之診斷部分的實例包括適於揭示疾病或病症之存在的可偵測部分。通常，診斷部分允許確定與疾病或病症相關之分子(例如，靶肽、一或多種蛋白質)之存在、不存在或水準。該等診斷劑亦適用於預後及/或診斷疾病或病症及其進展。
適用於本發明之方法及多肽之治療部分的實例包括例如消炎劑、抗癌劑、抗神經退化劑及抗感染劑。功能部分亦可具有一或多種以上提及之功能。
例示性治療劑包括能夠在核DNA中引起多鏈斷裂且因此適用於誘導細胞死亡(例如，癌症)之具有高能電離輻射之放射性核種。例示性高能放射性核種包括：90Y、125I、1311、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re及188Re。此等同位素通常產生具有短路徑長度之高能OC粒子或β粒子。該等放射性核種殺死其緊密鄰近之細胞，例如結合物已連接或進入之贅瘤細胞。其對非定位細胞幾乎無影響或無影響且為基本上非免疫原性的。
例示性治療劑亦包括細胞毒性劑，諸如細胞抑制劑(例如烷基化劑、DNA合成抑制劑、DNA插入劑或交聯劑、或DNA-RNA轉錄調控劑)、酶抑制劑、基因調控劑、細胞毒性核苷、微管蛋白結合劑、激素及激素拮抗劑、抗血管生成劑及其類似物。
例示性治療劑亦包括烷基化劑，諸如蒽環族藥物(例如阿德力黴素、洋紅黴素、環孢菌素A、氯喹、甲基喋呤、光神黴素、泊非黴素(porfiromycin)、鏈黴素、泊非黴素、蒽二酮及氮丙啶)。在另一實施例中，化學治療部分為細胞抑制劑，諸如DNA合成抑制劑。DNA合成抑制劑之實例包括但不限於胺甲喋呤及二氯胺甲喋呤、3-胺基-1,2,4-苯并三嗪1,4-二氧化物、胺基喋呤、胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷、5-氟-5'-脫氧尿苷、5-氟尿嘧啶、更昔洛韋(ganciclovir)、羥基脲、放線菌素D及絲裂黴素C。例示性DNA插入劑或交聯劑包括但不限於博來黴素(bleomycin)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、環磷醯胺、順二胺二氯化鉑(II)(順鉑(cisplatin))、美法侖(melphalan)、米托蒽醌(mitoxantrone)及奧沙利鉑(oxaliplatin)。例示性治療劑亦包括轉錄調控劑，諸如放線菌素D、道諾黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、高三尖杉酯鹼(homoharringtonine)及艾達魯比辛(idarubicin)。與本發明相容之其他例示性細胞抑制劑包括安莎黴素(ansamycin)苯醌、類醌衍生物(例如喹諾酮、染料木素(genistein)、細菌週期素(bactacyclin))、白消安(busulfan)、依弗醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、三嗪酮(triaziquone)、地吖醌(diaziquone)、咔唑醌(carbazilquinone)、吲哚醌(indoloquinone)EO9、二氮雜環丙基-苯醌甲基DZQ、三亞乙基磷醯胺及亞硝基脲化合物(例如卡莫司汀、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine))。
例示性治療劑亦包括細胞毒性核苷，諸如阿糖腺苷、阿拉伯糖基胞嘧啶、阿糖胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿苷(floxuridine)、 呋氟尿嘧啶(ftorafur)及6-巰基嘌呤；微管蛋白結合劑，諸如紫杉醇(taxoids)(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、歐洲紫杉醇(docetaxel)、紫杉烷(taxane))、諾考達唑(nocodazole)、根黴素、多拉司他汀(dolastatins)(例如多拉司他汀-10、多拉司他汀-11或多拉司他汀-15)、秋水仙鹼及秋水仙素(例如ZD6126)、考布他汀(combretastatins)(例如考布他汀A-4、AVE-6032)及長春花生物鹼(例如長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)及長春瑞濱(vinorelbine)(諾維本(navelbine)))；抗血管生成化合物，諸如血管抑制素Kl-3、DL-α-二氟甲基-鳥胺酸、內皮抑素、菸麯黴素(fumagillin)、染料木素、米諾環素(minocycline)、星孢菌素(staurosporine)及(±)-沙利度胺(thalidomide)。例示性治療劑亦包括激素及激素拮抗劑，諸如皮質類固醇(例如普賴松(prednisone))、孕酮(例如羥孕酮(hydroxyprogesterone)或甲羥孕酮(medroprogesterone))、雌激素(例如己烯雌酚)、抗雌激素藥(例如他莫昔芬(tamoxifen))、雄激素(例如睾酮(testosterone))、芳香酶抑制劑(例如胺魯米特(aminogluthetimide))、17-(烯丙基胺基)-17-去甲氧基格爾德黴素、4-胺基-1,8-萘二甲醯亞胺、芹菜素(apigenin)、布雷菲爾德菌素(brefeldin)A、希美替定(cimetidine)、二氯亞甲基二膦酸、亮丙利德(leuprolide)(亮丙瑞林(leuprorelin))、黃體生成素釋放激素、皮斐松(pifithrin)-α、雷帕黴素(rapamycin)、性激素結合球蛋白及毒胡蘿蔔素(thapsigargin)。
例示性治療劑亦包括酶抑制劑，諸如S(+)-喜樹鹼、薑黃素、(-)-魚藤素、5,6-二氯苯并咪唑1-β-D-呋喃核糖苷、伊妥普賽、福美坦、福司曲星、硬毛素、2-亞胺基-1-咪唑啶乙酸(環肌酸)、麥維諾素(mevinolin)、曲古抑菌素A、酪胺酸磷酸化抑素AG 34及酪胺酸磷酸化抑素AG 879。例示性治療劑亦包括基因調控劑，諸如5-氮雜-2'-脫氧胞苷、5-氮雜胞苷、膽鈣化醇(維生素D3)、4-羥基他莫昔芬、褪黑激素、米非司酮、雷洛昔芬、反式視黃醛(維生素A醛)、視黃酸、維生素A酸、9-順-視黃酸、13-順-視黃酸、視黃醇(維生素A)、他莫昔芬及曲格 列酮。
例示性治療劑亦包括細胞毒性劑，諸如喋啶族藥物、二炔類及鬼臼毒素類。彼等類別中尤其適用之成員包括例如甲基喋呤、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，諸如伊妥普賽或磷酸伊妥普賽、異長春鹼、長春地辛、環氧長春鹼及其類似物。
與本文中之教示相容的其他細胞毒素包括奧里斯他汀(auristatin)(例如奧里斯他汀E及單甲基奧里斯他汀E)、卡奇黴素(calicheamicin)、短桿菌肽D、類美登素(例如美登素)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、拓撲替康(topotecan)、紫杉烷、細胞分裂抑素B、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根鹼(emetine)、替諾泊苷(tenoposide)、秋水仙鹼、二羥基蒽二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。其他類型之功能部分為此項技術中已知的，且可基於本文中所包含之教示容易地用於本發明之方法及組合物中。
用於將上述功能部分、小分子、核酸、聚合物、肽、蛋白質、化學治療劑或其他類型分子連接至特定胺基酸側鏈之化學反應為此項技術中已知的(關於特定連接子之詳細綜述，參見例如Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press(1996))。
VIII.醫藥組合物
可將α4結合劑(諸如具有穩定Fc區之VLA-4結合抗體)調配為醫藥組合物。通常，醫藥組合物包括醫藥學上可接受之載劑。如本文中所使用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包覆劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。
「醫藥學上可接受之鹽」係指保留母體化合物之所要生物活性且不賦予任何不希望之毒理學作用的鹽(參見例如Berge,S.M.等人，(1977)J.Pharm. Sci.66：1-19)。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括衍生自以下酸之彼等酸加成鹽：無毒無機酸，諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸及其類似酸；以及無毒有機酸，諸如脂族單羧酸及二羧酸、經苯基取代之鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及其類似物。鹼加成鹽包括衍生自以下鹼之彼等鹼加成鹽：鹼土金屬，諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物；以及無毒有機胺，諸如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及其類似物。
可根據此項技術中已知的方法調配本文中所描述之抗體組合物。醫藥調配物為確立之技術，且進一步描述於以下文獻中：Gennaro(編),Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott,Williams & Wilkins(2000)(ISBN：0683306472)；Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippincott Williams & Wilkins Publishers(1999)(ISBN：0683305727)；及Kibbe(編),Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association，第3版(2000)(ISBN：091733096X)。
在一個實施例中，α4抗體可與諸如氯化鈉、七水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉及聚山梨醇酯80之賦形劑材料一起調配。在另一實施例中，α4抗體可調配於檸檬酸鹽緩衝液中，例如以pH 5、5.5、6、6.5、7或7.5。在另一實施例中，α4抗體可調配於包括2%、4%、5%、6%、8%、10%、12%、14%或15%蔗糖之溶液中。其可例如以約20mg/ml之濃度於緩衝溶液中提供，且可儲存在2-8℃下。
醫藥組合物亦可呈多種其他形式。此等包括例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如可注射溶液及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、脂質體及栓劑。該形式可視預定投與模式及治療應用而定。通常，本文所描述之劑的組合物呈可注射或可輸注溶液形式。
該等組合物可藉由非經腸模式(例如，經靜脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射)投與。如本文中所使用之片語「非經腸投與」及「非經腸地投與」意謂除經腸及局部投與以外的投與模式，通常藉由注射，且包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、被膜下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
醫藥組合物在製造及儲存條件下通常必須為無菌且穩定的。亦可測試醫藥組合物以確保其滿足關於投與之法規及行業標準。
該組合物可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或適於高藥物濃度之其他有序結構。無菌可注射溶液可藉由將本文中所描述之劑以所需量視需要與以上所列舉之成分之一或組合一起併入適當溶劑中，繼而進行過濾滅菌來製備。一般而言，藉由將本文中所描述之劑併入含有基礎分散介質及來自以上列舉之彼等成分的其他所需成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉劑的情況下，典型製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，從而由其先前經無菌過濾之溶液產生本文中所描述之劑加任何其他所要成分之粉末。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包覆劑、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用表面活性劑來維持溶液之適當流動性。可藉由在組合物中包括吸收延遲劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來延長可注射組合物之吸收。
IX.投與
可藉由多種方法將具有穩定Fc區之α4結合抗體投與個體，例如人類個體。對於許多應用，投與途徑為以下之一：靜脈內注射或輸注、皮下注射或肌肉內注射。α4結合抗體可作為固定劑量或呈mg/kg劑量形式投與。抗體可經靜脈內(IV)或皮下(SC)投與。舉例而言，抗體可以約50-600mg IV之間(例如每4週)或約50-100mg SC(例如75mg)之間的固定單位劑量投與，例如，每週至少一次(例如每週兩次)。在一個實施例中，抗體以50mg、60mg、80mg、100 mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、180mg、200mg、300mg、400mg、500mg或600mg或更大固定單位劑量經靜脈內投與。靜脈內劑量之投與可為每週一次或兩次或三次或更多次，或者每兩週、三週、四週或五週一次，或更低頻率。
在一個實施例中，抗體係以50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、100mg或120mg或更大固定單位劑量經皮下投與。皮下劑量之投與可為每週一次或兩次或三次或更多次，或者每兩週、三週、四週或五週一次，或更低頻率。
具有穩定Fc區之抗α4抗體亦可以約1與10mg/kg之間，例如約6.0mg/kg、4.0mg/kg、3.0mg/kg、2.0mg/kg、1.0mg/kg之劑量呈藥團形式投與。改良之劑量範圍包括小於約600mg/個體、約400mg/個體、約300mg/個體、約250mg/個體、約200mg/個體或約150mg/個體之劑量，通常用於每第四週或每月投與一次。α4結合抗體可例如每三至五週，例如每四週或每個月投與。
可根據患者先前投與抗α4抗體之清除率來調節劑量。舉例而言，在患者系統中之抗α4抗體水準降至預定水準以下之前，不能向患者投與第二或後續劑量。在一個實施例中，分析來自患者之樣品(例如，血漿、血清、血液、尿液或腦脊髓液(CSF))中抗α4抗體之存在，且若抗α4抗體水準高於預定水準，則將不向患者投與第二或後續劑量。若患者系統中之抗α4抗體水準低於預定水準，則向患者投與第二或後續劑量。經測定抗α4水準過高(高於預定水準)之患者可在一或二或三天或一週之後再次測試，且若患者樣品中之抗α4抗體水準已降至預定水準以下，則可向患者投與抗體之第二或後續劑量。
亦可選擇劑量以減少或避免產生針對α4結合抗體之抗體，以達成超過40%、50%、70%、75%或80%之α4次單元飽和度，以達成低於80%、70%、60%、50%或40%之α4次單元飽和度，或防止循環白血球水準增高。
在某些實施例中，活性劑可用將防止化合物快速釋放之載劑製備， 諸如控制釋放調配物，包括植入物及微囊化遞送系統。可使用生物可降解型生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。許多用於製備該等調配物之方法已取得專利或一般為已知的。參見例如Controlled Drug Delivery(Drugs and the Pharmaceutical Sciences)，第二版，J.Robinson及V.H.L.Lee編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1987。
醫藥組合物可用醫療裝置投與。舉例而言，醫藥組合物可用無針皮下注射裝置，諸如美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號、或第4,596,556號中所揭示之裝置來投與。熟知植入物及模組之實例論述於例如以下文獻中：美國專利第4,487,603號，該專利揭示一種用於以受控速率分配藥物之可植入微輸液泵；美國專利第4,486,194號，該專利揭示一種經由皮膚投與藥物之治療裝置；美國專利第4,447,233號，該專利揭示一種用於以精確輸注速率遞送藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，該專利揭示一種用於連續藥物遞送之可變流量可植入輸注裝置；美國專利第4,439,196號，該專利揭示一種具有多腔隔室之滲透性藥物遞送系統；及美國專利第4,475,196號，該專利揭示一種滲透性藥物遞送系統。固然，許多其他該等植入物、遞送系統及模組亦為已知的。
本發明亦提供一種用於投與第一劑及第二劑之裝置。該裝置可包括例如一或多個用於儲存醫藥調配物之外殼，且可經配置以遞送該第一劑及第二劑之單位劑量。第一劑及第二劑可儲存在相同或單獨的隔室中。舉例而言，該裝置可在投與之前將該等劑組合。亦有可能使用不同的裝置來投與第一劑及第二劑。
調節劑量方案以提供所要反應，諸如治療反應或組合治療效果。一般而言，可使用VLA-4結合劑及第二劑之任何劑量組合(單獨的或共同調配的)以便以生物可利用之量向個體提供兩種劑。
如本文中所使用之劑量單位形式或「固定劑量」係指適合作為單一劑量用於欲治療之個體的物理離散單元；各單元含有經計算可與所需藥物載劑聯合且視情況與其他劑聯合以產生所要治療效果的預定量的活性化合物。
醫藥組合物可包括「治療有效量」之本文中所描述之劑。可基於所投與之第一劑及第二劑之組合效果來確定該等有效量。劑之治療有效量亦可根據諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重、以及化合物在個體中引發所要反應(諸如改善至少一個病症參數，例如多發性硬化症參數，或改善病症之至少一種症狀，例如多發性硬化症的之症狀，諸如肌肉萎縮、共濟失調及震顫)之能力等因素而變化。治療有效量亦為組合物之治療有益作用勝過任何毒性或不利作用的量。
X.裝置及套組
含有本文中所描述之抗體的調配物可用醫療裝置投與。該裝置可設計為具有可攜性、室溫儲存及容易使用之特徵，因此其可在緊急情況下使用，諸如由未經訓練之個體或由現場應急人員移至醫療設施及其他醫療設備。該裝置可包括例如一或多個用於儲存包括α4結合抗體之醫藥調配物之外殼，且可經配置以遞送該劑之一或多個單位劑量。
舉例而言，醫藥組合物可用經皮遞送裝置，諸如注射器，包括皮下注射器或多腔注射器來投與。其他適合之遞送裝置包括支架、導管、微針及可植入控制釋放裝置。該組合物可用有或無串聯過濾器之標準靜脈內設備，包括例如靜脈內管而經靜脈內投與。在某些實施例中，該裝置將為用於經皮下或肌肉內投與之注射器。
醫藥組合物可用醫療裝置投與。舉例而言，醫藥組合物可用無針皮下注射裝置，諸如美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號、或第4,596,556號中所揭示之 裝置來投與。熟知植入物及模組之實例描述於例如以下文獻中：美國專利第4,487,603號，該專利揭示一種用於以受控速率分配藥物之可植入微輸液泵；美國專利第4,486,194號，該專利揭示一種經由皮膚投與藥物之治療裝置；美國專利第4,447,233號，該專利揭示一種用於以精確輸注速率遞送藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，該專利揭示一種用於連續藥物遞送之可變流量可植入輸注裝置；美國專利第4,439,196號，該專利揭示一種具有多腔隔室之滲透性藥物遞送系統；及美國專利第4,475,196號，該專利揭示一種滲透性藥物遞送系統。治療組合物亦可呈生物可降解或非生物可降解型持續釋放調配物形式用於經皮下或肌肉內投與。用於該等組合物之方法為此項技術中已知的。亦可使用可植入泵或外部泵來達成連續投與。投與亦可間歇性地進行，諸如每日注射一次，或以低劑量持續進行，諸如呈持續釋放調配物形式。可改進遞送裝置以最佳地適於投與α4結合抗體。舉例而言，注射器可矽化至對抗體儲存及遞送而言最佳的程度。固然，許多其他該等植入物、遞送系統及模組亦為已知的。
本發明亦提供一種用於投與第一劑及第二劑(例如，抗體及第二劑)之裝置。該裝置可包括例如一或多個用於儲存醫藥調配物之外殼，且可經配置以遞送該第一劑及第二劑之單位劑量。第一劑及第二劑可儲存在相同或單獨的隔室中。在一個實施例中，該裝置可在投與之前將該等劑組合。在一些實施例中，第一劑及第二劑係藉由不同的裝置投與。
α4結合抗體可提供於套組中。在一個實施例中，該套組包括(a)含有包括高濃度VLA-4結合抗體之組合物的容器、視情況(b)含有包括第二劑之組合物的容器及視情況(c)資訊材料。資訊材料可為描述材料、指導材料、營銷材料或與本文中所描述之方法有關的其他材料及/或該等劑用於治療益處之用法。在一個實施例中，該套組亦包括第二劑。舉例而言，該套組包括含有包括α4結合抗體之組合物的第一容器及包括第二劑之第二容器。
套組之資訊材料在其形式方面不受限制。在一個實施例中，資訊材料可包括關於抗體產生、濃度、到期日期、批次或生產現場資訊等的資訊。在一個實施例中，資訊材料係關於投與α4結合抗體之方法，例如以適合之劑量、劑型或投與模式(例如，本文中所描述之劑量、劑型或投與模式)進行；治療患有急性病症(諸如脊髓損傷或創傷性腦損傷)或發炎性疾病(例如，MS)或處在經歷與發炎性疾病相關之急性發作風險下的個體。資訊可呈各種形式提供，包括印刷文本、電腦可讀材料、視訊記錄或音頻記錄或提供真實材料之鏈路或地址的資訊。
除劑以外，套組中之組合物可包括其他成分，諸如溶劑或緩衝液、穩定劑或防腐劑。該劑可呈任何形式提供，例如液體、乾燥或凍乾形式，且為實質上純及/或無菌的。當劑呈液體溶液形式提供時，液體溶液通常為水溶液。當劑呈乾燥形式提供時，一般藉由添加適合之溶劑來復原。可視情況在套組中提供溶劑，例如無菌水或緩衝液。
套組可包括針對含有該等劑之一或多種組合物的一或多個容器。在一些實施例中，該套組含有針對組合物及資訊材料之單獨容器、分配器或隔室。舉例而言，組合物可容納於瓶、小瓶或注射器中，而資訊材料可包含在塑料套管或包裝中。在其他實施例中，套組之個別元件包含在單獨的未分開容器內。舉例而言，組合物包含在貼有呈標籤形式之資訊材料的瓶、小瓶或注射器中。在一些實施例中，該套組包括複數個(例如，一包)單獨的容器，各容器含有該等劑之一或多個單位劑型(例如，本文中所描述之劑型)。該等容器可包括組合單位劑量，例如包括α4結合抗體及第二劑之單元，諸如以所要比率。舉例而言，該套組可包括複數個注射器、安瓿、箔包、泡罩包裝或醫療裝置，各自含有例如單一組合單位劑量。套組之容器可為氣密性、不透水(例如，不透水分變化或蒸發)及/或不透光。
套組視情況包括適於投與組合物之裝置，例如注射器或其他適合之遞送裝置。該裝置可預裝該等劑之一或二者，或者可為空的但適於裝載。
XI.腫瘤學
本文中所描述之α4結合抗體及方法可用於治療癌症，包括實體癌及血液學惡性病。例示性實體癌包括肉瘤及癌瘤，諸如肺癌、乳癌、胰臟癌、結腸癌、前列腺癌、膀胱癌及腦癌。血液學惡性病包括癌症，諸如多發性骨髓瘤、白血病及淋巴瘤。
提供用含有α4結合抗體，諸如本文中所描述之抗VLA-4抗體的組合物治療患有血液學惡性病之患者的方法。血液學惡性病為體內血液形成及免疫系統癌症。此類型癌症影響血液、骨髓及/或淋巴結。血液學惡性病包括白血病，諸如急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性前骨髓細胞性白血病、急性紅白血病及毛細胞白血病(HCL)；淋巴瘤，諸如霍奇金氏病及非霍奇金氏淋巴瘤；及多發性骨髓瘤；瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症；骨髓發育不良症候群(MDS)(其最終導致AML)；骨髓增生性疾病，諸如真性紅血球增多症(亦稱為PV、PCV或真性紅血球增多症(PRV))、本態性血小板增多症(ET)、骨髓纖維化、重鏈病；由輕鏈病引起之澱粉樣病變。
可藉由以例如可用於鑑定惡性細胞之光學顯微術分析血球計數及血膜來鑑定患有血液學惡性病之患者。亦可使用諸如來自骨髓之活組織切片來鑑定惡性細胞，且來自淋巴結之活組織切片可用於鑑定淋巴結病。
α4結合抗體(例如，人類化抗VLA-4抗體，諸如HuHP1/2、H1L0、H1L1、H1L2或H1L3)可用於治療白血病，諸如AML。白血病為起源於骨髓之癌症，其中惡性細胞為白細胞(白血球)。AML(亦稱為急性髓細胞性白血病、急性髓母細胞性白血病、急性粒細胞性白血病及急性非淋巴細胞性白血病)為顆粒 球或單核球中發生之惡性病。AML之特徵為不能發揮正常血細胞之功能且阻斷正常骨髓細胞之產生，從而導致血液中缺乏紅細胞(貧血)及血小板(血小板減少症)及正常白細胞(尤其嗜中性白血球，亦即，嗜中性白血球減少症)的細胞被(稱為白血病母細胞)之不受控制性過度生長及積聚。
所有AML亞型均適於用VLA-4結合抗體進行治療。AML亞型係基於診斷時骨髓母細胞已達到之發育階段進行分類。類別及子集允許醫生決定何種治療最適合該細胞類型以及疾病發展之快速程度。該等子集為：M0，骨髓母細胞，進行特殊分析；M1，骨髓母細胞，未成熟；M2，骨髓母細胞，成熟；M3，前骨髓球；M4，骨髓單核球；M5，單核球；M6，紅白血病；及M7，巨核球。VLA-4抗體可與尤其適於AML亞型之第二劑一起投與。舉例而言，急性前骨髓細胞性白血病(APL)及急性單核球性白血病為需要與其他AML亞型不同之治療的AML亞型。用於治療APL之第二劑可包括全反式視黃酸(ATRA)或抗代謝物，諸如阿糖胞苷。用於治療急性單核球性白血病之第二劑可包括去氧腺苷類似物，諸如2-氯-2'-去氧腺苷(2-CDA)。
AML之風險因素包括存在某些遺傳性病症，諸如唐氏症候群(Down syndrome)、範可尼貧血症(Fanconi anemia)、舒-戴二氏症候群(Shwachman-Diamond syndrome)及其他。患有AML及遺傳性病症之患者可投與VLA-4結合抗體及第二劑以治療該遺傳性病症之症狀。舉例而言，患有AML及範可尼貧血症之患者可投與VLA-4結合抗體及抗生素。
AML之其他風險因素包括用於治療不同的癌症的化學療法或放射療法、抽菸及暴露於大量苯。
適合用α4結合抗體治療之其他癌症包括實體腫瘤，諸如肉瘤及癌瘤(例如，纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤)、尤文 氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、卵巢癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威爾姆氏瘤(Wilm's tumor)、子宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、小細胞肺癌、上皮癌、膠質瘤、星形細胞瘤、骨髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡突神經膠質瘤、許旺氏細胞瘤(schwannoma)、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤)。
XII.其他病症
本文中所描述之調配物及方法亦可用於治療其他炎症性、免疫性或自體免疫性病症，例如中樞神經系統炎症(例如，除多發性硬化症、腦膜炎、視神經脊髓炎、神經結節病、CNS血管炎、腦炎及橫貫性脊髓炎以外)；組織或器官移植物排斥反應或移植物對抗宿主病；急性CNS損傷，例如中風或脊髓損傷(SCI)；慢性腎病；過敏反應，例如過敏性哮喘、中度至重度過敏性鼻炎、眼部過敏；1型糖尿病；炎症性腸病，例如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎(例如，用於治療或維持緩解)；癲癇症；嗜酸性球性胃腸炎；重症肌無力；纖維肌痛；與風濕病學/免疫學相關之病症，諸如關節炎性病症，例如類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎；皮膚病學疾病，諸如炎症性/免疫性皮膚病，例如牛皮癬、白癜風、皮炎(例如異位性皮炎)、扁平苔癬、中度至重度慢性蕁麻疹；系統性紅斑狼瘡(SLE；例如，狼瘡性腎炎)；硬皮病(例如，進行性全身性硬化(PSS)，諸如肺PSS)；急性或慢性原發性嗜酸性球性肺炎；休格倫氏症候群；急性冠狀動脈症候群(ACS)；急性心肌梗死；動脈粥樣硬化；及纖維化病症，例如肺纖維化(例如，特發性肺纖維化)、肺部纖維化(例如，XRT誘導型)、骨髓纖維化、肝硬化、腎小球膜增生性腎小球性腎炎、新月體性腎小球腎炎、糖尿病性腎病及腎間質纖維化。在一較佳實施例中，該調配物可用於治療癲癇症。
本文中所描述之調配物及方法亦可用於治療神經系統病症，諸如大腦局部缺血，包括在患者中預防短暫性局部缺血性發作及/或動脈狹窄。其他例示性神經系統病症包括慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經病(CIDP)；格林-巴利症候群(Guillian-Barre Syndrome，GBS)；眼部疾病，諸如黃斑部變性(例如，濕性黃斑變性)及前部缺血性視神經病變；神經性疼痛(例如，症狀性神經性疼痛)；阿茲海默氏病；肌萎縮性側索硬化症(ALS)(例如，疾病調節性ALS)及帕金森氏病。
本文中所描述之調配物及方法亦可用於治療已進行移植，諸如腎、心臟或骨髓移植之患者。
XIII.多發性硬化症
含有本文中所描述之α4結合抗體之調配物可用於治療炎症性疾病，諸如多發性硬化症(MS)。多發性硬化症為以炎症及髓鞘喪失為特徵之中樞神經系統疾病。
可藉由如MS診斷研討會所定義之確定臨床確定性MS之診斷的準則來鑑定患有MS之患者(Poser等人，Ann.Neurol.13：227,1983)。舉例而言，患有臨床確定性MS之個體必須具有兩次發作及兩個病變之臨床證據或一個病變之臨床證據及另一獨立病變之近似臨床證據。確定性MS亦可藉由兩次發作及腦脊髓液中IgG寡株帶之證據或藉由發作、兩個病變之臨床證據及腦脊髓液中IgG寡株帶之組合來診斷。亦可使用麥當勞準則(McDonald criteria)來診斷MS。(McDonald等人，2001,「Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis：guidelines from the International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis,」Ann.Neurol.50：121-127)。麥當勞準則包括在不存在多次臨床發作之情況下使用欲用於診斷MS之一定時間內CNS損傷之MRI證據來診斷MS。可用若干種不同的方式評估多發性硬化症之有效治療。可使用以下參數規定治療有效性。兩個例 示性準則包括：EDSS(擴展型失能狀態量表)以及MRI(磁共振成像)上出現惡化。EDSS為用於對由於MS引起之臨床損傷進行分級的方法(Kurtzke,Neurology 33：1444,1983)。評估八種功能系統之神經損傷類型及嚴重程度。簡而言之，在治療之前，評估患者以下系統中之損傷：錐體、小腦、腦幹、感覺、腸及膀胱、視覺、大腦及其他。在限定間隔進行隨訪。標度在0(正常)至10(由於MS導致死亡)之範圍內。減少一個完整步驟指示有效治療(Kurtzke,Ann.Neurol.36：573-79,1994)。亦可使用熟習此項技術者使用之其他準則來診斷患者。
惡化定義為出現可歸因於MS之新症狀且伴有適當新神經異常(IFNB MS研究組，同上)。另外，惡化必須持續至少24小時，並且在穩定或改良之前至少持續30天。簡而言之，由臨床醫生給患者進行標準神經系統檢查。根據神經學分級標度之變化，惡化為輕度、中度或重度(Sipe等人，Neurology 34：1368,1984)。確定年度惡化率及無惡化患者之比例。
對於此等量測中之任一者，若治療組與安慰劑組之間在無惡化或無復發患者之比率或比例方面存在統計上顯著之差異，則可認為治療為有效的。另外，亦可量測首次惡化之時間以及惡化持續時間及嚴重程度。就此而言，治療有效性之量度為治療組與對照組相比在首次惡化時間或持續時間及嚴重程度方面存在統計上顯著的差異。無惡化或無復發時段超過一年、18個月或20個月尤其值得注意。亦可使用此項技術中使用的任何方法來評定效力，例如以評定MS之症狀，包括使用單獨或與其他準則組合使用的計時步行測試評定活動性改良。
亦可基於以下準則中之一或多個來評估投與第一劑及視情況第二劑之效力：藉由限制稀釋測定之MBP反應性T細胞之頻率、MBP反應性T細胞株及純系之增殖反應、自患者測定之T細胞株及純系對MBP之細胞介素概況。藉由反應細胞頻率降低、與天然細胞相比存在胸苷併入減少與肽改變以及TNF 及IFN-
Figure 108119374-A0305-02-0113-56
減少來指示效力。
臨床量度包括一年及兩年間隔內之復發率，以及EDSS之變化，包括持續六個月之EDSS自基線進展1.0單位之時間。在克普蘭-麥爾曲線上，失能持續進展之延遲顯示效力。其他準則包括MRI上T2影像之面積及體積之變化，以及由釓增強影像確定之病變數目及體積。
MRI可用於使用釓-DTPA增強成像量測活動性病變(McDonald等人，Ann.Neurol.36：14,1994)或使用T2加權技術量測病變位置及程度。簡言之，獲得基線MRI。各後續研究使用相同成像平面及患者位置。可選擇定位及成像序列以使病變偵測最佳化並有助於病變追蹤。相同定位及成像序列可用於後續研究。放射科醫師可確定MS病變之存在、位置及程度。可概述病變區域並針對總病變區域逐片求和。可進行三種分析：新病變證據、活動性病變出現率、病變區域變化百分比(Paty等人，Neurology 43：665,1993)。由於治療達成之改良可由個別患者中與基線相比或治療組相對於安慰劑組中存在統計學上顯著之改良來確定。
可用本文中所描述之方法治療之與多發性硬化症相關之例示性症狀包括：視神經炎、複視、眼球震顫、眼辨距不良、核間性眼肌麻痹、動作及聲音光幻視、瞳孔傳入缺陷、局部麻痹、單肢輕癱、下肢輕癱、輕偏癱、四肢輕癱、癱瘓、截癱、偏癱、四肢癱瘓、四肢麻痹、痙攣、構音障礙、肌肉萎縮、肌痙攣、抽筋、肌張力低下、陣攣、肌陣攣、肌纖維震顫、不寧腿症候群、足下垂、反射功能障礙、感覺異常、麻木、神經痛、神經病理性及神經原性疼痛、拉赫米特氏病徵(l'hermitte's)、本體感受性功能障礙、三叉神經痛、運動失調、意向性震顫、辨距不良、前庭性共濟失調、眩暈、語言共濟失調、張力障礙、輪替運動障礙、頻繁排尿、膀胱痙攣、弛緩性膀胱、逼尿肌-括約肌協同失調、勃起功能障礙、性快感缺乏、性冷淡、便秘、便急、大便失禁、抑鬱、認知功 能障礙、癡呆、情緒起伏、情緒不穩、欣快症、雙極性症候群、焦慮、失語症、語言障礙、疲勞、烏特霍夫氏症狀、胃食道回流及睡眠障礙。
各MS案例顯示若干呈遞模式及後續過程之一。最通常地，MS首先將自身體現為一系列發作，繼之以完全或部分緩解，因為症狀會神秘地減輕，僅在穩定一段時間後方能恢復。此稱為復發性緩解性(RR)MS。臨床孤立症候群(CIS)為MS之另一種復發性形式。CIS係指首先急性發作持續至少24小時之神經系統症狀且由中樞神經系統(CNS)中之炎症或脫髓鞘(覆蓋神經細胞之髓鞘脫落)引起。原發性進行性(PP)MS之特徵在於平緩臨床減輕而無明顯緩解，但可能存在暫時性平台期或輕微症狀緩解。當患者經歷偶發性復發或MRI上有新病變之證據時發生活動性原發性進行性MS。「不活動」或「有進展」意謂有證據表明症狀隨時間而惡化，有或無復發或MRI上顯示有或無新病變。繼發性進行性(SP)MS開始於復發性緩解性過程，繼之以稍後原發性進行性過程。活動性繼發性進行性MS被視為MS之復發性形式之一。少數情況下，患者可存在進行性復發性(PR)過程，其中該疾病採取進行性途徑間雜急性發作。PP、SP及PR有時歸併在一起且稱為慢性進行性MS。
因而，多發性硬化症之復發性形式(或簡稱為復發性多發性硬化症)包括但不限於臨床孤立症候群(CIS)、復發性緩解性多發性硬化症(RRMS)及活動性繼發性進行性多發性硬化症(活動性SPMS)。
少數患者經歷惡性MS，定義為迅速不間斷衰退，從而引起疾病發作後不久便嚴重失能或甚至死亡。可藉由投與本文中所描述之療法而使此衰退停滯或減速。
投與本文中所提供之抗α4抗體可有效緩解MS之一或多種症狀，諸如以上所描述之一或多種症狀。舉例而言，投與本文中所描述之抗α4抗體可用於治療原發性或繼發性進行性多發性硬化症(分別為PPMS或SPMS)，且用抗α4 抗體治療可對預防復發有效。
除人類研究以外或在進行人類研究之前，可使用動物模型來評估使用兩種劑之效力。用於多發性硬化症之例示性動物模型為實驗性自體免疫性腦炎(EAE)小鼠模型，例如，如(Tuohy等人，(J.Immunol.(1988)141：1126-1130)、Sobel等人，(J.Immunol.(1984)132：2393-2401)及Traugott(Cell Immunol.(1989)119：114-129)中所描述。在EAE誘導之前，可向小鼠投與本文中所描述之第一劑及第二劑。隨後針對特徵準則對小鼠進行評估以確定在模型中使用兩種劑之效力。
XIV.癲癇症
含有本文中所描述之α4結合抗體的調配物適用於治療癲癇症。
癲癇發作為由可藉由腦電圖或臨床手段偵測之異常放電神經元引起之陣發性發作，其中腦中受影響之特定部位影響臨床表現。癲癇發作根本上起因於神經元之基本興奮性不平衡，此可能與神經元膜或興奮性及抑制性過程有關。亦參見Holmes等人，Epilepsia 45(12)：1568-1579,2004)。癲癇在概念上定義為腦病症，其特徵在於產生癲癇發作之持久素因以及此病狀之神經生物學、認知、心理學及社會後果(Fisher R.S.,Curr Opin Neurol.28(2)：130-5,2015)。最近對癲癇症盛行率及發病率之綜述報告終生盛行率為每1000人有7.6人，且年度累積發病率為每100,000人中67.77人(Fiest等人，Neurology 88(3)：296-303,2017)。
在本發明之前，用於癲癇症患者之常用療法為抗癲癇症藥物(AED)，且估計大約70%之患者利用AED療法達成良好癲癇發作控制。將未能耐受2次(或更多次)充分試驗且適當地選擇並使用AED之患者定義為患有抗藥性癲癇症(參見Kwan等人，Epilepsia.51(6)：1069-77,2010；及erratum in Epilepsia.51(9)：1922,2010)。對於此等患者，考慮其他療法，包括癲癇症手術、神經刺激裝置、專門化飲食、行為療法及其他實驗性治療。AED通常藉由調節電壓依賴性或配 位體閘控離子通道或藉由對抑制性或興奮性神經遞質系統之作用來起作用。目前，市面上存在超過20種可利用之AED。儘管近年已推出許多更新的AED，但新老藥物在控制癲癇症方面大體上同樣有效，且仍然很少有先前抗藥性癲癇症患者因利用更新的療法而變得無癲癇發作。
對開發可在抗藥性癲癇症中改良癲癇發作控制或消除癲癇發作之療法的需要仍然亟待滿足。靶向免疫系統及炎症在癲癇症發病機制中之潛在作用代表AED開發及臨床研究中未充分研究之領域。來自癲癇症實驗模型及人類癲癇症患者之證據表明炎症之作用。
本文中所揭示之調配物可用於治療癲癇症。舉例而言，可向罹患癲癇症之患者投與包含重組抗α4抗體或其α4結合片段之調配物，該抗體或其片段包含：(a)含有SEQ ID NO：80之序列的重鏈；及(b)含有SEQ ID NO：81之序列的輕鏈。假定阻斷α4整合素將減少白血球-血管相互作用並且使BBB完整性穩定。另外，假設由癲癇發作誘導之癲癇症減輕白血球-血管相互作用將降低癲癇發作頻率及嚴重程度。
XV.抗體產生
可藉由活體內或活體外方法，諸如噬菌體呈現來產生結合至α4之重組抗體。該等方法可用於提供抗α4 CDR以用於本文中所描述之CDR移植抗體中。另外，在本文中所揭示之生殖系構架的情況下可使用諸如噬菌體呈現之方法來選擇該等CDR，例如藉由使用構架為生殖系構架之庫。
EP 239 400(Winter等人.)描述藉由將一個物種之互補性決定區(CDR)取代(在指定可變區內)為另一物種之互補性決定區來改變抗體。經CDR取代之抗體與真嵌合抗體相比不太可能在人類中引發免疫反應，因為經CDR取代之抗體含有顯著較少之非人類組分。(Riechmann等人，1988,Nature 332,323-327；Verhoeyen等人，1988,Science 239,1534-1536)。通常，藉由使用重組 核酸技術將鼠類抗體之CDR取代至人類抗體中之相應區域中以產生編碼所要經取代抗體之序列。可添加所要同型(通常，對於CH為γI且對於CL為κ)之人類恆定區基因區段，且可在哺乳動物細胞中共表現重鏈及輕鏈基因以產生可溶性抗體。大型非免疫噬菌體呈現庫亦可用於分離高親和力抗體，可使用標準噬菌體技術將其開發為人類治療劑(參見例如Hoogenboom等人，(1998)Immunotechnology 4：1-20；及Hoogenboom等人，(2000)Immunol Today 2：371-8；U.S.2003-0232333)。
本文中所描述之抗α4抗體或抗體片段可識別並特異性地結合至α4次單元中參與結合至同源配體，例如VCAM-1或纖維連接蛋白。在一些實施例中，抗α4抗體或其抗體片段識別並特異性地結合至α4整合素之B抗原決定基。本文中所描述之抗體之結合可抑制α4整合素結合至一或多個同源配位體(例如VCAM-1及纖維連接蛋白)。
在一些實施例中，本文中所提供之抗體可與細胞(例如淋巴球)上之VLA-4相互作用，但不會引起細胞聚集。
例示性α4結合抗體具有一或多個CDR，例如，本文中所揭示之特定抗體之所有三個重鏈(HC)CDR及/或所有三個輕鏈(LC)CDR，或者總體上與此種抗體具有至少80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性的CDR。在一個實施例中，H1及H2高變環具有與本文中所描述之抗體相同的典型結構。在一個實施例中，L1及L2高變環具有與本文中所描述之抗體相同的典型結構。
在一個實施例中，HC及/或LC可變域序列之胺基酸序列與本文中所描述之抗體之HC及/或LC可變域之胺基酸序列具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性。HC及/或LC可變域序列之胺基酸序列可與本文中所描述之抗體的相應序列相差至少一個胺基酸，但不超過 十、八、六、五、四、三或二個胺基酸。舉例而言，差異可能主要或完全在構架區中。
HC及LC可變域序列之胺基酸序列可由在高嚴格度條件下與本文中所描述之核酸序列雜交的核酸序列或者編碼本文中所描述之可變域或胺基酸序列的核酸序列編碼。在一個實施例中，HC及/或LC可變域之一或多個構架區(例如，FR1、FR2、FR3及/或FR4)之胺基酸序列與本文中所描述之抗體之HC及LC可變域之相應構架區具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性。在一個實施例中，一或多個重鏈或輕鏈構架區(例如，HC FR1、FR2及FR3)與來自人類生殖系抗體之相應構架區之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或100%一致性。
如下計算兩個序列之間的「同源性」或「序列一致性」(該等術語在本文中可互換使用)。出於最佳比較目的將序列對準(例如，可在第一及第二胺基酸或核酸序列之一或二者中引入空位以達成最佳對準，且出於比較目的，可忽略非同源序列)。使用GCG套裝軟體中之GAP程式以Blossum 62評分矩陣將最佳對準確定為最佳評分，其中空位罰分為12，空位延伸罰分為4，且框移空位罰分為5。隨後比較相應胺基酸位置或核苷酸位置之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之位置被與第二序列中之相應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔用時，則該等分子在該位置上一致(如本文中所使用，胺基酸或核酸「一致性」等效於胺基酸或核酸「同源性」)。兩個序列之間的一致性百分比為該等序列共用之一致位置數目的函數。
如本文中所使用，術語「在高嚴格度條件下雜交」描述雜交及洗滌之條件。關於進行雜交反應之指導可見於Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中，該參考文獻係以引用之方式併入。該參考文獻中描述水性及非水性方法，且可使用任一種。高嚴格度雜交條件包 括在約45℃下在6X SSC中雜交，繼而在65℃下在0.2X SSC、0.1% SDS中或實質上相似之條件下進行一或多次洗滌。
XVI.抗體產生
可在原核生物及真核生物細胞中產生抗體。在一個實施例中，抗體(例如scFv)表現於諸如畢赤氏酵母(Pichia)(參見例如Powers等人，(2001)J.Immunol.Methods 251：123-35)、漢遜酵母(Hanseula)或酵母菌(Saccharomyces)之酵母細胞中。
在一個實施例中，在哺乳動物細胞中產生抗體，尤其全長抗體，例如IgG。用於重組表現之例示性哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括dhfr-CHO細胞，描述於Urlaub及Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中，與DHFR可選擇標記物一起使用，例如，如Kaufman及Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所描述)、淋巴球細胞株，例如NS0骨髓瘤細胞及SP2細胞、COS細胞、K562及來自轉殖基因動物，例如轉殖基因哺乳動物之細胞。舉例而言，該細胞為乳房上皮細胞。
除編碼免疫球蛋白結構域之核酸序列以外，重組表現載體亦可攜帶額外核酸序列，諸如調控載體在宿主細胞中複製之序列(例如，複製起點)及可選擇標記基因。可選擇標記基因有助於選擇已引入載體之宿主細胞(參見例如美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號)。例示性可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主細胞中用於胺甲喋呤選擇/擴增)及neo基因(用於G418選擇)。
在用於重組表現抗體(例如，全長抗體或其抗原結合部分)之例示性系統中，藉由磷酸鈣介導之轉染將編碼抗體重鏈及抗體輕鏈二者之重組表現載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組表現載體內，抗體重鏈及輕鏈基因各自可操作地連接至增強子/啟動子調控元件(例如，來源於SV40、CMV、腺病毒及其類似物， 諸如CMV增強子/AdMLP啟動子調控元件或SV40增強子/AdMLP啟動子調控元件)以驅動該等基因之高水準轉錄。重組表現載體亦攜帶DHFR基因，其允許使用胺甲喋呤選擇/擴增來選擇已轉染有該載體之CHO細胞。培養所選擇之轉型宿主細胞以允許表現抗體重鏈及輕鏈，並且自培養基中回收完整抗體。使用標準分子生物學技術製備重組表現載體、轉染宿主細胞、選擇轉型體、培養宿主細胞以及自培養基中回收抗體。舉例而言，一些抗體可藉由用蛋白A或蛋白G進行親和層析來分離。舉例而言，可使用此項技術中已知的蛋白質濃縮技術將經純化之α4結合抗體濃縮至約100mg/mL至約200mg/mL。
抗體亦可包括修飾，例如改變Fc功能之修飾，例如以減少或移除與Fc受體或與C1q或兩者之相互作用。舉例而言，人類IgG4恆定區可在殘基228處具有Ser至Pro突變以固定鉸鏈區。IgG4 Fc(鉸鏈+CH2+CH3結構域)之胺基酸序列提供於圖5中。
在另一實例中，人類IgG1恆定區可在一或多個殘基，例如殘基234及237中之一或多個處突變，例如，根據美國專利第5,648,260號之編號。其他例示性修飾包括美國專利第5,648,260號中所描述之修飾。
對於包括Fc結構域之一些抗體，可設計抗體產生系統以合成Fc區糖基化之抗體。在另一實例中，IgG分子之Fc結構域在CH2結構域中之天冬醯胺297處糖基化(參見圖5)。此天冬醯胺為用雙觸角型寡糖修飾之位點。此糖基化參與由Fc(受體及補體C1q介導之效應功能(Burton及Woof,(1992)Adv.Immunol.51：1-84；Jefferis等人，(1998)Immunol.Rev.163：59-76)。可在適當地使對應於天冬醯胺297之殘基糖基化的哺乳動物表現系統中產生Fc結構域。Fc結構域亦可包括其他真核生物轉譯後修飾。
其他適合之Fc結構域修飾包括WO2004/029207中所描述之彼等修飾。舉例而言，Fc結構域可為XMAB® Fc(Xencor，Monrovia，CA)。Fc結構域 或其片段可在Fcγ受體(FcγR)結合區中具有取代，諸如WO05/063815中所描述之結構域及片段。在一些實施例中，Fc結構域或其片段在新生兒Fc受體(FcRn)結合區中具有取代，諸如WO05047327中所描述之結構域及片段。在其他實施例中，Fc結構域為單鏈或其片段，或其經修飾形式，諸如WO2008143954中所描述者。其他適合之Fc修飾為已知的且描述於此項技術中。
亦可由轉殖基因動物產生抗體。舉例而言，美國專利第5,849,992號描述一種在轉殖基因哺乳動物之乳腺中表現抗體的方法。構築包括乳汁特異性啟動子及編碼相關抗體(例如本文中所描述之抗體)之核酸序列以及分泌信號序列的轉殖基因。由該等轉殖基因哺乳動物中之雌性產生之乳汁包括於其中分泌之相關抗體，例如本文中所描述之抗體。可自乳汁中純化抗體，或對於一些應用，直接使用。
抗體可經修飾，例如，具有使其穩定性及/或在循環中，例如在血液、血清、淋巴、支氣管肺泡灌洗液或其他組織中之滯留時間提高例如至少1.5、2、5、10或50倍的部分。
舉例而言，VLA-4結合抗體可與聚合物締合，例如實質上非抗原性聚合物，諸如聚環氧烷或聚氧化乙烯。適合之聚合物將實質上按重量而變化。可使用數目平均分子量在約200至約35,000道爾頓(或約1,000至約15,000及2,000至約12,500)範圍內之聚合物。
舉例而言，VLA-4結合抗體可結合至水溶性聚合物，例如親水性聚乙烯聚合物，例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯啶酮。該等聚合物之非限制性清單包括聚環氧烷均聚物，諸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物，條件為維持嵌段共聚物之水溶解度。其他適用聚合物包括聚氧化烯，諸如聚氧乙烯、聚氧丙烯及聚氧乙烯與聚氧丙烯之嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆(carbomers)；分支鏈或無分支鏈多糖，包 含糖單體D-甘露糖、D-半乳糖及L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如，聚甘露糖酸或海藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖及神經胺糖酸，包括同多糖及異多糖，諸如乳糖、支鏈澱粉、澱粉、羥乙基澱粉、直鏈澱粉、硫酸葡聚糖、聚葡萄糖、糊精、糖原或酸性黏多糖之多糖次單元，例如透明質酸；糖醇聚合物，諸如聚山梨糖醇及聚甘露糖醇；肝素或類肝素(heparon)。
XVII.例示性第二劑
在一些情況下，本文中所描述之調配物，例如含有α4結合抗體之調配物，包括第二劑，或與含第二劑之調配物組合投與。
在一個實施方式中，將α4結合抗體及第二劑提供為共調配物形式，並且該將共調配物投與個體。更有可能例如在投與共調配物前後至少24小時分別投與一劑量之α4結合抗體調配物，隨後投與一劑量之含第二劑之調配物。在另一實施方式中，將抗體及第二劑提供為單獨調配物，且投與步驟包括順序投與抗體及第二劑。順序投與可在同一天(例如，彼此相隔一小時內或相隔至少3、6或12小時)或在不同的日期提供。
一般而言，該抗體及該第二劑各自以時間上分開之複數個劑量投與。該抗體及該第二劑一般各自根據方案投與。用於一者或二者之方案可具有規律週期性。用於抗體之方案可具有與用於第二劑之方案不同的週期性，例如，一者可比另一者更頻繁地投與。在一種實施方式中，該抗體及該第二劑之一每週投與一次且另一者每個月投與一次。在另一實施方式中，該抗體及該第二劑之一連續投與，例如，在超過30分鐘但不足1、2、4或12小時之時段內，且另一者呈藥團形式投與。該抗體及該第二劑可藉由任何適當之方法，例如經皮下、肌肉內或靜脈內投與。
在一些實施例中，該抗體及該第二劑各自以與各自用於單一療法時 之處方劑量相同的劑量投與。在其他實施例中，以等於或低於單獨投與時達成效力所需之量的劑量投與該抗體。同樣，可以等於或低於單獨投與時達成效力所需之量的劑量投與該第二劑。
與α4結合抗體組合用於治療多發性硬化症之第二劑的非限制性實例包括：￭干擾素，例如人類干擾素β-1a(例如AVONEX®或REBIF®))及干擾素β-1b(BETASERONTM；在第17位經取代之人類干擾素β；Berlex/Chiron)；￭醋酸格拉替雷(亦稱為共聚物1、Cop-1；COPAXONETM；Teva Pharmaceutical Industries,Inc.)；￭RITUXAN®(利妥昔單抗(rituximab))或另一抗CD20抗體，包括與利妥昔單抗競爭或結合重疊抗原決定基之抗體；￭米托蒽醌(mixtoxantrone)(NOVANTRONE®，Lederle)；￭髓鞘再生劑，諸如奧匹奴單抗(opicinumab)；￭化學治療劑，例如克拉屈濱(clabribine)(LEUSTATIN®)、硫唑嘌呤(IMURAN®)、環磷醯胺(CYTOXAN®)、環孢黴素-A、胺甲喋呤、4-胺基吡啶及泰劄尼啶(tizanidine)；￭皮質類固醇，例如，甲基普賴松(MEDRONE®，Pfizer)、普賴松；￭免疫球蛋白，例如RITUXAN®(利妥昔單抗)；CTLA4 Ig；阿侖單抗(MABCAMPATH®)或達利珠單抗(結合CD25之抗體)；￭他汀類藥物；及￭TNF拮抗劑。
醋酸格拉替雷為由胺基酸麩胺酸、離胺酸、丙胺酸及酪胺酸之無規鏈形成的蛋白質(因此為GLATiramer)。醋酸格拉替雷可使用N-羧基胺基酸酐由此等胺基酸以約5份丙胺酸對3份離胺酸、1.5份麩胺酸及1份酪胺酸之比率在 溶液中合成。
額外第二劑包括其他人類細胞介素或生長因子，例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12 IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-11、GM-CSF、FGF及PDGF之抗體或拮抗劑。其他例示性第二劑包括針對諸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配位體之細胞表面分子的抗體。舉例而言，達利珠單抗為可改善多發性硬化症之抗CD25抗體。
其他例示性抗體包括提供本文中所描述之劑的活性的抗體，諸如嚙合干擾素受體，例如干擾素β受體之抗體。通常，在第二劑包括抗體之實施方式中，其特異性結合至除VLA-4以外或除α4整合素以外之靶蛋白質，或至少特異性結合至VLA-4上之抗原決定基而非由第一劑識別並特異性地結合的抗原決定基。
其他額外例示性第二劑包括：FK506、雷帕黴素、黴酚酸、來氟米特；非類固醇消炎藥(NSAID)，例如磷酸二酯酶抑制劑；腺苷激動劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、干擾如本文中所描述之促炎性細胞介素之信號傳導的劑、IL-1
Figure 108119374-A0305-02-0124-57
轉化酶抑制劑(例如Vx740)、抗P7、PSGL、TACE抑制劑；T細胞信號傳導抑制劑，諸如本文中所描述之激酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺吡啶、氮雜環丙胺、6-巰基嘌呤、血管緊張素轉化酶抑制劑、可溶性細胞介素受體及其衍生物；消炎性細胞介素(例如IL-4、IL-10、IL-13及TGF)。
在一些實施例中，第二劑可用於治療MS之一或多種症狀或副作用。該等劑包括例如金剛胺、貝可芬(baclofen)、罌粟鹼(papaverine)、美其敏(meclizine)、羥嗪、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、賽普沙辛(ciprofloxacin)、多庫酯(docusate)、佩默林(pemoline)、丹曲林(dantrolene)、去胺加壓素(desmopressin)、地塞米松(dexamethasone)、托特羅定(tolterodine)、苯妥英 (phenyloin)、奧昔布寧(oxybutynin)、比沙可啶(bisacodyl)、文拉法辛(venlafaxine)、阿米替林(amitriptyline)、六亞甲基四胺(methenamine)、克癇平錠(clonazepam)、異菸肼(isoniazid)、伐地那非(vardenafil)、硝化呋喃妥英(nitrofurantoin)、車前子親水膠漿(psyllium hydrophilic mucilloid)、前列地爾(alprostadil)、加巴噴丁(gabapentin)、去甲替林(nortriptyline)、帕羅西汀(paroxetine)、溴丙胺太林(propantheline bromide)、莫待芬寧(modafinil)、費洛克汀(fluoxetine)、非那吡啶(phenazopyridine)、甲基普賴松(methylprednisolone)、卡馬西平(carbamazepine)、伊米胺(imipramine)、二氮平(diazepam)、西地那非(sildenafil)、安非他酮(bupropion)及舍曲林(sertraline)。許多小分子第二劑具有介於150與5000道爾頓之間的分子量。
TNF拮抗劑之實例包括針對TNF(例如人類TNF
Figure 108119374-A0305-02-0125-59
)之嵌合、人類化、人類或活體外產生抗體(或其抗原結合片段)，諸如D2E7(人類TNF
Figure 108119374-A0305-02-0125-60
抗體，美國專利第6,258,562號；BASF)、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人類化抗TNF
Figure 108119374-A0305-02-0125-62
抗體；Celltech/Pharmacia)、cA2(嵌合抗TNF
Figure 108119374-A0305-02-0125-64
抗體；REMICADETM，Centocor)；抗TNF抗體片段(例如CPD870)；TNF受體之可溶性片段，例如p55或p75人類TNF受體或其衍生物，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白質，ENBRELTM；Immunex；參見例如Arthritis & Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.Med.(1996)第44卷，235A)、p55 kdTNFR-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白質(LENERCEPTTM))；酶拮抗劑，例如TNF
Figure 108119374-A0305-02-0125-65
轉化酶(TACE)抑制劑(例如，α-磺醯基異羥肟酸衍生物，WO 01/55112及N-羥基甲醯胺TACE抑制劑GW 3333、GW-005或GW-022)；及TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF結合蛋白；參見例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊),S284；Amer.J.Physiol.-Heart and Circulatory Physiology(1995)第268卷，第37-42頁)。
除第二劑以外，亦有可能向該個體遞送其他劑。然而，在一些實施 例中，除α4結合抗體及第二劑以外，未向該個體投與呈醫藥組合物形式之蛋白質或生物劑。α4結合抗體及第二劑可為藉由注射遞送之僅有劑。在第二劑為重組蛋白質之實施例中，α4結合抗體及第二劑可為投與個體之僅有重組劑，或至少為調節免疫或炎症反應之僅有重組劑。在其他實施例中，單獨α4結合抗體為投與個體之僅有重組劑或僅有生物劑。
除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語均具有與熟習本發明所屬領域之技術者通常所理解之含義相同的含義。儘管與本文中所描述之方法及材料類似或等效之方法及材料可用於實施或測試本發明，但以下描述適合之方法及材料。本文中所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻均以引用之方式整體併入。在矛盾之情況下，將以本說明書(包括定義)為準。另外，材料、方法及實例僅為說明性的且不意欲具有限制性。
實例
除非另外指示，否則此等實例中之所有胺基酸編號均使用EU編號。
實例1.變異抗VLA-4抗體比人類化HP1/2更有效.
對於VL鏈使用生殖系構架IGKV4-1(針對設計L1及L2)或生殖系工程化AAH7033.1(針對設計L3)且對於VH使用生殖系構架IGHV1-f來構築抗VLA-4抗體。此等抗體與美國專利第6,602,503號中所描述之人類化HP1/2抗體相比具有較少回復突變。
重鏈變異
重鏈之三種變異之序列作為設計H0、設計H1及設計H2示於圖1中。各設計將鼠類HP1/2之CDR移植至IGHV1-f構架中。設計H0不包括構架區回復突變，而設計H1及H2在構架區序列中具有不同程度之回復突變以使人類化抗體之親和力最佳化。
輕鏈變異
輕鏈之四種變異之序列作為設計L0、設計L1、設計L2及設計L3示於圖2中(亦稱為L0、L1、L2、L3)。各設計將鼠類HP1/2之CDR移植至生殖系構架中。IGKV4-1生殖系構架用於設計L0、L1及L2，而AAH70335生殖系工程化構架用於設計L3。設計L0不包括構架區回復突變，而設計L1、L2及L3在構架區序列中具有不同程度之回復突變以使人類化抗體之親和力最佳化。
競爭ELISA分析之結果示於表2及圖3中。在此實驗中，將α4β1與測試mAb一起預培育，隨後使用鼠類HP1/2作為競爭試劑。此實驗之結果指示具有輕鏈L2或L3之抗體比美國專利第6,602,503號中所描述之抗體更有效。結果示於以下表2中及圖3中。用於此分析之抗體中的重鏈(H1)具有圖1中所示之「設計H1」序列，而L1係指圖2中之設計L1。
Figure 108119374-A0305-02-0127-17
在表2中，嵌合mAb為嵌合HP1/2抗體，其中鼠類可變重鏈及輕鏈基因融合至人類IgG1恆定區。此抗體在結合親和力方面與原始鼠類HP1/2抗體基本上相同(Sanchez-Madrid等人，Eur.J.Immunol.16：1343-1349,1996)。實驗結果指示藉由對生殖系工程化受體構架進行人類化有可能使單株抗體之親和力相對於其鼠類親本序列有所提高。
另一競爭分析法比較新抗體與U.S.5,840,299中所描述之人類化21.6抗α4抗體(TYSABRI®(那他珠單抗))之結合親和力。在此實驗中，分析小鼠HP1/2與測試mAb之混合物與α4β1之結合。此實驗之結果如圖4中及以下表3中所示，且指示新設計之抗體的效力比那他珠單抗高約10倍。
Figure 108119374-A0305-02-0128-18
實例2.人類化HP1/2(HuHP1/2)結合腫瘤細胞株上之VLA-4.
藉由流式細胞術測試抗VLA-4抗體HuHP1/2與多種細胞株之結合。在CLL(慢性淋巴球性白血病)細胞株Mec1及JM1上、MM(多發性骨髓瘤)細胞株U266及H929上以及AML(急性骨髓性白血病)細胞株HL60及KG1測試結合。HuHP1/2結合所有測試腫瘤細胞株(圖6)。使用流式細胞術資料計算抗體與各不同的細胞株結合之EC50值。此資訊示於以下表4中。
亦發現HuHP1/2阻斷AML細胞株黏附至纖維連接蛋白(FN)及VCAM1-Ig融合蛋白。為了測試抗體是否可阻斷黏附，在增加濃度之HP1/2或同型對照抗體存在下使AML細胞株HL60或KG1黏附至經FN塗覆之孔(圖7A)或經VCAM1-Ig塗覆之孔(圖7B)。HuHP1/2阻斷兩種細胞類型黏附至經FN塗覆之孔及經VCAM1-Ig塗覆之孔。用20ug/ml HuHP1/2達成對HL60細胞與兩種配位體結合之最大抑制(圖7C)。
亦發現HuHP1/2阻斷MM細胞株黏附至FN及VCAM1-Ig融合蛋白。在增加濃度之HP1/2或同型對照抗體存在下使MM細胞株U266及H929黏附至經FN塗覆之孔(圖8A)或經VCAM1-Ig塗覆之孔(圖8B)。HuHP1/2阻斷兩種細胞株類型黏附至經FN塗覆之孔及經VCAM1-Ig塗覆之孔。用20μg/ml HuHP1/2達成對U266細胞與兩種配位體結合之最大抑制(圖8C)。
亦發現HuHP1/2阻斷CLL細胞株黏附至FN及VCAM1-Ig融合蛋白。在增加濃度之HP1/2或同型對照抗體存在下使CLL細胞株Mec1及JM1黏 附至經FN塗覆之孔(圖9A)或經VCAM1-Ig塗覆之孔(圖9B)。HuHP1/2阻斷兩種細胞株類型黏附至經FN塗覆之孔及經VCAM1-Ig塗覆之孔。用20μg/ml HuHP1/2達成對Mec1細胞與兩種配位體結合之最大抑制(圖9C)。
由圖7至圖9中所示之資料計算HuHP1/2與腫瘤細胞株結合之IC50值。此等資料示於表4中。
Figure 108119374-A0305-02-0129-19
用於實例3至實例13之材料及方法
貫穿實例3至實例13，除非另外闡述，否則使用以下材料及方法。
一般而言，除非另外指示，否則本發明之實踐採用習知化學技術、分子生物學技術、重組DNA技術、免疫學技術(特定言之，例如抗體技術)及標準電泳技術。參見例如Sambrook,Fritsch及Maniatis,Molecular Cloning：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：A Practical Approach(Practical Approach Series,169),McCafferty編，IrI Pr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow等人，C.S.H.L.Press,Pub.(1999)；及Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人編，John Wiley & Sons(1992)。
親本抗體
為了產生本文中所揭示之穩定抗體，將編碼模型人類抗體(例如hu5c8)、其變異抗體或相應Fc區之聚核苷酸引入標準表現載體中。人類抗體hu5c8及其變異體描述於例如美國專利第5,474,771號及第6,331,615號中。以下 分別提供hu5c8 IgG4重鏈(SEQ ID NO：52)、hu5c8輕鏈(SEQ ID NO：53)、hu5c8 Fab(SEQ ID NO：54)、來自親本IgG4抗體之完整Fc部分(SEQ ID NO：55)、具有S228P突變之親本IgG4 Fc部分(SEQ ID NO：56)及具有S228P/T299A突變之親本無糖基化IgG4 Fc部分(SEQ ID NO：57)的胺基酸序列。重鏈之前導序列為MDWTWRVFCLLAVAPGAHS。亦提供親本IgG1無糖基化hu5c8抗體之重鏈(SEQ ID NO：58)及Fc部分(SEQ ID NO：59)序列。
Hu 5c8 IgG4重鏈(EAG1807)(SEQ ID NO：52)
Figure 108119374-A0305-02-0130-20
Hu 5c8輕鏈(SEQ ID NO：53)
Figure 108119374-A0305-02-0130-21
Figure 108119374-A0305-02-0131-22
Hu 5c8 VH/CH1結構域(SEQ ID NO：54)
Figure 108119374-A0305-02-0131-23
親本IgG4 Fc部分(SEQ ID NO：55)
Figure 108119374-A0305-02-0131-24
具有S228P突變之親本IgG4 Fc部分(SEQ ID NO：56)
Figure 108119374-A0305-02-0131-25
具有S228P/T299A突變之親本IgG4無糖基化Fc部分(YC407)(SEQ ID NO：57)
Figure 108119374-A0305-02-0131-26
Figure 108119374-A0305-02-0132-27
親本IgG1無糖基化Fc部分(SEQ ID NO：58)
Figure 108119374-A0305-02-0132-28
具有S228P/N297Q突變之親本IgG4無糖基化Fc(EAG2412)(SEQ ID NO：59)
Figure 108119374-A0305-02-0132-29
親本IgG1(SEQ ID NO：60)
Figure 108119374-A0305-02-0132-30
實例3.穩定性增加IgG Fc突變之合理設計
無糖基化抗體代表一類重要治療試劑，其中不需要免疫效應功能。 然而，已充分確定移除IgG1及IgG4中之CH2相關寡糖影響抗體構形及穩定性。抗體喪失穩定性可能會帶來不利地影響計畫時間線及資源之方法開發挑戰。吾等在本文中詳細描述用於設計CH2及CH3中之胺基酸位置庫以增加IgG Fc之穩定性的許多方法。此實例中所指示之所有編號均為EU編號。
A.無效應因子IgG之協變及殘基頻率設計：IgG4 CH2結構域
如先前所描述用不同的Cl類Ig摺疊序列資料庫進行協變分析(參見例如PCT公開案第WO2007109254號；Wang等人，2009,Proteins 76：99,2009)。亦如先前所描述進行Cl類Ig摺疊序列之編譯及基於結構/HMM之比對(PCT公開案第WO2007109254號，該案係以引用之方式整體併入本文中)。協變分析由關於發現一對胺基酸如何共同保守或不共同保守於特定蛋白質序列內的相關係數φ值之資料集組成，φ值在-1.0至1.0之範圍內。φ值為1.0指示當發現一個胺基酸處於序列子集內之一個位置時，發現不同殘基位置之另一胺基酸亦始終存在於該子集中。φ值為-1.0指示當發現一個胺基酸處於序列子集內之一個位置時，發現不同殘基位置之另一胺基酸決不存在於該序列子集中。發現絕對φ值大於0.2對於所分析之資料集有統計意義(PCT公開案第WO2007109254號；Wang等人，2009，同上)。基於在該資料集情況下之經驗，φ值>0.25被認為有意義(亦即，胺基酸配對共存可能有物理原因)，而φ值>0.5被認為極強且可能由於重要功能或結構原因而共同保守。
對於此研究，使用來自IgG4之CH2序列作為查詢序列，且使用φ值>0.3作為用於依據協變鑑定突變之截止值。由協變分析鑑定之殘基列於表5.1中(貫穿實例3其餘部分詳細描述之所有後續殘基均列於表5.1中)。在表5.1中，參考各殘基提供該位置處之所要胺基酸取代，根據EU編號系統。「基本原理」係指所採用之設計方法。協變及殘基頻率詳細描述於美國專利申請案第11/725,970號中。額外協變關聯數目係指由突變至指定位置處之所列出胺基酸類 型而形成之額外協變關係減去由進行此取代而損失之協變關係數目。額外協變關聯數目意欲為建議協變突變之品質的另一量度。在不存在占優相關額外協變關聯數目時建議多個胺基酸取代之情況下，在此位置使用庫方法，其中使用Delphia熱攻擊測試(詳細描述於實例4中)篩檢所有20個胺基酸。使用此方法，鑑定六個胺基酸位置具有所建議之特定協變突變：L242P(意謂第242位之L變成P)、Q268D、N286T、T307P、Y319F及S330A。另外，鑑定五個殘基位置具有多個所要(正額外協變關聯)取代，且利用庫方法。此等位置為：D270、P271、E294、A299及N315。
已成功使用基於蛋白質摺疊內個別位置之殘基頻率分析來改良穩定性的方法(Steipe,2004；Demarest等人，2006)，且先前描述於關於抗LTβR抗體BHA10 VH及VL結構域內之庫位置的鑑定的專利申請案BGNA242-1「STABILIZED POLYPEPTIDES AND METHODS FOR EVALUATING AND INCREASING THE STABILITY OF SAME」中。使用殘基頻率分析來鑑定穩定性增加突變之五個殘基位置：N276S、K288R、V308I、S324N及G327A。另外，在協變產生及殘基頻率突變中由PCR誤差產生兩個殘基：L309及N325。
Figure 108119374-A0305-02-0134-31
Figure 108119374-A0305-02-0135-32
B.用於無效應因子IgG之結構分析設計
除藉由協變及殘基頻率分析設計突變以外，完整人類IgG b.12抗體之公開晶體結構之結構分析(pdb碼：1hzh；參考文獻：Saphire,E.O.等人，(2001) Crystal structure of a neutralizing human IGG against HIV-I：a template for vaccine design.Science 293：1155-1159)。結構分析鑑定可加以調節以改良IgG分子之穩定性的特定結構品質。為了改變IgG4分子之穩定性以更接近IgG1之穩定性，進行許多突變以補償IgG1與IgG4分子之間的結構差異。一個此種突變位於IgG4中之延伸環中，E269。使用庫方法來篩檢可能補償此環之額外長度的殘基。此環亦經受如此實例部分C中詳細描述之其他變化。
CH3結構域之間的界面構成IgG分子Fc結構域中之最大蛋白質-蛋白質接觸區。介於IgG1與IgG4之間的此界面中之單一取代差異位於殘基409處。在IgG1中，離胺酸位於第409位，且在IgG4分子中，精胺酸位於第409位。設計IgG4中之R409取代為IgG1 K409以引入IgG1 CH3之所觀測之優越穩定性品質。亦設計R409M及R409I以檢驗此理論。為了更好地適應IgG4 CH3界面中所添加之精胺酸之體積，在來自相對CH3結構域之接觸殘基D399處進行許多突變：D399E及D399S(圖11A)。藉由取代此位置之較小側鏈，相對CH3結構域可更好地適應所添加之精胺酸之體積並增加CH3結構域之總體穩定性。使用另一方法設計增加CH3界面之疏水性以增加兩個相互作用結構域之間的締合(Y349F、T350V及T394V)以及增加界面側鏈之體積(F405Y)的突變。亦設計突變以測試位於與1hzh晶體結構中碳水化合物之接觸位點附近的殘基(V264、R292、V303)以及CH3/CH2界面附近之H310的穩定性。一組表面暴露之麩醯胺酸殘基(Q268、Q274及Q355)亦為許多改變總體表面電荷之突變的焦點。將相同方法用於E419。
最後，用於解釋嗜熱性蛋白質之熱穩定性增加的最常用機制之一涉及蛋白質內部核心之更緊密堆疊(參考文獻：Jaenicke,R.及Zavodszky,P.1990.Proteins under extreme physical conditions.FEBS Lett.268：344-349)。為了概括此現象，用異白胺酸或苯丙胺酸取代在CH2及CH3之「纈胺酸核心」中發現之纈 胺酸殘基。根據額外分支側鏈及較大相關體積預計穩定性增加。CH2中之「纈胺酸核心」為全部定向至CH2結構域之相同近端內部核心中的五個纈胺酸殘基(V240、V255、V263、V302及V323)。對於CH3，觀測到類似「纈胺酸核心」(V348、V369、V379、V397、V412及V427)。另外，使L351及L368突變至更高度分支化之疏水性側鏈。
C.無效應因子IgG之協變設計：基於在其他C類Ig結構域中觀測之協變模式在CH2糖基化位點附近進行協同突變.
IgG CH2結構域共同保守許多殘基以維持與EU第N297位處N連接之碳水化合物的相互作用以及與CD16、CD32及CD64之各種FcγR形式的相互作用。移除碳水化合物引起IgG-Fc顯著減少FcγR結合(Taylor及Garber,2005)。關於本文中所描述之設計，藉由用據發現在其他C類Ig摺疊結構域中共同保守之胺基酸進行取代來研究IgG-Fc內在N連接之碳水化合物附近之殘基的共同突變性。研究此等共同突變在存在及不存在N連接之碳水化合物之情況下對FcγR結合及對CH2結構域穩定性之影響，因為有可能此等修飾在無糖基Fc內可尤其良好地耐受且可減少無糖基Fc部分及糖基化Fc部分中與FcγR之相互作用。
對於可能與N連接之碳水化合物相互作用重要之殘基為此研究之焦點。使用與FcγRIIIa結合之IgG1-Fc之公開晶體結構及程式MOLMOL鑑定與N297處之碳水化合物直接接觸的IgG1-C^殘基(Sondermann,P.,Huber,R.,Oosthuizen,V.,Jacob,U.(2000)The 3.2 Ä crystal structure of the human IgG1 Fc fragment-FcgRIII complex.Nature,406：267-273；Koradi,R.,Billeter,M.及Wuthrich,K.(1996)MOLMOL：a program for display and analysis of macromolecular structures.J.Mol.Graph.14：51-55)。此等胺基酸為協變分析及設計之焦點。
如先前所描述進行Cl類Ig摺疊序列之編譯及基於結構/HMM之比對 (PCT公開案第WO2007109254號)。亦如先前所描述用不同的Cl類Ig摺疊序列資料庫進行協變分析(PCT公開案第WO2007109254號；Wang等人，2009，同上)。協變分析由關於發現一對胺基酸如何共同保守或不共同保守於特定蛋白質序列內的相關係數φ值之資料集組成，φ值在-1.0至1.0之範圍內。φ值為1.0指示當發現一個胺基酸處於序列子集內之一個位置時，發現不同殘基位置之另一胺基酸亦始終存在於該子集中。φ值為-1.0指示當發現一個胺基酸處於序列子集內之一個位置時，發現不同殘基位置之另一胺基酸決不存在於該序列子集中。發現絕對φ值大於0.2對於所分析之資料集有統計意義(PCT公開案第WO2007109254號；Wang等人，2009，同上)。基於在該資料集情況下之經驗，φ值>0.25被認為有意義(亦即，胺基酸配對共存可能有物理原因)，而φ值>0.5被認為極強且可能由於重要功能或結構原因而共同保守。
基於結構分析，發現疏水性殘基V262及V264在CH2結構域表面上形成藉由N連接之碳水化合物與溶劑螯合之疏水性貼片。另外，V266為V262及V264附近之殘基，且為CH2結構域所特有的，但其存在於環中且自身埋入結構域內部。發現V262、V264及V266在IgG-C^結構域內高度共同保守，彼此之間具有高度顯著之相關係數(φ值：V262-V264=0.44；V262-V26=0.40；V264-V266=0.54)。在吾等基於結構之IgG恆定域序列比對中突出顯示該等殘基(圖11B)。
該三個纈胺酸殘基(262、264及266)亦與CR2結構域中形成獨特環結構之殘基(殘基267-271)具有強相關係數。此環比由其他IgG恆定域CL、CH1及CH3形成之共有環長兩個胺基酸。特定相關性在V262與E269及D270之間(分別φ值=0.38及0.31)、V264與S267、D268及E269之間(φ值分別=0.27、0.44及0.52)以及V266與S267之間(φ值=0.30)。基於此等相關性，吾等推測此環可能對定位含有N297及其碳水化合物之環以及定位已知對與FcγR相互作用重要 的含有殘基325-330的環而言非常重要(Sondermann等人，2000；Shields等人，2001)。
基於此等觀測結果，吾等生成諸多設計以研究此等位置對其他胺基酸類型之耐受性(亦即，對CH2結構域之摺疊及穩定性之影響)，尤其在無糖基-IgG中。吾等希望觀測之另一態樣為此等位點處之修飾可能對IgG之FcγR結合性質產生的影響。基於此等觀察結果在CH2結構域內進行的胺基酸變化列於表5.2中，且示於圖11C中之IgG-Fc結構上(Sondermann,P.,Huber,R.,Oosthuizen,V.,Jacob,U.(2000)The 3.2 A crystal structure of the human IgG1 Fc fragment-FcgRIII complex.Nature,406：267-273)。天然序列相對於含有所有突變之序列(SDE9)的比對示於圖11D中。
Figure 108119374-A0305-02-0139-33
 a進行A299K突變以中斷N連接之糖基化基元，從而產生無糖基-IgG。b天然序列相對於完全修飾序列之比對示於圖10D中。
D.支持突變
為了測試指定殘基位置處特定突變類型之特異性，吾等設計一系列額外突變。此等包括在顯示增加之穩定性的殘基位置測試不同的胺基酸類型(極性、疏水性及帶電)。吾等亦將測試所有穩定性增加突變對各種IgG同型及糖基化狀態之應用。此等突變列於表5.3中。
Figure 108119374-A0305-02-0140-34
E.額外多突變構築體
為了降低由具有穩定性突變T299K之肽產生的潛在T細胞抗原決定基及利用T307P及D399S穩定性突變與產生無糖基化IgG1及IgG4之其他突變 的組合，吾等亦將產生以下構築體(表5.4)。
Figure 108119374-A0305-02-0141-35
實例4.在大腸桿菌中產生之IgG Fc抗體結構域之熱穩定性篩檢
採用美國專利申請案第11/725,970號中所描述之改進型熱攻擊分析法作為穩定性篩檢，以測定在40℃下在pH 4.5下進行熱攻擊事件後保留的可溶性IgG Fc蛋白的量。
在誘導性ara C啟動子控制下用編碼pBRM012(IgG1)及pBRM013(具有S228P、T299A突變之IgG4)Fc之質體加C末端組胺酸標籤對大腸桿菌菌株W3110(ATCC，Manassas，Va.，目錄號27325)進行轉型。使轉型體在30℃下在由補充有0.6%甘胺酸、0.6% Triton X100、0.02%阿拉伯糖及50μg/ml羧苄青黴素之SB(Teknova，Half Moon Bay，Ca.，目錄號S0140)組成之表現培養基中生長隔夜。藉由離心使細菌成團，且收集上清液以進行進一步處理。
在熱攻擊之後，藉由離心移除聚集之材料，且藉由DELFIA分析法來分析經處理之澄清上清液中剩餘之可溶性Fc樣品與蛋白A(Sigma P7837)的結合。在37℃下將兩個96孔板(MaxiSorp，Nalge Nunc，Rochester，NY，目錄號437111)用含0.5μg/ml蛋白A之PBS塗覆一小時，隨後在室溫下在振盪下用DELFIA分析緩衝液(DAB，10mM Tris HCl、150mM NaCl、20μM EDTA、0.5% BSA、0.02% Tween 20、0.01% NaN3，pH 7.4)阻斷一小時。用不含BSA之DAB(洗滌緩衝液)將板洗滌3次，並且將10μl上清液添加至90μl DAB中以達到100μl之最終體積(參考板)。接下來將10μl 10% HOAc添加至聚丙烯板中之各上清 液以達到樣品pH 4.5。在40℃下將板培育90分鐘，並且藉由以1400×g離心來移除變性蛋白質。將10μl酸及經熱處理之上清液添加至含有90μl補充有100mM Tris pH 8.0之DAB的另一DELFIA板(攻擊板)中。在室溫下在振盪下將DELFIA板培育一小時，並且如之前洗滌3次。藉由每孔添加100μl含有250ng/ml經Eu標記之抗His6抗體(Perkin Elmer，Boston，MA，目錄號AD0109)之DAB來偵測已結合之Fc，並且在室溫下在振盪下培育一小時。將板用洗滌緩衝液洗滌3次，且每孔添加100μl DELFIA增強溶液(Perkin Elmer，Boston，MA，目錄號4001-0010)。培育15分鐘後，使用銪方法在Victor 2(Perkin Elmer，Boston，MA)上對板進行讀取。藉由在40℃下對各種構築體之參考板與攻擊板之間的Eu螢光比進行分級來分析資料。螢光值大於pBRM013值解釋為在穩定性方面相對於靶構築體(IgG4.P agly)有所增加。資料示於表6.1中。
Figure 108119374-A0305-02-0142-36
Figure 108119374-A0305-02-0143-37
實例5.穩定IgG Fc抗體之產生 A.突變誘發、在大腸桿菌中瞬時表現穩定IgG Fc部分及純化
藉由使用Stratagene Quik-Change Lightning突變誘發套組進行定點突變誘發將穩定性突變併入先前於實例4中詳細描述之BRM 13構築體中。引子設計為長度在36-40個鹼基之間，中間有突變，兩側上有10-15個鹼基之正確序列，GC含量為至少40%，起始且終止於一或多個C/G鹼基。所有突變構築體均列於以下表7.1中。
Figure 108119374-A0305-02-0143-38
Figure 108119374-A0305-02-0144-39
使用將會引入突變之引子進行PCR後，在37℃下用Dpn I限制酶將各突變誘發消化5分鐘以便完全消化親本質體。隨後將突變誘發反應轉型至XL1-Blue大腸桿菌超勝任細胞中。對胺芐青黴素抗性菌落進行篩檢，並使用DNA定序證實來自突變誘發反應之正確序列。
藉由電穿孔使用EC3方案將序列經證實之DNA轉型至3110細胞中。揀選獨特菌落並且在含菌原培養物之10ml LB-amp中生長隔夜。將此預培養物轉移至1L表現培養基[SB+0.02%阿拉伯糖+amp/carb 50mg/L]，並且在32℃下生長隔夜。在離心機中對細胞進行低速離心並且完全再懸浮於100ml球形質體緩衝液(20%蔗糖、1mM EDTA、10mM Tris-HCl pH 8.0及溶菌酶(0.01% w/v))中。對細胞進行低速離心，且所得蛋白質在上清液中。
使用蛋白A瓊脂糖FF(GE Healthcare)藉由分批純化對IgG-Fc構築體進行純化。使用0.1M甘胺酸pH 3.0自蛋白A瓊脂糖溶析Fc分子，用Tris鹼中和，且最後使用Pierce 10ml透析卡匣(10,000MWCO截止值)透析至PBS中。
B.突變誘發、在CHO細胞中瞬時表現穩定抗體、抗體純化及表徵
使用Stratagene Quik-Change Lightning突變誘發套組藉由定點突變誘發將穩定性突變併入IgG4.P抗體(胺基酸228處已含有脯胺酸鉸鏈突變之VH構築體)中。抗原識別Fab來自抗CD40抗體5c8。引子設計為長度在36-40個鹼基之間，中間有突變，兩側上有10-15個鹼基之正確序列，GC含量為至少40%， 起始且終止於一或多個C/G鹼基。所有糖基化及無糖基化突變構築體均列於表7.2中。
Figure 108119374-A0305-02-0145-40
使用將會引入突變之引子進行PCR後，在37℃下用Dpn I限制酶將各突變誘發消化5分鐘以便完全消化親本質體。隨後將突變誘發反應轉型至XL10-Gold大腸桿菌超勝任細胞中。對胺芐青黴素抗性菌落進行篩檢，並使用DNA定序證實來自突變誘發反應之正確序列。
將來自經證實序列之DNA按比例放大並轉型至TOP10大腸桿菌勝任細胞(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中。針對插入物之存在對轉型至胺苄青黴素抗藥性之大腸桿菌菌落進行篩檢。隨後將菌落培養成250ml大規模培養物。使用Qiagen HiSpeed Maxiprep套組自細菌培養物提取並純化DNA以用於瞬時轉染。使用ε280對DNA進行定量以量測用於轉染之DNA濃度。
隨後將突變質體與等量5c8 VL質體一起用於共轉染CHO-S細胞以便瞬時表現抗體蛋白質。用於轉染之DNA之量為0.5mg/L VH及0.5mg/L VL。在5%轉染體積下用1mg/ml PEI(Polysciences，目錄號23966)以3mg PEI：1mg DNA之比率製備轉染培養基(來自Invitrogen之CHO-S-SFMII，含來自SAFC之LONG R4IGF-1)。將DNA添加至轉染培養基/PEI溶液並渦旋，隨後在室溫下靜置5分鐘。隨後將混合物以1×106個細胞/ml添加至500ml CHO-S細胞。在37℃、5% CO2下4小時之後，添加1倍體積之擴增培養基(CHOM37+20g/l PDSF+青黴素鏈黴素/兩性黴素)，最終培養體積為1L。在第1天，添加10ml 200g/L棉花水解物並且將溫度降至28℃。監測培養物生存力直至生存力降至70%以下(8-12天)。此時亦使用Octet(ForteBio)檢查蛋白質表現滴定濃度，以量測與抗IgG端之結合。藉由以2400rpm將培養物離心10分鐘來收集細胞，隨後使上清液通過0.2um超濾器進行過濾。
在AKTA(Amersham Biosciences)上使用蛋白A瓊脂糖FF(GE Healthcare)自上清液俘獲5C8抗體。使用pH 3.0之0.1M甘胺酸自蛋白A溶析抗體分子，用Tris鹼中和，使用Pierce 10ml透析卡匣(10,000MWCO截止值) 透析至PBS中，濃縮至1ml最終體積，且使用製備型粒徑排阻層析法(TOSOHASS，TOSOH Biosciences)進行進一步純化。將5C8分子透析至pH 6.0之20mmol檸檬酸鹽、150mmol NaCl溶液中。分別藉由4-20% Tris-甘胺酸SDS-PAGE及分析型粒徑排阻HPLC評定單體抗體產物之純度及百分比。
C.使用質譜分析證實穩定性工程化抗體之蛋白質序列及轉譯後修飾
在還原條件下分析樣品。在37℃下，在4M鹽酸胍存在下，在100mM DTT中進行還原1小時。在注射之前，將樣品用PBS進行1：1稀釋。向混合物中添加冰醋酸至最終濃度為2%(v/v)。將5μg各樣品注射至苯基管柱上且藉由ESI-TOF加以分析。使用結合-溶析方法。緩衝液A含有0.03% TFA水溶液，且緩衝液B含有0.025% TFA乙腈溶液。流速保持恆定在100μl/min。由Analyst軟體獲得光譜並且使用MaxEntl進行解卷積。還原型分析之後，有3個樣品偵測為糖型，因此，對該3個樣品進行去糖基化：EC323、EC326及EAG2300。在還原條件下進行去糖基化：1mU N-聚糖酶/2μg蛋白質，存在20mM DTT、10mM Tris pH 7.0。在37℃下對樣品進行去糖基化。2小時之後，在2.7M鹽酸胍存在下再向樣品中添加30mM DTT，並且在37℃下再培育30分鐘。將5μg各還原去糖基化樣品注射至苯基管柱上並且如以上詳細描述加以分析。
結果證實所有13個樣品之一致性，其中重鏈N末端麩醯胺酸(Q)轉化至焦麩胺酸(PE)。表7.3列出針對所有糖基化及去糖基化樣品獲得之質量。所有輕鏈及重鏈均含有1%或更低之低水準糖化。在-20%-40%之相對強度下，在各樣品中觀測到對應於未修飾N末端麩醯胺酸之質量。所有輕鏈解卷積光譜均與預期一致。
Figure 108119374-A0305-02-0147-41
Figure 108119374-A0305-02-0148-42
應注意，在本文中所描述之抗體中，轉譯後修飾可廣泛變化。舉例而言，例行偵測蛋白質中之糖化(由蛋白質上之胺基與葡萄糖反應而引起之非酶促修飾)，且其水準視細胞培養條件而廣泛變化。當然，各重鏈及輕鏈上之糖化水準可遠高於以上所描述之1%。舉例而言，如本文中所描述之完整抗體之糖化水準可為10%、或20%、或30%、或40%、或高於40%。同樣，其他轉譯後修飾，諸如去胺基及糖基化，可視本文中所描述之抗體的產生及純化方法而變化。
樣品EC323、EC326及EAG2300含有常見GOF、GIF、G2F雙觸角聚糖，其中GOF為最豐富之物質，繼之以GIF，隨後為G2F。樣品EC323及EC326在-146 Da處含有來自GOF峰之峰，其對應於缺失核心岩藻糖(GO)之GOF聚糖。對於EC323，GO(減岩藻糖)之相對強度百分比為2%，而EC326樣品之相對強度百分比為23%。所有3種糖基化樣品在G2F聚糖上均含有低水準(<1%)之唾液酸。
所有樣品鏈均含有-18 Da峰，其已證明為與ESI-TOF之氣體溫度升高有關之儀器偽影。使用350℃之溫度來消除TFA加合物。
實例6.無糖基化IgG Fc抗體之熱穩定性
蛋白質穩定性為蛋白質治療劑之開發及按比例擴大的核心問題。穩定性不足可能導致許多開發問題，包括不適合在生物反應器中擴大生產、蛋白質純化困難以及不適合醫藥製備及使用。為了產生效應功能缺陷性Fc主鏈，將突變引入agly IgG4.P(S228P)中以增加CH2及CH3結構域之總體穩定性。此研究之目標為研究所設計之突變是否使熱穩定性增加。因此，使用差示掃描量熱術(DSC)評定各構築體之熱穩定性。藉由DSC評定大腸桿菌產生之Fc結構域構築體及全長抗體構築體。大腸桿菌產生之Fc結構域構築體及全長抗體構築體之表現及純化方法詳細描述於實例5中。
將抗體針對pH 6.0之25mM檸檬酸鈉、150mM NaCl緩衝液進行透析。將抗體濃縮至1mg/mL且藉由UV吸光度加以量測。使用自動化毛細管DSC(MicroCal，LLC，Northampton，MA)進行掃描。進行兩次緩衝液掃描以減去基線。使用中等反饋模式，以1℃/min自20℃至105℃運作掃描。隨後使用軟體Origin(MicroCal LLC，Northampton，MA)對掃描進行分析。使用三階多項式校正非零基線，並使用非雙態去摺疊模型擬合各抗體之去摺疊轉變。為了進一步評定此等構築體之穩定性，將全長抗體相對於pH 4.5之25mM磷酸鈉、25mM 檸檬酸鈉、150nM NaCl緩衝液進行透析。使用與以上詳細描述相同的DSC方案。使用缺乏Fab結構域之大腸桿菌表現之Fc結構域構築體來測試如實例2中詳細描述之Delphia熱攻擊分析中所鑑定之突變的穩定性增強。將構築體BRM023、BRM030及CR103-119與其熔融溫度一起列於表8.1中。
Figure 108119374-A0305-02-0150-43
如表8.1中所描繪，agly IgG1及IgG4.P(S228P,T299A)Fc部分對照就CH2而言分別具有65.9℃及62.3℃之熔解溫度且就CH3而言分別具有82.6℃及71.2℃之熔融溫度。在單位點突變中，BRM023(T307P)及BRM030(T299K)顯示CH2熔融溫度相對於agly IgG4.P(S228P,T299A)對照物增加3.4-3.9℃。在位置R409處用離胺酸或甲硫胺酸取代顯示CH3熔融溫度增加12℃及6.6℃。取 代至較小疏水性側鏈(Leu及He)不增加CH3之穩定性。此位置表示IgG1與IgG4之間的CH3界面中之單一差異。在D399位進行突變以補償IgG4 CH3界面中第409位之精胺酸側鏈之體積增加(如實例3中詳細描述)。較小側鏈(Ser)之取代促使熔融溫度增加約4℃。取代至具有相同大小但缺乏電荷之側鏈(Asp)或具有相同電荷之較大側鏈(Glu)均未顯示穩定性增加。如實例3中詳細描述之疏水性纈胺酸核心中之取代顯示對熔融溫度無效或使其降低，但V427F除外，其顯示CH3熔融溫度增加約4℃。
為了評估單一突變及多個突變之組合，利用全長IgG分子。如實例5中詳細描述將突變併入全長5c8抗體中。如在pH 6.0及pH 4.5下藉由DSC量測之突變對CH2及CH3結構域之熔融溫度的影響彙總於以下表8.2中。
Figure 108119374-A0305-02-0151-44
Figure 108119374-A0305-02-0152-45
如表8.2中所描繪，D399S突變使agly IgG4.P中CH3結構域之熱穩定性在pH 6.0下平均增高2℃且在pH 4.5下平均增高多達10℃。使用突變T299K 來產生無糖基化CH2。第299位之離胺酸取代相對於此位置之丙胺酸取代使IgG4.P分子之熔融溫度在pH 6.0下增高5℃且在pH 4.5下增高11℃。T299K突變亦使IgG1 CH2之Tm在pH 6.0下增高6℃。T307P突變當與D399S組合使用時顯示糖基化IgG4.P CH2結構域增高4℃。T307P本身不使糖基化IgG4.P形式之熔融溫度增高。在無糖基化形式中，T307P突變使CH2 Tm增高6℃。當與T299K突變組合時，CH2之Tm增高8℃。L309K突變當與T307P及T299A組合時使無糖基化IgG4.P穩定性增高1℃。然而，在組合T307P及T299K時，L309K突變致使增高3℃。在IgG4.P之糖基化形式中，L309K突變使CH2之Tm增高2℃。L309K突變當與T307P及T299A組合時使無糖基化IgG4.P穩定性增高1℃。然而，在組合T307P及T299K時，L309K突變致使在pH 4.5下增高3℃。CH2中之V323F突變顯示對CH2結構域之熔融溫度無影響，而V240F突變使熔融溫度降低13℃。另外，V427F突變亦顯示CH2之Tm降低13℃。
在IgG4.P中，在T299K、T307P、L309K及D399S組合時觀測到熔融溫度最顯著增高。此構築體與T299A IgG4.P相比顯示CH2之Tm增高11℃(pH 6.0)及12℃(pH 4.5)。實際上，T299K突變當與T307P、L309K及D399S組合時相對於T299A突變使Tm增加2-3℃。另外，T299K引入IgG4.P CH2中與IgG4.P同型之CH3轉化至IgG1之CH3組合引起CH2及CH3結構域相對於agly IgG4.P分別增高6℃及15℃。
CH2糖基化協變研究中鑑定之突變顯示對IgG1 CH2之Tm無影響至幾乎無影響(V262L，及V264T與V262L組合、環置換)，或顯示存在降低7℃之影響(V266F、V264T及V266F、環及V264T及V266F)。對於V262L、V264T及V266F之組合觀測到熔融Tm大幅降低10-12℃。
總之，T299K、T307P、L309K作為單一突變或與彼此組合時顯示能夠增加CH2結構域之熱穩定性。D399S賦予IgG4.P之CH3結構域以穩定性。
實例7：IgG Fc抗體之攪拌及pH保持步驟研究
非常需要蛋白質治療劑具有長貨架壽命，蛋白質之物理或化學性質在製造生產及儲存期間發生最低限度之變化。評估相關應力為調配物開發之重要部分，且評估IgG Fc突變體之兩種相關應力類型。
A.攪拌應力
攪拌模擬在製造及加工期間遇到之應力以及模擬實際運輸(亦即，將藥物產品小瓶運輸至測試場所)期間之應力。因此，分析48小時之時程內的攪拌穩定性，且使用分析型粒徑排阻層析法(SEC)監測蛋白質聚集或沈澱，並藉由在320nM下監測吸光度來量測濁度。濁度為由於使蛋白質/緩衝溶液混濁或甚至在極端情況下不透光之聚集及沈澱物形成導致之光散射量度。在各組實驗中一致使用以下方法：在3ml調配物管中以650rpm振盪1ml各樣品(0.5mg/ml)，用橡膠塞密封，且用石蠟膜再次密封。在必需時間點(0、6、24及48小時)提取100μl樣品，且以14,000rpm低速離心5分鐘來對所形成之聚集物或沈澱物進行低速離心。隨後運作樣品並且在分析型SEC管柱上加以分析。在SEC溶析曲線中，聚集之蛋白質以較短滯留時間溶析且蛋白質降解產物以較長滯留時間溶析。因此，使用單體物質之百分比來監測指定時間點之蛋白質總體穩定性。
選擇具有最高熱穩定性之構築體(參見實例6)用於攪拌研究。對於無糖基化IgG4分子，選擇YC401至YC403(均為無糖基化IgG4.P T299A及D399S[分別加T307P、L309K及T307P/L309K])、YC404至YC406(均為無糖基化IgG4.P T299K及D399S[分別加T307P、L309K及T307P/L309K])、呈野生型IgG4.P無糖基化(T299A)對照物形式之YC407、CN578(無糖基化IgG1 A299K)、EC331(具有IgG1 CH3結構域之無糖基化IgG4.P T299K及T307P)、無糖基化IgG1(T299A)、無糖基化IgG4.P(T299A)及無糖基化IgG1(T299A)用於研究。對於糖基化分子，選擇EC304(糖基化IgG4.P T307P、D399S)、EC323(糖基化IgG4.P D399S、L309K)、EC326(糖基化IgG4.P T307P、D399S、L309K)、糖基化IgG4.P T299A及糖基化IgG1用於研究。
在就濁度對無糖基化突變體進行比較時(參見以下表9.1及圖12A)，YC403(無糖基化IgG4.P T299A、T307P、L309K及D399S)及YC406(無糖基化IgG4.P T299K、T307P、L309K及D399S)與野生型YC407(無糖基化IgG4.P T299A)相比顯示最低量之濁度。兩種構築體在各時間點始終顯示相較於野生型為三分之一的濁度。兩種構築體之間僅有的差異為T299A(YC403)及T299K(YC406)。
Figure 108119374-A0305-02-0155-46
在比較單體%時(參見以下表9.2及圖12B，所有突變構築體均顯示聚集隨時間減少。在24小時時間點，所有突變構築體均優於野生型，且在48小時時間點，大部分構築體優良至少2倍。然而，保留最高單體%之構築體為YC403，繼之以YC402(無糖基化IgG4.P T299A、L309K及D399S)，隨後為YC406(無糖基化IgG4.P T299K、T307P、L309K及D399S)。此等構築體隨時間顯示最不平緩之單體%損失。在最佳排序構築體中所見之常見突變為L309K突變。此 資料顯示所選擇之突變在機械應力情形下改良總體穩定性。比較該等無糖基化IgG4.P構築體之兩種攪拌量測，YC403(無糖基化IgG4.P T299A、T307P、L309K及D399S)及YC406(無糖基化IgG4.P T299K、T307P、L309K及D399S)構築體隨時間最佳地抵抗機械應力。兩種分子均顯示能夠改良熱穩定性及結構穩定性之添加突變(T307P/L309K)。
Figure 108119374-A0305-02-0156-47
對於IgG1無糖基化分子，CN578(無糖基化IgG1 A299K)顯示最低限度之濁度，且其在整個實驗中亦基本上不顯示聚集。CN578之效能優於IgG1 T299A以及野生型IgG1 299T分子，因而證明對於無糖基化IgG1分子，A299K突變對攪拌具有最小影響。CN578在濁度研究中比IgG1 T299A優良5倍。CN578分子在48小時之時間跨度內亦不顯示聚集，該結果與無糖基化IgG1 T299A及糖基化IgG1 299T相同。EC331(其為具有IgG1 CH3結構域之無糖基化IgG4.P T299K及T307P)之效能與其他構築體相比非常優良，因為其在整個攪拌研究中亦維持100%單體。其與IgG4.P agly構築體(YC系列)相比顯示濁度改良2倍。此資料表明IgG1 CH3部分大大有助於該分子之熱穩定性及結構穩定性。
在糖基化分子EC304(糖基化IgG4.P T307P、D399S)、EC323(糖基化IgG4.P D399S、L309K)、EC326(糖基化IgG4.P T307P、D399S、L309K)中，聚集研究過程中之單體%與野生型糖基化IgG4.P分子相比有所改良(參見表9.2及圖12B)。然而，濁度在每個時間點均大大增加，甚至高達75倍。一貫地，各分子含有D399S，因此，如資料所顯示，此突變可能破壞結構穩定性。
B.低pH值保持步驟研究
非常需要蛋白質治療劑具有可製造性及可擴大性。進行pH值保持步驟研究對製程開發必不可少。pH值保持研究模擬蛋白質生產及純化階段期間之製程開發。在生產階段，蛋白質之可再現性及一致性對於品質保證必不可少。此方法可用於量測蛋白質在高pH或低pH下之穩定性。對於該研究，使用AKTA(Pharmacia Biotech，現為GE Healthcare)將1mg蛋白質裝載至蛋白A管柱上，且用pH 3.1之乙酸鹽緩衝液溶析。將蛋白質保持在低pH下持續2小時間隔至多達6小時。獲取100μl等分試樣，隨後在分析型SEC上運作以量測由於降解及聚集所致之蛋白質損失。結果彙總於表9.3(參見以下)及圖13中。
Figure 108119374-A0305-02-0157-48
對於此研究，選擇EC304(糖基化IgG4.P T307P、D399S)、EC323(糖基化IgG4.P D399S、L309K)、EC326(糖基化IgG4.P T307P、D399S、L309K)、糖基化IgG4.P T299A、EC331(其為具有IgG1 CH3結構域之無糖基化IgG4.P T299K及T307P)、無糖基化IgG1(T299A)、無糖基化IgG4.P(T299A)及糖基化IgG1用於研究。根據該資料，證明EC331能夠承受低pH值保持至少6小時而 不損失很多產量。此與所運作之無糖基化IgG4野生型對照物相比有所改良。據預計，其他無糖基化構築體不會由於降解而損失任何蛋白質，因為此構築體能夠承受低pH值保持。在兩者皆糖基化之情況下，EC304及EC326亦維持其產量，此亦與糖基化IgG1野生型相當。亦糖基化之EC323隨時間推移進展不佳。假定單獨L309K突變需要與T307P突變一起穩定，此可見於更穩定EC326構築體中。
實例8.穩定性工程化IgG Fc抗體之Fc受體結合
本發明之無糖基化變異抗體之效應功能的特徵在於其能夠結合Fc受體或補體分子，諸如C1q。
A.溶液相競爭Biacore實驗
使用溶液親和表面電漿子共振來分析與Fcγ受體之結合(參考Day ES,Cachero TG,Qian F,Sun Y,Wen D,Pelletier M,Hsu YM,Whitty A.Selectivity of BAFF/BLyS and APRIL for binding to the TNF family receptors BAFFR/BR3 and BCMA.Biochemistry.2005 Feb 15；44(6)：1919-31)。該方法利用所謂「質傳限制」結合條件，其中配位體結合(蛋白質結合至感測器晶片)之初始速率與溶液中之配位體濃度成比例(參考BIApplications Handbook(1994)第6章：Concentration measurement，第6-1-6-10頁，Pharmacia Biosensor AB)。在此等條件下，可溶性分析物(在晶片表面上流動之蛋白質)與晶片上之經固定蛋白質的結合與分析物擴散至晶片表面上之聚葡萄糖基質中相比為快速的。因此，分析物之擴散性質及流過晶片表面之溶液中的分析物濃度決定分析物結合至晶片之速率。在此實驗中，溶液中游離Fc受體之濃度係藉由與含有經固定IgG1 MAb之CM5 Biacore晶片之初始結合速率來確定。向此等Fc受體溶液中滴加穩定性工程化構築體(參見以下表10.1)。此等構築體之半最大(50%)抑制濃度(IC50)係藉由其抑制Fc受體結合至固定於感測器晶片表面上之經固定IgG1抗體的能力來顯示。初始結合速率係獲自原始感測圖資料(圖14)。用於計算IC50之滴定曲線示於圖15A(CD64 (FcγRI))及圖15B(CD16(FcγRIIIa V158))中。結果示於表10.1中且報告為兩次滴定之平均值。
Figure 108119374-A0305-02-0159-49
在CD64結合分析中，IgG1對照抗體之IC50為9.6μM，而IgG1 T299A(agly)及IgG4.P T299A(agly)之IC50分別為205μM及739μM。如所預期，IgG1分子對CD64之親和力大於IgG4分子，且無糖基化IgG1與糖基化IgG1相比顯示降低之親和力。穩定性工程化糖基化IgG4.P分子(EC300及EC326)具有約8μM之IC50值，相比之下，穩定性工程化無糖基化IgG4.P分子(EC331及YC400系列)在440至>5000μM之範圍內。穩定性工程化IgG4.P糖基化分子(EC300、EC326)之IC50與糖基化IgG1對照物等效，且具有T299A之穩定性工程化無糖基化IgG4.P(YC401、YC403)與無糖基化IgG4.P T299A對照物具有對數等效IC50。然而，具有T299K之穩定性工程化無糖基化IgG4.P與具有T299A取代之等效分子相比顯示高出1至2個對數之親和力降低(圖7A)。對於與無糖基化IgG1 T299A對照物相比顯示對數親和力降低之穩定性工程化無糖基化IgG1 T299K(CN578)亦觀測到此結果(圖16B)。實際上，T299K取代使無糖基化IgG1(T299A)分子自與無糖基化IgG4.P T299A對照物相比對CD64具有更大親和力變至與無 糖基化IgG4.P對照物相比對無糖基化IgG1(T299K)具有降低之親和力(圖16B)。總之，T299K突變降低了IgG1及IgG4分子二者對CD64之親和力。
對於CD16分析，IgG1對照物具有105μM之IC50，而無糖基化IgG4.P T299A及IgG1 T299A二者均具有>1000μM之IC50。糖基化穩定性工程化IgG4.P分子具有與IgG1對照物對數相當之IC50值，且所有穩定性工程化無糖基化分子(IgG4.P及IgG1二者)均具有>1000μM之IC50。為了研究T299K是否進一步降低對CD16之親和力，在高抗體濃度(5μM)下測試以T299K取代作為僅有差異之兩組構築體(YC401、YC404及YC403、YC406)。結合曲線顯示T299K突變在高濃度下引起對CD16之親和力降低(圖17)。總之，T299K突變降低IgG分子中對CD16之親和力。
B.C1q結合ELISA
藉由在4℃下用以10ug/ml處於PBS中之50μl重組可溶性人類CD40配位體塗覆96孔Maxisorb ELISA板(Nalge-Nunc Rochester，NY，USA)隔夜來進行C1q結合分析。將孔吸出並且用洗滌緩衝液(PBS、0.05% Tween 20)洗滌三次，且用200μl/孔之阻斷/稀釋緩衝液(0.1M Na2HPO4 pH 7.0、1M NaCl、0.05% Tween 20、1%明膠)阻斷1小時。將抗體以3倍稀釋度稀釋於阻斷/稀釋緩衝液中，且在室溫下培育2小時。
如上吸出並洗滌之後，添加50 J.孔之稀釋於阻斷/稀釋緩衝液中之Sigma人類C1q(C0660)之2 J.凝膠且在室溫下培育1.5小時。
如上吸出並洗滌之後，添加50pll/孔之於阻斷/稀釋緩衝液中稀釋3,560倍之綿羊抗C1q(Serotec AHP033)。在室溫下培育1小時之後，如上將諸孔吸出並洗滌。隨後添加50pll/孔之於阻斷/稀釋劑中稀釋至1：10,000之驢抗綿羊IgG HRP結合物(Jackson ImmunoResearch 713-035-147)，並且在室溫下將孔培育1小時。
如上吸出並洗滌之後，添加100μl TMB受質(420plM TMB、含0.004% H2O2之0.1M乙酸鈉/檸檬酸緩衝液，pH 4.9)並培育2分鐘，隨後用100ul 2N硫酸終止反應。用Softmax PRO儀器在450nm處讀取吸光度，且使用Softmax軟體以4參數擬合確定相對結合親和力(C值)。
實驗結果顯示CN578(IgG1 T299K)及YC406(無糖基化IgG4.P T299K、T307P、L309K及D399S)皆不具有可量測之C1q結合(圖17)，而IgG1 T299A具有一定之殘餘結合。
實例9.IgG1 CH3使無效應功能之無糖基化IgG4 CH2穩定
此部分中所描述之蛋白質來源於5c8抗體，且除非另外指示，否則包含來自IgG4之CH1區域、來自IgG4之CH2結構域及來自IgG1或IgG4抗體之CH3結構域(如所指示)。如實例3中所描述來產生並純化蛋白質。在pH 6.0及pH 4.5下藉由DSC量測經修飾抗體之CH2及CH3結構域之熱穩定性(詳細描述於實例6中)。藉由分析型SEC及藉由在A320nm下進行濁度量測來量測攪拌應力之影響(實例7)。本發明之無糖基化變異抗體之效應功能的特徵在於其能夠結合Fc受體或補體分子，諸如C1q。使用溶液親和表面電漿子共振來分析與Fcγ受體之結合，且藉由ELISA來分析與補體因子C1q之結合(實例6)。最後，藉由在SD大鼠中進行藥物動力學研究來測定血清半衰期(實例9)。
如實例5中詳細描述，在CHO中表現IgG4-CH2/IgG1-CH3無糖基化構築體，其中產量在每1公升培養物7至14mg之範圍內。與具有來自IgG4之CH3的相同構築體相比，引入IgG1-CH3似乎賦予更高產量(約1.5倍)(表8.1)。另外，與野生型無糖基IgG4之CH3結構域的穩定性(Tm=74℃)相比，IgG1無糖基IgG4-CH2/IgG1-CH3在CH3結構域中具有增加之熱穩定性(Tm=85℃)(表12.2及表8.2)。令人感興趣地觀測到IgG1 CH3為攪拌穩定性之決定性特徵(表12.3)，因為先前已認為CH2結構域中之聚糖損失將為穩定性之支配因素。
觀測到EAG2412構築體(N297Q IgG4-CH2/IgG1-，亦即，5c8可變區(IgG1構架)、IgG4 CH1、IgG4 CH2、具有N297Q及Ser228Pro取代之IgG1 CH3)顯示較佳效應功能概況，與T299A及T299K IgG4-CH2/IgG1-CH3相比對CD64及CD32之結合最低。發現IgG1-CH3對與Fcγ受體結合無影響。所有含無糖基IgG4-CH2結構域之構築體均不結合至C1q。
在SD大鼠中進行藥物動力學研究以解決穩定性工程化IgG4/IgG1分子之穩定性及血清半衰期。根據Biogen Idec實驗動物照護及使用委員會以及市、州及聯邦政府關於實驗室動物人性對待及照護之指導方針來養護大鼠。將稀釋於磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中之1mg/kg(1mg/ml)抗體之單次藥團注射經靜脈內投與雄性SD大鼠中。在注射後0、0.25、0.5、1、2、6、24、48、96、168、216、264及336小時將大鼠處死。製備分析用血清樣品以便對抗體水準進行定量。將樣品稀釋於補充有5%正常小鼠血清之DAB(Jackson ImmunoResearch 015-000-120)中，且偵測試劑為以250ng/ml之最終濃度使用的經Eu標記之小鼠抗人類Fc抗體(Perkin Elmer 1244-330)。藉由使用Excel之TREND函數與經純化抗體之標準曲線相比較來進行定量。
N297Q IgG4-CH2/IgG1-CH3與T299A IgG4抗體具有相同的半衰期，如所預期，其稍短於無糖基化IgG1(表12.5)。資料標繪於圖19C中。
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 a未觀測到結合
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實例10. T299為穩定性及效應功能之決定因素
此部分中所描述之蛋白質均來源於5c8抗體，且除非另外指示，否則包含IgG1抗體之CH1、CH2及CH3結構域。如實例5中所描述來產生並純化蛋白質。在pH 6.0及pH 4.5下藉由DSC量測突變對CH2及CH3結構域之熔融溫度的影響(詳細描述於實例6中)。本發明之無糖基化變異抗體之效應功能的特徵在於其能夠結合Fc受體或補體分子，諸如C1q。使用溶液親和表面電漿子共振來分析與Fcγ受體之結合，且藉由ELISA來分析與補體因子C1q之結合(實例8)。
如實例5中詳細描述，在CHO中表現IgG1 T299X及N297X/T299K無糖基化構築體，其中產量在每1公升培養物7至30mg之範圍內(表13.1)。在位置N297處與T299K組合添加二級突變確實使CH2結構域之熱穩定性降低1.5至4.4℃(表13.2)。另外，T299X突變相對於Arg(T299R)及Lys(T299K)之帶正電側鏈顯示最大程度之穩定性增加(表13.2)。兩個極性側鏈Asn(T299N)及Gln(T299Q)與T299A相比均顯示更高穩定性，但不如帶正電側鏈那般高。脯胺酸(T299P)顯示穩定性與T299A相比小幅降低，且較大疏水性側鏈Phe(T299F)使CH2結構域之熱穩定性降低2.4℃。最後，帶負電側鏈Glu(T299E)對CH2熱穩定性具有極小影響。此等結果顯示取代位置T299處之帶正電側鏈以增加CH2結構域中之熱穩定性的新穎性質。
觀測到N297X、T299K突變(CN645、CN646及CN647)均稍微增加對CD64之親和力，同時維持對CD32a及CD16之極低親和力(圖20B、圖20D 及圖20F)。T299X突變顯示對CD16之親和力始終較低，然而，在T299E之情況下，對CD32a之低親和力得以增加(表13.3及圖20C、圖18E)。亦值得注意的是，僅帶正電側鏈T299R及T299K賦予CD64低親和力(表13.3及圖20A)。最後，T299K、T299P及T299Q對追蹤C1q結合無反應；T299N、T299E、T299F顯示與C1q之結合稍有升高但仍極低(圖20G及圖20H)。N297P/T299K、N297D/T299K及N297S/T299K未顯示與C1q結合(圖20H)。
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實例11. 穩定Fc構築體顯示穩定性突變體之應用與Fab無關
此部分中所描述之蛋白質包含來源於5c8抗體之結合位點。EAG2476構築體包含來自IgG4免疫球蛋白分子之Fc部分，且EAG2478包含來自IgG1分子之Fc部分(EAG2476及EAG2478分別為YC406及CN578構築體之Fc型式(無Fab))。
如實例5中所描述來產生並純化蛋白質。在pH 6.0下藉由DSC量測突變對CH2及CH3結構域之熔融溫度的影響(詳細描述於實例6中)。本發明之無糖基化變異抗體之效應功能如圖21所示。抗體之特徵在於其能夠結合Fc受體。使用溶液親和表面電漿子共振來分析與Fcγ受體之結合(實例8)。
如實例5中詳細描述在CHO中表現穩定Fc無糖基化構築體，產量詳細描述於(表14.1)中。CH2結構域中之突變(T299K、T307P及L309K)在存在或不存在Fab之情況下顯示相同的熱穩定性(表14.2)以及具有相同的Fcγ受體結合親和力(表14.3)。總之，如所預期，本發明中詳細描述之穩定突變不依賴Fab且適用於穩定Fc結構域而不考慮Fab貢獻。
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實例12
為了產生具有所要性質，包括熱穩定性、純化時沈澱較少以及由抗體分泌細胞產生之抗體之效價提高的本發明抗體，用包含SEQ ID NO：11之可變輕鏈序列連接至人類κ輕鏈恆定區之輕鏈及包含SEQ ID NO：4之可變重鏈序列連接至不同的重鏈恆定區之重鏈產生眾多抗體構築體。在所測試之各種重鏈恆定區中，序列變化導致令人驚訝之重大結果。
舉例而言，SEQ ID NO：4之可變重鏈偶聯至包含CH1、具有S228P突變(EU編號)之鉸鏈、人類IgG4之CH2及CH3區的Fc區，其中IgG4已藉由消除N連接之糖基化基元NXS/T而無糖基化，其中天冬醯胺殘基297或蘇胺酸殘基299(EU編號)處之胺基酸變化導致抗體具有不良熱穩定性且傾向於在蛋白A溶析期間暴露於低pH值後沈澱。令人驚訝的是，當使用包含CH1、具有S228P突變(EU編號)之鉸鏈及人類IgG4之CH2及偶聯至人類IgG1之CH3區之CH2結構域中之N297Q突變(EU編號)的嵌合Fc區來製造包含SEQ ID NO：4之可變重鏈序列的抗體重鏈及包含SEQ ID NO：11之可變輕鏈序列連接至人類κ輕鏈恆定區之輕鏈時，所得抗體具有增加之熱穩定性，此與純化時沈澱較少及抗體產生細胞之抗體產生增加相關。換言之，含有包含SEQ ID NO：11序列之可變輕鏈(其連接至人類κ輕鏈恆定區)及包含SEQ ID NO：4序列之可變重鏈(其連接至包含CH1、具有S228P突變(EU編號)之鉸鏈及人類IgG4之具有N297Q突變(EU編號)之CH2(其偶聯至人類IgG1之CH3區)的嵌合Fc區)的抗體令人驚訝地具有較高熱穩定性、抗體純化時沈澱較少及抗體產生細胞之抗體產量較高，尤其 當與具有S228P(EU索引編號)之無糖基化人類IgG4相比時。
實例13. 如藉由氫/氘交換質譜及X射線晶體學測定之穩定無效應因子抗體之蛋白質構形、動力學性質及結構
結構及動力學性質顯著有助於蛋白質之功能。理解基礎結構機制對解釋所觀測之功能作用至關重要。為此，吾等已藉由氫/氘交換質譜(HfDX MS)及x射線晶體學檢查先前詳細描述之穩定性增加突變對蛋白質結構及動力學性質的影響。
A.氫/氘交換質譜
藉由質譜偵測氫/氘交換為表徵蛋白質動力學性質及構形的方法。蛋白質動力學性質/構形影響蛋白質中氘對氫之交換率，因此，當蛋白質結構經修飾(諸如具有突變)時，量測蛋白質氘化隨時間變化可說明構形變化。因此，吾等檢查穩定突變對吾等之無糖基化抗體Fc主鏈之氫/氘交換的影響。
用pD 6.0之50mM磷酸鈉、100mM氯化鈉、D2O將抗體(在pH 6.0之50mM磷酸鈉、100mM氯化鈉、H2O中)稀釋20倍，並且在室溫下培育不同量的時間(10秒、1分鐘、10分鐘、60分鐘及240分鐘)。藉由用pH 2.4之200mM磷酸鈉、0.5M TCEP及4M鹽酸胍、H2O，以1：1稀釋度將pH值降至2.6來淬滅交換反應。使用基於nanoACQUITY平台之Waters UPLC系統在線上對已淬滅之樣品進行消化、脫鹽及分離。將約20pmol已交換且淬滅之抗體注入經固定之胃蛋白酶管柱中。在15℃下，在含有0.05%甲酸之水中以0.1nL/min之流速進行線上消化2分鐘。將所得消化性肽捕獲於維持在0℃之ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm肽捕獲器(Waters，Milford，MA)上並且用水、0.05%甲酸脫鹽。藉由切換閥轉換流體，並且以40μL/min將所捕獲之肽自捕獲器溶析至保持在0℃之Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm,1mm×100mm管柱上(平均背壓為約9000psi)。使用含0.05%甲酸之6分鐘線性乙腈梯度(8-40%)來分離肽。將 溶析液導入Waters Synapt質譜儀中，進行電噴霧電離及鎖定質量校正(使用Glu-纖維蛋白原肽)。獲取m/z範圍260-1800內之質譜。使用精確質量與MS/MS之組合，在Waters IdentityE軟體之幫助下鑑定胃蛋白酶片段。如Weis等人所描述，使用基於Excel之方案HX-Express來確定肽氘水準。
如以上所描述來收集完整IgG4.P相對於N297Q IgG4.P、N297Q IgG4.P相對於N297Q IgG4.P-CH2/IgG1-CH3及T299A IgG4.P相對於YC406(T299K、T207P、L309K、D399S)之H/DX-MS資料。完整(糖基化)IgG4與無糖基化N297Q IgG4之比較顯示無糖基化形式顯示更大交換之序列區域。在肽L235-F241、F241-D249、1253-V262、V263-F275及H310-E318中觀測到更多H/D交換。IgG4肽M358-L365、T411-V422及A431-S442相較於N297Q IgG4.P-CH2/IgG1-CH3構築體中之相同肽的更高交換顯示IgG1-CH3與N297Q IgG4-CH2組合產生穩定性增加。在此情況下，與IgG1-CH3相比，來自IgG4之CH3結構域在CH3之3個不同區域中顯示更大交換。最後，肽L235-F241、F241-M252、V263-F275、V266-F275及V282-F296顯示突變構築體YC406與由於去糖基化而尤其更傾向於交換之序列區域中的無糖基化IgG4(T299A)相比存在穩定性增加。令人感興趣的是，CH3結構域中之D399S突變儘管產生熱穩定性之輕微增加，但賦予比野生型序列更大之交換。總體言之，H/D交換MS顯示由於去糖基化引起之構形變化被穩定性突變部分或完全恢復。
B.穩定性增強Fc構築體之X射線晶體學
使EAG2476構築體(agly IgG4-Fc T299K、T307P、L309K、D399S)結晶並收集資料達至2.8A解析度(資料完整性總體為92%；高解析度殼層為66%)。將該結構構建成電子密度且分別精化至R/R自由為27.7/33.9%。該結構揭示不對稱單元(ASU)中之兩個Fc鏈可重疊，兩個鏈之間存在極小偏差。環V266-E272且特定言之P291-V302與野生型IgG4晶體結構(pdb IADQ)中所觀測 者相當不同。此可能為突變T299K之直接結果。
EAG2478構築體(agly IgG1 Fc T299K)之晶體結構解至2.5Å解析度(資料完整性總體為92%；高解析度殼層為66%)。構建該結構且分別精化至R/R自由為27.4/35.8%。不同於EAG2476之結構，ASU中之兩個Fc鏈在EAG2478結構方面不一致。觀測到鏈A更類似於酶促去糖基化之IgG1 Fc(pdb 3DNK)之結構。EAG2478結構中之CH2結構域比在酶促去糖基化之IgG1 Fc(pdb 3DNK)及鼠類無糖基化IgG1 Fc(pdb 3HKF)中所觀測者更靠在一起。CH2結構域在EAG2476結構中比在EAG2478結構中觀測到的更開放。結構顯示在兩種情況下，T299K突變皆指向對接FcγIII受體之Y129側鏈，由此將解釋針對此突變所觀測的對受體之親和力降低。
實例14. 蛋白質純化.
在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中穩定表現具有SEQ ID NO：81之成熟輕鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND001之成熟輕鏈)及SEQ ID NO：80之成熟重鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND004/ND006之成熟重鏈)的蛋白質並且純化。所得分子稱為HP1/2 H1L3無糖基IgG4P/IgG1嵌合體S228P N297Q(Kabat編號)或HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3。
圖22A顯示輕鏈HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1 κ輕鏈(H1L3)之核苷酸序列(SEQ ID NO：91)及胺基酸序列(SEQ ID NO：92)，包括信號肽序列(信號肽序列及編碼DNA在圖22A中以加粗斜體字體顯示)。
圖22B顯示輕鏈HP1/2 hG4P agly(N297Q，EU編號)G1重鏈(H1L3)之核苷酸序列(SEQ ID NO：93)及胺基酸序列(SEQ ID NO：94)，包括信號肽序列(信號肽序列及編碼DNA在圖22B中以加粗斜體字體顯示)。
圖23A包括HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 κ輕鏈(H1L3)之胺基酸序列，包括輕鏈(上部)及重鏈(下部)二者之信號序列(加下劃線文本)。
圖23B包括具有SEQ ID NO：81之成熟輕鏈及SEQ ID NO：80之成熟重鏈的HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 κ輕鏈(H1L3)的胺基酸序列。在圖23B中，將輕鏈中(胺基酸殘基24-34、50-56及89-97)及重鏈中(殘基28-35、50-66及99-110)之互補性決定區(CDR)序列加下劃線。
純化製程全程使用無熱原容器及溶液。在室溫下進行純化製程。
在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中穩定表現HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3並且純化。
關於純化，簡而言之，將7.5L含有約10g HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3(藉由Octet得到之估計滴度：1310mg/L)之CHO培養基於25mM磷酸鈉pH 7.0、0.1M NaCl中以40-120mL/h裝載至400mL rProtein A Sepharose Fast Flow管柱(GE 17-1279-04，內徑50mm)上。用4×400mL相同緩衝液，隨後用3×400mL 25mM Na2HPO4 pH 5.5、0.1M NaCl洗滌管柱。用1000mL 25mM磷酸鈉pH 2.8、0.1M NaCl溶析HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3，用25mM磷酸鈉pH 8.6中和pH值。用Thermo Scientific Nalgene過濾器對樣品進行0.2μ過濾且儲存在4℃下。根據使用NonoDrop 2000光譜儀(其報告280nm下之值)獲得之吸收光譜估計溶析樣品之蛋白質含量(1mg/mL HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3之計算消光係數=1.49)。
將rProtein A溶析庫裝載至150mL TMAE管柱(EMD 1.16881.0500，內徑50mm)上之10mM磷酸鈉pH 7.0、0.1M NaCl中。收集流過物並藉由SDS-PAGE進行檢查。濃縮樣品，使用Millipore Pellicon-2超濾裝置將緩衝液交換至25mM磷酸鈉pH 7.0、25mM NaCl，並且再裝載至相同TMAE管柱上之25mM磷酸鈉pH 7.0、25mM NaCl中。收集流過物並藉由向514mL樣品中添加15.24mL 4M NaCl而調節至140mM NaCl，隨後用Thermo Scientific Nalgene過濾器進行0.2μ過濾，等分試樣並儲存在-80℃。產生9,384mg HP1/2 hG4P agly (N297Q)G1 H1L3，占理論產率之96%。
實例15. 蛋白質表徵.
經由如以下所論述之若干種不同的方法來表徵實例14中所描述之蛋白質。
A.紫外光譜
圖24提供具有SEQ ID NO：81之成熟輕鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND001之成熟輕鏈)及SEQ ID NO：80之成熟重鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND004/ND006之成熟重鏈)的蛋白質的紫外光譜。在NonoDrop 2000光譜儀上直接由25mM磷酸鈉、140mM NaCl pH 7.0中之未稀釋樣品量測HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3(RS)之紫外光譜。使用計算消光係數ε280 0.1%=1.49/cm，測定蛋白質濃度為17.74mg/mL。
B.十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
圖25說明具有SEQ ID NO：81之成熟輕鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND001之成熟輕鏈)及SEQ ID NO：80之成熟重鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND004/ND006之成熟重鏈)的蛋白質的SDS-PAGE結果。在用於還原樣品之含DTT之樣品緩衝液或用於非還原樣品之不含DTT之樣品緩衝液中製備HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3之等分試樣。在來自Invitrogen之4-20%聚丙烯醯胺梯度凝膠上進行SDS-PAGE，且用Simply Blue染色劑(Invitrogen)將凝膠染色並且用蒸餾水脫色。圖25顯示HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3(RS)之分析結果。在還原條件下，該凝膠顯示兩個譜帶，分別表示HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3之重鏈及輕鏈之預期分子量50及25kDa。在非還原條件下，對於抗體之HC2LC2四聚體結構，主要譜帶具有150kDa之預期分子量。樣品含有<0.5%之較高分子量形式。
C.等電聚焦(IEF)
圖26說明具有SEQ ID NO：81之成熟輕鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND001之成熟輕鏈)及SEQ ID NO：80之成熟重鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND004/ND006之成熟重鏈)的蛋白質的IEF結果。在IEF樣品緩衝液3-10中製備樣品，並且在Novex pH 3-10 IEF凝膠(Thermo Fisher EC66552BOX)上在130V恆值下運作92分鐘。將凝膠用12% TCA固定10分鐘，用Simply Blue染色劑(Invitrogen)染色並且用蒸餾水脫色。HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 RS運作為單一主要譜帶及若干次要更醋化變異體。HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3之計算pI為6.22。圖26亦顯示CHO DG44i細胞中表現之相同構築體，兩個其他HP1/2 H1L3構築體融合至野生型IgG4P Fc及IgG4PE Fc。該等分子之凝膠遷移率與該等分子之不同的pI值一致。注意泳道中指示所有樣品之計算pI。
D.分析型粒徑排阻層析法
圖27說明具有SEQ ID NO：81之成熟輕鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND001之成熟輕鏈)及SEQ ID NO：80之成熟重鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND004/ND006之成熟重鏈)的蛋白質的分析型粒徑排阻層析法結果。在Superdex 200 Increase 5/150 GL管柱(GE 28-9909-45)上使用Agilent 1200系列HPLC系統以0.2ml/min之流速在自20×PBS(Thermo Scientific 28348)稀釋之PBS(10mM磷酸鈉、0.15M NaCl，pH 7.5)中運作20μg研究標準物。在280nm下監測溶析液之吸光度並示於圖27中。HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3在7.8分鐘時溶析為單峰，不存在可偵測之聚集物或低分子量組分。
E.內毒素
使用Charles River Endosafe PTS20藥筒(0.05-5EU/ml)根據製造商之說明書測定內毒素。研究標準物中發現之內毒素水準<0.06EU/mg，適於NHP注射。
F.差示掃描量熱術(DSC)
圖28至圖30說明具有SEQ ID NO：81之成熟輕鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND001之成熟輕鏈)及SEQ ID NO：80之成熟重鏈(HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 ND004/ND006之成熟重鏈)的蛋白質的DSC結果。將HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3研究標準物在PBS中稀釋至約1mg/mL，隨後在4℃下相對於PBS透析約20小時。將約400μg(400μL)每種樣品添加至96孔板中。使用中等反饋模式，以2℃/min自20℃至120℃進行掃描，以提高峰解析度。使用MicroCal DSC儀器量測各結構域之Tm值(50%蛋白質分子在動態不可逆雙態平衡中去摺疊之相轉移溫度)。進行兩次緩衝液掃描以定義基線以供減去，且使用Origin軟體分析資料。為了比較，亦分析HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3 Fc片段(批次BJG2018-1-3-0088-E2)之樣品。作為Fab結構域指定之驗證，產生並分析研究標準物之Fab2片段。HP1/2 hG4P agly(N297Q)G1 H1L3完整抗體、Fc及Fab2片段之熔融曲線分別示於圖28、圖29及圖30中，且結構域熔融溫度(Tm)彙總於表11中。基於Tm值，抗體之G4P CH2結構域最不穩定(相轉移溫度為59.6℃)，繼而是完整抗體之Fab結構域(69.1℃)及G1 CH3結構域(85.9℃)。抗體之G4P CH2結構域之Tm值為57.4℃，且經分離之Fc片段中G1 CH3結構域之Tm值為84.5℃。對於Fab2片段，Fab結構域之Tm為69.4℃。
Figure 108119374-A0305-02-0174-64
實例16. 蛋白質之其他實驗分析.
研究兩種不同HP1/2蛋白質之產品屬性。第一種構築體，人類化HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q，EU編號)/IgG1嵌合體或HP1/2 G4P agly/G1，包含SEQ ID NO：81之成熟輕鏈及SEQ ID NO：80之成熟重鏈。第二種構築體，人類化HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(T299A，EU編號)或HP1/2 G4P agly，包含SEQ ID NO：81之成熟輕鏈及SEQ ID NO：89之成熟重鏈。設計、表現、純化並表徵HP1/2之兩種工程化型式。該等構築體瞬時表現於CHO細胞中。
Figure 108119374-A0305-02-0175-65
將900mL如上表中所指出含有72-122mg/L構築體(藉由Octet得到之估計滴度)之CHO培養基由重力裝載至9mL rProtein A Sepharose Fast Flow管柱(GE 17-1279-04)上。用6×5mL 25mM磷酸鈉pH 7.0、0.1M NaCl，隨後用6×4mL 25mM磷酸鈉pH 5.5、0.1M NaCl洗滌管柱。用7×5mL 25mM磷酸鈉pH 2.8、0.1M NaCl溶析mAb。藉由添加磷酸鈉pH 8.6將pH值中和至最終濃度20mM。觀測到不同量之沈澱物。將樣品以3000rpm離心5分鐘且過濾上清液，等分試樣，並儲存在-70℃。在中和之前及中和-離心-過濾步驟之後使用NonoDrop 2000光譜儀(其報告280nm下之值)由吸收光譜估計溶析樣品之蛋白質含量。
當中和ProA步驟後的四種抗體製劑時，由於沈澱而損失之蛋白質之量存在很大差異(參見以下表13)。HP1/2 G4P agly G1型式為性質更佳之構築體，僅3%產物由於沈澱而損失。
Figure 108119374-A0305-02-0175-66
Figure 108119374-A0305-02-0176-67
如以上表13中所示，最顯著為當那他珠單抗G4P agly樣品被中和時可見39%產物損失。相比之下，僅為該量三分之一(13%)的相應HP1/2構築體(HP1/2 G4P agly)由於沈澱而損失。HP1/2 G4P agly G1型式為性質最佳之構築體，僅3%產物由於沈澱而損失。
藉由SDS-PAGE及粒徑排阻層析法(SEC)表徵四種構築體樣品在離心及過濾之後的可溶性級分。SDS-PAGE(圖31)顯示所有四個樣品之單一顯著譜帶之分子質量為約150kDa，與IgG抗體所特有之四聚2重鏈2輕鏈複合物之存在一致。HP1/2與那他珠單抗樣品之間的明顯差異為那他珠單抗樣品中存在較高分子量加合物之彌漫性污跡，其自顯著譜帶延伸至凝膠頂部，表明存在可溶性聚集物。
圖32A說明HP1/2樣品之SEC分析結果。圖32B說明所有四種構築體之SEC分析結果。在Superdex Increase 5/150 GL管柱(GE 28-9909-45)上以0.2ml/min之流速在PBS(10mM磷酸鈉、0.15M NaCl，pH 7.5)中運作樣品。四個樣品之SEC分析顯示所有樣品中具有約150kDa之表觀分子質量的單一主峰(圖32A及圖32B)。
因而，與SDS-PAGE資料一致，SEC分析顯示在主峰之前溶析之那他珠單抗樣品中之較高分子量可溶性聚集物在HP1/2樣品中未偵測到或大大降低。此等分析共同揭示那他珠單抗樣品含有可溶性及不溶性聚集物，從而導致不良產率及比HP1/2樣品下所見純度低的純度。
亦藉由差示掃描量熱術(DSC)表徵兩種HP1/2樣品之穩定性。圖33a及圖33b分別說明人類化HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q)/IgG1嵌合體(HP1/2 G4P agly G1，左)及人類化HP1/2 G1/L3 huIgG4P agly(T299A)(HP1/2 G4Pagly，右)之DSC結果。藉由差示掃描量熱術(DSC)表徵兩種HP1/2樣品之穩定性。使 用MicroCal DSC儀器測定各結構域之Tm值。以2℃/min自20℃至120℃進行掃描。量測各結構域之Tm值(50%蛋白質分子在動態不可逆雙態平衡中去摺疊之相轉移溫度)。如所預期，許多熱轉移為相同的，因為該兩種構築體含有相同Fab區(69℃)及無糖基CH2結構域(約60℃)。
HP1/2 G4P agly G1型式之CH3結構域非常穩定，如自其Tm為約85℃顯而易見，而HP1/2 G4Pagly型式之CH3結構域的Tm僅為約69℃。
換言之，HP1/2 G4P agly G1(亦即，具有SEQ ID NO：80之胺基酸序列的重鏈)具有優於HP1/2 G4Pagly抗體之穩定性。
實例17：HP1/2之臨床藥物動力學及首次用於人類之劑量預測
臨床輸入之反向轉化整合可用於增強與臨床藥物動力學及藥效學相關之預測的信賴度。在此實例中，該技術用於告知重組人類化抗α4整合素抗體HP1/2 H1/L3 huIgG4P agly(N297Q，EU編號)/IgG1嵌合體(在此實例中稱為「HP1/2」或「BIIB107」)之臨床藥物動力學及藥效學性質，其與那他珠單抗(NTZ)來自相同α4抗原決定基子類。使用整體資料整合來增加HP1/2人類藥物動力學(PK)及有效劑量預測之可預測性及信賴度。
在食蟹獼猴(n=18)中投與HP1/2(3及30mg/kg)及NTZ(3mg/kg)之單次靜脈內劑量。來自18隻食蟹獼猴之總計180個血清濃度(60個NTZ，120個HP1/2)及252個PD(RO)量測值(84個NTZ，168個HP1/2)可用於PKPD分析。在食蟹獼猴中單次靜脈內藥團投與3-30mg/kg HP1/2及3mg/kg那他珠單抗(Tysabri)之後的觀測PK平均時程示於圖34中。投與抗-VLA之後，游離受體減至少於基線之10%，表明Tysabri及BIIB107在食蟹獼猴中之受體佔用率超過90%(參見圖35)。游離VLA受體在約500小時(21天)內逐漸恢復至劑量前水準。HP1/2與相同劑量(3mg/kg)之那他珠單抗(100h)相比似乎使VLA受體飽和(>=90%)持續更長時間(多達300小時)，表明HP1/2之效力相對於那他珠單抗更強。值得注 意的是，較高HP1/2劑量(30mg/kg)引起受體嚙合時間延長約2倍，超過800小時之後水準恢復至基線水準。
HP1/2(4.73ug/mL)形成藥物結合VLA之EC50(參見表14)當與Tysabri(6.40ug/mL)相比時相對較低，表明HP1/2之效力更高。
Figure 108119374-A0305-02-0178-68
 內聯表a動物間變異性表述為變異係數。標準誤差(SE)表述為相對標準誤差(呈百分比形式)。bE0=100-E0；Emax=100-Emax。
此等資料指示HP1/2結合至食蟹獼猴α4整合素之親和力比與人類受體結合之親和力弱約5倍(完整HP1/2)及約6倍(Fab片段)。完整那他珠單抗與石蟹獼猴α4整合素之結合比與人類α4整合素弱約2倍，而Fab結合在該兩個物種之間相同。此等資料亦指示HP1/2與人類α4整合素結合之親和力高於那他珠單抗。換言之，相較於完整抗體存在約5倍差異；相較於Fab片段存在約6倍差異；且HP1/2與那他珠單抗Fab片段之間存在超過19倍差異。此最後一項比較為重要的，此係因為那他珠單抗為野生型IgG4，已知其在活體內進行Fab臂交換(擾亂)且其變為功能單價的。相比之下，HP1/2在活體內保持二價，因為其含有可使鉸鏈穩定並防止擾亂之點突變(S228P，EU編號)。出於對PD反應進行建模之目的，因而在以下所示之方程組中使用那他珠單抗Fab片段之Kd及完整HP1/2之Kd為適當的。
如圖36中所示，發現α4整合素在人類及食蟹獼猴淋巴球上之表現在2倍差異內，且不需要調節便可用於人類HP1/2預測。
使用具有線性及米開勒斯-曼登消除之雙隔室模型及直接Emax模型在猴子中表徵NTZ及HP1/2血清濃度與α4整合素飽和度(受體佔用率(RO))之間的PKPD關係。藉由對猴PK參數(k10、k12、k21及V1)進行異速生長定標來預測HP1/2人類PK。參見Singh,A.P等人，The AAPS Journal,17(2),389-399。為了確保該方法之充分性，使用藉由獲取人類及猴參數相對於其各別體重之比率的對數而在猴子及人類中獲得的NTZ PK參數來進行敏感性分析。將固有猴參數直接應用於人類，包括Km、Vmax及PD參數(Emax、EC50、E0及V1)。基於在猴子中進行之比較PKPD研究中收集之資料，使用在人類中之活體外結合親和力(Kd)及NTZ EC50來預測HP1/2在人類中之EC50。參見Muralidharan,K.K.等人，Journal of Clinical Pharmacology,57(8),1017-1030。在調節跨物種效力(Kd)差異之後，使用組合在猴子(m)及人類(h)中獲得之EC50參數值的經驗定標方法來整合資料：
Figure 108119374-A0305-02-0179-69
來自最終「人類化」模型之PKPD參數值呈由多變數常態分佈產生之分佈的形式傳遞，其中平均向量設定至來自PKPD模型之估計值的群體參數估計值及共變異數矩陣。選擇在Cmax下產生<=10%之平均RO的劑量來定義HP1/2之最低預期生物效應水準(MABEL)劑量。
在單次靜脈內投與後模擬HP1/2及那他珠單抗之受體佔用率相對於時間剖面(圖37A至圖37D)。預期每4週投與0.5mg/kg之單次劑量為有效的，在劑量後約1個月之後次治療佔用率水準(<70%)開始恢復至基線。HP1/2及NTZ均展現具有靶介導之藥物處置的PK剖面，且在猴子中顯示劑量依賴性RO。預計HP1/2(0.62ug/mL)形成藥物結合α4之EC50值當與NTZ(2.51ug/mL)相比時較低。參見Muralidharan,K.K.等人，Journal of Clinical Pharmacology,57(8),1017-1030。預測與觀測NTZ人類PK輪廓之間存在總體良好之一致性，從而支持異速生長定標方法足以預測HP1/2臨床PK。預計HP1/2在人類中之MABEL 為0.0004mg/kg(相比之下，NTZ為約0.003mg/kg，參見圖38)。
鑒於此實例17，跨兩種人類化抗α4整合素抗體整合可利用PKPD資料使得能夠使用反向轉化建模方法來估計受體佔用率及人類藥物動力學，以便鑑定最低預期生物效應水準劑量。
以上所描述之本發明之實施例意欲僅為例示性的；眾多變化及修改對熟習此項技術者將顯而易知。所有該等變化及修飾均意欲處於如任何所附申請專利範圍中所定義之本發明範疇內。
<110> 美商百健MA公司(Biogen MA Inc.)
<120> 具有降低之效應功能的抗VLA-4抗體
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<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 西班牙小鼠
<400> 1
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<213> 人工序列
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<213> 西班牙小鼠
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<213> 智人
<400> 24
Figure 108119374-A0305-02-0205-112
Figure 108119374-A0305-02-0206-113
<210> 25
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Figure 108119374-A0305-02-0206-114
Figure 108119374-A0305-02-0207-115
<210> 26
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Figure 108119374-A0305-02-0208-116
Figure 108119374-A0305-02-0209-117
<210> 27
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Figure 108119374-A0305-02-0209-118
Figure 108119374-A0305-02-0210-119
<210> 28
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Figure 108119374-A0305-02-0210-120
Figure 108119374-A0305-02-0211-121
<210> 29
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Figure 108119374-A0305-02-0212-122
Figure 108119374-A0305-02-0213-123
<210> 30
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Figure 108119374-A0305-02-0213-124
Figure 108119374-A0305-02-0214-125
<210> 31
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Figure 108119374-A0305-02-0214-126
Figure 108119374-A0305-02-0215-127
<210> 32
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Figure 108119374-A0305-02-0216-128
Figure 108119374-A0305-02-0217-129
<210> 33
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Figure 108119374-A0305-02-0217-130
Figure 108119374-A0305-02-0218-131
<210> 34
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Figure 108119374-A0305-02-0218-132
Figure 108119374-A0305-02-0219-133
<210> 35
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Figure 108119374-A0305-02-0220-134
Figure 108119374-A0305-02-0221-135
<210> 36
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Figure 108119374-A0305-02-0221-136
Figure 108119374-A0305-02-0222-137
<210> 37
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Figure 108119374-A0305-02-0222-138
Figure 108119374-A0305-02-0223-139
<210> 38
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Figure 108119374-A0305-02-0224-140
Figure 108119374-A0305-02-0225-141
<210> 39
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 39
Figure 108119374-A0305-02-0225-142
Figure 108119374-A0305-02-0226-143
<210> 40
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Figure 108119374-A0305-02-0226-144
Figure 108119374-A0305-02-0227-145
<210> 41
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Figure 108119374-A0305-02-0228-146
Figure 108119374-A0305-02-0229-147
<210> 42
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Figure 108119374-A0305-02-0229-148
Figure 108119374-A0305-02-0230-149
<210> 43
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Figure 108119374-A0305-02-0230-150
Figure 108119374-A0305-02-0231-151
Figure 108119374-A0305-02-0232-152
<210> 44
<211> 230
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Figure 108119374-A0305-02-0232-153
Figure 108119374-A0305-02-0233-154
<210> 45
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Figure 108119374-A0305-02-0233-155
Figure 108119374-A0305-02-0234-156
<210> 46
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Figure 108119374-A0305-02-0234-157
Figure 108119374-A0305-02-0235-158
Figure 108119374-A0305-02-0236-159
<210> 47
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Figure 108119374-A0305-02-0236-160
Figure 108119374-A0305-02-0237-161
<210> 48
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Figure 108119374-A0305-02-0237-162
Figure 108119374-A0305-02-0238-163
<210> 49
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Figure 108119374-A0305-02-0238-164
Figure 108119374-A0305-02-0239-165
Figure 108119374-A0305-02-0240-166
<210> 50
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Figure 108119374-A0305-02-0240-167
Figure 108119374-A0305-02-0241-168
<210> 51
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Figure 108119374-A0305-02-0241-169
Figure 108119374-A0305-02-0242-170
<210> 52
<211> 444
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Figure 108119374-A0305-02-0242-171
Figure 108119374-A0305-02-0243-172
Figure 108119374-A0305-02-0244-173
Figure 108119374-A0305-02-0245-174
<210> 53
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Figure 108119374-A0305-02-0245-175
Figure 108119374-A0305-02-0246-176
<210> 54
<211> 216
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Figure 108119374-A0305-02-0246-177
Figure 108119374-A0305-02-0247-178
<210> 55
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Figure 108119374-A0305-02-0247-179
Figure 108119374-A0305-02-0248-181
<210> 56
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Figure 108119374-A0305-02-0249-182
Figure 108119374-A0305-02-0250-183
<210> 57
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Figure 108119374-A0305-02-0250-184
Figure 108119374-A0305-02-0251-185
<210> 58
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Figure 108119374-A0305-02-0251-186
Figure 108119374-A0305-02-0252-187
<210> 59
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Figure 108119374-A0305-02-0253-188
Figure 108119374-A0305-02-0254-189
<210> 60
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Figure 108119374-A0305-02-0254-190
Figure 108119374-A0305-02-0255-191
<210> 61
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Figure 108119374-A0305-02-0255-192
Figure 108119374-A0305-02-0256-193
Figure 108119374-A0305-02-0257-194
Figure 108119374-A0305-02-0258-195
<210> 62
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Figure 108119374-A0305-02-0258-196
Figure 108119374-A0305-02-0259-197
Figure 108119374-A0305-02-0260-198
<210> 63
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Figure 108119374-A0305-02-0260-199
Figure 108119374-A0305-02-0261-200
Figure 108119374-A0305-02-0262-201
<210> 64
<211> 444
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Figure 108119374-A0305-02-0263-202
Figure 108119374-A0305-02-0264-203
Figure 108119374-A0305-02-0265-204
<210> 65
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Figure 108119374-A0305-02-0265-205
Figure 108119374-A0305-02-0266-206
<210> 66
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Figure 108119374-A0305-02-0266-207
Figure 108119374-A0305-02-0267-208
<210> 67
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Figure 108119374-A0305-02-0268-209
Figure 108119374-A0305-02-0269-210
Figure 108119374-A0305-02-0270-211
<210> 68
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Figure 108119374-A0305-02-0270-212
Figure 108119374-A0305-02-0271-213
Figure 108119374-A0305-02-0272-214
<210> 69
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Figure 108119374-A0305-02-0272-215
Figure 108119374-A0305-02-0273-216
Figure 108119374-A0305-02-0274-217
Figure 108119374-A0305-02-0275-218
<210> 70
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Figure 108119374-A0305-02-0275-219
Figure 108119374-A0305-02-0276-220
Figure 108119374-A0305-02-0277-221
<210> 71
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
Figure 108119374-A0305-02-0277-222
Figure 108119374-A0305-02-0278-223
Figure 108119374-A0305-02-0279-224
<210> 72
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Figure 108119374-A0305-02-0279-225
Figure 108119374-A0305-02-0280-226
Figure 108119374-A0305-02-0281-227
Figure 108119374-A0305-02-0282-228
<210> 73
<211> 444
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
Figure 108119374-A0305-02-0282-229
Figure 108119374-A0305-02-0283-230
Figure 108119374-A0305-02-0284-231
<210> 74
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Figure 108119374-A0305-02-0284-232
Figure 108119374-A0305-02-0285-233
<210> 75
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Figure 108119374-A0305-02-0286-234
Figure 108119374-A0305-02-0287-235
<210> 76
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Figure 108119374-A0305-02-0287-236
Figure 108119374-A0305-02-0288-237
<210> 77
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Figure 108119374-A0305-02-0288-238
Figure 108119374-A0305-02-0289-239
<210> 78
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Figure 108119374-A0305-02-0290-240
Figure 108119374-A0305-02-0291-241
<210> 79
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Figure 108119374-A0305-02-0291-242
Figure 108119374-A0305-02-0292-243
<210> 80
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 80
Figure 108119374-A0305-02-0292-244
Figure 108119374-A0305-02-0293-245
Figure 108119374-A0305-02-0294-246
Figure 108119374-A0305-02-0295-247
<210> 81
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 81
Figure 108119374-A0305-02-0295-248
Figure 108119374-A0305-02-0296-249
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Figure 108119374-A0305-02-0296-250
Figure 108119374-A0305-02-0297-251
<210> 83
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Figure 108119374-A0305-02-0297-252
Figure 108119374-A0305-02-0298-253
<210> 84
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Figure 108119374-A0305-02-0299-254
Figure 108119374-A0305-02-0300-255
<210> 85
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 85
Figure 108119374-A0305-02-0300-256
Figure 108119374-A0305-02-0301-257
Figure 108119374-A0305-02-0302-258
<210> 86
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 86
Figure 108119374-A0305-02-0302-259
Figure 108119374-A0305-02-0303-260
Figure 108119374-A0305-02-0304-261
<210> 87
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 87
Figure 108119374-A0305-02-0305-262
Figure 108119374-A0305-02-0306-263
Figure 108119374-A0305-02-0307-264
<210> 88
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 88
Figure 108119374-A0305-02-0307-265
Figure 108119374-A0305-02-0308-266
Figure 108119374-A0305-02-0309-267
<210> 89
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 89
Figure 108119374-A0305-02-0310-268
Figure 108119374-A0305-02-0311-269
Figure 108119374-A0305-02-0312-270
<210> 90
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 90
Figure 108119374-A0305-02-0312-271
Figure 108119374-A0305-02-0313-272
Figure 108119374-A0305-02-0314-273
<210> 91
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 91
Figure 108119374-A0305-02-0315-274
<210> 92
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成胺基酸序列
<400> 92
Figure 108119374-A0305-02-0315-275
Figure 108119374-A0305-02-0316-276
<210> 93
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA序列
<400> 93
Figure 108119374-A0305-02-0317-277
Figure 108119374-A0305-02-0318-278
<210> 94
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成胺基酸序列
<400> 94
Figure 108119374-A0305-02-0318-279
Figure 108119374-A0305-02-0319-280
Figure 108119374-A0305-02-0320-281

Claims (17)

  1. 一種重組抗α4抗體或其α4結合片段，其包含：(a)含有SEQ ID NO：80之序列的重鏈；及(b)含有SEQ ID NO：81之序列的輕鏈。
  2. 如請求項1之重組抗α4抗體或α4結合片段，進一步其中：該重組抗α4抗體或其α4結合片段相對於包含野生型IgG4恆定區之抗體或結合片段對擾亂具有降低之易感性。
  3. 一種重組抗α4抗體或其α4結合片段，其包含：(a)含有SEQ ID NO：11之序列的可變輕鏈；(b)含有SEQ ID NO：4之序列的可變重鏈；(c)人類κ輕鏈(SEQ ID NO：82)之恆定輕鏈；及(d)嵌合Fc區，其包含來自IgG4同型之IgG抗體的鉸鏈、CH1結構域及CH2結構域以及來自IgG1同型之IgG抗體的CH3結構域，該嵌合Fc區包含對該CH2區中EU編號第297位(Kabat編號第314位)之麩醯胺酸(Q)之取代；對該鉸鏈區中EU編號胺基酸第228位(Kabat編號第241位)之脯胺酸(P)之取代；及該CH3區中EU編號第447位(Kabat編號第478位)之離胺酸(K)之缺失。
  4. 如請求項3之重組抗α4抗體或α4結合片段，其中該抗體或片段與包含以下之抗體相比具有增加之熱穩定性：(a)含有SEQ ID NO：11之序列的可變輕鏈；(b)含有SEQ ID NO：4之序列的可變重鏈；(c)人類κ輕鏈(SEQ ID NO：82)之恆定輕鏈；及(d)包含IgG4同型之IgG抗體的鉸鏈、CH1結構域、CH2結構域及CH3結構域的Fc區，該Fc區包含對EU編號第297位(Kabat編號第314位)之非天冬醯胺殘基之取代或由其組成。
  5. 一種編碼包含以下之蛋白質之聚核苷酸： (a)含有SEQ ID NO：11之序列的可變輕鏈；(b)含有SEQ ID NO：4之序列的可變重鏈；(c)人類κ輕鏈(SEQ ID NO：82)之恆定輕鏈；及(d)嵌合Fc區，其包含來自IgG4同型之IgG抗體的鉸鏈、CH1結構域及CH2結構域以及來自IgG1同型之IgG抗體的CH3結構域，該嵌合Fc區包含對該CH2區中EU編號第297位(Kabat編號第314位)之麩醯胺酸(Q)之取代；對該鉸鏈區中EU編號胺基酸第228位(Kabat編號第241位)之脯胺酸(P)之取代；及該CH3區中EU編號第447位(Kabat編號第478位)之離胺酸(K)之缺失。
  6. 如請求項5之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼蛋白質，其包含：(a)含有SEQ ID NO：80之序列的重鏈；及(b)含有SEQ ID NO：81之序列的輕鏈。
  7. 一種包含重組抗α4抗體之醫藥組合物的用途，其係用於製備治療多發性硬化症之症狀的醫藥品，其中該重組抗α4抗體包含：(a)含有SEQ ID NO：11之序列的可變輕鏈；(b)含有SEQ ID NO：4之序列的可變重鏈；(c)人類κ輕鏈(SEQ ID NO：82)之恆定輕鏈；及(d)嵌合Fc區，其包含來自IgG4同型之IgG抗體的鉸鏈、CH1結構域及CH2結構域以及來自IgG1同型之IgG抗體的CH3結構域，該嵌合Fc區包含對該CH2區中EU編號第297位(Kabat編號第314位)之麩醯胺酸(Q)之取代；對該鉸鏈區中EU編號胺基酸第228位(Kabat編號第241位)之脯胺酸(P)之取代；及該CH3區中EU編號第447位(Kabat編號第478位)之離胺酸(K)之缺失。
  8. 如請求項7之用途，其中該重組抗α4抗體包含：(a)含有SEQ ID NO：80之序列、基本上由該序列組成或由該序列組成之重鏈；及(b)含有SEQ ID NO：81之序列、基本上由該序列組成或由該序列組成之輕鏈。
  9. 一種宿主細胞，其經以下聚核苷酸轉染：(a)編碼抗體重鏈之聚核苷酸，該抗體重鏈包含含有SEQ ID NO：4之序列的可變重鏈；及嵌合Fc區，其包含來自IgG4同型之IgG抗體的鉸鏈、CH1結構域及CH2結構域以及來自IgG1同型之IgG抗體的CH3結構域，該嵌合Fc區包含對該CH2區中EU編號第297位(Kabat編號第314位)之麩醯胺酸(Q)之取代；對該鉸鏈區中EU編號胺基酸第228位(Kabat編號第241位)之脯胺酸(P)之取代；及該CH3區中EU編號第447位(Kabat編號第478位)之離胺酸(K)之缺失；以及(b)編碼抗體輕鏈之聚核苷酸，該抗體輕鏈包含含有SEQ ID NO：11之序列的可變輕鏈及人類κ輕鏈(SEQ ID NO：82)之恆定輕鏈。
  10. 如請求項9之宿主細胞，其中該宿主細胞經以下聚核苷酸轉染：(a)編碼抗體重鏈之聚核苷酸，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：80之序列；及(b)編碼輕鏈之聚核苷酸，該輕鏈包含SEQ ID NO：81之序列。
  11. 如請求項9或10之宿主細胞，其為中國倉鼠卵巢細胞。
  12. 一種製造重組抗α4抗體或其α4結合片段之方法，該方法係藉由提供經以下聚核苷酸轉染之宿主細胞：(a)編碼抗體重鏈之聚核苷酸，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：80之序列，該聚核苷酸經定位以供表現於該細胞中；以及(b)編碼輕鏈之聚核苷酸，該輕鏈包含SEQ ID NO：81之序列，該聚核苷酸經定位以供表現於該細胞中；以及培養該經轉染之宿主細胞以產生該重組抗α4抗體分子或其α4結合片段。
  13. 如請求項12之方法，其中該宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞。
  14. 如請求項3之重組抗α4抗體或α4結合片段，進一步其中：該重組抗α4抗體或其α4結合片段相對於包含野生型IgG4恆定區之抗體或結合片段對擾亂具有降低之易感性。
  15. 一種使重組抗α4抗體或其α4結合片段對擾亂之易感性相對於包含野生型IgG4恆定區之抗體或結合片段降低的方法，該方法包括：提供經以下聚核苷酸轉染之宿主細胞：(a)編碼抗體輕鏈之聚核苷酸，該抗體輕鏈包含含有SEQ ID NO：11之序列的可變輕鏈及人類κ輕鏈(SEQ ID NO：82)之恆定輕鏈，該聚核苷酸經定位以供表現於該細胞中；以及(b)編碼抗體重鏈之聚核苷酸，該抗體重鏈包含含有SEQ ID NO：4之序列的可變重鏈；及恆定重鏈，其包含嵌合Fc區，其包含來自IgG4同型之IgG抗體的鉸鏈、CH1結構域及CH2結構域以及來自IgG1同型之IgG抗體的CH3結構域，該嵌合Fc區包含對該CH2區中EU編號第297位(Kabat編號第314位)之麩醯胺酸(Q)之取代；對該鉸鏈區中EU編號胺基酸第228位(Kabat編號第241位)之脯胺酸(P)之取代；及該CH3區中EU編號第447位(Kabat編號第478位)之離胺酸(K)之缺失，該聚核苷酸經定位以供表現於該細胞中。
  16. 一種產生相對於包含野生型IgG4恆定區之抗體或結合片段對擾亂具有降低之易感性的重組抗α4抗體或其α4結合片段的方法，該方法包括：提供經以下聚核苷酸轉染之宿主細胞：(a)編碼抗體重鏈之聚核苷酸，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：80之序列，該聚核苷酸經定位以供表現於該細胞中；以及(b)編碼輕鏈之聚核苷酸，該輕鏈包含SEQ ID NO：81之序列，該聚核苷酸經定位以供表現於該細胞中；以及培養該經轉染之宿主細胞以產生該重組抗α4抗體分子或其α4結合片段。
  17. 如請求項15或16之方法，其中該宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞。
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