ES2633105T3

ES2633105T3 - Anticuerpos contra VLA-4

Info

Publication number: ES2633105T3
Application number: ES11730120.0T
Authority: ES
Inventors: Alexey A. Lugovskoy; Frederick R. Taylor; Karen Mclachlan
Original assignee: Biogen MA Inc
Current assignee: Biogen MA Inc
Priority date: 2010-04-16
Filing date: 2011-04-15
Publication date: 2017-09-19
Anticipated expiration: 2031-04-15
Also published as: EP4032912A1; EP2558499B1; US11083791B2; ES2805873T3; BR112012026403A8; DK3466977T3; WO2011130603A3; CY1122978T1; PT3202789T; SG10202112020VA; BR112012026403B1; MX340683B; EA201291065A1; SI3202789T1; CA2794863C; JP2020019811A; JP2018123165A; US10335485B2; EP3466977A1; BR112012026403A2

Abstract

Una molécula de anticuerpo recombinante o un fragmento de la misma que se une a α4 que comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, en la que: (a) la cadena pesada variable comprende la secuencia del armazón de la cadena pesada variable de IGHV1-f y las CDR de la cadena VH del anticuerpo murino HP1/2, en la que CDR1 comprende la secuencia GFNIKDTYM, CDR2 comprende la secuencia RIDPASGDTKYDPKFQV y CDR3 comprende la secuencia GMWVSTGYALDF; y (b) la cadena ligera variable comprende la secuencia del armazón de la cadena ligera variable de IGKV4-1 y las CDR de la cadena VL del anticuerpo murino HP1/2, en la que CDR1 comprende la secuencia KASQSVTNDVA, CDR2 comprende la secuencia YASNRYT y CDR3 comprende la secuencia QQDYSSPYT, en la que: (i) los restos aminoacídicos en las posiciones 1, 67 y 87 del armazón de la cadena ligera variable según el esquema de numeración de Kabat están sustituidos con restos no humanos, en los que el resto no humano en la posición 1 del armazón es serina (S), el resto no humano en la posición 67 del armazón es tirosina (Y) y el resto no humano en la posición 87 del armazón es fenilalanina (F); y (ii) los restos aminoacídicos en las posiciones 24 y 94 del armazón de la cadena pesada variable según el esquema de numeración de Kabat están sustituidos con restos no humanos, en los que el resto no humano en la posición 24 del armazón es alanina (A) y el resto no humano en la posición 94 del armazón es ácido aspártico (D); y en la que la molécula de anticuerpo recombinante o el fragmento de la misma que se une a α4 se une a VLA-4.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos contra VLA-4 5 SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los EE. UU. n.° 65/324.944, presentada el 16 de abril de 2010.

10 CAMPO DE LA INVENCION

[0002] Esta invencion se refiere a anticuerpos que se unen a a4 y a fragmentos de los mismos que se unen a a4.

15 ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0003] Los anticuerpos humanizados pueden usarse como agentes terapeuticos en lugar de anticuerpos murinos para evitar la respuesta inmunitaria indeseada en humanos denominada respuesta HAMA (anticuerpos humanos contra inmunoglobulinas de raton). Los anticuerpos humanizados se construyen generalmente

20 sustituyendo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo humano por las CDR de otra especie, tlpicamente de un anticuerpo de raton.

[0004] VLA-4 (o tambien a4p1) es un miembro de la familia de integrinas p1 de los receptores de la superficie celular. VLA-4 contiene una cadena a4 y una cadena p1 y esta implicada en interacciones intercelulares. Su

25 expresion se limita principalmente a celulas linfoclticas y mieloclticas. VLA-4 se une al ligando de celulas endoteliales VCAM-1 (molecula de adhesion a celulas vasculares 1) y puede facilitar la fijacion de los linfocitos T y B al fragmento que se une a la heparina II de la fibronectina del plasma humano.

[0005] El documento WO 2006096653 describe un anticuerpo contra VLA-4 denominado HP1/2 y variantes 30 humanizadas del mismo que usan un armazon aceptor de la region variable de la cadena pesada de IGHV1-f.

RESUMEN DE LA INVENCION

[0006] El tema de la invencion se define por las reivindicaciones.

35

[0007] Los inventores han descubierto que pueden usarse armazones de las regiones variables de la llnea germinal para optimizar anticuerpos que se unen a a4 con CDR injertadas, como los anticuerpos contra VLA-4. Por consiguiente, la invencion presenta cadenas pesadas variables (VH) y ligeras variables (VL) contra VLA-4 y moleculas de anticuerpos que incluyen tales armazones.

40

[0008] En un aspecto, la descripcion presenta una cadena VH de un anticuerpo contra a4 que tiene regiones CDR de un anticuerpo contra a4 donante, por ejemplo, un anticuerpo contra a4 descrito en este documento, y un armazon de la VH que tiene las regiones 1, 2, 3 y 4 de la secuencia de una region variable de la llnea germinal para la cadena VH, o que no tiene mas de cinco, diez o quince diferencias con respecto a la misma. En una realization, la

45 region de armazon variable 4 (FR4) es una secuencia consenso humana. En una realizacion, estan presentes todas las regiones de armazon FR1, FR2, FR3 y FR4 de la cadena VH. En otra realizacion, la cadena es un fragmento de union antigenica de una region de VH.

[0009] En una realizacion, la secuencia de la llnea germinal es la del IGHV1-f humano (SEQ ID NO:2) 50 mostrada en la figura 1. En ciertas realizaciones, la secuencia del armazon de la VH puede diferir en al menos uno,

pero no mas de dos, tres, cuatro, cinco, diez o quince restos aminoacldicos de una secuencia de la llnea germinal, por ejemplo, SEQ ID NO:2. En una realizacion, el armazon de la VH incluye ademas restos distintos de los restos humanos correspondientes. Por ejemplo, la cadena VH incluye restos no humanos en una o mas de las posiciones 24, 67, 76, 80 y 94 (numeration de Kabat) del armazon de SEQ ID NO:2.

55

[0010] En una realizacion, al menos una o mas de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los dominios variables derivan de un anticuerpo no humano donante que se une a a4. En una realizacion, las regiones de union antigenica del dominio variable de la cadena pesada con CDR injertadas incluyen las CDR correspondientes a las posiciones 26-34 (CDR1), 50-65 (CDR2) y 95-102 (CDR3) (numeracion de Kabat; Kabat et

al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a edicion, vol. 4, 1995, Departamento de Salud y Servicios Sociales de los EE. UU., NIH, EE. UU.).

[0011] Por lo tanto, en una realizacion, el armazon de la cadena pesada variable (VH) tiene una secuencia 5 aceptora derivada de la secuencia de la llnea germinal del anticuerpo humano IGHV1-f.

[0012] En otra realizacion, al menos un aminoacido, y menos de dos, tres, cuatro, cinco o diez restos aminoacldicos, en la region FR1 de la VH es distinto del resto correspondiente de la llnea germinal humana. Por ejemplo, uno o mas de tales restos pueden ser identicos a los de la region de armazon del anticuerpo no humano de

10 que derivan las secuencias CDR. En una realizacion, el resto aminoacldico en la posicion 24 de Kabat esta mutado para ser identico al de la region de armazon del anticuerpo no humano.

[0013] En otra realizacion, al menos un aminoacido, y menos de dos, tres, cuatro, cinco o diez restos aminoacldicos, en la region FR2 de la VH es distinto del resto correspondiente de la llnea germinal humana. Por

15 ejemplo, uno o mas de tales restos pueden ser identicos a los de la region de armazon del anticuerpo no humano de que derivan las secuencias CDR.

[0014] En otra realizacion mas, al menos un aminoacido, y menos de dos, tres, cuatro, cinco o diez restos aminoacldicos, en la region FR3 de la cadena VH es distinto del resto correspondiente de la llnea germinal humana.

20 Por ejemplo, uno o mas de tales restos pueden ser identicos a los de la region de armazon del anticuerpo no humano de que derivan las secuencias cDr. En una realizacion, el resto aminoacldico en la posicion 94 de Kabat es identico al de la region de armazon del anticuerpo no humano. En otra realizacion mas, los restos aminoacldicos en las posiciones 67, 76, 80 y 94 de Kabat son identicos a los de la region de armazon del anticuerpo no humano.

25 [0015] En ciertas realizaciones, la cadena VH del anticuerpo tiene la secuencia de SEQ ID NO:3, SEQ ID

NO:4 o SEQ ID NO:5.

[0016] En un aspecto, la description presenta una cadena VL contra VLA-4 que tiene regiones CDR de un anticuerpo contra VLA-4 donante, por ejemplo, un anticuerpo contra VLA-4 descrito en este documento, y un

30 armazon de la VL que tiene las regiones 1, 2, 3 y 4 de la secuencia de una region variable de la llnea germinal para la cadena VL, o que no tiene mas de cinco, diez o quince diferencias (por region o en total) con respecto a la misma. En una realizacion, la region de armazon variable 4 (FR4) es una secuencia consenso humana. En una realizacion, estan presentes todas las regiones de armazon FR1, FR2, FR3 y FR4 de la cadena VL. En otra realizacion, la cadena es un fragmento de union antigenica de una region VL.

35

[0017] En otra realizacion, la secuencia de la llnea germinal es la de IGKV4-1 (SEQ ID NO:7), mostrada en la

figura 2. En otras realizaciones mas, la secuencia del armazon de VL puede diferir en al menos uno, pero no mas de dos, tres, cuatro, cinco, diez o quince restos aminoacldicos de una secuencia de armazon de la llnea germinal, por ejemplo, SEQ ID NO:7. En otra realizacion, la VL incluye ademas restos distintos de los restos aminoacldicos

40 humanos correspondientes. Por ejemplo, la cadena VL incluye ademas restos no humanos en una o mas de las posiciones 1, 73 y 87 (numeration de Kabat) del armazon de SEQ ID NO:7.

[0018] En una realizacion, la secuencia es la de AAH7035.1 (SEQ ID NO:12) o la version genomanipulada en

la llnea germinal (SEQ ID NO:13) mostrada en la figura 2. En algunas realizaciones, la secuencia del armazon de la

45 VL puede diferir en al menos uno, pero no mas de cinco, diez, quince, veinte o veinticinco restos aminoacldicos de una secuencia de armazon genomanipulada en la llnea germinal, por ejemplo, SEQ ID NO:13. En una realizacion, la cadena VL incluye restos distintos de los restos humanos correspondientes. Por ejemplo, la cadena VL incluye ademas restos no humanos en una o mas de las posiciones 1 y 87 (numeracion de Kabat) del armazon de SEQ ID NO:12. En otra realizacion, la VL incluye sustituciones aminoacldicas en las regiones de armazon para parecerse a 50 una secuencia de armazon de la llnea germinal humana diferente, como la secuencia de IGKV4-1 de la llnea germinal. En ciertas realizaciones, la secuencia del armazon de la VL se altera para ser identica a la secuencia de IGKV4-1 de la llnea germinal en las posiciones 1-3, 5-23, 35-37, 39-42, 45-49, 57, 59-61, 63-64, 70-72, 74-84, 86-88 y 99-106 (numeracion de Kabat) de SeQ ID NO:12.

55 [0019] En una realizacion, al menos una o mas de las regiones determinantes de complementariedad (CDR)

de los dominios variables derivan de un anticuerpo no humano donante que se une a a4. En otra realizacion, las regiones de union antigenica del dominio variable de la cadena pesada con CDR injertadas incluyen las CDR correspondientes a las posiciones 24-31 (CDR1), 50-56 (CDR2) y 89-97 (CDR3) (numeracion de Kabat). Por lo tanto, en una realizacion, el armazon de la VL tiene una secuencia aceptora construida a partir de la secuencia de la

ilnea germinal de IGKV4-1, del anticuerpo AAH70335.1 o del anticuerpo AAH70335.1 genomanipulado en la llnea germinal.

[0020] En otra realizacion mas, al menos un aminoacido, y menos de dos, tres, cuatro, cinco, diez o quince

5 restos, en la region FR1 de la cadena VL es distinto del resto humano correspondiente. Por ejemplo, uno o mas de tales restos pueden ser identicos a los de la region de armazon del anticuerpo no humano de que derivan las

secuencias CDR. En una realizacion, el resto aminoacldico en la posicion N-terminal de la FR1 esta mutado para ser

identico al de la region de armazon del anticuerpo no humano.

10 [0021] En otra realizacion, al menos un aminoacido, y menos de dos, tres, cuatro, cinco, diez o quince restos,

en la region FR2 de la cadena VL es distinto del resto humano correspondiente. Por ejemplo, uno o mas de tales restos pueden ser identicos a los de la region de armazon del anticuerpo no humano de que derivan las secuencias CDR.

15 [0022] En otra realizacion mas, al menos un aminoacido, y menos de dos, tres, cuatro, cinco, diez o quince

restos, en la region FR3 de la cadena VL es distinto del resto humano correspondiente. Por ejemplo, uno o mas de tales restos pueden ser identicos a los de la region de armazon del anticuerpo no humano de que derivan las

secuencias CDR. En otra realizacion, el resto aminoacldico en la posicion 87 de Kabat esta mutado para ser identico

al de la region de armazon del anticuerpo no humano. En otra realizacion mas, los restos aminoacldicos en las 20 posiciones 67 y 87 de Kabat estan mutados para ser identicos a los de la secuencia del armazon del anticuerpo no humano. En otra realizacion mas, los restos aminoacldicos en las posiciones 67, 73 y 87 de Kabat de SEQ ID NO:7 estan mutados para ser identicos a los de la secuencia del armazon del anticuerpo no humano.

[0023] En otras realizaciones, la cadena VL del anticuerpo tiene la secuencia de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 25 SEQ ID N:10 o SEQ ID NO:11.

[0024] En una realizacion, las CDR de las secuencias de los armazones aceptores de las VH y VL se seleccionan para parecerse a las secuencias de las CDR de la secuencia de un anticuerpo no humano (por ejemplo, murino), en que el anticuerpo no humano se une a la integrina a4 o a un fragmento de la misma. En otra realizacion,

30 las secuencias de las CDR se seleccionan para parecerse a las secuencias de las CDR de un anticuerpo no humano que se une al epltopo B1 de la cadena a4 de VLA-4. En una realizacion, las CDR se seleccionan para parecerse a un anticuerpo monoclonal murino, por ejemplo, HP1/2, HP2/1, HP2/4, L25, P4C2 o 21.6 (Pulido et al., J. Biol. Chem. 266: 10241-10245, 1991; patente de los EE. UU. n.° 6.033.665). Modificacion puede significar, por ejemplo, escision e insertion o alteration, por ejemplo, por mutagenesis dirigida.

35

[0025] En otro aspecto, la description presenta un anticuerpo o un fragmento de union antigenica del mismo, que incluye:

- una cadena VL contra VLA-4 descrita en este documento, por ejemplo, una cadena VL contra VLA-4 que tiene 40 regiones CDR de un anticuerpo contra VLA-4 donante, por ejemplo, un anticuerpo contra VLA-4 descrito en este documento, y un armazon de la VL que tiene las regiones de armazon de LC 1, 2 y 3 de la secuencia de una region variable de la llnea germinal para la cadena VL, o que no tiene mas de cinco, diez o quince diferencias con respecto a la misma; en una realizacion, la region variable 4 es una secuencia consenso humana; y

45 - una cadena VH contra VLA-4 descrita en este documento, por ejemplo, una cadena VL contra VLA-4 que tiene regiones CDR de un anticuerpo contra VLA-4 donante, por ejemplo, un anticuerpo contra VLA-4 descrito en este documento, y un armazon de la VL que tiene las regiones de armazon de LC 1, 2 y 3 de la secuencia de una region variable de la llnea germinal para la cadena VL, o que no tiene mas de cinco, diez o quince diferencias con respecto a la misma; en una realizacion, la region variable 4 es una secuencia consenso humana.

50

[0026] En una realizacion, el anticuerpo se une a uno de a4p1 y a4p7 o a los dos.

[0027] En otro aspecto, una cadena VL o VH o un anticuerpo o un fragmento de los mismos, descritos en este documento, estan marcados de manera detectable.

55

[0028] En otro aspecto mas, la descripcion presenta un vector que contiene ADN codificante de la cadena pesada de un anticuerpo o un fragmento de la misma que se une a a4, descritos en este documento. En algunas realizaciones, el ADN del vector codifica una VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5.

[0029] En otro aspecto mas, la descripcion presenta un vector que contiene ADN codificante de la cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de la misma que se une a a4, descritos en este documento. En algunas realizaciones, el ADN del vector codifica una cadena VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ

5 ID NO:10 o SEQ ID NO:11.

[0030] En otro aspecto mas, la descripcion presenta un vector que contiene ADN codificante de la cadena pesada de un anticuerpo o un fragmento de la misma que se une a a4, descritos en este documento y de la cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de la misma que se une a a4, descritos en este documento.

10

[0031] En otro aspecto, la descripcion presenta una celula hospedadora que contiene un vector descrito en este documento, por ejemplo, una celula capaz de expresar la cadena pesada y/o la cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento del anticuerpo descritos en este documento.

15 [0032] En un aspecto, la descripcion presenta un procedimiento para preparar un anticuerpo recombinante

contra a4, o un fragmento del mismo que se une a a4, proporcionando una celula hospedadora transfectada con (a) una secuencia de ADN que codifica la cadena pesada de un anticuerpo descrita en este documento o un fragmento de la misma que se une a a4 y (b) una secuencia de ADN que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de la misma que se une a a4, y cultivando la celula transfectada para producir la molecula del anticuerpo

20 recombinante contra a4 o un fragmento del mismo que se une a4. El ADN codificante de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo puede producirse en el mismo vector o en vectores diferentes.

[0033] En un aspecto, la descripcion presenta un procedimiento para preparar un anticuerpo recombinante contra a4 o un fragmento del mismo que se une a a4, proporcionando una celula hospedadora transfectada con (a)

25 una secuencia de ADN que codifica la cadena pesada de un anticuerpo o un fragmento de la misma que se une a a4, por ejemplo, en que la secuencia de ADN tiene la secuencia de SEQ ID NO:3, 4 o 5, y (b) una secuencia de ADN que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de la misma que se une a a4, por ejemplo, en que la secuencia de ADN tiene la secuencia de SEQ ID NO:8, 9, 10 o 11, y cultivando la llnea celular transfectada para producir la molecula del anticuerpo recombinante contra a4 o un fragmento del mismo que se une a4. El ADN

30 codificante de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo puede producirse en el mismo vector o en vectores diferentes.

[0034] En otro aspecto, la descripcion presenta un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por una integrina a4, por ejemplo, una integrina a4p1 (VLA-4) o a4p7, mediante la administration

35 de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra a4 descrito en este documento o una composition farmaceutica que contiene el anticuerpo o fragmento a un sujeto que necesita un tratamiento semejante. El sujeto puede tener o correr el riesgo de padecer, por ejemplo, trastornos inflamatorios, inmunitarios o autoinmunitarios (por ejemplo, inflamaciones del sistema nervioso central como esclerosis multiple, meningitis, neuromielitis optica, neurosarcoidosis, vasculitis del SNC, encefalitis y mielitis transversa), rechazo de injertos de tejidos u organos o

40 enfermedad injerto contra huesped, lesiones agudas del SNC como ictus, traumatismo craneoencefalico (TCE) o lesiones medulares (LM); nefropatla cronica; alergias, por ejemplo, asma alergico; diabetes sacarina de tipo 1; trastornos intestinales inflamatorios como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; miastenia grave; fibromialgia; trastornos artrlticos como artritis reumatoide y artritis psoriatica; trastornos cutaneos inflamatorios/inmunitarios como psoriasis, vitiligo, dermatitis, liquen plano; lupus sistemico eritematoso; slndrome de Sjogren; canceres

45 hematologicos como mieloma multiple, leucemia, linfoma; canceres solidos como sarcomas o carcinomas, por ejemplo, de pulmon, mama, prostata, cerebro; y trastornos fibroticos como fibrosis pulmonar, mielofibrosis, cirrosis hepatica, glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis creciente, nefropatla diabetica y fibrosis intersticial renal.

50 [0035] En otro aspecto, la descripcion presenta un procedimiento de tratamiento de un paciente mediante la

administracion al paciente de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a a4. En una realization, el paciente tiene un cancer, como un tumor solido o una neoplasia hematologica. Por ejemplo, un paciente tratado con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a a4 puede tener leucemia mielogena aguda (LMA) o mieloma multiple (MM).

55

[0036] En otra realizacion, el paciente tiene un trastorno inflamatorio como esclerosis multiple, asma (por

ejemplo, asma de moderada a grave), artritis reumatoide, diabetes o la enfermedad de Crohn. En otra realizacion, la composicion se administra como un regimen. En otra realizacion mas, el procedimiento incluye ademas la selection de un paciente para el tratamiento con la composicion. Un paciente adecuado para el tratamiento, por ejemplo, ha

mostrado un signo o un slntoma indicativo de la aparicion de la enfermedad, como un signo o slntoma indicativo de EM.

[0037] En otra realizacion mas, el procedimiento incluye ademas la administracion al paciente de un segundo 5 agente terapeutico, como un agente quimioterapeutico, un agente trombolltico, un agente neuroprotector, un agente

antiinflamatorio, un esteroide, una citocina o un factor de crecimiento.

[0038] En una realizacion, al paciente se le administra un anticuerpo contra VLA-4 humanizado, o un fragmento del mismo, descrito en este documento como HuHP1/2, H1L1, H1L2 o H1L3.

10

[0039] En una realizacion, la composicion que contiene un anticuerpo que se une a a4 se administra como un regimen, por ejemplo, a intervalos regulares. Por ejemplo, la composicion puede administrarse una vez diaria, semanal o mensualmente; una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana o mas; o una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas o mas.

15

[0040] En una realizacion, la dosificacion puede ajustarse de acuerdo con la tasa de aclaramiento en el paciente de una administracion previa de un anticuerpo contra a4. Por ejemplo, en una realizacion, al paciente no se le administrara una segunda dosis o dosis de continuacion antes de que el nivel de los anticuerpos contra a4 en el sistema del paciente haya disminuido por debajo de un nivel predeterminado. En una realizacion, se analiza una

20 muestra de un paciente (por ejemplo, una muestra de plasma, suero, sangre u orina) para determinar la presencia de anticuerpos contra a4 y si el nivel de los anticuerpos contra a4 esta por encima de un nivel predeterminado, al paciente no se le administrara una segunda dosis o dosis de continuacion. Si el nivel de los anticuerpos contra a4 en el sistema del paciente esta por debajo de un nivel predeterminado, entonces al paciente se le administrara una segunda dosis o dosis de continuacion.

25

[0041] En una realizacion, la composicion se administra continuadamente, por ejemplo, durante un periodo de mas de 30 minutos, pero de menos de 1, 2, 4 o 12 horas. La composicion que contiene el anticuerpo y el segundo agente puede administrarse por cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, por via subcutanea, intramuscular o intravenosa.

30

[0042] En algunas realizaciones, cada uno de los dos, anticuerpo y segundo agente, se administran en la misma dosis que se prescribe para un monotratamiento. En otras realizaciones, el anticuerpo se administra en una dosis que es igual o menor que la cantidad requerida para su eficacia si se administra solo. Igualmente, el segundo agente puede administrarse en una dosis que es igual o menor que la cantidad requerida para su eficacia si se

35 administra solo.

[0043] Otro aspecto presentado en la descripcion es un procedimiento de evaluacion de un paciente mediante la determinacion de si el paciente cumple un criterio preseleccionado, y si el paciente cumple el criterio preseleccionado, la aprobacion, suministro, prescripcion o administracion al paciente de una formulacion de un

40 anticuerpo que se une a VLA-4 descrito en este documento. En una realizacion, el criterio preseleccionado es la falta de una respuesta adecuada del paciente a un tratamiento o regimen terapeutico alternativo previo, por ejemplo, para el tratamiento de la EM. En otra realizacion, el criterio preseleccionado es la ausencia de cualquier signo o slntoma de leucoencefalopatla multifocal progresiva (LMP) o la ausencia de cualquier diagnostico de LMP. En algunos casos, la seleccion se basa en la ausencia de un factor de riesgo para LMP, por ejemplo, el sujeto no resulta positivo para 45 el ADN del virus JC o no resulta positivo para anticuerpos contra el virus JC. En otra realizacion, el criterio es segun se describe en el documento PCT/US 07/75577 (publicado como WO 2008/021954), que describe procedimientos y sistemas para la distribucion de farmacos y para el suministro de farmacos a pacientes.

[0044] En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de distribucion de una composicion descrita en este 50 documento. La composicion contiene un anticuerpo que se une a a4. El procedimiento incluye proporcionar a un

destinatario (por ejemplo, un usuario final, paciente, medico, farmacia minorista o mayorista, distribuidor o departamento farmaceutico en un hospital, cllnica particular o seguro medico cerrado (HMO)) un envase que contiene suficientes dosis unitarias del farmaco para tratar al paciente durante al menos 6, 12, 24, 36 o 48 meses. En otro aspecto, la invencion presenta un procedimiento de evaluacion de la calidad de un envase o lote de envases 55 (por ejemplo, para determinar si han caducado) de una composicion descrita en este documento que contiene un anticuerpo que se une a a4. El procedimiento incluye evaluar si el envase ha caducado. La fecha de caducidad es al menos 6, 12, 24, 36 o 48 meses, por ejemplo mas de 24 o 36 meses, despues de un momento preseleccionado, como la fabricacion, ensayado o envasado. En algunas realizaciones, se toma una decision o medida como resultado del analisis. Por ejemplo, dependiendo del analisis correcto, el anticuerpo en el envase se usa o desecha,

se clasifica, selecciona, libera o retiene, se envla, se traslada a un nuevo lugar, se libera al comercio, se vende o se ofrece a la venta, se retira del comercio o deja de ofrecerse a la venta, dependiendo de si el producto ha caducado.

[0045] En otro aspecto, la descripcion presenta un envase que contiene al menos dos dosis unitarias de una 5 composition acuosa que contiene un anticuerpo contra a4. En una realization, todas las dosis unitarias contienen la

misma cantidad del anticuerpo y en otras realizaciones hay dosis unitarias de dos o mas concentraciones o dos o mas formulaciones diferentes, por ejemplo, con distintas concentraciones o propiedades de liberation.

[0046] En otro aspecto, la descripcion incluye un procedimiento para instruir al destinatario sobre la 10 administration de una formulation que contiene un anticuerpo que se une a a4. El procedimiento incluye instruir al

destinatario (por ejemplo, un usuario final, paciente, medico, farmacia minorista o mayorista, distribuidor o departamento farmaceutico en un hospital, cllnica particular o seguro medico cerrado (HMO)) acerca de que el anticuerpo debe administrarse a un paciente de acuerdo con un regimen descrito en este documento. El procedimiento tambien puede incluir instruir al destinatario acerca de que el anticuerpo debe administrarse antes de 15 la fecha de caducidad. La fecha de caducidad es al menos 6, 12, 24, 36 o 48 meses, por ejemplo mas de 24 o 36 meses, despues de un momento preseleccionado, como la fabricacion, ensayado o envasado. En una realizacion, el destinatario tambien recibe un suministro del anticuerpo, por ejemplo, un suministro de dosis unitarias del anticuerpo.

20 [0047] En otro aspecto, la descripcion presenta un procedimiento de preparation de un anticuerpo que

incluye regiones CDR de un anticuerpo donante, como un anticuerpo no humano, por ejemplo, murino, y armazones de las regiones variables de una o las dos cadenas, pesada y ligera, derivados de una region o regiones de armazon de las regiones variables de la llnea germinal humana. El procedimiento incluye uno o los dos de 1 y 2, en que 1 y 2 son como sigue:

25

1. identificar o seleccionar un armazon aceptor variable humano y estable de la cadena pesada, que tiene los mismos restos que la cadena pesada donante no humana en uno o mas de los restos en una o mas de a), b) y c):

a) las posiciones de Kabat de la VH n.° 2, 4, 24, 26, 27, 29, 36, 38, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 69, 71, 78, 93 y 94, las 30 cuales, sin querer limitarse a la teorla, se piensa que son importantes para mantener las conformaciones de las

CDR;

b) las posiciones de Kabat de la VH n.° 1, 2, 27, 28, 30, 43, 66, 68, 70, 72, 73, 74 y 75, las cuales, sin querer limitarse a la teorla, se piensa que son capaces de interaccionar con el antlgeno; y

c) las posiciones de Kabat de la VH n.° 37, 39, 44, 45, 47, 91, 93 y 103, las cuales, sin querer limitarse a la teorla, se 35 piensa que son importantes para la integridad de la interfaz VH/vL;

2. identificar o seleccionar un armazon aceptor variable y estable de la cadena ligera, que tiene los mismos restos que la cadena ligera donante en uno o mas de los restos en una o mas de a), b) y c):

40 a) las posiciones de Kabat de la VL n.° 2, 4, 38, 43, 44, 48, 58, 64, 71 y 73, las cuales, sin querer limitarse a la teorla, se piensa que son importantes para mantener las conformaciones de las CDR;

b) las posiciones de Kabat de la VL n.° 1, 2, 49, 57, 60, 63, 65, 66, 67, 68, 69 y 70, las cuales, sin querer limitarse a la teorla, se piensa que son capaces de interaccionar con el antlgeno; y

c) las posiciones de Kabat de la VL n.° 36, 38, 43, 44, 46, 49, 87 y 98, las cuales, sin querer limitarse a la teorla, se 45 piensa que son importantes para la integridad de la interfaz VH/VL;

3. proporcionar una region variable que tiene CDR donantes y el armazon de la llnea germinal seleccionado con los restos coincidentes identificados en 1 o 2, por ejemplo, seleccionando una secuencia de la llnea germinal y retromutando posteriormente los restos adicionales identificados en 1 o 2 de la llnea germinal a la secuencia murina

50 para maximizar as! la coincidencia de los restos identificados en 1 y 2; y

4. evaluar cada position coincidente, por ejemplo por analisis estructural o modelado tridimensional y, si una position presenta un estandar de riesgo predeterminado, por ejemplo, de interferir con las conformaciones de las CDR, las interacciones con el antlgeno o la integridad de la interfaz VH/VL, reintroducir entonces un resto murino

55 equivalente o un resto de un anticuerpo humano comun, compatible con la estructura del anticuerpo.

En una realizacion, al menos tres, cuatro o cinco de los restos identificados en (1.a) son coincidentes. Por ejemplo, en una realizacion, los restos 24, 29 o 94 son coincidentes.

[0048] En una realizacion, al menos tres, cuatro o cinco de los restos identificados en (1.b) son coincidentes. por ejemplo, en una realizacion, los restos 1,73 o 75 son coincidentes.

[0049] En una realizacion, al menos tres, cuatro o cinco de los restos identificados en (1.c) son coincidentes. 5 por ejemplo, en una realizacion, los restos 37, 93 o 103 son coincidentes.

[0050]

En una realizacion, al menos tres, cuatro o cinco de los restos identificados en (2.a) son coincidentes.

por ejemplo, en una realizacion, los restos 2, 71 y 73 son coincidentes.

10 [0051]

En una realizacion, al menos tres, cuatro o cinco de los restos identificados en (2.b) son coincidentes.

por ejemplo, en una realizacion, los restos 1,68 o 70 son coincidentes.

[0052] En una realizacion, al menos tres, cuatro o cinco de los restos identificados en (2.c) son coincidentes.

por ejemplo, en una realizacion, los restos 46, 87 o 98 son coincidentes.

15

[0053] En una realizacion, el resto 6 en (1.a), el resto 2 en (1.b) y el resto 4 en (1.c) son coincidentes.

[0054] En otra realizacion, el resto 4 en (2.a), el resto 2 en (2.b) y el resto 4 en (2.c) son coincidentes.

20 [0055] En una realizacion, la secuencia de la llnea germinal para la cadena pesada corresponde a las clases

VH3, VH1 y VH5 de la llnea germinal. En otra realizacion, la secuencia de la llnea germinal para la cadena ligera es

una secuencia de Vk o VA.

[0056] El termino “tratar” se refiere a administrar un tratamiento en una cantidad, manera y/o modo eficaz 25 para mejorar una dolencia, slntoma o parametro asociado con un trastorno o para prevenir la progresion de un

trastorno, bien en un grado estadlsticamente significativo o en un grado detectable para un experto en la tecnica. La cantidad, manera o modo eficaz puede variar dependiendo del sujeto y puede ajustarse al sujeto.

[0057] Un “anticuerpo que se une a a4” se refiere a un anticuerpo que se une a la subunidad a4 de la 30 integrina VLA-4 (a4p1) e inhibe al menos parcialmente una actividad de VLA-4, especialmente una actividad de

union de la integrina VLA-4 o una actividad de senalizacion, por ejemplo, la capacidad de transducir una senal mediada por VLA-4. Por ejemplo, un anticuerpo que se une a VLA-4 puede inhibir la union de VLA-4 a un ligando afln de VLA-4, por ejemplo, una protelna de la superficie celular como VCAM-1 (molecula de adhesion a celulas vasculares 1), o a un componente de la matriz extracelular como fibronectina u osteopontina. Un anticuerpo que se 35 une a a4 puede unirse a las dos a4p1 o a4p7. Tlpicamente, el anticuerpo se une al epltopo B1 de a4. Un anticuerpo que se une a a4 puede unirse a VLA-4 con una Kd de menos de aproximadamente 10'6, 10'7, 10'8, 10'9, 10'10 o 10'11

M.

[0058] Tal como se usa en este documento, el termino “anticuerpo” se refiere a una protelna que incluye al 40 menos una region variable de inmunoglobulina, por ejemplo, una secuencia aminoacldica que proporciona un

dominio variable de inmunoglobulina o una secuencia de un dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una region variable de una cadena pesada (H) (abreviada en este documento como VH) y una region variable de una cadena ligera (L) (abreviada en este documento como VL). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de la cadena pesada (H) y dos regiones variables de la cadena ligera (L). 45 Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de los tipos k o A. En una realizacion, el anticuerpo esta glucosilado. Un anticuerpo puede ser funcional para citotoxicidad dependiente de anticuerpos y/o citotoxicidad mediada por el complemento o puede no ser funcional para una o ninguna de estas actividades.

[0059] Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariablidad 50 denominadas “regiones determinantes de complementariedad” (“CDR”), intercaladas con regiones que estan mas

conservadas, denominadas “regiones de armazon” (FR). La extension de las FR y las CDR ha sido definida con exactitud (vease Kabat E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a edicion, Departamento de Salud y Servicios Sociales de los EE. UU., publicacion del NIH n.° 91-3242; y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). En este documento se usan las definiciones de Kabat. Cada una de las VH y VL 55 se compone tlpicamente de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0060] Un “dominio de inmunoglobulina” se refiere a un dominio del dominio variable o constante de moleculas de inmunoglobulina. Los dominios de inmunoglobulina contienen tlpicamente dos laminas p formadas por

aproximadamente siete hebras p y un enlace disulfuro conservado (vease, por ejemplo, A. F. Williams y A. N. Barclay (1988) Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405).

[0061] Tal como se usa en este documento, una “secuencia de un dominio variable de inmunoglobulina” se 5 refiere a una secuencia aminoacldica que puede formar la estructura de un dominio variable de inmunoglobulina. Por

ejemplo, la secuencia puede incluir toda o parte de la secuencia aminoacldica de un dominio variable de origen natural. Por ejemplo, la secuencia puede omitir uno, dos o mas aminoacidos N o C-terminales, aminoacidos internos, puede incluir una o mas inserciones o aminoacidos terminales adicionales o puede incluir otras alteraciones. En una realizacion, un polipeptido que incluye la secuencia de un dominio variable de inmunoglobulina puede asociarse con 10 la secuencia de otro dominio variable de inmunoglobulina para formar una estructura diana de union (o “sitio de union antigenica”), por ejemplo, una estructura que interacciona con VLA-4.

[0062] Las cadenas VH o VL del anticuerpo pueden incluir ademas toda o parte de la region constante de una cadena pesada o ligera para as! formar una cadena de inmunoglobulina pesada o ligera, respectivamente. En una

15 realizacion, el anticuerpo es un tetramero de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina pueden estar conectadas por enlaces disulfuro. La region constante de la cadena pesada incluye tlpicamente tres dominios constantes, CH1, CH2 y CH3. La region constante de la cadena ligera incluye tlpicamente un dominio CL. La region variable de las cadenas pesada y ligera contiene un dominio de union que interacciona con un antlgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos facilitan 20 tlpicamente la union del anticuerpo a los tejidos o factores del hospedador, incluidas diversas celulas del sistema inmunitario (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clasico.

[0063] El termino “inmunoglobulina” comprende diversas clases amplias de polipeptidos que pueden distinguirse bioqulmicamente. Los expertos en la tecnica apreciaran que las cadenas pesadas se clasifican como

25 gamma, mi, alfa, delta o epsilon (y, p, a, 5, e), con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, Y1-Y4). La naturaleza de esta cadena es la que determina la “clase” del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. estan bien caracterizadas y se sabe que confieren especializacion funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son facilmente discernibles para los expertos en la tecnica a la vista de la presente descripcion y, por consiguiente, 30 estan dentro del alcance de la presente invencion. Todas las clases de inmunoglobulinas estan claramente dentro del alcance de la presente invencion. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (k, A). Cada una de las cadenas pesadas puede estar unida a una cadena ligera k o y.

[0064] El termino “fragmento de union antigenica” de un anticuerpo completo se refiere a uno o mas 35 fragmentos de un anticuerpo completo que retienen la capacidad de unirse especlficamente a una diana de interes,

por ejemplo, VLA-4. Algunos ejemplos de fragmentos de union abarcados por el termino “fragmento de union antigenica” de un anticuerpo completo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consta de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consta de los dominios VH y CH1; (iv) un 40 fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546) que consta de un dominio VH; y (vi) una region determinante de complementariedad (CDR) aislada que retiene la funcionalidad. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y VH, estan codificados por genes separados, pueden unirse por procedimientos recombinantes, mediante un conector sintetico que permite su slntesis como una unica cadena de protelna en la que las regiones VL y VH se emparejan para 45 formar moleculas monovalentes conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv). Vease, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883.

[0065] En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos anteriormente estan pegilados.

50 [0066] En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos son

multiespeclficos. En otras realizaciones, los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos son monovalentes o biespeclficos.

[0067] Los detalles de una o mas realizaciones de la invencion se exponen en los dibujos acompanantes y la

55 descripcion a continuation. Otras caracterlsticas, objetivos y ventajas de la invencion resultaran evidentes de la descripcion y los dibujos y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra las tres variantes de secuencia de la cadena pesada de HP1/2 con respecto a la cadena pesada de IGHV1-f de la linea germinal humana. Las letras minusculas encima de la secuencia representan inserciones de 5 acuerdo con el esquema de numeracion de Kabat.

La figura 2 muestra las cuatro variantes de secuencia de la cadena ligera de HP1/2 con respecto a la secuencia del

anticuerpo IGKV4-1 de la linea germinal (disenos L0, L1 y L2) o la secuencia k del anticuerpo AAH7033.1 humano

genomanipulado en la linea germinal (diseno L3). Las letras minusculas encima de la secuencia representan inserciones de acuerdo con el esquema de numeracion de Kabat.

10 La figura 3 es un grafico que representa los resultados de los ensayos ELISA.

La figura 4 es un grafico que representa los resultados de los ensayos ELISA.

La figura 5 es la secuencia aminoacidica de un Fc de IgG4 (dominios bisagra + CH2 + CH3). La region bisagra se representa en negrita y el dominio CH3 esta subrayado. La “S” en el recuadro es Ser228. La “N” en el circulo es Asn297.

15 La figura 6 es un grafico que representa datos de citometna de flujo de la union de HuHP1/2 a diversas lineas de celulas tumorales. “HP1/2” se refiere a HP1/2 humanizado.

Las figuras 7A-7C son paneles de graficos que representan la inhibicion la union de lineas celulares de LMA a pocillos recubiertos con fibronectina o VCAM1-Ig por HuHP1/2. La figura 7A representa la inhibicion de la union de celulas HL60 y KG1 a pocillos recubiertos con FN. La figura 7B representa la inhibicion de la union de celulas KG1 a 20 pocillos recubiertos con VCAM1-Ig. La figura 7C representa la inhibicion de la union de celulas HL60 a pocillos recubiertos con FN y VCAM1-Ig cuando se incuban con 20 pg/ml de HuHP1/2 (barras rellenas). Las barras blancas indican el porcentaje de adhesion celular en presencia de un control de isotipo. “HP1/2” se refiere a HP1/2 humanizado.

Las figuras 8A-8C constituyen un panel de graficos que representan la inhibicion de la union de lineas celulares de 25 MM a pocillos recubiertos con fibronectina o VCAM1-Ig por HuHP1/2. La figura 8A representa la inhibicion de la union de celulas U266 y H929 a pocillos recubiertos con FN. La figura 8B representa la inhibicion de la union de celulas U266 y H929 a pocillos recubiertos con VCAM1-Ig. La figura 8C representa la inhibicion de la union de celulas U266 a pocillos recubiertos con FN y VCAM1-Ig cuando se incuban con 20 pg/ml de HuHP1/2 (barras rellenas). Las barras blancas indican el porcentaje de adhesion celular en presencia de un control de isotipo. “HP1/2” 30 se refiere a HP1/2 humanizado.

Las figuras 9A-9C constituyen un panel de graficos que representan la inhibicion de la union de lineas celulares de LLC a pocillos recubiertos con fibronectina o VCAM1-Ig por HuHP1/2. La figura 9A representa la inhibicion de la union de celulas Mec1 y JM1 a pocillos recubiertos con FN. La figura 9B representa la inhibicion de la union de celulas Mec1 y JM1 a pocillos recubiertos con VCAM1-Ig. La figura 9C representa la inhibicion de la union de celulas 35 Mec1 a pocillos recubiertos con FN y VCAM1-Ig cuando se incuban con 20 pg/ml de HuHP1/2 (barras rellenas). Las barras blancas indican el porcentaje de adhesion celular en presencia de un control de isotipo. “HP1/2” se refiere a HP1/2 humanizado.

DESCRIPCION DETALLADA

40

[0069] Se ha demostrado que los anticuerpos contra VLA-4 son utiles para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, natalizumab (Tysabri®), un anticuerpo contra VLA-4, se usa para el tratamiento de la esclerosis multiple recurrente y la enfermedad de Crohn. Sin embargo, para el tratamiento de ciertas dolencias, por ejemplo, dolencias agudas como lesiones medulares (LM) o traumatismos craneoencefalicos (TCE), o tratamientos que se

45 administran en un numero finito como el tratamiento del cancer, puede ser ventajoso tratar con un anticuerpo contra VLA-4 que se una con una afinidad diferente a la de natalizumab, por ejemplo, una mayor afinidad. Ademas, el tratamiento con anticuerpos contra VLA-4 esta asociado con un trastorno raro pero a veces letal, la leucoencefalopatia multifocal progresiva (LMP), por la que una parte del tratamiento requiere la eliminacion del anticuerpo del sujeto tratado, por ejemplo, mediante plasmaferesis o inmunoabsorcion. Debido a la necesidad de 50 eliminar el anticuerpo, tambien es deseable equilibrar las ventajas de un anticuerpo que tiene mayor afinidad por VLA-4 con las desventajas de un anticuerpo que se une tan firmemente que hace dificil su eliminacion o crea un riesgo asociado con una lenta tasa de renovacion. Tales anticuerpos pueden ser utiles tambien para el tratamiento de dolencias, como la esclerosis multiple, en las que puede requerirse un tratamiento menos frecuente o la administracion por medios distintos de la infusion puede ser mas eficiente. Al permitir el tratamiento con dosis mas 55 bajas puede reducirse tambien el riesgo de efectos adversos como LMP. Por consiguiente, la presente invencion proporciona anticuerpos que tienen tales propiedades deseables.

[0070] La invencion se basa al menos en parte en las caracteristicas inesperadas de anticuerpos humanizados que se unen a a4 de nuevo diseno, que tiene una afinidad por a4 que es 10 veces mayor que la del

anticuerpo contra a4 natalizumab.

[0071] Se proporcionan anticuerpos que se unen a a4 y fragmentos de los mismos en los que los armazones de la cadena ligera variable (VL) y la cadena pesada variable (VH) tienen secuencias aceptoras construidas a parti r

5 de la llnea germinal o secuencias de anticuerpos genomanipulados en la llnea germinal, como los anticuerpos IGKV4-1, geAAH70335.1 o IGHV1-f. Las secuencias CDR derivan de anticuerpos que se unen a a4 no humanos, como el anticuerpo contra VLA-4 HP1/2. Los anticuerpos descritos en este documento pueden tener un aumento de la afinidad de al menos 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 veces, por ejemplo, en relacion con su parental murino. En una realization, el aumento de la afinidad es de al menos 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 veces, pero respectivamente de menos de 25, 20 o 15 10 veces.

Composiciones farmaceuticas

[0072] Un agente que se une a a4, como un anticuerpo que se une a VLA-4, puede formularse como una 15 composition farmaceutica. Tlpicamente, una composition farmaceutica incluye un vehlculo farmaceuticamente

aceptable. Tal como se usa en este documento, un “vehlculo farmaceuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion y similares que sean fisiologicamente compatibles.

20 [0073] Una “sal farmaceuticamente aceptable” se refiere a una sal que retiene la actividad biologica deseada

del compuesto parental y no confiere ningun efecto toxicologico indeseado (vease, por ejemplo, Berge, S. M. et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Algunos ejemplos de tales sales incluyen sales de adicion de acido y sales de adicion de base. Las sales de adicion de acido incluyen aquellas derivadas de acidos inorganicos no toxicos como acido clorhldrico, nltrico, fosforico, sulfurico, bromhldrico, yodhldrico y similares, as! como de acidos organicos no 25 toxicos como acidos mono y dicarboxllicos alifaticos, acidos alcanoicos sustituidos con fenilo, acidos hidroxialcanoicos, acidos aromaticos, acidos sulfonicos alifaticos y aromaticos y similares. Las sales de adicion de base incluyen aquellas derivadas de metales alcalinoterreos como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, as! como de aminas organicas no toxicas como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocalna, colina, dietanolamina, etilendiamina, procalna y similares.

30

[0074] Las composiciones del anticuerpo descritas en este documento pueden formularse de acuerdo con los procedimientos conocidos en la tecnica. La formulation farmaceutica en una tecnica bien establecida y se describe mas detalladamente en Genaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.a edition, Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery

35 Systems, 7.a edicion, Lippincott, Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); y Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3.a edicion (2000) (ISBN: 091733096X).

[0075] En una realizacion, el anticuerpo contra a4 puede formularse con materiales excipientes, como cloruro de sodio, fosfato dibasico de sodio heptahidrato, fosfato monobasico de sodio y polisorbato 80. En otra realizacion,

40 el anticuerpo contra a4 puede formularse en un tampon de citrato, por ejemplo a pH 5, 5,5, 6, 6,5, 7 o 7,5. En otra realizacion mas, el anticuerpo contra a4 puede formularse en una disolucion que contiene el 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14 o 15 % de sacarosa. Por ejemplo, puede proporcionarse en una disolucion tamponada a una concentration de aproximadamente 20 mg/ml y puede almacenarse a 2-8 °C.

45 [0076] Las composiciones farmaceuticas pueden estar tambien en diversas otras formas. Estas incluyen, por

ejemplo, formas de dosificacion llquidas, semisolidas y solidas, tales como disoluciones llquidas (por ejemplo, disoluciones para inyeccion o infusion), dispersiones o suspensiones, comprimidos, plldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma puede depender del modo de administration y la aplicacion terapeutica que se pretenden. Tlpicamente, las composiciones de los agentes descritos en este documento estan en forma de disoluciones para 50 inyeccion o infusion.

[0077] Tales composiciones pueden administrarse de modo parenteral (por ejemplo, mediante inyeccion

intravenosa, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular). Las expresiones “administracion por via parenteral” o administrado por via parenteral”, tal como se usan en este documento, significan modos de administracion distintos 55 de la administracion por via enterica o topica, normalmente mediante inyeccion, e incluyen, sin limitation, la inyeccion e infusion intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardlaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intrarraquldea, epidural e intraesternal.

[0078] Tlpicamente, las composiciones farmaceuticas deben ser esteriles y estables en las condiciones de

fabrication y almacenamiento. Una composition farmaceutica puede probarse tambien para asegurar que satisface los estandares regulatorios e industriales para su administration.

5 [0079] La composicion puede formularse como disolucion, microemulsion, dispersion, liposomas u otras

estructuras ordenadas adecuadas para altas concentraciones de farmacos. Las disoluciones inyectables esteriles pueden prepararse mediante la incorporation de un agente descrito en este documento en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combination de los ingredientes enumerados anteriormente, segun se necesite, seguida de una esterilizacion por filtration. En general, las dispersiones se preparan mediante la 10 incorporacion de un agente descrito en este documento en un vehlculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los demas ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparation de disoluciones inyectables esteriles, los procedimientos tlpicos de preparation son el secado al vaclo y la liofilizacion que producen un polvo de un agente descrito en este documento mas cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolucion de los mismos previamente esterilizada por filtracion. La fluidez correcta de la 15 disolucion puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de una dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

20 Administracion

[0080] Un anticuerpo contra a4 puede administrate a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, por diversos procedimientos. Para muchas aplicaciones, la via de administracion es una de entre: inyeccion o infusion intravenosa, inyeccion subcutanea o inyeccion intramuscular. Un anticuerpo que se une a a4 puede administrate en

25 una dosis fija o en una dosis de mg/kg. El anticuerpo puede administrarse por via intravenosa (IV) o subcutanea (SC). Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse en una dosis unitaria fija de entre aproximadamente 50 y 600 mg por via IV, por ejemplo, cada cuatro semanas, o de entre aproximadamente 50 y 100 mg por via SC (por ejemplo, 75 mg), por ejemplo, al menos una vez a la semana (por ejemplo, dos veces a la semana). En una realization, el anticuerpo se administra por via IV a una dosis unitaria fija de 50 mg, 60 mg, 80 mg, 100 mg, 120 mg, 30 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 180 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg o mas. La administracion de la dosis por via IV puede ser una, dos o tres veces o mas a la semana, o una vez cada dos, tres, cuatro o cinco semanas o con menor frecuencia.

[0081] En una realizacion, el anticuerpo se administra por via SC en una dosis unitaria fija de 50 mg, 60 mg, 35 70 mg, 75 mg, 80 mg, 100 mg, 120 mg o mas. La administracion de la dosis por via SC puede ser una, dos o tres

veces o mas a la semana o una vez cada dos, tres, cuatro o cinco semanas o con menor frecuencia.

[0082] Un anticuerpo contra a4 puede administrarse tambien en un bolo en una dosis de entre aproximadamente 1 y 10 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 6,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 2,0 mg/kg o 1,0

40 mg/kg. Los intervalos de dosis modificados incluyen una dosis que es menor de aproximadamente 600 mg/sujeto, aproximadamente 400 mg/sujeto, aproximadamente 300 mg/sujeto, aproximadamente 250 mg/sujeto, aproximadamente 200 mg/sujeto o aproximadamente 150 mg/sujeto, tlpicamente para administracion cada cuatro semanas o una vez al mes. El anticuerpo contra a4 puede administrarse, por ejemplo, cada tres a cinco semanas, por ejemplo, cada cuatro semanas o mensualmente.

45

[0083] La dosificacion puede ajustarse en funcion de la tasa de aclaramiento del paciente de una administracion previa del anticuerpo contra a4. Por ejemplo, al paciente puede no administrated una segunda dosis o dosis de continuation antes de que el nivel de los anticuerpos contra a4 en el sistema del paciente haya disminuido por debajo de un nivel predeterminado. En una realizacion, se analiza una muestra de un paciente (por

50 ejemplo, de plasma, suero, sangre, orina o llquido cefalorraquldeo (LCR)) para determinar la presencia de anticuerpos contra a4 y si el nivel de los anticuerpos contra a4 esta por encima de un nivel predeterminado, al paciente no se le administrara una segunda dosis o dosis de continuacion. Si el nivel de los anticuerpos contra a4 en el sistema del paciente esta por debajo de un nivel predeterminado, entonces al paciente se le administrara una segunda dosis o dosis de continuacion. Un paciente en el que se determina que los niveles de anticuerpos contra a4 55 son demasiado elevados (por encima del nivel predeterminado) puede analizarse de nuevo despues de uno o tres dlas o una semana y si el nivel de los anticuerpos contra a4 en el paciente ha disminuido por debajo del nivel predeterminado, al paciente se le puede administrar una segunda dosis o dosis de continuacion del anticuerpo.

[0084] La dosis puede elegirse tambien para reducir o evitar la production de anticuerpos contra el

anticuerpo que se une a a4, para conseguir una saturacion de la subunidad a4 superior al 40, 50, 70, 75 u 80 %, para conseguir una saturacion de la subunidad a4 inferior al 80, 70, 60, 50 o 40 % o para prevenir un aumento del nivel de leucocitos circulantes.

5 [0085] En ciertas realizaciones, el agente activo puede preparase con un vehlculo que protegera al

compuesto de una liberacion rapida, como una formulacion de liberacion controlada, incluidos implantes y sistemas de administracion microencapsulados. Pueden usarse pollmeros biocompatibles biodegradables como acetato de vinilo y etileno, polianhldridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Muchos procedimientos para la preparacion de tales formulaciones estan patentados o son generalmente conocidos. Vease, 10 por ejemplo, Controlled Drug Delivery (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), 2.a edicion, J. Robinson y V. H. L. Lee, eds., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987.

[0086] Las composiciones farmaceuticas pueden administrarse con un dispositivo medico. Por ejemplo, las composiciones farmaceuticas pueden administrarse con un dispositivo de inyeccion hipodermica sin aguja, como los

15 dispositivos descritos en las patentes de los EE. UU. n.° 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 o 4.596.556. Algunos ejemplos de implantes y modulos bien conocidos se analizan, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. n.° 4.487.603, que describe una bomba de microinfusion implantable para la administracion de medicamentos con una velocidad controlada; la patente de los EE. UU n.° 4.486.194, que describe un dispositivo terapeutico para la administracion de medicamentos a traves de la piel; la patente de los EE. UU. n.° 4.447.233, que 20 describe una bomba de infusion de medicamentos para la administracion de medicamentos con una velocidad de infusion exacta; la patente de los EE. UU. n.° 4.447.224, que describe un aparato de infusion implantable de flujo variable para la administracion continuada de farmacos; la patente de los EE. UU. n.° 4.439.196, que describe un sistema osmotico de administracion de farmacos con compartimentos de camaras multiples; y la patente de los EE. UU. n.° 4.475.196, que describe un sistema osmotico de administracion de farmacos. Por supuesto, tambien se 25 conocen muchos otros implantes, sistemas de administracion y modulos semejantes.

[0087] Esta descripcion tambien presenta un dispositivo para la administracion de un primer y un segundo agente. El dispositivo puede incluir, por ejemplo, uno o mas alojamientos para almacenar preparaciones farmaceuticas y puede estar configurado para administrar dosis unitarias del primer y el segundo agente. El primer y

30 el segundo agente pueden almacenarse en el mismo o en distintos compartimentos. Por ejemplo, el dispositivo puede combinar los agentes antes de la administracion. Tambien es posible usar diferentes dispositivos para administrar el primer y el segundo agente.

[0088] Los reglmenes de dosificacion se ajustan para proporcionar la respuesta deseada, como una 35 respuesta terapeutica o un efecto terapeutico combinatorio. Generalmente, puede usarse cualquier combination de

dosis (bien por separado o coformuladas) del agente que se une a VLA-4 y el segundo agente con el fin de proporcionar a un sujeto los dos agentes en cantidades biodisponibles.

[0089] La forma de dosificacion unitaria o “dosis fija”, tal como se usa en este documento, se refiere a 40 unidades flsicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que han de tratarse; cada unidad

contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehlculo farmaceutico requerido y opcionalmente en asociacion con el otro agente.

[0090] Una composition farmaceutica puede incluir una “cantidad terapeuticamente eficaz” de un agente 45 descrito en este documento. Tales cantidades eficaces pueden determinarse sobre la base del efecto combinatorio

del primer y el segundo agente administrados. Una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente puede variar tambien en funcion de factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y de la capacidad del compuesto de desencadenar una respuesta deseada en el individuo, como la mejorla de al menos un parametro del trastorno, por ejemplo, un parametro de la esclerosis multiple, o la mejorla de al menos un slntoma 50 del trastorno, por ejemplo, un slntoma de la esclerosis multiple, como atrofia muscular, ataxia y temblores. Una cantidad terapeuticamente eficaz es tambien una cantidad en la que cualquier efecto toxico o perjudicial de la composicion queda compensado por los efectos terapeuticamente beneficiosos.

Dispositivos y kits 55

[0091] Las formulaciones que contienen un anticuerpo descrito en este documento pueden administrarse con un dispositivo medico. El dispositivo puede disenarse con caracterlsticas como portabilidad, almacenamiento a temperatura ambiente y facilidad de uso, de manera que pueda usarse en situaciones de emergencia, por ejemplo, por un sujeto sin entrenamiento o por el personal de emergencia sobre el terreno, trasladado a instalaciones

medicas y otros equipos medicos. El dispositivo puede incluir, por ejemplo uno o mas alojamientos para almacenar preparaciones farmaceuticas que incluyen un anticuerpo que se une a a4 y puede configurarse para administrar una o mas dosis unitarias del agente.

5 [0092] Por ejemplo, la composicion farmaceutica puede administrarse con un dispositivo de administracion

transcutanea, como una jeringa, incluida una jeringa hipodermica o de multiples camaras. Otros dispositivos de administracion adecuados incluyen protesis intravasculares, cateteres, microagujas y dispositivos implantables de liberacion controlada. La composicion puede administrarse por via intravenosa con un equipo IV estandar, incluidos, por ejemplo, tubos IV, con o sin filtros en llnea. En ciertas realizaciones, el dispositivo sera una jeringa para uso en 10 administracion por via SC o IM.

[0093] Las composiciones farmaceuticas pueden administrarse con dispositivos medicos. Por ejemplo, las composiciones farmaceuticas pueden administrarse con un dispositivo de inyeccion hipodermica sin aguja, como los dispositivos descritos en las patentes de los EE. UU. n.° 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880,

15 4.790.824 o 4.596.556. Algunos ejemplos de implantes y modulos bien conocidos se describen, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. n.° 4.487.603, que describe una bomba de microinfusion implantable para la administracion de medicamentos con una velocidad controlada; la patente de los EE. UU n.° 4.486.194, que describe un dispositivo terapeutico para la administracion de medicamentos a traves de la piel; la patente de los EE. UU. n.° 4.447.233, que describe una bomba de infusion de medicamentos para la administracion de medicamentos con una velocidad de 20 infusion exacta; la patente de los EE. UU. n.° 4.447.224, que describe un aparato de infusion implantable de flujo variable para la administracion continuada de farmacos; la patente de los EE. UU. n.° 4.439.196, que describe un sistema osmotico de administracion de farmacos con compartimentos de camaras multiples; y la patente de los EE. UU. n.° 4.475.196, que describe un sistema osmotico de administracion de farmacos. La composicion terapeutica puede estar tambien en forma de una formulacion biodegradable o no biodegradable de liberacion mantenida para 25 administracion por via subcutanea o intramuscular. Los procedimientos para tales composiciones son conocidos en la tecnica. La administracion continuada tambien puede conseguirse mediante una bomba implantable o externa. La administracion tambien puede llevarse a cabo de forma intermitente, como mediante una unica inyeccion diaria, o de forma continuada en una dosis baja, como en una formulacion de liberacion mantenida. El dispositivo de administracion puede modificarse para adecuarse optimamente a la administracion de un anticuerpo contra a4. Por 30 ejemplo, una jeringa puede siliconizarse de manera que sea optima para el almacenamiento y administracion del anticuerpo. Por supuesto, tambien se conocen muchos otros implantes, sistemas de administracion y modulos semejantes.

[0094] Esta description tambien presenta un dispositivo para la administracion de un primer y un segundo 35 agente (por ejemplo, un anticuerpo y un segundo agente). El dispositivo puede incluir, por ejemplo, uno o mas

alojamientos para almacenar preparaciones farmaceuticas y puede estar configurado para administrar dosis unitarias del primer y el segundo agente. El primer y el segundo agente pueden almacenarse en el mismo o en distintos compartimentos. En una realization, el dispositivo combina los agentes antes de la administracion. En algunas realizaciones, el primer y el segundo agente se administran mediante dispositivos diferentes.

40

[0095] Un anticuerpo contra a4 puede proporcionarse en un kit. En una realizacion, el kit incluye (a) un recipiente que contiene una composicion que incluye una alta concentration de un anticuerpo que se une a VLA-4, opcionalmente (b) un recipiente que contiene una composicion que incluye un segundo agente y opcionalmente (c) material informativo. El material informativo puede ser descriptivo, instructivo, de comercializacion u otro material que

45 se refiera a los procedimientos descritos en este documento y/o el uso de los agentes para su utilidad terapeutica. En una realizacion, el kit incluye tambien un segundo agente. Por ejemplo, el kit incluye un primer recipiente que contiene una composicion que incluye el anticuerpo que se une a a4 y un segundo recipiente que incluye el segundo agente.

50 [0096] El material informativo de los kits no esta limitado en su forma. En una realizacion, el material

informativo puede incluir information sobre la production del anticuerpo, su concentracion, fecha de caducidad, information sobre el lote o sitio de produccion y demas. En una realizacion, el material informativo se refiere a procedimientos de administracion del anticuerpo que se une a a4, por ejemplo, en una dosis, forma de dosificacion o modo de administracion adecuados (por ejemplo, una dosis, forma de dosificacion o modo de administracion 55 descritos en este documento) para tratar un sujeto que tiene un trastorno agudo, como una lesion medular o un traumatismo craneoencefalico, o una enfermedad inflamatoria (por ejemplo EM) o que presenta riesgo de experimentar una crisis asociada con una enfermedad inflamatoria. La informacion puede proporcionarse de diversas formas, incluido texto impreso, material legible por ordenador, grabaciones de video o de audio o informacion que proporciona un enlace o direccion para acceder a material sustancial.

[0097] Ademas del agente, la composicion en el kit puede incluir otros ingredientes, como un disolvente o tampon, un estabilizante o un conservante. El agente puede proporcionarse en cualquier forma, por ejemplo, en forma llquida, seca o liofilizada y sustancialmente puro y/o esteril. Cuando los agentes se proporcionan en una

5 disolucion llquida, la disolucion llquida es tlpicamente una disolucion acuosa. Cuando los agentes se proporcionan en forma seca, generalmente se reconstituyen mediante la adicion de un disolvente adecuado. Opcionalmente, el disolvente, por ejemplo, agua o tampon esteril, puede proporcionarse en el kit.

[0098] El kit puede incluir uno o mas recipientes para la composicion o composiciones que contienen los 10 agentes. En algunas realizaciones, el kit contiene recipientes diferentes, separadores o compartimentos para la

composicion y el material informativo. Por ejemplo, la composicion puede estar contenida en una botella, vial o jeringa y el material informativo puede estar contenido en una funda o paquete de plastico. En otras realizaciones, los distintos elementos del kit estan contenidos dentro de un recipiente unico no dividido. Por ejemplo, la composicion esta contenida en una botella, vial o jeringa que lleva fijado a los mismos el material informativo en 15 forma de una etiqueta. En algunas realizaciones, el kit incluye una pluralidad (por ejemplo, un paquete) de recipientes individuales, cada uno de los cuales contiene una o mas formas de dosificacion unitaria (por ejemplo, una forma de dosificacion descrita en este documento) de los agentes. Los recipientes pueden incluir una dosis unitaria combinada, por ejemplo, una unidad que incluye tanto el anticuerpo que se une a a4 como el segundo agente en una relacion deseada. Por ejemplo, el kit puede incluir una pluralidad de jeringas, ampollas, envases en 20 lamina de plastico, envases en bllsteres o dispositivos medicos, cada uno de los cuales contiene, por ejemplo, una unica dosis unitaria combinada. Los recipientes de los kits pueden ser hermeticos al aire, resistentes al agua (por ejemplo, impermeables a cambios de humedad o evaporacion) y/o estar protegidos de la luz.

[0099] Opcionalmente, el kit incluye un dispositivo adecuado para administrar la composicion, por ejemplo, 25 una jeringa u otro dispositivo de administracion adecuado. El dispositivo puede proporcionarse precargado con uno o

los dos agentes o puede estar simplemente vaclo pero preparado para su carga.

Oncologfa

30 [0100] Los anticuerpos que se unen a a4 y los procedimientos descritos en este documento pueden usarse

para tratar el cancer, incluidos canceres solidos y neoplasias hematologicas. Algunos ejemplos de canceres solidos incluyen sarcomas y carcinomas, por ejemplo, de pulmon, mama, pancreas, colon, prostata, vejiga y cerebro. Las neoplasias hematologicas incluyen canceres como mieloma multiple, leucemia y linfoma.

35 [0101] Se proporcionan procedimientos para tratar a un paciente que tiene una neoplasia hematologica con

una composicion que contiene un anticuerpo que se une a a4, como un anticuerpo contra VLA-4 descrito en este documento. Las neoplasias hematologicas son canceres de los sistemas hematopoyetico e inmunitario del cuerpo. Los canceres de este tipo afectan a la sangre, la medula osea y/o los ganglios linfaticos. Las neoplasias hematologicas incluyen leucemias, como la leucemia linfoblastica aguda (LLA), leucemia mielogena aguda (LMA), 40 leucemia mielogena cronica (LMC), leucemia linfocltica cronica (LLC), leucemia promielocltica aguda, eritroleucemia aguda y leucemia de celulas pilosas (LCP); linfomas, como la enfermedad de Hodgkin y el linfoma no de Hodgkin y el mieloma multiple; macroglobulinemia de Waldenstrom; slndrome mielodisplasico (sMd) (que puede culminar en LMA); una enfermedad mieloproliferativa, como policitemia vera (tambien denominada PV, PCV o policitemia rubra vera (PRV)), trombocitosis esencial (TE), mielofibrosis, enfermedad de la cadena pesada; y amilodosis debida a la 45 enfermedad de la cadena ligera.

[0102] Los pacientes con una neoplasia hematologica pueden identificarse por analisis de recuento de celulas sangulneas y frotis de sangre, por ejemplo, mediante microscopla optica, que es util para la identificacion de celulas malignas. Una biopsia, por ejemplo de medula osea, tambien puede usarse para identificar celulas malignas

50 y una biopsia de un ganglio linfatico puede ser util para identificar una linfadenopatla.

[0103] Un anticuerpo que se une a a4 (por ejemplo, un anticuerpo contra VLA-4 humanizado como HuHP1/2, H1L0, H1L1, H1L2 o H1L3) es util para el tratamiento de una leucemia como LMA. Las leucemias son canceres que se originan en la medula osea, en la que las celulas malignas son globulos blancos (leucocitos). La LMA (tambien

55 denominada leucemia mielocltica aguda, leucemia mieloblastica aguda, leucemia granulocltica aguda y leucemia no linfocltica aguda) es una neoplasia que se produce en granulocitos o monocitos. La LMA se caracteriza por el crecimiento exagerado e incontrolado y la acumulacion de celulas denominadas blastos leucemicos, que no pueden funcionar como las celulas sangulneas normales y el bloqueo de la produccion de celulas medulares normales, lo que conduce a una deficiencia de globulos rojos (anemia), plaquetas (trombocitopenia) y globulos blancos normales

(especialmente neutrofilos, es decir, neutropenia) en la sangre.

[0104] Todos los subtipos de LMA son adecuados para el tratamiento con un anticuerpo que se une a VLA-4.

Los subtipos de LMA se clasifican en funcion de la fase de desarrollo alcanzado por los mieloblastos en el momento 5 del diagnostico. Las categorlas y subtipos permiten al medico decidir el tratamiento que funciona mejor para el tipo de celulas y conocer la rapidez con que la enfermedad puede evolucionar. Los subtipos son: M0, mieloblastico, en analisis especial; M1, mieloblastico, sin maduracion; M2, mieloblastico, con maduracion; M3, promielocltico; M4, mielomonocltico; M5, monocltico; M6, eritroleucemia; y M7, megacariocltico. Un anticuerpo contra VLA-4 puede administrarse con un agente secundario especialmente adecuado al subtipo de LMA. Por ejemplo, la leucemia 10 promielocltica aguda (LPA) y la leucemia monocltica aguda son subtipos de la LMA que necesitan un tratamiento diferente al de otros subtipos de LMA. Un segundo agente para el tratamiento de la LPA puede incluir acido transretinoico total (ATRA) o un antimetabolito como citarabina. Un segundo agente para el tratamiento de la leucemia monocltica aguda puede incluir un analogo de desoxiadenosina como 2-cloro-2'-desoxiadenosina (2-CDA).

15 [0105] Los factores de riesgo de la LMA incluyen la presencia de ciertos trastornos geneticos como el

slndrome de Down, la anemia de Fanconi, el slndrome de Shwachman-Diamond y otros. A un paciente que tiene LMA y un trastorno genetico puede administrarsele un anticuerpo que se une a VLA-4 y un segundo agente para tratar un slntoma del trastorno genetico. Por ejemplo, a un paciente con LMA y anemia de Fanconi puede administrarsele un anticuerpo contra VLA-4 y un antibiotico.

20

[0106] Otros factores de riesgo para LMA incluyen la quimioterapia o radioterapia para el tratamiento de un cancer diferente, el humo del tabaco y la exposicion a grandes cantidades de benceno.

[0107] Otros canceres adecuados para el tratamiento con un anticuerpo que se une a a4 incluyen tumores 25 solidos como sarcomas y carcinomas (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma,

sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, lifangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cancer de ovario, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandulas sudorlparas, carcinoma de glandulas sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, carcinoma qulstico, carcinoma medular, 30 carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma de las vlas biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cancer cervical, cancer uterino, cancer testicular, carcinoma microcltico de pulmon, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, schwanoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma).

35

Otros trastornos

[0108] Las formulaciones y procedimientos descritos en este documento pueden usarse tambien para tratar otros trastornos inflamatorios, inmunitarios o autoinmunitarios, por ejemplo, inflamaciones del sistema nervioso

40 central (por ejemplo, ademas de esclerosis multiple, meningitis, neuromielitis optica, neurosarcoidosis, vasculitis del SNC, encefalitis y mielitis transversa); rechazo de injertos de tejidos u organos o enfermedad injerto contra huesped; lesiones agudas del SNC, por ejemplo, ictus o lesiones medulares (LM); nefropatla cronica; alergias, por ejemplo, asma alergico, rinitis alergica de moderada a grave, alergia ocular; diabetes sacarina de tipo 1; trastornos intestinales inflamatorios, por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa (por ejemplo, para tratamiento o 45 mantenimiento de la remision); gastroenteritis eosinofllica; miastenia grave; fibromialgia; trastornos asociados con reumatologla/inmunologla como trastornos artrfticos, por ejemplo, artritis reumatoide y artritis psoriatica; trastornos dermatologicos como trastornos cutaneos inflamatorios/inmunitarios, por ejemplo, psoriasis, vitiligo, dermatitis (por ejemplo, dermatitis atopica), liquen plano, urticaria cronica de moderada a grave; lupus sistemico eritematoso (LSE; por ejemplo, nefritis lupica); escleroderma (por ejemplo, esclerosis sistemica progresiva (ESP), como ESP de 50 pulmon); neumonla eosinofllica primaria aguda o cronica; slndrome de Sjogren; slndrome coronario agudo (SCA); infarto de miocardio agudo; aterosclerosis; y trastornos fibroticos, por ejemplo, fibrosis pulmonar (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopatica), fibrosis de pulmon (por ejemplo, inducida por radioterapia), mielofibrosis, cirrosis hepatica, glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis creciente, nefropatla diabetica y fibrosis intersticial renal.

55

[0109] Las formulaciones y procedimientos descritos en este documento pueden usarse tambien para tratar trastornos neurologicos como isquemia cerebral, incluida la prevencion en pacientes con ataques isquemicos transitorios y/o estenosis arterial. Otros ejemplos de trastornos neurologicos incluyen polineuropatla desmielinizante inflamatoria cronica (PDIC); slndrome de Guillian-Barre (SGB); enfermedades oculares como la degeneracion

macular (por ejemplo, degeneracion macular humeda) y neuropatla optica isquemica anterior; dolor neuropatico (por ejemplo, dolor neuropatico sintomatico); enfermedad de Alzheimer; esclerosis lateral amiotrofica (ELA) (por ejemplo, modificadores de la enfermedad ELA) y la enfermedad de Parkinson.

5 [0110] Las formulaciones y procedimientos descritos en este documento pueden usarse tambien para tratar

pacientes que han sufrido un trasplante, como un trasplante de rinon, corazon o de medula osea.

Esclerosis multiple

10 [0111] Las formulaciones que contienen un anticuerpo que se une a a4 descritas en este documento son

utiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias como la esclerosis multiple (EM). La esclerosis multiple es una enfermedad del sistema nervioso central que se caracteriza por la inflamacion y perdida de las laminas de mielina.

15 [0112] Los pacientes con EM pueden identificarse por criterios que establecen un diagnostico de EM

cllnicamente definida tal como se define por el taller de diagnostico de la EM (Poser et al., Ann. Neurol. 13: 227, 1983). Por ejemplo, un individuo con EM cllnicamente definida ha tenido dos ataques y presenta pruebas cllnicas de dos lesiones o pruebas cllnicas de una lesion y pruebas paracllnicas de otra lesion independiente. La EM puede diagnosticarse tambien por pruebas de dos ataques y bandas oligoclonales de IgG en el llquido cefalorraquldeo o 20 una combinacion de un ataque, pruebas cllnicas de dos lesiones y una banda oligoclonal de IgG en el llquido cefalorraquldeo. Los criterios de McDonald pueden usarse tambien para el diagnostico de la EM (McDonald et al. 2001, “Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis," Ann. Neurol. 50:121-127). Los criterios de McDonald incluyen el uso de pruebas de IRM de la afectacion del SNC con el tiempo para su uso en el diagnostico de la EM en ausencia de ataques cllnicos 25 multiples. El tratamiento eficaz de la esclerosis multiple puede evaluarse de varias maneras diferentes. Para calibrar la eficacia del tratamiento pueden usarse los parametros siguientes. Dos criterios ejemplares incluyen: EDSS (escala del estado de discapacidad ampliada) y la aparicion de exacerbaciones en IRM (imagenes por resonancia magnetica). La EDDS es un procedimiento para la calificacion de la afectacion cllnica debida a la EM (Kurtzke, Neurology 33: 1444, 1983). Se evaluan ocho sistemas funcionales en cuanto al tipo y la gravedad de la afectacion 30 neurologica. Brevemente, antes del tratamiento, los pacientes se evaluan en cuanto a la afectacion de los sistemas siguientes: piramidal, cerebeloso, del tronco encefalico, sensorial, intestinal y de la vejiga, visual, cerebral y otros. Se llevan a cabo seguimientos a intervalos definidos. La escala se extiende de 0 (normal) a 10 (muerte debida a EM). Una disminucion de un grado completo indica un tratamiento eficaz (Kurtzke, Ann. Neurol. 36: 573-79, 1994). Los pacientes pueden diagnosticarse tambien usando otros criterios usados por los expertos en la tecnica.

35

[0113] Las exacerbaciones se definen por la aparicion de un nuevo slntoma que es atribuible a la EM, acompanado de una nueva anormalidad neurologica apropiada (grupo de estudio de la EM con IFNB, cita anterior). Ademas, la exacerbacion puede durar al menos 24 horas y estar precedida de estabilidad o mejorla durante al menos 30 dlas. Brevemente, los pacientes se someten a un examen neurologico estandar por medicos. Las

40 exacerbaciones son leves, moderadas o graves, en funcion de los cambios en una escala de clasificacion neurologica (Sipe y col, Neurology 34: 1368, 1984). Se determinan una tasa de exacerbacion anual y la proporcion de pacientes sin exacerbaciones.

[0114] El tratamiento puede considerarse eficaz si hay una diferencia estadlsticamente significativa en la tasa 45 o proporcion de pacientes sin exacerbaciones o sin recaldas entre el grupo tratado y el grupo del placebo para cada

una de estas mediciones. Ademas, tambien pueden medirse el tiempo hasta la primera exacerbacion y la duracion y gravedad de la exacerbacion. En este sentido, una medida de la eficacia como tratamiento es una diferencia estadlsticamente significativa en el tiempo hasta la primera exacerbacion o en la duracion y gravedad en el grupo tratado comparado con el grupo de control. Un periodo sin exacerbaciones o sin recaldas mayor de un ano, 18 50 meses o 20 meses es especialmente digno de mencion. La eficacia puede evaluarse tambien usando cualquier procedimiento usado en la tecnica, por ejemplo, para evaluar los slntomas de la EM, incluida la mejorla de la movilidad mediante una prueba de caminata cronometrada usada sola o en combinacion con otros criterios.

[0115] La eficacia de la administracion de un primer agente y, opcionalmente, un segundo agente puede 55 evaluarse tambien sobre la base de uno o mas de los criterios siguientes: frecuencia de linfocitos T reactivos a MBP

determinada por dilucion limitante, respuesta de proliferacion de llneas y clones de linfocitos T reactivos a MBP, perfiles de citocina de llneas y clones de linfocitos T en respuesta a MBP establecidos en pacientes. La eficacia se indica por una disminucion de la frecuencia de las celulas reactivas, una reduccion de la incorporation de timidina con peptidos alterados en comparacion con los nativos y una reduccion de TNF e INF-a.

[0116] Las mediciones cilnicas incluyen la tasa de recalda en intervalos de uno y dos anos y un cambio en la EDSS, incluido el tiempo hasta la progresion desde el valor inicial de 1,0 unidades en la EDSS que persiste durante seis meses. En una curva de Kaplan-Meier, un retraso en la progresion mantenida de la discapacidad muestra

5 eficacia. Otros criterios incluyen un cambio en el area y volumen de imagenes T2 en IRM y el numero y volumen de las lesiones determinados mediante imagenes intensificadas con gadolinio.

[0117] Las IRM pueden usarse para medir las lesiones activas mediante imagenes intensificadas con gadolinio-DTPA (McDonald et al., Ann. Neurol. 36: 14, 1994) o la localizacion y extension de las lesiones mediante

10 tecnicas ponderadas por T2. Brevemente, se obtienen IMR de referencia. El mismo plano de obtencion de la imagen y la misma posicion del paciente se usan en los estudios subsiguientes. La posicion y las secuencias de obtencion de imagenes pueden elegirse para maximizar la deteccion de las lesiones y facilitar el trazado de las lesiones. La misma posicion y las mismas secuencias de obtencion de imagenes pueden usarse en los estudios subsiguientes. La presencia, localizacion y extension de las lesiones de EM puede ser determinada por los radiologos. El area de 15 las lesiones puede delinearse y sumarse corte a corte para obtener el area total de la lesion. Pueden hacerse tres analisis: pruebas de nuevas lesiones, tasa de aparicion de lesiones activas y porcentaje de cambio en el area de la lesion (Paty et al., Neurology 43: 665, 1993). Una mejorla debida al tratamiento puede establecerse mediante una mejorla estadlsticamente significativa en un paciente individual comparado con el valor de referencia o en un grupo tratado en comparacion con un grupo de placebo.

20

[0118] Algunos ejemplos de slntomas asociados con la esclerosis multiple que pueden tratarse con los procedimientos descritos en este documento incluyen: neuritis optica, diplopia, nistagmo, dismetrla ocular, oftalmoplejia internuclear, fosfenos de movimiento y sonido, defecto pupilar aferente, paresia, monoparesia, paraparesia, hemiparesia, cuadriparesia, plejia, paraplejia, hemiplejia, tetraplejia, cuadriplejia, espasticidad, disartria,

25 atrofia muscular, espasmos, calambres, hipotonla, clono, mioclono, mioquimia, slndrome de las piernas inquietas, pie caldo, reflejos disfuncionales, parestesia, anastesia, neuralgia, dolor neuropatico y neurogenico, fenomeno de Lhermitte, disfuncion propioceptiva, neuralgia trigeminal, ataxia, temblor intencional, dismetrla, ataxia vestibular, vertigo, ataxia del habla, distoma, disdiadococinesia, miccion frecuente, espasticidad de la vejiga, vejiga flacida, disinergia detrusoesfinteriana, disfuncion erectil, anorgasmia, frigidez, estrenimiento, urgencia fecal, incontinencia 30 fecal, depresion, disfuncion cognitiva, demencia, cambios de humor, debilidad emocional, euforia, slndrome bipolar, ansiedad, afasia, disfasia, fatiga, slntoma de Uhthoff, reflujo gastroesofagico y trastornos del sueno.

[0119] Cada caso de EM muestra uno o varios patrones de presentacion y evolucion posterior. En el caso mas comun, la EM se manifiesta primeramente como una serie de ataques seguidos de remisiones totales o

35 parciales al disminuir los slntomas misteriosamente para reaparecer mas tarde despues de un periodo de estabilidad. Es lo que se denomina EM de recalda y remision (RR). La EM primariamente progresiva (PP) se caracteriza por un empeoramiento cllnico gradual sin remisiones perceptibles, aunque puede haber periodos de estabilidad temporal o pequenos alivios de los slntomas. La EM secundariamente progresiva (SP) comienza con una evolucion de recalda y remision seguida mas tarde por una evolucion primaria progresiva. En raras ocasiones, los 40 pacientes pueden tener una evolucion de recaldas progresivas (RP) en la que la enfermedad sigue una ruta progresiva puntualizada por ataques agudos. A veces, las formas PP, SP y RP se agrupan conjuntamente bajo el nombre de EM progresiva cronica.

[0120] Algunos pacientes padecen EM maligna, definida como un empeoramiento rapido y persistente que 45 resulta en una discapacidad significativa o incluso en la muerte al poco tiempo de la aparicion de la enfermedad.

Este empeoramiento puede detenerse o desacelerarse mediante la administracion de un tratamiento combinado descrito en este documento.

[0121] La administracion de un anticuerpo contra a4 presentado en este documento puede ser eficaz para 50 aliviar uno o mas slntomas de la EM, como uno o mas de los slntomas descritos anteriormente. Por ejemplo, la

administracion de un anticuerpo contra a4 descrito en este documento puede usarse para tratar la esclerosis multiple primaria o secundariamente progresiva (EMPP o EMSP, respectivamente) y el tratamiento con un anticuerpo contra a4 puede ser eficaz para prevenir la recalda.

55 [0122] Ademas o antes de los estudios en humanos, puede usarse un modelo animal para evaluar la eficacia

del uso de los dos agentes. Un ejemplo de modelo animal para la esclerosis multiple es el modelo de raton de encefalitis autoinmunitaria experimental (EAE), por ejemplo, tal como se describe en Tuohy et al. (J. Immunol. (1988) 141: 1126-1130), Sobel et al. (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401) y Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129). A los ratones puede administrarseles un primer y un segundo agente descritos en este documento antes de la

induccion de la EAE. Despues, los ratones se evaluan en cuanto a criterios caracterlsticos para determinar la eficacia del uso de los dos agentes en el modelo.

Generation de anticuerpos 5

[0123] Los anticuerpos recombinantes que se unen a a4 pueden generarse por procedimientos in vivo o in

vitro como el despliegue en fagos. Los procedimientos pueden usarse para suministrar las CDR contra a4 para uso en los anticuerpos con CDR injertadas descritos en este documento. Ademas, los procedimientos como el despliegue en fagos pueden usarse para seleccionar tales CDR en el contexto de los armazones de la llnea

10 germinal descritos en este documento, como mediante el uso de un banco en el que el armazon es un armazon de

la llnea germinal.

[0124] El documento EP 239400 (Winter et al.) describe la alteracion de anticuerpos por sustitucion (dentro de una region variable dada) de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una especie por las de

15 otra especie. Puede ser menos probable que los anticuerpos con CDR sustituidas desencadenen una respuesta inmunitaria en humanos en comparacion con anticuerpos realmente quimericos, ya que los anticuerpos con CDR sustituidas contienen considerablemente menos componentes no humanos. (Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536). Tlpicamente, se sustituyen las CDR de un anticuerpo murino en las regiones correspondientes de un anticuerpo humano mediante tecnologla de acidos nucleicos

20 recombinantes para producir secuencias codificantes del anticuerpo sustituido deseado. Pueden anadirse

segmentos genicos de las regiones constantes del isotipo deseado (normalmente y-I para CH y k para CL) y los genes de las cadenas pesada y ligera pueden coexpresarse en celulas de mamlferos para producir un anticuerpo soluble. Tambien pueden usarse extensos bancos de despliegue en fagos para aislar anticuerpos de alta afinidad que pueden desarrollarse como agentes terapeuticos para humanos mediante la tecnologla estandar de fagos 25 (vease, por ejemplo, Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4: 1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol. Today 2: 371-8; y el documento U.S. 2003-0232333).

[0125] Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra a4 descrito en este documento puede reconocer epltopos de la subunidad a4 que estan implicados en la union a un ligando afln, por ejemplo, VCAM-1 o fibronectina.

30 Los anticuerpos descritos en este documento pueden inhibir la union a uno o mas de los ligandos afines (por ejemplo, VCAM-1 y fibronectina).

[0126] En algunas realizaciones, los anticuerpos presentados en este documento pueden interaccionar con VLA-4 en celulas, por ejemplo linfocitos, pero no causar agregacion celular.

35

[0127] Un ejemplo de anticuerpo que se une a a4 tiene una o mas CDR, por ejemplo, las tres CDR de la cadena pesada (HC) y/o las tres CDR de la cadena ligera (LC) de un anticuerpo concreto descrito en este documento, o CDR que son, en conjunto, identicas en al menos el 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % a las de un anticuerpo semejante. En una realizacion, los bucles hipervariables H1 y H2 tienen la misma estructura canonica

40 que los de un anticuerpo descrito en este documento. En una realizacion, los bucles hipervariables L1 y L2 tienen la misma estructura canonica que los de un anticuerpo descrito en este documento.

[0128] En una realizacion, la secuencia aminoacldica de la secuencia del dominio variable de la HC y/o LC es identica en al menos el 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 o el 100 % a la secuencia aminoacldica del dominio

45 variable de la HC y/o LC de un anticuerpo descrito en este documento. La secuencia aminoacldica de la secuencia del dominio variable de la HC y/o LC puede diferir en al menos un aminoacido, pero no mas de diez, ocho, seis, cinco, cuatro, tres o dos aminoacidos de la secuencia correspondiente de un anticuerpo descrito en este documento. Por ejemplo, las diferencias pueden corresponder primaria o totalmente a las regiones de armazon.

50 [0129] Las secuencias aminoacldicas de las secuencias de los dominios variables de las HC y LC pueden

estar codificadas por una secuencia de acido nucleico que hibrida en condiciones de alta astringencia con una secuencia de acido nucleico descrita en este documento o una secuencia que codifica un dominio variable o una secuencia aminoacldica descrita en este documento. En una realizacion, las secuencias aminoacldicas de una o mas regiones de armazon (por ejemplo, FR1, FR2, FR3 y/o FR4) del dominio variable de la HC y/o LC son identicas 55 en al menos el 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 o el 100 % a las regiones de armazon correspondientes de los dominios variables de las HC y LC de un anticuerpo descrito en este documento. En una realizacion, una o mas de las regiones de armazon de la cadena pesada o ligera (por ejemplo, FR1, FR2 y FR3 de la HC) son identicas en al menos el 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o el 100 % a la secuencia de las regiones de armazon correspondientes de un anticuerpo de la llnea germinal humana.

[0130] Los calculos de “homologia” o de “identidad de secuencia” entre dos secuencias (los terminos se usan de forma intercambiable ene este documento) se realizan de la manera siguiente. Las secuencias se alinean con el fin de una comparacion optima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o las dos de una primera y una

5 segunda secuencia aminoacldica o secuencia de acido nucleico para el alineamiento optimo y las secuencias no homologas pueden ignorarse para la comparacion). El alineamiento optimo se determina cono la mejor puntuacion obtenida usando el programa GAP del paquete de software GCG con una matriz de puntuacion Blossum 62 y una penalizacion por hueco de 12, una penalization por extension de hueco de 4 y una penalization por hueco por desfase del marco de lectura de 5. Entonces se comparan los restos aminoacldicos o los nucleotidos en las

10 posiciones de aminoacidos o nucleotidos correspondientes. Cuando una position en la primera secuencia esta ocupada por el mismo resto aminoacldico o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, las moleculas son identicas en esa posicion (tal como se usa en este documento, “identidad” de aminoacidos o acidos nucleicos es equivalente a “homologia” de aminoacidos o acidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas que comparten las secuencias.

15

[0131] Tal como se usa en este documento, la expresion “hibrida en condiciones de alta astringencia” describe las condiciones de hibridacion y lavado. Una orientation para llevar a cabo las reacciones de hi bridacion puede encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1989), 6.3.1-6.3.6. En dicha referencia se describen procedimientos acuosos y no acuosos, ambos de los cuales pueden usarse. La

20 hibridacion en condiciones de alta astringencia incluye la hibridacion en 6x SSC a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o mas lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % a 65 °C o condiciones sustancialmente similares.

Production de anticuerpos

25 [0132] Los anticuerpos pueden producirse en celulas procariotas y eucariotas. En una realization, los

anticuerpos (por ejemplo, scFV) se expresan en una celula de levadura como Pichia (vease, por ejemplo, Powers et al. (2001) J. Immunol. Methods 251: 123-35), Hansenula o Saccharomyces.

[0133] En una realizacion, los anticuerpos, especialmente anticuerpos completos, por ejemplo, IgG, se

30 producen en celulas de mamlferos. Algunos ejemplos de celulas hospedadoras de mamlferos para expresion

recombinante incluyen celulas de ovario de hamster chino (celulas CHO) (incluidas las celulas CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, tal como se describe en Kaufman y Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), llneas celulares linfoclticas, por ejemplo, celulas de mieloma NS0 y celulas SP2, celulas COS, K562 y celulas de un animal

35 transgenico, por ejemplo, un mamlfero transgenico. Por ejemplo, la celula es una celula epitelial mamaria.

[0134] Ademas de la secuencia de acido nucleico que codifica el dominio de inmunoglobulina, los vectores de expresion recombinante pueden contener secuencias de acido nucleico adicionales, como secuencias que regulan la replication del vector en las celulas hospedadoras (por ejemplo, orlgenes de replication) y genes de marcadores

40 seleccionables. Los genes de marcadores seleccionables facilitan la selection de las celulas hospedadoras en las que se ha introducido el vector (vease, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. n.° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Algunos ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen el gen de la dihidrofolato-reductasa (DHFR) (para usar en celulas hospedadoras dhfr con seleccion/amplificacion con metotrexato) y el gen neo (para seleccion con G418).

45

[0135] En un sistema ejemplar de expresion recombinante de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo completo o una portion de union antigenica del mismo), un vector de expresion recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo se introduce en celulas CHO dhfr- mediante transfection mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresion recombinante, los genes de las cadenas

50 pesada y ligera del anticuerpo estan ligados operativamente a elementos reguladores potenciadores/promotores (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, como un elemento regulador potenciador de CMV/promotor de AdMLP o un elemento regulador potenciador de SV40/promotor de AdMLP) para impulsar altos niveles de transcripcion de los genes. El vector de expresion recombinante tambien contiene un gen DHFR que permite la seleccion de celulas CHO que han sido transfectadas con el vector usando seleccion/amplificacion con

55 metotrexato. Las celulas hospedadoras transformadas seleccionadas se cultivan para permitir la expresion de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y el anticuerpo completo se recupera del medio de cultivo. Se usan tecnicas estandar de biologla molecular para preparar el vector de expresion recombinante, transfectar las celulas hospedadoras, seleccionar los transformantes, cultivar las celulas hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Por ejemplo, algunos anticuerpos pueden aislarse por cromatografla de afinidad con protelna A o protelna

G. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a a4 purificados pueden concentrarse a de aproximadamente 100 mg/ml a 200 mg/ml usando tecnicas de concentration de protelnas conocidas en la tecnica.

[0136] Los anticuerpos tambien pueden incluir modificaciones, por ejemplo, modificaciones que alteran la

5 funcion del Fc, por ejemplo, para reducir o eliminar la interaction con un receptor del Fc, con C1q o con los dos. Por ejemplo, la region constante de la IgG4 humana puede tener una mutation de Ser a Pro en el resto 228 para fijar la region bisagra. La secuencia aminoacldica de un Fc de IgG4 (dominios bisagra + CH2 + CH3) se proporciona en la figura 5.

10 [0137] En otro ejemplo, la region constante de la IgG1 humana puede estar mutada en uno o mas restos, por

ejemplo, uno o mas de los restos 234 y 237, por ejemplo, segun la numeration en la patente de los EE. UU. n.° 5.648.260. Otros ejemplos de modificaciones incluyen aquellos descritos en la patente de los EE. UU. n.° 5.648.260.

[0138] Para algunos anticuerpos que incluyen un dominio Fc, el sistema de production de anticuerpos puede 15 disenarse para sintetizar anticuerpos en los que la region Fc este glucosilada. En otro ejemplo, el dominio Fc de las

moleculas de IgG esta glucosilado en la asparragina 297 del dominio CH2 (vease la figura 5). Esta asparragina es el sitio para la modification con oligosacaridos de tipo biantenario. La glucosilacion participa en las funciones efectoras mediadas por los receptores del Fcy y el complemento C1q (Burton y Woof (1992) Adv. Immunol. 51: 1-84; Jefferis et al. (1998) Immunol. Rev. 163: 59-76). El dominio Fc puede producirse en un sistema de expresion de mamlferos que 20 glucosile adecuadamente el resto correspondiente a la asparragina 297. El dominio Fc puede incluir tambien otras modificaciones postranslacionales eucarioticas.

[0139] Otras modificaciones adecuadas del dominio Fc incluyen aquellas descritas en el documento WO 2004/029207. Por ejemplo, el dominio Fc puede ser un Fc XmAb® (Xencor, Monrovia, CA, EE. UU.). El dominio Fc,

25 o un fragmento del mismo, puede tener una sustitucion en la region de union a un receptor del Fcy (FcyR), como los dominios y fragmentos descritos en el documento WO 05/063815. En algunas realizaciones, el dominio Fc, o un fragmento del mismo, tiene una sustitucion en la region de union al receptor del Fc neonatal (FcRn), como los dominios y fragmentos descritos en el documento WO 05047327. En otras realizaciones, el dominio Fc es una sola cadena o un fragmento de la misma, o una version modificada de la misma como las descritas en el documento WO 30 2008143954. Otras modificaciones adecuadas del Fc son conocidas y estan descritas en la tecnica.

[0140] Los anticuerpos tambien pueden producirse en un animal transgenico. Por ejemplo, la patente de los EE. UU. n.° 5.849.992 describe un procedimiento para expresar un anticuerpo en la glandula mamaria de un animal transgenico. Se construye un transgen que incluye un promotor especlfico de la leche y secuencias de acido

35 nucleico que codifican el anticuerpo de interes, por ejemplo, un anticuerpo descrito en este documento y una secuencia senal para secretion. La leche producida por las hembras de tales mamlferos transgenicos incluye, secretado en la misma, el anticuerpo de interes, por ejemplo, un anticuerpo descrito en este documento. El anticuerpo puede purificarse de la leche o, para algunas aplicaciones, usarse directamente.

40 [0141] Los anticuerpos pueden modificarse, por ejemplo, con una fraction que mejora su estabilizacion y/o

retention en la circulation, por ejemplo, en la sangre, suero, linfa, lavado broncoalveolar u otros tejidos, por ejemplo, al menos 1,5, 2, 5, 10 o 50 veces.

[0142] Por ejemplo, un anticuerpo que se une a VLA-4 puede asociarse con un pollmero, por ejemplo, un

45 pollmero sustancialmente no antigenico, como un oxido de polialquileno o un oxido de polietileno. Los pollmeros adecuados pueden variar sustancialmente en peso. Pueden usarse pollmeros con pesos moleculares promedio en numero en el intervalo de aproximadamente 200 a aproximadamente 35.000 Da (o de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000 y de 2.000 a aproximadamente 12.500).

50 [0143] Por ejemplo, un anticuerpo que se une a VLA-4 puede conjugarse con un pollmero soluble en agua,

por ejemplo, un pollmero hidrofilo de polivinilo, por ejemplo, alcohol polivinllico o polivinilpirrolidona. Una lista no limitante de tales pollmeros incluye homopollmeros de oxido de polialquileno) como polietilenglicol (PEG) o propilenglicoles, polioles polioxietilenados, copollmeros de los mismos y copollmeros de bloques de los mismos, siempre que la solubilidad en agua de los copollmeros de bloques se mantenga. Otros pollmeros utiles adicionales 55 incluyen polioxialquilenos como polioxietileno, polioxipropileno, y copollmeros de bloques de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbomeros; polisacaridos ramificados o sin ramificar que comprenden los monomeros sacaridos D-manosa, D y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, acido D-glucuronico, acido sialico, acido D-galacturonico, acido D-manuronico (por ejemplo, acido polimanuronico o acido alglnico), D- glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y acido neuramlnico, incluidos homopolisacaridos y heteropolisacaridos

como lactosa, amilopectina, almidon, hidroxietilalmidon, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucogeno o la subunidad de polisacarido de mucopolisacaridos acidos, por ejemplo, acido hialuronico; pollmeros de alcoholes de azucares como polisorbitol y polimanitol; heparina o heparona.

5 Ejemplos de segundos agentes

[0144] En algunos casos, las formulaciones descritas en este documento, por ejemplo, formulaciones que contienen un anticuerpo que se une a a4, incluyen un segundo agente o se administran en combinacion con una formulacion que contiene un segundo agente.

10

[0145] En una implementacion, el anticuerpo que se une a a4 y el segundo agente se proporcionan como coformulacion y la coformulacion se administra al sujeto. Ademas, es posible, por ejemplo, al menos 24 horas antes o despues de administrar la coformulacion, administrar por separado una dosis de la formulacion del anticuerpo que se une a a4 y despues una dosis de una formulacion que contiene el segundo agente. En otra implementacion, el

15 anticuerpo y el segundo agente se proporcionan como formulaciones separadas y la etapa de administracion incluye administrar secuencialmente el anticuerpo y el segundo agente. Las administraciones secuenciales pueden proporcionarse el mismo dla (por ejemplo, con una hora de diferencia entre si o con al menos 3, 6 o 12 horas de diferencia) o en dlas diferentes.

20 [0146] Generalmente, el anticuerpo y el segundo agente se administran cada uno como una pluralidad de

dosis separadas en el tiempo. El anticuerpo y el segundo agente se administran generalmente de acuerdo con un regimen. El regimen para uno o los dos puede tener una periodicidad regular. El regimen para el anticuerpo puede tener una periodicidad diferente a la del regimen para el segundo agente, por ejemplo, uno puede administrarse con mayor frecuencia que el otro. En una implementacion, uno de los dos, anticuerpo y segundo agente, se administra 25 una vez a la semana y el otro una vez al mes. En otra implementacion, uno de los dos, anticuerpo y segundo agente, se administra de forma continuada, por ejemplo, durante un periodo de mas de 30 minutos, pero de menos de 1, 2, 4 o 12 horas y el otro se administra como un bolo. El anticuerpo y el segundo agente pueden administrarse por cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, por via subcutanea, intramuscular o intravenosa.

30 [0147] En algunas realizaciones, cada uno los dos, anticuerpo y segundo agente, se administra en la misma

dosis que se prescribe para un monotratamiento. En otras realizaciones, el anticuerpo se administra en una dosis que es igual o menor que la cantidad requerida para su eficacia si se administra solo. Igualmente, el segundo agente puede administrarse en una dosis que es igual o menor que la cantidad requerida para su eficacia si se administra solo.

35

[0148] Algunos ejemplos no limitantes de segundos agentes para el tratamiento de la esclerosis multiple en

combinacion con un anticuerpo que se une a a4 incluyen:

• interferones, por ejemplo, interferon p-1a humano (por ejemplo, AVONEX® o Rebif®) e interferon p-1 b 40 (BETASERON™, interferon p humano sustituido en la posicion 17; Berlex/Chiron);

• acetato de glatiramero (denominado tambien copollmero 1, Cop-1, COPAXONE™; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.);

45 • Rituxan® (rituximab) u otros anticuerpos contra CD20, por ejemplo, uno que compite con rituximab o se une a un epltopo solapante con el mismo;

• mitoxantrona (NOVANTRONE®, Lederle);

50 • un agente quimioterapeutico, por ejemplo, cladribina (LEUSTATIN®), azatioprina (IMURAN®), ciclofosfamida (CYTOXAN®), ciclosporina A, metotrexato, 4-aminopiridina y tizanidina;

• un corticosteroide, por ejemplo, metilprednisolona (MEDRONE®, Pfizer), prednisona;

55 • una inmunoglubulina, por ejemplo, Rituxan® (rituximab); CTLA4-Ig; alemtuzumab (MabCAMPATH®) o daclizumab (un anticuerpo que se une a CD25);

• estatinas; y

• antagonistas de TNF.

[0149] El acetato de glatiramero es una protelna formada por una cadena aleatoria de los aminoacidos: acido glutamico, lisina, alanina y tirosina (de ahl el nombre GLATiramero). El acetato de glatiramero puede sintetizarse en

5 disolucion a partir de estos aminoacidos, en una relacion de aproximadamente 5 partes de alanina por 3 partes de lisina, 1,5 partes de acido glutamico y 1 parte de tirosina, usando anhldridos de N-carboxiaminoacidos.

[0150] Otros segundos agentes adicionales incluyen anticuerpos o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento humanos, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-11, GM-

10 CSF, FGF y PDGF. Otros ejemplos mas de segundos agentes incluyen anticuerpos contra moleculas de la superficie celular como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86 y CD90 o sus ligandos. por ejemplo, daclizumab es un anticuerpo contra CD25 que puede mejorar la esclerosis multiple.

[0151] Otros anticuerpos ejemplares adicionales incluyen anticuerpos que proporcionan una actividad de un 15 agente descrito en este documento, como un anticuerpo que se une a un receptor de interferon, por ejemplo, un

receptor de interferon p. Tlpicamente, en implementaciones en las que el segundo agente incluye un anticuerpo, este se une a una protelna diana diferente de VLA-4 o diferente de la integrina a4, o al menos a un epltopo de VLA-4 diferente del reconocido por el primer agente.

20 [0152] Aun otros ejemplos adicionales de segundos agentes incluyen: FK506, rapamicina, micofenolato de

mofetilo, leflunomida, farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), por ejemplo, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitromboticos, inhibidores del complemento, agentes adrenergicos, agentes que interfieren con la senalizacion por las citocinas proinflamatorias segun se describen en este documento, inhibidores de la enzima convertidora de IL-1 p (por ejemplo, Vx740), anticuerpos contra P7, PSGL, inhibidores de TACE, 25 inhibidores de la senalizacion de los linfocitos T como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalacina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos, segun se describen en este documento, y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGF).

30 [0153] En algunas realizaciones puede usarse un segundo agente para tratar uno o mas slntomas o efectos

secundarios de la EM. Tales agentes incluyen, por ejemplo, amantadina, baclofeno, papaverina, meclicina, hidroxicina, sulfametoxazol, ciprofloxacina, docusato, pemolina, dantroleno, desmopresina, dexametasona, tolterodina, fenitolna, oxibutinina, bisacodilo, venlafaxina, amitriptilina, metenamina, clonacepan, isoniacida, vardenafilo, nitrofurantolna, muciloide hidrofilo de Psyllium, alprostadilo, gabapentina, nortriptilina, paroxetina, 35 bromuro de propantelina, modafinilo, fluoxetina, fenazopiridina, metilprednisolona, carbamacepina, imipramina, diacepan, sildenafilo, bupropion y sertralina. Muchos segundos agentes que son pequenas moleculas tienen un peso molecular entre 150 y 5.000 Da.

[0154] Algunos ejemplos de antagonistas de TNF incluyen anticuerpos quimericos, humanizados, humanos o 40 generados in vitro (o fragmentos antigenicos de los mismos) contra TNF (por ejemplo, TNFa humano) como D2E7

(anticuerpo humano contra TNFa, patente de los EE. UU. n.° 6.258.562; BASF), CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (anticuerpo humanizado contra TNFa; Celltech/Pharmacia), cA2 (anticuerpo quimerico contra TNFa, REMICADE™; Centocor); fragmentos de anticuerpos contra TNF (por ejemplo, CPD870); fragmentos solubles de los receptores de TNF, por ejemplo los receptores p55 o p75 de TNF humano o derivados de los mismos, por ejemplo, 75kdTNFR-IgG 45 (protelna de fusion del receptor de TNF de 75 kDa e IgG, ENBREL™; Immunex; vease, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) vol. 37, pag. 295; J. Invest. Med. (1996) vol. 44, 235 A), p55kdTNFR-IgG (protelna de fusion del receptor de TNF de 55 kDa e IgG (LENERCEPT™)); antagonistas enzimaticos, por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de TNFa (TACE) (por ejemplo, un derivado del acido a-sulfonilhidroxamico, documento WO 01155112, y el inhibidor de tAcE de N-hidroxiformamida GW 3333, -005 o -022); y TNF-bp/s-TNFR (protelna 50 soluble que se une a TNF; vease, por ejemplo Arthritis & Rheumatism (1996) vol. 39, n.° 9 (suplemento), pag. 284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) vol. 268, pags. 37-42).

[0155] Ademas de un segundo agente, tambien es posible administrar otros agentes al sujeto. Sin embargo, en algunas realizaciones no se administra como composicion farmaceutica al sujeto ninguna otra protelna ni ningun

55 otro producto biologico distintos del anticuerpo que se une a a4 y el segundo agente. El anticuerpo que se une a a4 y el segundo agente pueden ser los unicos agentes que se administran por inyeccion. En realizaciones en las que el segundo agente es una protelna recombinante, el anticuerpo que se une a a4 y el segundo agente pueden ser los unicos agentes recombinantes administrados al sujeto o al menos los unicos agentes recombinantes que modulan las respuestas inmunitaria e inflamatoria. En otras realizaciones mas, el anticuerpo que se une a a4 solo es el unico

agente recombinante o el unico producto biologico administrado al sujeto.

[0156] A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en este documento tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la tecnica a la que pertenece la

5 invencion. Aunque en la practica o en las pruebas de la invencion pueden usarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, los procedimientos y materiales adecuados se describen a continuation. Ademas, los materiales, procedimientos y ejemplos son ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

EJEMPLOS

10

Ejemplo 1. Las variantes de anticuerpos contra VLA-4 son mas potentes que HP1/2 humanizado.

[0157] Los anticuerpos contra VLA-4 se construyeron usando el armazon de IGKV4-1 de la llnea germinal (disenos L1 y L2) o de AAH7033.1 genomanipulado en la llnea germinal (diseno L3) para la cadena VL y el armazon

15 de IGHV1-f de la llnea germinal para la VH. Estos anticuerpos tenlan menos retromutaciones que el anticuerpo humanizado HP1/2 descrito en la patente de los EE. UU. n.° 6.602.503.

Variaciones de la cadena pesada

20 [0158] Las secuencias de tres variaciones de la cadena pesada se muestran en la figura 1 como diseno H0,

diseno H1 y diseno H2. Cada diseno tiene las CDR de HP1/2 murino injertadas en el armazon de IGHV1-f. El diseno H0 no incluye retromutaciones de las regiones de armazon, mientras que los disenos H1 y H2 tienen varios grados de retromutaciones en las secuencias de las regiones de armazon para optimizar la afinidad del anticuerpo humanizado.

25

Variaciones de la cadena ligera

[0159] Las secuencias de cuatro variaciones de la cadena ligera se muestran en la figura 2 como diseno L0,

diseno L1, diseno L2 y diseno L3 (tambien denominadas L0, L1, L2 y L3). Cada diseno tiene las CDR de HP1/2 30 murino injertadas en el armazon de la llnea germinal. Para los disenos L0, L1 y L2 se uso el armazon de IGKV4-1 de la llnea germinal y para el diseno L3 se uso el armazon de AAH70335 genomanipulado en la llnea germinal. El diseno L0 no incluye retromutaciones en las regiones de armazon, mientras que los disenos L1, L2 y L3 tienen varios grados de retromutaciones en las regiones de armazon para optimizar la afinidad del anticuerpo humanizado.

35 [0160] Los resultados de ensayos ELISA de competition se muestran en la tabla 1 y la figura 3. En este

experimento, se preincubo a4p1 con el mAb de ensayo y despues se uso HP1/2 murino como reactivo competitivo. Los resultados de este experimento indicaron que los anticuerpos con las cadenas ligeras L2 o L3 eran mas potentes que el anticuerpo humanizado HuHP1/2 descrito en la patente de los EE. UU. n.° 6.602.503. Los resultados se muestran en la tabla 1 a continuacion y en la figura 3. La cadena pesada (H1) en los anticuerpos de este ensayo 40 tenia la secuencia del “diseno H1” mostrada en la figura 1, mientras que L1 se refiere al diseno L1 de la figura 2.

Tabla 1. Ensayo de competicion mediante ELISA

mAb: CI50 nM

HP1/2 quimerico: 1,06

H1L0: 1,87

H1L1: 1,67

H1L2: 0,9

H1L3: 0,49

HuHP1/2: 1,05

[0161] En la tabla 1, el mAb quimerico es un anticuerpo HP1/2 quimerizado, en el que las cadenas variables 45 murinas pesada y ligera estan fusionadas geneticamente a regiones constantes de IgG1 humana. Este anticuerpo es

esencialmente identico en cuanto a afinidad de union al anticuerpo HP1/2 murino original (Sanchez-Madrid et al., Eur. J. Immunol. 16: 1343-1349, 1996). Los resultados del experimento indican que es posible mejorar la afinidad del anticuerpo monoclonal con respecto a la secuencia parental murina a traves de la humanization en un armazon aceptor genomanipulado en la linea germinal.

50

[0162] Otro ensayo de competicion compara la afinidad de union de los nuevos anticuerpos con el anticuerpo humanizado contra a4 21.6 (Tysabri® (natalizumab)), descrito en el documento U.S. 5.840.299. En este experimento

se ensayo la union a a4p1 de una mezcla de HP1/2 de raton con los mAb de ensayo. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 4 y en la tabla 2 a continuacion e indican que los anticuerpos de nuevo diseno son aproximadamente 10 veces mas potentes que natalizumab.

Tabla 2. Ensayo de competicion mediante ELISA

mAb: CI50 nM

HP1/2 quimerico: 1,64

H1L0: 4,46

H1L1: 4,55

H1L2: 1,34

HuHP1/2: 1,41

Tysabri®: 10,9

Ejemplo 2. El anticuerpo HP1/2 humanizado (HuHP1/2) se une VLA-4 en lineas celulares tumorales

[0163] La union del anticuerpo contra VLA-4 HuHP1/2 a diversas lineas celulares se analizo mediante 10 citometrla de flujo. La union se analizo en las lineas celulares de LLC (leucemia linfocitica cronica) Mec1 y JM1, en

las lineas celulares de MM (mieloma multiple) U266 y H929 y en las lineas celulares de LMA (leucemia mielogena aguda) HL60 y KG1. HuHP1/2 se unio a todas las lineas celulares tumorales probadas (figura 6). Los datos de citometria de flujo se usaron para calcular los valores de la CE50 para la union del anticuerpo a cada una de las diferentes lineas celulares. La information se muestra a continuacion en la tabla 3.

15

[0164] Tambien se encontro que HuHP1/2 bloqueaba la adhesion de las lineas celulares de LMA a fibronectina (FN) y a la proteina de fusion VCAM-1-Ig. Para analizar si el anticuerpo podria bloquear la adhesion, se permitio la adhesion de las lineas celulares de LMA HL60 y KG1 a pocillos recubiertos con FN (figura 7A) o pocillos recubiertos con VCAM1-Ig (figura 7B) en presencia de concentraciones crecientes de HP1/2 o del anticuerpo de

20 control de isotipo. HuHP1/2 bloqueo la adhesion de los dos tipos de celulas a los pocillos recubiertos con FN y a los pocillos recubiertos con VCAM1-Ig. La maxima inhibition de la union de las celulas HL60 a los dos ligandos se alcanzo con 20 pg/ml de HuHP1/2 (figura 7C).

[0165] Tambien se encontro que HuHP1/2 bloqueaba la adhesion de las lineas celulares de MM a FN y a la 25 proteina de fusion VCAM-1-Ig. Se permitio la adhesion de las lineas celulares de MM U266 y H929 a pocillos

recubiertos con FN (figura 8A) o pocillos recubiertos con VCAM1-Ig (figura 8B) en presencia de concentraciones crecientes de HP1/2 o del anticuerpo de control de isotipo. HuHP1/2 bloqueo la adhesion de los dos tipos de lineas celulares a los pocillos recubiertos con FN y con VCAM1-Ig. La maxima inhibicion de la union de las celulas U266 a los dos ligandos se alcanzo con 20 pg/ml de HuHP1/2 (figura 8C).

30

[0166] Tambien se encontro que HuHP1/2 bloqueaba la adhesion de las lineas celulares de LLC a FN y a la proteina de fusion VCAM-1-Ig. Se permitio la adhesion de las lineas celulares de LLC Mec1 y JM1 a pocillos recubiertos con FN (figura 9A) o pocillos recubiertos con VCAM1-Ig (figura 9B) en presencia de concentraciones crecientes de HP1/2 o del anticuerpo de control de isotipo. HuHP1/2 bloqueo la adhesion de los dos tipos de lineas

35 celulares a los pocillos recubiertos con FN y con VCAM1-Ig. La maxima inhibicion de la union de las celulas Mec1 a los dos ligandos se alcanzo con 20 pg/ml de HuHP1/2 (figura 9C).

[0167] Los valores de la CI50 para la union de HuHP1/2 a las lineas celulares tumorales se calcularon a partir

de los datos mostrados en las figuras 7-9. Estos datos se muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Cuantificacion de HuHP1/2 en lineas celulares tumorales

: CE50 (nM) CI50 (nM)

Fibronectina: VCAM

LLC: Mec1 0,11 0,10 0,07

JM1: 0,21 - 0,12

MM: U266 0,46 0,14 0,13

H929: 0,91 0,21 1,35

LMA: HL60 0,11 0,16 0,91

KG1: 0,19 0,05 0,1

[0168] Otras realizaciones se encuentran en las reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molecula de anticuerpo recombinante o un fragmento de la misma que se une a a4 que comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, en la que:

5

(a) la cadena pesada variable comprende la secuencia del armazon de la cadena pesada variable de IGHV1-f y las CDR de la cadena VH del anticuerpo murino HP1/2, en la que CDR1 comprende la secuencia GFNIKDTYM, CDR2 comprende la secuencia RIDPASGDTKYDPKFQV y CDR3 comprende la secuencia GMWVSTGYALDF; y

(b) la cadena ligera variable comprende la secuencia del armazon de la cadena ligera variable de IGKV4-1 y las 10 CDR de la cadena VL del anticuerpo murino HP1/2, en la que CDR1 comprende la secuencia KASQSVTnDvA,

CDR2 comprende la secuencia YASNRYT y CDR3 comprende la secuencia QQDYSSPYT, en la que:

(i) los restos aminoacldicos en las posiciones 1, 67 y 87 del armazon de la cadena ligera variable segun el esquema de numeracion de Kabat estan sustituidos con restos no humanos, en los que el resto no humano en la posicion 1

15 del armazon es serina (S), el resto no humano en la posicion 67 del armazon es tirosina (Y) y el resto no humano en la posicion 87 del armazon es fenilalanina (F); y

(ii) los restos aminoacldicos en las posiciones 24 y 94 del armazon de la cadena pesada variable segun el esquema de numeracion de Kabat estan sustituidos con restos no humanos, en los que el resto no humano en la posicion 24 del armazon es alanina (A) y el resto no humano en la posicion 94 del armazon es acido aspartico (D);

20

y en la que la molecula de anticuerpo recombinante o el fragmento de la misma que se une a a4 se une a VLA-4.
2. Un procedimiento de preparation de un anticuerpo recombinante contra a4, o un fragmento del mismo que se une a a4, que comprende

25

(a) proporcionar una celula hospedadora que comprende una secuencia de ADN que codifica la molecula de anticuerpo recombinante, o un fragmento de la misma que se une a a4, de la reivindicacion 1 y

(b) cultivar la celula para producir la molecula de anticuerpo recombinante contra a4 o un fragmento de la misma que se une a a4.

30
3. La molecula de anticuerpo recombinante, o un fragmento de la misma que se une a a4, de la reivindicacion 1 para uso como medicamento en el tratamiento de un paciente.
4. La molecula de anticuerpo recombinante, o un fragmento de la misma que se une a a4, para uso 35 segun la reivindicacion 3, en el que el paciente tiene un cancer.
5. La molecula de anticuerpo recombinante, o un fragmento de la misma que se une a a4, para uso segun la reivindicacion 4, en el que el paciente tiene un tumor solido, una neoplasia hematologica, un mieloma multiple o leucemia mielogena aguda (LMA).

40
6. La molecula de anticuerpo recombinante, o un fragmento de la misma que se une a a4, para uso segun la reivindicacion 3, en que el paciente tiene un trastorno inflamatorio, esclerosis multiple, asma, artritis reumatoide, diabetes, neuritis optica, enfermedad de Crohn, un trastorno agudo, una lesion medular o un traumatismo craneoencefalico.

45
7. La molecula de anticuerpo recombinante, o un fragmento de la misma que se une a a4, para uso segun la reivindicacion 3, en el que el tratamiento comprende ademas la administration al paciente de un segundo agente terapeutico, seleccionado opcionalmente de entre un agente trombolltico, un agente quimioterapeutico, un agente neuroprotector, un agente antiinflamatorio, un esteroide, una citocina o un factor de crecimiento.