ES2912934T3

ES2912934T3 - Anticuerpos anti VLA-4

Info

Publication number: ES2912934T3
Application number: ES18205524T
Authority: ES
Inventors: Alexey A Lugovskoy; Frederick R Taylor; Karen Mclachlan
Original assignee: Biogen MA Inc
Current assignee: Biogen MA Inc
Priority date: 2010-04-16
Filing date: 2011-04-15
Publication date: 2022-05-30
Anticipated expiration: 2031-04-15
Also published as: MX340683B; LT3202789T; ME02793B; PT2558499T; JP2017123846A; PL3202789T3; DK2558499T3; BR112012026403B1; JP2022141875A; DK3466977T3; WO2011130603A2; US20180221480A1; CY1119154T1; SG184318A1; HRP20201219T1; SI2558499T1; CA2794863A1; PL2558499T3; EA201291065A1; RS56082B1

Abstract

Una molécula de anticuerpo recombinante, o un fragmento de unión a α4 de la misma, que comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, donde: (a) la cadena pesada variable comprende la secuencia de la región marco de cadena pesada variable de IGHV1- f y las CDR de la cadena VH del anticuerpo murino HP1/2, donde la CDR1 comprende la secuencia GFNIKDTYM, la CDR2 comprende la secuencia RIDPASGDTKYDPKFQV y la CDR3 comprende la secuencia GMWVSTGYALDF, y los residuos de aminoácidos en las posiciones marco 24 y 94 del marco de la cadena pesada variable según el esquema de numeración de Kabat están sustituidos, donde el residuo sustituido en la posición marco 24 es alanina (A) y el residuo sustituido en la posición marco 94 es ácido aspártico (D); (b) la cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 11; y donde la molécula de anticuerpo recombinante o el fragmento de unión a α4 de la misma se une a VLA-4.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti vla-4

SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de EE.UU. N.° 61/324.944, presentada el 16 de abril de 2010.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a anticuerpos de unión a alfa-4 y fragmentos de unión a alfa-4 de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los anticuerpos humanizados se pueden utilizar como agentes terapéuticos en lugar de anticuerpos murinos para evitar la respuesta inmunitaria no deseable en seres humanos denominada respuesta HAMA (anticuerpo humano anti ratón). Los anticuerpos humanizados se construyen generalmente sustituyendo las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de un anticuerpo humano con las CDR de otra especie, típicamente un anticuerpo de ratón.

VLA-4 (también denominado a4p1) es un miembro de la familia de las integrinas p1 de receptores de la superficie celular. VLA-4 contiene una cadena a4 y una cadena p1 y participa en las interacciones intercelulares. Su expresión está principalmente restringida a células linfoides y mieloides. VLA-4 se une al ligando de células endoteliales VCAM-1 (molécula de adhesión de células vasculares 1) y puede mediar en la unión de linfocitos T y B al fragmento de unión a heparina II de fibronectina plasmática humana.

El documento WO 2006/096653 describe un anticuerpo anti VLA-4 llamado HP1/2 y variantes humanizadas del mismo utilizando una región marco aceptora variable de cadena pesada de IGHV1-f.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Basándose en la descripción que está contenida en esta invención, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo recombinante, o un fragmento de unión a a4 de la misma, que comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, donde:

(a) la cadena pesada variable comprende la secuencia de la región marco de cadena pesada variable de IGHV1-f y las CDR de la cadena VH del anticuerpo murino HP1/2, donde la CDR1 comprende la secuencia GFNIKDTYM, la CDR2 comprende la secuencia RIDPASGDTKYDPKFQV y la CDR3 comprende la secuencia GMWVSTGYALDF, y los residuos de aminoácidos en las posiciones marco 24 y 94 del marco de la cadena pesada variable según el esquema de numeración de Kabat están sustituidos, donde el residuo sustituido en la posición marco 24 es alanina (A) y el residuo sustituido en la posición marco 94 es ácido aspártico (D);

(b) la cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 11;

y donde la molécula de anticuerpo recombinante o el fragmento de unión a a4 de la misma se une a VLA-4.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para elaborar una molécula de anticuerpo anti a4 recombinante, o un fragmento de unión a a4 de la misma, que comprende

(a) proporcionar una célula huésped que comprende una secuencia de ADN que codifica la molécula de anticuerpo recombinante, o un fragmento de unión a a4 de la misma, como se define en la presente invención, y

(b) cultivar la célula para producir la molécula de anticuerpo anti a4 recombinante, o fragmento de unión a a4 de la misma.

La presente invención y las realizaciones de la misma se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

Los inventores han descubierto que las regiones marco de la región variable de la línea germinal se pueden utilizar para optimizar los anticuerpos de unión a alfa-4 injertados con CDR, tal como los anticuerpos anti VLA-4. Por consiguiente, la invención presenta cadenas pesadas variables (VH) y ligeras variables (VL) anti VLA-4 y moléculas de anticuerpo que incluyen dichas regiones marco.

En un aspecto, la descripción presenta una cadena VH de anticuerpo anti a4 que tiene CDR de un anticuerpo anti a4 donante, por ejemplo, un anticuerpo anti a4 descrito en esta invención, y una región marco VH que tiene las regiones 1, 2, 3 y 4 de la secuencia de, o que no tiene más de 5, 10 o 15 diferencias de una secuencia de región variable de línea germinal para la cadena VH. En una realización, la región marco variable 4 (FR4) es una secuencia consenso humana. En una realización, están presentes las regiones marco completas de cadena VH FR1, FR2, FR3 y FR4. En otra realización, la cadena es un fragmento de unión a antígeno de una región VH.

En una realización, la secuencia de línea germinal es IGHV1-f humana (SEQ ID NO:2), representada en la figura 1. En determinadas realizaciones, la secuencia de la región marco VH puede diferir en al menos uno, pero no más de 2, 3, 4, 5, 10 o 15 residuos de aminoácidos de una secuencia de línea germinal, por ejemplo, SEQ ID NO:2. En una realización, la región marco VH incluye además otros residuos humanos distintos de los correspondientes. Por ejemplo, la cadena VH incluye residuos no humanos, en una o más de las posiciones de la región marco 24, 67, 76, 80 y 94 (numeración de Kabat) de la SEQ ID NO:2.

En una realización, al menos una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los dominios variables se obtienen de un anticuerpo de unión a a4 no humano donante. En una realización, las regiones de unión a antígeno del dominio variable de cadena pesada injertado con CDR incluyen las CDR correspondientes a las posiciones 26-34 (CDR1), 50-65 (CDR2) y 95-102 (CDR3) (numeración de Kabat; Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., vol. 4, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, USA).

Por lo tanto, en una realización, la región marco de cadena pesada variable (VH) tiene una secuencia aceptora obtenida de la secuencia de línea germinal del anticuerpo humano IGHV1-f.

En otra realización, al menos un aminoácido y menos de 2, 3, 4, 5 o 10 residuos de aminoácidos, en la región FR1 de VH son distintos del residuo de línea germinal humana correspondiente. Por ejemplo, uno o más de dichos residuos pueden ser idénticos a la región marco del anticuerpo no humano de la que se obtienen las secuencias de CDR. En una realización, el residuo de aminoácido en la posición 24 de Kabat está mutado para que sea idéntico a la región marco del anticuerpo no humano.

En otra realización, al menos un aminoácido, y menos de 2, 3, 4, 5 o 10 residuos de aminoácidos, en la región FR2 de VH son distintos del residuo de línea germinal humana correspondiente. Por ejemplo, uno o más de dichos residuos pueden ser idénticos a la región marco del anticuerpo no humano de la que se obtienen las secuencias de CDR.

Aún en otra realización, al menos un aminoácido, y menos de 2, 3, 4, 5 o 10 residuos de aminoácidos, en la FR3 de la cadena VH son distintos del residuo de línea germinal humana correspondiente. Por ejemplo, uno o más de dichos residuos pueden ser idénticos a la región marco del anticuerpo no humano de la que se obtienen las secuencias de CDR. En una realización, el residuo de aminoácido en la posición 94 de Kabat es idéntico a la región marco del anticuerpo no humano. Aún en otra realización, los residuos de aminoácidos en las posiciones 67, 76, 80 y 94 de Kabat son idénticos a la región marco del anticuerpo no humano.

En determinadas realizaciones, la cadena VH del anticuerpo tiene la secuencia de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5.

En un aspecto, la descripción presenta una cadena VL anti VLA-4 que tiene CDR de un anticuerpo anti VLA-4 donante, por ejemplo, un anticuerpo anti VLA-4 descrito en esta invención, y una región marco VL que tiene las regiones 1, 2, 3 y 4 de la secuencia de, o que no tiene más de 5, 10 o 15 diferencias de una secuencia de región variable de línea germinal para la cadena VL. En una realización, la región marco variable 4 (FR4) es una secuencia consenso humana. En una realización, están presentes las regiones marco completas de cadena VL FR1, FR2, FR3 y FR4. En otra realización, la cadena es un fragmento de unión a antígeno de una región VL.

En otra realización, la secuencia de línea germinal es IGKV4-1 (SEQ ID NO:7), representada en la figura 2. Aún en otras realizaciones, la secuencia de la región marco VL puede diferir en al menos uno, pero no más de 2, 3, 4, 5, 10 o 15 residuos de aminoácidos de una secuencia de la región marco de línea germinal, por ejemplo, SEQ ID NO:7. En otra realización, VL incluye además otros residuos de aminoácidos humanos distintos de los correspondientes. Por ejemplo, la cadena VL incluye además residuos no humanos, en una o más de las posiciones de la región marco 1, 73 y 87 (numeración de Kabat) de la SEQ ID NO:7.

En una realización, la secuencia es AAH7035.1 (SEQ ID NO:12) o su versión genomanipulada en la línea germinal (SEQ ID NO:13), representada en la figura 2. En algunas realizaciones, la secuencia de la región marco VL puede diferir en al menos uno, pero no más de 5, 10, 15, 20 o 25 residuos de aminoácidos de una secuencia de la región marco genomanipulada en la línea germinal, por ejemplo, SEQ ID NO:13. En una realización, la cadena VL incluye otros residuos humanos distintos de los correspondientes. Por ejemplo, la cadena VL incluye residuos no humanos, en una o más de las posiciones de la región marco 1 y 87 (numeración de Kabat) de la SEQ ID NO:12. En otra realización, la VL incluye sustituciones de aminoácidos en las regiones marco para parecerse a una secuencia de la región marco de línea germinal humana diferente, tal como la secuencia de línea germinal IGKV4-1. En determinadas realizaciones, la secuencia de la región marco VL se altera para que sea idéntica a la secuencia de línea germinal IGKV4-1 en las posiciones 1-3, 5-23, 35-37, 39-42, 45-49, 57, 59-61,63-64, 70-72, 74-84,86-88, 99-106 (numeración de Kabat) de SEQ ID NO:12.

En una realización, al menos una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los dominios variables se obtienen de un anticuerpo de unión a a4 no humano donante. En otra realización, las regiones de unión a antígeno del dominio variable de cadena pesada injertado con CDR incluyen las CDR correspondientes a las posiciones 24-31 (CDR1), 50-56 (CDR2) y 89-97 (CDr 3) (numeración de Kabat). Por lo tanto, en una realización, la región marco VL tiene una secuencia aceptora construida a partir de la secuencia de línea germinal IGKV4-1, del anticuerpo AAH70335.1 o del anticuerpo AAH70335.1 genomanipulado en la línea germinal.

Aún en otra realización, al menos un aminoácido, y menos de 2, 3, 4, 5, 10 o 15 residuos, en la FR1 de la cadena VL son distintos del residuo humano correspondientes. Por ejemplo, uno o más de dichos residuos pueden ser idénticos a la región marco del anticuerpo no humano de la que se obtienen las secuencias de CDR. En una realización, el residuo de aminoácido en la posición del extremo N de FR1 está mutado para que sea idéntico a la región marco del anticuerpo no humano.

En otra realización, al menos un aminoácido, y menos de 2, 3, 4, 5, 10 o 15 residuos, en la FR2 de la cadena VL son distintos del residuo humano correspondiente. Por ejemplo, uno o más de dichos residuos pueden ser idénticos a la región marco del anticuerpo no humano de la que se obtienen las secuencias de CDR.

Aún en otra realización, al menos un aminoácido, y menos de 2, 3, 4, 5, 10 o 15 residuos, en la FR3 de la VL son distintos del residuo humano correspondiente. Por ejemplo, uno o más de dichos residuos pueden ser idénticos a la región marco del anticuerpo no humano de la que se obtienen las secuencias de CDR. En otra realización, el residuo de aminoácido en la posición 87 de Kabat está mutado para que sea idéntico a la región marco del anticuerpo no humano. Aún en otra realización, los residuos de aminoácidos en las posiciones 67 y 87 de Kabat se mutan para que sean idénticos a la secuencia de la región marco del anticuerpo no humano. Aún en otra realización, los residuos de aminoácidos en las posiciones 67, 73 y 87 de Kabat de SEQ ID NO:7 se mutan para que sean idénticos a la secuencia de la región marco del anticuerpo no humano.

En otras realizaciones, la cadena VL del anticuerpo tiene la secuencia de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11.

En una realización, las CDR de las secuencias de la región marco aceptoras VH y VL se seleccionan para parecerse a las secuencias de CDR de una secuencia de anticuerpo no humano (por ejemplo, murino), donde el anticuerpo no humano se une a la integrina alfa-4 o un fragmento de la misma. En otra realización, las secuencias de las c Dr se seleccionan para parecerse a las secuencias de las CDR de un anticuerpo no humano que se une al epítopo B1 de la cadena a4 de VLA-4. En una realización, las CDR se seleccionan para parecerse a un anticuerpo monoclonal murino, por ejemplo, HP1/2, HP2/1, HP2/4, L25, P4C2 o 21.6 (Pulido y col., J. Biol. Chem. 266:10241-10245, 1991; Patente de e E.UU. N.° 6.033.665). La modificación puede significar, por ejemplo, escisión e inserción o alteración, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida.

En otro aspecto, la descripción presenta un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, incluyendo:

-una cadena VL anti VLA-4 descrita en esta invención, por ejemplo, una cadena VL anti VLA-4 que tiene CDR de un anticuerpo anti VLA-4 donante, por ejemplo, un anticuerpo anti VLA-4 descrito en esta invención, y una región marco VL que tiene las regiones marco LC 1, 2 y 3 de la secuencia de, o que no tiene más de 5, 10 o 15 diferencias con respecto a, una secuencia de región variable de línea germinal para la cadena VL. En una realización, la región variable 4 es una secuencia consenso humana; y

-una cadena VH anti VLA-4 descrita en esta invención, por ejemplo, una cadena VL anti VLA-4 que tiene CDR de un anticuerpo anti VLA-4 donante, por ejemplo, un anticuerpo anti VLA-4 descrito en esta invención, y una región marco VL que tiene las regiones marco LC 1, 2 y 3 de la secuencia de, o que no tiene más de 5, 10 o 15 diferencias con respecto a, una secuencia de región variable de línea germinal para la cadena VL. En una realización, la región variable 4 es una secuencia consenso humana.

En una realización, el anticuerpo se une a uno o ambos de a4p1 y a4p7.

En otro aspecto, una cadena VL o VH, o un anticuerpo, o un fragmento del mismo, descrito en esta invención, está marcado de forma detectable.

Aún en otro aspecto, la descripción presenta un vector que contiene ADN que codifica una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, descrito en esta invención. En algunas realizaciones, el ADN del vector codifica una VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5.

Aún en otro aspecto, la descripción presenta un vector que contiene ADN que codifica una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, descrito en esta invención. En algunas realizaciones, el ADN del vector codifica una cadena VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11.

Aún en otro aspecto, la descripción presenta un vector que contiene ADN que codifica una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, descrito en esta invención y una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, descrito en esta invención.

En otro aspecto, la descripción presenta una célula huésped que contiene un vector descrito en esta invención, por ejemplo, uno capaz de expresar un anticuerpo de cadena ligera y/o pesada o un fragmento de anticuerpo descrito en esta invención.

En un aspecto, la descripción presenta un procedimiento para elaborar un anticuerpo anti a4 recombinante, o un fragmento de unión a a4 del mismo, al proporcionar una célula huésped transfectada con (a) una secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de anticuerpo descrita en esta invención, o un fragmento de unión a a4 de la misma, y (b) una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, y cultivar la célula transfectada para producir la molécula de anticuerpo anti a4 recombinante o un fragmento de unión a a4 de la misma. El ADN que codifica las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se puede producir en el mismo vector o en diferentes vectores.

En un aspecto, la descripción presenta un procedimiento para elaborar un anticuerpo anti a4 recombinante, o un fragmento de unión a a4 del mismo, proporcionando una célula huésped transfectada con (a) una secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, por ejemplo, donde la secuencia de ADN tiene la secuencia de las SEQ ID NO:3, 4 o 5, y (b) una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de unión a a4 de la misma, por ejemplo, donde la secuencia de ADN tiene la secuencia de las SEQ ID NO: 8, 9, 10 u 11, y cultivar la línea celular transfectada para producir la molécula de anticuerpo anti a4 recombinante, o fragmento de unión a a4 de la misma. El ADN que codifica las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se puede producir en el mismo vector o en diferentes vectores.

En otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno mediado por una integrina a4, por ejemplo, una integrina a4p1 (VLA-4) o a4p7, mediante la administración de un anticuerpo a4 o fragmento de anticuerpo descrito en esta invención, o una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo o fragmento, a un sujeto que necesita dicho tratamiento. El sujeto puede tener o estar en riesgo de desarrollar, por ejemplo, trastornos inflamatorios, inmunitarios o autoinmunitarios (por ejemplo, inflamación del sistema nervioso central, como esclerosis múltiple, meningitis, neuromielitis óptica, neurosarcoidosis, vasculitis del SNC, encefalitis y mielitis transversa), rechazo de injerto de tejido u órgano o enfermedad de injerto contra huésped, lesión aguda del SNC, tal como ictus, lesión cerebral traumática (LCT) o lesión de la médula espinal (LME); enfermedad renal crónica; alergia, por ejemplo, asma alérgica; diabetes mellitus tipo 1; trastornos inflamatorios del intestino, tales como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa; miastenia gravis; fibromialgia; trastornos artríticos, tales como artritis reumatoide, artritis psoriásica; trastornos cutáneos inflamatorios/inmunitarios, tales como psoriasis, vitíligo, dermatitis, liquen plano; lupus eritematoso sistémico; síndrome de Sjogren; cánceres hematológicos, tales como mieloma múltiple, leucemia, linfoma; cánceres sólidos, tales como sarcomas o carcinomas, por ejemplo, de pulmón, mama, próstata, cerebro; y trastornos fibróticos, tales como fibrosis pulmonar, mielofibrosis, cirrosis hepática, glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis semilunar, nefropatía diabética y fibrosis intersticial renal.

En otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento para tratar a un paciente mediante la administración al paciente de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a a4. En una realización, el paciente tiene un cáncer, tal como un tumor sólido o una neoplasia maligna hematológica. Por ejemplo, un paciente tratado con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a a4 puede tener leucemia mielógena aguda (LMA) o mieloma múltiple (MM).

En otra realización, el paciente tiene un trastorno inflamatorio, tal como esclerosis múltiple, asma (por ejemplo, asma moderada a grave), artritis reumatoide, diabetes o enfermedad de Crohn. En otra realización, la composición se administra como un régimen. En otra realización, el procedimiento incluye además seleccionar un paciente adecuado para el tratamiento con la composición. Un paciente adecuado para el tratamiento, por ejemplo, ha demostrado un signo o síntoma indicativo de inicio de la enfermedad, tal como un signo o síntoma indicativo de EM.

En aún otra realización, el procedimiento incluye además administrar al paciente un segundo agente terapéutico, tal como un agente quimioterapéutico, un agente trombolítico, un agente neuroprotector, un agente antiinflamatorio, un esteroide, una citocina o un factor de crecimiento.

En una realización, al paciente se le administra un anticuerpo anti VLA-4 humanizado, o un fragmento del mismo, descrito en esta invención, tal como HuHPl/2, H1L1, H1L2 o H1L3.

En una realización, la composición que contiene un anticuerpo de unión a a4 se administra como un régimen, tal como a intervalos regulares. Por ejemplo, la composición se puede administrar una vez al día, semanalmente o mensualmente; una vez por semana, dos veces por semana, tres veces por semana, cuatro veces por semana o más; o una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas o más.

En una realización, la dosificación se puede ajustar según la tasa de eliminación del paciente de una administración previa de anticuerpo anti a4. Por ejemplo, en una realización, a un paciente no se le administrará una segunda dosis o dosis de seguimiento antes de que el nivel de anticuerpos anti a4 en el sistema del paciente haya caído por debajo de un nivel predeterminado. En una realización, se analiza una muestra de un paciente (por ejemplo, muestra de plasma, suero, sangre u orina) para determinar la presencia de anticuerpos anti a4, y si el nivel de anticuerpos anti a4 está por encima de un nivel predeterminado, al paciente no se le administrará una segunda dosis o dosis de seguimiento. Si el nivel de anticuerpos anti a4 en el sistema del paciente está por debajo de un nivel predeterminado, entonces se administra al paciente una segunda dosis o una dosis de seguimiento.

En una realización, la composición se administra continuamente, por ejemplo, durante un período de más de 30 minutos pero menor de 1, 2, 4 o 12 horas. La composición que contiene el anticuerpo y el segundo agente pueden administrarse por cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa.

En algunas realizaciones, cada uno del anticuerpo y el segundo agente se administra en la misma dosis que se prescribe para la monoterapia. En otras realizaciones, el anticuerpo se administra en una dosis que es igual o inferior a una cantidad requerida para la eficacia si se administra en solitario. Del mismo modo, el segundo agente puede administrarse en una dosis que sea igual o inferior a una cantidad requerida para la eficacia si se administra solo.

Otro aspecto presentado en la descripción es un procedimiento para evaluar a un paciente determinando si el paciente cumple un criterio preseleccionado, y si el paciente cumple el criterio preseleccionado aprobando, proporcionando, prescribiendo o administrando al paciente una formulación de anticuerpo de unión a VLA-4 descrita en esta invención. En una realización, el criterio preseleccionado es el fracaso del paciente para responder adecuadamente a un tratamiento o régimen terapéutico alternativo anterior, por ejemplo, para el tratamiento de la EM. En otra realización, el criterio preseleccionado es la ausencia de signos o síntomas de leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), o la ausencia de cualquier diagnóstico de LMP. En algunos casos, la selección se basa en la ausencia de un factor de riesgo de LMP, por ejemplo, el sujeto no da positivo en la prueba de ADN del virus JC o no da positivo en la prueba de anticuerpos contra el virus JC. En otra realización, el criterio es como se describe en el documento PCT/US07/75577 (publicado como documento WO2008/021954), que describe procedimientos y sistemas para la distribución de fármacos y para proporcionar fármacos a los pacientes.

En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para distribuir una composición descrita en esta invención. La composición contiene un anticuerpo de unión a alfa-4. El procedimiento incluye proporcionar a un receptor (por ejemplo, un usuario final, paciente, médico, farmacia minorista o mayorista, distribuidor o departamento de farmacia en un hospital, clínica de rehabilitación o HMO) un paquete que contenga dosis unitarias suficientes del fármaco para tratar a un paciente durante al menos 6, 12, 24, 36 o 48 meses. En otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento para evaluar la calidad de un paquete o lote de paquetes (por ejemplo, para determinar si ha caducado) de una composición descrita en esta invención que contiene un anticuerpo de unión a alfa-4. El procedimiento incluye evaluar si el paquete ha caducado. La fecha de vencimiento es de al menos 6, 12, 24, 36 o 48 meses, por ejemplo, más de 24 o 36 meses, a partir de un evento preseleccionado, tal como la fabricación, análisis o envasado. En algunas realizaciones, se toma una decisión o paso como resultado del análisis. Por ejemplo, dependiendo del análisis correcto, el anticuerpo en el paquete se utiliza, se desecha, se clasifica, se selecciona, se libera o se conserva, se envía, se mueve a una nueva ubicación, se comercializa, se vende, o se ofrece para la venta, se retira del mercado o ya no se ofrece para la venta, dependiendo de si el producto ha caducado.

En otro aspecto, la descripción presenta un paquete que contiene al menos dos dosis unitarias de una composición acuosa que contiene un anticuerpo de unión a a4. En una realización, todas las dosis unitarias contienen la misma cantidad de anticuerpo, y en otras realizaciones, hay dosis unitarias de dos o más potencias, o dos o más formulaciones diferentes, por ejemplo, que tienen diferentes potencias o propiedades de liberación.

En otro aspecto, la descripción incluye un procedimiento para instruir a un receptor sobre la administración de una formulación que contiene el anticuerpo de unión a a4. El procedimiento incluye indicar al receptor (por ejemplo, un usuario final, paciente, médico, farmacia minorista o mayorista, distribuidor o departamento de farmacia en un hospital, clínica de rehabilitación o HMO) que el anticuerpo debe administrarse a un paciente según un régimen descrito en esta invención. El procedimiento también puede incluir indicar al receptor que el anticuerpo debe administrarse antes de la fecha de vencimiento. La fecha de vencimiento es de al menos 6, 12, 24, 36 o 48 meses, por ejemplo, más de 24 o 36 meses, a partir de un evento preseleccionado, tal como la fabricación, análisis o envasado. En una realización, el receptor también recibe un suministro del anticuerpo, por ejemplo, un suministro de dosis unitarias del anticuerpo.

En otro aspecto, la descripción presenta un procedimiento para elaborar un anticuerpo que incluye CDR de un anticuerpo donante, tal como un anticuerpo no humano, por ejemplo, un anticuerpo murino, y una o ambas regiones marco de la región variable de cadena pesada y ligera obtenidas de la región o regiones marco de la región variable de línea germinal humana. El procedimiento incluye uno o ambos de 1 y 2, donde 1 y 2 son los siguientes:

1. identificar o seleccionar una región marco variable de cadena pesada aceptora humana estable que tenga los mismos residuos que la cadena pesada donante no humana en uno o más de los residuos en uno o más de a), b) y c):

a) Kabat N.° 2, 4, 24, 26, 27, 29, 36, 38, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 69, 71, 78, 93 y 94 de VII, que, sin quedar ligando a la teoría, se cree que son importantes para mantener conformaciones de CDR;

b) Kabat N.° 1, 2, 27, 28, 30, 43. 66, 68, 70, 72, 73, 74 y 75 de VH que, sin quedar ligando a la teoría, se cree que pueden interactuar con el antígeno; y

c) Kabat N.° 37, 39, 44, 45, 47, 91, 93 y 103 de VH, que, sin quedar ligando a la teoría, se cree que son importantes para la integridad de la interfaz VH/VL; y

2. identificar o seleccionar una región marco variable de cadena ligera aceptora estable que tenga los mismos residuos que la cadena ligera donante en uno o más de los residuos en uno o más de a), b) y c):

a) Kabat N.° 2, 4, 38, 43, 44, 48, 58, 64, 71 y 73 de VL, que, sin quedar ligando a la teoría, se cree que son importantes para mantener conformaciones de CDR;

b) Kabat N.° 1, 2, 49, 57, 60, 63, 65, 66, 67, 68, 69 y 70 de VL que, sin quedar ligando a la teoría, se cree que pueden interactuar potencialmente con el antígeno; y

c) Kabat N.° 36, 38, 43, 44, 46, 49, 87 y 98 de VL, que, sin quedar ligando a la teoría, se cree que son importantes para la integridad de la interfaz VH/VL;

3. proporcionar una región variable que tenga CDR donantes y la región marco de línea germinal seleccionada que tenga residuos emparejados identificados en 1 o 2, tal como seleccionando una secuencia de línea germinal y retromutando adicionalmente más residuos identificados en 1 o 2 de la línea germinal con respecto a la secuencia murina para maximizar adicionalmente el emparejamiento en los residuos identificados en 1 y 2; y

4. evaluar cada posición emparejada, por ejemplo mediante análisis estructural tridimensional o modelado, y si una posición cumple con un estándar predeterminado de riesgo de, por ejemplo, interferir con conformaciones de CDR, interacciones de antígenos o integridad de la interfaz VH/VL, reintroducir a continuación un residuo murino equivalente, o un residuo de anticuerpo humano común, compatible con la estructura del anticuerpo.

En una realización, se emparejan al menos 3, 4 o 5 de los residuos identificados en (1.a). Por ejemplo, en una realización, se emparejan los residuos 24, 29 o 94.

En una realización, se emparejan al menos 3, 4 o 5 de los residuos identificados en (1.b). Por ejemplo, en una realización, se emparejan los residuos 1, 73 o 75.

En una realización, se emparejan al menos 3, 4 o 5 de los residuos identificados en (1.c). Por ejemplo, en una realización, se emparejan los residuos 37, 93 o 103.

En una realización, se emparejan al menos 3, 4 o 5 de los residuos identificados en (2.a). Por ejemplo, en una realización, se emparejan los residuos 2, 71 y 73.

En una realización, se emparejan al menos 3, 4 o 5 de los residuos identificados en (2.b). Por ejemplo, en una realización, se emparejan los residuos 1, 68 o 70.

En una realización, se emparejan al menos 3, 4 o 5 de los residuos identificados en (2.c). Por ejemplo, en una realización, se emparejan los residuos 46, 87 o 98.

En una realización, se emparejan el residuo 6 en (1.a), el residuo 2 en (1.b) y el residuo 4 en (1.c).

En otra realización, se emparejan el residuo 4 en (2.a), el residuo 2 en (2.b) y el residuo 4 en (2.c).

En una realización, la secuencia de línea germinal de cadena pesada es de la clase de línea germinal VH3, VH1 y VH5. En otra realización, la secuencia de línea germinal de cadena ligera es una secuencia Vkappa o Vlambda.

El término "tratar" se refiere a administrar una terapia en una cantidad, manera y/o modo eficaz para mejorar una afección, síntoma o parámetro asociado con un trastorno o para prevenir la progresión de un trastorno, ya sea a un grado estadísticamente significativo o en un grado detectable para un experto en la técnica. Una cantidad, manera o modo eficaz puede variar dependiendo del sujeto y puede adaptarse al sujeto.

Un "anticuerpo de unión a a4" se refiere a un anticuerpo que se une a la subunidad a4 de la integrina VLA-4 (a4p1), e inhibe, al menos parcialmente, una actividad de VLA-4, particularmente una actividad de unión de una integrina VLA-4 o una actividad de señalización, por ejemplo, capacidad para transducir una señal mediada por VLA-4. Por ejemplo, un anticuerpo de unión a VLA-4 puede inhibir la unión de VLA-4 a un ligando afín de VLA-4, por ejemplo, una proteína de superficie celular tal como VCAM-1 (molécula de adhesión de células vasculares 1), o a un componente de la matriz extracelular, tal como la fibronectina o la osteopontina. Un anticuerpo de unión a alfa-4 puede unirse tanto a a4p1 como a a4p7. Típicamente, el anticuerpo se une al epítopo B1 de a4. Un anticuerpo que se une a a4 puede unirse a VLA-4 con una Kd de menos de aproximadamente 10'6, 10'7, 10'8, 10'9, 10'r o 10'11 M.

Como se utiliza en esta invención, el término "anticuerpo" se refiere a una proteína que incluye al menos una región variable de inmunoglobulina, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que proporciona un dominio variable de inmunoglobulina o una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una región variable de cadena pesada (II) (abreviada en esta invención como VH), y una región variable de cadena ligera (L) (abreviada en esta invención como VL). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de cadena pesada (H) y dos regiones variables de cadena ligera (L). Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipo kappa o lambda. En una realización, el anticuerpo está glucosilado. Un anticuerpo puede ser funcional para la citotoxicidad dependiente del anticuerpo y/o la citotoxicidad mediada por el complemento, o puede ser no funcional para una o ambas de estas actividades.

Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de complementariedad" ("CDR"), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas "regiones marco" (FR). La extensión de las FR y las CDR se ha definido con precisión (véanse, Kabat, E.A., y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH N.° 91-3242; y Chothia, C. y col. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). En esta invención se utilizan las definiciones de Kabat. Típicamente, cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, Cd R3, FR4.

Un "dominio de inmunoglobulina" se refiere a un dominio del dominio variable o constante de las moléculas de inmunoglobulina. Típicamente, los dominios de inmunoglobulina contienen dos láminas p formadas por aproximadamente siete cadenas p y un enlace disulfuro conservado (véase, por ejemplo, A. F. Williams y A. N. Barclay (1988) Ann. Rev. Immunol. 6:381-405).

Como se utiliza en esta invención, una "secuencia de dominio variable de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de aminoácidos que puede formar la estructura de un dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, la secuencia puede incluir la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos de un dominio variable de origen natural. Por ejemplo, la secuencia puede omitir uno, dos o más aminoácidos del extremo N o C, los aminoácidos internos, puede incluir una o más inserciones o aminoácidos terminales adicionales, o puede incluir otras alteraciones. En una realización, un polipéptido que incluye una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina puede asociarse con otra secuencia de dominio variable de inmunoglobulina para formar una estructura de unión a diana (o "sitio de unión a antígeno"), por ejemplo, una estructura que interactúa con VLA-4.

La cadena VH o VL del anticuerpo puede incluir además la totalidad o parte de una región constante de cadena pesada o ligera, para formar así una cadena de inmunoglobulina pesada o ligera, respectivamente. En una realización, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina. Las cadenas de inmunoglobulina pesadas y ligeras se pueden conectar por enlaces disulfuro. Típicamente, la región constante de cadena pesada incluye tres dominios constantes, CH1, CH2 y CH3. Típicamente, la región constante de cadena ligera incluye un dominio Cl . La región variable de las cadenas pesada y ligera contiene un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Típicamente, las regiones constantes de los anticuerpos median en la unión del anticuerpo a los tejidos o factores del huésped, incluidas diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.

El término "inmunoglobulina" comprende diversas clases amplias de polipéptidos que se pueden distinguir bioquímicamente. Los expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon (y, m, a, 8, £) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, y1-Y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. están bien caracterizadas y se sabe que confieren una especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la técnica en vista de la presente descripción y, por consiguiente, están dentro del alcance de la presente invención. Todas las clases de inmunoglobulinas están claramente dentro del alcance de la presente invención. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (k, A). Cada clase de cadena pesada puede estar unida a una cadena ligera kappa o lambda.

La expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo de longitud completa se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que conservan la capacidad de unirse específicamente a una diana de interés, por ejemplo, VLA-4. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo de longitud completa incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y col., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR) que conserva la funcionalidad. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes independientes, pueden unirse utilizando procedimientos recombinantes a través de un enlazador sintético que les permite elaborarse como una única cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes conocidas como Fv monocatenario (scFv). Véanse, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426; y Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.

En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos anteriormente están pegilados.

En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos son multiespecíficos. En realizaciones adicionales, los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos son monovalentes o biespecíficos.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción que se encuentra más adelante. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

Las referencias a procedimientos de tratamiento deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra las tres variantes de secuencia de la cadena pesada de HP1/2 con respecto a la línea germinal humana pesada IGHV1-f. Las letras minúsculas encima de la secuencia representan inserciones según el esquema de numeración de Kabat.

La figura 2 muestra las cuatro variantes de secuencia de la cadena ligera de HP1/2 con respecto a una secuencia de anticuerpo IGKV4-1 de línea germinal (Diseño L0, L1 y L2) o una secuencia de anticuerpo AAH7033.1 humano genomanipulado en la línea germinal kappa humana (Diseño L3). Las letras minúsculas encima de la secuencia representan inserciones según el esquema de numeración de Kabat.

La figura 3 es un gráfico que representa los resultados de ensayos ELISA.

La figura 4 es un gráfico que representa los resultados de ensayos ELISA.

La figura 5 es la secuencia de aminoácidos de un Fc de IgG4 (dominio bisagra CH2 CH3). La región bisagra se representa en negrita y el dominio CH3 está subrayado. La "S" dentro del recuadro es Ser228. La "N" dentro del círculo es Asn297.

La figura 6 es un gráfico que representa los datos de citometría de flujo de la unión de HuHP1/2 a diversas líneas celulares tumorales. "HP1/2" se refiere a HP1/2 humanizado.

Las figuras 7A-7C son una serie de gráficos que representan la inhibición de la unión de líneas de células de LMA a pocillos revestidos con fibronectina o VCAM1-Ig por el HuHP1/2. La figura 7A representa la inhibición de la unión de células HL60 y KG1 a pocillos revestidos con FN. La figura 7B representa la inhibición de la unión de células KG1 a pocillos revestidos con VCAM1-Ig. La figura 7C representa la inhibición de la unión de células HL60 a pocillos revestidos con FN y VCAM1-Ig cuando se incubaron con 20 pg/ml de HuHP1/2 (barras de color sólido). Las barras de color claro indican el porcentaje de adhesión celular en presencia de un control de isotipo. "HP1/2" se refiere a HP1/2 humanizado.

Las figuras 8A-8C constituyen un panel de gráficos que representan la inhibición de la unión de líneas de células de MM a pocillos revestidos con fibronectina o VCAM1-Ig por el HuHP1/2. La figura 8A representa la inhibición de la unión de células U266 y H929 a pocillos revestidos con FN. La figura 8B representa la inhibición de la unión de células U266 y H929 a pocillos revestidos con VCAM1-Ig. La figura 8C representa la inhibición de la unión de células U266 a pocillos revestidos con FN y VCAM1-Ig cuando se incubaron con 20 pg/ml de HuHP1/2 (barras de color sólido). Las barras de color claro indican el porcentaje de adhesión celular en presencia de un control de isotipo. "HP1/2" se refiere a HP1/2 humanizado.

Las figuras 9A-9C constituyen un panel de gráficos que representan la inhibición de la unión de líneas de células de LLC a pocillos revestidos con fibronectina o VCAMl-Ig por el HuHP1/2. La figura 9A representa la inhibición de la unión de células Mecl y JM1 a pocillos revestidos con Fn . La figura 9B representa la inhibición de la unión de células Mecl y JM1 a pocillos revestidos con VCAM1-Ig. La figura 9C representa la inhibición de la unión de células Mecl a pocillos revestidos con FN y VCAM1-Ig cuando se incubaron con 20 pg/ml de HuHP1/2 (barras de color sólido). Las barras de color claro indican el porcentaje de adhesión celular en presencia de un control de isotipo. "HP1/2" se refiere a HP1/2 humanizado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Se ha demostrado que los anticuerpos contra VLA-4 son útiles en el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, natalizumab (Tysabri®), un anticuerpo anti VLA-4, se utiliza para tratar la esclerosis múltiple recurrente y la enfermedad de Crohn. Sin embargo, para el tratamiento de determinadas afecciones, por ejemplo, afecciones agudas tales como lesión de la médula espinal (LME) o lesión cerebral traumática (LCT), o tratamientos que se administran en un número finito, tal como el tratamiento del cáncer, puede ser ventajoso tratar con un anticuerpo anti VLA-4 que se une con una afinidad diferente a la del natalizumab, por ejemplo, una afinidad mayor. Además, el tratamiento con anticuerpos anti VLA-4 se asocia con un trastorno raro pero a veces mortal, la leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), para la cual una parte del tratamiento requiere la eliminación de anticuerpos del sujeto tratado, por ejemplo, mediante plasmaféresis o inmunoabsorción. Debido a la necesidad de eliminar el anticuerpo, también es deseable equilibrar las ventajas de un anticuerpo que tiene mayor afinidad por VLA-4 con la desventaja de un anticuerpo que se une con tanta fuerza que dificulta la eliminación o crea un riesgo asociado con una tasa de renovación lenta. Dichos anticuerpos también pueden ser útiles para tratar afecciones tales como la esclerosis múltiple en la que puede requerirse un tratamiento menos frecuente o la administración por medios distintos de la infusión puede ser más eficaz. Permitir el tratamiento con dosis más bajas también puede reducir el riesgo de eventos adversos tal como la leucoencefalopatía multifocal progresiva. Por consiguiente, la presente invención proporciona anticuerpos que tienen dichas propiedades deseables.

La invención se basa, al menos en parte, en las características inesperadas de los anticuerpos de unión a a4 humanizados recientemente diseñados que tienen una afinidad de unión por a4 que es 10 veces mayor que la del anticuerpo anti a4 natalizumab.

Se proporcionan anticuerpos de unión a alfa-4, y fragmentos de los mismos, donde las regiones marco de cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) tienen secuencias aceptoras construidas a partir de secuencias de anticuerpos de línea germinal o genomanipuladas en la línea germinal, tales como anticuerpos IGKV4-1 o geAAH70335.1 o IGHV1-f. Las secuencias de CDR se obtienen de anticuerpos de unión anti a4 no humanos tales como el anticuerpo anti VLA-4 HP1/2. Los anticuerpos descritos en esta invención pueden tener un aumento de la afinidad de al menos 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 veces, por ejemplo, en relación con su progenitor murino. En una realización, el aumento de la afinidad es de al menos 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 veces pero es, respectivamente, menor de 25, 20 o 15 veces.

Composiciones farmacéuticas

Se puede formular un agente de unión a a4, tal como un anticuerpo de unión a VLA-4, como una composición farmacéutica. Típicamente, una composición farmacéutica incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en esta invención, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, que son fisiológicamente compatibles.

Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M., y col. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácidos incluyen obtenidas a partir de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición de bases incluyen las obtenidas a partir de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Las composiciones de anticuerpos descritas en esta invención se pueden formular según los procedimientos conocidos en la técnica. La formulación farmacéutica es una técnica ya establecida y se describe adicionalmente en Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel y col., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a Ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); y Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3a ed. (2000) (ISBN: 091733096X).

En una realización, el anticuerpo a4 se puede formular con materiales excipientes, tales como cloruro de sodio, fosfato dibásico de sodio heptahidrato, fosfato monobásico de sodio y polisorbato 80. En otra realización, el anticuerpo a4 se puede formular en un tampón de citrato, por ejemplo, a pH 5, 5,5, 6, 6,5, 7 o 7,5. Aún en otra realización, el anticuerpo a4 se puede formular en una solución que incluye el 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14 o el 15 % de sacarosa. Se puede proporcionar, por ejemplo, en una solución tamponada a una concentración de aproximadamente 20 mg/ml y se puede almacenar a 2-8 °C.

Las composiciones farmacéuticas también pueden estar en una diversidad de formas diferentes. Estas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma puede depender del modo previsto de administración y la aplicación terapéutica. Típicamente, las composiciones para los agentes descritos en esta invención están en forma de soluciones inyectables o infusibles.

Dichas composiciones se pueden administrar por vía parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular). Como se utilizan en esta invención, las expresiones "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, habitualmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, inyección e infusión subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.

Típicamente, las composiciones farmacéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. También se puede probar una composición farmacéutica para asegurar que cumple con los estándares reglamentarios y de la industria para su administración.

La composición puede formularse en forma de solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando un agente descrito en esta invención en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando un agente descrito en esta invención en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación típicos son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo de un agente descrito en esta invención más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Administración

Un anticuerpo de unión a a4 se puede administrar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, mediante una diversidad de procedimientos. Para muchas aplicaciones, la vía de administración es una de: inyección o infusión intravenosa, inyección subcutánea o inyección intramuscular. Un anticuerpo de unión a a4 se puede administrar como una dosis fija, o en una dosis de mg/kg. El anticuerpo se puede administrar por vía intravenosa (IV) o por vía subcutánea (SC). Por ejemplo, el anticuerpo se puede administrar a una dosis unitaria fija de entre aproximadamente 50-600 mg IV, por ejemplo, cada 4 semanas, o entre aproximadamente 50-100 mg SC (por ejemplo, 75 mg), por ejemplo, al menos una vez a la semana (por ejemplo, dos veces por semana). En una realización, el anticuerpo se administra IV a una dosis unitaria fija de 50 mg, 60 mg, 80 mg, 100 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 180 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg o 600 mg o más. La administración de la dosis IV puede ser una o dos o tres veces o más por semana, o una vez cada dos, tres, cuatro o cinco semanas, o con menos frecuencia.

En una realización, el anticuerpo se administra SC a una dosis unitaria fija de 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 100 mg o 120 mg o más. La administración de la dosis SC puede ser una o dos o tres veces o más por semana, o una vez cada dos, tres, cuatro o cinco semanas, o con menos frecuencia.

Un anticuerpo anti a4 también se puede administrar en un bolo a una dosis de entre aproximadamente 1 y 10 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 6,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 1,0 mg/kg. Los intervalos de dosis modificados incluyen una dosis que es inferior a aproximadamente 600 mg/sujeto, aproximadamente 400 mg/sujeto, aproximadamente 300 mg/sujeto, aproximadamente 250 mg/sujeto, aproximadamente 200 mg/sujeto o aproximadamente 150 mg/sujeto, típicamente para administración cada cuatro semanas o una vez al mes. El anticuerpo de unión a a4 se puede administrar, por ejemplo, cada tres a cinco semanas, por ejemplo, cada cuatro semanas, o mensualmente.

La dosificación se puede ajustar según la tasa de eliminación del paciente de una administración previa de anticuerpo anti a4. Por ejemplo, a un paciente puede no administrársele una segunda dosis o dosis de seguimiento antes de que el nivel de anticuerpos anti a4 en el sistema del paciente haya caído por debajo de un nivel predeterminado. En una realización, se analiza una muestra de un paciente (por ejemplo, muestra de plasma, suero, sangre, orina o líquido cefalorraquídeo (LCR)) para determinar la presencia de anticuerpos anti a4, y si el nivel de anticuerpos anti a4 está por encima de un nivel predeterminado, al paciente no se le administrará una segunda dosis o dosis de seguimiento. Si el nivel de anticuerpos anti a4 en el sistema del paciente está por debajo de un nivel predeterminado, entonces se administra al paciente una segunda dosis o una dosis de seguimiento. Un paciente cuyos niveles de anti a4 se determine que son demasiado altos (por encima del nivel predeterminado) puede volver a analizarse después de uno, dos o tres días, o una semana, y si el nivel de anticuerpos anti a4 en las muestras del paciente ha descendido por debajo del nivel predeterminado, se puede administrar al paciente una segunda dosis de anticuerpo o una dosis de seguimiento.

La dosis también se puede elegir para reducir o evitar la producción de anticuerpos contra el anticuerpo de unión a a4, para lograr más de un 40, 50, 70, 75 o un 80 % de saturación de la subunidad a4, para alcanzar menos del 80, 70, 60, 50 o del 40 % de saturación de la subunidad a4, o para prevenir un aumento del nivel de glóbulos blancos circulantes

En determinadas realizaciones, el agente activo puede prepararse con un vehículo que protegerá al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tal como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos procedimientos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o se conocen generalmente. Véanse, por ejemplo, Controlled Drug Delivery (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Segunda Edición, J. Robinson y V. H. L. Lee, eds., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse con un dispositivo médico. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tales como los dispositivos descritos en las Patente de EE.UU. N.° 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Se analizan ejemplos de implantes y módulos ya conocidos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N.° 4.487.603, que describe una microbomba de infusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; la Patente de EE.UU. N.° 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la Patente de EE.UU. N.° 4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicamentos para suministrar medicamentos a una velocidad de infusión precisa; la Patente de EE.UU. N.° 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para el suministro continuo de fármacos; la Patente de EE.UU. N.° 4.439.196, que describe un sistema osmótico de suministro de fármacos que tiene compartimentos de múltiples cámaras; y la Patente de EE.UU. N.° 4.475.196, que describe un sistema osmótico de suministro de fármacos. Por supuesto, también se conocen muchos otros de dichos implantes, sistemas de suministro y módulos.

La presente descripción también presenta un dispositivo para administrar un primer y segundo agentes. El dispositivo puede incluir, por ejemplo, uno o más alojamientos para almacenar preparaciones farmacéuticas, y puede configurarse para suministrar dosis unitarias del primer y segundo agentes. El primer y el segundo agentes se pueden almacenar en el mismo compartimiento o compartimientos independientes. Por ejemplo, el dispositivo puede combinar los agentes antes de la administración. También es posible utilizar diferentes dispositivos para administrar el primer y segundo agentes.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada, tal como una respuesta terapéutica o un efecto terapéutico combinatorio. Generalmente, se puede utilizar cualquier combinación de dosis (ya sea por separado o formuladas conjuntamente) del agente de unión a VLA-4 y el segundo agente para proporcionar a un sujeto ambos agentes en cantidades biodisponibles.

Como se utiliza en esta invención, la forma unitaria de dosificación o "dosis fija" se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido y, opcionalmente, en asociación con el otro agente.

Una composición farmacéutica puede incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente descrito en esta invención. Dichas cantidades eficaces pueden determinarse basándose en el efecto combinatorio del primer y segundo agentes administrados. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente también puede variar según factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del compuesto para provocar una respuesta deseada en el individuo, tal como la mejora de al menos un parámetro del trastorno, por ejemplo, un parámetro de esclerosis múltiple, o la mejora de al menos un síntoma del trastorno, por ejemplo, un síntoma de esclerosis múltiple, tal como atrofia muscular, ataxia y temblores. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición es superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Dispositivos y kits

Las formulaciones que contienen un anticuerpo descrito en esta invención pueden administrarse con un dispositivo médico. El dispositivo puede diseñarse con características tales como portabilidad, almacenamiento a temperatura ambiente y facilidad de uso para que pueda ser utilizado en situaciones de emergencia, tales como por un sujeto no capacitado o por personal de emergencia en el campo, trasladado a instalaciones médicas y otros equipos médicos. El dispositivo puede incluir, por ejemplo, uno o más alojamientos para almacenar preparaciones farmacéuticas que incluyen un anticuerpo de unión a a4, y puede configurarse para administrar una o más dosis unitarias del agente.

Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede administrar con un dispositivo de suministro transcutáneo, tal como una jeringa, incluyendo una jeringa hipodérmica o de múltiples cámaras. Otros dispositivos de suministro adecuados incluyen endoprótesis, catéteres, microagujas y dispositivos implantables de liberación controlada. La composición se puede administrar por vía intravenosa con un equipo estándar de IV, incluyendo, por ejemplo, tubos de IV, con o sin filtros en línea. En determinadas realizaciones, el dispositivo será una jeringa para su uso en administración SC o IM.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tales como los dispositivos descritos en las Patente de EE.UU. N.° 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Se describen ejemplos de implantes y módulos ya conocidos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N.° 4.487.603, que describe una microbomba de infusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; la Patente de EE.UU. N.° 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la Patente de EE.UU. N.° 4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicamentos para suministrar medicamentos a una velocidad de infusión precisa; la Patente de EE.UU. N.° 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para el suministro continuo de fármacos; la Patente de EE.UU. N.° 4.439.196, que describe un sistema osmótico de suministro de fármacos que tiene compartimentos de múltiples cámaras; y la Patente de EE.UU. N.° 4.475.196, que describe un sistema osmótico de suministro de fármacos. La composición terapéutica también puede estar en forma de una formulación de liberación sostenida biodegradable o no biodegradable para administración subcutánea o intramuscular. Los procedimientos para dichas composiciones se conocen en la técnica. La administración continua también se puede lograr utilizando una bomba implantable o externa. La administración también se puede realizar de forma intermitente, tal como mediante inyección diaria única, o continuamente a una dosis baja, tal como en una formulación de liberación sostenida. El dispositivo de suministro puede modificarse para adaptarse de manera óptima a la administración del anticuerpo de unión a a4. Por ejemplo, una jeringa se puede siliconizar en una medida que sea óptima para el almacenamiento y el suministro del anticuerpo. Por supuesto, también se conocen muchos otros de dichos implantes, sistemas de suministro y módulos.

Esta descripción también presenta un dispositivo para administrar un primer y segundo agentes (por ejemplo, un anticuerpo y un segundo agente). El dispositivo puede incluir, por ejemplo, uno o más alojamientos para almacenar preparaciones farmacéuticas, y puede configurarse para suministrar dosis unitarias del primer y segundo agentes. El primer y el segundo agentes se pueden almacenar en el mismo compartimiento o compartimientos independientes. En una realización, el dispositivo combina los agentes antes de la administración. En algunas realizaciones, el primer y segundo agentes se administran mediante diferentes dispositivos.

Se puede proporcionar un anticuerpo de unión a a4 en un kit. En una realización, el kit incluye (a) un recipiente que contiene una composición que incluye una alta concentración de anticuerpo de unión a VLA-4, opcionalmente (b) un recipiente que contiene una composición que incluye un segundo agente y opcionalmente (c) material informativo. El material informativo puede ser descriptivo, instructivo, de marketing u otro material que se refiera a los procedimientos descritos en esta invención y/o el uso de los agentes para el beneficio terapéutico. En una realización, el kit también incluye un segundo agente. Por ejemplo, el kit incluye un primer recipiente que contiene una composición que incluye el anticuerpo de unión a a4 y un segundo recipiente que incluye el segundo agente.

El material informativo de los kits no está limitado en su forma. En una realización, el material informativo puede incluir información sobre la producción del anticuerpo, la concentración, la fecha de vencimiento, la información del lote o del sitio de producción, etc. En una realización, el material informativo se refiere a procedimientos de administración del anticuerpo de unión a a4, por ejemplo, en una dosis, forma farmacéutica o modo de administración adecuados (por ejemplo, una dosis, forma farmacéutica o modo de administración descritos en esta invención), para tratar a un sujeto que tiene un trastorno agudo, tal como una lesión de la médula espinal o una lesión cerebral traumática, o una enfermedad inflamatoria (por ejemplo, EM), o que está en riesgo de experimentar un episodio asociado con una enfermedad inflamatoria. La información se puede proporcionar en una diversidad de formatos, incluyendo texto impreso, material legible por ordenador, grabación de vídeo o grabación de audio, o información que proporciona un enlace o dirección al material sustantivo.

Además del agente, la composición en el kit puede incluir otros ingredientes, tal como un disolvente o tampón, un estabilizante o un conservante. El agente se puede proporcionar en cualquier forma, por ejemplo, en forma líquida, seca o liofilizada, y en forma sustancialmente pura y/o estéril. Cuando los agentes se proporcionan en una solución líquida, típicamente la solución líquida es una solución acuosa. Cuando los agentes se proporcionan en forma seca, la reconstitución generalmente se realiza mediante la adición de un disolvente adecuado. El disolvente, por ejemplo, agua estéril o tampón, se puede proporcionar opcionalmente en el kit.

El kit puede incluir uno o más recipientes para la composición o composiciones que contienen los agentes. En algunas realizaciones, el kit contiene recipientes, divisores o compartimentos separados para la composición y el material informativo. Por ejemplo, la composición puede estar contenida en un frasco, vial o jeringa, y el material informativo puede estar contenido en una funda o paquete de plástico. En otras realizaciones, los elementos separados del kit están dentro de un solo recipiente no dividido. Por ejemplo, la composición está contenida en un frasco, vial o jeringa que tienen adjunta a los mismos material informativo en forma de una etiqueta. En algunas realizaciones, el kit incluye una pluralidad (por ejemplo, un paquete) de recipientes individuales, conteniendo cada uno una o más formas farmacéuticas unitarias (por ejemplo, una forma farmacéutica descrita en esta invención) de los agentes. Los contenedores pueden incluir una dosificación unitaria combinada, por ejemplo, una unidad que incluye tanto el anticuerpo de unión a a4 como el segundo agente, en una relación deseada. Por ejemplo, el kit puede incluir una pluralidad de jeringas, ampollas, paquetes de papel de aluminio, paquetes de ampollas o dispositivos médicos, conteniendo cada uno, por ejemplo, una dosis unitaria de combinación única. Los recipientes de los kits pueden ser herméticos, impermeables (por ejemplo, impermeables a los cambios de humedad o evaporación) y/o herméticos a la luz.

El kit incluye opcionalmente un dispositivo adecuado para administrar la composición, por ejemplo, una jeringa u otro dispositivo de suministro adecuado. El dispositivo se puede proporcionar precargado con uno o ambos agentes o puede estar vacío, pero es adecuado para la carga.

Oncología

Los anticuerpos de unión a a4 y los procedimientos descritos en esta invención se pueden utilizar para tratar el cáncer, incluyendo cánceres sólidos y neoplasias malignas hematológicas. Los cánceres sólidos de ejemplo incluyen sarcomas y carcinomas, tales como los de pulmón, mama, páncreas, colon, próstata, vejiga y cerebro. Las neoplasias malignas hematológicas incluyen cánceres como mieloma múltiple, leucemia y linfoma.

Se proporcionan procedimientos para tratar a un paciente que tiene una neoplasia maligna hematológica con una composición que contiene un anticuerpo de unión a a4, tal como el anticuerpo anti VLA-4 descrito en esta invención. Las neoplasias malignas hematológicas son cánceres de los sistemas inmunitario y de formación de sangre del cuerpo. Los cánceres de este tipo afectan a la sangre, la médula ósea y/o los ganglios linfáticos. Las neoplasias malignas hematológicas incluyen leucemias, tales como leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia promielocítica aguda, eritroleucemia aguda y leucemia de células pilosas (LCP); linfomas, tales como enfermedad de Hodgkin y linfoma no Hodgkin; y mieloma múltiple; macroblobulinemia de Waldenstrom; síndrome mielodisplásico (SMD) (que puede culminar en LMA); una enfermedad mieloproliferativa, tal como policitemia vera (también llamada PV, PCV o policitemia rubra vera (PRV)), trombocitosis esencial (TE), mielofibrosis, enfermedad de cadenas pesadas; y amiloide debido a la enfermedad de cadenas ligeras.

Los pacientes que tienen una neoplasia maligna hematológica pueden identificarse mediante análisis de hemograma y frotis de sangre, por ejemplo, mediante microscopía óptica, que es útil para identificar células neoplásicas. También se puede utilizar una biopsia, tal como la de médula ósea, para identificar células neoplásicas, y una biopsia de un ganglio linfático puede ser útil para identificar una linfadenopatía.

Un anticuerpo de unión a a4 (por ejemplo, un anticuerpo anti VLA-4 humanizado, tal como HuHP1/2, H1L0, H1L1, H1L2 o H1L3) es útil para el tratamiento de una leucemia, tal como LMA. Las leucemias son cánceres que se originan en la médula ósea, donde las células neoplásicas son los glóbulos blancos (leucocitos). La LMA (también llamada leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia granulocítica aguda y leucemia no linfocítica aguda) es una neoplasia maligna que se origina en los granulocitos o los monocitos. La LMA está caracterizada por el crecimiento descontrolado y exagerado y la acumulación de células llamadas blastos leucémicos, que no funcionan como células sanguíneas normales, y el bloqueo de la producción de células normales de la médula ósea, lo que lleva a una deficiencia de glóbulos rojos (anemia) y plaquetas (trombocitopenia) y glóbulos blancos normales (especialmente neutrófilos, es decir, neutropenia) en la sangre.

Todos los subtipos de LMA son adecuados para el tratamiento con un anticuerpo de unión a VLA-4. Los subtipos de LMA se clasifican basándose en la etapa de desarrollo que hayan alcanzado los mieloblastos en el momento del diagnóstico. Las categorías y subconjuntos permiten al médico decidir qué tratamiento funciona mejor para el tipo de célula y con qué rapidez puede desarrollarse la enfermedad. Los subconjuntos son: M0, mieloblástica, en análisis especial; M1, mieloblástica, sin maduración; M2, mieloblástica, con maduración; M3, promielocítica; M4, mielomonocítica; M5, monocítica; M6, eritroleucemia; y M7, megacariocítica. Un anticuerpo VLA-4 se puede administrar con un agente secundario que sea particularmente adecuado para el subtipo de LMA. Por ejemplo, la leucemia promielocítica aguda (LPA) y la leucemia monocítica aguda son subtipos de LMA que necesitan un tratamiento diferente al de otros subtipos de LMA. Un segundo agente para el tratamiento de la LPA puede incluir el ácido todo-trans retinoico (ATRA) o un antimetabolito, tal como citarabina. Un segundo agente para el tratamiento de la leucemia monocítica aguda puede incluir un análogo de desoxiadenosina, tal como 2-cloro-2'-desoxiadenosina (2-CDA).

Los factores de riesgo de la LMA incluyen la presencia de determinados trastornos genéticos, tal como síndrome de Down, anemia de Fanconi, síndrome de Shwachman-Diamond, etc. A un paciente que tiene LMA y un trastorno genético se le puede administrar un anticuerpo de unión a VLA-4 y un segundo agente para tratar un síntoma del trastorno genético. Por ejemplo, a un paciente con LMA y anemia de Fanconi se le puede administrar un anticuerpo de unión a VLA-4 y un antibiótico.

Otros factores de riesgo para la LMA incluyen quimioterapia o radioterapia para el tratamiento de un cáncer diferente, humo de tabaco y exposición a grandes cantidades de benceno.

Otros cánceres adecuados para el tratamiento con un anticuerpo de unión a a4 incluyen tumores sólidos tales como sarcomas y carcinomas (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer de ovario, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistoadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello del útero, cáncer de útero, cáncer testicular, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, schwannoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma).

Otros trastornos

Las formulaciones y los procedimientos descritos en esta invención también se pueden utilizar para tratar otros trastornos inflamatorios, inmunitarios o autoinmunitarios, por ejemplo, inflamación del sistema nervioso central (por ejemplo, además de esclerosis múltiple, meningitis, neuromielitis óptica, neurosarcoidosis, vasculitis del s Nc , encefalitis y mielitis transversa); rechazo de injerto de tejido u órgano o enfermedad de injerto contra huésped; lesión aguda del SNC, por ejemplo, ictus o lesión de la médula espinal (LME); enfermedad renal crónica; alergia, por ejemplo, asma alérgica, rinitis alérgica de moderada a grave, alergia ocular; diabetes mellitus tipo 1; trastornos inflamatorios del intestino, por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa (por ejemplo, para el tratamiento o mantenimiento de la remisión); gastroenteritis eosinófila; miastenia gravis; fibromialgia; trastornos asociados con reumatología/inmunología, tales como trastornos artríticos, por ejemplo, artritis reumatoide, artritis psoriásica; trastornos dermatológicos, tales como trastornos cutáneos inflamatorios/inmunitarios, por ejemplo, psoriasis, vitíligo, dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica), liquen plano, urticaria crónica de moderada a grave; lupus eritematoso sistémico (LES, por ejemplo, nefritis lúpica); esclerodermia (por ejemplo, esclerosis sistémica progresiva (ESP), tal como ESP del pulmón); neumonía eosinófila primaria aguda o crónica; síndrome de Sjogren; síndrome coronario agudo (SCA); infarto agudo del miocardio; aterosclerosis; y trastornos fibróticos, por ejemplo, fibrosis pulmonar (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática), fibrosis pulmonar (por ejemplo, inducida por XRT), mielofibrosis, cirrosis hepática, glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis semilunar, nefropatía diabética y fibrosis intersticial renal.

Las formulaciones y los procedimientos descritos en esta invención también se pueden utilizar para tratar trastornos neurológicos, tales como isquemia cerebral, incluida la prevención en pacientes con ataques isquémicos transitorios y/o estenosis arterial. Otros trastornos neurológicos de ejemplo incluyen polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC); síndrome de Guillian-Barré (SGB); enfermedades oculares, tales como degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular húmeda) y neuropatía óptica anteriorisquémica; dolor neuropático (por ejemplo, dolor neuropático sintomático); enfermedad de Alzheimer; esclerosis lateral amiotrófica (ELA) (por ejemplo, ELA modificadora de la enfermedad) y enfermedad de Parkinson.

Las formulaciones y los procedimientos descritos en esta invención también se pueden utilizar para tratar pacientes que se han sometido a un trasplante, tal como un trasplante renal, de corazón o de médula ósea.

Esclerosis múltiple

Las formulaciones que contienen un anticuerpo de unión a alfa-4 descrito en esta invención son útiles para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como la esclerosis múltiple (EM). La esclerosis múltiple es una enfermedad del sistema nervioso central que se caracteriza por la inflamación y la pérdida de vainas de mielina.

Los pacientes que tienen EM pueden identificarse mediante criterios que establecen un diagnóstico de la EM clínicamente definida según lo definido por el taller sobre el diagnóstico de EM (Poser y col., Ann. Neurol. 13:227, 1983). Por ejemplo, un individuo con EM clínicamente definida ha tenido dos ataques y evidencia clínica de dos lesiones o evidencia clínica de una lesión y evidencia paraclínica de otra lesión separada. La EM definitiva también se puede diagnosticar mediante evidencia de dos ataques y bandas oligoclonales de IgG en el líquido cefalorraquídeo o por combinación de un ataque, evidencia clínica de dos lesiones y banda oligoclonal de IgG en el líquido cefalorraquídeo. Los criterios de McDonald también se pueden utilizar para diagnosticar la EM (McDonald y col., 2001, "Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis", Ann. Neurol. 50:121-127). Los criterios de McDonald incluyen el uso de evidencia de MRI de deterioro del SNC a lo largo del tiempo a utilizar en el diagnóstico de la EM, en ausencia de ataques clínicos múltiples. El tratamiento eficaz de la esclerosis múltiple se puede evaluar de varias maneras diferentes. Los siguientes parámetros se pueden utilizar para medir la eficacia del tratamiento. Dos criterios de ejemplo incluyen: EDSS (escala de estado de discapacidad extendida) y aparición de exacerbaciones en MRI (resonancia magnética). La EDSS es un procedimiento para calificar el deterioro clínico debido a la EM (Kurtzke, Neurology 33:1444, 1983). Se evalúan ocho sistemas funcionales según el tipo y la gravedad del deterioro neurológico. Brevemente, antes del tratamiento, se evalúa a los pacientes para detectar deterioro en los siguientes sistemas: piramidal, cerebelo, tronco cerebral, sensorial, intestinal y vesical, visual, cerebral y otros. Los seguimientos se realizan a intervalos definidos. La escala varía de 0 (normal) a 10 (muerte por EM). Una disminución de una etapa completa indica un tratamiento eficaz (Kurtzke, Ann. Neurol. 36:573-79, 1994). Los pacientes también pueden ser diagnosticados utilizando otros criterios utilizados por los expertos en la técnica.

Las exacerbaciones se definen como la aparición de un nuevo síntoma que se puede atribuir a la EM y que se acompaña de una nueva anomalía neurológica apropiada (grupo de estudio de la EM con IFNB, anteriormente). Además, la exacerbación debe durar al menos 24 horas y debe ir precedida de estabilidad o mejora durante al menos 30 días. Brevemente, los médicos realizan un examen neurológico estándar en los pacientes. Las exacerbaciones son leves, moderadas o graves según los cambios en una Escala de Clasificación Neurológica (Sipe y col., Neurology 34:1368, 1984). Se determina una tasa de exacerbación anual y una proporción de pacientes sin exacerbaciones.

La terapia puede considerarse eficaz si existe una diferencia estadísticamente significativa en la tasa o proporción de pacientes sin exacerbaciones o sin recaídas entre el grupo tratado y el grupo de placebo para cualquiera de estas mediciones. Además, también se puede medir el tiempo hasta la primera exacerbación y la duración y la gravedad de la exacerbación. Una medida de la eficacia como terapia en este sentido es una diferencia estadísticamente significativa en el tiempo hasta la primera exacerbación o la duración y la gravedad en el grupo tratado en comparación con el grupo control. Un periodo sin exacerbaciones o sin recaídas de más de un año, 18 meses o 20 meses es particularmente notable. La eficacia también se puede evaluar utilizando cualquier procedimiento utilizado en la técnica, por ejemplo, para evaluar los síntomas de la EM, incluida la mejora de la movilidad mediante una prueba de caminata cronometrada utilizada sola o en combinación con otros criterios.

La eficacia de administrar un primer agente y, opcionalmente, un segundo agente, también se puede evaluar en función de uno o más de los siguientes criterios: frecuencia de linfocitos T reactivos a MBP determinada por dilución limitante, respuesta de proliferación de líneas de linfocitos T reactivos a MBP y clones, perfiles de citocinas de líneas de linfocitos T y clones a MBP establecidos de pacientes. La eficacia está indicada por la disminución en la frecuencia de las células reactivas, una reducción en la incorporación de timidina con un péptido alterado en comparación con el nativo, y una reducción en el TNF e IFN-a.

Las mediciones clínicas incluyen la tasa de recaída en intervalos de uno y dos años, y un cambio en la EDSS, incluido el tiempo hasta la progresión desde el valor inicial de 1,0 unidades en la EDSS que persiste durante seis meses. En una curva de Kaplan-Meier, una demora en la progresión sostenida de la discapacidad muestra la eficacia. Otros criterios incluyen un cambio en el área y el volumen de las imágenes T2 en la MRI, y el número y el volumen de las lesiones determinadas por las imágenes potenciadas con gadolinio.

Se puede utilizar MRI para medir lesiones activas utilizando imágenes mejoradas con gadolinio-DTPA (McDonald y col. Ann. Neurol. 36:14, 1994) o la ubicación y extensión de las lesiones utilizando técnicas ponderadas en T2. Brevemente, se obtienen MRI iniciales. Se utilizan el mismo plano de imagen y la posición del paciente para cada estudio posterior. Se pueden elegir las secuencias de posicionamiento e imagen para maximizar la detección de lesiones y facilitar el seguimiento de las lesiones. Se pueden utilizar las mismas secuencias de posicionamiento e imagen en estudios posteriores. La presencia, la ubicación y la extensión de las lesiones de la EM se pueden determinar por los radiólogos. Las áreas de las lesiones se pueden delinear y sumar corte por corte para determinar el área total de la lesión. Se pueden hacer tres análisis: evidencia de nuevas lesiones, tasa de aparición de lesiones activas, porcentaje de cambio en el área de la lesión (Paty y col., Neurology 43:665, 1993). La mejora debida a la terapia se puede establecer mediante una mejora estadísticamente significativa en un paciente individual en comparación con el valor inicial o en un grupo tratado frente a un grupo de placebo.

Los síntomas de ejemplo asociados con la esclerosis múltiple, que pueden tratarse con los procedimientos descritos en esta invención, incluyen: neuritis óptica, diplopía, nistagmo, dismetría ocular, oftalmoplejía internuclear, fosfenos de movimiento y sonido, defecto de pupila aferente, paresia, monoparesia, paraparesia, hemiparesia, cuadriparesia, plegia, paraplejia, hemiplejia, tetraplejia, cuadriplegia, espasticidad, disartria, atrofia muscular, espasmos, calambres, hipotonía, clono, mioclono, mioquimia, síndrome de las piernas inquietas, pie caído, reflejos disfuncionales, parestesia, anestesia, neuralgia, dolor neuropático y neurogénico, l'hermitte, disfunción propioceptiva, neuralgia del trigémino, ataxia, temblor de intención, dismetria, ataxia vestibular, vértigo, ataxia del habla, distonía, disdiadococinesia, micciones frecuentes, espasticidad vesical, vejiga flácida, disinergia detrusor-esfínter, disfunción eréctil, anorgasmia, frigidez, estreñimiento, urgencia fecal, incontinencia fecal, depresión, disfunción cognitiva, demencia, cambios de humor, labilidad emocional, euforia, síndrome bipolar, ansiedad, afasia, disfasia, fatiga, síntomas de uhthoff, reflujo gastroesofágico y trastornos del sueño.

Cada caso de EM muestra uno de varios patrones de presentación y curso posterior. Más comúnmente, la EM se manifiesta en primer lugar como una serie de ataques seguidos por remisiones completas o parciales a medida que los síntomas disminuyen misteriosamente, y a continuación regresan después de un periodo de estabilidad. Esto se denomina EM recurrente-remitente (RR). La EM primaria-progresiva (PP) se caracteriza por un declive clínico gradual sin remisiones distintas, aunque puede haber mesetas temporales o un alivio menor de los síntomas. La EM secundaria-progresiva (SP) comienza con un curso de recaídas-remisiones seguido de un curso posterior progresivo primario. En raras ocasiones, los pacientes pueden tener un curso de recaída progresiva (PR) en el que la enfermedad toma un camino progresivo con ataques agudos puntuales. PP, SP y PR a veces se agrupan y se denominan EM progresiva crónica.

Algunos pacientes experimentan EM maligna, definida como un declive rápido e implacable que da como resultado una discapacidad significativa o incluso la muerte poco después del inicio de la enfermedad. Esta disminución puede detenerse o desacelerarse mediante la administración de una terapia de combinación descrita en esta invención.

La administración de un anticuerpo anti a4 presentado en esta invención puede ser eficaz para aliviar uno o más síntomas de la EM, tales como uno o más de los síntomas descritos anteriormente. Por ejemplo, la administración de un anticuerpo anti a4 descrito en esta invención se puede utilizar para tratar la esclerosis múltiple primaria o secundaria progresiva (EMPP o EMSP, respectivamente), y el tratamiento con un anticuerpo anti a4 puede ser eficaz para prevenir la recaída.

Además de o antes de los estudios en seres humanos, se puede utilizar un modelo animal para evaluar la eficacia del uso de los dos agentes. Un modelo animal de ejemplo para la esclerosis múltiple es el modelo de ratón de encefalitis autoinmune experimental (EAE), por ejemplo, como se describe en (Tuohy y col. (J. Immunol. (1988) 141: 1126-1130), Sobel y col. (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401), y Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129). A los ratones se les puede administrar un primer y segundo agente descritos en esta invención antes de la inducción de EAE. A continuación, se evalúa a los ratones con criterios característicos para determinar la eficacia del uso de los dos agentes en el modelo.

Generación de anticuerpos

Los anticuerpos recombinantes que se unen a alfa-4 pueden generarse mediante procedimientos in vivo o in vitro tales como la presentación en fagos. Los procedimientos se pueden utilizar para suministrar CDR anti a4 para su uso en los anticuerpos injertados con CDR descritos en esta invención. Además, se pueden utilizar procedimientos tales como la presentación en fagos para seleccionar dichas CDR en el contexto de las regiones marco de línea germinal descritas en esta invención, tal como mediante el uso de una biblioteca donde la región marco es una región marco de línea germinal.

El documento EP 239 400 (Winter y col.) describe la alteración de anticuerpos mediante sustitución (dentro de una región variable determinada) de sus regiones determinantes de complementariedad (CDR) para una especie con los de otra. Es menos probable que los anticuerpos sustituidos por c Dr provoquen una respuesta inmunitaria en los seres humanos en comparación con los anticuerpos quiméricos verdaderos porque los anticuerpos sustituidos por CDR contienen una cantidad considerablemente menor de componentes no humanos (Riechmann y col., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen y col., 1988, Science 239, 1534-1536). Típicamente, las CDR de un anticuerpo murino son sustituidas en las regiones correspondientes en un anticuerpo humano utilizando tecnología de ácido nucleico recombinante para producir secuencias que codifican el anticuerpo sustituido deseado. Se pueden añadir segmentos de genes de la región constante humana del isotipo deseado (habitualmente gamma I para CH y kappa para CL) y los genes de cadena pesada y ligera pueden expresarse conjuntamente en células de mamífero para producir un anticuerpo soluble. También se pueden utilizar grandes bibliotecas de expresión de fagos no inmunizados para aislar anticuerpos de alta afinidad que se pueden desarrollar como productos terapéuticos humanos utilizando tecnología de fagos estándar (véase, por ejemplo, Hoogenboom y col. (1998) Immunotechnology 4:1-20; y Hoogenboom y col. (2000) Immunol Today 2:371-8; documento U.S. 2003-0232333).

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti a4 descrito en esta invención puede reconocer epítopos de la subunidad a4 que están implicados en la unión a un ligando afín, por ejemplo, VCAM-1 o fibronectina. Los anticuerpos descritos en esta invención pueden inhibir la unión a uno o más de los ligandos afines (por ejemplo, VCAM-1 y fibronectina).

En algunas realizaciones, los anticuerpos presentados en esta invención pueden interactuar con VLA-4 en las células, por ejemplo, linfocitos, pero no provocan agregación celular.

Un anticuerpo de unión a a4 de ejemplo tiene una o más CDR, por ejemplo, las tres CDR de cadena pesada (HC) y/o las tres CDR de cadena ligera (LC) de un anticuerpo particular descrito en esta invención, o CDR que son, en suma, al menos un 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % idénticas a tal anticuerpo. En una realización, los bucles hipervariables H1 y H2 tienen la misma estructura canónica que los de un anticuerpo descrito en esta invención. En una realización, los bucles hipervariables L1 y L2 tienen la misma estructura canónica que los de un anticuerpo descrito en esta invención.

En una realización, la secuencia de aminoácidos de la secuencia de dominio variable HC y/o LC es al menos un 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio variable HC y/o LC de un anticuerpo descrito en esta invención. La secuencia de aminoácidos de la secuencia de dominio variable HC y/o LC puede diferir en al menos un aminoácido, pero no más de diez, ocho, seis, cinco, cuatro, tres o dos aminoácidos de la secuencia correspondiente de un anticuerpo descrito en esta invención. Por ejemplo, las diferencias pueden estar principal o totalmente en las regiones de marco.

Las secuencias de aminoácidos de las secuencias de dominio variable HC y LC se pueden codificar por una secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones de alta astringencia con una secuencia de ácido nucleico descrita en esta invención o una que codifica un dominio variable o una secuencia de aminoácidos descrita en esta invención. En una realización, las secuencias de aminoácidos de una o más regiones marco (por ejemplo, FR1, FR2, FR3 y/o FR4) del dominio variable HC y/o LC son al menos un 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 o un 100 % idénticas a las regiones de marco correspondientes de los dominios variables HC y LC de un anticuerpo descrito en esta invención. En una realización, una o más regiones de marco de cadena pesada o ligera (por ejemplo, FR1, FR2 y FR3 de HC) son al menos un 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o un 100 % idénticas a la secuencia de regiones de marco correspondientes de un anticuerpo de línea germinal humana.

Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" entre dos secuencias (las expresiones se utilizan indistintamente en esta invención) se realizan de la siguiente manera. Las secuencias se alinean para fines comparativos óptimos (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para la alineación óptima y las secuencias no homólogas pueden ignorarse para fines comparativos). La alineación óptima se determina como la mejor puntuación utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG con una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización de extensión de hueco de 4 y una penalización de hueco de desplazamiento de marco de 5. A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se utiliza en esta invención, "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias va en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias.

Como se utiliza en esta invención, la expresión "se hibrida bajo condiciones de alta astringencia" describe condiciones para hibridación y lavado. Puede encontrarse orientación para la realización de las reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Se describen y se pueden utilizar procedimientos acuosos y no acuosos en esa referencia. Las condiciones de hibridación de alta astringencia incluyen hibridación en 6 x SSC a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % a 65 °C o condiciones sustancialmente similares.

Producción de Anticuerpos

Los anticuerpos se pueden producir en células procariotas y eucariotas. En una realización, los anticuerpos (por ejemplo, scFv) se expresan en una célula de levadura tal como Pichia (véase, por ejemplo, Powers y col. (2001) J. Immunol. Methods 251:123-35), Hanseuda, o Saccharomyces.

En una realización, los anticuerpos, particularmente anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, IgG, se producen en células de mamífero. Las células huésped de mamífero de ejemplo para expresión recombinante incluyen ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), líneas celulares linfocíticas, por ejemplo, células de mieloma NS0 y células SP2, células COS, K562, y una célula de un animal transgénico, por ejemplo, un mamífero transgénico. Por ejemplo, la célula es una célula epitelial mamaria.

Además de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el dominio de inmunoglobulina, los vectores de expresión recombinantes pueden portar secuencias de ácidos nucleicos adicionales tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Los genes marcadores seleccionables de ejemplo incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células huésped dhfr con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418).

En un sistema de ejemplo para la expresión recombinante de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa o una porción de unión a antígeno del mismo), un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo se introduce en células CHO dhfr- mediante transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo están cada uno enlazados operativamente a elementos reguladores de potenciador/promotor (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares tales como un elemento regulador de potenciador de CMV/promotor de AdMLP o un elemento regulador de potenciador de SV40/promotor de AdMLP) para impulsar altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector utilizando la selección/amplificación con metotrexato. Las células huésped transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Se utilizan técnicas de biología molecular estándares para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar los transformantes, cultivar las células huésped, y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Por ejemplo, algunos anticuerpos se pueden aislar mediante cromatografía de afinidad con una proteína A o una proteína G. Por ejemplo, los anticuerpos de unión a a4 purificados se pueden concentrar hasta aproximadamente 100 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml utilizando técnicas de concentración de proteínas que se conocen en la técnica.

Los anticuerpos también pueden incluir modificaciones, por ejemplo, modificaciones que alteran la función de Fc, por ejemplo, para disminuir o eliminar la interacción con un receptor de Fc o con C1q, o ambos. Por ejemplo, la región constante de IgG4 humana puede tener una mutación Ser a Pro en el residuo 228 para fijar la región bisagra. La secuencia de aminoácidos de un Fc de IgG4 (dominio bisagra CH2 CH3) se proporciona en la figura 5.

En otro ejemplo, la región constante de IgG1 humana se puede mutar en uno o más residuos, por ejemplo, uno o más de los residuos 234 y 237, por ejemplo, según la numeración en la Patente de EE.UU. N.° 5.648.260. Otras modificaciones de ejemplo incluyen las descritas en la Patente de EE.UU. N.° 5.648.260.

Para algunos anticuerpos que incluyen un dominio Fc, el sistema de producción de anticuerpos puede diseñarse para sintetizar anticuerpos en los que la región Fc está glucosilada. En otro ejemplo, el dominio Fc de las moléculas de IgG está glucosilado en la asparagina 297 en el dominio CH2 (véase la figura 5). Esta asparagina es el sitio para la modificación con oligosacáridos de tipo biantenario. Esta glucosilación participa en funciones efectoras mediadas por receptores Fcy y complemento C1q (Burton y Woof (1992) Adv. Immunol. 51:1-84; Jefferis y col. (1998) Immunol. Rev.

163:59-76). El dominio Fc puede producirse en un sistema de expresión de mamífero que glucosila adecuadamente el residuo correspondiente a la asparagina 297. El dominio Fc también puede incluir otras modificaciones postraduccionales eucariotas.

Otras modificaciones adecuadas del dominio Fc incluyen las descritas en el documento WO2004/029207. Por ejemplo, el dominio Fc puede ser un XmAb® Fc (Xencor, Monrovia, CA). El dominio Fc, o un fragmento del mismo, puede tener una sustitución en una región de unión al receptor Fcy (FcyR), tal como los dominios y fragmentos descritos en el documento WO05/063815. En algunas realizaciones, el dominio Fc, o un fragmento del mismo, tiene una sustitución en una región de unión al receptor Fc neonatal (FcRn), tal como los dominios y fragmentos descritos en el documento WO05047327. En otras realizaciones, el dominio Fc es una cadena sencilla, o un fragmento de la misma, o una versión modificada del mismo, tal como los descritos en el documento WO2008143954. Se conocen y se describen en la técnica otras modificaciones de Fc adecuadas.

Los anticuerpos también pueden ser producidos por un animal transgénico. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 5.849.992 describe un procedimiento para expresar un anticuerpo en la glándula mamaria de un mamífero transgénico. Se construye un transgén que incluye un promotor específico de la leche y secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo de interés, por ejemplo, un anticuerpo descrito en esta invención y una secuencia señal para la secreción. La leche producida por las hembras de dichos mamíferos transgénicos incluye, secretado en su interior, el anticuerpo de interés, por ejemplo, un anticuerpo descrito en esta invención. El anticuerpo puede ser purificado de la leche, o para algunas aplicaciones, se puede utilizar directamente.

Los anticuerpos pueden modificarse, por ejemplo, con un resto que mejora su estabilización y/o retención en circulación, por ejemplo, en sangre, suero, linfa, lavado broncoalveolar u otros tejidos, por ejemplo, en al menos 1,5, 2, 5, 10 o 50 veces.

Por ejemplo, un anticuerpo de unión a VLA-4 puede estar asociado con un polímero, por ejemplo, un polímero sustancialmente no antigénico, tal como un óxido de polialquileno o un óxido de polietileno. Los polímeros adecuados variarán sustancialmente en peso. Se pueden utilizar polímeros que tengan un peso molecular promedio en número que varíe de aproximadamente 200 a aproximadamente 35.000 daltons (o de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000, y de 2.000 a aproximadamente 12.500).

Por ejemplo, un anticuerpo de unión a VLA-4 puede conjugarse con un polímero soluble en agua, por ejemplo, un polímero de polivinilo hidrófilo, por ejemplo, alcohol polivinílico o polivinilpirrolidona. Una lista no limitante de dichos polímeros incluye homopolímeros de óxido de polialquileno tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque. Los polímeros útiles adicionales incluyen polioxialquilenos tales como polioxietileno, polioxipropileno y copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o no ramificados que comprenden los monómeros de sacárido D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por ejemplo, ácido polimanurónico o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico, incluidos homopolisacáridos y heteropolisacáridos tales como lactosa, amilopectina, almidón, hidroxietil almidón, amilosa, dextrano sulfato, dextrano, dextrinas, glucógeno, o la subunidad polisacárida de los mucopolisacáridos de ácido, por ejemplo, ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar tales como polisorbitol y polmannitol; heparina o heparon.

Segundos agentes de ejemplo

En algunos casos, las formulaciones descritas en esta invención, por ejemplo, formulaciones que contienen un anticuerpo de unión a alfa-4, incluyen un segundo agente o se administran en combinación con una formulación que contiene un segundo agente.

En una implementación, el anticuerpo de unión a a4 y el segundo agente se proporcionan como una formulación conjunta, y la formulación conjunta se administra al sujeto. Además es posible, por ejemplo, al menos 24 horas antes o después de administrar la formulación conjunta, administrar por separado una dosis de la formulación de anticuerpo de unión a a4 y a continuación una dosis de una formulación que contenga el segundo agente. En otra implementación, el anticuerpo y el segundo agente se proporcionan como formulaciones separadas, y la etapa de administración incluye la administración secuencial del anticuerpo y el segundo agente. Las administraciones secuenciales se pueden proporcionar el mismo día (por ejemplo, en una hora entre sí o con al menos 3, 6 o 12 horas de diferencia) o en días diferentes.

Generalmente, el anticuerpo y el segundo agente se administran cada uno como una pluralidad de dosis separadas en el tiempo. El anticuerpo y el segundo agente generalmente se administran cada uno según un régimen. El régimen para uno o ambos puede tener una periodicidad regular. El régimen para el anticuerpo puede tener una periodicidad diferente del régimen para el segundo agente, por ejemplo, uno puede administrarse con más frecuencia que el otro. En una implementación, uno del anticuerpo y el segundo agente se administra una vez a la semana y el otro una vez al mes. En otra implementación, uno del anticuerpo y el segundo agente se administra continuamente, por ejemplo, durante un periodo de más de 30 minutos, pero menos de 1, 2, 4 o 12 horas, y el otro se administra como un bolo. El anticuerpo y el segundo agente pueden administrarse por cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa.

Los ejemplos no limitantes de segundos agentes para tratar la esclerosis múltiple en combinación con un anticuerpo de unión a a4 incluyen:

■ interferones, por ejemplo, interferón beta-la humano (por ejemplo, AVONEX® o Rebif®) e interferón betalb (BETASERON™; interferón beta humano sustituido en la posición 17; Berlex/Chiron);

■ acetato de glatiramer (también denominado Copolímero 1, Cop-1; COPAXONE™; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.);

■ Rituxan® (rituximab) u otro anticuerpo anti CD20, por ejemplo, uno que compita o se una a un epítopo superpuesto con rituximab;

■ mixtoxantrona (NOVANTRONE®, Lederle);

■ un quimioterapéutico, por ejemplo, clabribina (LEUSTATIN®), azatioprina (IMURAN®), ciclofosfamida (CYTOXAN®), ciclosporina-A, metotrexato, 4-aminopiridina y tizanidina;

■ un corticosteroide, por ejemplo, metilprednisolona (MEDRONE®, Pfizer), prednisona;

■ una inmunoglobulina, por ejemplo, Rituxan® (rituximab); CTLA4 Ig; alemtuzumab (MabCAMPATH®) o daclizumab (un anticuerpo que se une a CD25);

■ estatinas; y

■ antagonistas del TNF.

El acetato de glatiramer es una proteína formada por una cadena aleatoria de aminoácidos: ácido glutámico, lisina, alanina y tirosina (por lo tanto, GLATiramer). Se puede sintetizar acetato de glatiramer en solución a partir de estos aminoácidos una relación de aproximadamente 5 partes de alanina con respecto a 3 partes de lisina, 1,5 partes de ácido glutámico y 1 parte de tirosina utilizando anhídridos de N-carboxiaminoácido.

Los segundos agentes adicionales incluyen anticuerpos o antagonistas de otras citocinas humanas o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF y PDGF. Aún otros segundos agentes de ejemplo incluyen anticuerpos contra moléculas de superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Por ejemplo, daclizubmab es un anticuerpo anti CD25 que puede mejorar la esclerosis múltiple.

Aún otros anticuerpos de ejemplo incluyen anticuerpos que proporcionan una actividad de un agente descrito en esta invención, tal como un anticuerpo que se acopla a un receptor de interferón, por ejemplo, un receptor de interferón beta. Típicamente, en implementaciones en las que el segundo agente incluye un anticuerpo, se une a una proteína diana distinta de VLA-4 o distinta de la integrina a4, o al menos un epítopo en VLA-4 distinto del reconocido por el primer agente.

Aún otros agentes secundarios de ejemplo adicionales incluyen: FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), por ejemplo, inhibidores de la fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización de las citocinas proinflamatorias como se describe en esta invención, inhibidores de la enzima convertidora de IL-1p (por ejemplo, Vx740), anti P7, PSGL, inhibidores de TACE, inhibidores de señalización de linfocitos T tales como inhibidores de cinasa, inhibidores de la metaloproteinasa, sulfasalazina, azatloprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores de citocinas solubles y derivados de los mismos, como se describe en esta invención, citocinas antiinflamatorias por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGF).

En algunas realizaciones, puede utilizarse un segundo agente para tratar uno o más síntomas o efectos secundarios de la EM. Dichos agentes incluyen, por ejemplo, amantadina, baclofeno, papaverina, meclizina, hidroxizina, sulfametoxazol, ciprofloxacino, docusato, pemolina, dantroleno, desmopresina, dexametasona, tolterodina, fenitoína, oxibutinina, bisacodilo, venlafaxina, amitriptilina, metenamina, clonazepam, isoniazida, vardenafilo, nitrofurantoína, mucilo hidrófilo de psilio, alprostadil, gabapentina, nortriptilina, paroxetina, bromuro de propantelina, modafinilo, fluoxetina, fenazopiridina, metilprednisolona, carbamazepina, imipramina, diazepam, sildenafilo, bupropión y sertralina. Muchos segundos agentes que son moléculas pequeñas tienen un peso molecular entre 150 y 5000 Daltons.

Los ejemplos de antagonistas de TNF incluyen anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o generados in vitro (o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) contra TNF (por ejemplo, TNF a humano), tal como D2E7, (anticuerpo TNFa humano, Patente de EE.UU. N.° 6.258.562; BASF), CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (anticuerpo anti TNFa humanizado; Celltech/Pharmacia), cA2 (anticuerpo anti TNFa quimérico; REMICADE™, Centocor); fragmentos de anticuerpos anti TNF (por ejemplo, CPD870); fragmentos solubles de los receptores del TNF, por ejemplo, receptores del TNF humano p55 o p75 o derivados de los mismos, por ejemplo, 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de IgG del receptor TNF de 75 kD, En BREL™; Immunex; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A), p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de IgG del receptor del TNF de 55 kD (LENERCEPT™)); antagonistas enzimáticos, por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de TNFa (TACE) (por ejemplo, un derivado de ácido alfa-sulfonil hidroxámico, documento WO 01/55112, e inhibidor TACE de N-hidroxiformamida GW 3333, -005 o -022); y TNF-bp/s-TNFR (proteína de unión a TNF soluble; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.° 9 (suplemento), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, págs. 37-42).

Además de un segundo agente, también es posible suministrar otros agentes al sujeto. Sin embargo, en algunas realizaciones, no se administra al sujeto como una composición farmacéutica ninguna proteína o ningún agente biológico, aparte del anticuerpo de unión a a4 y el segundo agente. El anticuerpo de unión a a4 y el segundo agente pueden ser los únicos agentes que se suministran mediante inyección. En realizaciones en las que el segundo agente es una proteína recombinante, el anticuerpo de unión a a4 y el segundo agente pueden ser los únicos agentes recombinantes administrados al sujeto, o al menos los únicos agentes recombinantes que modulan las respuestas inmunitarias o inflamatorias. Aún en otras realizaciones, el anticuerpo de unión a a4 en solitario es el único agente recombinante o el único agente biológico administrado al sujeto.

A menos que se indique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en esta invención tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta invención en la práctica o ensayo de la invención, a continuación se describen procedimientos y materiales adecuados.

Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

EJEMPLO

Ejemplo 1. Los anticuerpos anti VLA 4 variantes son más potentes que HP1/2 humanizado.

Se construyeron anticuerpos anti VLA-4 utilizando la región marco de línea germinal IGKV4-1 (o el diseño L1 y L2) o AAH7033.1 genomanipulado en la línea germinal (para el diseño L3) para la cadena VL y la región marco de línea germinal IGHV1-f para VH. Estos anticuerpos tenían menos retromutaciones que el anticuerpo HP1/2 humanizado descrito en la Patente de EE.UU. N.° 6.602.503.

Variaciones de cadena pesada

Las secuencias de tres variaciones de la cadena pesada se muestran en la figura 1 como Diseño H0, Diseño H1 y Diseño H2. Cada diseño tiene las CDR de HP1/2 murino injertadas en la región marco IGHV1-f. El Diseño H0 no incluye retromutaciones de las regiones marco, mientras que los Diseños H1 y H2 tienen diversos grados de retromutaciones en las secuencias de las regiones marco para optimizar la afinidad del anticuerpo humanizado.

Variaciones de cadena ligera

Las secuencias de cuatro variaciones de la cadena ligera se muestran en la figura 2 como Diseño L0, Diseño L1, Diseño L2 y Diseño L3 (también llamados L0, L1, L2, L3). Cada diseño tiene las CDR de HP1/2 murino injertadas en la región marco de línea germinal. La región marco de línea germinal IGKV4-1 se utilizó para los Diseños L0, L1 y L2, y la región marco genomanipulada en la línea germinal AAH70335 se utilizó para el Diseño L3. El Diseño L0 no incluye retromutaciones de las regiones marco, mientras que los Diseños l 1, L2 y L3 tienen diversos grados de retromutaciones en las regiones marco para optimizar la afinidad del anticuerpo humanizado.

Los resultados de los ensayos ELISA de competición se muestran en la tabla 1 y la figura 3. En este experimento, se preincubó a4p1 con mAb de prueba y a continuación se utilizó HP1/2 murino como reactivo competitivo. Los resultados de este experimento indicaron que los anticuerpos que tenían cadenas ligeras L2 o L3 eran más potentes que el anticuerpo humanizado MuIIP1/2 descrito en la Patente de EE.UU. N.° 6.602.503. Los resultados se muestran en la tabla 1 a continuación, y en la figura 3. La cadena pesada (H1) en los anticuerpos para este ensayo tenía la secuencia "Diseño H1" que se muestra en la figura 1, mientras que L1 se refiere al Diseño L1 en la figura 2.

Tabla 1. Ensayo de competición por ELI A

En la tabla 1, el mAb quimérico es un anticuerpo HP1/2 quimerizado, donde las cadenas pesada y ligera variables murinas se fusionan genéticamente con regiones constantes de IgG1 humana. Este anticuerpo es esencialmente idéntico en afinidad de unión al anticuerpo IIP1/2 murino original (Sanchez-Madrid y col., Eur. J. Immunol. 16:1343-1349, 1996). Los resultados del experimento indican que es posible mejorar la afinidad del anticuerpo monoclonal en relación con su secuencia parental murina a través de la humanización en la región marco aceptora genomanipulada en la línea germinal.

Otro ensayo competitivo compara la afinidad de unión de los nuevos anticuerpos con el anticuerpo anti a4 21.6 humanizado (Tysabri® (natalizumab)) descrito en el documento U.S. 5.840.299. En este experimento se ensayó la unión de la mezcla de HP1/2 de ratón con mAb de prueba a a4p1. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 4 y en la tabla 2 a continuación, e indican que los anticuerpos recién diseñados son aproximadamente 10 veces más potentes que natalizumab.

Tabla 2. Ensayo de competición por ELISA

Ejemplo 2. El HP1/2 humanizado (HuHP1/2) se une a VLA-4 en líneas celulares tumorales.

Se ensayó la unión del anticuerpo anti VLA-4 HuHP1/2 a una diversidad de líneas celulares mediante citometría de flujo. La unión se ensayó en las líneas de células de LLC (leucemia linfocítica crónica) Mecl y JM1; en las líneas de células de MM (mieloma múltiple) U266 y H929; y en las líneas de células de LMA (leucemia mielógena aguda) HL60 y KG1. HuHP1/2 se unió a todas las líneas celulares tumorales ensayadas (figura 6). Los datos de citometría de flujo se utilizaron para calcular los valores de CE50 para la unión de anticuerpos a cada una de las diferentes líneas celulares. Esta información se muestra a continuación en la tabla 3.

También se encontró que HuHP1/2 bloquea la adhesión de las líneas de células de LMA a la fibronectina (FN) y la proteína de fusión VCAM1-Ig. Para probar si el anticuerpo podía bloquear la adhesión, se permitió que las líneas de células de LMA HL60 o KG1 se adhirieran a pocillos revestidos con FN (figura 7A) o pocillos revestidos con VCAM1-Ig (figura 7B) en presencia de concentraciones crecientes de HP1/2 o anticuerpo de control de isotipo. HuHP1/2 bloqueó la adhesión de ambos tipos de células a los pocillos revestidos con FN y a los pocillos revestidos con VCAM1-Ig. La inhibición máxima de la unión de células HL60 a ambos ligandos se logró con 20 pg/ml de HuHP1/2 (figura 7C).

También se encontró que HuHP1/2 bloquea la adhesión de las líneas de células de MM a la proteína de fusión FN y VCAM1-Ig. Se permitió que las líneas de células de MM U266 y H929 se adhirieran a pocillos revestidos con FN (figura 8A) o pocillos revestidos con VCAM1-Ig (figura 8B) en presencia de concentraciones crecientes de HP1/2 o anticuerpo de control de isotipo. HuHPl/2 bloqueó la adhesión de ambos tipos de líneas celulares a pocillos revestidos con FN y VCAM1-Ig. La inhibición máxima de la unión de células U266 a ambos ligandos se logró con 20 pg/ml de HuHPl/2 (figura 8C).

También se encontró que HuHP1/2 bloquea la adhesión de las líneas de células de LLC a la proteína de fusión FN y VCAM1-Ig. Se permitió que las líneas de células de LLC Mecl y JM1 se adhirieran a pocillos revestidos con FN (figura 9A) o pocillos revestidos con VCAM1-Ig (figura 9B) en presencia de concentraciones crecientes de HP1/2 o anticuerpo de control de isotipo. HuHPl/2 bloqueó la adhesión de ambos tipos de líneas celulares a pocillos revestidos con FN y VCAM1-Ig. La inhibición máxima de la unión de células Mecl a ambos ligandos se logró con 20 pg/ml de HuHP1/2 (figura 9C).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de anticuerpo recombinante, o un fragmento de unión a a4 de la misma, que comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, donde:

2. La molécula de anticuerpo anti a4 recombinante, o fragmento de unión a a4 de la misma, de la reivindicación 1, donde la cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

3. Un vector que comprende ADN que codifica la cadena pesada variable como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y la cadena ligera variable como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Un procedimiento para elaborar una molécula de anticuerpo anti a4 recombinante, o un fragmento de unión a a4 de la misma, que comprende

(a) proporcionar una célula huésped que comprende una secuencia de ADN que codifica la molécula de anticuerpo recombinante, o un fragmento de unión a a4 de la misma, como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, y

5. La molécula de anticuerpo anti a4 recombinante, o fragmento de unión a a4 de la misma, como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su uso como medicamento en el tratamiento de un paciente.

6. La molécula de anticuerpo anti a4 recombinante, o fragmento de unión a a4 de la misma, para su uso según la reivindicación 5, donde el paciente tiene un trastorno inflamatorio.

7. La molécula de anticuerpo anti a4 recombinante, o fragmento de unión a a4 de la misma, para su uso según la reivindicación 5, donde el paciente tiene esclerosis múltiple, asma, artritis reumatoide, diabetes, neuritis óptica o enfermedad de Crohn.

8. La molécula de anticuerpo anti a4 recombinante, o fragmento de unión a a4 de la misma, para su uso según la reivindicación 5, donde el paciente tiene un trastorno agudo, una lesión de la médula espinal o una lesión cerebral traumática.

9. La molécula de anticuerpo anti a4 recombinante, o fragmento de unión a a4 de la misma, para su uso según la reivindicación 5, donde el tratamiento comprende además administrar al paciente un segundo agente terapéutico.

10. La molécula de anticuerpo anti a4 recombinante, o fragmento de unión a a4 de la misma, para su uso según la reivindicación 9, donde el segundo agente terapéutico es un agente trombolítico, un agente quimioterapéutico, un agente neuroprotector, un agente antiinflamatorio, un esteroide, una citocina o un factor de crecimiento.