PT2558499T

PT2558499T - Anticorpos anti-vla-4

Info

Publication number: PT2558499T
Application number: PT117301200T
Authority: PT
Inventors: A Lugovskoy Alexey; r taylor Frederick; Mclachlan Karen
Original assignee: Biogen Ma Inc
Priority date: 2010-04-16
Filing date: 2011-04-15
Publication date: 2017-07-14
Also published as: EP4032912A1; ES2633105T3; EP2558499B1; US11083791B2; ES2805873T3; BR112012026403A8; DK3466977T3; WO2011130603A3; CY1122978T1; PT3202789T; SG10202112020VA; BR112012026403B1; MX340683B; EA201291065A1; SI3202789T1; CA2794863C; JP2020019811A; JP2018123165A; US10335485B2; EP3466977A1

Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS ANTI-VLA-4"

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório dos EUA N° 61/324944, apresentado em 16 de abril de 2010.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a anticorpos de ligação a alfa-4 e seus fragmentos de ligação a alfa-4.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os anticorpos humanizados podem ser utilizados como agentes terapêuticos em vez dos anticorpos murinos para evitar a resposta imunitária indesejável em humanos denominada a resposta HAMA (Anticorpo Anti-Murganho Humano). Os anticorpos humanizados são geralmente construídos substituindo as regiões determinantes de complementaridade (CDR) de um anticorpo humano com as CDR de outra espécie, tipicamente um anticorpo de murganho. VLA-4 (também denominado α4β1) é um elemento da família de integrinas βΐ de recetores da superfície celular. VLA-4 contém uma cadeia a4 e uma cadeia βΐ e está envolvido em interações célula-célula. A sua expressão está principalmente restrita a células linfoides e mieloides. VLA-4 liga-se ao ligando de célula endotelial VCAM-1 (Molécula de Adesão Celular Vascular 1), e pode mediar a ligação de linfócitos T e B ao fragmento de ligação da heparina II da fibronectina plasmática humana. 0 documento W02006096653 divulga um anticorpo anti-VLA-4 denominado HPl/2 e as suas variantes humanizadas, utilizando uma estrutura aceitadora da região variável da cadeia pesada de IGHVl-f.

SUMARIO DA INVENÇÃO A matéria da invenção é definida pelas reivindicações. A requerente verificou que podem ser utilizadas estruturas de região variável de linha germinativa para otimizar anticorpos de ligação a alfa-4 enxertados com CDR, tal como anticorpos anti-VLA-4. Por conseguinte, a invenção apresenta cadeias pesadas variáveis (VH) e leves variáveis (VL) de anti-VLA-4 e moléculas de anticorpo incluindo tais estruturas.

Num aspeto, a divulgação apresenta uma cadeia VH do anticorpo anti-a4 possuindo CDR de um anticorpo anti-a4 dador, e. g., um anticorpo anti-a4 aqui descrito, e uma estrutura de VH possuindo as regiões 1, 2, 3 e 4 da sequência de, ou possuindo não mais do que 5, 10 ou 15 diferenças relativamente a uma sequência da região variável para a cadeia VH. Numa forma de realização, a região estrutural variável 4 (FR4) é uma sequência consenso humana. Numa forma de realização, as regiões estruturais de cadeia VH completa FRl, FR2, FR3 e FR4, estão presentes.

Noutra forma de realização, a cadeia é um fragmento de ligação a antigénio de uma região VH.

Numa forma de realização, a sequência de linha germinativa é IGHVl-f humana (SEQ ID N°: 2), representada na FIG. 1. Em determinadas formas de realização, a sequência estrutural VH pode diferir em, pelo menos, um, mas em não mais do que 2, 3, 4, 5, 10 ou 15 resíduos de aminoácido relativamente a uma sequência de linha germinativa, e. g. , SEQ ID N°: 2. Numa forma de realização, a estrutura VH inclui ainda outros além dos resíduos humanos correspondentes. Por exemplo, a cadeia VH inclui resíduos não humanos, numa ou mais das posições estruturais 24, 67, 76, 80, e 94 (numeração de Rabat) da SEQ ID N°: 2.

Numa forma de realização, pelo menos, uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDR) dos domínios variáveis são derivadas de um anticorpo de ligação a a4 não humano dador. Numa forma de realização, as regiões de ligação a antigénio do domínio variável da cadeia pesada enxertado com CDR incluem as CDR correspondendo às posições 26-34 (CDRl), 50-65 (CDR2) e 95-102 (CDR3) (numeração de Rabat; Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., vol. 4, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, EUA).

Assim, numa forma de realização, a estrutura da cadeia pesada variável (VH) possui uma sequência aceitadora derivada da sequência de linha germinativa de anticorpo humano IGHVl-f.

Noutra forma de realização, pelo menos, um aminoácido, e menos do que 2, 3, 4, 5 ou 10 resíduos de aminoácidos, na região FRl da VH é diferente do resíduo da linha germinativa humana correspondente. Um ou mais de tais resíduos podem, por exemplo, ser idênticos à região estrutural do anticorpo não humano a partir da qual as sequências CDR são derivadas. Numa forma de realização, o resíduo de aminoácido na posição 24 de Rabat é mutado para ser idêntico à região estrutural do anticorpo não humano.

Noutra forma de realização, pelo menos, um aminoácido, e menos do que 2, 3, 4 5, ou 10 resíduos de aminoácidos, na região FR2 da VH é diferente do resíduo da linha germinativa correspondente. Um ou mais de tais resíduos podem, por exemplo, ser idênticos à região estrutural do anticorpo não humano a partir da qual as sequências CDR são derivadas.

Ainda noutra forma de realização, pelo menos, um aminoácido, e menos do que 2, 3, 4, 5, ou 10 resíduos de aminoácidos, na FR3 da cadeia VH é diferente do resíduo da linha germinativa correspondente. Um ou mais de tais resíduos podem, por exemplo, ser idênticos à região estrutural do anticorpo não humano a partir da qual as sequências CDR são derivadas. Numa forma de realização, o resíduo de aminoácido na posição 94 de Rabat é idêntico à região estrutural do anticorpo não humano. Ainda noutra forma de realização, os resíduos de aminoácidos nas posições 67, 76, 80, e 94 de Rabat são idênticos à região estrutural do anticorpo não humano.

Em determinadas formas de realização, a cadeia VH do anticorpo possui a sequência da SEQ ID N° : 3, SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 5 .

Num aspeto, a divulgação apresenta uma cadeia VL anti-VLA-4 possuindo CDR de um anticorpo anti-VLA-4 dador, e. g., um anticorpo anti-VLA-4 aqui descrito, e uma estrutura VL possuindo as regiões 1, 2, 3 e 4 da sequência de, ou possuindo não mais do que 5, 10 ou 15 diferenças (por/região ou no total) relativamente a uma sequência da região variável de linha germinativa para a cadeia VL. Numa forma de realização, a região estrutural variável 4 (FR4) é uma sequência consenso humana. Numa forma de realização, as regiões estruturais da cadeia VL completas FRl, FR2, FR3 e FR4, estão presente. Noutra forma de realização, a cadeia é um fragmento de ligação a antigénio de uma região VL.

Noutra forma de realização, a sequência de linha germinativa é IGKV4-1 (SEQ ID N° : 7), representada na FIG. 2. Ainda noutras formas de realização, a sequência estrutural VL pode diferir em, pelo menos, um, mas não mais do que 2, 3, 4, 5, 10 ou 15 resíduos de aminoácidos relativamente a uma sequência estrutural da linha germinativa, e. g., SEQ ID N°: 7. Noutra forma de realização, a VL inclui ainda outros, além dos resíduos de aminoácidos humanos correspondentes. Por exemplo, a cadeia VL inclui ainda resíduos não humanos numa ou mais das posições estruturais 1, 73, e 87 (numeração de Rabat) da SEQ ID N°: 7.

Numa forma de realização, a sequência é AAH7035.1 (SEQ ID N°: 12) ou a sua versão manipulada com a linha germinativa (SEQ ID N°: 13), representada na FIG. 2. Em algumas formas de realização, a sequência estrutural VL pode diferir em, pelo menos, um, mas não mais do que 5, 10, 15, 20 ou 25 resíduos de aminoácidos relativamente a uma sequência estrutural manipulada com a linha germinativa, e. g. , SEQ ID N° : 13. Numa forma de realização, a cadeia VL inclui outros além dos resíduos humanos correspondentes. Por exemplo, a cadeia VL inclui resíduos não humanos numa ou mais das posições estruturais 1 e 87 (numeração de Rabat) da SEQ ID N° : 12. Noutra forma de realização, a VL inclui substituições de aminoácidos nas regiões estruturais para se assemelharem a uma sequência estrutural de linha germinativa humana diferente, tal como relativamente à sequência da linha germinativa IGKV4-1. Em determinadas formas de realização, a sequência estrutural VL é alterada para ser idêntica à sequência de linha germinativa IGKV4-1 nas posições 1-3, 5-23, 35-37, 39-42, 45-49, 57, 59-61, 63-64, 70-72, 74-84, 86-88, 99-106 (numeração de Rabat) da SEQ ID N°: 12.

Numa forma de realização, pelo menos, uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDR) dos domínios variáveis são derivadas de um anticorpo de ligação a a4 não humano dador. Noutra forma de realização, as regiões de ligação a antigénio do domino variável da cadeia pesada enxertado com CDR incluem as CDR correspondentes às posições 24-31 (CDRl), 50-56 (CDR2) e 89-97 (CDR3) (numeração de Rabat) . Assim, numa forma de realização, a estrutura de VL possui uma sequência aceitadora construída a partir da sequência de linha germinativa IGRV4-1, a partir do anticorpo AAH70335.1 ou a partir do anticorpo manipulado com linha germinativa AAH70335.1.

Ainda noutra forma de realização, pelo menos, um aminoácido e menos do que 2, 3, 4, 5, 10 ou 15 resíduos, em FRl da cadeia VL é diferente do resíduo humano correspondente. Um ou mais de tais resíduos pode, por exemplo, ser idêntico à região estrutural do anticorpo não humano a partir da qual as sequências das CDR são derivadas. Numa forma de realização, o resíduo de aminoácido na posição N-terminal de FRl é mutado para ser idêntico à região estrutural do anticorpo não humano.

Noutra forma de realização, pelo menos, um aminoácido, e menos do que 2, 3, 4, 5, 10 ou 15 resíduos, em FR2 da cadeia VL é diferente do resíduo humano correspondente. Um ou mais de tais resíduos pode, por exemplo, ser idêntico à região estrutural do anticorpo não humano a partir da qual as sequências CDR são derivadas.

Ainda noutra forma de realização, pelo menos, um aminoácido, e menos do que 2, 3, 4, 5, 10 ou 15 resíduos, na FR3 da VL é diferente do resíduo humano correspondente. Um ou mais de tais resíduos pode, por exemplo, ser idêntico à região estrutural do anticorpo não humano a partir da qual as sequências CDR são derivadas. Noutra forma de realização, o resíduo de aminoácido na posição 87 de Rabat é mutado para ser idêntico à região estrutural do anticorpo não humano. Ainda noutra forma de realização, os resíduos de aminoácidos nas posições 67 e 87 de Rabat são mutadas para serem idênticas à região estrutural do anticorpo não humano. Ainda noutra forma de realização, os resíduos de aminoácidos nas posições 67, 73, e 87 de Rabat da SEQ ID N°: 7 são mutadas para serem idênticas à região estrutural do anticorpo não humano.

Noutras formas de realização, a cadeia VL do anticorpo possui a sequência da SEQ ID N° : 8, SEQ ID N° : 9, SEQ ID N° : 10 ou SEQ ID N°: 11.

Numa forma de realização, as CDR das sequências estruturais aceitadoras VH e VL são selecionadas para se assemelharem às sequências das CDR de um anticorpo não humano (e. g., murino) , onde o anticorpo não humano se liga à integrina alfa-4 ou a um seu fragmento. Noutra forma de realização, as sequências das CDR são selecionadas para se assemelharem às sequências das CDR de um anticorpo não humano que se liga ao epítopo Bl da cadeia a4 de VLA-4. Numa forma de realização, as CDR são selecionadas para se assemelharem a um anticorpo monoclonal murino, e. g. , HPl/2, HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, ou 21.6 (Pulido et al., J. Biol. Chem. 266:10241-10245, 1991; Patente U.S. N° 6033665). Modificação pode significar, e. g., excisão e inserção ou alteração, e. g., por mutagénese dirigida.

Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio, incluindo: uma cadeia VL de anti-VLA-4 aqui descrita, e. g., uma cadeia VL de anti-VLA-4 possuindo CDR de um anticorpo anti-VLA-4 dador, e. g., um anticorpo anti-VLA-4 aqui descrito, e uma estrutura VL possuindo as regiões estruturais LC 1, 2 e 3 da sequência de, ou possuindo não mais do que 5, 10 ou 15 diferenças relativamente a uma sequência da região variável de linha germinativa para a cadeia VL. Numa forma de realização, a região variável 4 é uma sequência consenso humana; e uma cadeia VH anti-VLA-4 aqui descrita, e. g., uma cadeia VL de anti-VLA-4 possuindo CDR de um anticorpo anti-VLA-4 dador, e. g., um anticorpo anti-VLA-4 aqui descrito, e uma estrutura VL possuindo as regiões estruturais LC 1, 2 e 3 da sequência de, ou possuindo não mais do que 5, 10 ou 15 diferenças relativamente a uma sequência da região variável de linha germinativa para a cadeia VL. Numa forma de realização, a região variável 4 é uma sequência consenso humana.

Numa forma de realização, o anticorpo liga-se a um ou ambos de α4β1 e α4β7.

Noutro aspeto, uma cadeia VL ou VH, ou anticorpo, ou seu fragmento, aqui descrita, é marcada de modo detetável.

Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta um vetor contendo ADN que codifica uma cadeia pesada do anticorpo, ou um seu fragmento de ligação a a4, aqui descrito. Em algumas formas de realização, o ADN do vetor codifica uma VH possuindo a sequência da SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 5.

Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta um vetor contendo ADN que codifica uma cadeia leve do anticorpo, ou um seu fragmento de ligação a a4, aqui descrito. Em algumas formas de realização, o ADN do vetor codifica uma cadeia VL possuindo a sequência da SEQ ID N° : 8, SEQ ID N° : 9, SEQ ID N° : 10 ou SEQ ID N°: 11.

Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta um vetor contendo ADN que codifica uma cadeia pesada do anticorpo, ou um seu fragmento de ligação a a4, aqui descrito e uma cadeia leve do anticorpo, ou um seu fragmento de ligação a a4, aqui descrito.

Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta uma célula hospedeira contendo um vetor aqui descrito, e. g., um capaz de expressar um anticorpo de cadeia pesada e/ou leve ou seu fragmento de anticorpo aqui descrito.

Num aspeto, a divulgação apresenta um método de preparação de um anticorpo anti-a4 recombinante, ou um seu fragmento de ligação a a4, proporcionando uma célula hospedeira transfectada com (a) uma sequência de ADN que codifica uma cadeia pesada do anticorpo aqui descrito ou um seu fragmento de ligação a a4, e (b) uma sequência de ADN que codifica uma cadeia leve do anticorpo ou um seu fragmento de ligação a a4, e cultivando a célula transfectada para produzir a molécula de anticorpo anti-a4 recombinante ou seu fragmento de ligação a α4. O ADN que codifica as cadeias pesada e leve do anticorpo pode ser produzido no mesmo vetor ou em diferentes vetores.

Num aspeto, a divulgação apresenta um método de preparação de um anticorpo anti-a4 recombinante, ou um seu fragmento de ligação a a4, proporcionando uma célula hospedeira transfectada com (a) uma sequência de ADN que codifica uma cadeia pesada do anticorpo, ou um seu fragmento de ligação a a4, e. g., onde a sequência de ADN possui a sequência da SEQ ID N° :3, 4 ou 5, e (b) uma sequência de ADN que codifica uma cadeia leve do anticorpo, ou um seu fragmento de ligação a a4, e. g., em que a sequência de ADN possui a sequência da SEQ ID N° : 8, 9, 10 ou 11, e cultivando a linha celular transfectada para produzir a molécula de anticorpo anti-a4 recombinante ou seu fragmento de ligação a a4 . O ADN que codifica as cadeias pesada e leve do anticorpo pode ser produzido no mesmo vetor ou em diferentes vetores.

Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método de tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por uma integrina a4, e. g. , uma integrina α4β1 (VLA-4) ou α4β7, administrando um anticorpo de a4 ou fragmento de anticorpo aqui descrito, ou uma composição farmacêutica contendo o anticorpo ou fragmento, a um indivíduo com necessidade de tal tratamento. O indivíduo pode ter ou estar em risco de desenvolver, por exemplo, distúrbios inflamatórios, imunes ou autoimunes (e. g., inflamação do sistema nervoso central, tais como esclerose múltipla, meningite, neuromielite ótica, neurossarcoidose, vasculite do SNC, encefalite e mielite transversa), rejeição de enxertos de tecido ou órgãos ou doença enxerto-versus-hospedeiro, lesão do SNC aguda, tais como acidente vascular cerebral, lesão cerebral traumática (TBI) ou lesão da medula espinal (SCI); doença renal crónica; alergia, e. g., asma alérgica; diabetes mellitus tipo 1; distúrbios inflamatórios intestinais, tais como doença de Crohn, colite ulcerosa; miastenia grave; fibromialgia; distúrbios artríticos, tais como artrite reumatoide, artrite psoriática; distúrbios inflamatórios/imunes da pele, tais como psoríase, vitiligo, dermatite, líquen plano; lúpus eritematoso sistémico; Síndroma de Sjogren; cancros hematológicos, tais como mieloma múltiplo, leucemia, linfoma; cancros sólidos, tais como sarcomas ou carcinomas, e. g., da pulmão, mama, próstata, cérebro; e distúrbios fibróticos, tais como fibrose pulmonar, mielofibrose, cirrose hepática, glomerulonefrite proliferativa mesangial, glomerulonefrite crescente, nefropatia diabética e fibrose intersticial renal.

Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método de tratamento de um doente administrando ao doente um anticorpo de ligação a a4 ou fragmento de anticorpo. Numa forma de realização, o doente tem um cancro, tais como um tumor sólido ou uma malignidade hematológica. Por exemplo, um doente tratado com um anticorpo de ligação a a4 ou fragmento de anticorpo pode ter leucemia mieloide aguda (AML) ou mieloma múltiplo (MM).

Noutra forma de realização, o doente possui um distúrbio inflamatório, tais como esclerose múltipla, asma (e. g., asma moderada a grave), artrite reumatoide, diabetes, ou doença de Crohn. Noutra forma de realização, a composição é administrada como um regime. Ainda noutra forma de realização, o método inclui ainda selecionar um doente adequado para tratamento com a composição. Um doente adequado para o tratamento, por exemplo, demonstrou um sinal ou sintoma indicativo do início da doença, tais como um sinal ou sintoma indicativo de ME.

Ainda noutra forma de realização, o método inclui ainda administrar ao doente um segundo agente terapêutico, tal como um agente quimioterapêutico, um agente trombolitico, um agente neuroprotetor, um agente anti-inflamatório, um esteroide, uma citocina ou um fator de crescimento.

Numa forma de realização, é administrado ao doente um anticorpo anti-VLA-4 humanizado, ou seu fragmento, aqui descrito, tais como HuHPl/2, HlLl, H1L2 ou H1L3.

Numa forma de realização, a composição contendo um anticorpo de ligação a a4 é administrada como um regime, tal como em intervalos regulares. Por exemplo, a composição pode ser administrada uma vez por dia, semana ou mês; uma vez por semana, duas vezes por semana, três vezes por semana, quatro vezes por semana ou mais; ou uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas ou mais.

Numa forma de realização, a dosagem pode ser ajustada de acordo com a taxa de eliminação de um doente de uma administração anterior do anticorpo anti-a4. Por exemplo, numa forma de realização, não será administrada a um doente uma segunda dose ou dose de seguimento antes do nivel de anticorpos anti-a4 no sistema do doente ter diminuído para abaixo de um nível predeterminado. Numa forma de realização, uma amostra de um doente (e. g., amostra de plasma, soro, sangue ou urina) é ensaiada para a presença de anticorpos anti-a4 e, se o nível de anticorpos anti-a4 estiver acima de um nível predeterminado, não será administrada ao doente uma segunda dose ou dose de seguimento. Se o nível de anticorpos anti-a4 no sistema do doente sistema estiver abaixo de um nível predeterminado, então é administrada ao doente uma segunda dose ou dose de seguimento.

Numa forma de realização, a composição é administrada continuamente, e. g. , durante um período de mais do que 30 minutos mas menos do que 1, 2, 4 ou 12 horas. A composição contendo o anticorpo e o segundo agente pode ser administrada por qualquer método apropriado, e. g., subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente.

Em algumas formas de realização, cada do anticorpo e do segundo agente é administrado na mesma dose que cada é prescrito para monoterapia. Noutras formas de realização, o anticorpo é administrado numa dosagem que é igual ou inferior a uma quantidade necessária para eficácia se administrado por si só. Do mesmo modo, o segundo agente pode ser administrado numa dosagem que é igual ou inferior a uma quantidade necessária para eficácia se administrado por si só.

Outro aspeto apresentado na divulgação é um método de avaliação de um doente através da determinação se o doente cumpre o critério pré-selecionado, e se o doente cumpre o critério pré-selecionado, proporcionando, prescrevendo ou administrando uma formulação de anticorpo de ligação a VLA-4 aqui descrito ao doente. Numa forma de realização, o critério pré-selecionado é a falha do doente a responder de modo adequado a um tratamento ou regime terapêutico alternativo anterior, e. g., para tratamento de EM. Noutra forma de realização, o critério pré-selecionado é a ausência de quaisquer sinais ou sintomas de Leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), ou a ausência de qualquer diagnóstico de PML. Em alguns casos, a seleção é baseada na ausência de um fator de risco para LMP, por exemplo, o indivíduo não testa positivo para o ADN do vírus JC ou não testa positivo para anticorpos do vírus JC. Noutra forma de realização, o critério é como descrito no documento PCT/US07/75577 (publicado como W02008/021954), o qual descreve métodos e sistemas para a distribuição de fármacos e para proporcionar fármacos a doentes.

Noutro aspeto, é proporcionado um método de distribuição de uma composição aqui descrita. A composição contém um anticorpo de ligação a alfa-4. O método inclui proporcionar um recetor (e. g., um utilizador final, doente, médico, farmácia de vendas normais ou a retalho, distribuidor ou departamento farmacêutico num hospital, clínica de lar de idosos ou HMO) com uma embalagem contendo dosagens unitárias suficientes do fármaco para tratar um doente durante, pelo menos, 6, 12, 24, 36 ou 48 meses. Noutro aspeto, a invenção apresenta um método de avaliação da qualidade de uma embalagem ou lote de embalagens (e. g., para determinar se esta expirou) de uma composição aqui descrita contendo um anticorpo de ligação a alfa-4. O método inclui avaliar se a embalagem expirou. A data de validade é, pelo menos, 6, 12, 24, 36 ou 48 meses, e. g., superior a 24 ou 36 meses, a partir de um evento pré-selecionado, tais como fabrico, ensaio ou embalamento. Em algumas formas de realização, é tomada uma decisão ou passo em resultado da análise. Por exemplo, dependendo da análise correta, o anticorpo na embalagem é utilizado ou descartado, classificado, selecionado, libertado ou retido, enviado, movido para um novo local, lançado no comércio, vendido ou oferecido para venda, retirado do comércio ou deixado de ser oferecido para venda, dependendo se o produto expirou.

Noutro aspeto, a divulgação apresenta uma embalagem contendo, pelo menos, duas doses unitárias de uma composição aquosa contendo um anticorpo de ligação a oí4 . Numa forma de realização, todas as doses unitárias contêm a mesma quantidade de anticorpo e, noutras formas de realização, existem dosagens unitárias de duas ou mais miligramagens, ou duas ou mais formulações diferentes, e. g., possuindo diferentes miligramagens ou propriedades de libertação.

Noutro aspeto, a divulgação inclui um método de instrução de um recetor sobre a administração de uma formulação contendo anticorpo de ligação a a4 . 0 método inclui instruir o recetor (e. g., um utilizador final, doente, médico, farmácia de vendas normais ou a retalho, distribuidor ou departamento farmacêutico num hospital, clínica de lar de idosos ou HMO) de que o anticorpo deve ser administrado a um doente de acordo com um regime aqui descrito. 0 método pode também incluir instruir o recetor de que o anticorpo deve ser administrado antes da data de validade. A data de validade é, pelo menos, 6, 12, 24, 36 ou 48 meses, e. g., superior a 24 ou 36 meses, a partir de um evento pré-selecionado, tais como fabrico, ensaio ou embalamento. Numa forma de realização, o recetor também recebe um fornecimento do anticorpo, e. g., um fornecimento de dosagens unitárias do anticorpo.

Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método de preparação de um anticorpo, o qual inclui CDR de um anticorpo dador, tal como um não humano, e. g., um anticorpo murino, e uma ou ambas estruturas de região variável da cadeia pesada e leve derivadas da região ou regiões estruturais da região variável de linha germinativa humana. 0 método inclui um ou ambos de 1 e 2, onde 1 e 2 são como se seguem: 1. identificar ou selecionar uma estrutura variável da cadeia pesada aceitadora humana estável, a qual tem os mesmos resíduos que a cadeia pesada dadora não humana num ou mais dos resíduos num ou mais de a), b) e c): a) VH de Rabat N° 2, 4, 24, 26, 27, 29, 36, 38, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 69, 71, 78, 93 e 94, a qual se pensa, sem estar limitado pela teoria, ser importante para manter as conformações da CDR; b) VH de Rabat N° 1, 2, 27, 28, 30, 43, 66, 68, 70, 72, 73, 74 e 75, a qual se pensa, sem estar limitado pela teoria, ser capaz de interagir com o antigénio; e c) VH de Rabat N° 37, 39, 44, 45, 47, 91, 93 e 103, a qual se pensa, sem estar limitado pela teoria, ser importante para a integridade da interface VH/VL; e 2. identificar ou selecionar uma estrutura variável da cadeia leve aceitadora estável, a qual tem os mesmos resíduos que a cadeia leve dadora num ou mais dos resíduos num ou mais de a) , b) e c) : a) VL de Rabat N° 2, 4, 38, 43, 44, 48, 58, 64, 71 e 73, a qual se pensa, sem estar limitado pela teoria, ser importante para manter as conformações da CDR; b) VL de Rabat N° 1, 2, 49, 57, 60, 63, 65, 66, 67, 68, 69 e 70, a qual se pensa, sem estar limitado pela teoria, ser potencialmente capaz de interagir com o antigénio; e c) VL de Rabat N° 36, 38, 43, 44, 46, 49, 87 e 98, a qual se pensa, sem estar limitado pela teoria, ser importante para a integridade da interface VH/VL; 3. proporcionar uma região variável possuindo CDR dadoras e a estrutura de linha germinativa selecionada possuindo resíduos correspondentes identificados em 1 ou 2, tal como selecionado uma sequência de linha germinativa e retromutando ainda resíduos adicionais identificados em 1 ou 2 da linha germinativa para a sequência murina de modo a maximizar ainda mais a correspondência nos resíduos identificados em 1 e 2; e 4. avaliar cada posição correspondente, tal como por análise estrutural 3D ou modelação e, se uma posição cumprir um padrão predeterminado para risco de, por exemplo, interferir com as conformações da CDR, interações de antigénio ou integridade da interface VH/VL, então reintroduzir um resíduo murino equivalente, ou um resíduo de anticorpo humano comum, compatível com a estrutura do anticorpo.

Numa forma de realização, pelo menos, 3, 4 ou 5 dos resíduos identificados em (l.a) são correspondentes. Por exemplo, numa forma de realização, os resíduos 24, 29 ou 94 são correspondentes.

Numa forma de realização, pelo menos, 3, 4 ou 5 dos resíduos identificados em (l.b) são correspondentes. Por exemplo, numa forma de realização, os resíduos 1, 73 ou 75 são correspondentes.

Numa forma de realização, pelo menos, 3, 4 ou 5 dos resíduos identificados em (l.c) são correspondentes. Por exemplo, numa forma de realização, os resíduos 37, 93 ou 103 são correspondentes.

Numa forma de realização, pelo menos, 3, 4 ou 5 dos resíduos identificados em (2.a) são correspondentes. Por exemplo, numa forma de realização, os resíduos 2, 71 e 73 são correspondentes.

Numa forma de realização, pelo menos, 3, 4 ou 5 dos resíduos identificados em (2.b) são correspondentes. Por exemplo, numa forma de realização, os resíduos 1, 68 ou 70 são correspondentes.

Numa forma de realização, pelo menos, 3, 4 ou 5 dos resíduos identificados em (2.c) são correspondentes. Por exemplo, numa forma de realização, os resíduos 46, 87 ou 98 são correspondentes.

Numa forma de realização, o resíduo 6 em (l.a), resíduo 2 em (l.b) e resíduo 4 em (l.c) são correspondentes.

Noutra forma de realização, o resíduo 4 em (2.a), resíduo 2 em (2.b) e resíduo 4 em (2.c) são correspondentes.

Numa forma de realização, a sequência de linha germinativa de cadeia pesada é da classe de linha germinativa VH3, VHl e VH5. Noutra forma de realização, a sequência de linha germinativa de cadeia leve é uma sequência Vcapa ou Vlambda. O termo "tratar" refere-se a administrar uma terapia numa quantidade, maneira e/ou modo eficaz para melhorar um estado, sintoma ou parâmetro associado com distúrbio ou para impedir a progressão de um distúrbio, a um grau estatisticamente significativo ou a um grau detetável por um especialista na técnica. Uma quantidade, maneira ou modo eficaz pode variar dependendo do indivíduo e pode ser adaptada do indivíduo.

Um "anticorpo de ligação a a4" refere-se a um anticorpo que se liga à subunidade a4 da integrina VLA-4 (α4β1) e inibe, pelo menos parcialmente, uma atividade de VLA-4, particularmente uma atividade de ligação de uma integrina VLA-4 ou uma atividade de sinalização, e. g., capacidade de transduzir um sinal mediado por VLA-4. Por exemplo, um anticorpo de ligação a VLA-4 pode inibir a ligação de VLA-4 a um ligando cognato de VLA-4, e. g., uma proteína de superfície celular, tal como VCAM-1 (Molécula de Adesão Celular Vascular 1), ou a um componente da matriz extracelular, tais como fibronectina ou osteopontina. Um anticorpo de ligação a alfa-4 pode ligar-se a α4β1 ou α4β7. Tipicamente, o anticorpo liga-se ao epítopo Bl de a4. Um anticorpo de ligação a a4 pode ligar-se a VLA-4 com uma Kd inferior a cerca de IO-6, IO-7, 10_1, 10“9, 10“10 ou IO-11 M.

Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se a uma proteína que inclui, pelo menos, uma região variável das imunoglobulinas, e. g. , uma sequência de aminoácidos que proporciona um domínio variável da imunoglobulina ou sequência do domínio variável da imunoglobulina. Por exemplo, um anticorpo pode incluir uma região variável da cadeia pesada (H) (aqui abreviada como VH) , e uma região variável da cadeia leve (L) (aqui abreviada como VL). Noutro exemplo, um anticorpo inclui duas regiões variáveis da cadeia pesada (H) e duas regiões variáveis da cadeia leve (L) . As cadeias leves da imunoglobulina podem ser dos tipos capa ou lambda. Numa forma de realização, o anticorpo é glicosilado. Um anticorpo pode ser funcional para citotoxicidade dependente de anticorpo e/ou citotoxicidade mediada por complemento, ou pode ser não funcional para uma ou ambas destas atividades.

As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas "regiões determinantes de complementaridade" ("CDR"), interespaçadas com regiões que são mais conservadas, denominadas "regiões estruturais" (FR). A extensão das FR e CDR foi definida de modo preciso (ver, Rabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N° 91-3242; e Chothia, C. et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). Aqui são utilizadas as definições de Rabat. Cada VH e VL é, tipicamente, composta por três CDR e quatro FR, dispostas do terminal amino para o terminal carboxilo na seguinte ordem: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Um "domínio da imunoglobulina" refere-se a um domínio do domínio variável ou constante de moléculas de imunoglobulina. Os domínios da imunoglobulina contêm, tipicamente, duas folhas β formadas por cerca de sete cadeias β, e uma ligação dissulfureto conservada (ver, e. g., A. F. Williams e A. N. Barclay (1988)

Ann. Rev. Immunol. _6:381-405).

Como aqui utilizada, uma "sequência do domínio variável da imunoglobulina" refere-se a uma sequência de aminoácidos que pode formar a estrutura de um domínio variável da imunoglobulina. Por exemplo, a sequência pode incluir toda ou parte da sequência de aminoácidos de um domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, a sequência pode omitir um, dois ou mais aminoácidos N- ou C-terminais, aminoácidos internos, pode incluir uma ou mais inserções ou aminoácidos terminais adicionais, ou pode incluir outras alterações. Numa forma de realização, um polipéptido que inclui uma sequência do domínio variável da imunoglobulina pode associar-se com outra sequência do domínio variável da imunoglobulina para formar uma estrutura de ligação alvo (ou "sítio de ligação a antigénio") , e. g., uma estrutura que interage com VLA-4. A cadeia VH ou VL do anticorpo pode ainda incluir toda ou parte de uma região constante da cadeia pesada ou leve para, desse modo, formar uma cadeia de imunoglobulina pesada ou leve, respetivamente. Numa forma de realização, o anticorpo é um tetrâmero de duas cadeias de imunoglobulina pesadas e duas cadeias de imunoglobulina leves. As cadeias de imunoglobulina pesadas e leves podem ser ligadas por ligações dissulfureto. A região constante da cadeia pesada inclui tipicamente três domínios constantes, CHI, CH2 e CH3. A região constante da cadeia leve inclui, tipicamente, um domínio CL. A região variável das cadeias pesada e leve contém um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos mediam, tipicamente, a ligação do anticorpo a tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunitário (e. g., células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complemento clássico. 0 termo "imunoglobulina" compreende várias classes amplas de polipéptidos que podem ser distinguidas bioquimicamente. Os especialistas na técnica entenderão que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon (γ, μ, α, δ, ε) com algumas subclasses entre elas (e. g., γ1-γ4) . É a natureza desta cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgD ou IgE, respetivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), e. g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, etc., estão bem caracterizadas e são conhecidas por conferirem especialização funcional. As versões modificadas de cada destas classes e isotipos são facilmente discerníveis para o especialista considerando a presente divulgação e, por conseguinte, estão dentro do âmbito da presente invenção. Todas as classes de imunoglobulina estão claramente dentro do âmbito da presente invenção. As cadeias leves são classificas como capa ou lambda (κ, λ) . Cada classe da cadeia pesada pode ser ligada com uma cadeia leve capa ou lambda. A expressão "fragmento de ligação a antigénio" de um anticorpo de comprimento total refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo de comprimento total que retém a capacidade de se ligar especificamente a um alvo de interesse, e. g. , VLA-4. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pela expressão "fragmento de ligação a antigénio" de um anticorpo de comprimento total incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente incluindo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região da região de articulação; (iii) um fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), o qual consiste de um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada que retém a funcionalidade. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, estes podem ser ligados, utilizando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite prepará-los como uma cadeia de proteína simples na qual as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv) . Ver, e. g., Bird et al., (1988) Science 242:423-426; e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883.

Em algumas formas de realização, os anticorpos descritos acima são peguilados.

Em algumas formas de realização, os anticorpos descritos acima ou seus fragmentos são multiespecíticos. Em formas de realização adicionais, os anticorpos descritos acima ou seus fragmentos são monovalentes ou biespecíficos.

Os detalhes de uma ou mais formas de realização da invenção são apresentados nos desenhos anexos e na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e desenhos, e a partir das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 apresenta as três variantes da sequência da cadeia pesada de HPl/2 para uma linha germinativa pesada humana IGHVl-f. As letras minúsculas por cima das sequências representam inserções de acordo com o esquema de numeração de Rabat. A FIG. 2 apresenta as quatro variantes da sequência da cadeia leve de HPl/2 para uma sequência de anticorpo IGKV4-1 de linha germinativa (Conceção LO, Ll, e L2) ou sequência de anticorpo AAH7033.1 manipulada para linha germinativa capa humana (Conceção L3). As letras minúsculas por cima das sequências representam inserções de acordo com o esquema de numeração de Rabat. A FIG. 3 é um gráfico que representa os resultados de ensaios ELISA. A FIG. 4 é um gráfico que representa os resultados de ensaios ELISA. A FIG. 5 é uma sequência de aminoácidos de um Fc de IgG4 (articulação + domínio CH2 + CH3) . A região de articulação está representada a negrito, e o domínio CH3 está sublinhado. 0 "S" dentro do quadrado é Ser228. 0 "N" dentro do círculo é Asn297. A FIG. 6 é um gráfico que representa dados de citometria de fluxo da ligação de HuHPl/2 a várias linhas celulares de tumor. "HPl/2" refere-se a HPl/2 humanizada. A FIG. 7A-7C é um painel de gráficos que representam a inibição da ligação de linhas celulares AML a fibronectina ou poços revestidos com VCAMl-Ig por HuHPl/2. A FIG. 7A representa a inibição da ligação de células HL60 e KG1 a poços revestidos com FN. A FIG. 7B representa a inibição da ligação de células KG1 a poços revestidos com VCAMl-Ig. A FIG. 7C representa a inibição da ligação de células HL60 a poços revestidos com FN e VCAMl-Ig quando incubadas com 20 yg/mL de HuHPl/2 (Barras a cheio). As barras claras indicam a percentagem de adesão das células na presença de um controlo de isotipo. "HPl/2" refere-se a HPl/2 humanizada. A FIG. 8A-8C constitui um painel de gráficos que representam a inibição da ligação de linhas celulares MM a fibronectina ou poços revestidos com VCAMl-Ig por HuHPl/2. A FIG. 8A representa a inibição da ligação de células U266 e H929 a poços revestidos com FN. A FIG. 8B representa a inibição da ligação de células U266 e H929 a poços revestidos com VCAMl-Ig. A FIG. 8C representa a inibição da ligação de células U266 a poços revestidos FN e VCAMl-Ig quando incubadas com 20 yg/mL de HuHPl/2 (Barras a cheio). As barras claras indicam a percentagem de adesão das células na presença de um controlo de isotipo. "HPl/2" refere-se a HPl/2 humanizada. A Fig. 9A-9C constitui um painel de gráficos que representam a inibição da ligação de linhas celulares CLL a fibronectina ou poços revestidos com VCAMl-Ig por HuHPl/2. A FIG. 9A representa a inibição da ligação de células Mecl e JMl a poços revestidos com FN. A FIG. 9B representa a inibição da ligação de células Mecl e JMl a poços revestidos com VCAMl-Ig. A FIG. 9C representa a inibição da ligação de células Mecl a poços revestidos com FN e VCAMl-Ig quando incubadas com 20 yg/mL de HuHPl/2 (Barras a cheio). As barras claras indicam a percentagem de adesão das células na presença de um controlo de isotipo. "HPl/2" refere-se a HPl/2 humanizada.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Demonstrou-se que os anticorpos contra VLA-4 são úteis no tratamento de doença. Por exemplo, natalizumab (Tysabri®) , um anticorpo anti-VLA-4 é utilizado para tratar esclerose múltipla e doença de Crohn reincidentes. Contudo, para o tratamento de determinados estados, por exemplo, estados agudos, tais como lesão da medula espinal (SCI) ou lesão cerebral traumática (TBI), ou tratamentos que são administrados num número finito, tal como tratamento de cancro, pode ser vantajoso tratar com um anticorpo anti-VLA-4 que se liga com uma afinidade diferente que o natalizumab, e. g., uma maior afinidade. Além disso, o tratamento com anticorpos anti-VLA-4 está associado com um distúrbio raro mas por vezes fatal, leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML) , para a qual uma parte do tratamento requer a remoção do anticorpo do indivíduo tratado, por exemplo, utilizando permuta de plasma ou imunoabsorção. Devido à necessidade de remover o anticorpo, é também desejável equilibrar as vantagens de um anticorpo que possui afinidade aumentada para VLA-4 com a desvantagem de um anticorpo que se liga tão fortemente que torna a remoção difícil ou origina um risco associado com uma taxa de regeneração lenta. Tais anticorpos também podem ser úteis para tratar estados, tal como esclerose múltipla, em que pode ser necessário tratamento menos frequente ou a administração por meios que não a infusão, podem ser mais eficaz. Possibilitar o tratamento com doses menores também pode reduzir o risco de eventos adversos, tal como LMP. Por conseguinte, a presente invenção proporciona anticorpos possuindo tais propriedades desej áveis. A invenção é baseada, pelo menos em parte, nas características inesperadas de anticorpos de ligação a a4 humanizados recentemente concebidos que possuem uma afinidade de ligação para a4 que é 10 vezes superior àquela do anticorpo anti-a4 natalizumab.

Os anticorpos de ligação a alfa-4, e seus fragmentos, são proporcionados onde as estruturas da cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) possuem sequências aceitadoras construídas a partir de sequências de anticorpo de linha germinativa ou manipuladas para linha germinativa, tais como os anticorpos IGKV4-1 ou geAAH70335.1 ou IGHVl-f. As sequências CDR são derivadas de anticorpos de ligação anti-a4 não humanos, tal como o anticorpo anti-VLA-4 HPl/2. Os anticorpos aqui descritos podem ter um aumento de, pelo menos, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 vezes na afinidade, e. g., relativamente ao seu parente murino. Numa forma de realização, o aumento na afinidade é, pelo menos, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 vezes mas é, respetivamente, menos do que 25, 20 ou 15 ve z e s .

Composições Farmacêuticas

Um agente de ligação a a4, tal como um anticorpo de ligação a VLA-4, pode ser formulado como uma composição farmacêutica. Tipicamente, uma composição farmacêutica inclui um veiculo farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizado, "veiculo farmaceuticamente aceitável" inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção, e semelhantes, que são fisiologicamente compatíveis.

Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto parental e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejáveis (ver, e. g., Berge, S.M., et ai., (1977) J. Pharm. Sei. 66:1-19). Os exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Os sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como ácido clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, e semelhantes, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos mono- e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos substituídos com fenilo, ácidos hidroxi-alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfonicos alifáticos e aromáticos e semelhantes. Os sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalinoterrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína, e semelhantes.

As composições de anticorpo aqui descritas podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos na técnica. A formulação farmacêutica é uma técnica bem estabelecida, e é descrita adicionalmente em Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a Ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); e Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3a ed. (2000) (ISBN: 091733096X).

Numa forma de realização, o anticorpo α4 pode ser formulado com materiais excipientes, tais como cloreto de sódio, fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado, fosfato de sódio monobásico, e polissorbato 80. Noutra forma de realização, o anticorpo a4 pode ser formulado num tampão citrato, e. g. , a pH 5, 5,5, 6, 6,5, 7, ou 7,5. Ainda noutra forma de realização, o anticorpo a4 pode ser formulado numa solução incluindo sacarose a 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14 ou 15%. Este pode ser proporcionado, por exemplo, numa solução tamponada a uma concentração de cerca de 20 mg/mL e pode ser armazenado a 2-8 °C.

As composições farmacêuticas também podem estar numa variedade de outras formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semissólidas e sólidas, tais como, soluções líquidas (e. g., soluções injetáveis e passíveis de infusão), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma pode depender do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica. Tipicamente, as composições para os agentes aqui descritos estão na forma de soluções injetáveis e passíveis de infusão.

Tais composições podem ser administradas por um modo parentérico (e. g., injeção intravenosa, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular). As frases "administração parentérica" e "administradas parentericamente", como aqui utilizadas, significam modos de administração além da administração entérica e tópica, normalmente por injeção, e incluem, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intra-espinal, epidural e intra-esternal e infusão.

As composições farmacêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabrico e armazenamento. Uma composição farmacêutica também pode ser testada para assegurar que cumpre os padrões regulatórios e industriais para a administração. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma, ou outra estrutura solicitada adequada para concentração elevada de fármaco. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando um agente aqui descrito na quantidade necessária num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como necessário, seguido por esterilização por filtração. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando um agente aqui descrito num transportador estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos típicos de preparação são secagem em vácuo e liofilização, o que origina um pó de um agente aqui descrito mais qualquer ingrediente desejado adicionado a partir de uma sua solução previamente filtrada de modo estéril. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento, tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula necessário no caso da dispersão e através da utilização de tensioativos. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser provocada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Administração

Um anticorpo de ligação a a4 pode ser administrado a um indivíduo, e. g., um indivíduo humano, através de uma variedade de métodos. Para muitas aplicações, a via de administração é uma de: injeção ou infusão intravenosa, injeção subcutânea ou injeção intramuscular. Um anticorpo de ligação a a4 pode ser administrado como uma dose fixa, ou numa dose de mg/kg. 0 anticorpo pode ser administrado intravenosamente (IV) ou subcutaneamente (SC). Por exemplo, o anticorpo pode ser administrado numa dose unitária fixa de entre cerca de 50-600 mg IV, e. g., a cada 4 semanas, ou entre cerca de 50-100 mg SC (e. g. , 75 mg), e. g. , pelo menos, uma vez por semana (e. g., duas vezes por semana). Numa forma de realização, o anticorpo é administrado IV numa dose unitária fixa de 50 mg, 60 mg, 80 mg, 100 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 180 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, ou 600 mg ou mais. A administração da dose IV pode ser uma ou duas ou três vezes ou mais por semana, ou uma vez a cada duas, três, quatro, ou cinco semanas, ou menos frequentemente.

Numa forma de realização, o anticorpo é administrado SC numa dose unitária fixa de 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 100 mg, ou 120 mg ou mais. A administração da dose SC pode ser uma ou duas ou três vezes ou mais por semana, ou uma vez a cada duas, três, quatro, ou cinco semanas, ou menos frequentemente.

Um anticorpo anti-a4 também pode administrado num bólus numa dose de entre cerca de 1 e 10 mg/kg, e. g., cerca de 6,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 1,0 mg/kg. As gamas de dose modificadas incluem uma dose que é inferior a cerca de 600 mg/indivíduo, cerca de 400 mg/indivíduo, cerca de 300 mg/indivíduo, cerca de 250 mg/indivíduo, cerca de 200 mg/indivíduo, ou cerca de 150 mg/indivíduo, tipicamente para administração a cada quatro semanas ou uma vez por mês. O anticorpo de ligação a a4 pode ser administrado, por exemplo, a cada três a cinco semanas, e. g., a cada quatro semanas, ou mensalmente. A dosagem pode ser ajustada de acordo com a taxa de eliminação de um doente de uma administração anterior de anticorpo anti-a4. Por exemplo, pode não ser administrada a um doente uma segunda dose ou dose de seguimento antes do nível de anticorpos anti-a4 no sistema do doente der diminuído para abaixo de um nível predeterminado. Numa forma de realização, uma amostra de um doente (e. g., plasma, soro, sangue, urina ou fluido cerebrospinal (CSF)) é ensaiada para a presença de anticorpos anti-a4 e, se o nível de anticorpos anti-a4 estiver acima de um nível predeterminado, não será administrada ao doente uma segunda dose ou dose de seguimento. Se o nível de anticorpos anti-a4 no sistema do doente estiver abaixo de um nível predeterminado, então é administrada ao doente uma segunda dose ou dose de seguimento. Um doente cujos níveis de anti-a4 são determinados como sendo demasiado elevados (acima do nível predeterminado) pode ser testado novamente após um ou dois ou três dias, ou uma semana e, se o nível de anticorpo anti-a4 nas amostras do doente tiverem diminuído para abaixo do nível predeterminado, pode ser administrada ao doente uma segunda dose ou dose de seguimento do anticorpo. A dose também pode ser escolhida para reduzir ou evitar a produção de anticorpos contra o anticorpo de ligação a a4, para obter mais do que 40, 50, 70, 75 ou 80% de saturação da subunidade a4, para obter menos do que 80, 70, 60, 50 ou 40% de saturação da subunidade a4, ou para impedir um aumento no nível de circulação de glóbulos brancos.

Em determinadas formas de realização, o agente ativo pode ser preparado com um veículo que irá proteger o composto contra a rápida libertação, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como acetato de etileno-vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações estão patenteados ou são geralmente conhecidos. Ver, e. g., Controlled Drug Delivery (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Segunda Edição, J. Robinson e V. H. L. Lee, eds., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987.

As composições farmacêuticas podem ser administradas com um dispositivo médico. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser administradas com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos divulgado nas Patentes U.S. N° 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824; ou 4596556. Os exemplos de implantes e módulos bem conhecidos são discutidos, e. g., na Patente U.S. N° 4487603, a qual divulga uma bomba de micro-infusão implantável para distribuir medicação numa taxa controlada; Patente U.S. N° 4486194, a qual divulga um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; Patente U.S. N° 4447233, a qual divulga uma bomba de infusão de medicação para distribuir a medicação numa taxa de infusão precisa; Patente U.S. N° 4447224, a qual divulga um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para distribuição continua de fármaco; Patente U.S. N° 4439196, a qual divulga um sistema de distribuição de fármaco osmótico possuindo compartimentos de várias câmaras; e Patente U.S. N° 4475196, a qual divulga um sistema de distribuição de fármaco osmótico. Naturalmente, são também conhecidos muitos outros desses implantes, sistemas de distribuição e módulos.

Esta divulgação também apresenta um dispositivo para administrar um primeiro e segundo agente. O dispositivo pode incluir, por exemplo, um ou mais alojamentos para armazenar preparações farmacêuticas, e pode ser configurado para distribuir doses unitárias do primeiro e segundo agente. O primeiro e segundo agentes podem ser armazenados no mesmo ou em compartimentos separados. Por exemplo, o dispositivo pode combinar os agentes antes da administração. É também possível utilizar diferentes dispositivos para administrar o primeiro e segundo agente.

Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta desejada, tais como uma resposta terapêutica ou um efeito terapêutico combinatório. Em geral, pode ser utilizada qualquer combinação de doses (separadas ou co-formuladas) do agente de ligação a VLA-4 e do segundo agente, de modo a proporcionar a um indivíduo ambos os agentes em quantidades biodisponíveis.

Forma de dosagem unitária ou "dose fixa", como aqui utilizada, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário e, opcionalmente, em associação com o outro agente.

Uma composição farmacêutica pode incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente aqui descrito. Tais quantidades eficazes podem ser determinadas com base no efeito combinatório do primeiro e segundo agente administrados. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente também pode variar de acordo com fatores, tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do composto para desencadear uma resposta desejada no indivíduo, tal como amenização de, pelo menos, um parâmetro do distúrbio, e. g., um parâmetro da esclerose múltipla, ou amenização de, pelo menos, um sintoma do distúrbio, e. g., um sintoma da esclerose múltipla, tais como atrofia muscular, ataxia e tremores. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da composição são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

Dispositivos e Kits

As formulações contendo um anticorpo aqui descrito podem ser administradas com um dispositivo médico. 0 dispositivo pode ser concebido com características, tais como portabilidade, armazenamento à temperatura ambiente e facilidade de utilização, de modo que este possa ser utilizado em situações de emergência, tais como por um indivíduo não treinado ou por pessoal de emergência no campo, removido para instalações médicas e outro equipamento médico. 0 dispositivo pode incluir, por exemplo, um ou mais alojamentos para armazenar preparações farmacêuticas que incluem um anticorpo de ligação a a4, e pode ser configurado para distribuir uma ou mais doses unitárias do agente.

Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser administrada com um dispositivo de distribuição transcutâneo, tal como uma seringa, incluindo uma seringa hipodérmica ou multicâmara. Outros dispositivos de distribuição adequados incluem stents, cateteres, microagulhas e dispositivos de libertação controlada implantáveis. A composição pode ser administrada intravenosamente com equipamento IV padrão, incluindo, e. g. , tubos IV, com ou sem filtros em linha. Em determinadas formas de realização, o dispositivo será uma seringa para utilização em administração SC ou IM.

As composições farmacêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser administradas com um dispositivo de injeção hipodérmico sem agulha, tais como os dispositivos divulgado nas Patentes U.S. N° 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824; ou 4596556. Os exemplos de implantes e módulos bem conhecidos são descritos, e. g. , na Patente U.S. N° 4487603, a qual divulga uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar medicação numa taxa controlada; Patente U.S. N° 4486194, a qual divulga um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; Patente U.S. N° 4447233, a qual divulga uma bomba de infusão de medicação para distribuir a medicação numa taxa de infusão precisa; Patente U.S. N° 4447224, a qual divulga um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para distribuição continua de fármaco; Patente U.S. N° 4439196, a qual divulga um sistema de distribuição de fármaco osmótico possuindo compartimentos de várias câmaras; e Patente U.S. N° 4475196, a qual divulga um sistema de distribuição de fármaco osmótico. A composição terapêutica também pode estar na forma de uma formulação de libertação prolongada biodegradável ou não biodegradável para administração subcutânea ou intramuscular. Os métodos para tais composições são conhecidos na técnica. A administração continua também pode ser obtida utilizando uma bomba implantável ou externa. A administração também pode ser conduzida intermitentemente, tal como por injeção diária única, ou continuamente a uma dose baixa, tal como numa formulação de libertação prolongada. 0 dispositivo de distribuição pode ser modificado para ser adequado de modo ótimo para administração de um anticorpo de ligação a a4. Por exemplo, uma seringa pode ser siliconizada, numa medida em que seja ótima para armazenamento e distribuição do anticorpo. Naturalmente, são também conhecidos muitos outros tais implantes, sistemas de distribuição, e módulos.

Esta divulgação também apresenta um dispositivo para administrar um primeiro e segundo agentes (e. g., um anticorpo e um segunda agente) . 0 dispositivo pode incluir, por exemplo, um ou mais alojamentos para armazenar preparações farmacêuticas, e pode ser configurado para distribuir doses unitárias do primeiro e segundo agente. 0 primeiro e segundo agentes podem ser armazenados no mesmo ou em compartimentos separados. Numa forma de realização, o dispositivo combina os agentes antes da administração. Em algumas formas de realização, o primeiro e segundo agentes são administrados por diferentes dispositivos.

Um anticorpo de ligação a a4 pode ser proporcionado num kit. Numa forma de realização, o kit inclui (a) um recipiente que contém uma composição que inclui uma concentração elevada de anticorpo de ligação a VLA-4, opcionalmente (b) um recipiente que contém uma composição que inclui um segundo agente e, opcionalmente, (c) material informacional. 0 material informacional pode ser descritivo, instrucional, de marketing ou outro material que se refere aos métodos aqui descritos e/ou à utilização dos agentes para beneficio terapêutico. Numa forma de realização, o kit também inclui um segundo agente. Por exemplo, o kit inclui um primeiro recipiente que contém uma composição que inclui o anticorpo de ligação a a4, e um segundo recipiente que inclui o segundo agente. 0 material informativo dos kits não está limitado na sua forma. Numa forma de realização, o material informacional pode incluir informação acerca da produção do anticorpo, concentração, date de validade, lote ou informação do local de produção, e por ai em diante. Numa forma de realização, o material informativo refere-se a métodos de administração do anticorpo de ligação a a4, e. g., numa dose, forma de dosagem, ou modo de administração adequados (e. g., uma dose, forma de dosagem, ou modo de administração aqui descrito), para tratar um indivíduo que possui um distúrbio agudo, tais como uma lesão da medula espinal ou lesão cerebral traumática, ou uma doença inflamatória (e. g., MS) , ou que está em risco de experienciar um episódio associado a uma doença inflamatória. A informação pode ser proporcionada numa variedade de formatos, incluindo texto impresso, material legível por computador, gravação de vídeo ou gravação de áudio ou informação que proporcione uma ligação ou endereço para o material substantivo.

Além do agente, a composição no kit pode incluir outros ingredientes, tais como um solvente ou tampão, um estabilizador, ou um conservante. 0 agente pode ser proporcionado em qualquer forma, e. g., forma liquida, seca ou liofilizada e, substancialmente, pura e/ou estéril. Quando os agentes são proporcionados numa solução liquida, a solução liquida é, tipicamente, uma solução aquosa. Quando os agentes são proporcionados como uma forma seca, a reconstituição geralmente é através da adição de um solvente adequado. 0 solvente, e. g., água estéril ou tampão, pode, opcionalmente, ser proporcionado no kit. 0 kit pode incluir um ou mais recipientes para a composição ou composições contendo os agentes. Em algumas formas de realização, o kit contém recipientes, divisores ou compartimentos separados para a composição e material informacional. Por exemplo, a composição pode estar contida numa garrafa, frasquinho ou seringa, e o material informacional pode estar contido numa manga ou pacote de plástico. Noutras formas de realização, os elementos separados do kit estão contidos dentro de um único recipiente, não dividido. Por exemplo, a composição está contida numa garrafa, frasquinho ou seringa que tem, fixa a esta, o material informacional na forma de uma etiqueta. Em algumas formas de realização, o kit inclui uma pluralidade (e. g., uma embalagem) de recipientes individuais, cada contendo uma ou mais formas de dosagem unitárias (e. g., uma forma de dosagem aqui descrita) dos agentes. Os recipientes podem incluir uma dosagem unitária de combinação, e. g., uma unidade que inclui o anticorpo de ligação a a4 e o segundo agente, tal como numa razão desejada.

Por exemplo, o kit pode incluir uma pluralidade de seringas, ampolas, embalagens de alumínio, embalagens blister ou dispositivos médicos, cada contendo, por exemplo, uma única dosagem unitária de combinação. Os recipientes dos kits podem ser herméticos, à prova de água (e. g., impermeáveis a alterações na humidade ou evaporação) e/ou à prova de luz. 0 kit inclui, opcionalmente, um dispositivo adequado para administrar a composição, e. g., uma seringa ou outro dispositivo de distribuição adequado. 0 dispositivo pode ser proporcionado pré-carregado com um ou ambos os agentes ou pode estar vazio mas ser adequado para ser carregado.

Oncologia

Os anticorpos de ligação a a4 e métodos aqui descritos podem ser utilizados para tratar cancro, incluindo cancros sólidos e malignidades hematológicas. Os cancros sólidos exemplificativos incluem sarcomas e carcinomas, tais como do pulmão, mama, pâncreas, cólon, próstata, bexiga e cérebro. As malignidades hematológicas incluem cancros, tais como mieloma múltiplo, leucemia e linfoma. São proporcionados métodos para tratar um doente possuindo uma malignidade hematológica com uma composição contendo um anticorpo de ligação a a4, tal como anticorpo anti-VLA-4 aqui descrito. As malignidades hematológicas são cancros dos sistemas imunitário e de formação de sangue do corpo. Os cancros deste tipo afetam o sangue, medula óssea e/ou nódulos linfáticos. As malignidades hematológicas incluem leucemias, tais como leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia promielocítica aguda, eritroleucemia aguda, e leucemia de células pilosas (HCL); linfomas, tais como doença de Hodgkin e linfoma de Não Hodgkin; e mieloma múltipla; macroblobulinemia de Waldenstrom; síndroma mielodisplásica (MDS) (a qual pode culminar em AML); uma doença mieloproliferativo, tais como policitemia vera (também denominada PV, PCV ou policitemia rubra vera (PRV)), trombocitose essencial (ET), mielofibrose, doença da cadeia pesada; e amiloide devido a doença da cadeia leve.

Os doentes que possuem uma malignidade hematológica podem ser identificados por análise da contagem sanguínea e esfregaço sanguíneo, por exemplo, por microscopia ótica, a qual é útil para identificar células malignas. Uma biopsia, tal como da medula óssea, também pode ser utilizada identificar células malignas, e uma biopsia de um nódulo linfático pode ser utilizado para identificar uma linfadenopatia.

Um anticorpo de ligação a a4 (e. g., um anticorpo anti-VLA-4 humanizado, tais como HuHPl/2, HILO, HlLl, H1L2 ou H1L3) é útil para o tratamento de uma leucemia, tal como AML. As leucemias são cancros que têm origem na medula óssea, onde as células malignas são glóbulos brancos (leucócitos). AML (também denominada leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia granulocítica aguda, e leucemia não linfocítica aguda) é uma malignidade que surge nos granulócitos ou monócitos. AML é caracterizada pelo crescimento exagerado, não controlado, e acumulação de células denominadas blastos leucémicos, os quais falham no funcionamento como células sanguíneas normais, e no bloqueio da produção de células da medula normais, levando a uma deficiência de glóbulos vermelhos (anemia), e plaquetas (trombocitopenia) e glóbulos brancos normais (especialmente neutrófilos, i. e., neutropenia) no sangue.

Todos os subtipos de AML são adequados para tratamento com um anticorpo de ligação a VLA-4. Os subtipos de AML são classificados com base no estádio de desenvolvimento que os mieloblastos atingiram no momento do diagnóstico. As categorias e subconjuntos permitem ao médico decidir qual o tratamento que melhor funciona para o tipo de célula e quão rapidamente a doença se pode desenvolver. Os subconjuntos são: MO, mieloblástico, em análise especial; Ml, Mieloblástico, sem maturação; M2, Mieloblástico, com maturação; M3, Promielocítico; M4, Mielomonocítico; M5, Monocítico; M6, Eritroleucemia; e M7, Megacariocítico. Um anticorpo VLA-4 pode ser administrado com um agente secundário que é particularmente adequado para o subtipo de AML. Por exemplo, a leucemia promielocítica aguda (APL) e leucemia monocítica aguda são subtipos de AML que necessitam de tratamento diferente dos outros subtipos de AML. Um segundo agente para o tratamento de APL pode incluir ácido retinoico todo-trans (ATRA) ou um antimetabolito, tal como citarabina. Um segundo agente para o tratamento da leucemia monocítica aguda pode incluir um análogo de desoxiadenosina, tal como 2-cloro-2'-desoxiadenosina (2-CDA).

Os fatores de risco de AML incluem a presença de determinados distúrbios genéticos, tais como síndrome de Down, anemia de Fanconi, síndrome de Shwachman-Diamond e outros. A um doente que possui AML e um distúrbio genético pode ser administrado um anticorpo de ligação a VLA-4 e um segundo agente para tratar um sintoma do distúrbio genético. Por exemplo, a um doente com AML e anemia de Fanconi pode ser administrado um anticorpo de ligação a VLA-4 e um antibiótico.

Outros fatores de risco para AML incluem quimioterapia ou radioterapia para o tratamento de um cancro diferente, fumo do tabaco e exposição a grandes quantidades de benzeno.

Outros cancros adequados para o tratamento com um anticorpo de ligação a a4 incluem tumores sólidos, tais como sarcomas e carcinomas (e. g., fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiossarcoma, endothliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing's, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, cancro ovariano, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândulas sudoríparas, carcinoma de glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do dueto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm, cancro cervical, cancro uterino, cancro testicular, carcinoma pulmonar de células pequenas, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, schwanoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma).

Outros Distúrbios

As formulações e métodos aqui descritos também podem ser utilizados para tratar outros distúrbios inflamatórios, imunes ou autoimunes, e. g., inflamação do sistema nervoso central (e. g., além de esclerose múltipla, meningite, neuromielite ótica, neurossarcoidose, vasculite do SNC, encefalite e mielite transversa); rejeição de enxerto de tecido ou órgão ou doença de enxerto-versus-dospedeiro; lesão do SNC aguda, e. g., acidente vascular cerebral ou lesão da medula espinal (SCI); doença renal crónica; alergia, e. g., asma alérgica, rinite alérgica moderada a grave, alergia ocular; diabetes mellitus tipo 1; distúrbios inflamatórios intestinais, e. g., doença de Crohn, colite ulcerosa (e. g., para o tratamento ou manutenção da remissão); gastroenterite eosinofílica; miastenia grave; fibromialgia; distúrbios associados com reumatologia/imunologia, tal como distúrbios artríticos, e. g., artrite reumatoide, artrite psoriática; distúrbios dermatológicos, tal como distúrbios da pele inflamatórios/imunes, e. g., psoríase, vitiligo, dermatite (e. g., dermatite atópica), líquen plano, urticária crónica moderada a grave; lúpus eritematoso sistémico (SLE; e. g., nefrite lúpica); esclerodermia (e. g., Esclerose Sistémica Progressiva (PSS), tal como PSS do pulmão); pneumonia eosinofílica primária aguda ou crónica; Síndrome de Sjogren; síndrome coronariana aguda (ACS); enfarte agudo do miocárdio; aterosclerose; e distúrbios fibróticos, e. g., fibrose pulmonar (e. g., fibrose pulmonar idiopática), fibrose pulmonar (e. g., induzida por XRT), mielofibrose, cirrose hepática, glomerulonefrite proliferativa mesangial, glomerulonefrite crescente, nefropatia diabética e fibrose intersticial renal.

As formulações e métodos aqui descritos também podem ser utilizados para tratar distúrbios neurológicos, tal como isquemia cerebral, incluindo prevenção em doentes com ataques isquémicos transitórios e/ou estenose arterial. Outros distúrbios neurológicos exemplificativos incluem polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica (CIDP); Síndrome de Guillian-Barre (GBS); doenças oculares, tais como degeneração macular (e. g., degeneração macular húmida), e neuropatia ótica isquémica anterior; dor neuropática (e. g., dor neuropática sintomática); Doença de Alzheimer; Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) (e. g., ALS modificadora de doença) e Doença de Parkinson.

As formulações e métodos aqui descritos também podem ser utilizados para doentes que sofreram transplante, tais como transplante renal, de coração, ou medula óssea.

Esclerose Múltipla

As formulações contendo um anticorpo de ligação a alfa-4 aqui descritas são úteis para o tratamento de doenças inflamatórias, tal como esclerose múltipla (MS) . A esclerose múltipla é uma doença do sistema nervoso central que é caracterizada por inflamação e perda de bainhas de mielina.

Os doentes que possuem MS podem ser identificados por critérios que estabelecem um diagnóstico de MS clinicamente definitiva, como definido pelo workshop sobre o diagnóstico de MS (Poser et al., Ann. Neurol. 13:227, 1983) . Por exemplo, um indivíduo com MS clinicamente definitiva teve dois ataques e evidência clínica de duas lesões ou evidência clínica de uma lesão e evidência paraclínica de outra lesão separada. A MS definitiva também pode ser diagnosticada pela evidência de dois ataques e bandas oligoclonais de IgG no fluido cerebrospinal ou pela combinação de um ataque, evidência clínica de duas lesões e banda oligoclonal de IgG no cerebrospinal fluido. Os critérios de McDonald também podem ser utilizados para diagnosticar MS. (McDonald et al., 2001, "Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Painel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis", Ann. Neurol. 50:121-127). Os critérios de McDonald incluem a utilização de evidência de MRI de deficiência no SNC ao longo do tempo para ser utilizada no diagnóstico de MS, na ausência de múltiplos ataques clínicos. 0 tratamento eficaz da esclerose múltipla pode ser avaliado em diversos modos diferentes. Os parâmetros seguintes podem ser utilizados para avaliar a eficácia do tratamento. Dois critérios exemplificativos incluem: EDSS (Escala do estado de incapacidade prolongada), e aparecimento de exacerbações na MRI (imagem de ressonância magnética) . A EDSS é um método para avaliar a deficiência clínica devido a MS (Kurtzke, Neurology 33:1444, 1983) . Oito sistemas funcionais são avaliados para o tipo e gravidade de deficiência neurológica. Resumidamente, antes do tratamento, os doentes são avaliados para deficiência nos sistemas seguintes: piramidal, cerebeloso, do tronco cerebral, sensorial, do intestino e bexiga, visual, cerebral, e outros. Os seguimentos são conduzidos em intervalos definitivos. A escala varia desde 0 (normal) a 10 (morte devido a MS) . Uma diminuição de um passo completo indica um tratamento eficaz (Kurtzke, Ann. Neurol. 36:573-79, 1994) . Os doentes também podem ser diagnosticados utilizando outros critérios, utilizados pelos especialistas na técnica.

As exacerbações são definidas como o aparecimento de um novo sintoma que é atribuível a MS e acompanhado por uma nova anormalidade neurológica apropriada (IFNB MS Study Group, supra). Além disso, a exacerbação deve durar, pelo menos, 24 horas e ser precedida por estabilidade ou melhoria durante, pelo menos, 30 dias. Resumidamente, é realizado aos doentes, pelos médicos, um exame neurológico padrão. As exacerbações são ligeiras, moderadas ou graves, de acordo com alterações numa Escala de Avaliação Neurológica (Sipe et al., Neurology 34:1368, 1984). São determinadas uma taxa de exacerbação anual e proporção de doentes livres de exacerbação. A terapia pode ser considerada eficaz se existir uma diferença estatisticamente significativa na taxa ou proporção de doentes livres de exacerbação ou livres de recidiva entre o grupo tratado e o grupo placebo para qualquer destas medições. Além disso, também pode ser medido o tempo para a primeira exacerbação e a duração e gravidade da exacerbação. Uma medida da eficácia como terapia a este respeito é a diferença estatisticamente significativa no tempo para a primeira exacerbação ou duração e gravidade no grupo tratado em comparação com o grupo e controlo. Um periodo livre de exacerbação ou livre de recidiva de mais do que um ano, 18 meses ou 20 meses, é particularmente notável. A eficácia também pode ser avaliada utilizando qualquer método utilizado na técnica, por exemplo, para avaliar os sintomas da MS, incluindo melhoria da mobilidade utilizando um teste de caminhada cronometrada utilizado por si só ou em combinação com outros critérios. A eficácia da administração de um primeiro agente e, opcionalmente, um segundo agente, também pode ser avaliada com base num ou mais dos critérios seguintes: frequência de células T reativas a MBP determinada por diluição limitativa, resposta de proliferação de linhas celulares T e clones reativos a MBP, perfis de citocinas de linhas celulares T e clones para MBP estabelecidos a partir de doentes. A eficácia é indicada pela diminuição na frequência de células reativas, uma redução na incorporação de timidina com péptido alterado em comparação com o nativo e uma redução no TNF e IFN-a.

As medições clinicas incluem a taxa de recidiva em intervalos de um e dois anos, e uma alteração na EDSS, incluindo tempo para a progressão a partir da linha de base de 1,0 unidades na EDSS que persiste durante seis meses. Numa curva Kaplan-Meier, um retardamento na progressão prolongada da deficiência mostra eficácia. Outros critérios incluem uma alteração na área e volume de imagens T2 na MRI, e o número e volume de lesões determinados por imagens melhoradas com gadolinio. A MRI pode ser utilizada para medir lesões ativas utilizando imagens melhorada com gadolinium-DTPA (McDonald et al. Ann. Neurol. 36:14, 1994) ou o local e extensão das lesões utilizando técnicas ponderadas de T2. Resumidamente, são obtidas MRI de linha de base. São utilizados o mesmo plano de imagem e posição do doente para cada estudo subsequente. 0 posicionamento e as sequências de imagem podem ser escolhidos para maximizar a deteção da lesão e facilitar o rastreamento da lesão. Podem ser utilizados o mesmo posicionamento e sequências de imagem em estudos subsequentes. A presença, local e extensão de lesões de MS podem ser determinados por radiologistas. As áreas das lesões podem ser destacadas e somadas fatia por fatia para a área de lesão total. Podem ser realizadas três análises: evidência de novas lesões, taxa de aparecimento de lesões ativas, alteração na percentagem na área de lesão (Paty et al., Neurology 43:665, 1993). A melhoria devido a terapia pode ser estabelecida por uma melhoria estatisticamente significativa num doente individual em comparação com a linha de base ou num grupo tratado versus um grupo placebo.

Os sintomas exemplificativos, associados com a esclerose múltipla, os quais podem ser tratados com os métodos aqui descritos, incluem: neurite ótica, diplopia, nistagmo, dismetria ocular, oftalmoplegia internuclear, fosfenos de movimento e som, defeito pupilar aferente, parésia, monoparésia, paraparésia, hemiparésia, quadraparésia, plegia, paraplegia, hemiplegia, tetraplegia, quadraplegia, espasticidade, disartria, atrofia muscular, espasmos, cãibras, hipotonia, clonus, mioclonia, miocíma, síndrome das pernas inquietas, gota de pé, reflexos disfuncionais, parestesia, anestesia, neuralgia, dor neuropática e neurogénica, lhermite, disfunção proprioceptiva, nevralgia do trigémeo, ataxia, tremor intencional, dysmetria, ataxia vestibular, vertigens, ataxia da fala, distonia, disdiadococinesia, micção frequente, espasticidade da bexiga, bexiga flácida, disssinergia detrusor-esfíncter, disfunção erétil, anorgasmia, frigidez, obstipação, urgência fecal, incontinência fecal, depressão, disfunção cognitiva, demência, mudanças de humor, labilidade emocional, euforia, síndrome bipolar, ansiedade, afasia, disfasia, fadiga, sintoma de uhthoff, refluxo gastroesofágico e distúrbios do sono.

Cada caso de MS apresenta um de diversos padrões de apresentação e subsequente curso. Mais geralmente, a MS, em primeiro lugar, manifesta-se, ela própria, como uma série de ataques, seguido por remissão completa ou parcial à medida que os sintomas diminuem misteriosamente, apenas para voltarem mais tarte após um período de estabilidade. Esta é denominada MS recidivante-remitente (RR) . A MS primária-progressiva (PP) é caracterizada por um declínio clínico gradual sem remissões distintas, embora possam existir estabilizações temporárias ou pequenos alívios dos sintomas. A MS secundária-progressiva (SP) começa com um curso recidivante-remitente seguido por um curso primário-progressivo posterior. Raramente, os doentes podem ter um curso progressivo-recidivante (PR), no qual a doença assume uma via progressiva pontuada por ataques agudos. PP, SP, e PR são, por vezes, agrupadas, e denominadas MS progressiva crónica.

Poucos doentes experienciam MS maligna, definida como um declínio rápido e implacável resultando em Incapacidade significativa ou mesmo morte pouco depois do início da doença. Este declínio pode ser parado ou desacelerado por administração de uma terapia de combinação aqui descrita. A administração de um anticorpo anti-a4 aqui apresentado pode ser eficaz para aliviar um ou mais sintomas da MS, tal como um ou mais dos sintomas descritos anteriormente. Por exemplo, a administração de um anticorpo anti-a4 aqui descrito pode ser utilizada para tratar esclerose múltipla progressiva primária ou secundária (PPMS ou SPMS, respetivamente) , e o tratamento com um anticorpo anti-a4 pode ser eficaz para impedir a recidiva.

Além ou antes dos estudos humanos, pode ser utilizado um modelo animal para avaliar a eficácia da utilização dos dois agentes. Um modelo animal exemplificativo para a esclerose múltipla é o modelo de ratinho de encefalite autoimune experimental (EAE) , e. g., como descrito em (Tuohy et al. (J. Immunol. (1988) 141: 1126-1130), Sobel et al. (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401), e Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129). Aos murganhos pode ser administrado um primeiro e segundo agentes aqui descritos antes da indução da EAE. Os murganhos são, depois, avaliados para critérios característicos para determinar a eficácia da utilização dos dois agentes no modelo.

Produção de Anticorpos

Os anticorpos recombinantes que se ligam a alfa-4 podem ser produzidos por métodos in vivo ou in vitro, tal como apresentação de fagos. Os métodos podem ser utilizados para fornecer CDR de anti-a4 para utilização em anticorpos enxertados com CDR aqui descritos. Além disso, os métodos tal como apresentação de fagos, podem ser utilizados para selecionar tais CDR no contexto das estruturas de linha germinativa aqui divulgadas, tal como utilizando uma biblioteca onde a estrutura é uma estrutura de linha germinativa. 0 documento EP 239400 (Winter et al.) descreve a alteração de anticorpos através da substituição (dentro de uma dada região variável) das regiões determinantes de complementaridade (CDR) para uma espécie com aquelas de outra. Os anticorpos substituídos com CDR podem ser menos propensos a desencadearem uma resposta imunitária em humanos em comparação com anticorpos quiméricos verdadeiros, uma vez que os anticorpos substituídos com CDR contêm consideravelmente menos componentes não humanos. (Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536). Tipicamente, CDR de um anticorpo murino substituídas nas regiões correspondentes num anticorpo humano utilizando tecnologia de ácidos nucleicos recombinante para produzir sequências que codificam o anticorpo substituído desejado. Os segmentos génicos da região constante humana do isotipo desejado (normalmente gama I para CH e capa for CL) podem ser adicionados e os genes da cadeia pesada e leve podem ser co-expressos em células de mamíferos para produzir o anticorpo solúvel. Também podem ser utilizadas grandes bibliotecas de apresentação de fagos não imunizados para isolar anticorpos com elevada afinidade que podem ser desenvolvidos como terapêuticas humanas utilizando tecnologia de fagos padrão (ver, e. g., Hoogenboom et al., (1998) Immunotechnology 4:1-20; e Hoogenboom et al., (2000) Immunol Today 2:371-8; U.S. 2003-0232333) .

Um anticorpo anti-a4 ou fragmento de anticorpo aqui descrito pode reconhecer os epítopos da subunidade a4 que estão envolvidos na ligação a um ligando cognato, e. g., VCAM-1 ou fibronectina. Os anticorpos aqui descritos podem inibir a ligação a um ou mais dos ligandos cognatos (e. g., VCAM-1 e fibronectina).

Em algumas formas de realização, os anticorpos aqui apresentados podem interagir com VLA-4 nas células, e. g., linfócitos, mas não provocam agregação celular.

Um anticorpo de ligação a a4 exemplif icativo tem uma ou mais CDR, e. g., tods as três CDR da cadeia pesada (HC) e/ou todas as três CDR da cadeia leve (LC) de um anticorpo particular aqui divulgado, ou CDR que são, no total, pelo menos, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% idênticas a um tal anticorpo.

Numa forma de realização, as ansas hipervariáveis Hl e H2 têm a mesma estrutura canónica que as de um anticorpo aqui descrito. Numa forma de realização, as ansas hipervariáveis Ll e L2 têm a mesma estrutura canónica que as de um anticorpo aqui descrito.

Numa forma de realização, a sequência de aminoácido das sequências do domínio variável da HC e/ou LC é, pelo menos, 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 ou 100% idêntica à sequência de aminoácido do domínio variável da HC e/ou LC de um anticorpo aqui descrito. A sequência de aminoácido da sequência do domínio variável da HC e/ou LC pode diferir em, pelo menos, um aminoácido, mas não mais do que dez, oito, seis, cinco, quatro, três ou dois aminoácidos relativamente à sequência correspondente de um anticorpo aqui descrito. Por exemplo, as diferenças podem estar principalmente ou totalmente nas regiões estruturais.

As sequências de aminoácidos das sequências de domínio variável das HC e LC podem ser codificadas por uma sequência de ácido nucleicos que híbrida sob condições de elevada restringência para uma sequência de ácido nucleicos aqui descrita ou uma que codifica um domínio variável ou uma sequência de aminoácidos aqui descrita. Numa forma de realização, as sequências de aminoácidos de um ou mais regiões estruturais (e. g., FRl, FR2, FR3, e/ou FR4) do domínio variável das HC e/ou LC são, pelo menos, 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 ou 100% idênticas às regiões estruturais correspondentes dos domínios variáveis da HC e LC de um anticorpo aqui descrito. Numa forma de realização, uma ou mais regiões estruturais da cadeia pesada ou leve (e. g. , HC FRl, FR2, e FR3) são, pelo menos, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 100% idênticas à sequência das regiões estruturais correspondentes de um anticorpo de linha germinativa humana.

Os cálculos da "homologia" ou "identidade de sequência" entre duas sequências (o termo e a expressão são aqui utilizados indistintamente) são realizados como se segue. As sequências são alinhadas para efeitos de comparação ótima (e. g., podem ser introduzidas lacunas numa ou em ambas de uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos para alinhamento ótimo e as sequências não homólogas podem ser desconsideradas para efeitos de comparação). O alinhamento ótimo é determinado como a melhor pontuação utilizando o programa GAP no pacote de software GCG embalagem com uma matriz de pontuação Blossum 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma penalidade de extensão de lacuna de 4, e uma penalidade de lacuna de estrutura de 5. Os resíduos de aminoácidos ou nucleótidos nas posições de aminoácidos ou posições de nucleótidos correspondentes são depois comparadas. Quando uma posição na primeira sequência está ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleótido que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição (como aqui utilizado, "identidade" do aminoácido ou ácido nucleico é equivalente a "homologia" do aminoácido ou ácido nucleico). A percentagem da identidade entre as duas sequências é em função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências.

Como aqui utilizado, a expressão "híbrida sob condições de elevada restringência" descreve as condições para hibridação e lavagem. 0 guia para realizar as reações de hibridação pode ser encontrado em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.I. (1989), 6.3.1-6.3.6. Os métodos aquosos e não aquosos são descritos nessa referência e pode ser utilizado qualquer deles. As condições de hibridação de elevada restringência incluem hibridação em SSC 6X a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em SSC 0,2X, SDS 0,1% a 65 °C, ou condições substancialmente semelhantes.

Produção de Anticorpos

Os anticorpos podem ser produzidos em células procarióticas e eucarióticas. Numa forma de realização, os anticorpos (e. g., scFv) são expressos numa célula de levedura, tal como Pichia (ver, e. g., Powers et al. (2001) J. Immunol. Methods 251:123-35), Hanseula, ou Saccharomyces.

Numa forma de realização, os anticorpos, particularmente os anticorpos comprimento total, e. g., IgG, são produzidos em células de mamíferos. As células hospedeiras de mamíferos exemplificativas para expressão recombinante incluem células do

Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr-, descritas em Urlaub e Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220, utilizadas com um marcador selecionável de DHFR, e. g. , como descrito em Kaufman e Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), linhas celulares linfociticas, e. g., células de mieloma NSO e células SP2, células COS, K562, e uma célula de um animal transgénico, e. g., um mamífero transgénico. Por exemplo, a célula é uma célula epitelial de mamífero.

Além da sequência de ácidos nucleicos que codifica o domínio da imunoglobulina, os vetores de expressão recombinantes podem transportar sequência de ácidos nucleicos adicionais, tal como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (e. g., origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (ver, e. g. , Patente U.S. N° 4399216, 4634665 e 5179017). Os genes marcadores selecionáveis exemplificativos incluem o gene da di-hidrofolato redutase (DHFR) (para utilização em células hospedeiras dhfr~ com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418).

Num sistema exemplificativo para a expressão recombinante de um anticorpo (e. g. , um anticorpo de comprimento total ou uma sua parte de ligação a antigénio), um vetor de expressão recombinante que codifica ambas a cadeia pesada do anticorpo e a cadeia leve do anticorpo é introduzido em células CHO dhfr~ por transfecção mediada por fosfato de cálcio. Dentro do vetor de expressão recombinante, os genes da cadeia pesada e leve do anticorpo são, cada, ligados operativamente a elementos reguladores potenciadores/promotores (e. g., derivados de SV40, CMV, adenovirus, e semelhantes, tais como um elemento regulador potenciador de CMV/promotor de AdMLP ou um elemento regulador potenciador de SV40/promotor de AdMLP) para dirigir níveis elevados de transcrição dos genes. 0 vetor de expressão recombinante também transporta um gene DHFR, o qual permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor utilizando seleção/amplificação com metotrexato. As células hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesada e leve do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado do meio de cultura. São utilizadas técnicas de biologia molecular padrão para preparar o vetor de expressão recombinante, para transfectar as células hospedeiras, para selecionados os transformantes, para cultivar as células hospedeiras, e para recuperar o anticorpo do meio de cultura. Por exemplo, alguns anticorpos podem ser isolados por cromatografia de afinidade com uma Proteína A ou Proteína G. Por exemplo, os anticorpos de ligação a a4 purificados podem ser concentrados para cerca de 100 mg/mL a cerca de 200 mg/mL utilizando técnicas de concentração de proteínas que são conhecidas na técnica.

Os anticorpos também podem incluir modificações, e. g., modificações que alteram a função de Fc, e. g., para diminuir ou remover a interação com um recetor de Fc ou com Clq, ou ambos. Por exemplo, a região constante IgG4 humana pode ter uma mutação Ser para Pro no resíduo 228 para fixar a região de articulação. A sequência de aminoácidos de uma Fc de IgG4 (articulação + domínio CH2 + CH3) é proporcionada na FIG. 5.

Noutro exemplo, a região constante IgGl humana pode ser mutada num ou mais resíduos, e. g., um ou mais dos resíduos 234 e 237, e. g., de acordo com a numeração na Patente U.S. N° 5648260.

Outras modificações exemplificativas incluem aquelas descritas na Patente U.S. N° 5648260.

Para alguns anticorpos que incluem um domínio Fc, o sistema de produção de anticorpo pode ser concebido para sintetizar anticorpos nos quais a região Fc é glicosilada. Noutro exemplo, o domínio Fc de moléculas IgG é glicosilado na asparagina 297 no domínio CH2 (ver FIG. 5) . Esta asparagina é o sítio para a modificação com oligossacáridos tipo biantenário. Esta glicosilação participa em funções efetoras mediadas por recetores Fcy e complemento Clq (Burton e Woof (1992) Adv. Immunol. 51:1-84; Jefferis et al. (1998) Immunol. Rev. 163:59-76). Ο domino Fc pode ser produzido num sistema de expressão de mamíferos que glicosila apropriadamente o resíduo correspondente à asparagina 297. O domínio Fc também pode incluir outras modificações pós-tradução eucarióticas.

Outras modificações do domínio Fc adequadas incluem aquelas descritas no documento W02004/029207. Por exemplo, o domínio Fc pode ser um XmAb® Fc (Xencor, Monrovia, CA) . O domínio Fc, ou um seu fragmento, pode ter uma substituição numa região de ligação ao Recetor Fcy (FcyR) , tais como os domínios e fragmentos descritos no documento W005/063815. Em algumas formas de realização, o domínio Fc, ou um seu fragmento, possui uma substituição numa região de ligação ao Receptor Fc neonatal (FcRn), tais como os domínios e fragmentos descritos no documento WO05047327. Noutras formas de realização, o domínio Fc é uma cadeia simples, ou seu fragmento, ou sua versão modificada, tal como aqueles descritos no documento WO2008143954. Outras modificações de Fc adequadas são conhecidas e descritas na técnica.

Os anticorpos também podem ser produzidos por um animal transgénico. Por exemplo, a Patente U.S. N° 5849992 descreve um método para expressar um anticorpo numa glândula mamária de um mamífero transgénico. Um transgene é construído de modo a incluir um promotor específico de leite e sequências de ácidos nucleicos que codificam o anticorpo de interesse, e. g., um anticorpo aqui descrito, e uma sequência sinal para secreção. 0 leite produzido pelas fêmeas de tais mamíferos transgénicos inclui, aí segregado, o anticorpo de interesse, e. g., um anticorpo aqui descrito. 0 anticorpo pode ser purificado a partir do leite ou, para algumas aplicações, utilizado diretamente.

Os anticorpos podem ser modificados, e. g., com uma unidade que melhorada a sua estabilização e/ou retenção em circulação, e. g., no sangue, soro, linfa, lavagem broncoalveolar, ou outros tecidos, e. g., em, pelo menos, 1,5, 2, 5, 10 ou 50 vezes.

Por exemplo, um anticorpo de ligação a VLA-4 pode ser associado com um polímero, e. g., um polímero substancialmente não antigénico, tais como a óxido de polialquileno ou um óxido de polietileno. Os polímeros adequados irão variar substancialmente em peso. Podem ser utilizados polímeros possuindo pesos médios numéricos moleculares que variam desde cerca de 200 a cerca de 35000 daltons (ou cerca de 1000 a cerca de 15000, e 2000 a cerca de 12500).

Por exemplo, um anticorpo de ligação a VLA-4 pode ser conjugado a um polímero solúvel em água, e. g., um polímero de polivinilo hidrofílico, e. g., álcool polivinílico ou polivinilpirrolidona. Uma lista não limitativa de tais polímeros incluem homopolímeros de óxido de polialquileno, tais como polietilenoglicol (PEG) ou polipropilenoglicóis, polióis polioxietilenados, os seus copolímeros e os seus copolímeros de bloco, desde que a solubilidade em água dos copolímeros de bloco seja mantida. Polímeros úteis adicionais incluem polioxialquilenos, tais como polioxietileno, polioxipropileno, e copolímeros de bloco de polioxietileno e polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polissacáridos ramificados ou não ramificados que compreendem os monómeros sacarídicos D-manose, D- e L-galactose, fucose, frutose, D-xilose, L-arabinose, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónicp (e. g. , ácido polimanurónico, ou ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glicose e ácido neuramínico, incluindo homopolissacáridos e heteropolissacáridos, tais como lactose, amilopectina, amido, hidroxietilamido, amilose, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glicogénio ou a subunidade polissacarídica de mucopolissacáridos ácidos, e. g., ácido hialurónicp; polímeros de álcoois de açúcar, tais como polissorbitol e polimanitol; heparina ou heparona.

Agentes secundários exemplificativos

Em alguns casos, as formulações aqui descritas, e. g., formulações contendo um anticorpo de ligação a alfa-4, incluem um segundo agente, ou são administradas em combinação com uma formulação contendo um segundo agente.

Numa implementação, o anticorpo de ligação a a4 e segundo agente é proporcionado como uma co-formulação, e a co-formulação é administrada ao indivíduo. É ainda possível, e. g., pelo menos, 24 horas antes ou após a administração da co-formulação, administrar separadamente uma dose da formulação do anticorpo de ligação a α4 e, depois, uma dose de uma formulação contendo o segundo agente. Noutra implementação, o anticorpo e o segundo agente são proporcionados como formulações separadas, e o passo de administrar inclui administrar sequencialmente o anticorpo e o segundo agente. As administrações sequenciais podem ser proporcionadas no mesmo dia (e. g., com um intervalo de uma hora um do outro ou, pelo menos, um intervalo de 3, 6 ou 12 horas) ou em diferentes dias.

Em geral, o anticorpo e o segundo agente são administrados, casa, como uma pluralidade de doses separadas no tempo. 0 anticorpo e o segundo agente são geralmente administrados, cada, de acordo com um regime. 0 regime para um ou ambos pode ter uma periocidade regular. 0 regime para o anticorpo pode ter uma periocidade diferente do regime para o segundo agente, e. g., um pode ser administrado mais frequentemente que o outro Numa implementação, um do anticorpo e o segundo agente é administrado uma vez por semana e o outro uma vez por mês. Noutra implementação, um do anticorpo e o segundo agente é administrado continuamente, e. g. , durante um período de mais do que 30 minutos mas menos do que 1, 2, 4 ou 12 horas, e o outro é administrado como um bólus. O anticorpo e o segundo agente podem ser administrados por qualquer método apropriado, e. g., subcutaneamente, intramuscularmente, ou intravenosamente.

Em algumas formas de realização, cada do anticorpo e do segundo agente é administrado na mesma dose em que cada é prescrito para monoterapia. Noutras formas de realização, o anticorpo é administrado numa dosagem que é igual ou inferior a uma quantidade necessária para eficácia se administrado por si só. Do mesmo modo, o segundo agente pode ser administrado numa dosagem que é igual ou inferior a uma quantidade necessária para eficácia se administrado por si só.

Os exemplos não limitativos dos segundos agentes para tratar esclerose múltipla em combinação com um anticorpo de ligação a a4 incluem: interferões, e. g., interferão beta-la humano (e. g., AVONEX® ou Rebif®) ) e interferão beta-lb (BETASERON™; interferão beta humano substituído na posição 17; Berlex/Chiron); acetato de glatirâmero (também denominado Copolímero 1, Cop-1; COPAXONE™; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.);

Rituxan® rituximab) ou outro anticorpo anti-CD20, e. g., um que compete com ou liga-se a um epítopo sobreposto com rituximab; mixtoxantrona (NOVANTRONE®, Lederle); um quimioterapêutico, e. g. , clabribina (LEUSTATIN®) , azatioprina (IMURAN®), ciclofosfamida (CYTOXAN®), ciclosporina-A, metotrexato, 4-aminopiridina, e tizanidina; um corticosteroide, e. g., metilprednisolona (MEDRONE®, Pfizer), prednisona; uma imunoglobulina, e. g. , Rituxan® (rituximab); CTLA4 Ig; alemtuzumab (MabCAMPATH®) ou daclizumab (um anticorpo que se liga a CD25); estatinas; e antagonistas de TNF. 0 acetato de glatirâmero é uma proteína formada a partir de uma cadeia aleatória de aminoácidos - ácido glutâmico, lisina, alanina e tirosina (por conseguinte, GLATirâmero). 0 acetato de glatirâmero pode ser sintetizado em solução a partir destes aminoácidos a uma razão de, aproximadamente, 5 partes de alanina para 3 partes de lisina, 1,5 partes de ácido glutâmico e 1 parte de tirosina utilizando anidridos de ácido N-carboxiamino.

Os segundos agentes adicionais incluem anticorpos ou antagonistas de outras citocinas humanas ou fatores de crescimento, por exemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF e PDGF. Ainda outros segundos agentes exemplificativos incluem anticorpos para moléculas de superfície celular, tais como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 ou os seus ligandos. Por exemplo, daclizubmab é um anticorpo anti-CD25 que pode amenizar a esclerose múltipla.

Ainda outros anticorpos exemplificativos incluem anticorpos que proporcionam uma atividade de um agente aqui descrito, tal como um anticorpo que se acopla com um recetor de interferão, e. g., um recetor beta de interferão. Tipicamente, em implementações nas quais o segundo agente inclui um anticorpo, este liga-se a uma proteína alvo que não VLA-4 ou que não a integrina a4 ou, pelo menos, um epítopo em VLA-4 que não aquele reconhecido pelo primeiro agente.

Ainda outros segundos agents exemplificativos adicionais incluem: FK506, rapamicina, micofenolato de mofetil, leflunomida, fármacos anti-inflamatórios não esteroides (NSAID), por exemplo, inibidores de fosfodiesterase, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interferem com a sinalização por citocinas pró-inflamatórias, como aqui descrita, inibidores de enzima conversora de IL-Ιβ (e. g., Vx740), anti-P7s, PSGL, inibidores de TACE, inibidores da sinalização de células T, tais como inibidores de cinase, inibidores de metaloproteinase, sulfasalazina, azatloprina, 6-mercaptopurinas, inibidores da enzima conversora de angiotensina, recetores de citocinas solúveis e os seus derivados, como aqui descritos, citocinas anti-inflamatórias (e. g., IL-4, IL-10, IL-13 e TGF).

Em algumas formas de realização, um segundo agente pode ser utilizado para tratar um ou mais sintomas ou efeitos secundários de MS. Tais agentes incluem, e. g., amantadina, baclofeno, papaverina, meclizina, hidroxizina, sulfametoxazole, ciprofloxacina, docusato, pemolina, dantroleno, desmopressina, dexametasona, tolterodina, fenitoina, oxibutinina, bisacodilo, venlafaxina, amitriptilina, metenamina, clonazepam, isoniazida, vardenafil, nitrofurantoina, muciloide hidrofilico de psilio, alprostadilo, gabapentina, nortriptilina, paroxetina, brometo de propantelina, modafinilo, fluoxetina, fenazopiridina, metilprednisolona, carbamazepina, imipramina, diazepam, sildenafil, bupropiona e sertralina. Muitos segundos agentes que são moléculas pequenas têm um peso molecular entre 150 e 5000 Daltons.

Os exemplos de antagonistas de TNF incluem anticorpos quiméricos, humanizados, humanos ou produzidos in vitro (ou os seus fragmentos de ligação a antigénio) para TNF (e. g., TNF α humano), tais como D2E7, (anticorpo de TNFa humano, Patente U.S. N° 6258562; BASF), CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (anticorpo anti-TNFa humanizado; Celltech/Pharmacia), cA2 (anticorpo anti-TNFa quimérico; REMICADE™, Centocor); fragmentos de anticorpo anti-TNF (e. g., CPD870); fragmentos solúveis dos recetores de TNF, e. g., recetores de TNF humanos p55 ou p75 ou os seus derivados, e. g., 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusão recetor de TNF-IgG com 75 kD, ENBREL™; Immunex; ver, e. g., Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A), p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusão recetor de TNF-IgG com 55 kD (LENERCEPT™)); antagonistas enzimáticos, e. g., inibidores da enzima conversora de TNFa (TACE) (e. g., um derivado de ácido alfa-sulfonil-hidroxâmico, documento WO 01155112, e inibidor TACE de N-hidroxiformamida GW 3333, -005 ou -022); e TNF-bp/s-TNFR (proteína de ligação a TNF solúvel; ver, e. g. , Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N° 9 (suplemento), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, p. 37-42).

Além de um segundo agente, é também possível administrar outros agentes ao indivíduo. Contudo, em algumas formas de realização, não são administrados proteína ou produto biológico, além do anticorpo de ligação a a4 e segundo agente, ao indivíduo como uma composição farmacêutica. O anticorpo de ligação a a4 e o segundo agente podem ser os únicos agentes que são administrados por injeção. Em formas de realização nas quais o segundo agente é uma proteína recombinante, o anticorpo de ligação a a4 e o segundo agente podem ser os únicos agentes recombinantes administrados ao indivíduo ou, pelo menos, os únicos agentes recombinantes que modulam as respostas imunitária ou inflamatória. Ainda noutras formas de realização, o anticorpo de ligação a α4 por si só é ο único agente recombinante ou o único produto biológico administrado ao indivíduo. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como aquele geralmente entendido por um especialista na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da invenção, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos.

EXEMPLO

Exemplo 1. Os anticorpos anti-VLA-4 variantes são mais potentes que o HPl/2 humanizado.

Os anticorpos anti-VLA-4 foram construídos utilizando a estrutura de linha germinativa IGKV4-1 (ou conceção Ll e L2) ou AAH7033.1 manipulada com a linha germinativa (para a conceção L3) para a cadeia VL e estrutura de linha germinativa IGHVl-f para VH. Estes anticorpos tiveram menos retromutações que o anticorpo HPl/2 humanizado descrito na Patente U.S. N° 6602503.

Variações da cadeia pesada

As sequências de três variações da cadeia pesada são mostradas na FIG. 1 como Conceção HO, Conceção Hl e Conceção H2. Cada conceção tem as CDR de HPl/2 murino enxertadas na estrutura de IGHVl-f. A Conceção HO não inclui retromutações das regiões estruturais, enquanto as Conceções Hl e H2 têm vários graus de retromutações nas sequências das regiões estruturais para otimizar a afinidade do anticorpo humanizado.

Variações da cadeia leve

As sequências de quatro variações da cadeia leve são mostradas na FIG. 2 como Conceção LO, Conceção Ll, Conceção L2 e Conceção L3 (também denominadas LO, Ll, L2, L3) . Cada conceção tem as CDR de HPl/2 murino enxertadas na estrutura de linha germinativa. A estrutura de linha germinativa IGKV4-1 foi utilizada para as Conceções LO, Ll e L2, e a estrutura manipulada com a linha germinativa AAH70335 foi utilizada para a Conceção L3. A Conceção LO não inclui retromutações das regiões estruturais, enquanto as Conceções Ll, L2 e L3 possuem vários graus de retromutações nas regiões estruturais para otimizar a afinidade dos anticorpos humanizados.

Os resultados dos ensaios ELISA de competição são mostrados na Tabela 1 e FIG. 3. Nesta experiência, α4β1 foi pré-incubado com mAb de teste e, depois, foi utilizado HPl/2 murino como reagente de competição. Os resultados desta experiência indicaram que os anticorpos possuindo as cadeias leves L2 ou L3 foram mais potentes que o anticorpo humanizado HuHPl/2 descrito na Patente U.S. N° 6602503. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo, e na FIG. 3. A cadeia pesada (Hl) nos anticorpos para este ensaio teve a sequência da "Conceção Hl" mostrada na FIG. 1, enquanto Ll refere-se à Conceção Ll na FIG. 2.

Tabela 1. Ensaio de Competição por ELISA

Na Tabela 1, o mAb quimérico é anticorpo HPl/2 quimerizado, onde as cadeias pesada e leve variáveis murinas estão fundidas geneticamente a regiões constantes de IgGl humanas. Este anticorpo é essencialmente idêntico na afinidade de ligação ao anticorpo HPl/2 murino original (Sanchez-Madrid et al.r Eur. J. Immunol. 16:1343-1349, 1996). Os resultados da experiência indicam que é possível melhorar a afinidade do anticorpo monoclonal relativamente à sua sequência parental murina através da humanização na estrutura aceitadora manipulada com a linha germinativa.

Outro ensaio de competição compara a afinidade e ligação dos novos anticorpos com o anticorpo anti-a4 21.6 humanizado (Tysabri® (natalizumab)) descrito no documento U.S. 5840299. Nesta experiência, foi ensaiada a ligação da mistura de HPl/2 de ratinho com o mAb de teste para α4β1. Os resultados desta experiência são mostrados na FIG. 4 e na Tabela 2 abaixo, e indicam que os anticorpos concebidos recentemente são cerca de 10 vezes mais potentes que natalizumab.

Tabela 2. Ensaio de Competição por ELISA

Exemplo 2. 0 HPl/2 humanizado (HuHPl/2) liga-se a VLA-4 em linhas celulares tumorais. A ligação do anticorpo anti-VLA-4 HuHPl/2 a uma variedade de linhas celulares foi testada por citometria de fluxo. A ligação foi testada nas linhas celulares de CLL (leucemia linfocítica crónicas) Mecl e JMl; nas linhas celulares de MM (mieloma múltiplo) U266 e H929; e nas linhas celulares de AML (leucemia mielogénica aguda) HL60 e KG1. HuHPl/2 ligou-se a todas as linhas celulares tumorais testadas (FIG. 6). Os dados de citometria de fluxo foram utilizados para calcular os valores de EC50 para a ligação do anticorpo a cada das diferentes linhas celulares. Esta informação é mostrada abaixo na Tabela 3.

Verificou-se também que HuHPl/2 bloqueia a adesão das linhas celulares de AML à fibronectina (FN) e proteína de fusão VCAMl-Ig. Para testar se o anticorpo poderia bloquear a adesão, as linhas celulares de AML HL60 ou KG1 foram deixadas a aderir a poços revestidos com FN (FIG. 7A) ou poços revestidos com VCAMl-Ig (FIG. 7B) na presença de concentrações crescentes de HPl/2 ou anticorpo de controlo de isotipo. HuHPl/2 bloqueou a adesão de ambos os tipos de linhas celulares a poços revestidos com FN e poços revestidos com VCAMl. A inibição máxima da ligação da célula HL60 a ambos os ligandos foi obtida com 20 pg/mL de HuHPl/2 (FIG . 7C) .

Verificou-se também que HuHPl/2 bloqueia a adesão das linhas celulares de MM à FN e proteína de fusão VCAMl-Ig. As linhas celulares de MM U266 e H929 foram deixadas a aderir a poços revestidos com FN (FIG. 8A) ou poços revestidos com VCAMl-Ig (FIG. 8B) na presença de concentrações crescentes de HPl/2 ou anticorpo de controlo de isotipo. HuHPl/2 bloqueou a adesão de ambos os tipos de linhas celulares a poços revestidos com FN e com VCAMl-Ig. A inibição máxima da ligação da célula U266 a ambos os ligandos foi obtida com 20 pg/mL de HuHPl/2 (FIG. 8C).

Verificou-se também que HuHPl/2 bloqueia a adesão das linhas celulares de CLL à FN e proteína de fusão VCAMl-Ig. As linhas celulares de CLL Mecl e JMl foram deixadas a aderir a poços revestidos com FN (FIG. 9A) ou poços revestidos com VCAMl-Ig (FIG. 9B) na presença de concentrações crescentes de HPl/2 ou anticorpo de controlo de isotipo. HuHPl/2 bloqueou a adesão de ambos os tipos de linhas celulares a poços revestidos com FN e com VCAMl-Ig. A inibição máxima da ligação da célula Mecl a ambos os ligandos foi obtida com 20 pg/mL de HuHPl/2 (FIG. 9C).

Os valores de IC50 para a ligação de HuHPl/2 às linhas celulares tumorais foram calculados a partir dos dados mostrados nas FIG. 7-9. Estes dados são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3. Quantificação de HuHPl/2 em linhas celulares tumorais

Outras formas de realização estão nas reivindicações.

Lisboa, 10 de julho de 2017

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de anticorpo recombinante ou um seu fragmento de ligação a a4, compreendendo uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável, em que: (a) a cadeia pesada variável compreende a sequência estrutural da cadeia pesada variável de IGHVl-f e as CDR da cadeia VH do anticorpo murino HPl/2, em que CDRl compreende a sequência GFNIKDTYM, CDR2 compreende a sequência RIDPASGDTKYDPKFQV e CDR3 compreende a sequência GMWVSTGYALDF; e, (b) a cadeia leve variável compreende a sequência estrutural da cadeia leve variável de IGKV4-1 e as CDR da cadeia VL do anticorpo murino HPl/2, em que CDRl compreende a sequência KASQSVTNDVA, CDR2 compreende a sequência YASNRYT e CDR3 compreende a sequência QQDYSSPYT, em que: (i) os resíduos de aminoácidos das posições estruturais 1, 67 e 87 da cadeia leve variável de acordo com o esquema de numeração de Rabat são substituídos com resíduos não humanos, em que o resíduo não humano na posição estrutural 1 é serina (S), o resíduo não humano na posição estrutural 67 é tirosina (Y) e o resíduo não humano na posição estrutural 87 é fenilalanina (F); e (ii) os resíduos de aminoácidos das posições estruturais 24 e 94 da cadeia pesada variável de acordo com o esquema de numeração de Rabat são substituídos com resíduos não humanos, em que o resíduo não humano na posição estrutural 24 é alanina (A) e o resíduo não humano na posição estrutural 94 é ácido aspártico (D); e em que a molécula de anticorpo recombinante ou o seu fragmento de ligação a a4 se liga a VLA-4.
2. Método de preparação de um anticorpo anti-a4 recombinante ou um seu fragmento de ligação a a4, compreendendo (a) proporcionar uma célula hospedeira compreendendo uma sequência de ADN que codifica a molécula de anticorpo recombinante ou um seu fragmento de ligação a a4, da reivindicação 1 e (b) cultivar a célula para produzir a molécula de anticorpo anti-a4 recombinante ou seu fragmento de ligação a oé4 .
3. Molécula de anticorpo recombinante ou seu fragmento de ligação a a4, da reivindicação 1, para utilização como um medicamento no tratamento de um doente.
4. Molécula de anticorpo recombinante ou seu fragmento de ligação a a4, para utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o doente tem um cancro.
5. Molécula de anticorpo recombinante ou seu fragmento de ligação a a4, para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o doente tem um tumor sólido, uma malignidade hematológica, um mieloma múltiplo ou leucemia mieloide aguda (AML).
6. Molécula de anticorpo recombinante ou seu fragmento de ligação a a4, para utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o doente tem um distúrbio inflamatório, esclerose múltipla, asma, artrite reumatoide, diabetes, neurite ótica, doença de Crohn, um distúrbio agudo, uma lesão da medula espinal ou lesão cerebral traumática.
7. Molécula de anticorpo recombinante ou seu fragmento de ligação a a4, para utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o tratamento compreende ainda administrar ao doente um segundo agente terapêutico, opcionalmente selecionado de um agente trombolítico, um agente quimioterapêutico, um agente neuroprotetor, um agente anti-inflamatório, um esteroide, uma citocina ou um fator de crescimento. Lisboa, 10 de julho de 2017