KR101809878B1 - 항-히알루로난제 투여와 관련된 유해 부작용의 치료 - Google Patents

항-히알루로난제 투여와 관련된 유해 부작용의 치료 Download PDF

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Abstract

본원에서는 대상에 PEG 히알루로난 분해 효소의 전신적 투여의 유해 효과를 개선하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 PEG화된 히알루로난 분해 효소, 특히 PEG화된 히알루로니다제, 예컨대 임의의 동물 또는 박테리아 히알루로니다제를 대상에 전신으로 투여하는 단계 및 상기 유해효과를 개선하는데 충분한 양의 코르티코스테로이드를 투여하는 단계를 포함한다. 또한 단일제 치료 또 조합 치료를 위한 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

항-히알루로난제 투여와 관련된 유해 부작용의 치료 {TREATMENT OF THE ADVERSE SIDE-EFFECTS ASSOCIATED WITH ADMINISTRATION OF AN ANTI-HYALURONAN AGENT}
본 발명은 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제의 용도와 관련된 방법으로서, 단일제 또는 조합으로 치료에 사용할 수 있는 방법을 제공한다.
히알루로난 (히알루론산: HA)은 많은 조직, 특히 연성 결합조직의 세포외 기질, 에서 발견되는 다당류이다. HA는 또한 포유류의 피부, 연골, 및 관절액에서 많이 발견된다. 히알루로난은 눈의 유리체액의 주요한 구성요소이기도 하다. HA는 물과 혈장 단백질의 항상성 유지 등 각종 생리적인 과정에서 역할을 한다(Laurent TC 등 (1992) FASEB J 6: 2397-2404). 특정 질환 및 장애가 히알루로난의 발현 및/또는 생산에 관련되어 있다. 히알루로니다제는 히알루로난을 분해하는 효소이다. HA 분해를 촉매함으로써, 히알루로니다제는 단일제로 또는 다른 치료제와 조합으로 HA 또는 기타 글리코사미노글리칸의 축적과 관련된 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제의 용도와 관련된 방법으로서, 단일제 또는 조합으로 치료에 사용할 수 있는 방법을 제공한다.
관련 출원
우선권의 이익은 Harold Michael Shepard, Curtis Thompson, Ziaoming Li , 및 Gregory Frost의 "PEG화 히알루로니다제의 투여와 관련된 유해 부작용 및 부작용을 개선 또는 예방하는 방법"이라는 제목의 2010.7.20.자 미국 가출원번호 61/399,993호, 및 Harold Michael Shepard, Curtis Thompson, Ziaoming Li , 및 Gregory Frost의 "항-히알루로난제의 투여와 관련된 유해 부작용 및 부작용을 개선 또는 예방하는 방법"이라는 제목의 2010.10.14자 미국 가출원번호 61/455,260호에 대해 주장된다.
본 출원은 미국 가출원번호 61/399,993호, 미국 가출원번호 61/455,260호에
대해 우선권을 주장하는, "항-히알루로난제의 투여와 관련된 유해 부작용 및 부작용을 개선 또는 예방하는 방법"이라는 제목으로 동일한 일자에 출원된 미국 특허출원번호 13/135,817호와 관련된다. 상기 언급된 관련출원의 대상물은 그 전체가 참조로서 포함된다.
본 출원은 미국 가출원번호 61/124,278호, 미국 가출원번호 61/130,357호, 미국 가출원번호 61/195,624호에 대해 우선권을 주장하는, 2009년 4월 14일에 출원되어 US2010003238로 공개된 미국 특허출원번호 12/386,222와 관련된다. 이 출원은 또한 미국 가출원번호 61/124,278호, 미국 가출원번호 61/130,357호, 미국 가출원번호 61/195,624호에 대해 우선권을 주장하는, 2009년 4월 14일에 출원되어 WO2009128917로 공개된 국제 PCT 출원번호 PCT/US2009/002352와 관련된다. 상기 주지된 관련출원의 대상물은 그 전체가 참조로서 포함된다.
전자적으로 제공된 서열목록의 참조에 의한 포함
서열목록의 전자 버전이 본원과 함께 제출되며, 이의 내용은 그 전체로 참조로써 포함된다. 상기 전자 파일은 824 킬로바이트 크기이며, 3084seqPC1.txt.라 명명되었다.
요약
항-히알루로난제 투여로 인해 대상에서 나타나는 유해 효과를 이를 개선하는 데 충분한 양의 코르티코스테로이드를 투여함으로써 개선 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 코르티코스테로이드는 글루코코르티코이드일 수 있다. 예를 들면, 글루코코르티코이드는 코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 및 프레드니손일 수 있고, 특히 덱사메타손이다. 일 예로, 코르티코스테로이드는 경구 투여된다.
본원에서 제공되는 방법의 일부 실시예에서, 유해 효과는 근골격계 부작용이다. 예를 들어 유해 효과는 근육 및 관절의 통증, 상지의 뻣뻣함, 하지의 뻣뻣함, 경련, 근염, 전신의 근육통 및 근압통, 쇠약, 피로, 및 무릎 및 팔꿈치 관절의 운동 범위 감소이다. 전형적으로, 유해 효과는 항-히알루로난제의 용량-제한 독성(DLT)에서 야기된 것이다. 상기 방법에서, 상기 코르티코스테로이드는 항-히알루로난제의 DLT를 야기하는 투여량을 제거하거나 증가시키기 위한 양으로 투여된다. 또 다른 실시예에서, 유해 효과는 독성 척도 상의 3등급이고, 상기 코르티코스테로이드는 상기 등급을 1등급 또는 2등급으로 감소시키기 위한 양 또는 상기 코르티코스테로이드 투여하고 수 시간 이내에 해소되는 3등급으로 감소시키기 위한 양으로 투여된다.
이 방법에서, 항-히알루로난제는 경구, 정맥내, 피하, 근육내, 종양내, 피내, 국소적, 경피, 직장 또는 표피하로 투여된다. 일반적으로, 항-히알루로난제는 히알루로난 분해 효소 또는 히알루로난 합성 억제제이다. 예를 들어, 항-히알루로난제는 HA 합성효소에 대한 센스 또는 안티센스 핵산 분자 또는 저분자 약물과 같은 히알루로난 합성을 억제하는 제제이다. 예를 들어, 항-히알루로난제는 4-메틸움벨리페론(4-methylumbelliferone (MU) ) 또는 그 유도체, 또는 레플루노마이드 또는 그 유도체이다. 이러한 유도체는, 예를 들어, 6,7-디하이드록시-4-메틸 쿠마린 또는 5,7-디하이드록시-4-메틸 쿠마린인 4-메틸움벨리페론(MU)의 유도체를 포함한다. 다른 실시예에서, 항-히알루로난제는 중합체에 컨주게이션됨으로써 변형된 히알루로난 분해 효소이다. 중합체는 PEG이고 항-히알루로난제는 PEG화 히알루로난 분해 효소가 될 수 있다.
본원에서 PEG화 히알루로난 분해 효소의 대상에 전신적 투여로 야기되는 유해 효과를 개선하기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 PEG화 히알루로난 분해 효소, 특히 PEG화 히알루로니다제, 예컨대 동물 또는 박테리아 히알루로니다제를 대상에 전신적으로 투여하고 상기 유해 효과를 개선하기에 충분한 양의 코르티코스테로이드를 투여하는 것을 포함한다. 이 방법의 일 실시예에서, 코르티코스테로이드는 경구 투여된다. 또 다른 실시예에서, PEG화 히알루로난 분해 효소는 정맥내 투여된다. 코르티코스테로이드 및/또는 PEG화 히알루로난 분해 효소는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 정맥내, 경구 또는 근육내와 같은 경로로 전신적으로 투여되어 영향을 미칠 수 있다.
상기 제공되는 방법에서, PEG화 히알루로난 분해 효소 투여와 관련된 유해 효과는 근골격계 부작용이다. 예를 들어 근골격계 부작용은 근육 및 관절의 통증, 상지 및 하지의 뻣뻣함, 경련, 근염, 전신의 근육통 및 근압통, 쇠약, 피로, 및/또는 무릎 및 팔꿈치 관절의 운동 범위 감소이다.
일부 실시예에서, 코르티코스테로이드는 글루코코르티코이드이다. 예를 들면, 코르티코스테로이드는 코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 및 프레드니손에서 선택되는 글루코코르티코이드이다. 특정 실시예에서, 글루코코르티코이드는 덱사메타손이다.
상기 제공되는 방법에서, 코르티코스테로이드는 항-히알루로난제 투여 전, 투여와 동시에, 투여와 함께 간헐적으로, 또는 투여 후에 투여된다. 상기 방법의 일 구현예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소와 공동-투여된다. 예를 들어, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소 투여 전에 투여된다. 이 실시예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소 투여 전 약 0.5 분, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간 또는 그 이상 전에 투여된다. 특정 실시예에서, 코르티코스테로이드 투여는 PEG화 히알루로난 분해 효소 투여 전 적어도 또는 약 1시간 또는 그 이상 전에 투여된다.
이 방법의 또 다른 구현예로서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소의 투여 후에 투여된다. 예를 들어, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소의 투여 후 약 0.5 분, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간 또는 그 이상 후에 투여된다. 또 다른 실시예에서, 코르티코스테로이드의 투여는 PEG화 히알루로난 분해 효소 투여 후 적어도 8시간 내지 12시간 후에 투여된다.
이 방법의 또 다른 구현예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소 투여 전 또는 후에 투여된다. 예를 들어, 코르티코이스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소 투여 직전 1분 내지 5분 전에 투여되고 PEG화 히알루로난 분해 효소 투여 8시간 후에 투여된다. 또 다른 실시예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소 투여 1시간 전 및 PEG화 히알루로난 분해 효소 투여 후 8 내지 12시간 후에 투여된다. 본원의 제공되는 방법에서, 코르티코스테로이드 투여 시점이 PEG화 히알루로난 분해 효소 투여와 관련된 1개 이상의 부작용을 개선시키는 한 임의의 투약 요법이 고려될 수 있다.
이 방법의 일부 실시예에서, 코르티코스테로이드는 약 0.1 내지 20 mg, 0.1 내지 15 mg, 0.1 내지 10 mg, 0.1 내지 5 mg, 0.2 내지 20 mg, 0.2 내지 15 mg, 0.2 내지 10 mg, 0.2 내지 5 mg, 0.4 내지 20 mg, 0.4 내지 15 mg, 0.4 내지 10 mg, 0.4 내지 5 mg, 0.4 내지 4 mg, 1 내지 20 mg, 1 내지 15 mg 또는 1 내지 10 mg 사이의 양으로 투여된다. 특정 실시예에서, 코르티코스테로이드는 0.4 에서 20 mg의 양으로 투여된다. 코르티코스테로이드의 예시적 투여량은 PEG화 히알루로난 분해 효소 투여와 관련된 1개 이상의 부작용을 개선하기 위한 임의의 용량이 될 수 있다.
상기 방법의 일 구현예로, PEG화 히알루로난 분해 효소는 이를 투여하는 대상의 체중의 약 0.0005 mg/kg, 0.0006 mg/kg, 0.0007 mg/kg, 0.0008 mg/kg, 0.0009 mg/kg, 0.001 mg/kg, 0.0016 mg/kg, 0.002 mg/kg, 0.003 mg/kg, 0.004 mg/kg, 0.005 mg/kg, 0.006 mg/kg, 0.007 mg/kg, 0.008 mg/kg, 0.009 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.016 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.30 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.40 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg.kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9 mg/kg, 9.5 mg/kg 또는 10 mg/kg의 양으로 투여된다.
이 방법의 다른 구현예로, PEG화 히알루로난 분해 효소는 이를 투여하는 대상의 체중의 약 10 유닛/kg (U/kg), 16 U/kg, 32 U/kg, 64 U/kg, 100 U/kg, 200 U/kg, 300 U/kg, 400 U/kg, 500 U/kg, 600 U/kg, 700 U/kg, 800 U/kg, 900 U/kg, 1,000 U/kg, 2,000 U/kg, 3,000 U/kg, 4,000 U/kg, 5,000 U/kg, 6,000 U/kg, 7,000 U/kg, 8,000 U/kg, 9,000 U/kg, 10,000 U/kg, 12,800 U/kg, 20,000 U/kg, 32,000 U/kg, 40,000 U/kg, 50,000 U/kg, 60,000 U/kg, 70,000 U/kg, 80,000 U/kg, 90,000 U/kg, 100,000 U/kg, 120,000 U/kg, 140,000 U/kg, 160,000 U/kg, 180,000 U/kg, 200,000 U/kg, 220,000 U/kg, 240,000 U/kg, 260,000 U/kg, 280,000 U/kg, 300,000 U/kg, 320,000 U/kg, 350,000 U/kg, 400,000 U/kg, 450,000 U/kg, 500,000 U/kg, 550,000 U/kg, 600,000 U/kg, 650,000 U/kg, 700,000 U/kg, 750,000 U/kg, 800,000 U/kg의 양으로 투여된다.
이 방법의 특정 구현예로, PEG화 히알루로난 분해 효소는 이를 투여하는 대상의 체중의 약 10 내지 320,000 유닛/kg 사이의 양으로 투여되고 코르티코스테로이드는 약 0.4 내지 20 mg 사이의 양으로 투여된다.
이 방법의 일부 구현예에서, 상기 방법에서 사용되는 PEG화 히알루로난 분해 효소는 히알루로니다제이고, 예를 들면 임의의 동물 또는 박테리아 히알루로니다제이다. 일부 실시예에서, 히알루로니다제는 가용성 히알루로니다제이다. 예를 들어, 히알루로니다제는 인간, 원숭이, 소, 양, 랫트, 마우스 또는 기니피그 PH20에서 선택된 가용성 PH20 히알루로니다제이다. 특정 실시예에서, 히알루로니다제는 인간 PH20이다. 다른 실시예에서, 히알루로니다제는 동물로부터 유래된 히알루로니다제이다. 예를 들어, 동물로부터 유래된 히알루로니다제는 정제된 소 고환 히알루로니다제 또는 정제된 양 고환 히알루로니다제로부터 선택된다. 이 방법의 특정 측면으로서, PEG화 히알루로난 분해 효소는 PEG화 PH20(PEGPH20)이고 코르티코스테로이드는 덱사메타손이다.
일 구현예에서, 이 방법에서 사용되는 히알루로니다제는 중성 활성을 가지고 N-글리코실화되어 있다. 일부 측면에서, 중성 활성을 가지고 N-글리코실화된 히알루로니다제 폴리펩티드는 전장(full length) PH20이거나 PH20의 C-말단이 절단된 형태로서, 전장 PH20은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 중성 활성을 가지고 N-글리코실화된 히알루로니다제 폴리펩티드는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 절단된 형태와 적어도 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지는 히알루로니다제 폴리펩티드이다. 또다른 측면에서, 중성 활성을 가지고 N-글리코실화된 히알루로니다제 폴리펩티드는 전장의 PH20이거나 C-말단이 절단된 PH20인 히알루로니다제 폴리펩티드로서, 아미노산 치환이 있어서, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 절단된 형태와 적어도 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 히알루로니다제 폴리펩티드이다. 일부 측면에서, 이 방법에 이용되는 히알루로니다제 폴리펩티드는 서열번호 49로 기재되는 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산 분자에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 이 방법에서 사용되는 히알루로니다제 폴리펩티드는 CHO 세포로부터 분비된다. 특정 실시예에서, PH20은 rHuPH20으로 명명된다.
이 방법의 일 구현예로, 히알루로니다제는 적어도 하나의 N-결합된 당 부분(N-linked sugar moiety)을 포함하는, 중성 활성을 가진 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드이다. 특정 측면에서, N-결합된 당 부분은 폴리펩티드의 아스파라긴 잔기에 공유결합된다. 다른 측면에서, 히알루로니다제는 적어도 2개 위치에서 글리코실화된다.
일부 측면에서, 본원에서 제공하는 방법에 사용되는 히알루로니다제에 있어서, 가용성 히알루로니다제는 서열번호 1에 포함된 아미노산 서열 또는 서열번호 1에 포함된 아미노산 서열과 적어도 약 91%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고; 여기서 상기 히알루로니다제는 가용성이고 C-말단에서 서열번호 1의 아미노산 잔기 467 내지 483 사이(467번째 아미노산 잔기 내지 483번째 아미노산 잔기 사이) 또는 이와 함께 약 91% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 에 있어서의 대응하는 아미노산 잔기인 아미노산 잔기에서 절단된다. 특정 실시예에서, 히알루로니다제는 서열번호 1의 1 내지 482번째 아미노산을 암호화하는 핵산 분자 또는 서열번호 1의 36 내지 482번째 아미노산을 암호화하는 핵산 분자에 의해 암호화된다. 다른 실시예에서, 가용성 히알루로니다제는 적어도 서열번호 1의 36 내지 464번째 아미노산 잔기를 포함한다. 다른 실시예에서, 가용성 히알루로니다제는 467 내지 483번째 아미노산 잔기 사이의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 절단되어 있는, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 히알루로니다제는 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483번째 아미노산 잔기 중으로부터 선택된 아미노산 잔기에서 절단되어 있다. 다른 실시예에서, 히알루로니다제는 서열번호 1의 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 및 500번째 아미노산 잔기로부터 선택된 잔기가 절단되어 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본원의 방법에서 사용되는 히알루로니다제 폴리펩티드는 포유류세포에서 생산되고 분비되는 C-말단이 절단된 형태이다. 특정 실시예에서, 포유류 세포는 CHO 세포이다.
본원에서 제공되는 방법에서, 히알루로난 분해 효소는 PEG화된다. 특정 실시예에서, PEG 부분은 분지된다(branched). 일부 실시예에서, PEG 부분은 mPEG-SBA (5 kDa), mPEG-SBA (20 kDa), mPEG-SBA (30 kDa), mPEG-SMB (20 kDa), mPEG-SMB (30 kDa), mPEG-부티르알데히드 (30 kDa), mPEG-SPA (20 kDa), mPEG-SPA (30 kDa), mPEG2-NHS (10 kDa 분지된), mPEG2-NHS (20 kDa 분지된), mPEG-NHS (40 kDa 분지된), mPEG2-NHS (60 kDa 분지된), PEG-NHS-비오틴 (5 kDa 비오틴화), PEG-p-니트로페닐-카르보네이트 (30 kDa) 및 PEG-프로피온 알데히드 (30 kDa) 가운데서 선택된다.
본원의 방법에서, 유해 효과는 히알루로난 관련 질환 또는 상태의 항-히알루로난제 치료로 인해 야기될 수 있다. 일 실시예로, 히알루로난 관련 질환 또는 상태는 고간질액압, 암, 부종, 디스크 압박 및 염증성 질환과 관련된 것이다. 예를 들어, 질환 또는 상태는 부종이고 그 부종은 장기 이식, 뇌졸중, 또는 뇌외상에 의해 유발된 것일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 염증성 질환은 류마티스성 관절염, 경피증, 치주염, 건선, 동맥경화증, 만성 상처, 크론병, 궤양성 대장염 및 염증성 장 질환을 포함한다.
추가적인 실시예에서, 유해 효과는 종양, 예를 들어 고형 종양인 암의 항-히알루로난제에 의한 치료로 인해 야기된 것이다. 종양은, 동일한 조직 유형의 비암조직 또는 동일한 종양 유형의 비전이성 종양과 비교할 때, 히알루로난의 증가된 세포 및/또는 기질 발현을 갖는 것일 수 있다. 일 실시예에서, 암은 말기암, 전이성 암 및 미분화성 암이다. 또 다른 실시예에서, 암은 난소암, 상피내암(in situ carcinoma (ISC)), 편평세포암(SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 뇌암 및 대장암이다.
또한 본원은 항-히알루로난제 치료와 관련된 유해 효과를 개선하기 위한 코르티코스테로이드의 용도 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한 본원은 히알루로난 관련 질환 또는 상태 치료를 위해 사용하기 위한 중합체에 컨주게이션된 히알루로난 분해 효소(즉, 중합체에 컨주게이션됨으로써 변형된 히알루로난 분해 효소)의 치료 방법 및 용도를 제공한다. 이러한 방법 또는 용도에서, 히알루로난 분해 효소는 (대상의) 약 0.01 ㎍/kg 에서 15 ㎍/kg 사이의 양으로 투여된다. 예를 들어, 본원에서 제공하는 방법에서, 히알루로난 분해 효소는 약 0.05 ㎍/kg 에서 10 ㎍/kg, 0.75 ㎍/kg 에서 7.5 ㎍/kg 또는 1.0 ㎍/kg 에서 3.0 ㎍/kg 사이 범위의 투여량으로 투여된다. 투여 빈도는 주 2회, 주 1회, 매 14일마다 1회, 매 21일마다 1회, 또는 월 1회이다. 특정 실시예에서, 히알루로난 분해 효소는 투여 주기가 1주, 2주, 3주 또는 4주인 투약 요법에 따라 투여된다. 투여 주기는 수 회 반복될 수 있다. 또한 일부 실시예에서, 1주기의 투여 후에, 미리 결정된 기간동안 투여를 중단하고 그리고나서 다음 주기의 투여를 재개한다. 일부 실시예에서, 첫 주기의 투여에 있어서의 투여 빈도는 다음 주기의 투여에 있어서의 투여 빈도와 동일하거나 다르다. 특정 실시예에서, 히알루로난 분해 효소는 첫 주기의 투여에 있어서 주 2회 투여되고, 다음 주기의 투여 동안에 주 1회 투여된다. 그러한 실시예에서, 투여 주기는 4주이다.
예를 들어, 히알루로난 분해 효소는 약 0.5 ㎍ 에서 1450 ㎍ 또는 150 유닛 (U) 에서 45,000 유닛 사이 범위의 양의 단일 투여량 투여를 위해 제형화된다. 히알루로난 분해 효소는 약 0.5 ㎍ 에서 1450 ㎍ 또는 150 유닛 (U) 에서 45,000 유닛 사이 범위의 양에서 치료제로서 제형화된다. 이러한 방법 및 용도에 있어서, 상기 히알루로난 분해 효소는 약 0.5 ㎍ 에서 1450 ㎍ 또는 150 유닛 (U) 에서 45,000 유닛 사이의 유닛 투여량으로 적어도 4주의 주기로 적어도 주 1회의 빈도로 투여될 수 있다. 특정 실시예에서 단일 투여량 투여 또는 유닛 투여량은 0.75 ㎍ 에서 1125㎍ ; 3.75 ㎍ 에서 750 ㎍ ; 56 ㎍ 에서 565 ㎍ ; 또는 75 ㎍ 에서 225 ㎍ 사이 범위의 양이다. 또 다른 실시예에서, 단일 투여량 투여 또는 유닛 투여는 약 24 유닛 (U) 에서 36,000 U; 120 U 에서 24,000 U; 1500 U 에서 18,000 U; 또는 2400 U 에서 7200 U 사이 범위의 양이다.
본원에서 제공되는 임의의 방법 또는 용도에서, 특히 히알루로난 관련 질환 또는 상태의 치료에 있어서, 대상으로부터의 시료에 있어서의 히알루로난 발현은 치료 전에 측정된다. 히알루로난 관련 질환 또는 상태는 고간질액압, 암, 부종, 디스크 압박 및 염증성 질환과 관련된 것이다. 예를 들어, 질환 또는 상태는 장기 이식, 뇌졸중, 또는 뇌외상에 의해 유발된 부종일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 질환 또는 상태는 염증성 질환이고 이는 류마티스성 관절염, 경피증, 치주염, 건선, 동맥경화증, 만성 상처, 크론병, 궤양성 대장염 및 염증성 장 질환이다. 특정 실시예에서, 질환 또는 상태는 암이고 암은 종양이다. 예를 들어 종양은 고형 종양이다. 종양은 동일한 조직 유형의 비암조직 또는 동일한 종양 유형의 비전이성 종양과 비교할 때, 히알루로난의 증가된 세포 및/또는 기질 발현이 있을 수 있다. 일 실시예에서, 암은 말기암, 전이성 암 및 미분화성 암이다. 또 다른 실시예에서, 암은 난소암, 상피내암(ISC), 편평세포암(SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 뇌암 또는 대장암이다.
본원에 기재된 또는 당업계에 공지되어 있는 임의의 히알루로난 분해 효소는 히알루로난 관련 질환 또는 상태 치료를 위한 방법 또는 용도에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 코르티코스테로이드가 더 투여된다. 예를 들면, 코르티코스테로이드는 코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 및 프레드니손에서 선택되는 글루코코르티코이드이다. 특정 실시예에서, 글루코코르티코이드는 덱사메타손이다.
본 발명의 방법의 일 구현예로, 방법은 제 2 작용제 또는 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 측면에서, 제 2 작용제 또는 암 치료제는, 예를 들어, 외과 수술, 방사선 치료, 화학 치료제, 생물학적 제제, 폴리펩티드, 항체, 펩티드, 저분자, 유전자 치료 벡터, 바이러스 및 DNA이다. 특정 실시예에서, 제 2 작용제는 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알렘투주맙; 알리트레티노인(9-시스-레티노산); 알로퓨리놀; 알트레타민; 알보시딥; 암바존; 암보마이신; 아메탄트론; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 아낙시론; 안시타빈; 안트라마이신; 아파지퀀; 아르기메스나; 삼산화비소; 아스파라기나제; 아스페를린; 아트리무스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바녹산트론; 바타불린; 바티마스타트; 라이브(live) BCG; 베낙시빈; 벤다무스틴; 벤조데파; 벡사로텐; 베바시주맙; 비칼루타미드; 비에타세르핀; 비리코다르; 비산트렌; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신; 보르테조밉; 브레퀴나르; 브로피리민; 부도티탄; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카네르티닙; 카페시타빈; 카라세미드; 카르베티머; 카보플라틴; 카르보퀀; 카르모푸르; 폴리페프로산과 함께 카르무스틴; 카르무스틴; 카루비신; 카르젤레신; 세데핑골; 셀레콕시브; 세마도틴; 클로람부실; 시오테로넬; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 클란페누르; 클로파라빈; 크리스나톨; 시클로포스파미드; 리포좀 시타라빈; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 리포좀 다우노루비신; 다우노루비신/다우노마이신; 다우노루비신; 데시타빈; 데니류킨 디프티톡스; 덱스니굴디핀; 덱소나플라틴; 덱스라족산; 데자구아닌; 디아지퀀; 디브로스피듐; 디에노게스트; 디날린; 디세르몰리드; 도세탁셀; 도페퀴다르; 독시플루리딘; 리포좀 독소루비신; 독소루비신 HCL; 독소루비신 HCL 리포좀 주사; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에코무스틴; 에다트렉세이트; 에도테카린; 에플로르니틴; 엘라크리다르; 엘리나피드; 엘리엇 B 용액; 엘사미트루신; 에미테푸르; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 엔자스타우린; 에피프로피딘; 에피루비신; 에포에틴 알파; 엡탈로프로스트; 에르불로졸; 에소루비신; 에스트라무스틴; 에타니다졸; 에토글루시드; 에토포시드 포스페이트; 에토포시드 VP-16; 에토포시드; 에토프린; 엑세메스탄; 엑시술린드; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 플록수리딘; 플루다라빈; 플루오로우라실; 5-플루오로우라실; 플루옥시메스테론; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신; 포트레타민; 풀베스트란트; 갈라루비신; 갈로시타빈; 겜시타빈; 겜투주맙/오조가미신; 게로퀴놀;기마테칸; 기메라실; 글록사존; 글루포스파미드; 고세렐린 아세테이트; 히드록시우레아; 이브리투모맙/티욱세탄; 이다루비신; 이포스파미드; 일모포신; 일로마스타트; 이매티닙 메실레이트; 이멕손; 임프로술판; 인디술람; 인프로퀀; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파; 인터페론 베타; 인터페론 감마; 인터페론; 인터류킨-2 및 다른 인터류킨 (재조합 인터류킨 포함); 인토플리신; 이오벤구안 [131-I]; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이르소글라딘; 익사베필론; 케토트렉세이트; L-알라노신; 란레오티드; 라파티닙; 레독산트론; 레트로졸; 류코보린; 류프롤리드; 류프로렐린 (류프로렐리드); 레바미솔; 렉사칼시톨; 리아로졸; 로바플라틴; 로메트렉솔; 로무스틴/CCNU; 로무스틴; 로나파르닙; 로속산트론; 루르토테칸; 마포스파미드; 만노술판; 마리마스타트; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민; 메클로레타민/질소 머스타드; 메게스트롤 아세테이트; 메게스트롤; 멜렌게스트롤; 멜팔란; 멜팔란sl/L-PAM; 메노가릴; 메피티오스탄; 머캅토퓨린; 6-머캅토퓨린; 메스나; 메테신드; 메토트렉세이트; 메톡살렌; 메토미데이트; 메토프린; 메투레데파; 미보플라틴; 미프록시펜; 미소니다졸; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토플락손; 미토길린; 미토구아존; 미토말신; 미토마이신 C; 미토마이신; 미토나피드; 미토퀴돈; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론; 미토졸로미드; 미보불린; 미조리빈; 모파로텐; 모피다몰; 무브리티닙; 미코페놀산; 난드롤론 펜프로피오네이트; 네다플라틴; 넬자라빈; 네모루비신; 니트라크린; 노코다졸; 노페투모맙; 노갈라마이신; 놀라트렉세드; 노르토픽산트론; 옥트레오티드; 오프렐베킨; 오르마플라틴; 오르타탁셀; 오테라실; 옥살리플라틴; 옥시수란; 옥소페나르신; 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파투빌론; 페가데마제; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; 펠데신; 펠리오마이신; 펠리트렉솔; 페메트렉세드; 펜타무스틴; 펜토스타틴; 페플로마이신; 페르포스파미드; 페리포신; 피코플라틴; 피나피드; 피포브로만; 피포술판; 피르페니돈; 피록산트론; 픽산트론; 플레비트렉세드; 플리카마이신 미트라마이신; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피머; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프로파미딘; 프로스피듐; 퓨미테파; 퓨로마이신; 피라조푸린; 퀴나크린; 라니무스틴; 라스부리카제; 리보프린; 리트로술판; 리툭시맙; 로글레티미드; 로퀴니멕스; 루포크로모마이신; 사바루비신; 사핑골; 사르그라모스팀; 사트라플라틴; 세브리플라틴; 세무스틴; 심트라젠; 시조피란; 소부족산; 소라페닙; 스파르포세이트; 스파르포스산; 스파르소마이신; 스피로게르마늄; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스쿠알라민; 스트렙토니그린; 스트렙토바리신; 스트렙토조신; 수포스파미드 술로페누르; 수니티닙 말레이트; 6-티오구아닌 (6-TG); 타세디날린; 탈크; 탈이소마이신; 탈리무스틴; 타목시펜; 타리퀴다르; 타우로무스틴; 테코갈란; 테가푸르; 텔록산트론; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드/VM-26; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아미프린; 티아조푸린; 틸로미솔; 틸로론; 팀코다르; 티모나시크; 티라파자민; 토픽산트론; 토포테칸; 토레미펜; 토시투모맙; 트라벡테딘(엑테이나시딘 743); 트라스투주맙; 트레스톨론; 트레티노인/ATRA; 트리시리빈; 트릴로스탄; 트리메트렉세이트; 트리플라틴 테트라니트레이트; 트립토렐린; 트로포스파미드; 투불로졸; 우베니멕스; 우라실 머스타드; 우레데파; 발루비신; 발스포다르; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 빈데신; 비네피딘; 빈플루닌; 빈포르미드; 빈글리시네이트; 빈류시놀; 빈류로신; 비노렐빈; 빈로시딘; 빈트립톨; 빈졸리딘; 보로졸; 크산토마이신 A (구아메사이클린); 제니플라틴; 질라스코르브 [2-H]; 지노스타틴; 졸레드로네이트; 조루비신 및 조수퀴다르로부터 선택되는 암 치료제이다.
가용성 히알루로니다제 및 그 제제를 포함해서, 본 발명에 제공되는 예시적인 히알루로난 분해 효소는, 예를 들어 미국 공개번호 US20040268425, US20050260186, US20060104968, US20090123367, US20090181013, US20090181032, US20090214505, US20090253175 및 US20100143457 및 미국 특허번호 7,767,429에 기술되어 있다.
본원에서 제공된 방법에 있어서, PEG화 히알루로난 분해 효소가 투여되는 대상은 인간 대상이다. 이 방법의 특정 측면에서, 대상은 암이 있고 치료는 PEG화 히알루로난 분해 효소를 전신적으로 투여하는 단계를 포함한다.
중합체에 컨주게이션된 히알루로난 분해 효소를 사용하는 본원에서 제공되는 임의의 방법 또는 용도에 있어서, 특이적 활성은 적어도 또는 약 20,000 U/mg, 25,000 U/mg, 30,000 U/mg, 31,000 U/mg, 32,000 U/mg, 33,000 U/mg, 34,000 U/mg, 35,000 U/mg, 36,000 U/mg, 37,000 U/mg, 38, 000 U/mg, 39,000 U/mg, 40,000 U/mg, 45,000 U/mg, 50,000 U/mg, 55,000 U/mg, 60,000 U/mg 또는 그 이상이 될 수 있다.
본원에서 정맥내 투여를 위하여 제형화된 히알루로난 분해 효소를 포함하는 첫 번째 조성물; 및 코르티코스테로이드를 포함하는 두 번째 조성물을 포함하는 조합을 제공한다. 특히, 본원에서 제공되는 조합에서 히알루로난 분해 효소는 PEG화 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PEG화 PH20(예컨대, PEGPH20)이다. 본원에서 제공된 조합의 다른 실시예에서, 코르티코스테로이드는 덱사메타손과 같은 글루코코르티코이드이다.
개요
A. 정의
B. 개요
1. 항-히알루로난제 및 히알루로난 관련 질환, 상태 및/또는 장애
2. 항-히알루로난제 치료와 관련된 유해 효과
3. 항- 히알루로난제의 유해 효과를 개선하기 위한 코르티코스테로 이드의 용도
C. 항-히알루로난제
1. 히알루로난 합성 억제제
2. 히알루로난 분해 효소
a. 히알루로니다제
ⅰ. 포유류-형 히알루로니다제
ⅱ. 박테리아 히알루로니다제
ⅲ. 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다제
b. 기타 히알루로난 분해효소
c. 가용성 히알루로난 분해효소
ⅰ. 가용성 인간 PH20
ⅱ. rHuPH20
d. 히알루로난 분해효소의 글리코실화
e. 변형된 (중합체- 컨주게이션된 ) 히알루로난 분해 효 소
PEG화 가용성 히알루로난 분해효소
D. 히알루로난 분해 효소의 핵산 및 암호화된 폴리펩티드를 제조하는 방법
1. 벡터 및 세포
2. 발현
a. 원핵세포
b. 효모 세포
c. 곤충 세포
d. 포유류 세포
e. 식물
3. 정제 기술
4. 히알루로난 분해효소 폴리펩티드의 PEG화
E. 코르티코스테로이드
F. 항- 히알루로난제의 유해 효과를 개선하기 위한 코르티코스테로이드의 용도
1. 약학적 조성물 및 제형
2. 투여량 및 투여
a. 코르티코스테로이드
b. 항-히알루로난제
ⅰ. 레플루노마이드 및 유도체
ⅱ. 히알루로난 분해 효소
3. 조합 치료
항암제 및 기타 치료
4. 포장 및 제조품
G. 항-히알루로난제 및 코르티코스테로이드의 활성을 평가하는 방법
1. 부작용을 평가하는 방법
2. 항-히알루로난 활성
a. 히알루로난 분해 효소의 활성을 평가하기 위한 분석 법
b. 동물 모델에서의 분석법
c. 인간에서의 분석법
d. 약동학
H. 히알루로난 관련 상태, 질환, 장애를 치료하는 데 있어 항- 히알루로난제의 용도
1. 치료를 위한 대상의 선택 및 치료 효과의 평가
a. 히알루로난 관련 질환 마커 검출을 위한 분석법
b. 대조군 시료에 상대적인 히알루로난 관련 마커의 검출
2. 암치료에서의 용도
I. 실시예
A. 정의
달리 정의된 바 없다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명들이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본원의 전체 개시를 통해 언급되는 모든 특허, 특허출원, 공개된 출원 및 공보, Genbank 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 다른 출판물은, 달리 알려진 바 없다면, 그 전체가 참조로써 삽입된다. 본원에서 용어들에 대한 복수의 정의가 존재하는 경우, 본 섹션의 것들이 우선한다. URL 또는 다른 그러한 식별자 또는 주소로 참조된 경우, 그러한 식별자는 바뀔 수 있으며, 인터넷 상의 특정 정보는 변화될 수 있으나, 동등한 정보가 인터넷을 검색하여 발견될 수 있다. 여기의 참조는 그 이용가능성 및 상기 정보의 공중의 보급성을 증명한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "유해 효과" 또는 "부작용"은, PEGPH20과 같은 PEG화 히알루로난 분해 효소 등 항-히알루로난제를 대상에 투여시 발생하는 해롭고 유해한 및/또는 의도치 않은 효과를 의미한다. 부작용의 일 예는 근골격계 부작용이다. 부작용 또는 유해 효과는 독성에 따라 등급이 매겨지며 다양한 독성 척도가 각 등급에 대한 정의를 내리는 데 사용된다. 그러한 척도의 예시는 World Health Organization or Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) 척도에 해당하는 National Cancer Institute Common Toxicity Criteria version 2.0 이다. 일반적으로, 이 척도는 다음과 같다: 1등급:=약한 정도의 부작용; 2등급=중등도의 부작용; 3등급=심한 정도의 부작용; 4등급=생명을 위협하는 정도 또는 장애를 유발하는 정도의 부작용; 5등급=치명적. 심각성의 등급을 매기는 일은 숙련된 의사 또는 기타 보건 전문가에 의해 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "용량-제한 독성(DLT)"은 더 큰 용량을 투여하는 것을 막을 정도로 심한 부작용을 유발하는 약물의 투여량을 의미한다. 치료 프로토콜, 치료 대상인 질환, 투약 요법 및 치료될 환자에 따라 DLT를 판단하거나 결정하는 것은 숙련된 의사의 숙련 수준 내이다. 항-히알루로난제 치료(코르티코스테로이드의 존재 또는 부재시에)에 있어서 DLT의 예시적인 정의는 항-히알루로난 치료와 관련된 유해 효과 또는 부작용이 관찰되고 독성 척도가 적어도 3등급 또는 그 초과이며 혈액학적 독성이 아닌 경우, 또는 치료를 계속 하는 경우에도 해소되지 않는 2등급 독성으로서 프로토콜 치료에 응할 환자의 능력을 제한하는 경우, 또는 4등급 또는 지연되는 3등급 혈액학적 독성이다. DLT는 예방적인 항-구토제 치료가 없이 발생한 오심 또는 구토 및 그러한 요법으로 효과적으로 치료되는 오심 또는 구토, 또는 수 시간 내지 24시간 이내에 스스로 해소되는 부작용을 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "근골격계 효과" 또는 "근골격계 부작용"은 근육, 힘줄, 인대, 뼈, 관절 및 관련 조직의 시스템에 미치는 효과를 의미한다. 근골격계 부작용은 근육과 관절의 통증, 상하지의 경직, 경련, 근염, 전신의 근육통 및 근압통, 쇠약, 피로 및 무릎과 팔꿈치의 운동 범위 감소를 포함한다. 이 역시 독성 척도에 기초하여 관찰된 또는 측정된 근골격계 부작용의 등급을 부여하는 것은 숙련된 의사의 수준 내이다. 관찰된 근골격계 부작용의 DLT를 부여하는 것은 또한 숙련된 의사의 수준 내이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 부작용 또는 유해 사례, 또는 그 변형의 "개선", "예방", 또는 "감소" 는 유해 효과 또는 부작용을 영구적으로 또는 일시적으로, 지속적으로 또는 한시적으로 경감시키는 것을 의미한다. 본원의 목적상, 근골격계 부작용과 같은 항-히알루로난제 투여에 따른 부작용은 코르티코스테로이드 존재시에 부재시보다 부작용에 대한 독성 척도에 따라 측정된 심각성의 등급이 감소 또는 경감되는 경우 코르티코스테로이드에 의해 개선된 것으로 간주된다. 일 실시예에서, 항-히알루로난제(단회, 수회 투여 또는 투약 요법 때문에) 투여시 관찰된 또는 측정된 3등급 이상의 독성이 코르티코스테로이드 존재하에서 1등급 또는 2등급으로 감소된 경우 부작용이 개선된 것으로 본다. 다른 예에서, 투여된 항-히알루로난제의 DLT가 코르티코스테로이드 투여에 따라 제거 또는 증가되었을 때 부작용은 개선된 것이다. 예를 들어, 투여된 항-히알루로난제로부터의 0.05 mg/mL의 DLT가 코르티코스테로이드를 대상에 투여함으로써 제거하거나 증가하여 동일한 투여량 또는 더 높은 투여량의 항-히알루로난제가 감소된 부작용을 갖은 채 투여될 수 있을 때 또는 DLT가 0.05 mg/mL을 초과하도록, 예를 들어 0.5 mg/mL까지, 증가될 수 있을 때, 부작용이 개선된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 부작용의 "예방(preventing)"은 부작용에 이르는 위험을 감소시키거나 줄이는 것을 의미한다. 따라서, 부작용을 예방하는 것은 본원에서 치료이고, 예컨대 코르티코스테로이드, 가 부작용이 나타나기 전에 투여된다, 즉 항-히알루로난제 투여 전 또는 함께 투여된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "정맥내 투여"는 치료제를 정맥내로 직접 전달하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 항-히알루로난제는 히알루로난(HA) 합성 또는 분해를 조절함으로써 조직 또는 세포의 히알루로난 수준을 변화시키는 임의의 제제를 의미한다. 본원의 목적에 대하여, 항-히알루로난제는 그 제제가 없을 때와 비교했을 때 조직 또는 세포의 히알루로난 수준을 감소시킨다. 그러한 약물은 HA 합성효소(HA synthase, HAS) 및 기타 효소 또는 히알루로난 대사와 관련된 수용체를 암호화하는 유전물질의 발현을 조절하는 화합물, 또는 HAS 작용 또는 활성을 포함하는 히알루로난을 합성 또는 분해하는 단백질을 조절하는 화합물을 포함한다. 이 제제에는 저분자, 핵산, 펩티드, 단백질 또는 기타 화합물들이 포함된다. 예를 들어, 항-히알루로난제는 안티센스 또는 센스 분자, 항체, 효소, 저분자 억제제 및 HAS 기질 유사체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 히알루로난 분해효소(hyaluronan degrading enzyme)는 히알루로난 중합체(또한 히알루론산 또는 HA라 언급됨)을 더 작은 분자량의 절편으로 절단하는 것을 촉매하는 효소를 나타낸다. 히알루로난 분해효소의 예는 히알루로니다제, 및 히알루로난을 탈중합하는 능력을 가지는 특정 콘드로이티나제(chondroitinase) 및 리아제(lyase)이다. 히알루로난 분해효소인 예시적인 콘드로이티나제는 콘드로이틴 ABC 리아제(또한 콘드로이티나제 ABC로 공지됨), 콘드로이틴 AC 리아제(또한 콘드로이틴 술페이트 리아제 또는 콘드로이틴 술페이트 엘리미나제로 공지) 및 콘드로이틴 C 리아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 콘드로이틴 ABC 리아제는 2개의 효소, 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제(EC 4.2.2.20) 및 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제(EC 4.2.2.21)를 포함한다. 예시적인 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제 및 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 플라보박테리움 헤파리넘(Flavobacterium heparinum) (프로테우스 불가리스 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제는 서열번호 98에 기재되어 있다; Sato 등(1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46)에서 유래된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 박테리아 유래 콘드로이티나제 AC 효소는 서열번호 99에 기재된 플라보박테리움 헤파리넘 빅티발리스 바덴시스(Flavobacterium heparinum Victivallis vadensis), 및 아르쓰로박터 아우레스켄스(Arthrobacter aurescens (Tkalec 등(2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst 등(1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 박테리아 유래 콘드로이티나제 C 효소는 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 플라보박테리움(Flavobacterium) (Hibi 등(1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci 등(1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda 등(1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133)에서 유래된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다제는 히알루로난 분해 효소의 한 분류이다. 히알루로니다제는 박테리아 히알루로니다제(EC 4.2.2.1 또는 EC 4.2.99.1), 거머리, 기타 기생동물, 및 갑각류 동물 유래 히알루로니다제(EC 3.2.1.36), 및 포유류-형 히알루로니다제(EC 3.2.1.35)를 포함한다. 히알루로니다제는 또한 쥐, 개, 고양이, 토끼, 조류, 소, 양, 돼지, 말, 어류, 개구리, 박테리아, 및 각종 거머리, 기타 기생동물 및 갑각류 유래와 같은 비-인간 기원의 임의의 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비-인간 히알루로니다제로서는 젖소 (서열번호 10, 11, 64 및 BH55(미국특허 제5,747,027호, 및 제5,827,721호), 장수말벌(서열번호 12 및 13), 꿀벌(서열번호 14), 흰얼굴 호박벌(서열번호 15), 페이퍼 말벌(서열번호 16), 마우스(서열번호 17-19, 32), 돼지(서열번호 20-21), 랫트(서열번호 22-24, 31), 토끼(서열번호 25), 양(서열번호 26, 27, 63 및 65), 침팬지(서열번호 101), 레서스 원숭이(서열번호 102), 오랑우탄(서열번호 28), 사이노몰거스 원숭이(서열번호 29), 기니피그(서열번호 30)로부터 유래된 히알루로니다제, 아르쓰로박터속(Arthrobacter sp .) (균주 FB24)(서열번호 67), 브델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus)(서열번호 68), 프로피오니박테륨 아크네(Propionibacterium acnes)(서열번호 69), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae)(서열번호 70); 18RS21(서열번호 71); 혈청형 Ia(서열번호 72); 혈청형 III(서열번호 73); 스타피로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(균주 COL(서열번호 74); 균주 MRSA252(서열번호 75 및 76); 균주 MSSA476(서열번호 77); 균주 NCTC 8325(서열번호 78); 균주 소 RF122(서열번호 79 및 80); 균주 USA300(서열번호 81), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Staphylococcus aureus)(서열번호 82); 균주 ATCC BAA255/R6(서열번호 83); 혈청형 2, 균주 D39/NCTC7466(서열번호 84), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(혈청형 M1)(서열번호 85); 혈청형 M2, 균주 MGAS10270(서열번호 86); 혈청형 M4, 균주 MGAS10750(서열번호 87); 혈청형 M6(서열번호 88); 혈청형 M12, 균주 MGAS2096(서열번호 89 및 90); 혈청형 M12, 균주 MGAS9429(서열번호 91); 혈청형 M28(서열번호 92), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)(서열번호 93-95); 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri )(균주 ATCC 700601/ES114(서열번호 96) 및 히알루론산에 특이적이고 콘드로이틴 또는 콘드로이틴 술페이트를 절단하지 않는 스트렙토마이세스 히알루로니티쿠스 히알루로니다제 효소 (Ohya, T. 및 Kaneko, Y.(1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607)를 포함한다. 히알루로니다제는 또한 인간 유래의 것을 포함한다. 인간 히알루로니다제의 예시는 HYAL1(서열번호 36), HYAL2(서열번호 37), HYAL3(서열번호 38), HYAL4(서열번호 39) 및 PH20(서열번호 1)를 들 수 있다. 또한, 히알루로니다제 중에서 양 및 소 PH20, 가용성 인간 PH20 및 가용성 rHuPH20 등의 가용성 히알루로니다제를 포함한다. 시판되는 소 또는 양 가용성 히알루로니다제의 예시는 비트라제®(양 히알루로니다제), 암파다제®(소 히알루로니다제) 및 히다제™(소 히알루로니다제)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "정제된 소 고환 히알루로니다제"는 소 고환 추출물로부터 정제된 소 히알루로니다제를 의미한다(미국 특허번호 2,488,564, 2,488,565, 2,806,815, 2,808,362, 2,676,139, 2,795,529, 5,747,027 및 5,827,721 참조). 시판되는 정제된 소 고환 히알루로니다제의 예시는 암파다제® 및 히다제™를 포함하고, Sigma Aldrich, Abnova, EMD Chemicals, GenWay Biotech, Inc., Raybiotech, Inc., 및 Calzyme 사에서 구입할 수 있는 소 히알루로니다제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한 서열번호 190-192 중 임의의 서열로 기재되는 핵산 분자의 발현으로 제조되는 재조합 소 히알루로니다제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "정제된 양 고환 히알루로니다제"는 양 고환 추출물로부터 정제된 양 히알루로니다제를 의미한다(미국 특허번호 2,488,564, 2,488,565 및 2,806,815 및 국제 PCT 공개번호 WO2005/118799 참조). 시판되는 정제된 양 고환 히알루로니다제의 예시는 비트라제®를 포함하고, Sigma Aldrich, Cell Sciences, EMD Chemicals, GenWay Biotech, Inc., Mybiosource.com 및 Raybiotech, Inc. 사에서 구입할 수 있는 양 히알루로니다제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한 서열번호 66 및 193-194 중 임의의 서열로 기재되는 핵산 분자의 발현으로 제조되는 재조합 양 히알루로니다제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "PH20"은 정자에서 발생하고 중성-활성을 가진 히알루로니다제 유형을 의미한다. PH20은 정자 표면에서 발생하며, 리소좀에서 유래된 첨체 내에 존재하는데, 첨체 내막에 결합되어 있다. PH20은 인간, 침팬지, 사이노몰거스 원숭이, 레서스 원숭이, 쥐, 소, 양, 기니피그, 토끼 및 랫트로부터 유래된 임의의 것일 수 있다. 예시적인 PH20 폴리펩티드는 인간(서열번호 1), 침팬지(서열번호 101), 레서스 원숭이(서열번호 102), 사이노몰거스 원숭이(서열번호 29), 소(서열번호 11 및 64), 마우스(서열번호 32), 랫트(서열번호 31), 토끼(서열번호 25), 양(서열번호 27, 63, 및 65) 및 기니피그(서열번호 30)로부터 유래된 것을 포함한다.
히알루로난 분해 효소에 대한 언급은, 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드 전구체 및 성숙한 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드(신호 서열이 제거된 상태의 것), 절단되었으나 활성이 있는 형태의 것을 포함하며, 대립형질 변이주 및 종 변이주, 스플라이스 변이주를 암호화하는 변이주, 및 서열번호 1, 10-48, 63-65, 67-102로 기재되는 전구체 폴리펩티드와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가진 폴리펩티드 및 이의 성숙한 형태의 것을 포함하는 기타 변이주를 포함한다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소에 대한 언급은 서열번호 50-51로 기재되는 인간 PH20 전구체 폴리펩티드 변이주를 또한 포함한다. 히알루로난 분해 효소는 또한 화학적 또는 번역 후 변형을 함유하는 것들 및 화학적 또는 번역 후 변형이 없는 것들을 포함한다. 그러한 변형은 PEG화, 알부민화, 글리코실화, 파르네실화, 카복실화, 히드록실화, 인산화, 및 기타 당업계에 알려진 폴리펩티드 변형을 포함한다. 절단된 PH20 히알루로니다제는 C-말단이 단축된 형태를 포함하는데, 특히 N-글리코실화되었을 때 절단되고 중성 활성을 가지는 형태를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "가용성 PH20"은 생리적 상태하에서 가용성인 PH20의 임의의 형태를 지칭한다. 예를 들어, 가용성 PH20은 37℃에서 Triton® X-114 용액에서 수상으로 분할(partition)된다(Bordier et al., (1981) J. Biol . Chem., 256:1604-7). GPI 앵커 PH20(GPI anchored PH20) 등 지질 앵커 PH20과 같은 막-앵커 단백질은 계면활성제-풍부상에서 분할될 것이나, 포스포리파제-C 처치에 따라 계면활성제 부족상 또는 수상에서 분할되지 않을 것이다. 가용성 PH20 가운데는 PH20이 막에 앵커링되는 부위 하나 이상이 제거되거나 변형된 가용성 PH20이 포함되는데, 가용성 형태가 히알루로니다제 활성을 유지한다. 가용성 PH20은 재조합 가용성 PH20 및 양 또는 소의 고환 추출물과 같은 자연적 출처로부터 포함되어 있는 또는 정제된 재조합 가용성 PH20을 포함한다. 그러한 가용성 PH20은 예시적으로 가용성 인간 PH20이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 가용성 인간 PH20 또는 sHuPH20은 생리적 상태하에서 가용성이도록 발현시 C-말단에 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커 서열의 전부 또는 일부를 결여한 성숙한 폴리펩티드를 포함한다. 가용성은 생리적 상태하에서 가용성을 나타내는지 확인할 수 있는 임의의 적절한 방법에 의해 평가할 수 있다. 그러한 방법의 예시는 Triton® X-114 분석법인데, 이 방법은 수용액상에서 분할 정도를 확인하는 것이며 상기 및 실시예에서 기술하고 있다. 또한, 가용성 인간 PH20 폴리펩티드는, CHO-S 세포 등 CHO 세포로부터 생산된 것이라면, 발현되고 세포 배양 배지로 분비된다. 그러나 가용성 인간 PH20 폴리펩티드는 CHO 세포로부터 생산된 것에 제한되지 않으며, 재조합 발현 및 폴리펩티드 합성을 포함하는 임의의 방법에 의해서라도 임의의 세포에서나 생산될 수 있다. CHO 세포에 의한 분비에 대한 언급은 정의적인(definitional) 것이다. 따라서, 폴리펩티드가 CHO 세포로부터 생산 및 분비되고 가용성인 경우, 즉 Triton® X-114에 의해 추출되었을 때 수상으로 분할되는 경우, 그것이 그렇게 생산되었든 아니든 가용성 PH20 폴리펩티드에 해당하는 것이다. sHuPH20에 대한 전구체 폴리펩티드는 이종의 또는 비-이종의(즉, 본래 상태) 신호 서열과 같은 신호서열을 포함할 수 있다. 예시적인 전구체는 아미노산 위치 1-35에 천연의 35개 신호 서열과 같은 신호 서열을 포함하는 것이다(예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 1-35 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이 "연장된 가용성 PH20" 또는 "esPH20"은 GPI 앵커-부착 신호 서열까지의 잔기 및 GPI-고정 부착 서열에 인접한 잔기의 하나 이상을 포함하는 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함하며, esPH20은 생리적 상태에서 가용성이다. 생리적 상태하에서의 가용성은 당업계의 통상의 지식을 가진자에게 알려져 있는 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기 및 실시예에서 기술된 Triton® X-114 분석법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 상기 논의한 바와 같이, 가용성 PH20은, CHO-S 세포와 같은 CHO 세포로부터 생산된다면, 발현되어 세포 배양 배지로 분비되는 폴리펩티드이다. 그러나, 가용성 인간 PH20 폴리펩티드는 CHO 세포로부터 생산되는 것에 제한되지 않으며, 임의의 세포로부터 또는 재조합 발현 및 폴리펩티드 합성을 포함해서 임의의 방법에 의해서라도 생산될 수 있다. CHO 세포에 의한 분비에 대한 언급은 정의적인 것이다. 그러므로, CHO 세포로부터 발현되고 분비되는 폴리펩티드가 가용성인 경우, 즉 Triton® X-114에 의해 추출되었을 때 수상에서 분할되는 경우, 그것이 그렇게 생산되었든 아니든 가용성 PH20 폴리펩티드에 해당하는 것이다. 인간 가용성 esPH20 폴리펩티드는, 서열번호 1의 36-490 잔기 이외에, 서열번호 1의 아미노산 위치 491에 인접한 하나 또는 그 이상의 아미노산을 포함하는데, 그 결과인 폴리펩티드는 가용성이다. 인간 esPH20 가용성 폴리펩티드는 예시적으로 서열번호 1의 아미노산 36-491, 36-492, 36-493, 36-494, 36-495, 36-496 및 36-497에 상응하는 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드의 예시는 서열번호 151-154 및 185-187 중 임의의 것으로 기재되는 아미노산 서열이다. 또한 대립형질 변이주 및 중성 활성을 유지하고 가용성인 서열번호 151-154 및 서열번호 185-187의 대응하는 폴리펩티드와 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 기타 변이주를 포함한다.
또한 대립형질 변이주 및 중성 활성을 유지하고 가용성인 서열번호 151-154 및 서열번호 185-187의 대응하는 폴리펩티드와 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지는 기타 변이주를 포함한다. 서열 동일성에 대한 언급은 아미노산 치환을 가진 변이체를 언급한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "esPH20들"에 대한 언급은 전구체 esPH20 폴리펩티드 및 성숙한 esPH20 폴리펩티드들(예컨대, 신호 서열이 제거된 것), 효소 활성을 가지며(전장(tull length) 형태의 적어도 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상을 유지하는) 가용성인, 이들의 절단된 형태를 포함하고, 대립형질 변이주 및 종 변이주, 스플라이스 변이주에 의해 암호화되는 변이주, 및 서열번호 1 및 3으로 기재된 전구체 폴리펩티드와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드 또는 이들의 성숙한 형태를 포함하는 기타 변이주를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "esPH20들"에 대한 언급은 또한 화학적 또는 번역 후 변형이 있는 것들 및 화학적 또는 번역 후 변형이 없는 것을 포함한다. 그러한 변형은 PEG화, 알부민화, 글리코실화, 파르네실화, 카복실화, 히드록실화, 인산화, 및 기타 당업계에 알려진 폴리펩티드 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)" 은 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 재조합적으로 발현되는 인간 PH2O 의 가용성 형태를 함유하는 조성물을 지칭한다. 가용성 rHuPH20 는, 신호 서열을 포함하고, 서열번호 49 에 개시된 핵산에 의해 암호화된다. 가용성 rHuPH20 를 암호화하는 핵산은 성숙형 폴리펩티드를 분비하는 CHO 세포에서 발현된다. 배양 배지에서 제조되면, C-말단에는 비균질성이 있게 되는데, 따라서 산물은 서열번호 4 내지 9 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있는 다양하고 풍부한 종 들의 혼합물을 포함한다.
마찬가지로, PH20의 다른 형태, 예컨대 esPH20에 대하여, 재조합적으로 발현된 폴리펩티드 및 이들의 조성물들은 비균질성을 보이는 C-말단이 있는 다수 종을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 36-497을 가지는 esPH20을 암호화하는, 서열번호 107의 폴리펩티드의 발현에 의해 생산된 재조합적으로 발현된 esPH20은, 36-496, 36-495와 같이 더 적은 수의 아미노산을 가지는 형태를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "N-결합된(N-linked) 부분"은 폴리펩티드의 번역 후 변형에 의해 글리코실화될 수 있는 폴리펩티드의 아스파라긴(N) 아미노산 잔기를 지칭한다. 인간 PH20의 N-결합된 부분은 예시적으로 서열번호 1로 기재되는 인간 PH20의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "N-글리코실화 폴리펩티드"는 적어도 3개의 N-결합된 아미노산 잔기, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 잔기 N235, N254 및 N393에 상응하는 N-결합된 부분의 올리고당 결합을 함유하는 PH20 폴리펩티드 또는 그것에 절단된 형태를 지칭한다.
N-글리코실화 폴리펩티드는 3, 4, 5 및 최대 모든 N-결합된 부분이 올리고당에 결합된 폴리펩티드를 포함한다. N-연결형 올리고당은 올리고만노스, 복합, 혼성 또는 황산화 올리고당, 또는 기타 올리고당 및 단당, 도는 기타 올리고당 및 단당류를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "N-부분적 글리코실화 폴리펩티드"는 적어도 3개의 N-결합된 부분에 연결된 N-아세틸글루코사민 글리칸을 최소한으로 함유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 부분적으로 글리코실화된 폴리펩티드는 단당류, 올리고당류, 및 EndoH, EndoF1, EndoF2 및/또는 EndoF3 처리시 형성된 것들을 포함하는 분지된 당 형태를 포함하는 다양한 글리칸 형태를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "탈글리코실화 PH20 폴리펩티드"는 가능한 글리코실화 부위의 전체가 못되는 수가 글리코실화되어 있는 PH20 폴리펩티드를 지칭한다. 탈글리코실화는 예를 들어 글리코실화를 제거함으로써, 글리코실화를 방지함으로써, 또는 글리코실화 부위를 제거하기 위해 폴리펩티드를 변형시킴으로써 이루어질 수 있다. 특정한 N-글리코실화 부위는 다른 부위와 달리 활성에 꼭 필요한 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "PEG화"는 일반적으로 히알루로난 분해 효소의 반감기를 증가시키기 위한, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제에 대한 중합체 분자, 예컨대 폴리에틸렌글리콜의 공유 또는 다른 안정적인 부착을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "컨주게이트(conjugate)"는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 또는 화학적 부분에 직접적 또는 간접적으로 연결된 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 컨주게이트는 융합단백질, 화학적 컨주게이트 및 임의의 다른 방법에 의해 생산된 것을 포함한다. 예를 들어, 컨주게이트는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 또는 화학적 부분에 직접적 또는 간접적으로 연결된 가용성 PH20 폴리펩티드를 지칭하는데, 이것에 의해 적어도 하나의 가용성 PH20 폴리펩티드가 상기 컨주게이트가 히알루로니다제 활성을 유지하는 한은 다른 폴리펩티드 또는 화학적 부분에 직접적 또는 간접적으로 연결된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "융합" 단백질은 한 핵산 분자로부터의 암호화 서열 및 또 다른 핵산 분자로부터의 암호화 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 지칭한다. 여기서 암호화 서열들은 동일한 리딩 프레임 내에 있어서 숙주 세포에서 융합 구조체가 전사 및 번역될 때, 두 가지 단백질을 포함하는 단백질이 생산된다. 상기 두 분자는 구조체상에서 인접할 수도 있고 1, 2, 3, 또는 그 초과의, 그러나 보통 10, 9, 8, 7, 또는 6개 아미노산 미만을 함유하는 링커 폴리펩티드에 의해 분리되어 있을 수 있다. 융합 구조체에 의해 암호화되는 단백질 산물은 융합 폴리펩티드로 지칭된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "중합체"는 폴리펩티드에 컨주게이션된, 즉, 링커를 통해 직접적으로 간접적으로 안정하게 연결된, 임의의 고분자량 자연적 또는 합성의 부분을 지칭한다. 이러한 중합체는, 일반적으로 혈청 반감기가 증가되어 있고, 시알산 잔기, PEG화 잔기, 덱스트란, 당 및 다른 잔기들, 예컨대 글리코실화를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 히알루로니다제, 예컨대 가용성 PH20 또는 rHuPH20은 중합체에 컨주게이션될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다제 기질이란 히알루로니다제 효소에 의해 절단되고 및/또는 탈중합되는 기질 (예를 들면, 단백질 또는 다당류)을 말한다. 일반적으로, 히알루로니다제 기질은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)이다. 예시의 히알루로니다제 기질은 히알루로난 (HA)이다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로난 관련 질환, 장애 또는 상태는 히알루로난 수준이 질환 또는 상태의 원인, 결과 또는 달리 관찰된 바와 같이 상승된 임의의 질환 또는 상태를 나타낸다. 히알루로난 관련 질환 또는 상태는 조직 또는 세포내에서 히알루로난 발현 증가, 간질액 압력 증가, 혈관 부피 감소 및/또는 조직내의 물 함량 증가를 수반한다. 히알루로난 관련 질환, 장애 또는 상태는 히알루로니다제, 예를 들면 가용성 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제를 함유하는 조성물을 단독으로 또는 다른 치료 및/또는 작용제와 함께 병용하여 또는 그에 추가로 투여하여 치료될 수 있다. 질환 및 상태로서는 히알루로난 풍부 암, 예를 들면, 말기암, 전이성 암, 미분화 암, 난소암, 상피내암(ISC), 편평세포암(SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 대장암 및 다른 암 등의 고형 종양을 포함하는 종양을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 히알루로난 관련 질환 및 상태는 예시적으로 상승된 간질액 압력와 연관된 질환, 예를 들면, 디스크 압박과 연관된 질환 및 부종, 예를 들면 장기 이식, 뇌졸중, 뇌외상 또는 다른 손상에 기인한 부종이다. 히알루로난 관련 질환 및 상태는 예시적으로 상승된 간질액 압력, 혈관 부피 감소 및/또는 암, 디스크 압박 및 부종을 포함한 조직내의 물 함량 증가를 포함한다. 일례에서, 히알루로난 관련 상태, 질환 또는 장애의 치료는 간질액 압력(IFP) 증가, 혈관부피 감소 및 조직내의 물 함량 증가 중 하나 이상에 대한 개선, 감소 또는 다른 유익한 효과를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 증가된 히알루로난 수준은 질환 또는 상태에 종속하는 특정한 조직, 체액 또는 세포내에 히알루로난의 양을 말한다. 예를 들면, 히알루로난 풍부 종양의 존재의 결과로서, 히알루로난(HA) 수준은 체액, 예를 들면, 혈액, 오줌, 타액 및 혈청, 및/또는 종양성 조직 또는 세포내에서 증가될 수 있다. 상기 수준은 표준시료, 또는 다른 적당한 대조군, 예를 들면 HA 관련 질환을 갖지 않는 대상체로부터의 비교시료와 비교될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 특이적 활성은 단백질 mg 당 활성의 유닛을 지칭한다. 히알루로니다제의 밀리그램은 몰 소거 계수가 M-1 cm-1의 단위로 약 1.7이라고 가정할 때, 280 nm에서의 용액의 흡광도로 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, 상승된 히알루로난 수준은 질환에서 결과적으로 또는 달리 관찰된, 질환 또는 상태에 종속하는 특정한 조직, 체액 또는 세포내에 히알루로난의 양을 말한다. 예를 들면, 히알루로난 풍부 종양의 존재의 결과로서, 히알루로난(HA) 수준은 체액, 예를 들면, 혈액, 오줌, 타액 및 혈청, 및/또는 종양성 조직 또는 세포내에서 증가될 수 있다. 상기 수준은 표준시료, 또는 다른 적당한 대조군, 예를 들면 HA 관련 질환을 갖지 않는 대상체로부터의 비교시료와 비교될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "활성"이란 전장(완전한) 단백질과 관련된 폴리펩티드 또는 이의 부분의 기능적 활성 또는 활성들을 말한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 활성 절편은 전장 단백질의 활성을 나타낼 수 있다. 기능적 활성은 생물학적 활성, 촉매 또는 효소 활성, 항원성 (항-폴리펩티드 항체에 결합하거나 폴리펩티드와 경쟁하는 능력), 면역원성, 다량체를 형성하는 능력 및 폴리펩티드의 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 능력을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "히알루로니다제 활성"이란 히알루론산의 절단을 효소적으로 촉매작용하는 능력을 말한다. 히알루로니다제에 대한 미국약전(The United State Pharmacopeia; USA) XXII 분석법은 효소를 HA와 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 더 높은 분자량의 히알루론산 또는 잔류하는 히알루로난(HA) 기질의 양을 측정함으로써 간접적으로 히알루로니다제 활성을 결정한다 (USP XXII-NF XVII(1990), 644-645, united Strate Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). 참조 표준용액은 임의의 히알루로니다제의, 단위로, 상대적인 활성을 설명하기 위한 평가에 사용될 수 있다. 히알루로니다제, 가용성 PH20 및 esPH20을 포함하여, PH20과 같은 히알루로니다제 활성을 분석하기 위한 in vitro 분석법은 공지되어 있으며 본원에 기재되어 있다. 분석법은 예시적으로 절단되지 않은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때에 형성된 불용성 침전물을 검출함으로써 히알루로니다제에 의한 히알루론산의 절단을 간접적으로 측정하는 미세탁도 분석과, 미세역가 플레이트 웰에 비공유결합한 잔류 비오틴화-히알루론산을 스트렙타비딘 호스래디쉬 퍼록시다제 컨주게이트 및 발색원성(chromogenic) 기질로 검출함으로써 히알루론산의 절단을 간접적으로 측정하는 비오틴화-히알루론산 분석을 들 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다제의 유닛을 시험할 때에 활성을 결정하기 위한 표준곡선을 만들기 위해 참조표준을 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "중성 활성"은 PH20 폴리펩티드의 중성 PH(예컨대, 약 pH 7.0)에서 히알루론산의 절단을 효소적으로 촉매하는 능력을 지칭한다. 일반적으로, 중성 활성을 갖고 가용성인 PH20은, 예컨대 C-말단이 절단된 또는 N-부분적 글리코실화된 PH20은, 이에 상응하는 C-말단이 절단되지 않았거나 N-부분 글리코실화되지 않은 중성 활성을 가지는 PH20의 히알루로니다제 활성과 비교할 때, 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 또는 그 이상의 활성을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "GPI-앵커 부착 신호 서열"은 ER 의 내강에서 폴리펩티드에 미리형성된 GPI-앵커의 부가를 지시하는 아미노산의 C-말단 서열이다. GPI-앵커 부착 신호 서열은 GPI-앵커된 폴리펩티드, 예컨대, GPI-앵커된 PH20 폴리펩티드의 전구체 폴리펩티드 내에 존재한다. C-말단 GPI-앵커 부착 신호 서열은 일반적으로 8-20 아미노산의 대부분 소수성 영역, 그 앞의 8-12 아미노산의 친수성 스페이서 영역, GPI-앵커 부착의 ω-위치 또는 위치의 바로 하류를 포함한다. GPI-앵커 부착 신호 서열은 당 분야에 널리 알려진 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 이들은 생물정보 웹사이트, 예컨대, ExPASy 프로테오믹스 툴 사이트 (예컨대, 월드와이드웹 사이트 expasy.ch/tools/)에서 쉽게 이용할 수 있는 것들을 포함하여, 인실리코 방법 및 알고리즘을 포함하나 이에 제한되지 않는다 (예컨대, Udenfriend 등 (1995) Methods Enzymol. 250:571-582, Eisenhaber 등,(1999) J. Biol. Chem. 292: 741-758, Kronegg 및 Buloz, (1999), "Detection/prediction of GPI cleavage site (GPI-anchor) in a protein (DGPI)", 예컨대, 웹사이트 129.194.185.165/dgpi/, Fankhauser 등, (2005) Bioinformatics 21:1846-1852, Omaetxebarria 등, (2007) Proteomics 7:1951-1960, Pierleoni 등, (2008) BMC Bioinformatics 9:392).
본원에 사용된 바와 같이, "핵산"은 DNA, RNA, 및 펩티드 핵산(PNA)을 포함하는 이들의 유사체 및 이들의 혼합물을 포함한다. 핵산은 단일 또는 이중-가닥일 수 있다. 형광 또는 방사성 동위원소와 같은 검출가능한 표지로 선택적으로 표지되어 있는 프로브 또는 프라이머를 언급할 때, 단일-가닥 분자가 고려된다. 상기 분자는 전형적으로 라이브러리 탐색 또는 프라이밍을 위하여 그들의 표적이 통계적으로 고유하거나, 낮은 복제수 (전형적으로 5 미만, 일반적으로 3 미만)이도록 하는 길이를 갖는다. 일반적으로 프로브 또는 프라이머는 관심있는 유전자와 상보적이거나 동일한 서열의 적어도 14, 16 또는 30 의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브 및 프라이머는 10, 20, 30, 50, 100 이상의 핵산 길이일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 펩티드는 2 아미노산 길이와 동일하거나 더 길고, 40 아미노산 길이와 동일하거나 더 짧은 길이인 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 제공되는 아미노산의 다양한 서열 내에 존재하는 아미노산은 그들의 공지된 3-문자 또는 1-문자 약어(표 1)에 의해 표시된다. 다양한 핵산 절편 내 존재하는 뉴클레오티드들은 당 분야에서 일상적으로 사용되는 표준 단일-문자 명명법으로 명명된다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산"은 아미노기와 카르복실기를 포함하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 두개 또는 그 이상의 아미노산을 포함한다. 본원의 목적을 위하여, 아미노산은 20개의 천연-발생 아미노산, 비-천연 아미노산 및 아미노산 유사체(즉, α-탄소가 측쇄를 갖는 아미노산)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 그 펩티드 결합에서 폴리펩티드의 화학적 소화(가수분해)시 형성되는 아미노산을 나타낸다. 본원에서 기재된 아미노산 잔기는 "L" 이성체 형태로 간주된다. "D" 이성체 형태 내 잔기라 명명된 잔기들은 원하는 기능적 성질이 폴리펩티드에 의해 유지되는 한 임의의 L-아미노산 잔기로 대체될 수 있다. NH2는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노기를 나타낸다. COOH는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 존재하는 유리 카르복실기를 나타낸다. J. Biol. Chem., 243:3557-3559(1968)에 기재되고, 37 C.F.R. §§1.821-1.822를 채택한 표준 폴리펩티드 명명법을 유지하면서, 아미노산 잔기들에 대한 약어를 표 1에 나타낸다:
[표 1] 대응 표
Figure 112017000450674-pat00001
본원에 식으로 나타난 모든 아미노산 잔기 서열은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로의 통상적인 방향인 좌측에서 우측으로의 방향성을 가진다. 또한, "아미노산 잔기"라는 어구는 대응 표(표 1)에 열거된 아미노산 및 변형된 아미노산 및 희귀 아미노산, 예컨대 37 C.F.R. §§1.821-1.822에 언급된 것들 및 참조로써 본원에 삽입된 것들을 포함하도록 정의된다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 끝의 대쉬(dash)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가적 서열에, 아미노-말단기, 예컨대, NH2에, 또는 카르복실-말단기, 예컨대, COOH에 대한 펩티드 결합을 나타내는 것임을 유의해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "천연적으로 발생하는 α-아미노산"은 인간에서 동족 mRNA 코돈과 함께 아미노산과 결합한 tRNA 분자의 특이적 인지에 의해 단백질로 조립되는, 자연계에서 발견되는 20개의 α-아미노산 잔기를 지칭한다. 따라서, "비-천연 아미노산"은 예를 들어 20개의 천연-발생 아미노산 이외의 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함하며, 아미노산의 D-이소스테레오머를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비-천연 아미노산의 예는 본원에 기재되고, 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 구축물은 자연계에서 발견되지 않는 방식으로 결합되고 병치된 DNA 분절을 포함하는, 단일 또는 이중 가닥의, 선형 또는 원형 DNA 분자이다. DNA 구축물은 인간 조작의 결과로써 존재하며, 조작된 분자의 클론 및 다른 복제들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절(segment)은 명시된 성질을 가지는 더 큰 DNA 분자의 부분이다. 예를 들면, 특정 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분절은 더 큰 DNA 분자, 예컨대, 5'에서 3' 방향으로 해독시 명시된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 플라스미드 또는 플라스미드 절편의 일부분이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 말단으로 해독되는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 천연 출처로부터 분리되거나, in vitro 에서 합성되거나, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 뉴클레오티드(약어로 "nt") 또는 염기쌍(약어로 "bp")이라는 용어로 본원에서 주어진다. 용어 뉴클레오티드는 문맥이 허용하는 경우 단일- 및 이중-가닥 분자를 위해 사용된다. 상기 용어가 이중-가닥 분자에 적용되는 경우, 총 길이를 나타내기 위하여 사용되며, 상기 용어 염기쌍과 동등한 것으로 이해될 것이다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 2개의 가닥은 길이에 있어 약간 상이할 수 있으며, 이들의 말단이 엇갈려 있을 수 있고, 따라서 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내 모든 뉴클레오티드들이 짝을 이루지 않을 수 있다는 것이 당해 기술분야의 당업자에게 인식될 것이다. 상기 짝이 없는 말단은, 일반적으로, 20 뉴클레오티드의 길이를 초과하지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, 두 단백질 또는 핵산 사이의 "유사성"은 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성을 나타낸다. 유사성은 잔기들의 서열 및 그안에 포함된 잔기들의 동일성 및/또는 상동성의 정도에 기초할 수 있다. 단백질 또는 핵산 사이의 유사성의 정도를 평가하는 방법은 당해 기술분야에 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 서열 유사성을 평가하는 한 방법에서, 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 서열 사이에 최고 수준의 상동성을 나타내는 방식으로 배열된다. "동일성"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 다르지 않은 정도를 나타낸다. 아미노산 서열, 어느 정도에서 뉴클레오티드 서열에 대한 배열(alignment)시 또한 아미노산(또는 뉴클레오티드)의 보전적 차이 및/또는 빈번한 치환을 고려할 수 있다. 보전적 차이는 관련된 잔기들의 물리-화학적 성질을 보존하는 것들이다. 배열은 전체적(서열의 전장에 대하여 그리고 모든 잔기들을 포함하는, 비교되는 서열의 배열)이거나 지역적(가장 유사한 지역 또는 지역들 만을 포함하는 서열의 부분의 배열)일 수 있다.
"동일성(identity)"은 그 자체로 기술로-인식되는 의미를 가지며, 공개된 기술을 사용하여 측정될 수 있다(예컨대: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988;Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 참조).
두개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 동일성을 측정하는 수많은 방법들이 있지만, 용어 "동일성"은 당업자에게 널리 알려져 있다(Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073(1988)).
본원에 사용된 바와 같이, (핵산 및/또는 아미노산 서열과 관련하여) 상동인(homologous)은 약 25% 이상의 서열 동일성, 전형적으로 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 의미하며; 필요하다면, 정확한 백분률이 명시될 수 있다. 본원의 목적을 위하여, 용어 "상동성" 및 "동일성"은 다르게 지시된 바 없다면 종종 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 백분률 상동성 또는 동일성의 결정을 위하여, 최고 수준 매칭이 얻어지도록 서열을 배열한다(예컨대 Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo 등(1988) SIAM J Applied Math 48:1073 참조). 서열 동일성에 의하여, 보존된 아미노산의 수가 표준 배열 알고리즘 프로그램에 의하여 결정되어, 각 공급자에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티(defualt gap penalties)를 가지고 사용될 수 있다. 실질적으로 상동인 핵산 분자는 관심있는 핵산의 길이를 내내 따라 전형적으로 중등도의 엄격성(stringency)으로, 또는 고도의 엄격성으로 혼성화된다. 또한 혼성화하는 핵산 분자 내 코돈 대신에 축퇴성 코돈(degenerate codon)을 포함하는 핵산 분자가 고려된다.
임의의 두개의 분자가 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 "동일한" 또는 또는 "상동인" 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 가지는지 여부는 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예컨대, Pearson 등(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(다른 프로그램은 GCG 프로그램 패키지를 포함한다(Devereux, J., 등, Nucleic Acids Research 12(I):387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., 등, J Molec Biol 215:403(1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, 및 Carillo 등(1988) SIAM J Applied Math 48:1073)에서와 같은 디폴트 파라미터들을 사용한 "FASTA" 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 생물공학 정보를 위한 국립센터(the National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스의 BLAST 함수가 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 다른 상업적으로 또는 대중적으로 이용가능한 프로그램은 DNAStar "MegAlign" 프로그램(Madison, WI) 및 위스콘신대학 유전학 컴퓨터 그룹(the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG)) "Gap" 프로그램(Madison WI)을 포함한다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 백분률 상동성 또는 동일성은 예를 들어 GAP 컴퓨터 프로그램을 사용한 서열 정보를 비교하여 결정될 수 있다(예를 들면, Needleman (1970) J. Mol. Biol. 48:443, Smith 및 Waterman에 의해 개정(1981) Adv. Appl. Math. 2:482). 요약하면, 상기 GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것 내의 기호의 전체 갯수로 나눈, 유사한, 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)들의 수로써 유사성을 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 1진법 비교 매트릭스(동일성에 대해 1의 값을, 비동일성에 대해 0 의 값을 포함) 및 Schwartz 및 Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 기술된 것과 같은 Gribskov 등(1986) Nucl. Acids Res. 14:6745의 편중 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대하여 3.0의 페널티 및 각각의 갭 내 각각의 기호에 대하여 추가의 0.10 페널티; 및 (3) 말단 갭에 대한 페널티 없음을 포함할 수 있다.
따라서 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일성" 또는 "상동성"은 시험 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "~에 90% 이상 동일한"은 참조 핵산 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 90 내지 99.99 백분률의 동일성을 나타낸다. 90% 이상의 수준의 동일성은 예증 목적을 위하여 100 아미노산의 시험 및 참조 폴리펩티드 길이를 비교한다고 상정하여 시험 폴리펩티드 내 아미노산의 10% 이하(즉, 100개 중 10개)가 참조 폴리펩티드의 아미노산과 다르다는 사실을 나타낸다. 유사한 비교를 시험 및 참조 폴리뉴클레오티드 사이에 행할 수 있다. 상기 차이는 폴리펩티드의 전장에 걸쳐 무작위적으로 분포된 점 돌연변이(point mutation)로서 나타날 수 있거나, 또는 이들은 최대 허용가능한, 예컨대 10/100 아미노산 차이(약 90% 동일성)까지 길이를 달리하는 하나 이상의 위치 내 모여 있을 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 상기 약 85 내지 90% 초과의 상동성 또는 동일성의 수준에서, 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 세트에 독립적이어야 하고; 그러한 높은 수준의 동일성은 종종 소프트웨어에 의지함이 없이 수동 배열에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 배열된 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열 내 상응하는 위치를 배열하기 위한 상동성(유사성 및/또는 동일성)의 사용을 의미한다. 전형적으로, 50% 이상의 동일성으로 관련된 둘 이상의 서열이 배열된다. 서열들의 배열된 세트는 상응하는 위치에서 배열되는 2 이상의 서열을 의미하며, EST와 같은 RNA 및 게놈 DNA 서열과 배열되는 다른 cDNA로부터 유래한 배열하는 서열(aligning sequence)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머"는 적절한 조건 하(예컨대, 4개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합화제, 예컨대 DNA 중합효소, RNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재)에 적절한 완충액 및 적절한 온도에서 주형-유도(template-directed) DNA 합성의 개시점으로써 작용할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 특정 핵산 분자가 "프로브" 및 "프라이머"로서 제공될 수 있음이 평가될 수 있다. 그러나, 프라이머는 신장을 위한 3' 히드록시기를 가진다. 프라이머는 다양한 방법 예를 들면 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역-전사효소(RT) PCR, RNA PCR, LCR, 다중 PCR, 팬핸들(panhandle) PCR, 캡쳐 PCR, 발현 PCR, 3' 및 5' RACE, 제자리(in situ) PCR, 라이게이션-매개 PCR 및 다른 증폭 프로토콜에서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머 쌍"은 (예를 들면, PCR에 의해)증폭되는 서열의 5' 말단과 혼성화하는 5'(상류) 프라이머 및 증폭되는 서열의 3' 말단의 상보물과 혼성화하는 3' (하류) 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적으로 혼성화한다"는 핵산 분자(예를 들면, 올리고뉴클레오티드)가 표적 핵산 분자에 상보적 염기-쌍에 의한 어닐링하는 것을 의미한다. 당업자는 특이적 혼성화에 영향을 미치는 in vitro 및 in vivo 파라미터, 예컨대 특정 분자의 길이 및 조성에 친숙하다. in vitro 혼성화에 특히 관련된 파라미터는 추가로 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성 및 염 농도를 포함한다. 특이적으로 결합된 핵산 분자를 제거하기 위한 예시적인 세척 조건은 고도 엄격성에서는 0.1x SSPE, 0.1% SDS, 65℃이고, 중등도 엄격성에서는 0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃이다. 동등한 엄격성 조건은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 특별한 적용을 위하여 적절한 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자의 특이적 혼성화를 달성하기 위하여 상기 파라미터들을 용이하게 조정할 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 서열을 언급할 때 '상보적인'은 뉴클레오티드의 두 서열이 전형적으로 상대되는 뉴클레오티드 사이에 25%, 15% 또는 5% 미만의 불일치를 가지고 혼성화할 수 있다는 것을 의미한다. 필요하다면, 상보성의 백분률은 특정될 것이다. 전형적으로 상기 2개의 분자는 이들이 높은 엄격성의 조건 하에서 혼성화하도록 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, "산물에 실질적으로 동일한"은 관심있는 성질이 충분히 바뀌지 않아 실질적으로 동일한 산물이 본래 산물 대신 사용될 수 있을 정도로 충분히 유사하다는 의미이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "유사한"은 관련 분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 문맥에 따라 변경되는 것으로도 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 대립형질 변이체 또는 대립형질 변이는 동일한 염색체 위치를 차지하는 유전자의 둘 이상의 임의의 선택적인 형태를 의미한다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고, 군집 내 표현형의 다형성(polymorphism)을 초래한다. 유전자 돌연변이는 침묵적이거나(암호화된 폴리펩티드에 변화 없음), 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 용어 "대립형질 변이체"는 또한 유전자의 대립형질 변이체에 의해 암호화되는 단백질을 지시하기 위하여 본원에서 사용된다. 전형적으로 유전자의 참조 형태는 군집 또는 한 종의 참조 구성원으로부터의 폴리펩티드의 야생형 형태 및/또는 우세형 형태를 암호화한다. 전형적으로, 대립형질 변이체는 종 간 변이체를 포함하며, 전형적으로 동일 종으로부터의 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 80%, 90% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 가지며; 동일성의 정도는 유전자, 및 비교가 이종간인지 종내인지에 좌우된다. 일반적으로, 이종간 대립형질 변이체는 폴리펩티드의 야생형 및/또는 우세형 형태와 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 포함하여 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성 또는 그 이상을 가진다. 본원에서 대립형질 변이체에 대한 언급은 일반적으로 동일한 종의 구성원 간의 단백질 내 변이를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 "대립형질 변이체"와 상호교환적으로 사용되는 "대립형질"은 그들의 유전자 또는 일부의 대안적인 형태를 의미한다. 대립형질은 상동 염색체 상의 동일 장소 또는 위치를 차지한다. 대상이 한 유전자의 2개의 동일한 대립형질을 가지는 경우 그 대상은 그 유전자 또는 대립형질에 대해 동형컨주게이션성(homozygous)이라고 언급된다. 대상이 한 유전자의 2개의 상이한 대립형질을 가지는 경우 그 대상은 그 유전자에 대해 이형컨주게이션성(heterozygous)이라고 언급된다. 특정 유전자의 대립형질은 단일 뉴클레오티드 또는 여러 뉴클레오티드에서 서로 상이할 수 있으며, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립형질은 또한 돌연변이를 포함하는 유전자의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 종 변이체는 다른 포유류 종들, 예컨대 마우스와 사람을 포함한 상이한 종 간 폴리펩티드의 변이체를 의미한다. PH20의 한 예로, 본원에 제공되는 종 변이체는 예시적으로 인간, 침팬지, 마카크 원숭이, 사이노몰거스 원숭이 등 영장류의 PH20이나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 종 변이체는 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % 또는 서열 동일성을 가진다. 종 변이체 하이 및 중에서 상응하는 잔기들은 매칭되는 뉴클레오티드 또는 잔기들의 수를 최대화하기 위하여, 예컨대, 두 서열 간의 상동성이 95% 이상이거나, 96% 이상이거나, 97% 이상이거나, 98% 이상이거나, 99% 이상이도록 비교하고, 배열하여 결정될 수 있다. 이어서, 관심있는 위치에 기준 핵산 분자에서 할당된 숫자를 부여한다. 배열은 특히 서열 동일성이80% 초과인 경우 수동으로 또는 눈으로 수행될 수 있다. 그러면 관심 위치는 참조 핵산 분자 내에서 숫자가 부여된다. 정렬은 수작업으로, 또는 눈으로, 특히 서열 동일성이 80%를 넘는 경우에, 될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 인간 단백질은 모든 대립형질 변이주 및 이들의 보존적 변이체를 포함하는 인간의 게놈에 존재하는 핵산 분자, 예컨대 DNA에 의해 암호화되는 것이다. 단백질의 변이체 또는 변형은, 만일 상기 변형이 야생형 또는 인간 단백질의 우세한 서열을 기초로 한다면, 인간 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같이, 스플라이스 변이체는 하나 초과의 mRNA의 형태를 초래하는 게놈 DNA의 최초 전사체의 차별적 프로세싱에 의해 생성되는 변이체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 변형(modification)은, 폴리펩티드의 아미노산 서열, 또는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열의 변형에 관한 것이며, 각각 아미노산 및 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및 치환을 포함한다. 예시적인 변형은 아미노산 치환이다. 아미노산이 치환된 폴리펩티드는 아미노산 치환을 포함하지 않는 폴리펩티드에 65%, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %,93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타낼 수 있다. 아미노산 치환은 보전적일 수도 비보전적일 수도 있다. 예시적인 변형은 아미노산 치환이다. 아미노산이 치환된 폴리펩티드는 아미노산 치환이 없는 폴리펩티드와 65 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 그 이상의 서열 동일성을 보일 수 있다. 아미노산 치환은 보존적이거나 비-보존적일 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드에 임의의 변형을 가하더라도 그 폴리펩티드의 활성은 유지된다. 재조합 DNA 방법론을 사용하는 것과 같은, 폴리펩티드를 변형하는 방법들은 당업자가 통상적으로 수행할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산의 적합한 보존적 치환은 당업자에게 공지되어 있으며 결과물인 분자의 활성을 변화시키지 않고도 일반적으로 수행될 수 있다. 일반적으로, 당업자는 폴리펩티드의 비-필수적 영역에 있어서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변형시키지 않는 것으로 인식한다 (예컨대, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224 참조). 이러한 치환은 다음 표 2에 기재된 바에 따라 수행될 수 있다.
[표 2]
Figure 112017000450674-pat00002
기타 치환도 가능하며 경험적으로 또는 공지된 보존적 치환에 따라 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 프로모터는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 포함하는 유전자의 부분을 의미한다. 프로모터 서열은 항상은 아니나 일반적으로 유전자의 5' 비-암호화 지역에서 발견된다.
본원에 사용된 바와 같이, 분리된 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이들의 생물학적으로 활성인 부분은 상기 단백질이 유래한 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나 또는 화학적으로 합성시 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 것이다. 제제는, 순도를 측정하기 위하여 당업자에 의해 사용되는 분석 표준 방법, 예컨대, 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 결정되어, 쉽게 검출가능한 불순물이 없는 것으로 나타나거나, 추가 정제가 물질의 물리적 및 화학적 성질, 예컨대, 효소 및 생물학적 활성을 검출가능하게 변경하지 않을 만큼 충분히 순수하다면, 실질적으로 없는 것으로 결정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 그러한 경우, 추가 정제가 화합물의 특이적 활성을 증가시킬 수 있다.
따라서, 본원에서 유의성있게 정제된 PH20과 같은, 유의성있게 정제된 폴리펩티드에 대한 언급은, 상기 단백질이 그것이 분리되거나 재조합적으로 제조되는 세포의 세포 성분들로부터 분리되어 있는 단백질 제제를 지칭한다. 일 구현예에서, 용어 '세포 물질로부터 실질적 무함유'는 약 30% 미만(건중량)의 비-효소 단백질(또한 본원에서 오염 단백질로서 언급됨), 일반적으로 약 20% 미만의 비-효소 단백질 또는 10% 미만의 비-효소 단백질 또는 약 5% 미만의 비-효소 단백질을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다. 상기 효소 단백질이 재조합적으로 제조시, 이는 또한 배양 배지로부터 실질적으로 유리된 것이다. 즉, 배양 배지가 효소 단백질 제제의 부피의 약 또는 20%, 10% 또는 5% 미만을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 화학적 전구체 또는 다른 화학물질의 실질적 부재는 단백질이 그 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리되어 있는 단백질 제제를 포함한다. 상기 용어는 약 30%(건중량) 미만, 20%, 10%, 5% 또는 그 이하의 화학적 전구체 또는 비-효소 화학물질 또는 성분을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩티드와 관련한 합성은 재조합 방법 및/또는 화학적 합성 방법에 의하여 제조된 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 재조합 DNA 방법을 이용한 재조합 수단에 의한 제조는 클로닝된 DNA에 의해 암호화되는 단백질 발현을 위한 분자 생물학의 잘 알려진 방법의 사용을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터(또는 플라스미드)는 이종기원 (heterologous) 핵산을 그의 발현 또는 복제를 위해 세포 내에 도입하기 위하여 사용되는 별개의 요소를 의미한다. 벡터는 전형적으로 에피좀(episome)으로 남지만, 유전자 또는 그의 일부가 게놈의 염색체 내로 통합(integration)에 영향을 주도록 설계될 수 있다. 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체 및 포유동물 인공 염색체인 벡터가 또한 고려된다. 상기 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 DNA 절편의 발현을 실행할 수 있는 조절 서열, 예컨대 프로모터 지역과 작동가능하게 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 상기 부가적 부분은 프로모터 및 종결자(terminator) 서열을 포함할 수 있으며, 임의적으로는 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선택마커, 인핸서, 폴리아데닐레이션 서열 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 조절 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터(virus vector)" 또는 "바이러스성 벡터(viral vector)"를 포함한다. 바이러스성 벡터는 (비히클 또는 셔틀로써) 외인성 유전자를 세포 내로 운반하도록 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 제작된 바이러스이다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절을 언급할 때의 "작동가능하게" 또는 "작동가능하게 연결된"은 상기 분절이 그들의 의도된 목적, 예컨대 전사가 프로모터 하류 및 임의의 전사된 서열 상류에서 개시되도록 기능하도록 배열된 것을 의미한다. 프로모터는 보통 전사기구가 결합하여 전사가 개시되고 암호화 부분을 따라 종결자까지 진행되도록 하는 도메인이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "평가(assessing)"는 시료 내 존재하는 단백질, 예컨대 효소, 또는 이의 도메인과 같은 단백질의 활성에 대한 절대값의 획득 및 또한 상기 활성의 수준을 나타내는 지표, 비율, 백분률, 시각적 또는 다른 값의 획득과 관련한 정량적 및 정성적 결정을 포함하는 것을 의미한다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있다. 실제 검출되는 화학 종은 물론 단백질 가수분해 산물 그 자체일 필요는 없으나, 예를 들면 그의 유도체 또는 어떤 추가 물질일 수 있다. 예를 들면, 절단 산물의 검출은 형광 부분과 같은 검출가능한 부분이 될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 활성은 화합물의 in vivo 활성 또는 화합물, 조성물 또는 기타 혼합물의 in vivo로 투여시 초래되는 생리학적 반응을 의미한다. 따라서, 생물학적 활성은 상기 화합물, 조성물 및 혼합물의 치료적 효과 및 약학적 활성을 포함한다. 생물학적 활성은 상기 활성을 시험하거나 사용하기 위해 설계된 in vitro 시스템에서 관찰될 수 있다. 따라서, 본원의 목적상, 히알루로니다제 효소의 생물학적 활성은 히알루론산의 분해이다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 서열을 언급할 때의 "동등한"은 문제된 2개의 서열들이 동일한 아미노산 서열 또는 동등한 단백질을 암호화하는 것을 의미한다. "동등한"이 2개의 단백질 또는 펩티드를 언급하는데 사용되는 경우, 이는 2개의 단백질 또는 펩티드가 상기 단백질 또는 펩티드의 활성 또는 기능을 실질적으로 변경하지 않는 아미노산 치환만을 가지는, 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 것을 의미한다. "동등한"이 성질을 언급하는 경우, 상기 성질은 동일한 정도로 나타날 필요는 없으나(예컨대, 2개의 펩티드가 동일한 종류의 효소 활성을 다른 속도로 나타낼 수 있다), 상기 활성은 대개 실질적으로 동일하다.
본원에 사용된 바와 같이, "조절하다(modulate)" 및 "조절(modulation)" 또는 "변경하다(alter)"는 분자, 예컨대 단백질의 활성의 변화를 의미한다. 예시적인 활성은 생물학적 활성, 예컨대 신호 전달(signal transduction)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 조절은 활성의 증가(즉, 상향조절 또는 작용제 활성), 활성의 감소(즉, 하향조절 또는 억제) 또는 활성의 임의의 다른 변경(예컨대, 주기성, 빈도, 지속시간, 동역학 또는 다른 파라미터의 변화)를 포함한다. 조절은 문맥에 좌우되며, 전형적으로 조절은 지정된 상태, 예를 들어, 야생형 단백질, 구성적 상태의 단백질, 또는 지정된 세포 종류 또는 상태에서 발현되는 단백질과 비교된다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 임의의 혼합물을 의미한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 조합은 2개 이상의 물질의 사이의 또는 중의 임의의 연합을 의미한다. 조합은 2개 이상의 별개의 물질, 예컨대, 2개의 조성물 또는 2개의 집합물일 수 있고, 이들의 혼합물, 예컨대 2개 이상의 물질의 단일 혼합물일 수 있으며, 또는 이들의 변형일 수 있다. 일반적으로 조합의 요소들은 기능적으로 연합되거나 또는 관련되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "질환 또는 장애"는 감염, 후천성 상태, 유전적 상태를 포함하나 이에 제한되지 않는 원인 또는 상태로부터 기인하고, 확인가능한 증상을 특징으로 하는 개체 내 병리학적 상태를 의미한다. 본원의 관심 대상인 질환 및 장애는 히알루로난-관련 질환 및 장애이다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 상태를 가진 대상을 "치료하는 것"은 대상의 증상이 부분적으로 또는 전체적으로 완화되거나, 또는 치료 후 정적인 상태로 남는 것을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 요법 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 잠재적 질환의 방지 및/또는 증상의 악화 또는 질환의 진행의 방지를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 약학적으로 유효한 제제는 임의의 치료적 제제 또는 생물활성 제제, 예를 들어 화학요법제, 마취제, 혈관수축제, 산포제, 저분자 약물 및 치료용 단백질을 포함하는 통상적인 치료 약물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료는 상태, 장애 또는 질환 또는 다른 적응증의 증상을 개선하거나 또는 그렇지 않다면 유리하게 변경하는 임의의 방식을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료 효과는 질환 또는 상태의 증상을 변경, 전형적으로는, 개선하거나 완화하는, 또는 질환 또는 상태를 치유하는 대상의 치료로부터 얻어지는 효과를 의미한다. 치료적으로 유효한 양은 대상에 투여 후 치료 효과를 야기하는 조성물, 분자 또는 화합물의 양을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 포유동물, 예컨대 인간을 포함한 동물을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 환자는 질환 또는 장애 증상을 보이는 인간 대상을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대체로 동일한"은 당업자가 동일하거나 허용 가능한 오차 범위 내에 있다고 판단할 양 이내를 의미한다. 예를 들어, 전형적으로, 약학적 조성물에 있어서, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 또는 10% 내에 있는 경우 대체로 동일한 것으로 본다. 이러한 양은 대상에 의해 특정 조성물에 있어서의 변이에 대한 내성에 의존하여 다양할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 투약요법(dosing regime)은 투여되는, 제제, 예컨대 가용성 히알루로니다제 또는 다른 제제를 포함하는 조성물의 양, 및 투여 빈도를 지칭한다. 투약요법은 치료될 질환 또는 상태과의 상관관계이며, 따라서 가변적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 투여 빈도는 치료의 연속적 투여 사이의 시간을 지칭한다. 예를 들어, 빈도는 수일, 수주 또는 수개월 일 수 있다. 예를 들어, 빈도는 매주 1회 초과, 예컨대, 주 2회, 주 3회, 주 4회, 주 5회, 주 6회 또는 매일 일 수 있다. 빈도는 또한 1, 2, 3, 또는 4 주일 수 있다. 특정 빈도는 치료할 특정 질환 또는 상태의 함수이다. 일반적으로, 빈도는 매주 1회 초과이며, 일반적으로 매주 2회이다.
본원에 사용된 바와 같이, "투여 주기"는 연속적 투여에 대하여 반복되는, 상기 효소 및/또는 제 2 작용제의 투여의 투약 요법의 반복된 일정을 지칭한다. 예를 들어, 투여 주기의 예는 3주일 동안 매주 2회 투여하고 이어서 1주일간 투여를 중단하는 28일의 주기이다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상의 mg/kg에 기초한 참조 용량에서, 평균 인간 대상은 약 70 kg-75 kg, 예를 들어 70 kg의 중량을 갖는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료, 예컨대, 약학적 조성물 또는 다른 치료제의 투여에 의한 특정 질환 또는 장애의 증상의 개선은, 영구적이든지 또는 일시적이든지, 지속적이든지 또는 일시적이든지, 증상의 임의의 감소 또는 상태의 유해 효과, 예컨대, 예를 들어, 항-히알루로난제, 예컨대 PEG화된 히알루로니다제의 투여와 관련된 또는 항-히알루로난제, 예컨대 PEG화된 히알루로니다제의 투여로 발생하는 유해 효과의 임의의 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 방지 또는 예방은 질환 또는 상태를 발전시킬 위험을 감소를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 투여량"은 치료 효과를 생성하기에 최소한 충분한 양으로 화합물을 포함하는 제제, 화합물, 물질, 또는 조성물의 양을 의미한다. 따라서, 질환 또는 장애의 증상을 예방, 치유, 개선, 정지 또는 부분적 정지에 필요한 양을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단위 투여 형태(unit dose form)는 인간 및 동물 대상에 적절하고, 당업계에 알려진 바와 같이 개별 포장된 물리적으로 분리된 단위를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단일 투여 제형은 단일 투여로서의 제형을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 직접 투여 제형은 투여를 위해 추가적인 희석이 요구되지 않는 조성물을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이,"제조품(article of manufacture)"은 제조되어 판매되는 제품을 의미한다. 본 출원을 통해 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 포장 물품 내에 포함된 항-히알루로난제, 예를 들어 히알루로난 분해효소, 예컨대 히알루로니다제, 및 제 2 작용제 조성물을 포괄하는 의도이다. 예를 들어, 제 2 작용제는 코르티코스테로이드이다.
본원에 사용된 바와 같이, 유체(fluid)는 흐를 수 있는 임의의 조성물을 의미한다. 따라서, 유체는 반-고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림 및 다른 기타 조성물의 형태인 조성물을 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같이, 조합, 예컨대 본원에서 제공하는 조성물의 조합은 조합의 구성요소들의 연합을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 키트는 본원에서 제공되는 조성물과, 전달, 투여, 진단, 및 생물학적 활성 또는 성질의 평가를 위한 장비/장치, 재구성, 활성화를 포함하나 이에 국한되지 않는 목적을 위한 다른 물질의 조합물을 의미한다. 키트는 선택적으로 사용 지침서를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 추출물 또는 용해물(lysate)은 용해되거나 또는 파괴된 세포로부터 만들어진 제제 또는 분획을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 동물은 임의의 동물, 예컨대, 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함한 영장류; 마우스 및 랫트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지 및 다른 동물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비-인간 동물은 고려된 동물로서 인간을 배제한다. 본원에서 제공되는 히알루로니다제는 임의의 출처, 동물, 식물, 원핵 및 진균 유래이다. 대부분 히알루로니다제들은 포유동물 기원을 포함한 동물 기원이다. 일반적으로 히알루로니다제는 인간으로부터 기원된다.
본원에 사용된 바와 같이, 항암 치료는 암을 치료하기 위한 약물 및 다른 제제의 투여 및 치료 프로토콜, 예를 들면 외과적 수술이나 방사선을 포함한다. 항암치료는 항암제의 투여를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 항암제는 항암치료에 사용되는 임의의 약물 또는 화합물을 지칭한다. 이들은 다른 화합물과 단독 또는 조합으로 사용될 때, 종양 또는 암과 관련된 임상적 증상 또는 진단 마커의 완화의 상태로 완화, 감소, 개선, 예방, 또는 차도에 놓이게 하거나 유지시킬 수 있는 임의의 약물을 포함하며, 본원에서 제공된 조합 및 조성물로 이용될 수 있다. 예시적인 항암제는 단독으로 또는 조합 및/또는 다른 항암제, 예컨대 화학치료제, 폴리펩티드, 항체, 펩티드, 저분자 또는 유전자 치료 벡터, 바이러스 또는 DNA와 조합으로 이용되는 본원에서 제공되는 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 대조군은 시험 파라미터로 처리되지 않는다는 것을 제외하고는 시험 시료와 실질적으로 동일한 시료를 의미하거나, 또는 만약 그것이 혈장 시료라면, 그것은 관심 있는 상태를 가진 감염되지 않은 정상적 지원자 유래일 수 있다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "하나의" "한" 및 "상기"는 문맥상 명백하게 반대로 구술되지 않는다면 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포외 도메인"을 포함하는 화합물에 대한 언급은 하나 또는 복수의 세포외 도메인을 가지는 화합물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약"으로 표현되는 범위 및 양은 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. "약"은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 5개의 염기"는 "약 5개의 염기" 및 또한 "5개의 염기"를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "임의적인(선택적인)" 또는 "임의적으로(선택적으로)"는 그 다음에 기재되는 사건 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않고, 그 기재가 상기 사건 또는 환경이 발생하는 경우의 예 및 그것이 발생하지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 임의적으로 치환된 기는 상기 기가 비치환되거나 또는 치환된 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 보호기, 아미노산, 및 다른 화합물에 대한 약어는 달리 기재되어 있지 않으면, 통상적인 사용법에 따라서 공지된 약어 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법을 사용한다((1972), Biochem. 11:1726 참조).
B. 개요
1. 항-히알루로제 및 히알루로난 관련 질환, 상태 및/또는 장애
히알루로난 발현 및/또는 생산과 관련된 특정한 질환들이 있는데, 염증성 질환 및 암도 여기에 포함된다. HA는 그러한 질환들의 진행에 관련된 다양한 생물학적 활성에 연관되어 있다(예컨대 Itano et al. (2008) Semin Cancer Biol 18(4):268-274; Tammi et al. (2008) Semin Cancer Biol 18(4):288-295 참조). 예를 들어, HA는 상피-간엽세포 전이(Epithelial-Mesenchymal Transition) 및 p53 종양 억제자 경로를 포함한 암 진행과 관련된 생물학적 과정에 연관되어 있다. 또한, HA는 종양과 같은 병적 조직에서의 물 흡수와 간질액압(IFP) 증가와 관련이 있어서, 종양 혈관이 압착되도록 한다. 예를 들어, 염증 부위나 종양 병소에서는, 히알루로난, 기타 기질 구성요소 및 물이 급격히 축적된다. 이러한 급격한 축적으로 인해, 병소는 환경과 평형을 이루지 못하게 되고 정상 조직보다 간질액압이 높아지게 된다.
항-히알루로난제는 히알루론산 합성을 저해하거나 분해를 증가시킴으로써 히알루론산 수준을 감소시킨다(HA; 히알루로난으로도 지칭된다). 예를 들어, 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소는 히알루론산(HA)를 방해하고 분해한다. 히알루로난을 분해하거나 히알루로난 합성을 억제하는 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소의 처리는 히알루로난을 감소시켜, 조직을 수축시키고 혈관을 확장시키며, 및 더 많은 혈액이 그 부위로 흘러들어오게 한다.
또한, 가장 고형인 종양 및 HA 축적과 관련된 기타 병적 조직의 IFP가 상승되면 효과적인 약물 전달에 대한 장벽으로 작용한다(Heldin et al. (2004) Nat Rev Cancer 4(10):806-813). 따라서, 히알루로난 분해 효소와 같은 히알루로난제는, 조직 부위의 IFP와 물 함량, 및 이와 관련된 혈액 관류 증가를 감소시킬 뿐 아니라, 공동 투여되는 요법의 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제는 종양으로 화학요법제의 전달을 강화할 수 있다.
그러므로, 항-히알루로난, 예컨대 히알루로난 분해 효소는 히알루로난(히알루론산, HA)의 축적을 나타내는 질환 또는 상태의 단일제 또는 조합에 유용한 특성을 나타낸다. 히알루로난 관련 질환, 상태 및/또는 장애는 암 및 염증성 질환을 포함한다. 히알루로난-풍부 암은 고형 종양, 예를 들어, 전이성 암, 미분화성 암, 난소암, 상피내암(ISC), 편평세포암(SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 결장암 및 기타 암을 포함하는 암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 히알루로니다제는 종양으로부터 HA를 제거하여 종양 부피의 감소, 종양내 간질압 감소, 종양세포 증식 속도를 느리게 하고, 종양 투과를 증가시킴으로써 동시투여한 화학요법 약물 및 생물학적 제제의 증가된 유효성을 야기한다(예를 들어 미국 공개 번호 20100003238호 및 국제 PCT 공개 번호 WO 2009/128917 참조).
PEG화는 체내에서 치료적 단백질의 반감기를 증가시킴으로써 전신적 치료 프로토콜에서의 효용을 증가시키는 데 사용되는 정립된 기술이다. 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제의 PEG화는, 1분 미만에서 약 48시간 내지 72시간으로 체내의 이들의 반감기를 증가시키고 HA 풍부 암의 전신적 처리를 가능하게 한다(미국 공개 번호 20100003238호 및 국제 PCT 공개 번호 WO 2009/128917호 참조). PEG화되지 않은 히알루로니다제에 대한 증가된 반감기는, HA의 제거 뿐만 아니라 이들의 혈장 내 이들의 존재 및 HA를 분해하는 이들의 능력으로 인한 병적 조직, 예컨대 종양 내에 HA의 재생산량의 축소 또는 감소를 허용한다. 혈장 효소 수준 유지는 종양 HA와 같은 HA를 제거할 수 있고, 및 또한 HA 재합성에 대항한다.
2. 항-히알루로난제 치료와 관련된 유해 효과
항-히알루로난제, 예를 들어 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소는 부작용과 관련된다는 것이 이전에 관찰된 바 없다. 그럼에도 불구하고, 본원에서 기술하는 바와 같이, 인간을 포함한 몇몇 종은, 전임상 및 임상 연구(하기 및 실시예 6-7에서 기술된) 모두에서 관찰된 바와 같이, PEG화 히알루로니다제 투여 후에 근골격계 부작용을 일으킨다.
근골격계 부작용에는 뻣뻣함, 근육 및 관절통, 무릎과 팔꿈치 관절의 운동범위 감소가 포함된다.
0.05 mg/kg의 PEGPH20을 단일 정맥내 투여받은 인간에게서 투여 약 6시간 후에 유해 근골격계 증상들이 나타났다. 상기 유해 효과는 다음 효과들 중 하나 이상을 포함한다: 근육 및 관절 통증/상하지 뻣뻣함, 경련, 근육, 근염, 전신의 근육통 및 근압통, 쇠약 및 피로. Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) 척도에 따르면, 관찰된 증상들은 3등급에 달했다. 유해 효과는 치료가 중단되면 수 일 후에 해소되었다. 실시예 6는 다양한 투약 요법, 투여량, 투여빈도 하에서, PEGPH20 치료를 받은 인간 환자의 시료에 있어서 발생한 유해 효과를 예시한다. 근골격계 사례의 심각성은 PEGPH20 투여량 및 투여 빈도의 조합에 의해 영향을 받는 것으로 보인다. 예를 들어, PEGPH20 투여량이 많고 투여 빈도가 높을수록 증상이 심하게 나타났다.
PEGPH20을 투여받은 원숭이들은 활동 저하, 무기력, 방향감각 상실, 구부린 자세(hunched posture), 사지 관절 각도 감소를 나타내었다. PEGPH20을 주 2회 IV로 4주간 투여한 경우, 무릎 및 팔꿈치 관절의 운동 범위 감소가 나타났다. 투여를 중지하자 부분적 내지 완전한 회복이 관찰되었다.
0.08 mg/kg의 PEGPH20 또는 0.3 mg/kg의 PEGPH20을 단일 투여한 비글견은 다음날 보행 능력 감소, 기립의 어려움, 활동 감소 및 목, 등 및 사지의 근육 긴장을 보였다. 그러나 투여를 중지하자 4일쯤 완전히 회복되었다. 그러나 투여를 중지하자 다음날 바로 완전히 회복되었다.
3. 항-히알루로난제의 유해 효과를 개선하기 위한 코르티코스테로이드의 사용
본원은 코르티코스테로이드를 전처치 또는 병용 투여함으로써 항-항-히알루로난제 처리 또는 투여와 관련된 유해 효과, 예컨대 근골격계 부작용을 개선 또는 예방하는 방법 및 용도를 제공한다. 예를 들어, 본원에 나타난 바와 같이, PEG화 히알루로니다제의 전신적 투여시 나타난 근골격계 부작용은, 코르티코스테로이드, 예컨대 덱사메타손과 같은 글루코코르티코이드를 전투약 및/또는 병용 투여함으로써 개선, 및/또는 제거될 수 있다. 이로써 PEGPH20을 더 높은 농도로 투여해도 내성이 생기는 동시에 투여 빈도를 높일 수 있는 결과를 얻을 수 있다. 그러므로, 본원에서 기술하는 바와 같이, 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 단일 치료 또는 조합 치료 PH20 처리와 관련된 유해 사례는 코르티코스테로이드의 존재에 있어서 극복될 수 있다.
그러므로, 본원은 히알루로난 축적을 나타내는 질환 및 상태의 단일제 또는 조합 치료를 위한, PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제의 사용과 관련된 유해사례를 개선하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제의 치료로 인한 유해 근골격계 부작용을 개선하기 위해 코르티코스테로이드, 예컨대 글루코코르티코이드를 사용한다. 일부 실시예에서, 유해 부작용이 감소된다. 다른 실시예에서, 유해 부작용은 제거된다. 기타 투여 방법도 고려될 수 있지만, 일반적으로 코르티코스테로이드는 경구로 투여된다. 일반적으로, 글루코코르티코이드는 약 0.4 내지 20 mg 사이의 양으로 투여되는데, 예를 들어 1회 투여시 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.75 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg 또는 20 mg을 투여할 수 있다.
코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제 투여 전, 투여 후, 또는 동시에 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 코르티코스테로이드는 항-히알루로난제, 예컨대 PEG화 히알루로난 분해효소 전에 투여된다. 예를 들어, 코르티코스테로이드는 항-히알루로난제 투여 전 0.5 분, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간 또는 그 이상까지 투여될 수 있다. 다른 실시예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해효소와 같은 항-히알루로난제와 동시에 투여된다. 이 실시예에서, 코르티코스테로이드는 항-히알루로난제와 별도로 또는 함께 투여될 수 있다. 일반적으로, 코르티코스테로이드는 항-히알루로난제와 별도로 투여된다. 다른 실시예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제 투여 다음에 투여된다. 예를 들어, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제 투여 후에 약 0.5 분, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간 또는 그 이상까지 투여될 수 있다.
일부 실시예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제가 히알루로난 관련 질환 또는 상태의 치료를 위해 단독으로 투여되는 투약 요법에서 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 코르티코스테로이드는 항-히알루로난제, 예컨대 PEG화 히알루로난 분해 효소와 질환 또는 장애를 치료하기 위한 하나 또는 그 이상의 제제 및/또는 치료, 예를 들어, 항암제, 예컨대 암 치료를 위한 화학요법, 항체, 벡터 또는 핵산과 조합으로 투여되는 투약 요법에 사용된다. 이 실시예에서, 제 2 작용제 또는 제제는 항-히알루로난제와 별도로 또는 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-히알루로난제, 예를 들어, PEG화 히알루로난 분해 효소 또는 기타 변형된 히알루로난 분해 효소는 추가적인 제제 또는 치료 전, 후 또는 함께 투여된다. 그러므로, 항-히알루로난제, 예를 들어 히알루로난 분해 효소, 특히 변형된 히알루로난 분해효소, 예컨대 PEG화 가용성 히알루로니다제는 치료제 단독 또는 다른 치료제와 조합으로 투여될 수 있다.
C. 항-히알루로난제
히알루론산, 히알루로네이트 또는 히알루로난이라고도 불리는 HA는, 선형의 글리코사미노글리칸 고분자 물질로서, 이당류 단위체인 β1,3,N-아세틸-D-글루코사민-결합된(linked) β1,4 투(to) D-글루쿠론산을 반복하여 포함한다. 히알루로난은 결합조직, 상피조직, 및 신경조직에 넓게 분포되어 있다. 히알루로난은 또한 세포외 기질의 주요 구성요소이고 간질 장벽의 구성요소이다. 예를 들어, 연골의 세포외 기질은 적은 양의 HA를 포함한다. HA는 발달 및 정상 조직 항상성 유지 과정에서 조직 리모델링시 역할을 담당하고, 세포 부착과 이동에 관여할 것 같다. HA는 또한 관절에서 생물학적 윤활제로 작용하며 운동 상태 및 정적 상태에서 모두 중요하다(예컨대 Engstrom-Laurent (1997) J. Intern. Med., 242:57-60; Jiang et al. (2007) Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 23:435-61 참조). HA는 그 자체로 질환을 조절, 예를 들어, 관절 질환의 치료, 안과의 외과적 기구 또는 상처 치유에 이용될 수 있다.
HA는 또한 질환과도 관련이 있다. HA 대사, 분포 및 작용 변화로 인한 HA 축적은 관절염, 면역장애 및 염증성 장애, 폐 및 혈관 질환 및 암(Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345:1454-1459) 등과 관련이 있다. 그러한 질환은 HA 합성을 억제하거나 HA를 분해함으로써 치유될 수 있다(예컨대 Morohashi 2006; 미국 공개번호 20100003238 및 국제 PCT 공개번호 WO 2009/128917 참조). 예를 들어, 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제는 종양 및 암 또는 염증성 질환 또는 상태를 포함하는 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에서 개시하고 있는 바와 같이, 세포 및 조직에서 히알루로난 수준을 낮추는 그러한 치료는 근골격계 부작용과 같은 유해 부작용을 야기할 수 있다. 본원에서 제공하는 바와 같이, 이러한 유해효과는 코르티코스테로이드를 전투약 또는 병용 투여함으로써 완화 또는 개선될 수 있다.
그러므로, 코르티코스테로이드는 병적 상태에서 HA 축적 또는 상승을 억제, 분해 또는 감소시키는 임의의 약물의 유해 부작용, 예컨대 근골격계 부작용을 감소시키는 방법에 이용될 수 있다. 그러한 제제는 당업자에게 공지되어 있거나 확인될 수 있다. 예를 들어, HA 합성 또는 분해에 대한 투여량 및 투여 경로의 효과를 포함하는 이러한 제제의 효과는, 본원에서 설명되거나 이 분야에 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 히알루로난 분해를 측정하는 in vitro 분석법 (예를 들어, Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269 참조), HA에 대해 조직 또는 기타 시료의 염색, 예컨대 HA-결합 단백질 또는 기타 항-HA 시약을 이용에 의하여(예를 들어, Nishida et al. (1999) J. Biol. Chem., 274:21893-21899 참조), 입자 배제 분석(Nishida et al. 1999; Morohashi et al. (2006) Biochem Biophys. Res. Comm., 345:1454-1459); has 유전자에 대한 HAS mRNA 발현 측정 또는 분석(Nishida et al. 1999)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 이 분야의 당업자에 알려진 다양한 분석법으로 평가될 수 있다. 그러한 분석법의 예로는 히알루로난 분해를 측정하는 in vitro 분석법 (예컨대 Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269 참조), HA-결합 단백질 또는 기타 항-HA 시약 등을 이용하여 조직 또는 기타 시료를 염색하여 HA를 확인하는 방법 (예컨대 Nishida et al. (1999) J. Biol. Chem., 274:21893-21899 참조), 입자 제외 분석(Nishida et al. 1999; Morohashi et al. (2006) Biochem Biophys. Res. Comm., 345:1454-1459); has 유전자에 대한 HAS mRNA 발현 측정 또는 분석(Nishida et al. 1999)이 있다. 이러한 항-히알루로난제의 예시로는 히알루로난 합성 저해 제제 또는 히알루로난 분해 제제가 있다.
1. 히알루로난 합성 억제제
서로 다른 종류의 세포들이 서로 다른 HAS 효소를 발현하며 HAS mRNA의 발현은 HA 생합성과 상호관련되어 있다. 종양세포에 있어서의 HAS 유전자의 침묵(silencing)은 종양 성장 및 전이를 억제하는 것으로 알려져 있다. 항-히알루로난제는 HA 합성효소의 발현 또는 수준을 억제, 감소 또는 하향 조절하는 임의의 제제를 포함한다. 그러한 제제들은 당업자에게 공지되어 있거나 확인될 수 있다.
예를 들어, HAS의 하향 조절은 HAS를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자들과 특이적으로 혼성화하거나 그렇지 않으면 상호작용을 하는 올리고뉴클레오티드를 제공함으로써 성취될 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 합성을 억제하는 항-히알루로난제는 has 유전자에 대한 안티센스 또는 센스 분자를 포함한다. 그러한 안티센스 또는 센스 억제는 일반적으로 수소결합에 기초한 올리고뉴클레오티드 가닥 또는 분절의 혼성화에 기반으로하며, 적어도 하나의 가닥 또는 분절이 절단되거나, 분해되거나, 그렇지 않으며 작동불능이 되게한다. 다른 실시예에서, 번역 후 유전자 침묵(post-transcriptional gene silencing; PTGS), RNAi, 리보자임 및 DNA자임이 적용될 수 있다. HAS1(서열번호 195), HAS2(서열번호 196) 또는 HAS3(서열번호 197 또는 198)의 서열에 기초한 이러한 구조체를 생성하는 이 분야의 당업자의 수준의 범위 내에 있다. 안티센스 또는 센스 화합물이 특이적으로 혼성화할 수 있는 표적 핵산과 100% 상보적일 필요가 없다는 것은 당업계에서 쉽게 이해될 수 있는 사실이다. 게다가, 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 분절과 혼성화될 수 있어, 개입 분절 또는 인접 분절은 혼성화 사례(예컨대 루프 구조 또는 헤어핀 구조)에 포함되지 않는다. 일반적으로, 안티센스 또는 센스 화합물은 표적 핵산 내의 표적 영역에 적어도 70%의 서열 상보성을 가지고, 예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%와 같이, 75% 내지 100%의 상보성을 가진다. 예시적인 센스 또는 안티센스 분자는 당업계에 공지되어 있다(예컨대 Chao et al. (2005) J. Biol . Chem., 280:27513-27522; Simpson et al. (2002) J. Biol . Chem., 277:10050-10057; Simpson et al. (2002) Am. J Path., 161:849; Nishida et al. (1999) J. Biol. Chem., 274:21893-21899; Edward et al. (2010) British J Dermatology, 162:1224-1232; Udabage et al. (2005) Cancer Res., 65:6139; 및 미국 공개번호 US20070286856 참조).
HA 합성 억제제인 다른 예시적인 항-히알루로난제는 4-메틸움벨리페론(4-Methylumbelliferone, 4-MU; 7-히드록시-4-메틸쿠마린(7-hydroxy-4-methylcoumarin)) 또는 그 유도체이다. 4-MU는 HA 합성에 필수적인 UDP-GlcUA 전구체 풀(pool)을 감소시킴으로써 작용한다. 예를 들어, 포유류 세포에서, HA는 UDP-글루쿠론산(UGA) 및 UDP-N-아세틸-D-글루코사민 전구체를 사용하여 HAS에 의해 합성 억제를 야기한다. 4-MU는 UGA가 생산되는 과정을 방해하여 세포내 UGA 풀을 줄어들게 하여 HA 합성을 억제한다. 4-MU는 항암 활성을 가진 것으로 알려져 있다(예컨대 Lokeshwar et al. (2010) Cancer Res., 70:2613-23; Nakazawa et al. (2006) Cancer Chemother. Pharmacol., 57:165-170; Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345-1454-1459 참조). B16 흑색종 모델에서 600 mg/kg/일로 4-MU의 경구투여가 전이를 64%까지 감소시킨다(Yoshihara et al. (2005) FEBS Lett., 579:2722-6). 4-MU의 구조는 하기에 기재되어 있다. 또한, 4-MU의 유도체는 항암 활성을 나타내는데, 특히 6,7-디하이드로지-4-메틸 쿠마린 및 5,7-디하이드록시-4-메틸 쿠마린이 그렇다(예컨대 Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345-1454-1459 참조).
4-Methylumbelliferone (4-MU; C10H8O3)
Figure 112017000450674-pat00003
또 다른 항-히알루로난제의 예시는 레플루노마이드(Leflunomide) (Arava), 제니스테인(genistein) 또는 에르브스타틴(erbstatin)과 같은 타이로신 키나제 억제제이다. 레플루노마이드는 또한 피리미딘 합성 억제제이기도 하다. 레플루노마이드는 류마티스성 관절염(RA) 치료약으로 알려져 있으며, 이종이식 뿐 아니라 동종이식에 대한 거부반응 치료에도 효과적인 것으로 보고되어 있다. HA는 직접적 또는 간접적으로 HA에 기여하는 것으로 알려져 있다(예컨대 Stuhlmeier (2005) J Immunol., 174:7376-7382 참조). 타이로신 키나제 억제제는 HAS1 유전자 발현을 억제한다(Stuhlmeier 2005).
2. 히알루로난 분해 효소
항-히알루로난제는 히알루로난 분해 효소를 포함한다. 히알루로난은 세포외 기질의 필수적인 구성요소이고 간질 장벽의 주요 구성요소이다. 히알루로난의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로난의 점도를 낮추어, 조직 투과성을 높이고 비경구적으로 투여된 유체의 흡수 속도를 증가시킨다. 그래서, 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소는, 기타 제제, 약물 및 단백질과 함께 그들의 분산 및 전달을 강화하기 위하여 산포제 또는 분산제로서 사용되어 왔다.
히알루로난 분해효소는 히알루로난 폴리머를 절단함으로써 히알루로난을 분해하고, 상기 폴리머는 교대하는 β-1→4 및 β-1→3 글리코시드 결합을 통하여 함께 연결된, 반복되는 이당류 단위, D-글루쿠론산(GlcA) 및 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)으로 구성되어 있다. 히알루로난 사슬은 길이가 약 25,000 이당류 반복(repeats) 이상에 달하고, 히알루로난의 폴리머는 생체내 크기가 약 5,000 내지 20,000,000Da 범위에 이른다. 따라서, 제공되는 용도 및 방법을 위한 히알루로난 분해효소는 히알루로난 이당류 사슬 또는 폴리머의 절단 촉매능을 가지는 임의의 효소를 포함한다. 어떤 예에서 히알루로난 분해효소는 히알루로난 사슬 또는 폴리머에서 β-1→4 글리코시드 결합을 절단한다. 다른 예에서, 히알루로난 분해효소는 히알루로난 사슬 또는 폴리머에서 β-1→3 글리코시드 결합을 절단한다.
따라서, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는, 세포외 매트릭스의 핵심적인 성분이며, 간질 장벽의 주된 구성성분인 히알루론산을 분해하는 효소들의 패밀리이다. 간질 장벽의 주된 구성성분인 히알루론산의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로난 분해 효소는 히알루론산의 점도를 낮추고, 이로써 조직 침투성을 증가시킨다. 이와 같이, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는, 예를 들어, 기타 작용제, 약물 및 단백질의 분산성 및 전달을 증강시키기 위해 그들과 함께 산포제 또는 분산제로서 사용된다. 히알루로난-분해 효소는 또한 대량피하주사 (hypodermoclysis) (피하 액체 투여) 를 위한 기타 주입된 약물의 흡수 및 분산을 증가시키기 위한 보조제로서, 및 방사요법제의 재흡수 개선을 위한 피하 요로조영술에서의 보조제로서 사용된다. 히알루로난-분해 효소, 예를 들어, 히알루로니다제는 안과적 과정, 예를 들어, 안과 수술 전 국소 마취에서의 안구주위 및 테논하 차단의 적용에 이용될 수 있다. 히알루로니다제는 또한, 성형수술, 예컨대 안검미용성형 및 페이스 리프트에서의 운동불능 촉진에 의한 기타 치료 및 미용 용도에서 이용될 수 있다.
히알루로니다제를 포함하는 여러가지 형태의 히알루로난 분해 효소가, 인간을 포함하는 대상체에서의 치료 용도를 위해 제조 및 승인되었다. 본원에서 제공하는 조성물 및 방법은, 이들 및 기타 치료 용도를 통해, 히알루로난-관련된 질환 및 상태의 치료를 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 동물-유래된 히알루로니다제 제제에는 정제된 양 고환 히알루로니다제인 Vitrase®(ISTA Pharmaceuticals), 소 고환 히알루로니다제인 Amphadase®(Amphastar Pharmaceuticals), 및 소 고환 히알루로니다제인 히다제™(Prima Pharm Inc.)를 포함한다. 본원에서 제공하는 방법 및 용도에 있어서는 임의의 동물-유래된 히알루로니다제 제제가 사용될 수 있다는 것은 이해될 수 있다(예컨대, 미국 특허번호 2,488,564, 2,488,565, 2,676,139, 2,795,529, 2,806,815, 2,808,362, 5,747,027 및 5,827,721호, 국제 PCT 공개번호 WO2005/118799 참조). Hylenex®(Halozyme Therapeutics)는, rHuPH20으로 명명된, PH20의 가용성 형태를 암호화하는 핵산을 포함하는 유전학 공학(조작)된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 의해 생상된 인간 재조합 히알루로니다제이다.
본원에서 제공하는 조성물 및 방법에 있어서, 예시적인 히알루로난 분해 효소는 가용성 히알루로니다제이다. 기타 예시적인 히알루로난 분해 효소는 히알루로난을 절단할 능력이 있는 특정한 콘드로이티나제 및 리아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
하기 기술하는 바와 같이, 히알루로난 분해 효소는 막 결합 또는 세포로부터 분비되는 가용성 형태로 존재한다. 본원에서의 목적을 위해, 가용성 히알루로난-분해 효소가 본원에서의 방법, 용도, 조성물 또는 조합물을 위해 제공된다. 그러므로, 히알루로난-분해 효소는 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커를 포함하고/하거나 그렇지 않으면 막-앵커 또는 불용성인데, 히알루로난 분해 효소는 효소가 분비되고 가용성이 되도록 GPI 앵커 부분을 절단시키거나 결실시킴으로써 본원에서 가용성 형태로 제공된다. 따라서, 히알루로난 분해 효소는 절단된 변이주, 예컨대 GPI 앵커의 전체 또는 일부를 제거하기 위해 절단된 변이주를 포함한다. 본원에서 제공하는 히알루로난 분해 효소는 또한 가용성 히알루로난 분해 효소의 대립형질 또는 종 변이주 또는 기타 변이주를 포함한다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소는 그의 1 차 서열에 하나 이상의 변이, 예컨대 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 히알루로난 분해 효소의 변이주는 일반적으로 변이를 포함하지 않는 히알루로난 분해 효소와 비교할 때 적어도 또는 약 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 본원에서의 목적을 위해, 임의의 변이가 히알루로난 분해 효소에 포함될 수 있고, 상기 효소는 히알루로니다제 활성, 예컨대 해당 변이를 포함하지 않는 히알루로난 분해 효소의 활성의, 적어도 또는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 활성을 보유한다 (당업계에 널리 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있는 시험관내 및/또는 생체내 검정으로 측정된 바와 같은).
본원에 제공된 방법 및 용도는 가용성 히알루로니다제의 용도를 설명하고, 따라서 임의의 히알루로난 분해효소, 일반적으로 가용성 히알루로난 분해 효소가 사용될 수 있다. 본원에서 제공하는 방법 및 용도에 있어서 임의의 히알루로니다제가 사용될 수 있다는 것이 이해된다(예컨대 미국 특허번호 7,767,429 및 미국 공개번호 US20040268425 및 US20100143457 참조).
a. 히알루로니다제
히알루로니다제는 히알루로난 분해효소의 거대 패밀리의 구성원이다. 히알루로니다제에는 세가지의 클래스: 포유류-형(type) 히알루로니다제, 박테리아 히알루로니다제, 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다제가 있다. 상기 효소는 제공되는 조성물, 조합물 및 방법에서 이용될 수 있다.
ⅰ. 포유류-형 히알루로니다제
포유류-형 히알루로니다제(EC 3.2.1.35)는 히알루로난의 β1→4 글리코시드 결합을 다양한 길이의 올리고당류, 예컨대, 사당류(tetrasaccharide) 및 육당류(hexasaccharide)로 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다제이다. 상기 효소는 가수분해 및 트랜스글리코시다제 활성을 모두 가지며, 히알루로난 및 콘드로이틴 술페이트(CS), 일반적으로 C4-S 및 C6-S를 분해할 수 있다. 상기 유형의 히알루로니다제는 젖소(소의) 히알루로니다제(서열번호 10, 11 및 64 및 BH55 (미국특허번호 5,747,027 및 5,827,721), 서열번호 190-192로 기재되는 핵산 분자), 양(면양)(서열번호 26, 27, 63 및 65), 장수말벌(서열번호 12 및 13), 꿀벌(서열번호 14), 흰얼굴 호박벌(서열번호 15), 페이퍼 말벌(paper wasp)(서열번호 16), 마우스(서열번호 17 내지 19, 32), 돼지(서열번호 20-21), 랫트(서열번호 22-24, 31), 토끼(서열번호 25), 오랑우탄(서열번호 28), 사이노몰거스 원숭이(서열번호 29), 기니피그(서열번호 30), 침팬지(서열번호 101), 레서스 원숭이(서열번호 102) 및 인간(서열번호 1-2, 36-39) 히알루로니다제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 히알루로니다제의 예는 가용성 히알루로니다제이다.
포유류 히알루로니다제는 고환 추출물에서 우세하게 발견되는, 중성 활성인 것들 및 간 등의 기관에서 우세하게 발견되는 산성 활성인 것들로 추가로 하위분류될 수 있다. 중성 활성인 히알루로니다제의 예시는 양(서열번호 27, 63, 65), 소(서열번호 11 및 64) 및 인간(서열번호 1)과 같은 서로 다른 종 유래 PH20 을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 인간 PH20 (SPAM1 또는 정자 표면 단백질 PH20로도 공지)은 일반적으로 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커를 통해 원형질 막에 부착된다. 이는 정자-난자 부착에 자연적으로 관여하고, 히알루론산을 소화하여 정자의 난구세포 층의 침투를 돕는다.
인간 PH20 (SPAM1 로도 지칭됨) 이외에도, 5 가지 히알루로니다제-형 유전자, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 및 HYALP1 가 인간 게놈에서 동정되었다. HYALP1 는 가성유전자(pseudogene) 이고, HYAL3 (서열번호 38) 은 임의의 공지된 기질에 대한 활성을 보유하는 것으로 나타났다. HYAL4 (서열번호 39 에 기재된 전구체 폴리펩티드)는 콘드로티나아제이고, 히알루로난에 대한 활성은 거의 나타내지 않는다. HYAL1 (서열번호 36 에 기재된 전구체 폴리펩티드)은 원형(prototype)의 산성-활성 효소이고, PH20 (서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드)는 프로토유형 중성-활성 효소이다. 산성-활성 히알루로니다제, 예컨대 HYAL1 및 HYAL2 (서열번호 37 에 기재된 전구체 폴리펩티드)는 일반적으로 중성 pH (즉, pH 7) 에서 촉매 활성이 결여되어 있다. 예를 들어, HYAL1 은 pH 4.5 를 초과해서는 in vitro에서 촉매 활성이 거의 없다(Frost 등 (1997) Anal. Biochem. 251:263-269). HYAL2 는 in vitro에서 매우 낮은 특이적 활성도를 가진 산성-활성 효소이다. 히알루로니다제-유사 효소는 또한, 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI) 앵커를 통해 원형질막에 결합되어 있는 것, 예컨대 인간 HYAL2 및 인간 PH20 (Danilkovitch-Miagkova, 등 (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-5), 및 일반적으로 가용성인 것, 예컨대 인간 HYAL1 (Frost 등 (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5) 을 특징으로 할 수 있다.
PH20
PH20 은, 기타 포유류 히알루로니다제와 마찬가지로, 히알루론산의 β1→4 글리코시드 결합을 각종 길이의 다당류, 예컨대 사탄당 및 육탄당으로 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다아제이다. 이들은 가수분해성 활성 및 트랜스글리코시다아제 활성의 두가지를 모두 갖고 있으며, 히알루론산 및 콘드로이틴 술페이트, 예컨대 C4-S 및 C6-S 를 분해할 수 있다. PH20 은 본래 정자-난자 결합에 수반되고, 히알루론산 소화에 의해, 정자에 의한 난구세포층의 침투를 보조한다. PH20 은 정자 표면 및 리소좀-유도성 첨체에 위치해 있으며, 여기서 내첨체막에 결합되어 있다. 원형질막 PH20 은 중성 pH 에서만 히알루로니다제 활성을 갖는 반면, 내첨체막 PH20 는 중성 및 산성 pH 모두에서 활성을 갖는다. 히알루로니다제인 것에 더하여, PH20 도 또한 HA-유도성 세포 신호전달에 대한 수용체, 및 난자를 둘러싼 투명층에 대한 수용체인 것으로 나타난다.
예시 PH20 단백질에는, 이에 제한되지 않으나, 인간 (서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드, 서열번호 2에기재된 성숙형 폴리펩티드), 침팬지 (서열번호 101), 레서스 원숭이 (서열번호 102), 소 (서열번호 11 및 64), 토끼 (서열번호 25), 양 PH20 (서열번호 27, 63 및 65), 사이노몰거스 원숭이 (서열번호 29), 기니피그 (서열번호 30), 랫트 (서열번호 31) 및 마우스 (서열번호 32) PH20 폴리펩티드가 포함된다.
소 PH20 은 553 개 아미노산 전구체 폴리펩티드(서열번호 11) 이다. 소 PH20 와 인간 PH20 의 정렬은 오직 약한 상동성만을 보여주는데, 소 폴리펩티드에서의 GPI 앵커의 부재로 인해, 아미노산 470 부터 각각의 카르복시 말단까지에는 다중적인 갭들이 존재한다 (참고문헌은, 예를 들어, Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv.4: 427-440). 사실, 명백한 GPI 앵커는 인간을 제외한 다수의 기타 PH20 종들에서는 예측되지 않는다. 따라서, 양 및 소에서 생산된 PH20 폴리펩티드는 자연에서 가용성 형태로 존재한다. 소 PH20 은 전체적으로, 원형질막에는 매우 느슨하게 결합되어 존재하는데, 이는 포스포리파아제 감수성 앵커를 통해 고정되어 있지 않다(Lalancette 등 (2001) Biol Reprod. 65(2):628-36). 소 히알루로니다제의 이러한 독특한 특성은, 가용성 소 고환 히알루로니다제 효소의 임상 용도를 위한 추출물로서의 이용을 가능케 한다 (Wydase®, Hyalase®).
인간 PH20 mRNA 전사물은 번역되어 일반적으로, N-말단에 35 개의 아미노산 신호 서열 (아미노산 잔기 위치 1 내지 35) 및 C-말단에 19 개의 아미노산 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커 부착 신호 서열 (아미노산 잔기 위치 491 내지 509) 를 포함하는 509 개의 아미노산 전구체 폴리펩티드(서열번호 1)를 생성한다. 따라서, 성숙형 PH20 은 서열번호 2 에 기재된 474 아미노산 폴리펩티드이다. 전구체 폴리펩티드의 ER 로의 수송 및 신호 펩티드의 제거 후, C-말단 GPI-결합 신호 펩티드는 절단되어, 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 위치 490 에 해당하는 아미노산 위치에서 새롭게 형성된 C-말단 아미노산에 대한 GPI 앵커의 공유결합성 부착을 촉진한다. 따라서, 서열번호 2 에 기재된 아미노산 서열이 있는 474 개의 아미노산 GPI-고정 성숙형 폴리펩티드가 생산된다.
인간 PH20은 중성 및 산성 pH 의 모두에서 히알루로니다제 활성을 나타낸다. 한 국면에서, 인간 PH20 는 일반적으로 GPI 앵커를 통해 형질막에 고정되어 있는 원형의 중성-활성 히알루로니다제이다. 또다른 국면에서, PH20 은 중성 및 산성 pH 의 두가지 모두에서 히알루로니다제 활성을 갖는 내첨체막 상에 발현된다. PH20가 폴리펩티드의 서로 떨어진 영역에 2 개의 촉매 부위를 포함하는 것으로 보인다: 펩티드 1 및 펩티드 3 영역(Cherr 등, (2001) Matrix Biology 20:515-525). 증거는, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 아미노산 위치 107 내지 137 및 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 위치 142 내지 172 에 상응하는 PH20의, 펩티드 1 영역이 중성 pH 에서의 효소 활성에 필요하다는 것을 시사한다. 상기 영역 내 위치 111 및 113 의 아미노산(서열번호 2 에 기재된 성숙형 PH20 폴리펩티드에 해당)은 활성에 중요한 것으로 나타나는데, 이는 그의 아미노산 대체에 의한 돌연변이가, 야생형 PH20 에 비해, 각각 3% 히알루로니다제 활성을 갖거나 히알루로니다제 활성이 검출되지 않는 PH20 폴리펩티드를 제공한다는 것으로 뒷받침된다 (Arming 등, (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
펩티드 3 영역은, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 아미노산 위치 242 내지 262, 및 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 위치 277 내지 297 에 해당하는데, 산성 pH 에서의 효소 활성에 중요한 것으로 나타난다. 상기 영역 내에서, 성숙형 PH20 폴리펩티드의 위치 249 및 252 에서의 아미노산은 활성에 핵심적인 것으로 나타나고, 이들 중 하나에서라도 돌연변이가 발생하면 활성이 본질적으로 없는 폴리펩티드를 제공한다(Arming 등, (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
촉매 부위에 추가하여, PH20 은 또한 히알루로난-결합 부위를 포함한다. 실험적인 증거는, 상기 부위가 펩티드 2 영역에 위치하고 있음을 시사하며, 이는 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 아미노산 위치 205 내지 235 및, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 위치 170 내지 200 에 해당한다. 상기 영역은 히알루로니다제에서 고도로 보존성이고, 헤파린 결합 모티프와 유사하다. 위치 176 (서열번호 2 에 기재된 성숙형 PH20 폴리펩티드에 해당) 에서의 아르기닌 잔기의 글리신으로의 돌연변이는, 야생형 폴리펩티드에 비해 히알루로니다제 활성이 오직 약 1% 만 있는 폴리펩티드를 제공한다(Arming 등, (1997) Eur. J. Biochem.247:810-814).
서열번호 1 로 예시되는 인간 PH20 의 폴리펩티드의 N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 에는 7 개의 잠재적인 N-결합된 글리코실화 부위가 있다. 서열번호 1 의 아미노산 36 내지 464 는 최소 활성 인간 PH20 히알루로니다제 도메인을 포함하는 것으로 나타나기 때문에, N-결합된 글리코실화 부위 N-490 는 적절한 히알루로니다제 활성에는 필요하지 않다. 인간 PH20 에는 6 개의 이황화 결합이 있다. 서열번호 1 로 예시되는 폴리펩티드의 시스테인 잔기 C60 및 C351 사이, C224 및 C238 사이에 2 개의 이황화 결합이 있다 (각각, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 잔기 C25 및 C316, 및 C189 및 C203 에 해당됨). 서열번호 1 로 예시되는 폴리펩티드의 시스테인 잔기 C376 및 C387 사이; C381 및 C435 사이; C437 및 C443 사이; 및 C458 및 C464 사이에는 추가로 4 개의 이황화 결합이 형성된다 (각각, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 잔기 C341 및 C352 사이; C346 및 C400 사이; C402 및 C408 사이; 및, C423 및 C429 사이에 해당됨).
ⅱ. 박테리아 히알루로니다제
박테리아 히알루로니다제(EC 4.2.2.1 또는 EC 4.2.99.1)는 히알루로난 및 다양한 정도로 콘드로이틴 술페이트 및 데르마탄 술페이트를 분해한다. 박테리아에서 분리된 히알루로난 리아제는 작용방식에 의해 히알루로니다제(다른 출처 유래, 예컨대, 히알루로노글루코사미니다제, EC 3.2.1.35)와 다르다. 이들은 히알루로난 내의 N-아세틸-베타-D-글루코사민과 D-글루쿠론산 잔기 사이의 β1→4-글리코시드결합의, 가수분해보다는, 제거반응을 촉매하여, 3-(4-디옥시-β-D-글루크-4-에누로노실)-N-아세틸-D-글루코사민 사당류- 및 육당류, 및 이당류 최종산물을 생성하는 엔도-β-N-아세틸헥소사미니다제이다. 상기 반응으로 이들의 비환원 말단에서 불포화 헥수론산(hexuronic acid) 잔기를 가지는 올리고당이 형성된다.
제공되는 조성물, 조합물 및 방법에서 사용하기 위한 박테리아 유래 히알루로니다제의 예는 아르쓰로박터(Arthrobacter), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 클로스트리듐(Clostridium), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 펩토코커스(Peptococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 박테로이드(Bacteroides) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)의 균주를 포함한, 미생물 내 히알루로난 분해효소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 변이주 및 효소의 특정 예는 아르쓰로박터속(Arthrobacter sp .)(균주 FB24)(서열번호 67), 브델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus)(서열번호 68), 프로피오니박테륨 아크네(Propionibacterium acnes)(서열번호 69), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae)(서열번호 70); 18RS21(서열번호 71); 혈청형 Ia(서열번호 72); 혈청형 Ⅲ(서열번호 73), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(균주 COL(서열번호 74); 균주 MRSA252(서열번호 75 및 76); 균주 MSSA476(서열번호 77); 균주 NCTC 8325(서열번호 78); 균주 소(bovine) RF122(서열번호 79 및 80); 균주 USA300(서열번호 81), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)(서열번호 82); 균주 ATCC BAA-255/R6(서열번호 83); 혈청형 2, 균주 D39/NCTC 7466(서열번호 84), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(혈청형 M1)(서열번호 85); 혈청형 M2, 균주 MGAS10270(서열번호 86); 혈청형 M4, 균주 MGAS10750(서열번호 87); 혈청형 M6(서열번호 88); 혈청형 M12, 균주 MGAS2096(서열번호 89 및 90); 혈청형 M12, 균주 MGAS9429(서열번호 91); 혈청형 M28(서열번호 92); 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)(서열번호 93 내지 95); 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri)(균주 ATCC 700601/ES114(서열번호 96)), 및 히알루론산에 특이적이고 콘드로이틴 또는 콘드로이틴 술페이트를 절단하지 않는, 스트렙토마이세스 히알루로노리티쿠스(Streptomyces hyaluronolyticus) 히알루로니다제 효소(Ohya, T. 및 Kaneko, Y.(1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
ⅲ. 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다제
거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다제(EC 3.2.1.36)는 사당류 - 및 육당류 최종산물을 생성하는 엔도-β-글루쿠로니다제이다. 상기 효소는 히알루로네이트 내 β-D-글루쿠로네이트와 N-아세틸-D-글루코사민 잔기 사이에 β1→3-결합의 가수분해를 촉매한다. 거머리 유래 히알루로니다제의 예는 거머리과(Hirudinidae)(예를 들어, 히루도 메디키날리스(Hirudo medicinalis)), 돌거머리과(Erpobdellidae)(예를 들어, 네펠롭시스 옵스쿠라(Nephelopsis obscura) 및 에르포브델라 펀타타(Erpobdella punctata)), 넙적거머리과(Glossiphoniidae)(예를 들어, 데쎄로브델라 픽타(Desserobdella picta), 헤로브델라 스타그날리스(Helobdella stagnalis), 그로씨포니아 콤플란타(Glossiphonia complanata), 플라코브델라 오르나타(Placobdella ornata) 및 테로마이존속(Theromyzon sp.)) 및 말거머리과(Haemopidae)(해모피스 마르모라타(Haemopis marmorata))를 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (Hovingh 등(1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 124(3):319-26). 거머리 히알루로니다제와 동일한 작용기전을 가지는 박테리아 유래 히알루로니다제의 예는 시아노박테리아(cyanobacteria), 시네코코커스속(Synechococcus sp.)의 히알루로니다제(균주RCC307, 서열번호 97)이다.
b. 기타 히알루로난 분해효소
제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 히알루로니다제 패밀리 뿐만 아니라 다른 히알루로난 분해효소가 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 콘드로이티나제 및 리아제를 포함한, 히알루로난 절단능을 가지는 효소가 이용될 수 있다. 히알루로난을 분해할 수 있는 콘드로이티나제의 예는 콘드로이틴 ABC 리아제 (또한 콘드로이티나제 ABC로서 알려짐), 콘드로이틴 AC 리아제(또한 콘드로이틴 술페이트 리아제 또는 콘드로이틴 술페이트 엘리미나제로서 알려짐) 및 콘드로이틴 C 리아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위한 상기 효소의 생산 및 정제 방법은 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, 미국특허번호 6,054,569; Yamagata, 등(1968) J. Biol. Chem. 243(7):1523-1535; Yang 등(1985) J. Biol. Chem.160(30):1849-1857).
콘드로이틴 ABC 리아제는 두개의 효소, 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제(EC 4.2.2.20) 및 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제(EC 4.2.2.21)를 포함하고(Hamai 등(1997) J Biol Chem. 272(14):9123-30), 이들은 콘드로이틴-술페이트 및 데르마탄-술페이트 유형의 다양한 글리코사미노글리칸을 분해한다. 콘드로이틴 술페이트, 콘드로이틴-술페이트 프로테오글리칸 및 데르마탄 술페이트는 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제의 바람직한 기질이나, 상기 효소는 더 낮은 속도로 히알루로난에 작용할 수도 있다. 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제는 콘드로이틴-술페이트- 및 데르마탄-술페이트 유형의 다양한 글리코사미노글리칸을 분해하여, 궁극적으로 Δ4-불포화 사당류- 및 이당류로 분해되는 다른 크기의 Δ4-불포화 올리고당의 혼합물을 생성한다. 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제는 동일한 기질특이성을 가지나, 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제에 의해 생성된 중합체 콘드로이틴-술페이트 및 이들의 올리고당 절편, 모두의 비-환원 말단으로부터 이당류 잔기를 제거한다(Hamai, A. 등(1997) J. Biol. Chem. 272:9123-9130). 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제 및 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제의 예는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum) 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(프로테우스 불가리스 술페이트-콘드로이틴-ABC 엔도리아제는 서열번호 98에 기재되어 있음(Sato 등(1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46).
콘드로이틴 AC 리아제(EC 4.2.2.5)는 콘드로이틴 술페이트 A 및 C, 콘드로이틴 및 히알루론산에 대해 활성이나, 데르마탄 술페이트(콘드로이틴 술페이트 B)에 대해 불활성이다. 박테리아 유래 콘드로이티나제 AC 효소의 예는 서열번호 99 및 100에 각각 기재된, 플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum) 및 빅티발리스 바덴시스(Victivallis vadensis), 및 아르쓰로박터 이리시스(Arthrobacter aurescens) 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Tkalec 등(2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst 등(1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444).
콘드로이티나제 C 는 콘드로이틴 술페이트 C를 절단하여, 사당류와 불포화 6-황산화 이당류(delta Di-6S)를 생성한다. 이는 또한 히알루론산을 절단하여 불포화 비-황산화 이당류(delta Di-OS)를 생성한다. 박테리아의 콘드로이티나제 C 효소의 예는 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 플라보박테리움(Flavobacterium)의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Hibi 등(1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci 등(1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda 등(1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133).
c. 가용성 히알루로난 분해효소
가용성 히알루로니다제를 포함한, 가용성 히알루로난 분해효소가 본원의 상기 조성물, 조합물 또는 방법에서 제공된다. 가용성 히알루로난 분해효소는 세포(예컨대 CHO 세포)로부터 발현되고 분비되어 가용성 형태로 존재하는 임의의 히알루로난 분해 효소를 포함한다. 그러한 효소들은, 예컨대, 비-인간 동물 가용성 히알루로니다제, 박테리아 히알루로니다제 및 인간 히알루로니다제, Hyal1, 소의 PH20 및 양의 PH20, 이들의 대립형질 변이체 및 다른 변이체를 포함한 비-인간 가용성 히알루로니다제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 가용성 히알루로난 분해효소 중에서, 예를 들어, 가용성으로 변형된 임의의 히알루로난 분해효소가 포함된다. 예를 들어, GPI 앵커를 포함하는 히알루로난 분해효소는 GPI 앵커의 모두 또는 일부를 절단(truncation)하거나 제거하여 가용성으로 만들어질 수 있다. 하나의 예에서, GPI 앵커를 통해 정상적으로 막에 고정된, 인간 히알루로니다제 PH20은 C-말단에서 GPI 앵커의 모두 또는 일부의 절단(truncation) 및 제거에 의해 가용성으로 만들어질 수 있다.
가용성 히알루로난 분해효소는 또한 중성 활성 및 산성 활성 히알루로니다제를 포함한다. 투여후 효소활성의 원하는 수준 및/또는 투여부위와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 요인들에 따라, 중성 활성 및 산성 활성 히알루로니다제가 선택될 수 있다. 특정 예에서, 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위한 히알루로난 분해 효소는 가용성 중성 활성 히알루로니다제이다.
그 히알루로니다제가 가용성이고(발현시 분비됨) 히알루로니다제 활성을 유지하는 한, 가용성 히알루로니다제의 예는 임의의 종 유래 PH20, 예컨대 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63 내지 65, 및 101 내지 102 중 어느 하나에 기재된 임의의 것, 또는 C-말단 GPI 앵커의 모두 또는 일부가 손실된 이들의 절단된 형태이다. 가용성 히알루로니다제 중에는 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63 내지 65, 및 101 내지 102 중의 어느 하나의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체, 또는 이들의 절단된 형태가 또한 포함된다. 대립형질 변이체 및 다른 변이체는 당업자에게 알려져 있으며, 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31, 63-65, 및 101-102 중 어느 하나 또는 이들의 절단된 형태와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 아미노산 변이체는 보존적 및 비-보존적 돌연변이를 포함한다. 히알루로니다제의 활성을 위하여 중요하거나, 그렇지 않으면 요구되는 잔기들, 예컨대 상기 기재되거나 당 분야의 기술에서 알려진 임의의 것들이 일반적으로 불변이며, 변형될 수 없는 것으로 이해된다. 이들은 예를 들면 활성 부위 잔기들을 포함한다. 따라서, 예를 들어 인간 PH20 폴리펩티드 또는 이의 가용성 형태의 아미노산 잔기 111, 113 및 176 (서열번호 2에 기재된 성숙한 PH20 폴리펩티드 내 잔기들에 상응)이 일반적으로 불변이고, 변경되지 않는다. 글리코실화 및 적절한 접힘(folding)을 위하여 요구되는 이황화결합의 형성을 제공하는 다른 잔기들이 또한 불변일 수 있다.
일부 예에서, 가용성 히알루로난 분해효소는 정상적으로 GPI 앵커되어 있고 (예를 들면, 인간 PH20) C 말단 절단에 의해 가용성을 제공한다. 이러한 말단 절단은 GPI 앵커 부착 신호 서열의 모두를 제거하거나 GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부만을 제거할 수 있다. 그러나 얻어진 폴리펩티드는 가용성을 갖는다. 가용성 히알루로난 분해효소가 GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부를 유지하는 예에서, 폴리펩티드가 가용성이면 GPI 앵커 부착 신호 서열내에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상의 아미노산 잔기를 유지할 수 있다. GPI 앵커의 하나 이상의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드는 연장된 가용성 히알루로난 분해효소라고 한다. 당업자는 폴리펩티드가 당업계에 알려진 방법을 사용한 GPI-앵커인지를 결정할 수 있다. 이러한 방법은 공지의 알고리즘을 사용하여 GPI-앵커 부착 신호 서열 및 ω-부위의 존재 및 위치를 예상하고 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파제 C(PI-PLC) 또는 D(PI-PLD)로 소화 전 및 후의 가용성 분석을 실시하는 것을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
연장된 가용성 히알루로난 분해효소는 얻어진 폴리펩티드가 가용성이고 GPI 앵커 부착 신호 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하도록 임의의 천연 GPI 앵커 고정 히알루로난 분해효소에 C-말단 절단함으로써 제조될 수 있다(미국 공개번호 US20100143457 참조.). C-말단절단되지만 GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부를 유지하는 연장된 가용성 히알루로난 분해효소로는 영장류 기원인 연장된 가용성 PH20(esPH20) 폴리펩티드, 예를 들면 인간 및 침팬지 esPH20 폴리펩티드를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, esPH20 폴리펩티드는 활성 단편을 포함하는, 서열번호 1, 2 또는 101에 기재된 성숙 또는 전구체 폴리펩티드 또는 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중 어느 하나의 C-말단 절단에 의해 행해질 수 있는데, 얻어진 폴리펩티드는 가용성이고 GPI-앵커 부착 신호 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 유지한다. 대립형질 변이체 및 다른 변이체는 당업자에게 공지되어 있고 서열번호 1 또는 2 중 어느 하나와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 얻어진 esPH20 폴리펩티드가 가용성이고 GPI 앵커 부착 신호 서열로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 유지하는 것이면, 본원에서 제공된 esPH20 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드, 예를 들면 서열번호 1,2, 또는 101에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 아미노산이 C-말단 절단될 수 있다.
전형적으로, 본원의 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위하여, 가용성 인간 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 인간 PH20이 사용된다. 다른 동물 유래 히알루로난 분해효소, 예를 들면 PH20이 이용될 수 있으나, 그러한 제제는 동물 단백질이므로, 잠재적으로 면역원성이 있다. 예를 들어, 현저한 비율의 환자가 사전에 섭취된 음식물에 대해 이차적인 감작(sensitization)을 보여주고, 이들은 동물 단백질이기 때문에, 모든 환자는 차후에 감작의 위험을 가진다. 따라서, 비-인간 제제는 만성적인 사용에 적합하지 않을 수 있다. 비-인간 제제를 원한다면, 상기 폴리펩티드가 감소된 면역원성을 가지도록 준비될 수 있음이 본원에서 고려된다. 그러한 변형은 당업자의 수준내에 있으며, 예를 들어 분자에서 하나 이상의 항원성 에피토프의 제거 및/또는 대체를 포함할 수 있다.
본원의 방법에서 사용된, 히알루로니다제(예를 들면, PH20)를 포함한, 히알루로난 분해효소는 재조합적으로 생산되거나, 또는 예를 들어 고환 추출물과 같은 자연 출처로부터 정제되거나 부분적으로 정제될 수 있다. 재조합 히알루로난 분해효소를 포함한, 재조합 단백질의 생산방법은 본원의 다른 곳에서 제공되며, 당업자에게 잘 알려져 있다.
ⅰ. 가용성 인간 PH20
가용성 히알루로니다제로는 가용성 인간 PH20을 들 수 있다. 재조합 인간 PH20의 가용성 형태가 제조되어 왔고 본원에 기재된 조성물, 조합물 및 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 PH20의 가용성 형태의 제조는 미국 공개번호 20040268425호; 20050260186호, 20060104968호, 2010014357호, 및 국제 PCT 공개번호 WO2009111066에 기재되어 있다. 예를 들면, C-말단 절단된 폴리펩티드 변이체와 같은 가용성 PH20 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1에 포함된 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98% 서열 동일성을 갖고 히알루로니다제 활성을 유지하고 가용성을 갖는다. 이들 폴리펩티드 중에, GPI-앵커 부착 신호 서열의 전부 또는 일부가 완전히 결실된 가용성 PH20 폴리펩티드가 포함되어 있다.
또한, GPI 앵커의 적어도 하나의 아미노산을 함유하는 연장된 가용성 PH20(esPH20) 폴리펩티드가 포함되어 있다. 따라서, ER내에 단백질의 C-말단에 GPI 앵커가 공유결합되고 원형질막의 세포외 소엽(leaflet)에 고정되는 것 대신에, 이들 폴리펩티드는 분비되고 가용성을 갖는다. C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 전장의 야생형 폴리펩티드, 예를 들면 서열번호 1 또는 2에 기재된 서열을 갖는 전장의 야생형 폴리펩티드 또는 대립형질 변이체 또는 종변이체 또는 다른 변이체에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 또는 그 이상의 아미노산이 C-말단 절단될 수 있다.
본원에 제공된 서열번호 1로 기재된 인간 PH20의 C-말단 절단된 폴리펩티드로는 서열번호 1에 기재된 아미노산의 서열의 C-말단의 아미노산 잔기 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 및 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 또는 500이 절단되어 있거나 이와 85% 이상의 서열 동일성을 나타내는 폴리펩티드가 있다. 인간 PH20의 가용성 형태는 일반적으로 서열번호 1에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 36-464를 함유하는 것들을 포함한다. 예를 들어, 포유류 세포 내에서 발현되면, 상기 35 아미노산 N 말단 신호 서열은 프로세싱 중에 절단되고 성숙한 형태의 단백질이 분비된다. 따라서, 그 성숙한 가용성 폴리펩티드는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 36 내지 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 및 483을 함유한다. 표 3은 C-말단 절단 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함하는 예시의 C-말단 절단 PH20 폴리펩티드의 비제한적 예를 제공한다. 하기 표 3에서 전구체 및 성숙한 폴리펩티드의 길이(아미노산 내의) 및 C-말단 절단된 PH20 단백질의 전구체 및 성숙한 폴리펩티드의 예시의 아미노산 서열이 기재된 서열 식별기호(서열번호)가 제공된다. 또한, 비교를 위해 야생형 PH20 폴리펩티드도 표 3에 포함되어 있다. 특히, 가용성 히알루로니다제는 442, 443, 444, 445, 446 또는 447개 아미노산 길이의 가용성 인간 PH20 폴리펩티드로서, 그러한 폴리펩티드는 서열번호 4-9, 또는 그의 대립형질 변이체 또는 종 변이체가 될 수 있다.
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글리코실화가 히알루로니다제의 촉매 활성 및 안정성에 중요하기 때문에, 일반적으로 PH20의 가용성 형태는 폴리펩티드가 활성 유지를 보장하도록 정확한 N-글리코실화를 용이하게 하는 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조된다. 이러한 세포는, 예를 들면 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포를 포함한다(예를 들면, DG44 CHO 세포).
ⅱ. rHuPH20
인간 PH20의 재조합 가용성 형태가 생성되고, 본원에서 제공된 조성물, 조합물 및 방법에서 사용될 수 있다. 상기 재조합 인간 PH20의 가용성 형태의 생성은 미국 공개번호 20040268425호; 20050260186호; 20060104968호; 20100143457호; 및 국제 PCT 공개번호 WO2009111066 에 기재되어 있다. 이러한 폴리펩티드의 예는 아미노산 1 내지 482(서열번호 3에 기재)를 암호화하는 핵산분자로부터 생성되는 것들이다. 이러한 핵산 분자는 예시적으로 서열번호 49에 기재되어 있다. 전사 후 프로세싱은 35 아미노산 신호 서열을 제거하고 447 아미노산 가용성 재조합 인간 PH20(서열번호 4)을 남긴다. 배양배지에서 생산되기 때문에, C-말단에서 불균질성(heterogeneity)이 있으며, 따라서 rHuPH20으로 불리는 산물은 다양하고 풍부하게 서열번호 4-9 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있는 종의 혼합물을 포함한다. 일반적으로, rHuPH20은 활성을 유지하기 위해 정확한 N-글리코실화를 용이하게 하는 세포, 예를 들면 CHO 세포(예를 들면 DG44 CHO 세포)내에서 생성된다.
d. 히알루로난 분해효소의 글리코실화
촉매활성 및 안정성을 위해, 히알루로니다제를 포함하는 일부의 히알루로난 분해효소의 N-결합 및 O-결합 글리코실화를 포함하는 글리코실화가 중요할 수 있다. 당단백질을 변형시키는 글리칸의 유형을 변경하면 단백질의 항원성, 구조적 접힘, 가용성 및 안정성에 대한 현저한 효과가 나타나는 반면, 대부분의 효소는 최적의 효소활성에 대한 글리코실화가 필요하다고 생각되지 않는다. 일부 히알루로니다제에 대해, N-결합된 글리코실화를 제거하여 히알루로니다제 활성의 거의 완전한 불활화를 일으킬 수 있다. 따라서, 이러한 히알루로니다제에 대해, 활성 효소를 발생시키기 위해 N-결합된 글리칸의 존재가 중요하다.
N-결합된 올리고당류는 여러 주요한 형태(올리고만노스, 복합체, 하이브리드, 술페이트화 형태)로 분류되고, 모두 Asn-Xaa-Thr/Ser 서열(여기서 Xaa는 Pro가 아니다)내에 있는 Asn 잔기의 아미드 질소를 통해 부착된 (Man)3-GlcNAc-GlcNAc 코어를 갖는다. Asn-Xaa-Cys-부위에서의 글리코실화가 응고단백질 C에 대해 보고되었다. 일부 예에서, 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해효소는 N-글리코시드 및 O-글리코시드 결합을 함유할 수 있다. 예를 들면, PH20은 O-결합된 올리고당류 뿐만 아니라 N-결합된 올리고당류를 갖는다. 서열번호 1로 예시된 인간 PH20의 N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490에서 7개의 잠재 N-결합된 글리코실화 부위가 있다. 아미노산 잔기 N82, N166, 및 N254는 복합체 유형 글리칸으로 채워진 반면, 아미노산 잔기 N368, N393은 고(high) 만노스 유형 글리칸으로 채워져 있다. 아미노산 잔기 N235는 약 80%의 고 만노스 유형 글리칸 및 20%의 복합체 유형 글리칸으로 채워져 있다. 상기 기재된 바와 같이, 히알루로니다제 활성을 위해서 N490에서 N-결합된 글리코실화가 필요하지 않다.
일부 예에서, 제공된 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용하기 위한 히알루로난 분해효소는 글리코실화 부위의 하나 또는 전체에서 글리코실화된다. 예를 들면, 인간 PH20 또는 그 가용성 형태에 대해, 서열번호 1의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393에 상응하는 2, 3, 4, 5 또는 6의 N-글리코실화 부위가 글리코실화된다. 일부 예에서, 히알루로난 분해효소는 하나 이상의 본래의 글리코실화 부위에서 글리코실화된다. 다른 예에서, 히알루로난 분해효소는 하나 이상의 비-본래 글리코실화 부위에서 변형되어 하나 이상의 부가적인 부위에서 폴리펩티드의 글리코실화를 제공한다. 이러한 예에서, 부가적인 당 부분의 부착은 분자의 약동학 특성을 강화시킬 수 있는데, 예를 들면 반감기 개선 및/또는 활성 향상이 있다.
다른 예에서, 본원에서 제공된 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용하기 위한 히알루로난 분해효소는 부분적 탈글리코실화(또는 N-부분적으로 글리코실화 폴리펩티드)된다. 예를 들면, 부분적 탈글리코실화 가용성 PH20 폴리펩티드는 충분히 글리코실화 히알루로니다제의 히알루로니다제 활성의 전부 또는 일부를 유지하고 본원에서 제공된 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용될 수 있다. 부분적으로 탈글리코실화 히알루로니다제로는 임의의 종으로부터의 부분적 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드의 가용성 형태, 예를 들면 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 63, 65, 101 및 102에 기재된 것 또는 대립형질 변이체, 절단된 변이체, 또는 다른 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 당업자에게 공지되어 있고 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63, 65, 101 및 102의 어느 하나 또는 그 말단 절단된 형태와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 제공된 부분적 탈글리코실화 히알루로니다제는 하이브리드, 융합 및 키메릭 부분적 탈글리코실화 히알루로니다제 및 부분적 탈글리코실화 히알루로니다제 컨주게이트를 포함한다.
글리코시다제 또는 글리코시드 가수분해효소는 글리코시드 결합의 가수분해를 촉매작용하여 2개의 작은 당을 생성하는 효소이다. 척추동물에서 N-글리칸의 주요한 형태는 고(high) 만노스 글리칸, 하이브리드 글리칸 및 복합체의 글리칸을 포함한다. 고 만노스 글리칸, 하이브리드형 글리칸을 절단하는 EndoF1; 2분기(biantennary) 복합체형 글리칸을 절단하는 EndoF2; 2분기 이상의 분지쇄 복합체 글리칸을 절단하는 EndoF3; 및 고 만노스 글리칸 및 하이브리드형 글리칸을 절단하는 EndoH를 포함하는 부분적인 단백질 탈글리코실화를 일으키는 여러개의 글리코시다제가 있다. 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제, 예를 들면 가용성 PH20의 하나 또는 모든 이러한 글리코시다제로의 처리는 부분적인 탈글리코실화를 일으키고, 따라서 히알루로니다제 활성을 유지한다.
부분적 탈글리코실화 히알루로난 분해효소, 예를 들면 부분적 탈글리코실화 가용성 히알루로니다제는 하나 또는 그 이상의 글리코시다제, 일반적으로 모든 N-글리칸을 제거하지 않고 부분적으로 단백질을 탈글리코실화하는 글리코시다제에 의한 소화에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, PH20(예를 들면, rHuPH20라고 명명되는 재조합 PH20)과 하나 또는 모든 상기 글리코시다제(예를 들면, EndoF1, EndoF2 및/또는 EndoF3)의 처리는 부분적 탈글리코실화를 일으킨다. 이들 부분적 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드는 충분히 글리코실화된 폴리펩티드와 동등한 히알루로니다제 효소 활성을 나타낼 수 있다. 반면, PH20을 모든 N-글리칸을 절단하는 글리코시다제인 PNGaseF로 처리하면 모든 N-글리칸을 완전히 제거하여 PH20을 효소적으로 불활화시킬 수 있다. 따라서, 모든 N-결합된 글리코실화 부위 (예를 들면, 서열번호 1에 예시된 인간 PH20의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393)가 글리코실화될 수 있지만, 하나 또는 그 이상의 글리코시다제로의 처리는 하나 또는 그 이상의 글리코시다제에 의해 소화되지 않은 히알루로니다제에 비해 감소된 글리코실화의 정도를 제공할 수 있다.
부분적 탈글리코실화된 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한 부분적으로 탈글리코실화 히알루로난 분해효소는 완전히 글리코실화된 폴리펩티드의 글리코실화 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 서열번호 1의 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393의 아미노산에 상응하는 N-글리코실화 부위의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6은 부분적으로 탈글리코실화되어, 더이상 고 만노스 유형 또는 복합체 유형 글리칸을 함유하지 않고 대신 하나 이상의 N-아세틸글루코사민 부분을 함유하게 된다. 일부 실시예에서, 서열번호 1의 아미노산 N82, M166, M254에 상응하는 N-글리코실화 부위 1, 2, 또는 3은 탈글리코실화되는데, 이는 당 부분을 함유하지 않음을 의미한다. 다른 실시예에서, 서열번호 1의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393에 상응하는 N-글리코실화 부위 3, 4, 5, 또는 6은 글리코실화된다. 글리코실화된 아미노산 잔기는 최소한 하나의 N-아세틸글루코사민 부분을 함유한다. 일반적으로, 부분적 탈글리코실화된 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한 부분적 탈글리코실화된 히알루로난 분해효소는 충분히 글리코실화된 폴리펩티드에 의해 나타낸 히알루로니다제 활성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상인 히알루로니다제 활성을 나타낸다.
e. 변형된 (중합체-컨주게이션된) 히알루로난 분해효소
일례에서, 상기 제공된 조성물 및 조합물은 하나 이상의 중합성 분자(중합체)와의 컨주게이션에 의해 변형된 히알루로난 분해효소, 특히 가용성 히알루로니다제를 함유하며 이는 일반적으로 히알루로난 분해효소의 반감기가 증가되고, 예를 들면, 대상체내에 연장된/지속된 처리 효과가 증진된다.
중합성 분자, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG화 부분(PEG))이 히알루로난 분해효소, 예를 들면 히알루로니다제와의 공유결합 또는 다른 안정한 결합(컨주게이션)은 얻어진 히알루로난 분해효소-중합체 조성물에 유익한 특성을 부여한다. 이러한 특성은 대상체내의 혈액, 세포 및/또는 다른 조직내에 향상된 생체적합성, 대상 내에서 단백질(및 효소활성) 반감기의 연장, 프로테아제 및 가수분해로부터 단백질의 효율적인 차단, 향상된 in vivo 분포, 향상된 약동학 및/또는 약동학 및 증가된 수용성을 포함한다.
히알루로난 분해효소, 예를 들면 히알루로니다제에 컨주게이션될 수 있는 중합체로는 천연 및 합성 동형중합체, 예를 들면 폴리올(즉, poly-OH), 폴리아민(즉, poly-NH2) 및 폴리카르복실산(즉, poly-COOH), 및 추가의 이형중합체, 즉 하나 또는 그 이상의 다른 커플링기, 예를 들면 하이드록실기 및 아민기를 포함하는 중합체를 포함한다. 적당한 중합성 분자로는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예를 들면 폴리프로필렌 글리콜(PEG), 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 및 폴리프로필렌 글리콜, PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG) 분지 폴리에틸렌 글리콜(PEGs), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리-D,L-아미노산, 폴리에틸렌-co-말레산 무수물, 폴리스티렌-co-말레산 무수물을 포함하는 폴리알킬렌 글리콜(PAG), 카르복시메틸-덱스트란, 헤파린, 동종 알부민을 포함하는 덱스트란, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스 카르복시에틸셀룰로오스 및 히드록시프로필셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스, 키토산 가수분해산물, 전분, 예를 들면 히드록시에틸 전분 및 히드록시프로필 전분, 글리코겐, 아가로스 및 그 유도체, 구아검, 풀루란, 이눌린, 크산탄검, 카라기난, 펙틴, 알기닌산 가수분해물 및 생-중합체를 포함한다.
일반적으로, 중합체는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예를 들면 폴리에틸렌 옥사이드, 예를 들면 PEG, 일반적으로 mPEG이고 이것은 덱스트란 및 풀루란과 같은 다당류에 비해 가교결합할 수 있는 반응성기를 거의 갖고 있지 않다. 일반적으로, 중합체는 비독성 중합성 분자, 예를 들면 (m)폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이고, 이것은 상대적으로 단순화학을 이용하여 히알루로난 분해효소, 예를 들면 히알루로니다제(예를 들면 단백질 표면에 부착된 기에 대한)에 공유결합으로 컨주게이션 될 수 있다.
치료제의 PEG화(Pegylation, 페길화)는 단백질 분해에 대한 저항을 증가시키고, 혈장 반감기를 증가시키고 항원성 및 면역원성을 감소시키는 것에 대해 보고되어 있다(예를 들면, Lu and Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu and Felix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993 ; Felix 등. , Int. J. Peptide Res., 46 : 253-64,
1995; Benhar 등., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu 등, J Immunol., 154: 3088-95, 1995 참조; Caliceti 등. (2003) Adv. DrugDeliv. Rev. 55(10):1261-77 및 Molineux (2003) Pharmacotherapy 23(8 Pt 2):3S-SS) 참조). PEG화는 in vivo에서 핵산분자의 전달에 사용될 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스의 PEG화는 안정성 및 유전자 전달을 증가시킬 수 있다 (예를 들면, Cheng 등. (2003) Pharm. Res. 20(9): 1444-51 참조).
히알루로니다제를 포함한 히알루로난 분해효소에 부착하기 위한 적당한 중합성 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PEG 유도체, 예를 들면 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐 이미다졸(CDI-PEG), 분지형 PEGs 및 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다(Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S (eds.) "Poly(ethy1ene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J.Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, Nature Reviews 2:215 et seq. (2003); and Tsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004 참조). 중합성 분자는 일반적으로 약 3kDa 내지 약 60kDa의 범위의 분자량의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질, 예를 들면 rHuPH20에 컨주게이션된 중합성 분자는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 또는 60 kDa 이상의 분자량을 갖는다.
PEG화 가용성 히알루로난 분해효소
본원에서 방법, 조성물 및 조합물에서 사용된 히알루로난 분해효소는 PEG화 히알루로난 분해효소, 예를 들면 PEG화 가용성 히알루로난 분해효소일 수 있다. 일례에서, PEG화 가용성 히알루로니다제, 예를 들면 PEG화 rHuPH20이다. PEG 또는 PEG 유도체를 공유결합(컨주게이션)함으로써 폴리펩티드를 변형하는 각종 방법(즉, "PEG화")이 당업계에 알려져 있다(예를 들면, 미국 제 2006/0104968호; 미국 5,672,662호; 미국 제 6,737,505호; 및 미국 제 2004/0235734호). PEG화하는 기술은 특별한 링커 및 커플링 약물(예컨대, Roberts et al, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002 참조), 분지형 PEG 등을 통해 단일 컨주게이션 부위에 다중 PEG 잔기의 접착(Guiotto 등., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002 참조), 부위 특이적 PEG화 및/또는 모노PEG화(Chapman 등., Nature Biotech. 17:780-783, 1999 참조) 및 부위 방향성 효소 PEG화(예를 들면, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002 참조)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 종래에 기재된 방법 및 기술은 단일 단백질 분자에 접착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 초과의 PEG 또는 PEG 유도체를 갖는 단백질을 생성할 수 있다(예컨대, 미국 제 2006/0104968호 참조).
PEG화용 수많은 시약이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 시약은 N-히드록시숙신이미딜(NHS) 활성 PEG, 숙신이미딜 mPEG, mPEG2-N-히드록시숙신이미드, mPEG 숙신이미딜 알파-메틸부타노에이트, mPEG 숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG 숙신이미딜 부타노에이트, mPEG 카르복시메틸 3-히드록시부탄산 숙신이미딜 에스테르, 호모 2관능성(homobifunctional) PEG-숙신이미딜 프로피오네이트, 호모 2관능성 PEG 프로피온 알데히드, 호모 2관능성 PEG 부티르알데히드, PEG 말레이미드, PEG 히드라지드, p-니트로페닐 카르보네이트 PEG, mPEG-벤조트리아졸 카르보네이트, 프로피온알데히드 PEG, mPEG 부티르알데히드, 분지형 mPEG2 부티르알데히드, mPEG 아세틸, mPEG 피페리돈, mPEG 메틸케톤, mPEG "링커없는" 말레이미드, mPEG 비닐 술폰, mPEG 티올, mPEG 오르쏘피리딜티오에스테르, mPEG 오르쏘피리딜 이황화, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, 비닐술폰 PEG-NHS, 아크릴레이트 PEG-NHS, 플루오레세인 PEG-NHS 및 바이오틴 PEG-NHS(예를 들면, Monfardini 등, Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese 등., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; 미국 특허 제5,672,662호; 미국 특허 제5,932,462호; 미국 특허 제 6,495,659호; 미국 특허 제6,737,505호; 미국 특허 제4,002,531호; 미국 특허 제4,179,337호; 미국 특허 제 5,122,614호; 미국 특허 제5,324, 844호; 미국 특허 제5,446,090호; 미국 특허 제5,612,460호; 미국 특허 제5,643,575호; 미국 특허 제5,766,581호; 미국 특허 제5,795, 569호; 미국 특허 제 5,808,096호; 미국 특허 제5,900,461호; 미국 특허 제5,919,455호; 미국 특허 제5,985,263호; 미국 특허 제 5,990, 237호; 미국 특허 제6,113,906호; 미국 특허 제6,214,966호; 미국 특허 제6,258,351호; 미국 특허 제 6,340,742호; 미국 특허 제6,413,507호; 미국 특허 제6,420,339호; 미국 특허 제6,437,025호; 미국 특허 제 6,448,369호; 미국 특허 제6,461,802호; 미국 특허 제6,828,401호; 미국 특허 제6,858,736호; 미국 공개 제 2001/0021763호; 미국 공개 제 2001/0044526호; 미국 공개 제 2001/0046481 호; 미국 공개 제 2002/0052430호; 미국 공개 제 2002/0072573호; 미국 공개 제 2002/0156047호; 미국 공개 제 2003/0114647호; 미국 공개 제 2003/0143596호; 미국 공개 제 2003/0158333호; 미국 공개 제 2003/0220447호; 미국 공개 제 2004/0013637호; 미국 공개 제 2004/0235734호; WO0500360; 미국 공개 제 2005/0114037호; 미국 공개 제 2005/0171328호; 미국 공개 제 2005/0209416호; 유럽특허 제 1064951 호; 유럽특허 제0822199호; WO 01076640호; WO 0002017호; WO 0249673호; WO 9428024호; 및 WO 0187925)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
D. 히알루로난 분해 효소를 암호화하는 핵산 및 이의 폴리펩티드를 제조하는 방법
본원에 기재된 히알루로난 분해효소, 예컨대 가용성 히알루로니다제의 폴리펩티드는 단백질 정제 및 재조합 단백질 발현에 대한 해당 기술분야에서 잘 알려진 방법들에 의해 획득될 수 있다. 원하는 유전자를 암호화하는 핵산의 확인을 위한 당업자에게 알려진 임의의 방법들이 사용될 수 있다. 당해 기술분야에서 이용할 수 있는 임의의 방법을 사용하여, 예컨대 세포 또는 조직 원료로부터, 히알루로니다제를 암호화하는, 전장(즉, 전체 암호화부위를 포함하는) cDNA 또는 게놈 DNA 클론을 획득할 수 있다. 변형된 또는 변이체 가용성 히알루로니다제는, 예컨대 위치-지정 돌연변이생성법(site-directed mutagenesis)에 의해 야생형 폴리펩티드로부터 제작될 수 있다.
폴리펩티드는 핵산분자의 클로닝 및 분리에 대하여 당업자에서 알려진 임의의 이용가능한 방법들을 이용하여 클로닝되거나 분리될 수 있다. 그러한 방법들은 핵산분자의 PCR 증폭, 및 핵산분자 혼성화 스크리닝, 항체-기반 스크리닝 및 활성-기반 스크리닝을 포함한, 라이브러리 스크리닝을 포함한다.
예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법을 포함한, 핵산의 증폭방법은 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 분리하는데 사용될 수 있다. 핵산 함유 재료는 원하는 폴리펩티드-암호화 핵산분자가 분리될 수 있는 출발 재료로써 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 mRNA 제제, 세포추출물, 조직추출물, 체액시료(예컨대, 혈액, 혈청, 침), 건강한 대상 및/또는 병에 걸린 대상의 시료가 증폭방법에서 사용될 수 있다. 핵산 라이브러리는 또한 출발재료의 원료로써 사용될 수 있다. 프라이머는 원하는 폴리펩티드를 증폭하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 원하는 폴리펩티드가 생성되는 발현된 서열을 기초로 설계될 수 있다. 프라이머는 폴리펩티드 아미노산 서열의 역-번역을 기초로 설계될 수 있다. 증폭에 의해 생성되는 핵산분자를 서열분석하여 원하는 폴리펩티드를 암호화하는지 확인할 수 있다.
벡터, 예를 들어 단백질 발현벡터, 또는 DNA 서열을 암호화하는 핵심 단백질의 증폭을 위하여 설계된 벡터 내로 합성 유전자를 클로닝하기 위한 목적으로 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 링커서열을 포함하는, 추가 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드-암호화 핵산분자에 연결될 수 있다. 더욱이, 기능성 DNA 요소들을 특정화하는 추가 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드-암호화 핵산분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그러한 서열의 예는 세포 내 단백질 발현을 용이하게 하도록 고안된 프로모터 서열, 및 단백질 분비를 용이하게 하는 분비서열, 예를 들어 이종(heterologous) 신호 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그러한 서열은 당업자에 알려져 있다. 추가 뉴클레오티드 잔기 서열, 예컨대 단백질 결합지역을 특정화하는 염기의 서열이 또한 효소-암호화 핵산분자에 연결될 수 있다. 상기 지역은 특정 표적세포 내로 효소 흡수(uptake)를 용이하게 하는 단백질을 촉진하거나 암호화하거나, 또는 그렇지 않으면 합성 유전자 산물의 약동학을 변화시키는 잔기서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 효소는 PEG 부분(moiety)에 연결될 수 있다.
또한, 예를 들어, 폴리펩티드의 검출 또는 친화성 정제(affinity purification)를 돕기 위한 태그 또는 다른 부분이 첨가될 수 있다. 예를 들어, 추가 핵산 잔기서열, 예컨대 에피토프 태그 또는 다른 검출가능한 마커를 특정화하는 염기서열이 또한 효소-암호화 핵산분자에 연결될 수 있다. 그러한 서열의 예는 His 태그(예컨대, 6xHis, HHHHHH; 서열번호 54) 또는 Flag 태그(DYKDDDDK; 서열번호 55)를 암호화하는 핵산서열을 포함한다.
그 다음 확인되고 분리된 핵산이 적당한 클로닝 벡터 내로 삽입될 수 있다. 당해 기술분야에서 알려진 많은 벡터-숙주 시스템들이 이용될 수 있다. 가능한 벡터는 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않고, 벡터 시스템은 사용된 숙주세포에 적합(compatible)해야만 한다. 그러한 벡터는 람다 유도체와 같은 박테리오파지, pCMV4, pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드 또는 블루스크립트 벡터(Stratagene, La Jolla, CA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 발현벡터는 본원에서 예시된 HZ24 발현 벡터를 포함한다. 클로닝 벡터 내 삽입은, 예를 들어 상보성 점착종단(cohesive termini)을 가지는 클로닝 벡터 내로 DNA 절편을 연결함으로써 달성될 수 있다. 삽입은 TOPO 클로닝 벡터(INVITROGEN, Carlsbad, CA)를 이용하여 행해질 수 있다. 만약 절편 DNA에 사용된 상보적 제한부위(restriction sites)가 클로닝 벡터 내에 존재하지 않는다면, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, DNA 말단 상에 뉴클레오티드 서열(링커)을 연결함으로써 원하는 임의의 부위가 제조될 수 있다; 이러한 연결된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인식서열을 암호화하는, 특정한, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 대안적 방법에서, 절단된 벡터 및 단백질 유전자는 단일중합체 테일링(homopolymeric tailing)에 의해 변형될 수 있다. 재조합 분자는 예를 들어, 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공(electroporation) 및 초음파천공(sonoporation)을 통해 숙주세포 내로 도입되어, 많은 복제의 유전자 서열을 생성할 수 있다.
특정 구현예에서, 분리된 단백질 유전자, cDNA 또는 합성된 DNA 서열을 도입한 재조합 DNA 분자로 숙주세포를 형질전환하는 것은 상기 유전자의 복수복제의 생성을 가능케 한다. 따라서, 형질전환체를 성장시키고, 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 분리하고, 필요한 경우 분리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자를 회수함으로써, 상기 유전자가 다량으로 획득될 수 있다.
1. 벡터 및 세포
하나 이상의 원하는 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 히알루로난 분해 효소와 같은 단백질의 재조합 발현을 위하여, 상기 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 모두 또는 일부를 함유하는 핵산이 적당한 발현벡터, 즉 삽입된 단백질 암호화서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 함유하는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 필수 전사 및 번역 신호가 또한 효소 유전자용 본래 프로모터, 및/또는 이들의 인접부위에 의해 제공될 수 있다.
또한 효소를 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터가 제공된다. 벡터를 함유하는 세포가 또한 제공된다. 상기 세포는 진핵 및 원핵세포를 포함하며, 벡터는 그안에 사용하기 적합한 임의의 벡터이다.
상기 벡터를 함유하는, 내피세포를 포함하는 원핵 및 진핵세포가 제공된다. 그러한 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균세포, 고세포(Archea), 식물세포, 곤충세포 및 동물세포를 포함한다. 암호화된 단백질이 세포에 의해 발현되는 조건하에서 상기-기술된 세포를 성장시키고, 발현된 단백질을 회수함으로써, 상기 세포를 이용하여 이들의 단백질을 생산한다. 본원의 목적을 위하여, 예를 들어, 효소가 배지 내로 분비될 수 있다.
고유의 또는 이종의 신호 서열에 연결된, 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드, 일부 경우 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 이들의 복수복제를 함유하는 벡터가 제공된다. 상기 세포 내 효소 단백질의 발현을 위하여, 또는 상기 효소 단백질이 분비성 단백질로서 발현되도록 벡터를 선택할 수 있다.
다양한 숙주-벡터 시스템이 단백질 암호화 서열을 발현하는데 사용될 수 있다. 이들은 바이러스(예컨대, 백시니아바이러스(vaccinia virus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 다른 바이러스)로 감염된 포유류 세포 시스템; 바이러스(예컨대, 배큘로바이러스(baculovirus))로 감염된 곤충세포 시스템; 미생물, 예컨대 효모 벡터를 함유하는 효모; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 벡터의 발현요소는 그들의 강도 및 특이성에서 다르다. 사용된 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적절한 전사 및 번역요소 중에서 임의의 하나가 사용될 수 있다.
DNA 절편을 벡터 내로 삽입하기 위한 당업자에 알려진 임의의 방법들이 적당한 전사/번역 조절 신호 및 단백질 암호화 서열을 함유하는 키메릭 유전자를 함유하는 발현벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 in vitro 에서 재조합 DNA 및 합성 기법, 및 in vivo 재조합체(유전자 재조합)를 포함할 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산서열, 또는 도메인, 유도체, 절편, 또는 이들의 동족체(homologs)의 발현이 제2 핵산서열에 의해 조절됨으로써, 이들의 유전자 및 절편이 재조합 DNA 분자(들)로 형질전환된 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 단백질 발현은 해당 기술분야에서 알려진 임의의 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 원하는 단백질에 대한 유전자에 고유한 것이 아니다. 사용될 수 있는 프로모터는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: SV40 초기 프로모터(early promoter)(Bernoist 및 Chambon, Nature 290:304-310(1981)), 라우스육종(Rous sarcoma) 바이러스의 3' 장 말단반복(long terminal repeat) 내에 함유된 프로모터(Yamamoto 등 Cell 22:787-797(1980)), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445(1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절서열(Brinster 등, Nature 296:39-42(1982)); 원핵생물 발현벡터, 예컨대 β-락타마제 프로모터(Jay 등,(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) 또는 택(tac) 프로모터(DeBoer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25(1983)); 또한 [Scientific American 242:79-94(1980)] 내 "Useful Proteins from Recombinant Bacteria" 참조; 노팔린 합성효소(nopaline synthetase) 프로모터를 함유하는 식물 발현벡터(Herrar-Estrella 등, Nature 303:209-213(1984)) 또는 컬리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner 등, Nucleic Acids Res. 9:2871(1981)), 및 광합성효소 리불로스이인산 카르복실라제(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase)의 프로모터(Herrera-Estrella 등, Nature 310:115-120(1984)); 효모 및 다른 진균 유래 프로모터 요소, 예컨대 Gal4 프로모터, 알콜탈수소효소 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 및 조직특이성을 보이고 트랜스제닉 동물에서 사용되어온 다음의 동물 전사조절부위: 췌장 포상세포(pancreatic acinar cells)에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절부위(Swift 등, Cell 38:639-646(1984); Ornitz 등, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409(1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515(1987)); 췌장 베타세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절부위(Hanahan 등, Nature 315:115-122(1985)), 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절부위(Grosschedl 등, Cell 38:647-658(1984); Adams 등, Nature 318:533-538(1985); Alexander 등, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444(1987)), 고환, 유방, 림프계 및 비만세포에서 활성인 마우스 유선암 바이러스 조절부위(Leder 등, Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절부위(Pinckert 등, Genes 및 Devel. 1:268-276(1987)), 간에서 활성인 알파-태아단백질(fetoprotein) 유전자 조절부위(Krumlauf 등, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648(1985); Hammer 등, Science 235:53-58(1987)), 간에서 활성인 알파-1 항트립신 유전자 조절부위(Kelsey 등, Genes and Devel. 1:161-171(1987)), 골수세포에서 활성인 베타글로빈 유전자 조절부위(Magram 등, Nature 315:338-340(1985); Kollias 등, Cell 46:89-94(1986)), 뇌의 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에서 활성인 수초염기성단백질(myelin basic protein) 유전자 조절부위(Readhead 등, Cell 48:703-712(1987)), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절부위(Shani, Nature 314:283-286(1985)), 및 시상하부의 성선자극세포(gonadotrophs)에서 활성인 성선자극호르몬 분비호르몬(Mason 등, Science 234:1372-1378(1986)).
특정 구현예에서, 원하는 단백질 또는 도메인, 이들의 절편, 유도체 또는 동족체를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터, 하나 이상의 복제기점 및 임의적으로 하나 이상의 선별마커(예컨대, 항생제 내성 유전자)를 함유하는 벡터가 사용된다. E. coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 예는 예를 들어, pQE 발현벡터(Qiagen, Valencia, CA에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Qiagen에 의해 공개된 문헌 참조)를 포함한다. pQE 벡터는 E. coli에서 엄격하게 조절되는, 재조합 단백질의 고수준 발현을 제공하는 파지 T5 프로모터(E. coli RNA 폴리머라제에 의해 인식됨) 및 이중 lac 오퍼레이터 억제모듈, 효율적인 번역을 위한 합성 리보솜 결합부위(RBS Ⅱ), 6XHis 태그 암호화서열, t0 및 T1 전사 종결자, ColE1 복제기점, 및 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 가진다. pQE 벡터는 재조합 단백질의 N- 또는 C-말단에 6xHis 태그의 배치를 가능하게 한다. 상기 플라스미드는 세개의 판독프레임 모두를 위한 다중 클로닝 부위(multiple cloning sites)를 제공하고, N-말단 6xHis-태그된 단백질의 발현을 위해 제공하는, pQE 32, pQE 30 및 pQE 31을 포함한다. E.coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 다른 예는, 예를 들어, pET 발현벡터(미국특허 4,952,496 참조; NOVAGEN, Madison, WI 에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Novagen에서 공개된 문헌 참조)를 포함한다. 상기 플라스미드는 T7lac 프로모터, T7 종결자, 유도성 E. coli lac 오퍼레이터 및 lac 억제유전자를 포함하는 pET11a; T7 프로모터, T7 터미네이터 및 E. coli ompT 분비 신호를 함유하는 pET 12a-c; 및 His 컬럼으로 정제에서 사용하기 위한 His-Tag™ 리더서열, 및 컬럼을 통한 정제후 절단을 가능케 하는 트롬빈 절단부위, T7-lac 프로모터 부위 및 T7 종결자를 함유하는 pET 15b와 pET19b(NOVAGEN, Madison, WI)가 있다.
포유류 세포 발현용 벡터의 예는 HZ24 발현벡터이다. HZ24 발현벡터는 pCI 벡터 백본(Promega)로부터 유래되었다. 이는 베타-락타마제 내성 유전자(AmpR)를 암호화하는 DNA, F1 복제기점, 사이토메갈로바이러스의 극-초기(immediate-early) 인핸서/프로모터 부위(CMV) 및 SV40 후기(late) 폴리아데닐레이션 신호(SV40)을 포함한다. 상기 발현벡터는 또한 ECMV 바이러스(Clontech)의 내부 리보솜성 부착부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES) 및 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 가진다.
2. 발현
가용성 히알루로니다제를 포함한, 히알루로난 분해효소는 in vivo 및 in vitro 방법을 포함한 당업자에게 알려진 임의의 방법들에 의하여 제조될 수 있다. 원하는 단백질은 예컨대 투여 및 치료에 필요한, 상기 단백질의 요구되는 양 및 형태를 생산하기에 적당한 임의의 유기체에서 발현될 수 있다. 발현숙주는 진핵생물 및 원핵생물 유기체, 예컨대 E. coli, 효모, 식물, 곤충세포, 사람 세포주 및 트랜스제닉 동물을 포함한 포유류 세포를 포함한다. 발현숙주는 그 단백질 생산 수준 뿐만 아니라 발현된 단백질에 존재하는 번역-후 변형의 형태에서 상이하다. 발현숙주는 상기 및 기타 요인들, 예컨대 규제 및 안전성 고려사항, 생산비용 및 정제 필요성과 방법에 기초하여 선택될 수 있다.
많은 발현벡터들이 이용가능하고, 당업자에게 알려져 있으며, 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있다. 발현벡터의 선택은 숙주발현시스템의 선택에 의해 영향받을 것이다. 일반적으로, 발현벡터는 전사 프로모터와 임의적으로 인핸서, 번역 신호, 및 전사와 번역의 종결 신호를 포함할 수 있다. 안정한 형질전환에 사용되는 발현벡터는 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 가능케하는 선별마커를 전형적으로 가진다. 일부 경우, 벡터의 복제수를 증폭시키기 위해 복제기점이 이용될 수 있다.
가용성 히알루로니다제 폴리펩티드와 같은 히알루로난 분해효소는 또한 단백질 융합으로써 활용되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 효소융합은 효소에 추가 기능성을 부가하도록 생성될 수 있다. 효소융합 단백질의 예는 신호 서열, 예컨대 국재화용 태그, 예를 들어 his6 태그 또는 myc 태그, 또는 정제용 태그, 예를 들어 GST 융합, 그리고 단백질 분비 및/또는 막 연합을 지시하는 서열의 융합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
a. 원핵세포
원핵생물, 특히 E. coli는 대량의 단백질을 생산하기 위한 시스템을 제공한다. E. coli의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 간단하고 신속한 기법이다. E. coli용 발현벡터는 유도성 프로모터를 함유할 수 있고, 그러한 프로모터는 고수준의 단백질 발현 유도 및 숙주세포에 어떤 독성을 나타내는 단백질 발현에 유용하다. 유도성 프로모터의 예는 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7과 SP6 RNA 프로모터 및 온도로 조절되는 λPL 프로모터를 포함한다.
단백질, 예컨대 본원에서 제공되는 임의의 것은 E. coli의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 상기 세포질은 환원성 환경이고, 일부 분자에 대하여, 이는 불용성 봉입체(inclusion bodies) 형성을 초래할 수 있다. 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 및 β-머캅토에탄올 및 변성화제, 예컨대 구아니딘-HCl 및 우레아가 단백질을 재용해하는데 사용될 수 있다. 대안적 접근법은 산화성 환경 및 샤페로닌-유사의 다이설파이드 이소머라제(disulfide isomerases)를 제공하여, 가용성 단백질의 생산을 야기할 수 있는, 박테리아의 주변세포질공간(periplasmic space) 내 단백질 발현이다. 전형적으로, 주변세포질로 단백질을 지시하는 리더서열이 발현되는 단백질에 융합된다. 이어서, 상기 리더는 주변세포질 내 신호 펩티다아제에 의해 제거된다. 주변세포질-표적 리더서열의 예는 펙테이트 리아제 유전자의 pelB 리더 및 알카라인 포스파타제 유전자 유래 리더를 포함한다. 일부 경우, 주변세포질 발현은 배양배지 내로 발현된 단백질의 유출을 허용한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터 신속하고 간단한 정제를 가능케 한다. 분비되지 않는 단백질은 삼투압성 용해에 의해 주변세포질로부터 수득될 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부 경우 단백질은 불용성이 되며, 재용해 및 리폴딩(refolding)을 촉진하기 위해 변성화제와 환원제를 사용할 수 있다. 유도 및 성장 온도는 또한 발현수준 및 용해도에 영향을 줄 수 있으며, 전형적으로 25℃와 37℃ 사이의 온도가 사용된다. 전형적으로, 박테리아는 아글리코실화된(aglycosylated) 단백질을 생산한다. 따라서, 만약에 단백질이 기능하는데 글리코실화를 필요로 한다면, 숙주세포로부터 정제후 in vitro에서 글리코실화가 부가될 수 있다.
b. 효모 세포
효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아료위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)가 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것의 생산에 사용될 수 있는 잘 알려진 효모 발현숙주이다. 효모는 에피솜 복제 벡터 또는 동종성 재조합에 의한 안정한 염색체 통합에 의해서 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 유도성 프로모터는 유전자 발현을 조절하는데 사용된다. 그러한 프로모터의 예는 GAL1, GAL7 및 GAL5, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 CUP1, AOX1 또는 다른 피치아(Pichia), 또는 다른 효모 프로모터를 포함한다. 발현벡터는 대개 형질전환된 DNA의 선별 및 유지를 위한 선별마커, 예컨대 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3을 포함한다. 효모에서 발현된 단백질은 대개 가용성이다. 샤페로닌, 예컨대 Bip 및 단백질 다이설파이드 이소머라제와 공동-발현은 발현수준 및 용해도를 개선시킬 수 있다. 또한, 효모에서 발현된 단백질은 신호 펩티드 융합, 예컨대 사카로마이세스 세레비제의 효모 교배형 알파-인자 분비 신호, 및 효모 세포표면 단백질, 예컨대 Aga2p 교배 부착수용체(mating adhesion receptor) 또는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adreninivorans) 글루코아밀라제와 융합을 이용하여 분비되도록 유도될 수 있다. Kex-2 프로테아제와 같은 프로테아제 절단부위는 분비경로를 탈출시, 발현된 폴리펩티드로부터 융합된 서열을 제거되도록 조작될 수 있다. 효모는 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화가 가능하다.
c. 곤충세포
특히 배큘로바이러스 발현을 이용하는, 곤충세포는 폴리펩티드, 예컨대 히알루로난 분해효소의 발현에 유용하다. 곤충세포는 고수준의 단백질을 발현하고, 고등 진핵생물에 의해 이용되는 번역-후 변형 대부분이 가능하다. 배큘로바이러스는 안전성을 개선하고, 진핵발현의 규제 우려(regulatory concerns)를 감소시키는 제한성 숙주범위를 가진다. 전형적인 발현벡터는 고수준 발현을 위한 프로모터, 예컨대 배큘로바이러스의 다각체(polyhedrin) 프로모터를 사용한다. 일반적으로 사용되는 배큘로바이러스 시스템은 배큘로바이러스, 예컨대 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵다각체병 바이러스(AcNPV), 및 누에나방(Bombyx mori) 핵다각체병 바이러스(BmNPV) 및 곤충세포주, 예컨대 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 제왕나비(Danaus plexippus)(DpN1)에서 유래된 Sf9를 포함한다. 고수준의 발현을 위하여, 발현될 분자의 뉴클레오티드 서열이 바이러스의 다각체 개시코돈의 바로 하류에 융합된다. 포유류 분비 신호는 곤충세포에서 정확히 프로세싱되고, 발현된 단백질을 배양배지 내로 분비하기 위하여 이용될 수 있다. 또한, 세포주 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 곤주나비(Danaus plexippus)(DpN1)는 포유류 세포 시스템과 유사한 글리코실화 패턴을 가진 단백질을 생산한다.
곤충세포에서 대체 발현시스템은 안정하게 형질전환된 세포의 사용이다. 세포주, 예컨대 Schneider 2(S2) 및 Kc 세포(Drosophila melanogaster) 및 C7 세포(Aedes albopictus)가 발현에 사용될 수 있다. 초파리 메탈로티오네인 프로모터를 이용하여 카드뮴 또는 구리로 중금속 유도 존재 하 고수준의 발현을 유도할 수 있다. 발현벡터는 선별마커, 예컨대 네오마이신 및 하이그로마이신을 사용하여 전형적으로 유지된다.
d. 포유류 세포
포유류 발현 시스템은 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드와 같은 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드를 포함하는, 단백질 발현에 이용될 수 있다. 발현 구축물(construct)은 아데노바이러스와 같은 바이러스 감염, 또는 리포솜, 인산칼슘, DEAE-덱스트란과 같은 직접적인 DNA 이동, 및 전기천공과 미세주입과 같은 물리적인 수단에 의해 포유류 세포로 전달할 수 있다. 포유류 세포용 발현벡터는 전형적으로 mRNA 캡 부위, TATA 박스, 번역개시서열(Kozak 공통서열) 및 폴리아데닐화 요소를 포함한다. IRES 요소가 또한 다른 유전자, 예컨대 선별마커를 이용한 바이시스트로닉(bicistronic) 발현을 가능케 하도록 부가될 수 있다. 상기 벡터는 종종 고수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스(RSV)의 장 말단반복(long terminal repeat)을 포함한다. 이러한 프로모터-인핸서는 많은 세포형에서 활성이다. 조직 및 세포-형 프로모터 및 인핸서 부위가 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 프로모터/인핸서 부위의 예는 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유선암 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질(fetoprotein), 알파 1 항트립신, 베타글로빈, 수초염기성단백질, 미오신 경쇄 2, 및 성선자극호르몬 분비호르몬 유전자 조절과 같은 유전자 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 선별마커는 발현 구축물을 가진 세포를 선별하고 유지하는데 사용될 수 있다. 선별마커 유전자의 예는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 디아미나제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 티미딘 키나제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 메토트렉세이트 존재하에 발현을 수행하여 DHFR 유전자를 발현하는 세포만을 선별할 수 있다. 세포표면 신호링 분자, 예컨대 TCR-ζ 및 FcεRI-γ와 융합은 세포표면에서 활성상태인 단백질 발현을 지시할 수 있다.
마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포를 포함한 많은 세포주가 포유류 발현에 이용가능하다. 세포주의 예는 CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비분비성) 및 다른 골수종(myeloma) 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유모세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, 및 HKB 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포배양 배지로부터 분비된 단백질의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 적응된 세포주 또한 이용가능하다. 예는 CHO-S 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat# 11619-012) 및 무혈청 EBNA-1 세포주(Pham 등,(2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42)를 포함한다. 최대발현을 위해 최적화된 특정 배지에서 성장하도록 적응된 세포주가 또한 이용가능하다. 예를 들어, DG44 CHO 세포는 화학적으로 규명된, 동물 산물-부재 배지 내 현탁 배양물에서 성장하도록 적응되어 있다.
e. 식물
트랜스제닉 식물세포 및 식물이 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것을 발현하는데 이용될 수 있다. 발현 구축물은 전형적으로 미세입자투사법(microprojectile bombardment) 및 원형질체 내로의 PEG-매개 이동과 같은 직접적 DNA 이동을 이용하여, 그리고 아그로박테리움-매개 형질전환으로 식물로 전달될 수 있다. 발현벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사종결요소 및 번역조절요소를 포함할 수 있다. 발현벡터 및 형질전환 기법은 보통 쌍자엽식물(dicot) 숙주, 예컨대 애기장대(Arabidopsis)와 담배(tobacco), 및 단자엽식물(monocot), 예컨대 쌀과 옥수수로 나뉜다. 발현을 위한 식물 프로모터의 예는 컬리플라워 모자이크 (cauliflower mosaic) 바이러스 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터, 리보스이인산 카르복실라제 프로모터, 및 유비퀴틴 및 UBQ3 프로모터를 포함한다. 선별마커, 예컨대 하이그로마이신, 포스포만노스 이소머라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제가 종종 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 용이하게 하는데 사용된다. 형질전환된 식물세포는 세포, 응집체(캘러스 조직)로서 배양물 내 유지되거나 전체식물로 재생될 수 있다. 트랜스제닉 식물세포는 또한 히알루로니다제 폴리펩티드를 생산하도록 조작된 조류(algae)를 포함할 수 있다. 식물은 포유류 세포와 다른 글리코실화 패턴을 가지므로, 이는 이들 숙주 내에서 생산되는 단백질 선택에 영향을 미칠 수 있다.
3. 정제기술
숙주세포로부터, 히알루로난 분해효소 폴리펩티드 (예를 들면, 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드) 또는 다른 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 정제방법은 선택된 숙주세포 및 발현시스템에 좌우될 것이다. 분비된 분자를 위하여, 단백질은 일반적으로 세포를 제거한 후 배양배지로부터 정제된다. 세포내 발현을 위하여, 세포는 용해되고, 단백질은 추출물로부터 정제될 수 있다. 트랜스제닉 유기체, 예컨대 트랜스제닉 식물 및 동물이 발현을 위해 사용될 때, 용해된 세포추출물을 만들기 위하여 조직 또는 기관이 출발재료로써 사용될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 동물 생산은 우유 또는 알에서 폴리펩티드 생산을 포함할 수 있으며, 이는 수집되어, 필요하다면, 상기 단백질이 추출되고, 당해 기술분야의 표준방법을 이용하여 추가 정제될 수 있다.
단백질, 예컨대 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드는 SDS-PAGE, 크기분획(size fraction) 및 크기배제(size exclusion) 크로마토그래피, 암모늄 술페이트 침전, 및 이온교환 크로마토그래피, 예컨대 음이온교환을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당해 기술분야에 알려진 표준 단백질 정제기술을 이용하여 정제될 수 있다. 친화성 정제기술 또한 제제의 효율 및 순도를 향상시키기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, 항체, 수용체 및 히알루로니다제 효소에 결합하는 다른 분자가 친화성 정제에서 이용될 수 있다. 발현 구축물은 또한 단백질, 예컨대 myc 에피토프, GST 융합 또는 His6에 친화성 태그를 부가하도록 조작되고, myc 항체, 글루타치온 레진 및 Ni-레진으로 각각 친화성 정제될 수 있다. 겔전기영동 및 염색 및 분광광도기법을 포함한, 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 순도가 평가될 수 있다. 본원에 제공된, 정제된 rHuPH20 조성물은 일반적으로 적어도 70,000 내지 100,000 유닛/mg, 예를 들어 약 120,000 유닛/mg의 특이적 활성을 갖는다. 특이적 활성은 중합체와의 결합 등 변형에 따라 다양할 수 있다.
4. 히알루로난 분해효소 폴리펩티드의 PEG화
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 PEG가 생체적합성, 무독성, 비면역원성 및 수용성 중합체이기 때문에 생체적합재료, 생명공학 및 약물에서 널리 사용되어 왔다 (Zhao and Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997). 약물 전달 영역에서 PEG 유도체는 단백질과의 공유결합(즉, PEG화)에 널리 사용되어 면역원성, 단백질분해 및 신장에서의 클리어런스를 감소시키고 가용성을 향상시킨다(Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995). 마찬가지로, PEG는 저분자량, 비교적 소수성 약물에 부착되어 독성을 감소시키고 in vivo분포를 변경시킨다. 일반적으로 PEG화 약물은 용액으로서 주입된다.
분해성 및 가용성 약물 캐리어의 설계에서 사용된 많은 동일한 약물이 분해성 겔의 설계에서 사용될 수 있기 때문에 약물전달에 사용하기 위한 가교 분해성 PEG망의 합성 또는 제형화에 밀접하게 관련된다(Sawhney 등.,Macromolecules 26: 581-87, 1993). 고분자간 복합체는 2개의 상보적 중합체의 용액을 혼합함으로써 형성될 수 있다. 이러한 복합체는 일반적으로 관련 중합체 사이에 정전기 상호작용(다가음이온-다가양이온) 및/또는 수소결합(다가산-다가염기) 및/또는 수성 환경에서 중합체 사이에 소수성 상호작용에 의해 안정화된다(Krupers 등.,Eur. Polym J. 32:785-790, 1996). 예를 들면, 적당한 조건하에서 다가아크릴산(PAAc)과 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)의 혼합용액은 대부분 수소결합에 기초한 복합체를 형성시킨다. 생리적 조건에서 이들 복합체의 해리는 유리 약물(즉, 비-PEG화 약물)의 전달을 위해 사용되고 있다. 또한, 상보적인 중합체의 복합체는 동형 중합체(homopolymer)와 혼성중합체(copolymer)로부터 형성되었다.
PEG화용 수많은 시약에 대해 당업계에 기술되어 있다. 이러한 시약은 N-히드록시숙신이미딜(NHS) 활성 PEG, 숙신이미딜 mPEG, mPEG2-N-히드록시숙신이미드, mPEG 숙신이미딜 알파-메틸부타노에이트, mPEG 숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG 숙신이미딜 부타노에이트, mPEG 카르복시메틸 3-히드록시부탄산 숙신이미딜 에스테르, 호모 2관능성 PEG-숙신이미딜 프로피오네이트, 호모 2관능성 PEG 프로피온 알데히드, 호모 2관능성 PEG 부티르알데히드, PEG 말레이미드, PEG 히드라지드, p-니트로페닐 카르보네이트 PEG, mPEG-벤조트리아졸 카르보네이트, 프로피온 알데히드 PEG, mPEG 부티르알데히드, 분지 mPEG2 부티르알데히드, mPEG 아세틸, mPEG 피페리돈, mPEG메틸케톤, mPEG "링커없는" 말레이미드, mPEG 비닐 술폰, mPEG 티올, mPEG 오르쏘피리딜티오에스테르, mPEG 오르쏘피리딜 이황화, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, 비닐술폰 PEG-NHS, 아크릴레이트 PEG-NHS, 플루오레세인 PEGNHS 및 바이오틴 PEG-NHS(예를 들면, Monfardini 등, Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese 등., J.Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; 미국 특허 제5,672,662호; 미국 특허 제5,932,462호; 미국 특허 제6,495,659호; 미국 특허 제6,737,505호; 미국 특허 제4,002,531호; 미국 특허 제4,179,337호; 미국 특허 제5,122,614호; 미국 특허 제5,324, 844호; 미국 특허 제5,446,090호; 미국 특허 제5,612,460호; 미국 특허 제5,643,575호; 미국 특허 제5,766,581호; 미국 특허 제5,795, 569호; 미국 특허 제 5,808,096호; 미국 특허 제5,900,461호; 미국 특허 제5,919,455호; 미국 특허 제5,985,263호; 미국 특허 제 5,990, 237호; 미국 특허 제6,113,906호; 미국 특허 제6,214,966호; 미국 특허 제6,258,351호; 미국 특허 제 6,340,742호; 미국 특허 제6,413,507호; 미국 특허 제6,420,339호; 미국 특허 제6,437,025호; 미국 특허 제 6,448,369호; 미국 특허 제6,461,802호; 미국 특허 제6,828,401호; 미국 특허 제6,858,736호; 미국 공개 제 2001/0021763호; 미국 공개 제 2001/0044526호; 미국 공개 제 2001/0046481 호; 미국 공개 제 2002/0052430호; 미국 공개 제 2002/0072573호; 미국 공개 제 2002/0156047호; 미국 공개 제 2003/0114647호; 미국 공개 제 2003/0143596호; 미국 공개 제 2003/0158333호; 미국 공개 제 2003/0220447호; 미국 공개 제 2004/0013637호; 미국 공개 제 2004/0235734호; WO0500360; 미국 공개 제 2005/0114037호; 미국 공개 제 2005/0171328호; 미국 공개 제 2005/0209416호; 유럽특허 제1064951 호; 유럽특허 제0822199호; WO 01076640호; WO 0002017호; WO 0249673호; WO 9428024호; 및 WO 0187925호)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
일례에서, 폴리에틸렌글리콜은 약 3kD 내지 약 50kD, 예시적으로 약 5kD 내지 약 30kD의 범위의 분자량을 갖는다. 약물에 PEG의 공유결합(PEG화라고 알려진)은 공지의 약물합성기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 단백질의 PEG화는 적당한 반응조건하에서 NHS-활성화된 PEG와 단백질을 반응시킴으로써 달성될 수 있다.
수많은 반응은 PEG화에 대해 기재되어 있지만, 일반적으로 적용할 수 있는 것은 방향성을 제공하고 온화한 반응조건을 이용하고 독성 촉매 또는 부산물을 제거하기 위한 광범위한 하류처리는 필요로 하지 않는다. 예를 들면, 모노메톡시 PEG(mPEG)는 단지 하나의 반응성 말단 히드록실을 가지므로 그 이용은 얻어진 PEG 단백질 생성 혼합물의 일부의 불균질물을 한정한다. 친핵성 공격에 민감한 다양한 PEG를 만들 목적으로 말단 메톡시기와 반대의 중합체의 말단에서 히드록실기의 활성은 유효한 단백질을 PEG화하는 것이 필요하다. 공격성 친핵제는 보통 라이실잔기의 엡실론-아미노기이지만 국소조건이 바람직하다면 다른 아민이 반응할 수 있다(예를 들면, 히스티딘의 N-말단 알파 아민 또는 환상 아민). 더욱 직접적인 부착은 단일 라이신 또는 시스테인을 함유하는 단백질에서 가능하다. 후자의 잔기는 티올 특이적 변형에 대한 PEG-말레이미드를 목적으로 한다. 또한, PEG 히드라지드는 과요오드산 산화된 히알루로난 분해효소와 반응하고 NaCNBH3의 존재하에서 환원된다. 보다 구체적으로, PEG화 CMP 당은 적절한 글리코실 전이효소의 존재하에서 히알루로난 분해효소와 반응할 수 있다. 하나의 기술은 문제의 폴리펩티드에 많은 중합성 분자가 결합된 "PEG화" 기술이다. 이 기술을 사용하면 면역 시스템은 항체의 형성을 담당하는 기인한 폴리펩티드 표면에 에피토프를 인지하는 데에 어려움을 가지며 이에 의해 면역반응을 감소시킨다. 특별한 생리적 효과를 제공하기 위해 인체의 순환계에 직접적으로 도입된 폴리펩티드(즉 작용제)에 대해, 일반적인 가능한 면역반응은 IgG 및/또는 IgM 반응이지만 호흡계를 통해 흡입된 폴리펩티드(즉, 산업용 폴리펩티드)는 IgE 반응(즉 알러지)을 일으킬 수 있다. 감소된 면역반응을 설명하는 이론 중 하나는 중합성 분자가 항체 형성을 야기하는 면역반응을 담당하는 폴리펩티드의 표면의 에피토프를 차폐하는 것이다. 다른 이론 또는 적어도 부분적인 인자는 컨주게이트가 무거울수록 감소된 면역반응이 얻어진다는 것이다.
일반적으로, PEG화 히알루로니다제를 포함하는 본원에서 제공된 PEG화 히알루로난 분해효소를 제조하기 위해, PEG화 잔기는 폴리펩티드에 공유결합을 통해 컨주게이션된다. PEG화 기술은 특별한 링커 및 커플링 약물(예를 들면 Roberts 등, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002 참조), 단일 컨주게이션부위에 다중 PEG 잔기를 결합(예를 들면 분지 PEG를 사용하여; Guiotto 등., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), 부위 특이적 PEG화 및/또는 모노 PEG화(Chapman 등, Nature Biotech. 17:780-783, 1999 참조), 및 부위-직접적 효소 PEG화 (Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002 참조)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 종래에 기재된 방법 및 기술은 단일 단백질 분자에 접착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 초과 PEG 또는 PEG 유도체를 갖는 단백질을 생성할 수 있다(미국 특허 제 2006/0104968호 참조).
PEG화 히알루로난 분해효소, 예를 들면 PEG화 히알루로니다제를 제조하기 위한 PEG화 방법의 예시로서, PEG 알데히드, 숙신이미드 및 카르보네이트는 PEG 잔기, 일반적으로 숙신이미딜PEG를 rHuPH20에 컨주게이션하는데 적용되어 왔다. 예를 들면, rHuPH20은 mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA), mPEG-숙신이미딜 부타노에이트(mPEG-SBA), 및 ("분지"PEG 접착용) mPEG-N-히드록시숙신이미드를 포함하는 예시의 숙신이미딜 모노PEG(mPEG) 시약과 컨주게이션되어 있다. 이들 PEG화 숙신이미딜 에스테르는 PEG기와 활성화 크로스 링커 사이에 다른 길이의 탄소골격, 및 단일 또는 분지 PEG기 중의 어느 하나를 함유한다. 이러한 차이는, 예를 들면 컨주게이션처리 중 다른 반응 속도론에 제공하고 rHuPH20에 PEG 컨주게이션에 이용가능한 부위를 제한하는데 사용될 수 있다.
(상기 기재된)선형 또는 분지 PEG 중 어느 하나를 포함하는 숙신이미딜 PEG은 rHuPH20에 컨주게이션될 수 있다. PEG는 히알루로니다제 당 3개 내지 6개의 PEG 분자를 갖는 분자의 조합물을 포함하는 재생산적으로 rHuPH20을 생성시키는데 사용될 수 있다. 이러한 PEG화 rHuPH20 조성물은 용이하게 정제되어 대략 25,000 또는 30,000 유닛/mg 단백질의 히알루로니다제 활성도로 특이적 활성을 갖고 실질적으로 비-PEG화 rHuPH20을 갖지 않는(5% 미만의 비-PEG화 rHuPH20) 조성물을 생산할 수 있다.
각종 PEG 시약을 사용하여, 히알루로난 분해효소의 예시 버전, 특히 가용성 인간 재조합 히알루로니다제(예를 들면, rHuPH20)는 예를 들면 mPEG-SBA (30 kD), mPEG-SMB (30 kD), 및 mPEG2-NHS (40 kD), mPEG2-NHS (60 kD)에 기초한 분지형을 사용하여 제조할 수 있다. rHuPH20의 PEG화 형태는 NHS 약물 또한 카르보네이트 및 알데히드를 사용하고 하기의 각각의 시약을 사용하여 제조되고 있다: mPEG2-NHS-40K 분지형, mPEG-NHS-lOK 분지형, mPEG-NHS-20K 분지형, mPEG-NHS-40K 분지형, mPEG2-NHS-60K 분지형; mPEG-SBA-5K; mPEG-SBA-20K; mPEG- SBA-30K; mPEG-SMB-20K; mPEG-SMB-30K; mPEG-부티르알데히드; mPEG-SPA- 2OK; mPEG-SPA-30K; 및 PEGNHS-5K-바이오틴. PEG화 히알루로니다제는 Dowpharma의 p-니트로페닐 카르보네이트 PEG(30kDa) 및 프로피온알데히드 PEG(30kDa)로 PEG화 히알루로니다제를 포함하는 Dow Chemical Corporation의 사업부인 Dowpharma로부터 시판된 PEG화 시약을 사용하여 제조되었다.
일례에서, PEG화는 mPEG-SBA, 예를 들면 mPEG-SBA-30K(약 30Kda의 분자량을 갖는) 또는 다른 PEG 부탄산 유도체의 숙신이미딜 에스테르의 가용성 히알루로니다제에 컨주게이션을 포함한다. PEG 부탄산 유도체의 숙신이미딜 에스테르, 예를 들면 mPEG-SBA-30K를 단백질의 아미노기와 결합하는 것이 용이하다. 예를 들면, m-PEG-SBA-30K 및 rHuPH20의 공유결합 (이것은 크기가 대략 60KDa임)은 하기 반응식 1에서 나타낸 rHuPH20와 mPEG 사이의 안정한 아미드 결합을 제공한다.
반응식 1:
Figure 112017000450674-pat00005
일반적으로 mPEG-SBA-30K 또는 기타 PEG를 히알루로난 분해효소, 일부 예에서, 히알루로니다제, 적당한 완충액, 예를 들면 pH 6.8에서 130 mM NaCl/10mM HEPES, 또는 pH 7에서 70 mM의 인산염 완충액 중에서 PEG:폴리펩티드를 10:1의 몰비로 첨가하고, 이어서 멸균화, 예를 들면 멸균여과를 실시하고, 예를 들면 밤새동안 4℃에서 냉각실에서 교반하면서 계속된 컨주게이션을 실시한다. 일례에서, 컨주게이션화된 PEG-히알루로난 분해효소는 농축되고 완충액-교환된다.
다른 PEG 부탄산 유도체의 숙신이미딜 에스테르, 예를 들면 mPEG-SBA-30K를 결합하는 방법은 당업계에 알려져 있다(미국특허 제5,672,662호; 미국특허 제6,737,505호; 및 미국 공개 제 2004/0235734호). 예를 들면, 폴리펩티드, 예를 들면 히알루로난 분해효소(예를 들면, 히알루로니다제)는 붕산 완충액(0.1M, pH 8.0) 중에서 4 ℃에서 1시간 동안 반응하여 NHS 활성화된 PEG 유도체에 결합될 수 있다. 얻어진 PEG화 단백질은 초여과에 의해 정제될 수 있다. 대안적으로, 소 알칼리성 포스페이스트의 PEG화는 0.2M 소디움 포스페이트와 0.5M NaCl(pH 7.5)를 4 ℃에서 30분간 함유하는 완충액중에서 포스파타제를 mPEG-SBA와 혼합함으로써 달성될 수 있다. 미반응된 PEG는 초여과에 의해 제거될 수 있다. 다른 방법은 폴리펩티드를, 트리에틸아민을 첨가하여 pH를 7.2-9로 상승한 탈이온수 중에서 mPEG-SBA와 반응시킨다. 얻어진 혼합물은 수시간동안 실온에서 교반하여 PEG화를 종결한다.
동물-기원 히알루로니다제 및 박테리아 히알루로난 분해 효소 등의 히알루로난을 분해하는 폴리펩티드를 PEG화하는 방법은, 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 소 고환 히알루로니다제 및 콘드로이틴 ABC 리아제의 PEG화에 대해 기술한 유럽특허 제 04400472호를 참고하라. 또한, 미국 공개 제 2006014968호도 인간 PH20으로부터 유래된 인간 히알루로니다제의 PEG화에 대해 기술한다. 예를 들어, PEG화 히알루로난 분해 효소는 일반적으로 분자당 적어도 3개의 PEG 부분을 함유한다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소는 PEG 대 단백질의 몰비가 5:1 및 9:1이 될 수 있고, 예를 들어 7:1이 될 수도 있다.
E. 코르티코스테로이드
코르티코스테로이드는 부신 피질에서 생산되는 스테로이드 호르몬의 한 종류이다. 코르티코스테로이드는 스트레스 반응, 면역반응 및 염증 조절, 탄수화물 대사, 단백질 대사, 혈액 전해질 수준, 및 행동과 같은 넓은 범위의 생리적 시스템과 관련이 있다. 코르티코스테로이드는, 다수의 다른 작용을 갖는 항-염증성 제제인 글루코코르티코이드 및 신장에 작용을 통하여 염 및 수분의 균형을 주로 조절하는 미네랄로코르티코이드를 포함한다.
글루코코르티코이드는 글루코코르티코이드 수용체에 결합하는 스테로이드 호르몬, 예를 들어 코르티코스테로이드의 한 종류이다. 글루코코르티코이드는 글루코코르티코이드 수용체에 결합함으로써 그들의 효과를 야기한다. 활성화된 글루코코르티코이드 복합체는 교대로 핵내에서 항-염증 단백질의 발현을 상향-조절하고, 세포기질(cytosol)으로부터 핵 내로 다른 전사 인자들의 이동(translocation)을 막음으로써, 세포 기질내 전-염증 단백질의 발현을 억제한다.
일반적으로, 임의의 코르티코스테로이드, 예를 들어 글루코코르티코이드를 본원에서 제공된 방법 또는 조합물에 사용할 수 있다. 글루코코르티코이드는 합성 및 비-합성 글루코코르티코이드를 포함한다. 예시적인 글루코코르티코이드에는 알클로메타손, 알게스톤, 베클로메타손(예컨대 베클로메타손 디프로피오네이트), 베타메타손(예컨대 베타메타손 17-발레레이트, 베타메타손 소디움 아세테이트, 베타메타손 소디움 포스페이트, 베타메타손 발레레이트), 부데소나이드, 클로베타솔(예컨대 클로베타솔 프로피오네이트), 클로베타손, 클로코르톨론(예컨대 클로코르톨론 피발레이트), 클로프레드놀, 코르티코스테론, 코티손 및 하이드로코티손(예컨대 하이드로코티손 아세테이트), 코티바졸, 데플라자코트, 데소나이드, 데속시메타손, 덱사메타손(예컨대 덱사메타손 21-포스페이트, 덱사메타손 아세테이트, 덱사메타손 소디움 포스페이트), 디플로라존(예컨대 디플로라존 디아세테이트), 디플루코르톨론, 디플루프레드네이트, 에녹솔론, 플루아자코르트, 플루클로로나이드, 플루드로코티손(예컨대 플루드로코티손 아세테이트), 플루메타손(예컨대 플루메타손 피발레이트), 플루니솔라이드, 플루시놀론(예컨대 플루시놀론 아세토나이드), 플루오시노나이드, 플루오코르틴, 플루오코르톨론, 플루오로메톨론(예컨대 플루오로메톨론 아세테이트), 플루페롤론(예컨대 플루페롤론 아세테이트), 플루프레드니덴, 플루프레드니솔론, 플루란드레놀라이드, 플루티카손(예컨대 플루티카손 프로피오네이트), 포르모코르탈, 할시노나이드, 할로베타솔, 할로메타손, 할로프레돈, 하이드로코르타메이트, 하이드로코티손(예컨대 하이드로코티손 21-부티레이트, 하이드로코티손 아세포네이트, 하이드로코티손 아세테이트, 하이드로코티손 부테프레이트, 하이드로코티손 부티레이트, 하이드로코티손 싸이피오네이트, 하이드로코티손 헤미석시네이트, 하이드로코티손 프로부테이트, 하이드로코티손 소디움 포스페이트, 하이드로코티손 소디움 석시네이트, 하이드로코티손 발레레이트), 로테프레드놀 에타보네이트, 마지프레돈, 메드라이손, 메프레드니손, 메틸프레드니솔론(메틸프레드니솔론 아세포네이트, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 메틸프레드니솔론 헤미석시네이트, 메틸프레드니솔론 소디움 석시네이트), 모메타손(예컨대 모메타손 퓨로에이트), 파라메타손(예컨대 파라메타손 아세테이트), 프레드니카베이트, 프레드니솔론(예컨대 프레드니솔론 25-디에틸아미노아세테이트, 프레드니솔론 소디움 포스페이트, 프레드니솔론 21-헤미석시네이트, 프레드니솔론 아세테이트; 프레드니솔론 파네실레이트, 프레드니솔론 헤미석시네이트, 프레드니솔론-21(베타-D-글루쿠로나이드), 프레드니솔론 메타설포벤조에이트, 프레드니솔론 스테아글레이트, 프레드니솔론 테부테이트, 프레드니솔론 테트라하이드로프탈레이트, 프레드니손, 프레드니발, 프레드니리덴, 리멕솔론, 틱소코르톨, 트리암시놀론(예컨대 트리암시놀론 아세토나이드, 트리암시놀론 베네토나이드, 트리암시놀론 헥사세토나이드, 트리암시놀론 아세토나이드 21-팔미테이트, 트리암시놀론 디아세테이트)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이들 글루코코르티코이드 및 그의 염은 자세하게, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (16th ed. 1980)에서 논의된다.
일부 실시예에서, 글루코코르티코이드는 코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 및 프레드니손 중으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, 글루코코르티코이드는 덱사메타손이다.
F. 항- 히알루로난제의 유해 효과를 개선하기 위한 코르티코스테로이드의 용도
본원에서 항-히알루로난제, 예컨대, PEG화 히알루로난 분해 효소의 처리로 유도된 근골격계 유해 효과를 제거 또는 감소시키기 위해, 경구적으로 또는 정맥내로, 코르티코스테로이드, 특히, 글루코코르티코이드, 예를 들어, 덱사메타손을 이용하는 치료 방법 또는 용도를 제공한다. 상기 방법에 있어서, 코르티코스테로이드는 투약 요법 또는 항-히알루로난제, 예컨대 히알루로난 분해 효소의 치료 효과에 영향을 미치지 않는 양으로 사용된다. 예를 들어, 항-히알루로난제, 예컨대 히알루로난 분해 효소, 및 특히 중합체-컨주게이션된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 PEG화 히알루로난 분해 효소는 히알루로난 관련 질환 또는 상태의 단일 치료 또는 조합 치료를 위해 이용될 수 있다.
예를 들어, 섹션 H에서 기술하는 바와 같이, 치료적 유효성을 나타내기 위한 본원에서 보여진 저용량 PEG화 히알루로난 분해 효소(예를 들어, PEGPH20)를 이용하는 단일 치료 또는 조합 치료에서 히알루로난 관련 질환 또는 상태, 예컨대 암의 치료와 관련된 부작용 또는 유해 사례를 개선하는데 사용될 수 있다. 조성물들은 분리해서 또는 키트의 일부로서 함께 제공될 수 있다.
1. 약학적 조성물 및 제형
코르티코스테로이드, 특히 덱사메타손과 같은 글루코코르티코이드를 포함하는 약학적 조성물이 본원에서 제공된다. 코르티코스테로이드, 예컨대 글루코코르티코이드는, 항-히알루로난제, 예를 들어, PEG화 히알루로니다제를 이용한 히알루로난 관련 질환 또는 장해의 치료와 관련된 유해 부작용을 개선하기 위하여, 항-히알루로난제, 예컨대 PEG화 히알루로난 분해 효소를 포함하는 약학적 조성물와 함께 공동 제형화될 수 있거나 공동 투여될 수 있다.
본원에서는 항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 히알루로니다제와 같은 PEG화 히알루로난 분해 효소의 약학적 조성물을 제공한다. 본원에서는 암과 같은 히알루로난 관련 질환 또는 상태와 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위해 이용되는 제 2 작용제를 포함하는 약학적 조성물을 또한 제공한다. 이러한 작용제의 예시는 약물, 폴리펩티드, 핵산, 항체, 펩티드, 저분자, 유전자 치료 벡터, 바이러스 및 기타 치료제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 항-히알루로난제, 예컨대 PEG화 히알루로니다제, 예컨대 PEGPH20를 포함하는 PEG화 히알루로난 분해 효소는, 과도한 또는 축적된 히알루로난과 관련된 체내에 원하는 부위 또는 조직으로 그들의 전달을 개선하기 위한 이러한 제 2 작용제의 약제학적 제형과 함께 공동 제형화될 수 있거나 공동 투여될 수 있다.
약학적으로 허용되는 조성물은 동물 및 인간에서의 사용을 위해 일반적으로 인식되는 약전에 따라 제조되는, 관리 기관 또는 기타 기관에 대한 승인을 고려하여 제조된다. 화합물은 용액, 현탁액, 분말 또는 지속방출 제형과 같은 임의의 경구 및 정맥내 투여를 위해 적합한 약학적 제형으로 제형화될 수 있다. 일반적으로, 화합물은 당업계에 잘 알려진 기술 또는 공정을 사용하여 약학적 조성물로 제형화될 수 있다(예컨대 Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126 참조). 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
일례에서, 약학적 제제는 액체 형태, 예를 들어 용액, 시럽 또는 현탁액이 될 수 있다. 만일 액체 형태로 제공된다면, 약학적 제제는 사용 전에 치료에 유효한 농도로 희석될 수 있는 농축된 제제로 제공될 수 있다. 그러한 액체 제제는 약학적으로 허용가능한 첨가제, 예컨대 현탁화제(예컨대, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소첨가 식용지방); 유화제(예컨대, 레시틴 또는 아카시아); 비수용성 비히클(예컨대, 아몬드유, 유성 에스테르 또는 분별(fractionated) 식물성 기름); 및 보존제(예컨대, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르빈산)와 함께 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 약학적 제제는 사용전 물 또는 다른 적절한 비히클과 재구성하기 위한 동결건조된 형태로 존재될 수 있다.
약학적 조성물은 투여되는 조성물(예를 들어, 코르티코스테로이드 또는 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제)과 함께 희석제, 어쥬번트, 부형제 또는 비히클과 같은 담체를 포함할 수 있다. 적절한 약학적 담체의 예는 E. W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다. 그러한 조성물은 환자에게 적절하게 투여하기 위한 형태를 제공하기 위하여 치료적 유효량의 화합물 또는 제제를, 일반적으로 정제된 형태 또는 부분 정제된 형태로, 적절한 양의 담체와 함께 포함할 것이다. 그러한 담체는 멸균된 액체, 예컨대 물 및 석유, 동물성,식물성 또는 합성 기원의 것인 예컨대, 땅콩 오일, 대두유, 광물유, 참기름인 오일이 될 수 있다. 물은 전형적인 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 액체 담체, 특히 주사가능한 용액으로 적용될 수 있다. 조성물은 활성성분과 함께 다음을 함유할 수 있다: 희석제, 예컨대 락토스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트, 또는 카복시메틸셀룰로스; 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 및 탈크; 결합제 예컨대 녹말, 아카시아 고무와 같은 천연 고무, 젤라틴, 글루코스, 당밀, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스 및 그 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 기타 당업계에 알려진 결합제 등 활성물질을 함유할 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 녹말, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 몰트, 쌀, 밀가루, 분필, 실리카겔, 소디움 스테아레이ㅌ, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물 및 에탄올을 포함한다. 예를 들어, 적절한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올이다. 원한다면, 조성물은 기타 적은 양의 비독성 부수적 물질, 예를 들어 습윤 또는 현탁제, pH 완충제, 안정제, 가용성 강화제, 및 다른 그러한 제제, 예를 들어 소디움 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 및 사이클로덱스트린을 함유할 수 있다.
비경구적 제제에 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항생 제제, 등장성 제제, 완충제, 항산화제, 국소마취제, 현탁 제제 및 분산 제제, 유화 제제, 격절형성 제제(sequestering agent) 또는 킬레이트 제제 및 다른 약학적으로 허용가능한 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예로는 염화나트륨 주사, 링거 주사, 등장성 덱스트로스 주사, 멸균수 주사, 덱스트로스 및 락테이트화 링거 주사가 있다. 비수성 비경구 비히클로는 식물성 고정 오일, 면실유, 옥수수 오일, 참기름 및 땅콩 오일을 포함한다. 정균 또는 정진균 농도의 항생제제는 페놀 또는 크레졸, 머큐리얼, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스터, 티메로살, 벤잘코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드가 포함되는, 다중 투여 용기에 포장된 비경구 제제에 첨가될 수 있다. 등장성 제제는 염화나트륨 및 덱스트로스를 포함한다. 완충제는 인산염 및 구연산염을 포함한다. 항산화제는 소디움 바이설페이트를 포함한다. 국소마취제는 프로카인 하이드로클로라이드를 포함한다. 현탁제제 및 분산제제는 소디움 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화 제제는 폴리소르베이트 80 (TWEENs 80)을 포함한다. 금속 이온의 격절형성 제제 또는 킬레이트 제제는 EDTA를 포함한다. 약학적 담체는 또한 물 혼합성 비히클로서 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 및 pH 조정제로서 소디움 하이드록사이드, 염산, 구연산 또는 젖산을 포함한다.
주사가능 물질은 액체 용액 또는 현탁액의 통상의 형태, 투여 전에 액체에서의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로 준비될 수 있다. 전립선내 투여용 제형으로는 주사가 준비된 멸균 용액, 피하주사용 정제를 포함하는, 사용 바로 전에 용매와 혼합할 것이 준비된, 멸균 건조 가용성 제품, 예컨대 동결건조된 분말, 주사가 준비된 멸균 현탁액, 사용 바로 전에 비히클에 혼합할 것이 준비된 멸균건조 불용성 제품, 멸균 에멀젼이 포함된다. 용액은 수성 또는 비수성 형태일 수 있다.
2. 투여량 및 투여
본원에서 제공하는 방법 및 용도에서, 코르티코스테로이드는 투여된 항-히알루로난제의 부작용 또는 유해 효과를 개선, 감소 또는 예방하기 위한 양으로 투여된다. 이것은 특정 부작용을 유발하는 특정한 항-히알루로난제 및 투여 경로의 조합인 것으로 이해된다. 예시적인 항-히알루로난제로 처리에 의해 관찰된 예시적인 부작용은 근골격계 부작용이다. 유해 부작용을 유발하는 항-히알루로난제의 투여량 또는 투약요법은 본원에 기술되는 바와 같이 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다(예컨대 섹션 G를 참조). 실시예들은 PEGPH20 투여에 의해 예시된 바와 같은, 다양한 대상 및 모델에서의 유해 사례를 평가하고 모니터링하는 방법을 서술한다. 일반적으로, 항-히알루로난제의 양은 또한 HA 합성 억제 또는 HA 분해와 같은 치료 효과를 달성할 수 있는 양에 해당한다. 투여된 항-히알루로난제로부터 유발된 부작용을 개선, 감소 또는 예방하기 위한 코르티코스테로이드의 양은 또한 경험적으로 결정될 수 있다. 코르티코스테로이드의 양은 항히알루로난제, 투여경로, 관찰되거나 측정된 부작용 및 특정 환자 또는 대상과의 상관관계이다.
항-히알루로난제 및 코르티코스테로이드는 경구, 정맥내(IV), 피하, 근육내, 종양내, 피내, 국소적, 경피, 직장 또는 표피하를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 투여경로로 투여될 수 있다. 본원에서 기술하는 바와 같이, 국소적 투여는 또한, 특히 항-히알루로난제의 더 낮은 투여량을 위해 적용될 수 있다. 항-히알루로난제와 코르티코스테로이드의 투여 경로는 동일하거나 상이할 수 있다. 항-히알루로난제의 투여 경로는 항-히알루로난제의 작용 및 치료할 질환 또는 상태과의 상관관계이다. 마찬가지로, 코르티코스테로이드의 투여 경로는 특정한 코르티코스테로이드 및 개선되어야 할 부작용과의 상관관계이다. 일반적으로, 코르티코스테로이드 및 항-히알루로난제의 투여 경로는 전신적 효과를 얻도록 결정된다. 예를 들어, PEG화 히알루로난 분해 효소는 일반적으로 정맥내로 투여된다. 다른 실시예에서, 글루코코르티코이드는 일반적으로 경구로 투여된다. 기타 당업자에게 알려진 임의의 투여 경로도 고려될 수 있다.
코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제와 연속적으로, 간헐적으로, 동시에 또는 동일한 조성물로써 투여될 수 있다. 조성물은 다른 생물학적으로 활성인 제 2 작용제 또는 치료, 예컨대 화학요법제, 생물학적 제제와 함께 연속적으로, 간헐적으로, 동시에 또는 동일한 조성물로써 투여될 수 있다. 투여는 또한 조절된 방출 제형 및 방출이 조절된 기구, 예컨대, 펌프를 포함하는 조절된 방출 시스템을 포함할 수 있다.
또한, 투여가 원하는 약학적 효과를 생산할 수 있는 유효량을 제공되도록 약학적으로 활성이 있는 약물의 농도를 조절할 수 있다. 정확한 투여량은 당업계에 알려진 바와 같이 나이, 체중 및 환자 또는 동물의 상태에 따라 결정된다. 유닛-투여량 비경구적 제제는 앰풀, 바이알, 또는 바늘(needle)을 포함한 시린지로 포장된다. 약학적으로 활성인 제제(들)을 포함하는, 액체 용액 또는 재구성된 분말 제제의 부피는 질환의 심각성 및 포장을 위해 선택된 특정한 제조품과의 상관관계이다.비경구적 투여를 위한 모든 제제는 이 분야에 알려지고 숙련된 바와 같이 멸균이여야 한다.
약학적 조성물은 각 투여 경로에 적합한 투여량 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 치료적으로 활성인 제제 및 그 유도체는 일반적으로 유닛 투여량 형태 또는 다중 투여량 형태로 제형화되고 투여된다. 각 유닛 투여량은 약학적으로 필요한 담체, 비히클 또는 희석제와 연합하여 원하는 치료적 효과를 내기에 충분하도록 미리 결정된 양의 치료적으로 활성인 제제를 함유한다. 유닛 투여량 형태의 예는 앰풀 및 시린지 및 개별적으로 포장된 정제 또는 캡슐을 포함한다. 유닛 투여량 형태는 부분으로 또는 그의 다중으로 투여될 수 있다. 다중 투여 형태는 별개의 유닛 투여량 형태로 투여되도록 단일한 용기 내에 다수의 동일 유닛 투여량 형태이다. 다중 투여량 형태의 예로는 바이알, 정제 또는 캡슐의 병 또는 파인트(pint) 또는 갤런의 병이 있다. 그러므로, 다중 투여량 형태는 개별 포장되지 않은 다중의 유닛 투여량 이다. 일반적으로, 비-독성 담체와 균형을 갖으며 0.005% 내지 100% 범위 내로 활성 물질을 포함하는 투여량 형태 또는 조성물이 준비될 수 있다. 치료적 제제는 단일 또는 다중 투여 사용을 위한 약학적 조성물으로서 제형화될 수 있다.
a. 코르티코스테로이드
코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제의 투여로 인한 하나 또는 그 이상의 유해 효과, 특히 근골격계 유해 효과, 를 개선 또는 감소시키기 위해 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 치료적으로 유효한 양은 하나 또는 그 이상의 증상 또는 유해 효과를 개선, 예방, 제거 또는 감소시키기 위해 충분한 투여량이다. 호전 또는 성공적인 전처치의 지표는 CTCAE 척도에서 관련된 점수를 나타내는데 실패했는지에 대한 결정 또는 CTCAE 척도상에서 등급 또는 심각성에 변화가 있는 경우이다.
코르티코스테로이드는 치료적으로 유효한 투여량으로 제공된다. 치료적으로 유효한 농도는 공지의 in vitro 또는 in vivo(예컨대 동물 모델에서) 시스템에서 시험됨으로써 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 유해 효과를 개선하기 위해 투여되도록 선택된 코르티코스테로이드의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 동물 모델은 최적의 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 적용될 수 있다. 경험적으로 결정될 수 있는 정확한 투여량은 특정한 치료적 제제, 투약 요법 및 투약 스케줄, 투여 경로 및 병의 심각성에 따라 결정될 수 있다. 그러한 파라미터를 평가하는 방법은 섹션 G에 기술되어 있고, 실시예에서 예시된다.
조성물에 있어서 선택된 치료제의 농도는 흡수, 불활성화 및 배설 비율, 생리화학적 특징, 투여 스케줄, 및 투여량 및 기타 당업자에게 알려진 다른 요소들에 따라 결정된다. 예를 들어, 정확한 투여량 및 치료 지속은 질환 또는 상태, 치료될 조직, 환자 또는 대상 및 투여량 및 투약 요법을 포함해서 항-히알루로난제와의 상관관계인 것으로 이해된다. 코르티코스테로이드의 투여량은 환자의 나이와 건강, 투여하는 항-히알루로난제(예를 들어, 투여하는 PEG화 히알루로난 분해 효소), 코르티코스테로이드의 효능 및 투여 경로에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 히알루로난 분해 효소의 치료적 투여량 및 투약 요법과 더불어 농도와 투여량 값도 다양할 것이라는 것으로 언급된다. 추가적으로, 원하는 효과를 얻기 위해 코르티코스테로이드는 매일, 매주, 또는 매월 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 특정한 투여량 부피는 다양할 수 있고 투약 요법, 투여 빈도 및 원하는 투여 속도에 의존된다. 농도와 투여량 값은 또한 치료되는 개인의 나이에 따라 다양할 것으로 언급된다.
정확한 투여량 및 치료 지속은 공지의 테스트 프로토콜 또는 in vivo 또는 in vitro 시험 데이터의 외삽을 사용하여 경험적으로 결정될 수 있다. 임의의 특정한 대상에서, 특이적인 투약 요법은 개인적 필요 및 제형의 투여를 투여하거나 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간에 걸쳐 조절되어야 하고 여기서 서술된 농도 범위는 단지 예시이며 그 범위를 제한하기 위한 것이 아니라는 것으로 또한 이해될 것이다. 일반적으로, 투약 요법은 독성을 제한하기 위해 선택되며, 본원에서는 유해 부작용을 개선하기 위해 선택된다. 담당의사는 독성, 또는 골수, 간, 신장 또는 다른 조직 기능장애으로 인해 어떻게 그리고 언제 치료를 종결, 방해 또는 투여량을 낮추도록 치료를 조정할 지에 대해 알 것이라는 것으로 언급될 것이다. 반대로, 담당의사는 또한 임상적 반응이 적절하지 않는다면(독성 부작용을 막으면서) 어떻게 또는 언제 더 높은 수준으로 처리를 조정할 지에 대해 알 것이다. 치료제의 투여는 미국 식품 의약품국(Food and Drug Administration)에 의해 확립되고 미국의사약전(Physicians' Desk Reference)에 출판된 최대 투여량 수준을 초과하지 않아야 할 것이다.
일반적으로, 투여되는 코르티코스테로이드의 양은 특정한 코르티코스테로이드에 따라 결정되는데, 효능에 있어서의 차이가 서로 다른 코르티코스테로이드 사이에서 존재하기 때문이다(하기 표 4 참조). 코르티코스테로이드, 또는 글루코코르티코이드, 예를 들어 덱사메타손은, 경구(정제, 액체 또는 액체 농축액) PO, 정맥내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 코르티코스테로이드는 일반적으로 볼루스로 투여되나, 항-히알루로난제, 예컨대 PEG화 히알루로니다제의 투여와 관련된 하나 또는 그 이상의 부작용을 개선하기에 유효인 양인 한, 많은 것이 일정 기간에 걸쳐 투여된다.
Figure 112017000450674-pat00006
코르티코스테로이드는 항-히알루로난제, 예컨대 PEG화 히알루로난 분해 효소 투여와 관련된 하나 또는 그 이상의 부작용을 개선하기에 유효한 임의의 양으로 투여될 수 있다. 그러므로, 코르티코스테로이드, 예컨대 글루코코르티코이드는, 예를 들어 70 kg의 성인 인간 대상에 있어서 일회 투여량 당, 약 0.1 내지 100 mg 사이의 양으로, 약 0.1 에서 80 mg, 0.1 에서 60 mg, 0.1 에서 40 mg, 0.1 에서 30 mg, 0.1 에서 20 mg, 0.1 에서 15 mg, 0.1 에서 10 mg, 0.1 에서 5 mg, 0.2 에서 40 mg, 0.2 에서 30 mg, 0.2 에서 20 mg, 0.2 에서 15 mg, 0.2 에서 10 mg, 0.2 에서 5 mg, 0.4 에서 40 mg, 0.4 에서 30 mg, 0.4 에서 20 mg, 0.4 에서 15 mg, 0.4 에서 10 mg, 0.4 에서 5 mg, 0.4 에서 4 mg, 1 에서 20 mg, 1 에서 15 mg 또는 1 에서 10 mg의 양으로 투여된다. 일반적으로, 글루코코르티코이드와 같은 코르티코스테로이드는 평균 성인 인간 대상에게 1회 투여량 당 약 0.4 내지 20 mg, 예를 들어, 약 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.75 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg 또는 20 mg의 양으로 투여된다.
코르티코스테로이드는, 예를 들어, 평균 성인 인간 대상, 전형적으로 70kg 에서 75kg의 체중인 대상에게, 약 0.001 mg/kg (대상의), 0.002 mg/kg, 0.003 mg/kg, 0.004 mg/kg, 0.005 mg/kg, 0.006 mg/kg, 0.007 mg/kg, 0.008 mg/kg, 0.009 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.015 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.035 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.045 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.055 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.065 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.075 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.085 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.095 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.30 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.40 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.50 mg/kg, 0.55 mg/kg, 0.60 mg/kg, 0.65 mg/kg, 0.70 mg/kg, 0.75 mg/kg, 0.80 mg/kg, 0.85 mg/kg, 0.90 mg/kg, 0.95 mg/kg, 1 mg/kg, 1.05 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.15 mg/kg, 1.20 mg/kg, 1.25 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.35 mg/kg 또는 1.4 mg/kg으로 투여될 수 있다.
코르티코스테로이드 투여가 항-히알루로난제, 예컨대 PEG화 히알루로니다제의 투여와 관련된 하나 또는 그 이상의 유해 부작용을 개선하는 한 투여량 투여된 투여는 다양할 수 있다. 일 실시예에서, 글루코코르티코이드, 예를 들어, 덱사메타손의 투여량은 치료 주기당 연속적으로 더 낮은 투여량으로 투여된다. 그러므로, 그러한 치료 요법에서, 코르티코스테로이드 투여량은 점점 줄어든다. 예를 들어, 덱사메타손은 항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 히알루로니다제의 투여 전에, 최초 투여량 4 mg으로 투여하고, 그리고 각 항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 히알루로니다제의 연속적인 투여에서 덱사메타손 투여량은 더 낮추어, 투여량은 항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 히알루로니다제에 대하여 3 mg, 그리고 나서 항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 히알루로니다제 투여 당 2 mg, 그리고 나서 항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 히알루로니다제 투여 당 1 mg과 같다. PEG화 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제의 투여와 관련된 하나 또는 그 이상의 부작용을 감소시키는 데 유효한 코르티코스테로이드의 투여량인 한, 임의의 투여량이 고려될 수 있다.
투여 시간은 PEG화 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제의 투여와 관련된 하나 또는 그 이상의 유해 부작용을 개선하는 코르티코스테로이드의 투여인 한 다양할 수 있다. 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난 제와 연속적으로, 간헐적으로, 동시에 또는 동일 조성물로써 투여될 수 있다. 예를 들어, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제의 투여 전, 투여 중, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 코르티코스테로이드 및 PEG화 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제는 간헐적으로 투여된다. 일반적으로, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제의 투여 전에 투여된다. 예를 들어, 코르티코스테로이드, 예컨대 덱사메타손과 같은 글루코코르티코이드는 항-히알루로난제, 예를 들어, PEG화 히알루로난 분해 효소의 투여 전 약 0.5 분, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간 또는 그 이상 전에 투여될 수 있다.
일부 실시예에서, 코르티코스테로이드는 항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 히알루로난 분해 효소의 투여와 동시에 투여된다. 이 실시예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제와 함께, 또는 따로 투여될 수 있다. 일반적으로, 코르티코스테로이드는 항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 히알루로난 분해 효소과 별도로 투여된다. 다른 실시예에서, 코르티코스테로이드는 항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 히알루로난 분해 효소의 투여 후, 약 0.5 분, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간 또는 그 이상 후에 투여된다.
일 실시예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제의 투여 전에 투여된다. 예를 들어, 코르티코스테로이드, 예컨대 덱사메타손과 같은 글루코코르티코이드는 PEG화 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제의 투여 1시간 전에 투여된다. 다른 실시예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제의 투여 5분 전에 투여된다. 또 다른 실시예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제의 투여 전 및 후에 투여된다. 이 실시예에서, 코르티코스테로이드,예컨대 글루코코르티코이드, 예를 들어 덱사메타손은 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제의 투여 직전 1분 내지 5분 전에 투여되고, PEG화 히알루로난 분해효소와 같은 항-히알루로난제 투여 8시간 후에 투여된다. 또 다른 실시예에서, 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제의 투여 1시간 전에 투여되고 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제의 투여 8 내지 12시간 후에 투여된다.
항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 히알루로니다제의 투여와 관련된 하나 또는 그 이상의 부작용을 개선시키는 데 유효한 코르티코스테로이드의 투여 시간인 한, 임의의 투약 요법이 고려될 수 있다. 또한, 코르티코스테로이드의 투여량 또는 투약 요법은 히알루로난 관련 질환 또는 장애를 치료하는 데 있어서 항-히알루로난제의 치료적 효과를 방해하거나 감소시키지 않는 것이다.
b. 항-히알루로난제
본원의 방법에서, 코르티코스테로이드는 항-히알루로난제와 관련한 유해 사례를 개선 또는 감소시키기 위해 투여된다. 투여되는 항-히알루로난제의 양은 근골격계 부작용과 같은 유해 부작용을 유발하거나 초래하는 양이다. 일반적으로, 히알루로난 분해 효소의 투여량은 또한 히알루로난 관련 질환 또는 상태의 치료에 있어서의 치료적 효과를 달성하는 것이다. 그러므로, 항-히알루로난제의 조성물은 치료적으로 유용한 효과를 내기에 충분한 양을 포함한다. 활성 제제를 함유하는 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 항-히알루로난제의 조성물은 제 2 작용제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 히알루로난 분해 효소의 투여량(투여량 및 투약 요법)은 코르티코스테로이드, 예를 들어 글루코코르티코이드의 투여(투여량 및 투약 요법)를 결정한다.
치료적으로 유효한 농도의 항-히알루로난제는 본원에서 제공되는 것과 같은 공지의 in vivo 및 in vitro 시스템에 의해 화합물을 시험함으로써 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 항-히알루로난제, 예컨대 PEG화 히알루로니다제와 같은 PEG화 히알루로난 분해 효소의 농도는 복합체의 흡수, 불활성화 및 배설 비율, 복합체의 생리화학적 성질, 투여 스케줄, 투여되는 양 및 기타 당업자에게 알려진 다른 요소들에 의존한다. 예를 들어, 정확한 투여량 및 치료 지속은 치료될 조직, 치료된 질환 또는 상태, 투여 경로, 환자 또는 대상 및 항-히알루로난제와의 상관관계이며, 또한 공지의 테스트 프로토콜 또는 in vivo 또는 in vitro 시험 데이터의 외삽을 사용하여 경험적으로 결정될 수 있고, 이와 함께/또는 특정한 약물의 공지의 투약 요법으로부터 결정될 수 있다. 질환 또는 상태, 예를 들어 HA 풍부 종양과 같은 히알루로난 관련 질환 또는 상태의 치료를 위해 투여되는 항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 히알루로니다제와 같은 PEG화 히알루로난 분해 효소의 양은, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, in vitro 분석 및 동물 모델이 최적의 투여량 범위를 확인하는 데 도움이 되기 위해 적용될 수 있다. 정확한 투여량은 경험적으로 결정될 수 있는데, 특정한 효소, 투여 경로, 치료될 질환의 유형 및 질환의 심각성에 따라 결정될 수 있다.
예를 들어, 항암제와 같은 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료를 위한 약물 및 치료는 당업계에 잘 알려져 있다(예컨대 미국 공개번호 20100003238로 및 국제 PCT 공개번호 WO 2009/128917호 참조). 따라서, 조성물에 있어서의 항-히알루로난제, 예컨대 히알루로난 분해 효소, 예를 들어, 히알루로니다제 또는 제 2 작용제의 투여량은 주어진 투여 경로 하에서 제제에 대한 표준 투약 요법에 기초하여 선택될 수 있다. 또한 하기 섹션 H에 기술된 바와 같이, 훨씬 더 낮은 투여량의 히알루로난 분해 효소가, 예를 들어, 히알루로난 관련 질환 및 상태의 치료에 치료적으로 유효성을 나타내는 것을 본원에서 밝혀졌다. 그러므로, 더 낮은 투여량의 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PEG화 PH20과 같은 중합체-변형 히알루로난 분해 효소를 사용하는 투약 요법이 히알루로난 관련 질환 및 상태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 임의의 투여량 또는 투약 요법이 근골격계 부작용과 같은 유해 효과와 관련될 수 있는데, 코르티코스테로이드의 전처치, 동시 처치 및/또는 후처치에 의해 개선될 수 있다.
항-히알루로난제의 유효한 투여량의 예는 체중 1 kg당 0.01 ㎍에서 100 g의 범위에 이르는 투여량이다. 예를 들어, 항-히알루로난제의 유효한 투여량은 체중 1 kg당 0.01 ㎍에서 100 mg의 범위에 이르는 투여량, 예컨대 체중 1 kg 당 약 0.01 ㎍ 에서 1 mg, 체중 1 kg 당 1 ㎍ 에서 100 ㎍, 체중 1 kg 당 1 ㎍ 에서 10 ㎍ 또는 체중 1 kg 당 0.01 mg 에서 100 mg이다. 예를 들어, 유효한 양은 체중 1 kg 당 적어도 또는 약 0.01 ㎍, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 ㎍ 이상을 포함한다. 유효한 양의 다른 실시예에서는 체중 1 kg 당 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 g을 포함한다. 예를 들어, 히알루로니다제(예컨대 PEGPH20과 같은 PEG화 히알루로니다제) 등 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제은 약 0.1 ㎍/kg 에서 1 mg/kg, 예를 들어 0.5 ㎍/kg 에서 100 ㎍/kg, 0.75 ㎍/kg 에서 15 ㎍/kg, 0.75 ㎍/kg 에서 7.5 ㎍/kg 또는 1.0 ㎍/kg 에서 3.0 ㎍/kg으로 투여될 수 있다. 다른 실시예에서, 예를 들어, 히알루로니다제(예컨대 PEGPH20과 같은 PEG화 히알루로니다제) 등 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제는 1 mg/kg 에서 500 mg/kg, 200 mg/kg과 같이 100 mg/kg 에서 400 mg/kg으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 항-히알루로난제을 0.5 mg에서 100g 함유하는데, 예를 들어, 100 ㎍ 에서 0.5 mg과 같이 20 ㎍ 에서 1 mg, 5 mg에서 500 mg과 같은 1 mg 에서 1 g 범위를 함유한다.
투여량 또는 조성물은 단일 투여량 투여 또는 다중 투여량 투여를 위한 것일 수 있다. 투여량 또는 조성물은 주 1회, 주 수 회, 주 2회, 매 15일, 16일, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일 마다, 월 1회, 연 수회 또는 연 1회 투여될 수 있다. 다른 실시예에서, 투여량 또는 조성물은 분할되어 주 1회 주 수 회, 주 2회, 매 15일, 16일, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일 마다, 월 1회, 연 수회 또는 연 1회 투여될 수 있다. 항-히알루로난 조성물은 액체 조성물로 제형화되거나 동결건조될 수 있다. 조성물은 또한 정제 또는 캡슐로 제형화될 수 있다.
본원의 방법에 있어서의 사용을 위한 예시적인 항-히알루로난제의 투여량 및 투약 요법에 대한 기술을 하기에 제공한다. 항-히알루로난제는 단일제 치료를 위해 단독으로 사용될 수 있거나 HA 관련 질환 또는 상태를 치료하는데 이용하기 위한 다른 제제와 조합으로 사용될 수 있다. 본원의 다른 부분에서 논의되는 바와 같이, 본원의 방법 및 용도의 특정한 실시예에 있어서, 항-히알루로난제의 처리와 관련된 부작용을 개선하기 위하여 코르티코스테로이드와 조합으로 투여된다.
i. 레플루노마이드 및 유도체
일 실시예에서, 레플루노마이드(leflunomide) 또는 그 유도체는 일반적으로 활성 약물을 1-100 mg, 예를 들어 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg으로 함유하는 정제로 이용 가능하다. 히알루로난 관련 질환 및 상태, 예를 들어, 류마티스성 관절염의 치료를 위해, 이것이 매일 10 에서 500 mg, 일반적으로 매일 100 mg이 투여된다. 투여는 질환 또는 상태의 치료에 필요한 만큼 지속되거나, 연속적으로 더 적은 투여량으로 점점 더 양을 줄이거나 감소될 수 있다. 예를 들어, 류마티스성 관절염 치료를 위하여, 레플루노마이드는 최초 로딩 투여량을 3일동안 매일 100 mg으로 투여하고 그리고 나서 연속된 20 mg/일의 투여량으로 투여할 수 있다.
ii. 히알루로난-분해 효소
예를 들어, PEG화 히알루로난 분해 효소(예컨대 히알루로니다제)와 같은 히알루로난 분해 효소는 전신적으로, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 기타 임의의 전신적 경로로 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 더 낮은 투여량을 국소적으로 주어질 수 있다. 예를 들어, PEG화 히알루로니다제(예컨대 PH20) 등 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 히알루로난 분해 효소의 국소적 투여는 종양내 투여, 동맥내 주사(예컨대 간동맥), 복강내 투여, 방광내 투여 및 더 적은 절대적 투여량에서 국소적 작용을 증가시킬 수 있는 암 치료를 위해 사용된 다른 국소적 경로를 포함한다.
예시적인 투여량 범위는 약 0.3 유닛/kg 에서 320,000 유닛/kg, 예컨대 PEG화 히알루로니다제의 0 유닛/kg에서 320,000 유닛/kg, 또는 다른 PEG화 히알루로난 분해 효소의 기능적으로 동일한 양이다. 활성의 유닛은 표준 활성, 예를 들어 히알루로니다제 활성을 평가하는 미세탁도 분석법에서 측정된 활성과 같이 정규화되는 것으로 이해된다. PEG화 가용성 히알루로니다제는 전체 단백질 mg 당 더 낮은 활성을 나타내는데, 즉 컨주게이션되지 않은 천연 가용성 히알루로니다제와 비교할 때 더 낮은 특이적 활성을 보인다. 예를 들어, 예시적인 rHuPH20 제제는 약 120,000 유닛/mg의 특이적 활성을 나타낸 반면, rHuPH20의 PEG화 형태는 약 32,000 유닛/mg의 특이적 활성을 나타낸다. 전형적으로, rHuPH20 등 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소의 PEG화 형태는 약 18,000 내지 45,000 U/mg 범위의 특이적 활성을 나타낸다. 일 실시예에서, PEG-히알루로난 분해 효소는 저장 용액(stock solution)으로 제공될 수 있거나, 예를 들어, 3.5 mg/mL 112,000 U/mL (~32,000 U/mg)에서 PEG 대 단백질의 몰비가 5:1 및 9:1, 예를 들어 7:1, 또는 더 낮은 농축된 형태로 제공될 수 있다.
예를 들어, PEGPH20 등 히알루로니다제와 같은 PEG화 히알루로난 분해 효소는 주 2회, 주 1회 또는 매 21일에 1회 정맥내로 투여될 수 있다. 전형적으로, PEG화 히알루로난 분해 효소는 주 2회 투여된다. 투여 주기는 정해진 기간, 일반적으로 3주 또는 4주가 될 수 있다. 투여 주기는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년 또는 그 이상 동안 투약 요법에서 반복될 수 있다. 일반적으로, 투여 주기는 치료를 하는 의사의 재량에 따라 반복될 수 있고, 병 또는 상태의 차도, 유해 사례 및 기타 요소와 같은 요소에 따라 결정될 수 있다. 다른 실시예에서, 다음 주여 주기에, 히알루로난 분해 효소는 더 낮은 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소의 첫 투여 주기에 4주 동안 주 2회 투여될 수 있고, 그 다음 히알루로난 분해 효소의 투여주기에 주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회(예컨대 매 21일에 1회) 또는 4주에 1회 투여될 수 있다. 투여량이 질환 및 환자에 따라 다양할 수 있는 반면, PEG화 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소는 일반적으로 약 0.01 ㎍/kg 에서 25 mg/kg 범위로 투여될 수 있는데, 예를 들어 0.0005 mg/kg (0.5 ㎍/kg) 에서 10 mg/kg (320,000 U/kg), 예를 들어, 0.02 mg/kg 에서 1.5 mg/kg, 예를 들어, 0.05 mg/kg이 될 수 있다. PEG화 히알루로니다제는 예를 들어 보통 70 에서 75 kg의 체중인 평균 성인 대상에게 약 0.0005 mg/kg (대상의), 0.0006 mg/kg, 0.0007 mg/kg, 0.0008 mg/kg, 0.0009 mg/kg, 0.001 mg/kg, 0.0016 mg/kg, 0.002 mg/kg, 0.003 mg/kg, 0.004 mg/kg, 0.005 mg/kg, 0.006 mg/kg, 0.007 mg/kg, 0.008 mg/kg, 0.009 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.016 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.30 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.40 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg.kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 본원의 섹션 H에 기술된 바와 같이, 히알루로난 분해 효소는 20 ㎍/kg 미만, 예를 들어 0.01 ㎍/kg 에서 15 ㎍/kg , 0.05 ㎍/kg 에서 10 ㎍/kg , 0.75 ㎍/kg 에서 7.5 ㎍/kg 또는 1.0 ㎍/kg 에서 3.0 ㎍/kg의 더 적은 양으로 투여될 수 있다.
본원에서 제공하는 PEG화 히알루로니다제(예컨대 PH20)와 같은 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PEGPH20은, 그것이 투여되는 대상의 체중의 약 1 유닛/kg 에서 800,000 유닛/kg으로, 예를 들어 약 10 에서 800,000 유닛/kg, 10 에서 750,000 유닛/kg, 10 에서 700,000 유닛/kg, 10 에서 650,000 유닛/kg, 10 에서 600,000 유닛/kg, 10 에서 550,000 유닛/kg, 10 에서 500,000 유닛/kg, 10 에서 450,000 유닛/kg, 10 에서 400,000 유닛/kg, 10 에서 350,000 유닛/kg, 10 에서 320,000 유닛/kg, 10 에서 300,000 유닛/kg, 10 에서 280,000 유닛/kg, 10 에서 260,000 유닛/kg, 10 에서 240,000 유닛/kg, 10 에서 220,000 유닛/kg, 10 에서 200,000 유닛/kg, 10 에서 180,000 유닛/kg, 10 에서 160,000 유닛/kg, 10 에서 140,000 유닛/kg, 10 에서 120,000 유닛/kg, 10 에서 100,000 유닛/kg, 10 에서 80,000 유닛/kg, 10 에서 70,000 유닛/kg, 10 에서 60,000 유닛/kg, 10 에서 50,000 유닛/kg, 10 에서 40,000 유닛/kg, 10 에서 30,000 유닛/kg, 10 에서 20,000 유닛/kg, 10 에서 15,000 유닛/kg, 10 에서 12,800 유닛/kg, 10 에서 10,000 유닛/kg, 10 에서 9,000 유닛/kg, 10 에서 8,000 유닛/kg, 10 에서 7,000 유닛/kg, 10 에서 6,000 유닛/kg, 10 에서 5,000 유닛/kg, 10 에서 4,000 유닛/kg, 10 에서 3,000 유닛/kg, 10 에서 2,000 유닛/kg, 10 에서 1,000 유닛/kg, 10 에서 900 유닛/kg, 10 에서 800 유닛/kg, 10 에서 700 유닛/kg, 10 에서 500 유닛/kg, 10 에서 400 유닛/kg, 10 에서 300 유닛/kg, 10 에서 200 유닛/kg, 10 에서 100 유닛/kg, 16 에서 600,000 유닛/kg, 16 에서 500,000 유닛/kg, 16 에서 400,000 유닛/kg, 16 에서 350,000 유닛/kg, 16 에서 320,000 유닛/kg, 16 에서 160,000 유닛/kg, 16 에서 80,000 유닛/kg, 16 에서 40,000 유닛/kg, 16 에서 20,000 유닛/kg, 16 에서 16,000 유닛/kg, 16 에서 12,800 유닛/kg, 16 에서 10,000 유닛/kg, 16 에서 5,000 유닛/kg, 16 에서 4,000 유닛/kg, 16 에서 3,000 유닛/kg, 16 에서 2,000 유닛/kg, 16 에서 1,000 유닛/kg, 16 에서 900 유닛/kg, 16 에서 800 유닛/kg, 16 에서 700 유닛/kg, 16 에서 500 유닛/kg, 16 에서 400 유닛/kg, 16 에서 300 유닛/kg, 16 에서 200 유닛/kg, 16 에서 100 유닛/kg, 160 에서 12,800 유닛/kg, 160 에서 8,000 유닛/kg, 160 에서 6,000 유닛/kg, 160 에서 4,000 유닛/kg, 160 에서 2,000 유닛/kg, 160 에서 1,000 유닛/kg, 160 에서 500 유닛/kg, 500 에서 5000 유닛/kg, 1000 에서 100,000 유닛/kg 또는 1000 에서 10,000 유닛/kg으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에서 제공되는 PEG화 히알루로니다제(예컨대 PH20), 예를 들어 PEGPH20은, 약 1 유닛/kg ~ 1000 유닛/kg, 1 유닛/kg 에서 500 유닛/kg 또는 10 유닛/kg 에서 50 유닛/kg으로 투여될 수 있다.
일반적으로, PEG화 히알루로니다제의 특이적 활성은 약 18,000 U/mg에서 45,000 U/mg, 일반적으로, 대상의 체중 당 약 1 유닛/kg (U/kg), 2 U/kg, 3 U/kg, 4 U/kg, 5 U/kg, 6 U/kg, 7 U/kg, 8 U/kg, 8 U/kg 10 U/kg, 16 U/kg, 32 U/kg, 64 U/kg, 100 U/kg, 200 U/kg, 300 U/kg, 400 U/kg, 500 U/kg, 600 U/kg, 700 U/kg, 800 U/kg, 900 U/kg, 1,000 U/kg, 2,000 U/kg, 3,000 U/kg, 4,000 U/kg, 5,000 U/kg, 6,000 U/kg, 7,000 U/kg, 8,000 U/kg, 9,000 U/kg, 10,000 U/kg, 12,800 U/kg, 20,000 U/kg, 32,000 U/kg, 40,000 U/kg, 50,000 U/kg, 60,000 U/kg, 70,000 U/kg, 80,000 U/kg, 90,000 U/kg, 100,000 U/kg, 120,000 U/kg, 140,000 U/kg, 160,000 U/kg, 180,000 U/kg, 200,000 U/kg, 220,000 U/kg, 240,000 U/kg, 260,000 U/kg, 280,000 U/kg, 300,000 U/kg, 320,000 U/kg, 350,000 U/kg, 400,000 U/kg, 450,000 U/kg, 500,000 U/kg, 550,000 U/kg, 600,000 U/kg, 650,000 U/kg, 700,000 U/kg, 750,000 U/kg, 800,000 U/kg, 또는 그 이상이다.
일부 측면에서, PEG화 히알루로난 분해 효소는 혈장 내에 적어도 3 U/mL의 PEG화 히알루로니다제가 유지되도록 제형화되고 투여된다(예컨대 미국 공개번호 제US20100003238 및 국제 PCT 공개번호 제 WO2009128917호 참조). 예를 들어, PEG화 가용성 히알루로니다제는 혈장 내에 적어도 약 3 U/mL, 일반적으로 3 U/mL - 12 U/mL 또는 그 이상, 예를 들어, 적어도 약 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 11 U/mL, 12 U/mL, 13 U/mL, 14 U/mL, 15 U/mL, 16 U/mL, 17 U/mL, 18 U/mL, 19 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35 U/mL, 40 U/mL, 45 U/mL, 50 U/mL 또는 그 이상의 수준으로 유지되기에 충분한 양으로 전신적으로 투여되도록 제형화된다. 일반적으로, 혈장 내 적어도 3 U/mL의 히알루로니다제가 유지되도록 하려는 본원의 목적상, 약 0.02 mg/kg (대상의), 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.30 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.40 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg.kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg 또는 그 이상이 투여된다. 일반적으로, 변형된 히알루로니다제의 특이적 활성은 약 20,000 U/mg 에서 60,000 U/mg, 일반적으로 약 35,000 U/mg, 60,000 U; 70,000 U; 80,000 U; 90,000 U; 100,000 U; 200,000 U; 300,000 U; 400,000 U; 500,000 U; 600,000 U; 700,000 U; 800,000 U; 900,000 U; 1,000,000 U; 1,500,000 U; 2,000,000 U; 2,500,000 U; 3,000,000 U; 3,500,000 U; 4,000,000 U 또는 그 이상이 투여된다. 그러한 수준을 유지하기 위해, 투여는 매일, 1주일에 수 회, 주 2회, 주 1회 또는 월 1회로 될 수 있다.
혈액 내의 히알루로니다제를 적어도 3 U/mL로 유지하기 위해 PEG화 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PEG화 PH20의 양을 결정하는 것은 당업자가 할 수 있는 범위 내의 일이다. 혈액 내 히알루로니다제 수준은 혈액 내에 충분한 양의 히알루로니다제가 존재하는 것을 보장하도록 시간에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 당업자에 알려진 임의의 분석법이 혈장 내 히알루로니다제를 측정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 본원의 실시예에서 기술된 혈장 내 단백질에 대해 미세탁도 분석법 또는 효소 분석법이 수행될 수 있다. 혈장은 정상적으로 히알루로니다제 효소를 포함한다. 그러한 혈장 히알루로니다제 효소는 일반적으로 산성 pH에서 활성을 갖는다(미국 특허번호 제 7,105,330 참조). 그러므로, 변형된 효소로 처치하기 전에, 히알루로니다제의 혈장 수준을 결정하고 기준선(baseline)으로 사용해야 한다. 처리 후 혈장 히알루로니다제 수준의 다음 측정은 처리 전 수준과 비교될 수 있다. 대안적으로, 분석법은 혈장 내 내인성 리소좀 히알루로니다제 활성을 억제하는 pH 상태 하에서 수행될 수 있는데, 내인성 리소좀 히알루로니다제는 보통 산성 pH에서 활성을 나타낸다. 따라서, 변형된 가용성 히알루로니다제(예컨대 인간 PH20)가 중성 pH에서 활성인 곳에서, 단지 변형된 중성-활성 가용성 히알루로니다제 수준이 측정된다.
다른 실시예에서, 본원의 섹션 H에 기술된 바와 같이, PEG화 히알루로난 분해 효소는 더 낮은 용량으로 제형화되고 투여되는데, 본원에서 혈액 내 검출가능한 수준의 히알루로니다제가 부재한 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 치료적 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, PEG화 가용성 히알루로니다제는 20 ㎍/kg 미만, 예를 들어 0.01 ㎍/kg 에서 15 ㎍/kg, 0.05 ㎍/kg 에서 10 ㎍/kg , 0.75 ㎍/kg 에서 7.5 ㎍/kg 또는 1.0 ㎍/kg 에서 3.0 ㎍/kg, 예를 들면 약 0.01 ㎍/kg (대상의), 0.02 ㎍/kg, 0.03 ㎍/kg, 0.04 ㎍/kg, 0.05 ㎍/kg, 1.0 ㎍/kg, 1.5 ㎍/kg, 2.0 ㎍/kg, 2.5 ㎍/kg, 3.0 ㎍/kg, 3.5 ㎍/kg, 4.0 ㎍/kg, 4.5 ㎍/kg, 5.0 ㎍/kg, 5.5 ㎍/kg, 6.0 ㎍/kg, 7.0 ㎍/kg, 7.5 ㎍/kg, 8.0 ㎍/kg, 9.0 ㎍/kg, 10.0 ㎍/kg, 12.5 ㎍/kg 또는 15 ㎍/kg의 양으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 변형된 히알루로니다제의 특이적 활성은 약 20,000 U/mg 에서 60,000 U/mg, 일반적으로 약 35,000 U/mg, 200 유닛 에서 50,000 (U) 으로 투여되며, 예컨대, 200 U, 300 U; 400 U; 500 U; 600 U; 700 U; 800 U; 900 U; 1,000 U; 1250 U; 1500 U; 2000 U; 3000 U; 4000 U; 5,000 U; 6,000 U; 7,000 U; 8,000 U; 9,000 U; 10,000 U; 20,000 U; 30,000 U; 40,000 U; 또는 50,000 U으로 투여된다. 그러한 수준을 유지하기 위해, 투여는 매일, 1주일에 수 회, 주 2회, 주 1회, 또는 월 1회 이루어질 수 있다.
전형적으로, 본원에서 고려되는 PEG화 히알루로니다제의 주사 또는 주입의 부피는 약 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL 또는 그 이상이다. PEG화 히알루로니다제와 같은 PEG화 히알루로난 분해 효소는 약 50 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 400 U/mL 또는 500 U/mL (또는 작용적으로 동등한 양)의 저장 용액으로 제공될 수 있고, 직접 사용하거나 사용 전에 유효한 농도로 희석하기 위해 좀 더 농축된 형태, 예를 들어 약 1000 U/mL, 2000 U/mL, 3000 U/mL, 4000 U/mL, 5000 U/mL, 6000 U/mL, 7000 U/mL, 8000 U/mL, 9000 U/mL, 10,000 U/mL, 11,000 U/mL, 12,000 U/mL, 또는 12,800 U/mL로 제공될 수 있다. PEG화 히알루로니다제와 같은 PEG화 히알루로난 분해 효소의 투여되는 부피는 필요한 투여량에 따라 결정되나, 가용성 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소, 이용 가능한 저장 용액의 농도에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 PEG화 히알루로니다제와 같은 PEG화 히알루로난 분해 효소는 약 50 mL를 초과한 부피로 투여되지 않으며, 전형적으로 5-30 mL의 부피로 투여되고, 일반적으로 10 mL를 초과한 양으로는 투여되지 않는다는 것이 고려된다. 투여되는 PEG화 히알루로니다제와 같은 PEG화 히알루로난 분해 효소의 부피는 필요한 투여량과의 상관관계이나, 가용성 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소, 이용 가능한 저장 제형의 농도에 따라 다양할 수 있다.
3. 조합 치료
항- 히알루로난제 , 예를 들어 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 히알루로난 분해 효소(예컨대 PEGPH20과 같은 PEG화 히알루로니다제 )는, 예를 들어 히알루로난 관련 질환 또는 상태의 치료에 있어서 , 조합 치료제로 투여될 수 있다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 코르티코스테로이드는 조합 치료에 있어서 , 항- 히알루로난제의 부작용 또는 유해 사례를 개선하기 위해 투여될 수 있다.
예를 들어, 본원에 기술된 항- 히알루로난제의 조성물은, 다른 치료적 또는 약리학적 제제 또는 치료는, 예컨대 절차, 예를 들어, 히알루로난 관련 질환 또는 상태, 예를 들어, 히알루로난 -관련 암을 치료하기 위한 제제 또는 치료와 함께, 전에, 그와 함께 간헐적으로, 또는 그 다음에 공동- 제형화되거나 공동-투여될 수 있다. 그러한 제제는 다른 생물제제, 항암제, 저분자 화합물, 분산제, 마취제, 혈관수축제 및 수술, 그리고 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 질환 또는 상태의 치료를 위하여 이용가능한 그러한 다른 제제 및 치료는, 본원에 예시된 것들 모두를 포함하며, 당업자에게 알려져 있거나, 경험적으로 결정될 수 있다.
1종 또는 복수의 제 2 작용제 또는 1종 또는 복수의 처치가 1회 적용될 수 있고, 시간 간격을 두고 수 회에 걸쳐 더 적은 용량으로 나누어 투여될 수 있다. 선택된 제제/처리 제제는 처리 시간의 과정에 걸쳐, 예를 들어 수 시간, 수 일, 수 주, 또는 수 개월 동안에 걸쳐 1 또는 그 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 케이스에서, 지속적인 투여가 유용하다. 정확한 투여량 및 투여 과정은 지표 및 환자의 내성에 의존하는 것으로 이해된다. 일반적으로, 본원의 제 2 작용제/ 치료에 대한 투약 요법은 당업자에게 알려져 있다.
일 실시예에서 , 항- 히알루로난제 , 예를 들어 PEG화 히알루로니다제와 같은 PEG화 히알루로난 분해 효소는, 항- 히알루로난제 (예를 들어 PEG화 히알루로난 분해 효소) 및 질환 또는 상태를 치료하기 위한 제 2 작용제 또는 치료를 투여함으로써, 조합 치료의 일부로서 투여된다. 일 실시예에서 , PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항- 히알루로난제와 제 2 작용제 또는 치료는 공동- 제형화되거나 공동-투여될 수 있다. 또 다른 실시예에서 , 항- 히알루로난제 , 예를 들어 PEG화 히알루로니다제와 같은 PEG화 히알루로난 분해 효소는, 제 2 작용제 또는 치료 제제와 순차적으로, 간헐적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일반적으로, PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항- 히알루로난제는 , PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항- 히알루로난제가 예를 들어 간질 공간, 세포외 기질, 종양 조직, 혈액 또는 기타 조직과 같은 대상의 세포, 조직, 체액 내의 히알루론산을 감소시키거나 분해하도록, 제 2 작용제 또는 치료 제제의 투여 전에 투여된다. 예를 들어, 가용성 히알루로니다제 등 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항- 히알루로난제는 제 2 작용제 제제 투여 전 0.5 분, 1 분 , 2 분 , 3 분 , 4 분 , 5 분 , 6 분 , 7 분 , 8 분 , 9 분 , 10 분 , 20 분 , 30 분 , 1 시간 또는 그 이상 전에 투여될 수 있다. 일부 실시예에서 , PEG화 히알루로난 분해 효소 등 항- 히알루로난제는 제 2 작용제 제제와 함께 투여된다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 공동 투여의 원하는 근접성은 특정한 조직 설정, 및 치료될 특정 질환에서의 제제의 반감기 효과에 상당 부분 의존적이고, 적절한 동물 모델과 같은 적절한 모델에서 다양한 시간에 있어서 투여하는 제제의 효과를 시험함으로써 쉽게 최적화될 수 있다. 일부 상황에서, 항- 히알루로난제 , 예를 들어 PEG화 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소의 최적 투여 시간은 60분을 초과할 것이다.
항암제 및 다른 치료
항암제(또는 항암제 들) 또는 처치(또는 처치들)은 외과적 수술, 방사선 조사, 약물, 화학요법제, 폴리펩티드, 항체, 펩티드, 저분자 또는 유전자 치료 벡터, 바이러스 또는 DNA가 될 수 있다.
PEG화 히알루로니다제와 같은 PEG화 히알루로난 분해 효소의 투여후, 투여와 동시에 또는 투여전 투여될 수 있는 항암제의 예로는 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알렘투주맙; 알리트레티노인(9-시스-레티노산); 알로퓨리놀; 알트레타민; 알보시딥; 암바존; 암보마이신; 아메탄트론; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 아낙시론; 안시타빈; 안트라마이신; 아파지퀀; 아르기메스나; 삼산화비소; 아스파라기나제; 아스페를린; 아트리무스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바녹산트론; 바타불린; 바티마스타트; BCG 라이브; 베낙시빈; 벤다무스틴; 벤조데파; 벡사로텐; 베바시주맙; 비칼루타미드; 비에타세르핀; 비리코다르; 비산트렌; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신; 보르테조밉; 브레퀴나르; 브로피리민; 부도티탄; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카네르티닙; 카페시타빈; 카라세미드; 카르베티머; 카보플라틴; 카르보퀀; 카르모푸르; 폴리페프로산과의 카르무스틴; 카르무스틴; 카루비신; 카르젤레신; 세데핑골;셀레콕시브; 세마도틴; 클로람부실; 시오테로넬; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 클란페누르; 클로파라빈; 크리스나톨; 시클로포스파미드; 리포좀 시타라빈; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 리포좀 다우노루비신; 다우노루비신/다우노마이신; 다우노루비신; 데시타빈; 데니류킨 디프티톡스; 덱스니굴디핀; 덱소나플라틴; 덱스라족산; 데자구아닌; 디아지퀀; 디브로스피듐; 디에노게스트; 디날린; 디세르몰리드; 도세탁셀; 도페퀴다르; 독시플루리딘; 리포좀 독소루비신; 독소루비신 HCL; 독소루비신 HCL 리포좀 주사; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에코무스틴; 에다트렉세이트; 에도테카린; 에플로르니틴; 엘라크리다르; 엘리나피드; 엘리엇 B 용액; 엘사미트루신; 에미테푸르; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 엔자스타우린; 에피프로피딘; 에피루비신; 에포에틴 알파; 엡탈로프로스트; 에르불로졸; 에소루비신; 에스트라무스틴; 에타니다졸; 에토글루시드; 에토포시드 포스페이트; 에토포시드 VP-16; 에토포시드; 에토프린; 엑세메스탄; 엑시술린드; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 플록수리딘; 플루다라빈; 플루오로우라실; 5-플루오로우라실; 플루옥시메스테론; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신; 포트레타민; 풀베스트란트; 갈라루비신; 갈로시타빈; 겜시타빈; 겜투주맙/오조가미신; 게로퀴놀; 기마테칸; 기메라실; 글록사존; 글루포스파미드; 고세렐린 아세테이트; 히드록시우레아; 이브리투모맙/티욱세탄; 이다루비신; 이포스파미드; 일모포신; 일로마스타트; 이매티닙 메실레이트; 이멕손; 임프로술판; 인디술람; 인프로퀀; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파; 인터페론 베타; 인터페론 감마; 인터페론; 인터류킨-2 및 다른 인터류킨 (재조합 인터류킨 포함); 인토플리신; 이오벤구안 [131-I]; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이르소글라딘; 익사베필론; 케토트렉세이트; L-알라노신; 란레오티드; 라파티닙; 레독산트론; 레트로졸; 류코보린; 류프롤리드; 류프로렐린 (류프로렐리드); 레바미솔; 렉사칼시톨; 리아로졸; 로바플라틴; 로메트렉솔; 로무스틴/CCNU; 로무스틴; 로나파르닙; 로속산트론; 루르토테칸; 마포스파미드; 만노술판; 마리마스타트; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민; 메클로레타민/질소 머스타드; 메게스트롤 아세테이트; 메게스트롤; 멜렌게스트롤; 멜팔란; 멜팔란sl/L-PAM; 메노가릴; 메피티오스탄; 머캅토퓨린; 6-머캅토퓨린; 메스나; 메테신드; 메토트렉세이트; 메톡살렌; 메토미데이트; 메토프린; 메투레데파; 미보플라틴; 미프록시펜; 미소니다졸; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토플락손; 미토길린; 미토구아존; 미토말신; 미토마이신 C; 미토마이신; 미토나피드; 미토퀴돈; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론; 미토졸로미드; 미보불린; 미조리빈; 모파로텐; 모피다몰; 무브리티닙; 미코페놀산; 난드롤론 펜프로피오네이트; 네다플라틴; 넬자라빈; 네모루비신; 니트라크린; 노코다졸; 노페투모맙; 노갈라마이신; 놀라트렉세드; 노르토픽산트론; 옥트레오티드; 오프렐베킨; 오르마플라틴; 오르타탁셀; 오테라실; 옥살리플라틴; 옥시수란; 옥소페나르신; 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파투빌론; 페가데마제; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; 펠데신; 펠리오마이신; 펠리트렉솔; 페메트렉세드; 펜타무스틴; 펜토스타틴; 페플로마이신; 페르포스파미드; 페리포신; 피코플라틴; 피나피드; 피포브로만; 피포술판; 피르페니돈; 피록산트론; 픽산트론; 플레비트렉세드; 플리카마이시드 미트라마이신; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피머; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프로파미딘; 프로스피듐; 퓨미테파; 퓨로마이신; 피라조푸린; 퀴나크린; 라니무스틴; 라스부리카제; 리보프린; 리트로술판; 리툭시맙; 로글레티미드; 로퀴니멕스; 루포크로모마이신; 사바루비신; 사핑골; 사르그라모스팀; 사트라플라틴; 세브리플라틴; 세무스틴; 심트라젠; 시조피란; 소부족산; 소라페닙; 스파르포세이트; 스파르포스산; 스파르소마이신; 스피로게르마늄; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스쿠알라민; 스트렙토니그린; 스트렙토바리신; 스트렙토조신; 수포스파미드; 술로페누르; 수니티닙 말레이트; 6-티오구아닌 (6-TG); 타세디날린;탈크; 탈이소마이신; 탈리무스틴; 타목시펜; 타리퀴다르; 타우로무스틴; 테코갈란; 테가푸르; 텔록산트론; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드/VM-26; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아미프린; 티아조푸린; 틸로미솔; 틸로론; 팀코다르; 티모나시크; 티라파자민; 토픽산트론; 토포테칸; 토레미펜; 토시투모맙; 트라벡테딘 (엑테이나시딘 743); 트라스투주맙; 트레스톨론; 트레티노인/ATRA; 트리시리빈; 트릴로스탄; 트리메트렉세이트; 트리플라틴 테트라니트레이트; 트립토렐린; 트로포스파미드; 투불로졸; 우베니멕스; 우라실 머스타드; 우레데파; 발루비신; 발스포다르; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 빈데신; 비네피딘; 빈플루닌; 빈포르미드; 빈글리시네이트; 빈류시놀; 빈류로신; 비노렐빈; 빈로시딘; 빈트립톨; 빈졸리딘; 보로졸; 크산토마이신 A (구아메사이클린); 제니플라틴; 질라스코르브 [2-H]; 지노스타틴; 졸레드로네이트; 조루비신 및 조수퀴다르가 있다. 예를 들어: 알데스류킨 (예를 들어, 프로류킨®(PROLEUKIN)); 알렘투주맙 (예를 들어, 캠패스®(CAMPATH)); 알리트레티노인 (예를 들어, 판레틴®(PANRETIN)); 알로퓨리놀 (예를 들어, 질로프림®(ZYLOPRIM)); 알트레타민 (예를 들어, 헥살렌®(HEXALEN)); 아미포스틴 (예를 들어, 에티올®(ETHYOL)); 아나스트로졸 (예를 들어, 아리미덱스®(ARIMIDEX)); 삼산화비소 (예를 들어, 트리세녹스®(TRISENOX)); 아스파라기나제 (예를 들어, 엘스파르®(ELSPAR)); BCG 라이브 (예를 들어, 타이스®(TICE)BCG); 벡사로텐 (예를 들어, 타그레틴®(TARGRETIN)); 베바시주맙 (아바스틴®(AVASTIN)); 블레오마이신 (예를 들어, 블레녹산®(BLENOXANE)); 부술판 정맥내 (예를 들어, 부술펙스®(BUSULFEX)); 부술판 경구 (예를 들어, 밀레란®(MYLERAN)); 칼루스테론 (예를 들어, 메토사르브®(METHOSARB)); 카페시타빈 (예를 들어, 젤로다®(XELODA)); 카보플라틴 (예를 들어, 파라플라틴®(PARAPLATIN)); 카르무스틴 (예를 들어, BCNU®, BiCNU®); 폴리페프로산과의 카르무스틴 (예를 들어, 글리아델®(GLIADEL)웨이퍼); 셀레콕시브 (예를 들어, 셀레브렉스®(CELEBREX)); 클로람부실 (예를 들어, 류케란®(LEUKERAN)); 시스플라틴 (예를 들어, 플라티놀®(PLATINOL)); 클라드리빈 (예를 들어, 류스타틴®(LEUSTATIN), 2-CdA); 시클로포스파미드 (예를 들어, 사이톡산(CYTOXAN), 네오사르(NEOSAR)); 시타라빈 (예를 들어, 사이토사르-U®(CYTOSAR-U)); 리포좀 시타라빈 (예를 들어, 디포사이트®(DepoCyt)); 다카르바진 (예를 들어, DTIC-Dome®): 닥티노마이신 (예를 들어, 코스메겐®(COSMEGEN)); 다르베포에틴 알파 (예를 들어, 아라네스프®(ARANESP)); 리포좀 다우노루비신 (예를 들어, 다누옥솜®(DANUOXOME)); 다우노루비신/다우노마이신 (예를 들어, 세루비딘®(CERUBIDINE)); 데니류킨 디프티톡스 (예를 들어, 온타크®(ONTAK)); 덱스라족산 (예를 들어, 지네카드®(ZINECARD)); 도세탁셀 (예를 들어, 탁소테레®(TAXOTERE)); 독소루비신 (예를 들어, 아드리아마이신®(ADRIAMYCIN), 루벡스®(RUBEX)); 리포좀 독소루비신, 예를 들어 독소루비신 HCL 리포좀 주사 (예를 들어, 독실®(DOXIL)); 드로모스타놀론 프로피오네이트 (예를 들어, 드로모스타놀론®(DROMOSTANOLONE)및 마스터론®(MASTERONE)주사); 엘리엇 B 용액 (예를 들어, 엘리엇 B 용액®(Elliott's B Solution)); 에피루비신 (예를 들어, 엘렌스®(ELLENCE)); 에포에틴 알파 (예를 들어, 에포겐®(EPOGEN)); 에스트라무스틴 (예를 들어, 엠사이트®(EMCYT)); 에토포시드 포스페이트 (예를 들어, 에토포포스®(ETOPOPHOS)); 에토포시드 VP-16 (예를 들어, 베페시드®(VEPESID)); 엑세메스탄 (예를 들어, 아로마신®(AROMASIN)); 필그라스팀 (예를 들어, 뉴포겐®(NEUPOGEN)); 플록수리딘 (예를 들어, 푸드르®(FUDR)); 플루다라빈 (예를 들어, 플루다라®(FLUDARA)); 플루오로우라실, 예를 들어 5-FU (예를 들어, 아드루실(ADRUCIL)); 풀베스트란트 (예를 들어, 파슬로덱스(FASLODEX)); 겜시타빈 (예를 들어, 젬자(GEMZAR)); 겜투주맙/오조가미신 (예를 들어, 밀로타르그(MYLOTARG)); 고세렐린 아세테이트 (예를 들어, 졸라덱스(ZOLADEX)); 히드록시우레아 (예를 들어, 하이드레아(HYDREA)); 이브리투모맙/티욱세탄 (예를 들어, 제발린(ZEVALIN)); 이다루비신 (예를 들어, 이다마이신(IDAMYCIN)); 이포스파미드 (예를 들어, 이펙스(IFEX)); 이매티닙 메실레이트 (예를 들어, 글리벡(GLEEVEC)); 인터페론 알파-2a (예를 들어, 로페론-A(ROFERON-A)); 인터페론 알파-2b (예를 들어, 인트론 A(INTRON A)); 이리노테칸 (예를 들어, 캄프토사르(CAMPTOSAR)); 레트로졸 (예를 들어, 페마라(FEMARA)); 류코보린 (예를 들어, 웰코보린(WELLCOVORIN), 류코보린(LEUCOVORIN)); 레바미솔 (예를 들어, 에르가미솔(ERGAMISOL)); 로무스틴/CCNU (예를 들어, CeeBU); 메클로레타민/질소 머스타드 (예를 들어, 머스타겐(MUSTARGEN)); 메게스트롤 아세테이트 (예를 들어, 메가스(MEGACE)); 멜팔란sl/L-PAM (MelphalanslL-PAMs, 예를 들어, 알케란(ALKERAN)); 머캅토퓨린, 예를 들어 6-머캅토퓨린 (6-MP; 예를 들어 퓨리네톨(PURINETHOL)); 메스나 (예를 들어, 메스넥스(MESNEX)); 메토트렉세이트; 메톡살렌 (예를 들어, 우바덱스(UVADEX)); 미토마이신 C (예를 들, 뮤타마이신(MUTAMYCIN), 미토지트렉스(MITOZYTREX)); 미토탄 (예를 들어, 리소드렌(LYSODREN)); 미톡산트론 (예를 들어, 노반트론(NOVANTRONE)); 난드롤론 펜프로피오네이트 (예를 들어, 듀라볼린-50(DURABOLIN-50); 노페투모맙 (예를 들어, 베르루마®(VERLUMA)); 오프렐베킨 (예를 들어, 뉴메가®(NEUMEGA)); 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴®(ELOXATIN)); 파클리탁셀 (예를 들어, 팍센®(PAXENE), 탁솔®(TAXOL)); 파미드로네이트 (예를 들어, 아레디아®(AREDIA)); 페가데마제 (예를 들어, 아다겐®(ADAGEN)); 페가스파르가제 (예를 들어, 온카스파르®(ONCASPAR)); 페그필그라스팀 (예를 들어, 뉴라스타®(NEULASTA)); 펜토스타틴 (예를 들어, 니펜트®(NIPENT)); 피포브로만 (예를 들어, 베르사이트®(VERCYTE)); 플리카마이신/미트라마이신 (예를 들어, 미트라신®(MITHRACIN)); 포르피머 나트륨 (예를 들어, 포토프린®(PHOTOFRIN)); 프로카르바진 (예를 들어, 마튤란®(MATULANE)); 퀴나크린 (예를 들어, 아타브린®(ATABRINE)); 라스부리카제 (예를 들어, 엘리테크®(ELITEK)); 리툭시맙 (예를 들어, 리툭산®(RITUXAN)); 사르그라모스팀 (예를 들어, 프로카인®(PROKINE)); 스트렙토조신 (예를 들어, 자노사르®(ZANOSAR)); 수니티닙 말레이트 (예를 들어, 수텐트®(SUTENT)); 탈크 (예를 들어, 스클레로솔(SCLEROSOL)); 타목시펜 (예를 들어, 놀바덱스(NOLVADEX)); 테모졸로미드 (예를 들어, 테모다르®(TEMODAR)); 테니포시드/VM-26 (예를 들어, 부몬®(VUMON)); 테스토락톤 (예를 들어, 테슬락®(TESLAC)); 티오구아닌, 예를 들어 6-티오구아닌 (6-TG); 티오테파 (예를 들어, 티오플렉스®(THIOPLEX)); 토포테칸 (예를 들어, 하이캄틴®(HYCAMTIN)); 토레미펜 (예를 들어, 파레스톤®(FARESTON)); 토시투모맙 (예를 들어, 벡사르®(BEXXAR); 트라스투주맙 (예를 들어, 헤르셉틴®(HERCEPTIN)); 트레티노인/ATRA (예를 들어, 베사노이드®(VESANOID)); 우라실 머스타드; 발루비신 (예를 들어, 발스타르®(VALSTAR)); 빈블라스틴 (예를 들어, 벨반®(VELBAN)); 빈크리스틴 (예를 들어, 온코빈®(ONCOVIN)); 비노렐빈 (예를 들어, 나벨빈®(NAVELBINE)); 및 졸레드로네이트 (예를 들어, 조메타®(ZOMETA))가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
4. 포장 및 제조품
또한, 포장재료, 본원에서 제공된 임의의 약학적 조성물 및 조합, 및 상기 조성물 및 조합이 항-히알루로난제, 예를 들어, PEG화 히알루로난 분해 효소 투여와 관련된 부작용 치료 및/또는 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료하는데 이용된다는 것을 지시하는 라벨을 포함하는 제조품이 제공된다.
제조품의 예는 단일 챔버 및 이중 챔버 용기를 포함하는 용기이다. 용기는 튜브, 병 및 주사기를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 용기는 추가로 피하 투여용 바늘을 포함할 수 있다.
한 예에서, 약학적 조성물은 제 2 작용제 또는 치료 없이 코르티코스테로이드를 포함한다. 다른 예에서, 제조품은 코르티코스테로이드와 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 히알루로난-분해 효소를 함유한다. 상기 예에서, 코르티코스테로이드와 항-히알루로난제, 예컨대 PEG화 히알루로난 분해 효소는 제조품으로써 포장을 위하여 함께 또는 별도로 제공될 수 있다. 다른 실시예에서, 제조품은 코르티코스테로이드, 항-히알루로난제(예컨대 PEG화 히알루로난 분해 효소) 및 1종 이상의 제 2 작용제 또는 1종 이상의 처치를 함유한다. 상기 실시예에서, 코르티코스테로이드, 항-히알루로난제(예컨대 PEG화 히알루로난 분해 효소) 및 1종 이상의 제 2 작용제 또는 1종 이상의 처치는 제조품으로써 포장을 위하여 함께 또는 별도로 제공될 수 있다.
일 실시예에서, 약학적 조성물은 항-히알루로난제(예컨대 PEG화 히알루로난 분해 효소)를 함유하고 제 2 작용제 또는 처치를 포함하지 않는다. 다른 실시예에서, 제조품은 항-히알루로난제(예컨대 PEG화 히알루로난 분해 효소) 및 1종 이상의 제 2 작용제 또는 처치를 포함한다. 이 실시예에서, 제 2 작용제와 항-히알루로난제, 예컨대 PEG화 히알루로니다제와 같은 PEG화 히알루로난 분해 효소의 약학적 조성물은 제조품으로써 포장을 위하여 함께 또는 별도로 제공될 수 있다.
본원에서 제공되는 제조품은 포장재료를 함유한다. 약학적 제품을 포장하는데 사용되는 포장재료는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 각각이 본원에서 전체로 통합되는 미국특허번호 제5,323,907, 제5,052,558 및 제5,033,252호를 참조하라. 약학적 포장재료의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 용기, 주사기, 병, 그리고 선택된 제형과 의도된 투여 및 치료방식에 적절한 임의의 포장재료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
포장의 선택은 코르티코스테로이드, 예컨대 글루코코르티코이드 및 기타 제제, 및 이러한 조성물이 함께 또는 별도로 포장될 것인지에 따라 달라진다. 일반적으로, 포장은 담겨 있는 조성물과 비-반응성이다. 다른 실시예에서, 일부 구성 요소는 혼합물로써 포장될 수 있다. 다른 실시예에서, 모든 구성요소가 별도로 포장되어 있다. 그러므로, 예를 들어, 구성 요소는 투여 직전에 혼합되도록, 별도의 조성물로 포장될 수 있고, 직접 함께 투여될 수 있다. 대안적으로, 구성요소는 별도로 투여될 수 있는 별도의 조성물로 포장될 수도 있다.
구성요소는 용기 내에 포장될 수 있다. 구성요소는 동일한 용기 내에 별도로 포장될 수 있다. 일반적으로, 그러한 용기는 글루코코르티코이드를 함유하는 밀봉된, 한정된 공간, 다른 구성요소를 함유하는 밀봉된, 한정된 공간 또는 구성요소를 포함하고, 다음 영역은 쉽게 제거할 수 있는 막으로 분리될 수 있어, 막을 제거하면 구성요소가 혼합되도록 할 수 있다. 글루코코르티코이드가 투여 전에 다른 구성요소들로부터 분리되도록 할 수 있는 한, 임의의 용기 또는 다른 제조품이 고려된다. 적절한 구현예에 관해서라면, 미국 특허번호 제 3,539,794호 및 제 5,171,081호를 참조하라.
그 제조품을 포함하는 선택된 조성물들은 또한 키트로서 제공될 수 있다. 키트는 본원에 기재된 약학적 조성물 및 투여용품을 포함할 수 있다. 임의적으로, 키트는 투여량, 투약요법 및 투여방식에 대한 지침서를 포함한 적용 지침서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 본원에 기재된 약학적 조성물 및 진단용품을 포함할 수 있다.
G. 항-히알루로난제 및 코르티코스테로이드의 활성 및 효과를 평가하는 방법
본원에서는 투여된 항-히알루로난제로부터 유발된 유해 효과를 개선 및/또는 제거하기 위해 코르티코스테로이드, 예를 들어 덱사메타손과 같은 글루코코르티코이드로 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, PEG화 히알루로니다제의 전신적 투여는, 예를 들어 근육 및 관절의 통증, 상하지의 뻣뻣함, 경련, 근염, 전신의 근육통 및 근압통, 쇠약, 피로 및/또는 무릎 및 팔꿈치 관절의 운동 범위 감소를 포함하는 근골격계 부작용과 관련이 있다. 그러한 방법에서, 코르티코스테로이드는 일반적으로 히알루로난 합성을 억제하거나 히알루로난을 분해함으로써 히알루로난을 감소시키는 항-히알루로난제의 활성을 제거하지 않고 부작용을 개선시키기 위해 투여된다. PEG화 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제의 활성을 저해하지 않는 것을 포함하여, 코르티코스테로이드가 그러한 부작용을 억제하는 것을 평가하는 것은 당업자가 할 수 있는 범위 내의 일이다. 예를 들어, 다양한 동물 모델 및 인간에서의 임상적 연구가 수행될 수 있다. 항-히알루로난제의 부작용의 개선을 평가하는 것 뿐 아니라, 효능, 내성 및 약동학적 연구가 다양한 투여량의 코르티코스테로이드 존재 또는 부재하에서 수행될 수 있다.
특히, PEG화 히알루로난은 히알루로난 관련 질환 및 상태, 특히 암의 치료를 위한, 단독 또는 화학요법제와 같은 제 2 작용제와 조합되는 치료제이다(예를 들어 US 2010/0003238 및 WO09/128917 참조). 그러므로, 코르티코스테로이드를 이용한 PEG화 히알루로니다제의 부작용의 개선은, PEG화 히알루로니다제의 전신적, 예를 들어 근골격계의, 부작용을 최소화하면서 이러한 치료에 있어서 PEG화 히알루로니다제의 이용을 가능하게 한다. 암과 같은 히알루로난 관련 질환의 동물 모델을 포함한, 연구를 PEG화 히알루로니다제의 효능을 평가하기 위해 단독 또는 화학요법제와 조합으로, 그리고 코르티코스테로이드 처리 존재 또는 부재하에서 수행될 수 있다.
1. 부작용을 평가하기 위한 방법
근골격계 부작용의 개선 또는 제거에 있어서 코르티코스테로이드의 효능을 평가하기 위해 in vivo 분석이 사용될 수 있다. 평가될 수 있는 부작용은 예를 들어 근육 및 관절의 통증, 상하지의 뻣뻣함, 경련, 근염, 전신의 근육통 및 근압통, 쇠약, 피로 및/또는 무릎 및 팔꿈치 관절의 운동 범위 감소를 포함한다. 부작용을 평가하기 위한 분석법은 동물 모델이 될 수 있는데, 동물이 감소된 운동, 행동 또는 자세 변화, 방사선 소견, 조직병리학적 변화 및 기타 주목할 만한 임상적 관찰 소견을 보이는지 관찰할 수 있다. 다른 분석법은 인간 대상에서의 임상적 시험을 포함하는데, 여기서 환자들은 증상에 대해 질문을 받을 수 있고, 신체 검사, 영상화(예를 들어 MRI 또는 PET에 의해), 또는 방사선학적 평가에 의해 평가받을 수 있다. 항-히알루로난제 투여에 의해 유발된 부작용의 개선은 코르티코스테로이드 부재시와 비교할 때 코르티코스테로이드 존재하에서 부작용이 개선, 제거, 경감 또는 감소되었을 때 관찰된다.
그러한 실시예에서, 항-히알루로난제 및/또는 코르티코스테로이드의 투여량은, 부작용을 개선하면서, 활성을 달성하는데 필요한 최적의 또는 최소의 투여량을 확인하기위해 다양해질 수 있다. 그러한 연구는 당업자의 수준 내에 있는 것이다. 또한, 투약 요법도 다양할 수 있다. 예를 들어, 연구는 항-히알루로난제를 매월, 2주에 1회, 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회 또는 그 이상의 투약 스케줄을 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 코르티코스테로이드는 항-히알루로난제 투여 전, 동시 및/또는 후에 투여될 수 있다. 실시예들은 동물 모델 및 인간 환자에서의 그러한 연구에 대해 예시한다.
예를 들어, in vivo 동물 모델이 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드가 항-히알루로난 제제 투여와 관련된 부작용을 개선 또는 제거하는 능력을 평가하기 위해 활용될 수 있다. 동물 모델은 사이노몰거스 원숭이 또는 레서스 원숭이와 같은 비-인간 영장류, 개, 예를 들어, 비글견, 또는 PEG화 히알루로니다제 처치에 대한 반응으로 유해 부작용을 나타내는 임의의 다른 동물을 포함할 수 있다. 동물 모델은 코르티코스테로이드 존재 또는 부재 및 관찰되거나 측정된 근골격계 효과 내에서 항-히알루로난 제제를 투여받을 수 있다. 예를 들어, 사이노몰거스 원숭이, 비글 또는 근골격계 사례를 관찰할 수 있거나 측정할 수 있는 기타 유사한 동물 모델은 코르티코스테로이드 존재 또는 부재하에 항-히알루로난 제제를 처치할 수 있다.
일 실시예에서, 동물군, 예를 들어 사이노몰거스 원숭이 또는 비글견은 항-히알루로난 제제, 예를 들어 PEG화 히알루로니다제를 단독으로 정맥내 투여 등을 통해 투여받을 수 있다. 예를 들어, 투여는 주 2회가 될 수 있다. 치료는 사지 관절 운동 범위에서의 변화가 무릎 및 팔꿈치 관절에서 관찰되거나 강직 또는 감소된 운동성이 관찰되기 전까지 계속될 수 있다. 그리고 나서, 다른 동물군은 항-히알루로난제 및 항-히알루로난제를 투여한 동일한 날에 투여된 코르티코스테로이드, 예컨대 경구 투여의 덱사메타손 또는 다른 코르티코스테로이드으로 처리될 수 있다. 동물군은 그리고 나서 예를 들어, 관절 운동 범위 또는 다른 감소된 이동성, 관절의 조직병리학, 뻣뻣함에 대한 촉진 또는 당업자에게 알려진 영상화 시험을 통하여 덱사메타손와 같은 코르티코스테로이드가 항-히알루로난제에 의해 유도된 근골격계 부작용을 개선하는 능력을 평가하기 위해 비교할 수 있다. 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드의 투여량, 투여 빈도, 투여 경로 및 투여 시간은 코르티코스테로이드의 유효성을 최적화하기 위해 다양할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 항-히알루로난제와 관련한 유해 부작용의 개선 또는 제거에 있어서 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드의 효능은 고형 종양이 있는 인간 환자에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 임상 시험이 다음의 임의의 하나 또는 그 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 항-히알루로난제에 의해 매개된 유해 사례를 개선 및/또는 제거를 위한 코르티코스테로이드의 능력을 시험하기 위해 설계될 수 있다: 근육 및 관절의 통증/상하지 뻣뻣함, 경련, 근염, 전신의 근육통 및 근압통, 쇠약, 피로. 환자들은 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드를 이용하는 공동처리와 함께 또는 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드를 이용하는 공동처리 없이 항-히알루로난제 처리될 수 있다. 항-히알루로난제의 투여 동안 또는 투여 후에, 양 처리군에서의 부작용이 평가될 수 있다. 의사가 대상의 예를 들어 환자의 불평, 활력 징후, 체중 변화, 12 유도 심전도(12-Lead ECG), 심초음파, 임상 화학, 또는 영상화(MRI, PET 또는 방사선학적 평가)를 포함하는 대상의 신체 검사에 의해 증상의 심각성을 결정할 수 있다. 증상의 심각성은 NCI 유해 사례에 대한 표준 용어 기준(Common Terminology Criteria for Adverse Events; CTCAE) 등급 시스템을 사용하여 정량화할 수 있다. CTCAE는 유해사례(AE) 보고를 위해 활용되는 기술적 용어이다. 등급 (심각성) 척도는 각 AE 용어에 대해 제공된다. CTCAE는 1등급 내지 5등급, 다음의 일반적인 지침에 기초한 각 유해 사례의 심각성에 대한 암상적 서술을 보여준다: 1등급(약한 AE); 2등급(중등도 AE); 3등급(심각한 AE); 4등급(생명을 위협하는 또는 장애를 유발하는 AE); 및 5등급(사망과 관련된 AE). 코르티코스테로이드가 항-히알루로난제의 투여와 관련된 유해 부작용을 개선시키는 능력은 항-히알루로난 제제를 단독으로 투여받은 대상과 비교하여 항-히알루로난제 단독을 투여받은 대상에 있어서의 하나 또는 그 이상의 유해 부작용에 있어서의 CTCAE 척도상 등급 또는 심각성이 감소되는 것이 관찰됨으로써 측정될 수 있다, 즉, 부작용의 심각성이 3등급에서 1등급 또는 2등급으로 감소한다. 이는 본원에서 실시예들에서 예시된다.
또 다른 실시예에서, 임상 시험은 항-히알루로난제의 투여량을 증가시킴으로써 내성을 평가하고 용량 제한 독성을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 그러한 실시예에서, 코르티코스테로이드와 같은 개선제의 존재 하에서 대상이 견딜 수 있는 항-히알루로난제의 최대 내성 용량이 결정될 수 있다. 투약 요법은 각 등록된 환자가 동일 투여량 수준의 코르티코스테로이드에서 더 높은 투여량의 항-히알루로난제를 투여받는 투여량 증가시키는 것을 포함한다. 환자들은 부작용을 더 이상 견딜 수 없기 전에 코르티코스테로이드와 투여될 수 있는 최고 투여량의 항-히알루로난 제제를 결정하기 위하여 유해 사례가 모니터링될 수 있다. 내성은 처치 중 및 후에 나타나는 증상의 심각성에 기초하여 측정될 수 있다. 항-히알루로난제의 투여량은 유해사례가 미리 결정된 수준, 예를 들어 3등급에 달할 때까지 증가될 수 있다. 투약 요법은 코르티코스테로이드에 대한 계속적인 필요 및 유발되는 부작용과 관련한 항-히알루로난제에 대한 순응(acclimation) 가능성을 검사하기 위해 투여되는 코르티코스테로이드의 양을 점점 줄이는 것을 포함한다.
2. 항-히알루로난 활성
항-히알루로난제의 부작용을 개선하는 데 있어 코르티코스테로이드의 효과를 평가하기 위한 분석법 뿐 아니라, 다른 분석법이 코르티코스테로이드가 히알루로난 억제 또는 분해 활성에 미치는 효과를 평가하기 위하여 상기 언급된 것과 별개로 또는 상기 언급된 것과 함께 수행될 수 있다. 그러한 분석법에는 조직 또는 종양 생검에서의 히알루로난의 양의 측정, 혈장 내 가용성 히알루로난의 양의 측정, 혈액 또는 뇨 내 히알루로난 이화물의 측정, 혈장 내 히알루로니다제 활성의 측정, 간질액 압력, 종양에 있어서의 혈관 부피 또는 물 함량의 측정을 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다른 분석법, 예컨대 약동학적 측정, 당업자에게 잘 알려진 방법들은, 항-히알루로난제의 약동학적 파라미터에 대한 코르티코스테로이드의 효과를 평가하기 위해 사용할 수 있다.
a. 히알루로난 분해 효소의 활성을 평가하기 위한 분석법
히알루로난 분해 효소의 활성은 당업계에 익히 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다제에 대한 USP XXII 분석법은 효소를 30분 동안 37℃에서 HA와 반응시킨 후 남은 분해되지 않은 히알루론산(또는 히알루로난) (HA) 기질의 양을 측정함으로써 활성을 간접적으로 결정한다 (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 미국 약전 협회(United States Pharmacopeia Convention, Inc), 미국 메릴랜드주 락빌 소재). 히알루로니다제 표준품 (USP) 또는 국가 의약품집 (NF) 표준 히알루로니다제 용액이 임의의 히알루로니다제의 활성을, 단위로, 확인하기 위한 분석법에서 사용될 수 있다. 한 예에서, 활성은 미세탁도 분석법을 사용하여 측정된다. 이는 히알루론산이 혈청 알부민과 결합시 불용성 침전물의 형성을 기초로 한다. 상기 활성은 히알루로니다제 또는 혈액이나 혈장 등 히알루로니다제를 포함하는 시료를 나트륨 히알루로네이트 (히알루론산)와 설정된 기간 동안 (예를 들어, 10분) 배양한 후 소화되지 않은 나트륨 히알루로네이트를 산성화된 혈청 알부민의 첨가에 의해 침전시켜 측정된다. 생성된 시료의 탁도는 추가 현상 기간 후 640 nm에서 측정된다. 나트륨 히알루로네이트 기질에 대한 히알루로니다제 활성에 의해 유발된 탁도의 감소는 히알루로니다제 효소 활성의 척도이다.
다른 예에서, 히알루로니다제 활성은 히알루로니다제 또는 혈액 또는 혈장 등 히알루로니다제를 함유하는 시료와 배양 후 잔류 비오티닐화된 히알루론산을 측정하는 미세역가 분석법을 이용하여 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269], 미국 특허 공개 제20050260186호 참조). 히알루론산의 글루쿠론산 잔기 상의 유리 카르복실기를 비오티닐화시키고, 비오티닐화된 히알루론산 기질을 미세역가 플레이트에 공유결합으로 커플링시킨다. 히알루로니다제와의 배양 후, 잔류 비오티닐화된 히알루론산 기질을 아비딘-퍼옥시다제 반응을 이용하여 검출하고, 공지된 활성의 히알루로니다제 표준과의 반응 후 얻어지는 것과 비교한다. 히알루로니다제 활성을 측정하기 위한 다른 분석법이 또한 당분야에 공지되어 있고, 본원의 방법에서 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41]; [Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263] 참조).
산포제 또는 확산제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 가용성 히알루로니다제 (예를 들어, PEG화 rHuPH20)의 능력을 또한 평가할 수 있다. 예를 들어, 트립판 블루 염료를 히알루로난 분해 효소와 함께 또는 히알루로난 분해 효소 없이 예컨대 피하로 또는 피부내로 누드 마우스의 각 측면 상의 가측 피부로 주사할 수 있다. 그 후, 염료 면적을 예컨대 마이크로캘리퍼스로 측정하여, 산포제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소의 능력을 결정한다 (예를 들어, 미국 공개 특허 제20060104968호 참조).
상기 분석법들은 코르티코스테로이드 존재 또는 부재하에서 히알루로난 분해 효소를 사용하여 수행될 수 있으며, 코르티코스테로이드와 함께 또는 코르티코스테로이드 없이 히알루로니다제를 처치한 환자 또는 동물의 혈액 또는 혈장을 사용하여 수행될 수도 있다.
b. 동물 모델에서의 분석법
히알루로난 관련 질환, 장애 또는 상태의 동물 모델은 코르티코스테로이드의 공동 투여와 함께 또는 부존재 하에서 항-히알루로난제, 예컨대 변형된 히알루로니다제 또는 PEG화 히알루로니다제의 투여의 in vivo 효과를 평가하기 위해 활용할 수 있다. 화학요법제와 같은 또 다른 약물이 활성 평가에 포함될 수 있다. 적절한 동물 모델이 활용될 수 있는 예시적인 히알루로난 관련 질환은 고형 종양, 예를 들어 말기암, 전이성 암, 미분화성 암, 난소암, 원암종(ISC), 편평세포암(SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 결장암 및 기타 암을 포함한다. 또한 히알루로난 관련 질환 및 장애는 예시적으로 염증성 질환, 디스크 압박, 암 및 부종이 될 수 있고, 부종은 예를 들어 장기 이식, 뇌졸중, 뇌외상 또는 기타 부상으로 인해 유발된 것일 수 있다.
동물 모델에는 마우스, 랫트, 토끼, 개, 기니피그 및 사이노몰거스 원숭이 또는 레서스 원숭이와 같은 비-인간 영장류 모델이 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예에서, 누드마우스나 SCID 마우스와 같은 면역결핍 마우스에 히알루로난 관련 암으로부터 얻은 종양 세포를 이식하여 암에 대한 동물 모델을 확립할 수 있다. 히알루로난 관련 암 세포주는 예시적으로 PC3 전립선암 세포, BxPC-3 췌장 선암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, MCF-7 유방암 세포, BT474 유방암 세포, Tramp C2 전립선암 세포 및 Mat-LyLu 전립선암 세포, 및 히알루로난과 관련된 것으로 본원에서 기술된, 예컨대 히알루로난 수준가 증가되어 있는 기타 세포주가 될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 항-히알루로난제는 히알루로난 수준 또는 함량 등을 측정함으로써 항-히알루로난 활성에 코르티코스테로이드가 미치는 영향을 평가하기 위해서 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드와 함께 또는 코르티코스테로이드 없이 투여될 수 있다. 히알루로난 함량은 히알루로난에 대해 종양 조직 시료를 염색함으로써 또는 혈장 내 가용성 히알루로난 수준을 측정함으로써, 측정될 수 있다. 항-히알루로난 활성의 기타 측정으로는 종양 부피, 구상 부위(halo)의 형성 또는 크기, 간질액압, 물 함량 및/또는 혈관 부피의 평가를 포함한다. 상기 언급된 분석법은 실시예 9에 기술되어 있다.
다른 실시예에서, 비글견과 같은 개에 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드 존재 또는 부재하에서 항-히알루로난 제제를 처치할 수 있다. 피부 또는 골격근 조직과 같은 조직을 생검하고 히알루로난에 대해 염색하고 시각적으로 평가한다. 항-히알루로난 제제를 단독으로 처치한 동물의 조직과 항-히알루로난제와 코르티코스테로이드를 함께 처치한 동물의 조직을 비교하여 코르티코스테로이드가 항-히알루로난 활성에 미치는 효과를 측정하였다. 이러한 분석법에 대해서는 실시예 8에 기술하였다.
c. 인간에서의 분석법
항-히알루로난제-매개된 유해 효과를 개선하는 코르티코스테로이드의 능력의 평가가 수행된, 상기 섹션 G1에 기술된 바와 같은 임상 시험은 코르티코스테로이드 존재하에서 항-히알루로난제의 활성을 분석하기 위하여 동시에 사용된다. 예를 들어, 코르티코스테로이드와 함께 또는 코르티코스테로이드 없이 항-히알루로난 제제를 처리한 고형 종양이 있는 환자에서 항-히알루로난 활성을 측정하기 위한 분석법은, 코르티코스테로이드 투여량을 고정하고 항-히알루로난제의 투여량을 점점 증가시키거나, 항-히알루로난제의 양을 고정하고 코르티코스테로이드의 양을 점점 줄이는 형태로, 수행될 수 있다. 이러한 분석법은 종양 생검이 처치 전, 처치 중 및 처치 후에 채취될 수 있는 종양 조직 생검 분석법을 포함할 수 있다. 투여된 항-히알루로난제의 활성을 평가하기 위해서 종양에서의 히알루로난 수준을 측정하도록 조직을 염색한다. 처리 전, 처리 중 및 처리 후 생검된 염색된 종양 조직은 코르티코스테로이드 존재시의 항-히알루로난 활성을 평가하기 위해 비교될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 환자의 처리 기간에 걸쳐 서로 다른 시점에서 혈액과 뇨를 채취할 수 있고 히알루로난 이화물을 분석할 수 있다. 이화물의 존재는 히알루로난 분해의 지표이고 따라서 히알루로니다제 활성의 척도이다. 혈장 효소는 또한 투여 후에 시간에 걸쳐 평가될 수 있고 측정될 수 있다. 실시예들은 이들 분석법들을 예시한다.
항-히알루로난 활성을 평가하기 위한 추가적인 방법으로는 조직 내 물에서의 확산을 평가하는 분석법을 포함한다. 본원의 다른 부분에서 기술된 바와 같이, 일반적으로 히알루로난을 축적하는 조직들은 물의 부수적인 축적(concomitant accumulation)으로 인해 정상 조직 보다 더 높은 간질액압을 가진다. 따라서, 종양과 같은 HA를 축적하는 조직은 고간질액압이 가지며, 이는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, ADC MRI 또는 DCE MRI와 같은 확산 MRI가 사용될 수 있다. 물의 확산은 이러한 과정을 통해 평가될 수 있으며, 고형 종양과 같은 히알루로난 풍부 조직의 존재와 직접 관련되어 있다(예컨대 Chenevert et al. (1997) Clinical Cancer Research, 3:1457-1466 참조). 예를 들어, 히알루로난을 축적하는 종양은 관류가 증가하기 때문에 ADC MRI 또는 DCE MRI에서 눈에 띄는 증가를 보인다. 그러한 분석법은 코르티코스테로이드와 함께 또는 코르티코스테로이드 없이 항-히알루로난제의 존재 또는 부재하에서 수행될 수 있고, 결과를 비교할 수 있다. 확산을 측정하는 방법은 그러한 치료에 후에 세포 변화를 평가하기 위한 유용한 수단이다.
d. 약동학
약동학 연구는, 변형된 히알루로니다제와 같은, 변형된 히알루로난 분해 효소의 약동학적 성질에 대한 코르티코스테로이드의 공동 투여의 효과를 평가하기 위하여, 동물 모델을 사용하여 수행될 수 있거나 환자를 사용하여 임상 연구 동안에 수행될 수 있다. 동물 모델에는 마우스, 랫트, 토끼, 개, 기니피그 및 비인간 영장류 모델, 예컨대 사이노몰거스 원숭이 또는 레서스 원숭이가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 몇몇 예에서, 약동학 연구는 건강한 동물을 사용하여 수행된다. 다른 예에서, 상기 연구는 히알루로난에 의한 치료요법이 고려되는 질환의 동물 모델, 예컨대 임의의 히알루로난-관련 질환 또는 장애를 갖는 동물 모델을 사용하여 수행된다.
코르티코스테로이드 존재하에서, 변형된 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제의 약동학적 특성은 투여 후 최대 (피크) 농도 (Cmax), 피크 시간 (즉, 최대 농도가 발생한 시간; Tmax), 최소 농도 (즉, 용량 사이의 최소 농도; Cmin), 소실 반감기(T1/2) 및 곡선하면적 (즉, 시간 대 농도를 플롯팅하여 생성된 곡선하면적; AUC)과 같은 파라미터를 측정하여 평가될 수 있다. 변형된 히알루로니다제가 피하로 투여되는 경우에, 히알루로니다제의 절대 생체이용율은 피하 전달 후 히알루로니다제의 곡선하면적 (AUCsc)을 정맥내 전달 후 히알루로니다제의 AUC (AUCiv)와 비교하여 결정된다. 절대 생체이용율(F)은 하기 식을 이용하여 계산될 수 있다: F = ([AUC]sc × 용량sc) / ([AUC]iv × 용량iv).
투여량의 범위 및 투여의 서로 다른 투여 빈도는, 투여에 있어서 코르티코스테로이드, 예컨대 항-히알루로난제(예를 들어, PEG화 rHuPH20)의 농도를 증가시키거나 감소시키는 효과를 평가하기 위하여, 약동학적 연구에 있어서, 투여될 수 있다. 항-히알루로난제의 약동학 특성, 예컨대 생체이용율은 또한 코르티코스테로이드의 공동투여와 함께 또는 공동투여 없이 평가될 수 있다. 예를 들어, 비글견과 같은 개에게 하나 이상의 투여 경로를 사용하여 PEG화 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난 제제를 단독 또는 코르티코스테로이드와 함께 투여할 수 있다. 이러한 연구는 약동학적 특성에 있어서 항-히알루로난제과 코르티코스테로이드의 공통 투여의 효과를 평가하기 위해 수행될 수 있다. 추가적으로, 그 제제의 약동학적 및 약력학적 특성에 대한 코르티코스테로이드 존재 또는 부재하에서, 다른 제제, 예컨대 화학치료제와 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제의 공동투여의 효과가 또한 상기 언급된 바와 같은, 동물 모델 및/또는 인간 대상, 예컨대 임상 시험의 설정을 이용하는 in vivo에서 또한 평가될 수 있다.
H. 히알루로난 관련 상태, 질환 및 장애를 치료하는 데 있어 항- 히알루로난제의 용도
PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제는 단독 또는 치료제와 조합하여 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 특히, PEGPH20과 같은 변형된 히알루로난 분해 효소는 단독 또는 화학요법 약물들과 조합으로 항-종양 활성을 가진다(예컨대 미국 공개번호 US20100003238호 및 국제 공개번호 WO2009128917호 참조).
본원에서 밝혀진 바와 같이, 항-종양 활성은 혈장 내의 히알루로니다제 효소의 검출가능한 수준을 달성하지 못하거나 유지되지 않는 이전에 고려되었던 것보다 훨씬 더 낮은 투여량으로 관찰된다. 그러므로, 근골격계 부작용과 같은 유해 부작용의 정도는, 더 높은 투여량의 효소만큼 심각하지는 않다. 이러한 더 낮은 투여량에서, 효소는 종양 관련된 히알루로난(HA)에 있어서의 감소, 혈장 히알루로난의 상승, 및 종양 부피 및 종양 발생율(incidence)에 있어서의 유리한 변화와 관련된 약동학적 및 약력학적 성질을 나타낸다.
그러므로, 본원에서는 중합체-변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 중합체-변형된 히알루로니다제, 예를 들어 PH20(예를 들어 PEGPH20)를 환자에게 예를 들어, 환자에게 예를 들어, 20 ㎍/kg 미만, 예를 들어 약 0.01 ㎍/kg 에서 15 ㎍/kg, 0.05 ㎍/kg 에서 10 ㎍/kg , 0.75 ㎍/kg 에서 7.5 ㎍/kg 또는 1.0 ㎍/kg 에서 3.0 ㎍/kg, 예컨대 약 0.01 ㎍/kg (대상의), 0.02 ㎍/kg, 0.03 ㎍/kg, 0.04 ㎍/kg, 0.05 ㎍/kg, 1.0 ㎍/kg, 1.5 ㎍/kg, 2.0 ㎍/kg, 2.5 ㎍/kg, 3.0 ㎍/kg, 3.5 ㎍/kg, 4.0 ㎍/kg, 4.5 ㎍/kg, 5.0 ㎍/kg, 5.5 ㎍/kg, 6.0 ㎍/kg, 7.0 ㎍/kg, 7.5 ㎍/kg, 8.0 ㎍/kg, 9.0 ㎍/kg, 10.0 ㎍/kg, 12.5 ㎍/kg 또는 15 ㎍/kg의 양으로 투여됨으로써, 히알루로난 관련된 질환 또는 상태, 예컨대 암을 치료하기 위한 방법 또는 용도를 제공한다. 예를 들어, 본원에서 제공된, 중합체-변형된 히알루로니다제, 예컨대 PEG화 히알루로니다제(예를 들어 PH20)는 약 1 유닛/kg 에서 1000 유닛/kg, 1 유닛/kg 에서 500 유닛/kg 또는 10 유닛/kg 에서 50 유닛/kg으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 변형된 히알루로니다제의 특이적 활성은 약 20,000 U/mg 에서 60,000 U/mg, 일반적으로 약 35,000 U/mg, 200 유닛 에서 50,000 (U)으로 투여되며, 예컨대 200 U, 300 U; 400 U; 500 U; 600 U; 700 U; 800 U; 900 U; 1,000 U; 1250 U; 1500 U; 2000 U; 3000 U; 4000 U; 5,000 U; 6,000 U; 7,000 U; 8,000 U; 9,000 U; 10,000 U; 20,000 U; 30,000 U; 40,000 U; 또는 50,000 U으로 투여된다. 전형적으로, 주사 또는 주입의 부피는 약 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL 또는 50 mL와 같은, 50 mL 미만이다.
암과 같은 히알루로난 관련 질환 또는 상태의 치료를 위해서, 중합체-변형된 히알루로난 분해 효소는 전신적으로, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 임의의 다른 전신적 경로로 투여될 수 있다. 특정한 실시예에서, 더 낮은 투여량이 국소적으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 PEG화 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PEG화 히알루로니다제(예를 들어 PH20)의 국소 투여는 종양내 투여, 동맥 주사(예컨대 간동맥), 복강내 투여, 방광내 투여 및 더 낮은 절대적 투여량으로 국소 작용을 증가시킬 수 있는 암 치료에 이용된 다른 경로를 포함한다.
히알루로난 관련 질환 또는 상태, 예를 들어 암을 치료하기 위한 제공된 방법에서, 효소는 단독으로 또는 치료제와 조합으로 투여될 수 있다. 또한, 본원의 다른 방법에서 제공되는 방법과 같이, 코르티코스테로이드는 히알루로난 분해 효소와 관련된 임의의 부작용 또는 유해 사례를 개선하기 위해 투여될 수 있다.
히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 본원의 방법에서, 상기 제시된 중합체-변형된 히알루로난 분해 효소의 양은 투여 주기에 따라 주기적으로 투여된다. 예를 들어, 중합체-변형된 히알루로난 분해 효소의 주기적 투여는 주 2회, 주 1회 또는 매 21일에 1회 투여될 수 있다. 투여 주기의 시간 길이는 경험적으로 결정될 수 있으며, 치료될 질환, 질환의 심각성, 특정한 환자, 및 치료하는 의사의 숙련 수준 내에서 다른 고려할 사항에 의존된다. 변형된 히알루로니다제 효소을 이용한 처리의 시간의 길이는 1주, 2주, 1개월, 수 개월, 1년, 또는 수 년 또는 그 이상이 될 것이다. 예를 들어, 변형된 히알루로니다제 효소는 1년 이상의 기간 동안 주 2회 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 투여의 다음 주기에 있어서 투여의 주기적 빈도는 감소될 것이다. 예를 들어, 변형된 히알루로니다제 효소는 4주 동안은 주 2회 투여로 투여될 수 있으며, 그리고 나서 1년 이상의 주기에 걸처 주 1회 투여될 수 있다. 질환의 증상이 중단된 치료의 부재하에서도 유지된다면, 치료는 추가적인 시간의 길이동안 계속될 수 있고/있거나 투여 빈도의 기간이 증가될 수 있다. 부작용이 관찰된다면, 코르티코스테로이드 제제를 본원에 기재된 바와 같이 투약 요법에 포함시킬 수 있다.
또한, 효소에 대한 노출로부터 쉬는 기간을 제공하도록 휴약기간을 추가하도록 투여 주기를 조정할 수 있다. 휴약기간의 길이가 미리 결정될 수 있거나 관찰된 부작용에 환자가 어떻게 반응하는지 또는 관찰된 부작용에 의존하여 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 치료는 1주, 2주, 1개월 또는 수 개월 동안 중단될 수 있다. 일반적으로, 휴약기간은 환자의 투약 요법의 주기에 내재된다. 예를 들어, 예시적인 투약 요법은 28일 주기의 치료이며, 변형된 효소를 처음 3주동안 주 2회 투여하고, 다음으로 1주 동안 투약을 하지 않는다. 그러므로, 예를 들어, 28일의 투여 주기에 걸쳐 환자는 변형된 효소를 1, 4, 8, 11, 15, 및 18 째 날에 투여하고, 1주간 휴약기간을 가질 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 투여 주기는 임의로 원하는 길이의 시간일 수 있다. 그러므로, 28일의 주기의 투여는 임의의 길이의 시간으로 반복될 수 있다. 환자 및 치료될 질환에 특이적인 개인적인 고려사항에 의존하는 환자의 요구사항을 만족하는 투여 주기 및 투약 요법을 조정하는 것은 치료의사의 숙련 범위 내의 것이다.
특정 실시예에서, PEG화 히알루로니다제(예컨대 PH20)와 같은 중합체-변형된 히알루로난 분해 효소, 본원에서 제공되는, 예를 들어 PEGPH20의 단일 투여량 투여는, 약 0.5 ㎍ 에서 1450 ㎍ 또는 150 유닛 (U) 에서 45,000 유닛 범위 내의 양이다. 예를 들어, 단일 투여량 투여는 0.75 ㎍ 에서 1125 ㎍; 3.75 ㎍ 에서 750 ㎍ ; 56 ㎍ 에서 565 ㎍; 또는 75 ㎍ 에서 225 ㎍ 범위 내의 양이다. 다른 실시예에서, 단일 투여량 투여는 약 24 유닛 (U) 에서 36,000 U; 120 U 에서 24,000 U; 1500 U 에서 18,000 U; 또는 2400 U 에서 7200 U 사이의 양이다. 예를 들어, 본원에서는 대상에 적어도 4주의 주기동안 주당 적어도 1회의 빈도로 약 0.5 ㎍ 에서 1450 ㎍ 또는 150 유닛 (U) 에서 45,000 유닛 범위 내의 양의 유닛 투여량으로 투여되는 히알루로난 분해 효소의 용도를 제공한다. 빈도는 적어도 주 2회 또는 주 1회가 될 수 있다. 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하는 데 있어서 투여 주기는 환자의 특정한 필요에 따라서 수 회 반복될 수 있다.
본원에서 제공되는 일부 실시예에서, 본원의 방법을 사용해서, 코르티코스테로이드는 히알루로난 관련 질환 또는 상태의 치료에 있어서의, 예컨대 진전된 고형 종양이 있는 환자의 치료에 있어서의 치료 또는 용도를 위하여, 항-히알루로난제와 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 화학요법제 또는 기타 항암제 역시 치료에 사용될 수 있다. 하기 기재된 치료적 용도는 예시적이며 본원에 기술된 방법의 적용을 제한하지 않는다. 하기 기술에서, 코르티코스테로이드, 예를 들어 덱사메타손과 같은 글루코코르티코이드는 근골격계 부작용 또는 기타 부작용을 감소 또는 개선하기 위해 항-히알루로난제와 조합으로 사용될 수 있다. 투여량 및 투여 경로는 상기 섹션 F에 기술되어 있다.
본원의 제공된 방법은 고간질액압, 암, 특히 히알루로난 풍부 암, 부종, 디스크 압박, 염증성 질환, 및 히알루로난과 관련된 다른 히알루로난 관련 질환과 관련된 것을 포함하나 제한되지 않는 항-히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위하여 항-히알루로난 분해 효소의 용도를 위한 방법을 포함한다. 히알루로난 관련 상태 및 질환은 질환 또는 상태의 원인, 결과, 또는 그 외 관찰된 사항으로서 히알루로난 수준이 증가되어 있는 질환 또는 상태를 말한다. 일부 케이스에서, 히알루로난 관련 질환 및 상태는 간질액압 증가, 혈관 부피 감소, 및/또는 종양과 같은 조직내 물 함량 증가와 관련이 있다. 본원에서 제공되는 효소, 조성물 및 방법을 이용하여 치료될 수 있는 예시적인 히알루로난 관련 질환 및 상태는, 히알루로난 풍부 암, 예를 들어 말기암, 전이성 암, 미분화 암, 난소암, 원암종(ISC), 편평세포암, 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 결장암 및 기타 암과 같은 고형 종양을 포함하는 종양을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
증가된 히알루로난 수준은 염증을 포함하는 사실상 모든 질환 과정을 포함하는 다수의 다수의 염증성 질환과 관련이 있다. 그러한 질환 및 상태는 류머티스성 관절염, 치주염, 경피증, 건선, 동맥경화, 만성 상처, 크론병, 궤양성 대장염 및 염증성 장질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 증가된 수준에 대한 기전은 IL-1β와 같은 염증성 매개인자에 의한 HA 합성효소 유전자의 조절에 의한 것이다(Ducale et al. (2005) Am. J. Physiol . Gatrointest . Liver Physiol., 289:G462-G470). 또한, 히알루로난 자체가 다양한 백혈구들과 상호 작용을 하고 다양한 백혈구들을 활성화할 수 있어서, 염증을 악화시킨다(예컨대 Ducale et al. 2005; Jiang et al. (2007) Annu . Rev. Cell. Dev . Biol., 23:435-61 참조). 그러므로, 항-히알루로난제로 치료될 수 있는 기타 히알루로난 관련 질환 및 상태는 염증성 질환 및 상태를 포함하는데, 이러한 질환 및 상태는 류머티스성 관절염, 치주염, 경피증, 건선, 동맥경화, 만성 상처, 크론병, 궤양성 대장염 및 염증성 장질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한 예시적인 히알루로난 관련 질환 및 상태는 증가된 간질액압과 관련된 질환, 예컨대 디스크 압박 및 부종, 예를 들어 장기 이식, 뇌졸중, 뇌외상 또는 기타 부상에 의해 유발된 부종이다. 예시적인 히알루로난 관련 질환 및 상태는 간질액압 증가, 혈관 부피 감소, 및/또는 암, 디스크 압박 및 부종을 포함한 조직내 물 함량 증가와 관련된 질환 및 상태가 있다. 일 실시예에서, 히알루로난 관련 상태, 질환 또는 장애의 치료는 하나 이상의 증가된 간질액압(IFP), 감소된 혈관 부피, 및 조직내 증가된 물 함량 증가에 대한 개선, 감소, 또는 다른 유익한 효과를 포함한다.
전형적으로, 히알루로난 관련 질환 및 상태는, 대조군, 예컨대 다른 조직, 세포 또는 체액과 비교했을 때 조직, 세포 또는 체액(예컨대 종양 조직 또는 종양 관련 조직, 혈액, 또는 간질 공간) 내의 히알루로난 발현 증가와 관련이 있다. 상승된 히알루로난 발현은 정상 조직, 세포 또는 체액, 예를 들어 시험 대상인 시료와 유사한 조직, 세포 또는 체액이지만 정상인 대상(즉, 질환 또는 상태가 없거나 시험되는 대상에게 있는 종류의 질환 또는 상태가 없는 대상)과 같은 다른 대상, 예를 들어 히알루로난 관련 질환 또는 상태가 없는 대상으로부터 분리된 시료에 비해 증가될 수 있다. 상승된 히알루로난 발현은 비슷한 질환 또는 상태를 가지고 있으나 질환이 심각하지 않고/또는 히알루로난과 관련이 없고 또는 상대적으로 적은 양의 히알루로난을 발현하고 따라서 더 낮은 정도로 히알루로난과 관련이 있는 다른 대상의 유사한 조직과 비교했을 때 증가될 수 있다. 예를 들어, 시험되는 대상은 히알루로난 관련 암이 있을 수 있는데, 여기서 덜 심한 암, 예컨대 초기암, 분화된 암 또는 다른 유형의 암을 가진 대상과 비교할 때 조직, 세포, 체액 내 HA 양이 상대적으로 상승되어 있는 대상이다. 또 다른 예에서, 세포, 조직 또는 체액은, 예를 들어 상대적으로 낮은 수준의 HA 를 발현하는 것으로 공지된 종양 세포주, 예컨대 낮은 수준의 HA 를 발현하는 본원에 기재된 예시 종양 세포주, 예를 들어 HCT 116 세포주, HT29 세포주, NCI H460 세포주, DU145 세포주, Capan-1 세포주, 및 상기 세포주를 이용해 생성된 종양 모델 유래의 종양과 같은, 알고 있는 양 또는 상대적인 양의 HA 를 가진 대조군 시료, 예컨대 체액, 조직, 추출물 (예를 들어, 세포 또는 핵 추출물), 핵산 또는 펩티드 제제, 세포주, 생검, 표준 및 기타 시료에 비해 상승된 수준의 히알루로난을 포함한다(예컨대 실시예 17A 참조).
일반적으로, 히알루로난 관련 질환 또는 상태는 예를 들어, 병적 조직, 예를 들어 종양에 있어서의 증가된 HA 발현 증가과 관련이 있다. 일 실시예에서, HALO (히알루로난을 포함하는 프로테오글리칸이 풍부한 세포주위 기질 영역)는 대상의 조직, 예를 들어 병든 조직에서 형성된다. 또 다른 실시예에서, HALO 의 존재성은 대상체의 조직, 예를 들어 병든 조직 유래의 in vitro 세포 배양에서 검출된다.
일 실시예에서, 히알루로난 관련 상태, 질환 또는 장애는 간질액압 증가, 혈관 부피 감소 또는 조직내 물 함량 증가와 관련이 있다. 한 실시예에서, 예를 들어, 히알루로난 관련 상태, 질환 또는 장애의 치료는 하나 이상의 증가된 간질액압(IFP), 감소된 혈관 부피, 및 조직내 증가된 물 함량 증가에 대한 개선, 감소, 또는 다른 유익한 효과를 포함한다. 치료적 용도는 암치료, 종양 부피 감소, 화학요법 또는 다른 암 치료에 대한 감수성 증가, 암 치료제 또는 다른 치료제의 전달 또는 생물학적 이용가능성 향상, 간질액압 감소, 혈관 부피 증가, 대상의 조직 내 물 함량 감소, 및 기타 치료를 포함하는, 히알루로난 관련 질환 또는 상태에 대한 치료를 포함한다.
1. 치료 대상의 선택 및 치료 효과의 평가
이 방법들은 항-히알루로난제로 치료하기 위한 대상을 선택하기 위한 단계 및 치료 효과, 예컨대 치료의 효능을 평가하기 위한 단계를 포함한다. 그러한 방법들은 히알루로난 관련 질환 마커를 검출하는 것을 포함하는데, 상기 히알루로난 관련 질환 마커는 대상이 히알루로난 관련 질환을 갖는지, 대상이 항-히알루로난제의 치료에 반응할 것 같은지, 및/또는 대상으로부터의 시료, 예컨대 조직, 세포, 체액이 상승된 히알루로난 발현을 포함하는 지에 대한 임의의 지표들을 포함한다. 마커의 검출을 위한 예시적인 분석법들은 하기와 같이 기술되며, 대상으로부터의 시료 내의 HA 발현 및/또는 상대적 HA 발현을 측정하기 위한 분석법, 대상으로부터의 시료에 있어서 항-히알루로난제의 효과를 분석하기 위한 분석법, 및 특정한 히알루로난 관련 질환/상태와 관련된 일반적인 판독(readouts), 예컨대 낮은 히알루로니다제 발현 또는 활성, 높은 간질액압, 혈관 부피 및 물 함량을 측정하기 위한 분석법을 포함한다. 일반적으로, 대상의 시료에서 단백질 또는 핵산을 검출 또는 in vitro에서 세포/조직에서 치료 효과를 평가하기 위한 임의의 분석법이 사용될 수 있다.
본원에서 제공되는 방법들에 있어서 치료를 위해 선택된 대상은, 질환 또는 상태를 갖고 있지 않은 대상 또는 HA 발현이 상승되거나 비정상적이거나 축적되거나 하지 않는 정상 조직 또는 시료와 비교할 때, 상승되거나 비정상적이거나 축적된 히알루로난을 갖는 대상을 포함한다. 대상으로부터 임의의 시료 또는 조직은 시험될 수 있거나 정상 시료 또는 조직과 비교될 수 있다. 히알루로난 수준은 조직(예컨대 생검물), 종양, 세포 또는 혈액, 혈청, 뇨 또는 다른 체액으로부터 임의의 원천으로부터 측정될 수 있다.예를 들어, 본원의 다른 부분에 기술된 바와 같이, 고형 종양에서의 HA 축적 프로파일(profiles of HA deposition)은 일반적으로 세포주위 또는 기질로 분류된다. 증가된 혈장 수준의 HA는 빌름즈 종양(Wilm's tumor), 중피종 및 간 전이가 있는 환자에서 가장 현저하게 관찰되었다. 따라서, 질환 또는 상태에 의존하여, 서로 다른 시료는 히알루로난 수준에 대해 측정될 수 있다. 시료의 선택은 당업자의 수준 내의 일이다.
히알루로난 수준를 측정하기 위해 사용되는 분석법은 질환 또는 상태과의 상관관계이고 특정한 질환 또는 상태에 따라 선택될 수 있다. 당업자는 히알루로난을 검출하기 위한 방법들에 익숙한데, 여기에는 하기 섹션 (i)에 기술된 바와 같이 면역조직화학적 방법, ELISA 방법이 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에서, 예를 들어, 대상이 항-히알루로난제로 치료될 수 있을 것인 히알루로난 관련 상태 또는 질환을 있는지 여부를 결정하기 위해, 마커를 검출하기 위한 단계가 대상에 처리되기 전에 수행된다. 이 실시예에서, 마커가 검출되면(예를 들어 환자로부터 세포, 조직 또는 체액이 상승된 히알루로난 발현을 함유하고 있는지 또는 히알루로난 분해 효소에 반응하는지 여부가 결정된다면), 치료 단계가 수행될 수 있는데, 여기서 히알루로난 분해 효소가 대상에 투여된다. 일 실시예에서, 마커가 검출되지 않으면(예를 들어 환자로부터의 세포, 조직 또는 체액이 정상 또는 비-상승된 히알루로난 발현을 함유하고 있는지 또는 히알루로난 분해 효소에 반응하지 않는지 여부가 결정된다면), 다른 치료 옵션이 선택될 수 있다.
다른 실시예에 있어서, 마커를 검출하기 위한 단계는, 예를 들어, 항-히알루로난제를 이용한 처리가 질환 또는 상태의 치료에 대한 효과를 가지는지 여부를 결정하기 위해, 대상을 치료한 후에, 또는 대상의 치료 과정 중에 수행된다(예를 들어 (공동 투여되는 약물과 함께 또는 공동 투여되는 약물 없이) 항-히알루로난제(예를 들어 가용성 변형된 히알루로니다제)을 처리). 그러한 실시예에서, 마커가 검출되지 않거나 치료 전 양/수준과, 또는 다른 시료와 비교할 때 감소된 양 또는 수준으로 검출될 때, 치료를 계속하고, 다른 차례(주기)의 치료가 수행되고, 또는 다른 치료, 예컨대 조합 치료가 개시된다. 그러한 다른 실시예에서, 마커가 치료 전 또는 다른 시료와 동일한 수준으로 검출된다면, 다른 치료 옵션을 선택할 수 있다.
a. 히알루로난-관련 질환 마커를 검출하기 위한 분석법
히알루로난-관련 질환 및 상태의 마커를 검출하기 위한 분석법은 대상체의 조직, 세포 및/또는 체액, 예를 들어 종양 내의 히알루로난, HA 신타제 발현 및/또는 히알루로니다제 발현의 양 (예를 들어, 상대적 양)을 측정하기 위한 분석법을 포함한다. 이러한 분석법 중에서 특히, HA 발현, 히알루로난 신타제 2 (HAS2) 발현, HALO (히알루로난을 포함하는 프로테오글리칸이 풍부한 세포주위 매트릭스 영역)의 존재, 및 히알루로난-분해 효소, 예컨대 히알루로니다제의 존재 (예를 들어, 대상으로부터의 시료 내)를 검출할 수 있는 분석법이 포함된다.
단백질 및 핵산 수준을 검출하기 위한 분석법은 당분야에 익히 공지되어 있고, 본원의 방법에서 히알루로난, 히알루로난 신타제 또는 다른 단백질 및/또는 핵산 발현을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 분석법에는 ELISA, SDS-PAGE, 웨스턴 블럿, PCR, RT-PCR, 면역조직화학, 조직학 및 유동세포계측법이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 대상으로부터의 시료, 예컨대 조직 시료 (예를 들어, 환자 또는 동물 모델로부터의 종양의 생검, 기질 시료), 유체 (예를 들어, 혈액, 뇨, 혈장, 타액 또는 다른 시료), 세포 또는 세포의 시료, 또는 추출물, 또는 기타 시료는 항-HA 항체로 염색될 수 있으며, 예를 들어 조직 또는 시료 내의 히알루로난의 존재 및 정도를 결정하기 위한 고정된 또는 동결된 조직 절편의 조직학적 염색, 예컨대 면역조직화학 (IHC)(예를 들어, 실시예 8.B.2. 참조), 또는 면역형광 세포 염색, 풀-다운(pull-down) 분석법 및 유동세포계측법을 사용하여, 항-HA 항체로 염색될 수 있다. 다른 예에서, 시료, 예를 들어 생검은 HA mRNA의 양을 평가하기 위해 RT-PCR에 의해 분석될 수 있다.
암 내의 히알루로난-발현을 검출하기 위한 공지된 방법에는 방광암을 갖는 대상의 뇨 또는 방광 조직 추출물 내의 HA 수준을 측정하기 위한, 문헌 [Lokeshwar et al., Cancer Res. 57: 773-777 (1997)]에 기재된 ELISA-유사 분석법이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 분석을 위해, 뇨 또는 추출물을 마이크로웰 플레이트 (표준으로서 사용된 제대 HA가 또한 코팅됨) 상에 코팅한 후, 본원에 기재된 바와 같은 표지된 (예를 들어, 비오티닐화된) HA 결합 단백질과 함께 배양하고 (예를 들어, 16시간, 실온), 세척하고, 웰에 결합된 HA-결합 단백질을 아비딘-바이오틴 검출제 기질을 사용하여 정량한다. 이러한 방법은 당분야에 익히 공지되어 있다. 한 예에서, HA-관련 방광암을 갖는 대상으로부터의 뇨는 정상적인 환자 (건강한 대상 또는 다른 위-비뇨기 질환 또는 상태를 갖는 대상)로부터의 뇨/추출물과 비교하여 2 내지 9배 상승된 HA 수준을 함유하였으며; 그러므로, 마커는 뇨 내의 HA 수준이 정상적인 대상과 비교하여 상승된 경우, 예를 들어 정상적인 대상체와 비교하여 2배 또는 약 2배 내지 9배 또는 약 9배, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9배 또는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9배 상승으로 상승된 경우 검출될 것이다.
추가 예에서, 종양 세포 내의 in vitro 히알루로난 발현 및 생성은 임의의 한 상기 기재된 방법 중 하나를 사용하여 평가될 수 있다. 유사하게, 세포에 의한 in vitro, 생체외 또는 in vivo 히알루로난 신타제 2 (HAS2) 생성 및/또는 발현은 또한 예를 들어, ELISA, SDS-PAGE, 웨스턴 블럿, PCR, RT-PCR, 면역조직화학, 조직학 또는 유동세포 계측법에 의해 분석법될 수 있다.
다른 예에서, 대상으로부터의 시료, 예컨대 혈액 또는 혈장 내의 히알루로니다제 활성의 양은 예를 들어, 탁도 분석법에 의해 결정된다.
다른 예에서, 환자로부터의 세포 또는 다른 조직, 예를 들어 종양 세포를 분리하고, 예를 들어 치료에 반응한 세포 또는 조직, 예컨대 종양 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 측정하기 위한 클론원성 분석법 또는 임의의 다른 분석법을 사용하여 세포 또는 조직이 in vitro 히알루로난 분해 효소에 의한 처리에 대해 반응성인가를 결정하기 위한 연구에서 사용한다. 한 예에서, 대상으로부터의 암 세포를 표면, 예컨대 세포외 매트릭스 또는 단백질 혼합물, 예컨대 상표명 마트리겔(Matrigel)(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))로 시판되는 혼합물 상에 시딩함으로써 사용한다. 이 예에서, 히알루로난-관련 마커는 히알루로난 분해 효소의 투여에 대한 상기 세포 또는 조직의 민감성이다. 이 예에서, 세포의 임의의 특성, 예컨대 증식, 성장 또는 생존이 히알루로난 분해 효소의 첨가에 의해 억제되거나 차단되는 경우, 대상은 히알루로난 분해 효소 함유 조성물에 의한 치료에 잘 반응하는 것으로 판단된다.
히알루로난 발현 수준를 결정하기 위한 분석법 뿐 아니라, 치료 대상을 선택하기 위해서, 및/또는 치료 효능 및/또는 효과 지속 기간을 평가하기 위해서 다른 분석법이 사용될 수 있다. 간질액 압력 (IFP)은 적절한 프로브 또는 기구를 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 암 조직 또는 관심있는 다른 조직 내의 IFP를 측정하기 위해 변환기-장착된 카테터가 사용될 수 있다. 카테터를 수술용 바늘의 내부 구멍을 통해 통과시킨 다음, 종양의 중심에 삽입된다. 카테터를 제자리에서 유지시키면서 바늘을 회수한다. 그 후, IFP (mmHg)를 적절한 데이터 획득 장치 (예를 들어, 문헌 [Ozerdem et al. (2005) Microvasc. Res. 70:116-120] 참조)를 사용하여 측정할 수 있다. IFP를 측정하기 위한 다른 방법에는 바늘-중심지(wick-in-needle) 방법 (문헌 [Fadnes et al (1977) Microvasc. Res. 14:27-36])이 포함된다.
혈관 부피는 예를 들어, 초음파 영상화에 의해 측정될 수 있다. 이 방법은 검출되는 강한 초음파 반사율을 제공하는 과다에코 마이크로버블을 사용한다. 마이크로버블은 예컨대 정맥내로 대상 또는 동물 모델에 주사되는 경우 그의 크기로 인해 혈관 공간 내에 포획된다. 조직 물 함량, 예컨대 종양 조직 물 함량을 평가하기 위한 분석법은 또한 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 종양으로부터의 시료를 수확하고, 블럿팅하고, 중량측정하고, 동결건조 전에 순간 동결할 수 있다. 그 후, 물 중량을 조직 습윤 중량 대 건조 (즉, 동결건조된) 중량 비율로서 보고한다.
세포주위 매트릭스 (HALO)를 형성하는 종양 세포의 능력은 입자 배제 분석법 (예를 들어, 실시예 6 참조)을 사용하여 in vitro에서 평가될 수 있다. 작은 입자 (포르말린-고정된 적혈구)를 예를 들어, 큰 응집 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸인 어그리칸(aggrecan)의 존재하에 종양 세포의 저밀도 배양물에 첨가할 수 있다. 입자가 침강한 후, 배양물을 400x 확대로 관찰하여, 임의의 HALO가 종양 세포에 의해 형성되었는가를 결정할 수 있다. 이는 입자가 배제된 세포 주변의 구역으로서 시각화될 수 있다.
b. 대조 시료에 대해 상대적인 히알루로난-관련 마커의 검출
임의의 검출 방법을 위해, 마커의 검출이 전형적으로 판독 결과가 대조 시료과 비교하여 상승되었는가 또는 감소되었는가를 결정하는 것을 포함하도록, 마커 (예를 들어, HA 발현, 히알루로난 분해 효소에 대한 반응성, HA-신타제 발현 또는 히알루로니다제 활성)를 전형적으로 대조 시료과 비교한다.
예를 들어, 대조 시료는 기타 조직, 세포 또는 체액, 예를 들어 정상 조직, 세포 또는 체액이 될 수 있다. 예를 들어, 대조 시료는 다른 조직, 세포 또는 체액, 예컨대 정상적인 조직, 세포 또는 체액, 예를 들어 시험될 시료과 유사하나 상이한 대상, 예컨대 정상적인 대상(즉, 질환 또는 상태를 갖지 않은 대상, 또는 시험될 대상체가 갖는 유형의 질환 또는 상태를 갖지 않은 대상)으로부터 분리될 수 있다.또 다른 실시예에서, 유사한 질환 또는 상태를 갖고 있으나 그 질환이 중증은 아니고/아니거나 히알루로난과 관련되어 있지 않거나 상대적으로 적은 히알루로난을 발현하는 대상의 시료가 시험될 수 있다. 예를 들어, 시험될 세포, 조직 또는 체액이 암을 갖는 대상인 경우, 이는 덜 중증인 암, 예컨대 초기 암, 분화 또는 다른 유형의 암을 갖는 대상으로부터의 조직, 세포 또는 체액과 비교될 수 있다. 다른 예에서, 대조 시료는 공지된 양 또는 상대적 양의 HA를 갖는 체액, 조직, 추출물 (예를 들어, 세포 추출물 또는 핵 추출물), 핵산 또는 펩티드 제제, 세포주, 생검, 표준 또는 다른 시료, 예컨대 상대적으로 낮은 수준의 HA를 발현하는 것으로 공지된 시료, 예를 들어 종양 세포주, 예컨대 낮은 수준의 HA를 발현하는 종양 세포주일 수 있다. 본원에서 기술하는 상대적으로 HA를 낮은 수준으로 발현하는 종양 세포주는 예시적으로 HCT 116 세포주, HT29 세포주, NCI H460 세포주, DU145 세포주, Capan-1 세포주, 및 이러한 세포주를 사용하여 생성된 종양 모델로부터의 종양이다.
HA의 특정 변화, 예를 들어 증가 또는 감소는 사용된 분석법 및 측정되는 시료의 원천에 의존한다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, ELISA에서, 단백질의 특정 파장에서의 흡광도 또는 양이 몇 배 증가 또는 감소 (예를 들어, 표준 곡선을 사용하여 결정됨)되는지는 대조군에 대해 상대적인 것으로 표시될 수 있다. PCR 분석법, 예컨대 RT-PCR에서, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 예컨대 표준을 사용하여 대조군의 발현 수준과 비교될 수 있다 (예를 들어, 몇 배(fold) 변화로서 표시됨). 예를 들어, 대상체로부터의 시료 내의 히알루로난의 양을 시험하는 경우, 마커의 검출은 대상체로부터의 시료 (예를 들어, 암성 세포, 조직 또는 유체) 내의 HA의 양이 대조 시료, 예컨대 이전 단락에 기재된 대조 시료와 비교하여 상승되었는가를 결정할 수 있다.
예를 들어, 대상으로부터의 시료의 히알루로난 양을 시험할 때, 시료(예컨대 암세포, 조직 또는 체액) 내 HA의 양이 상기 문단에 기술한 대조군 시료와 같은 대조군 시료와 비교할 때 상승되었는지를 결정하는 것이 마커의 검출이 될 수 있다. 한 예에서, 암은 조직, 세포 또는 체액 내의 HA의 양이 대조 시료와 비교하여 0.5배, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 20배 또는 그 이상, 또는 약 0.5배, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 20배 또는 그 이상으로 상승된 경우 히알루로난-풍부 암인 것으로 결정된다.
일부 실시예에서, 종양을 직접 생검하고, HA의 발현에 대해 염색할 수 있다. 다른 예에서, 특정 종양과 관련된 시료, 예컨대 혈액 또는 뇨 시료 또는 다른 체액 시료를 HA에 대해 분석할 수 있다. 분석법의 유형은 종양-유형에 의존하여 달라질 것이나, HA를 검출하기 위해 하나 초과의 분석법을 사용할 수 있는 것으로 고려된다. 특정 종양을 위한 이러한 분석법에 대한 본원의 언급은 단지 예시를 위한 것이다. 예를 들어, 방광암의 경우, 뇨 시료가 표준 ELISA 절차에 의해 히알루로난에 대해 분석될 수 있다. 본원의 목적을 위해, 정상적인 환자 대조로부터의 뇨와 비교하여 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 그 이상의 HA를 나타내는 대상(예를 들어, 문헌 [Lokeshwar et al. (2000) J. Urol., 163:348-56] 참조)이 선택될 수 있다. 다른 예에서, 종양 세포를 생검하고, 예컨대 면역조직화학에 의해 HA에 대해 염색할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Anttila et al. (2000) Cancer Research,60:150-156]; [Karvinen et al. (2003) British J of Dermatology, 148:86-94]; [Lipponen et al. (2001) Euro J Can. 37: 849-856]; [Auvinen et al. (2000) American J of Pathology, 156:529] 참조). 일반적으로, 이러한 예에서, 임의의 암-세포 관련된 HA 신호가 관찰된 경우 종양 시료 또는 종양 세포는 HA에 대해 양성이라고 고려된다. 배경 염색을 위한 음성 대조로서, 모든 세포-관련 HA를 절단하기 위해, 세포를 히알루로니다제로 예비소화시킬 수 있다. 또한, 시료를 동일한 대상체로부터의 정상적인 세포 또는 조직과 비교할 수 있다. 또한, 이러한 방법에서, 세포-관련 히알루로난의 수준을 저, 중 또는 고로 점수화할 수 있다. 예를 들어, 종양 면적의 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 그 이상이 지속된 HA 신호를 나타낸 경우, HA 발현은 고 또는 중으로 고려된다. 전형적으로, 중 내지 고 HA를 갖는 대상의 치료가 본원에서 고려된다.
2. 암 치료에서의 사용
상기 주목된 바와 같이, 히알루로난은 암과 관련된 과정에서 역할을 하고, 히알루로난 수준은 종양 공격성, 및 종양 공격성 및 불량한 예후에 대한 다양한 마커와 상관관계가 있다. 그러므로, 히알루로난 분해 효소, 및 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제를 함유하는 조성물 및 조합물에 의해 히알루로난-관련 암을 치료하는 방법이 제공된다. 암에는 히알루로난-풍부 암, 및 상승된 간질액 압력과 관련된 암이 포함된다.
히알루로난은 발달, 재생, 보수, 배 발생, 배 발달, 상처 치유, 혈관 신생, 및 종양 형성을 포함하여, 세포 이동성과 관련이 있는 과정들에서 역할을 수행한다(Toole 1991 Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay (ed.), Plenum Press, New York, 1384-1386; Bertrand et al. 1992 Int. J. Cancer 52:1-6; Knudson et al, 1993 FASEB J. 7:1233-1241). 또한, 히알루로난 수준는 종양 공격성과 상호 관련이 있고(Ozello et al. 1960 Cancer Res. 20:600-604; Takeuchi et al. 1976, Cancer Res. 36:2133-2139; Kimata et al. 1983 Cancer Res. 43:1347-1354); 히알루로난은 종양 성장, 생존, 전이 및 간질액압을 포함한, 그러나 이에 제한되지 않는 수 개의 암의 과정에 관여한다.
히알루로니다제는 종양에 주사되는 경우 직접적 항발암 효과를 갖는다. 히알루로니다제는 마우스로 이식된 종양의 성장을 방지하고 (문헌 [De Maeyer et al., (1992) Int. J. Cancer 51:657-660]), 발암물질에 노출시 종양 형성을 억제한다 (문헌 [Pawlowski et al. (1979) Int. J. Cancer 23:105-109]). 히알루로니다제는 뇌암 (신경교종)의 치료에서 단독 치료제로서 효과적이다 (제 WO198802261호). 상기 기술된 바와 같이, 다른 항-히알루로난제도 공지의 항-종양 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.
히알루로난 관련 암은 히알루로난 발현, 일반적으로 상승된 히알루로난 발현과 관련된 암이며, 이는 예를 들어 상기 기술된 바와 같이, 치료 전에 결정될 수 있다. 본원에서 제공하는 항-히알루로난 제제를 함유하는 조성물 및 방법을 이용하여 치료될 수 있는 예시적인 히알루로난 관련 질환 및 상태에는 암, 특히 히알루로난 풍부 암, 예를 들어, 상승된 간질액압과 관련된 히알루로난-풍부 암이 있다.
예를 들어, 히알루로난-풍부 암은 암 세포가 in vitro 입자 배제 분석법에서 HALO를 생성하는 암; 히알루로난의 상승된 발현을 갖는 암 (종양으로부터의 섹션의 면역염색, 예를 들어 조직학적 염색에 의해 결정됨); 상승된 HAS2 (히알루로난 합성효소 2)를 갖는 암; 히알루로니다제 (HYAL1)를 시험관내에서 생성하지 않는 암일 수 있다. 히알루로난-풍부 암은 본원에서 기술된 바와 같은 히알루로난 발현을 평가하기 위한 임의의 방법, 및 단백질/mRNA 발현을 분석하기 위한 다른 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다.
여러 히알루로난-풍부 암이 확인되었다. 몇몇 경우에, 히알루로난 발현은 불량한 예후, 예를 들어 감소된 생존율 및/또는 재발-없는 생존율, 전이, 혈관형성, 다른 조직/구역으로의 암 세포 침윤, 및 불량한 예후의 다른 표시자와 상관관계가 있다. 이러한 상관관계는 예를 들어, 히알루로난-풍부 종양, 예를 들어 난소암, SCC, ISC, 전립선암, 폐암, 예를 들어 비소세포 폐암 (NSCLC), 유방암, 결장암 및 췌장암에서 관찰되었다 (예를 들어, 문헌 [Maarit et al., Cancer Research, 60:150-155 (2000)]; [Karvinen et al., British Journal of Dermatology, 148:86-94 (2003)]; [Lipponen et al., Eur. Journal of Cancer, 849-856 (2001)]; [Pirinen et al., Int. J. Cancer: 95: 12-17 (2001)]; [Auvinen et al., American Journal of Pathology, 156(2):529-536 (2000)]; [Ropponen et al., Cancer Research, 58: 342-347 (1998)] 참조). 그러므로, 히알루로난-풍부 암은 암의 하나 이상의 증상을 치료하기 위해 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제의 투여에 의해 치료될 수 있다. 히알루로난-풍부 종양에는 전립선, 유방, 결장, 난소, 위, 두경부 및 다른 종양 및 암이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
항-히알루로난제, 예컨대 히알루로난 분해효소, 특히 히알루로니다제는 종래의 화학요법에 대해 내성인 암의 감수성을 증가시키는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-히알루로난제, 예를 들어, 히알루로난 분해 효소, 예를 들어, 히알루로니다제, 예컨대 rHuPH20은 종양 부위 주변으로 확산을 증가시키고 (예를 들어, 종양 부위 내 및 주변의 화학요법제의 순환 및/또는 농축을 용이하게 하고/거나), 종양 세포 운동성을 예컨대 히알루론산 분해에 의해 억제시키고/거나, 종양 세포 자멸(apoptosis) 역치를 저하시키는데 효과적인 양으로 HYAL1 결핍과 관련된 종양을 갖는 환자에게 투여될 수 있다. 이는 종양 세포(들)를 아노이키스(anoikis) 상태로 만들 수 있으며, 이는 종양 세포를 화학요법제의 작용에 대해 더 감수성으로 만든다. 항-히알루로난제, 예컨대 히알루로니다제의 투여는 췌장, 위, 결장, 난소 및 유방의 기존 화학요법-내성 종양의 반응성을 유도할 수 있다 (문헌 [Baumgartner et al. (1988) Reg. Cancer Treat. 1:55-58]; [Zanker et al. (1986) Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390]).
일 실시예에서, 히알루로난 분해 효소, 특히 히알루로니다제와 같은 항-히알루로난제는 비-암세포에 비해 상대적으로 감소된 내인성 히알루로니다제 활성을 가진 전이성 및 비-전이성 암의 치료에 사용된다. 항-히알루로난제, 예를 들어 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소는, 단독 또는 기타 치료제와 조합으로 치료제로서 사용될 수 있다. 예시적인 소세포 폐암, 편평세포 폐암, 유방, 난소, 두경부 또는 히알루로난 활성 수준이 감소되거나 히알루론산 이화가 감소된 임의의 기타 암이 있다.
항-히알루로난제 단독 치료에서(코르티코스테로이드와의 조합에서도), 본원에서 제공되는 조성물 및 방법은 항-히알루로난 제제를 화학요법제 또는 기타 항암제 또는 치료와 조합으로, 예를 들어 동시에 또는 그 이전에 사용될 수 있다. 이 실시예에서, 항-히알루로난제, 예를 들어 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소는, 일반적으로 화학요법제 또는 다른 항암제가 고형종양으로 침투하는 것을 강화시킴으로써 질환을 치료한다. 항-히알루로난제, 예를 들어 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소는, 항암제와 함께 종양내로 주사되거나 퍼져 있는 암 또는 접근이 어려운 암의 경우에는 정맥내로 주사될 수 있다.
항암제는 화학요법제, 항체, 펩티드 또는 유전자 치료 벡터, 바이러스 또는 DNA가 될 수 있다. 추가적으로, 항-히알루로난제, 예를 들어 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소는, 종전에 다제약 내성을 획득한 화학요법이 듣지 않는 암에 있어서 종양 세포를 순환 풀로 모아 감작되도록 하는데 사용될 수 있다(St Croix et al., (1998) Cancer Lett September 131(1): 35-44). rHuPH20과 같은 히알루로니다제를 포함하는, 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제는, 단일클론 항체, 사이토카인과 같은 생물학적 물질 및 기타 글리코사미노글리칸을 축적하는 암에 대한 약물의 전달을 강화할 수 있다.
항-히알루로난제, 예를 들어 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소의 투여후, 투여와 동시에 또는 투여전 투여될 수 있는 항암제의 예로는, 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알렘투주맙; 알리트레티노인(9-시스-레티노산); 알로퓨리놀; 알트레타민; 알보시딥; 암바존; 암보마이신; 아메탄트론; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 아낙시론; 안시타빈; 안트라마이신; 아파지퀀; 아르기메스나; 삼산화비소; 아스파라기나제; 아스페를린; 아트리무스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바녹산트론; 바타불린; 바티마스타트; BCG 라이브; 베낙시빈; 벤다무스틴; 벤조데파; 벡사로텐; 베바시주맙; 비칼루타미드; 비에타세르핀; 비리코다르; 비산트렌; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신; 보르테조밉; 브레퀴나르; 브로피리민; 부도티탄; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카네르티닙; 카페시타빈; 카라세미드; 카르베티머; 카보플라틴; 카르보퀀; 카르모푸르; 폴리페프로산과의 카르무스틴; 카르무스틴; 카루비신; 카르젤레신; 세데핑골;셀레콕시브; 세마도틴; 클로람부실; 시오테로넬; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 클란페누르; 클로파라빈; 크리스나톨; 시클로포스파미드; 리포좀 시타라빈; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 리포좀 다우노루비신; 다우노루비신/다우노마이신; 다우노루비신; 데시타빈; 데니류킨 디프티톡스; 덱스니굴디핀; 덱소나플라틴; 덱스라족산; 데자구아닌; 디아지퀀; 디브로스피듐; 디에노게스트; 디날린; 디세르몰리드; 도세탁셀; 도페퀴다르; 독시플루리딘; 리포좀 독소루비신; 독소루비신 HCL; 독소루비신 HCL 리포좀 주사; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에코무스틴; 에다트렉세이트; 에도테카린; 에플로르니틴; 엘라크리다르; 엘리나피드; 엘리엇 B 용액; 엘사미트루신; 에미테푸르; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 엔자스타우린; 에피프로피딘; 에피루비신; 에포에틴 알파; 엡탈로프로스트; 에르불로졸; 에소루비신; 에스트라무스틴; 에타니다졸; 에토글루시드; 에토포시드 포스페이트; 에토포시드 VP-16; 에토포시드; 에토프린; 엑세메스탄; 엑시술린드; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 플록수리딘; 플루다라빈; 플루오로우라실; 5-플루오로우라실; 플루옥시메스테론; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신; 포트레타민; 풀베스트란트; 갈라루비신; 갈로시타빈; 겜시타빈; 겜투주맙/오조가미신; 게로퀴놀; 기마테칸; 기메라실; 글록사존; 글루포스파미드; 고세렐린 아세테이트; 히드록시우레아; 이브리투모맙/티욱세탄; 이다루비신; 이포스파미드; 일모포신; 일로마스타트; 이매티닙 메실레이트; 이멕손; 임프로술판; 인디술람; 인프로퀀; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파; 인터페론 베타; 인터페론 감마; 인터페론; 인터류킨-2 및 다른 인터류킨 (재조합 인터류킨 포함); 인토플리신; 이오벤구안 [131-I]; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이르소글라딘; 익사베필론; 케토트렉세이트; L-알라노신; 란레오티드; 라파티닙; 레독산트론; 레트로졸; 류코보린; 류프롤리드; 류프로렐린 (류프로렐리드); 레바미솔; 렉사칼시톨; 리아로졸; 로바플라틴; 로메트렉솔; 로무스틴/CCNU; 로무스틴; 로나파르닙; 로속산트론; 루르토테칸; 마포스파미드; 만노술판; 마리마스타트; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민; 메클로레타민/질소 머스타드; 메게스트롤 아세테이트; 메게스트롤; 멜렌게스트롤; 멜팔란; 멜팔란/L-PAM; 메노가릴; 메피티오스탄; 머캅토퓨린; 6-머캅토퓨린; 메스나; 메테신드; 메토트렉세이트; 메톡살렌; 메토미데이트; 메토프린; 메투레데파; 미보플라틴; 미프록시펜; 미소니다졸; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토플락손; 미토길린; 미토구아존; 미토말신; 미토마이신 C; 미토마이신; 미토나피드; 미토퀴돈; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론; 미토졸로미드; 미보불린; 미조리빈; 모파로텐; 모피다몰; 무브리티닙; 미코페놀산; 난드롤론 펜프로피오네이트; 네다플라틴; 넬자라빈; 네모루비신; 니트라크린; 노코다졸; 노페투모맙; 노갈라마이신; 놀라트렉세드; 노르토픽산트론; 옥트레오티드; 오프렐베킨; 오르마플라틴; 오르타탁셀; 오테라실; 옥살리플라틴; 옥시수란; 옥소페나르신; 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파투빌론; 페가데마제; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; 펠데신; 펠리오마이신; 펠리트렉솔; 페메트렉세드; 펜타무스틴; 펜토스타틴; 페플로마이신; 페르포스파미드; 페리포신; 피코플라틴; 피나피드; 피포브로만; 피포술판; 피르페니돈; 피록산트론; 픽산트론; 플레비트렉세드; 플리카마이시드 미트라마이신; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피머; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프로파미딘; 프로스피듐; 퓨미테파; 퓨로마이신; 피라조푸린; 퀴나크린; 라니무스틴; 라스부리카제; 리보프린; 리트로술판; 리툭시맙; 로글레티미드; 로퀴니멕스; 루포크로모마이신; 사바루비신; 사핑골; 사르그라모스팀; 사트라플라틴; 세브리플라틴; 세무스틴; 심트라젠; 시조피란; 소부족산; 소라페닙; 스파르포세이트; 스파르포스산; 스파르소마이신; 스피로게르마늄; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스쿠알라민; 스트렙토니그린; 스트렙토바리신; 스트렙토조신; 수포스파미드; 술로페누르; 수니티닙 말레이트; 6-티오구아닌 (6-TG); 타세디날린;탈크; 탈이소마이신; 탈리무스틴; 타목시펜; 타리퀴다르; 타우로무스틴; 테코갈란; 테가푸르; 텔록산트론; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드/VM-26; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아미프린; 티아조푸린; 틸로미솔; 틸로론; 팀코다르; 티모나시크; 티라파자민; 토픽산트론; 토포테칸; 토레미펜; 토시투모맙; 트라벡테딘 (엑테이나시딘 743); 트라스투주맙; 트레스톨론; 트레티노인/ATRA; 트리시리빈; 트릴로스탄; 트리메트렉세이트; 트리플라틴 테트라니트레이트; 트립토렐린; 트로포스파미드; 투불로졸; 우베니멕스; 우라실 머스타드; 우레데파; 발루비신; 발스포다르; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 빈데신; 비네피딘; 빈플루닌; 빈포르미드; 빈글리시네이트; 빈류시놀; 빈류로신; 비노렐빈; 빈로시딘; 빈트립톨; 빈졸리딘; 보로졸; 크산토마이신 A (구아메사이클린); 제니플라틴; 질라스코르브 [2-H]; 지노스타틴; 졸레드로네이트; 조루비신 및 조수퀴다르가 있다. 예를 들어: 알데스류킨 (예를 들어, 프로류킨®(PROLEUKIN)); 알렘투주맙 (예를 들어, 캠패스®(CAMPATH)); 알리트레티노인 (예를 들어, 판레틴®(PANRETIN)); 알로퓨리놀 (예를 들어, 질로프림®(ZYLOPRIM)); 알트레타민 (예를 들어, 헥살렌®(HEXALEN)); 아미포스틴 (예를 들어, 에티올®(ETHYOL)); 아나스트로졸 (예를 들어, 아리미덱스®(ARIMIDEX)); 삼산화비소 (예를 들어, 트리세녹스®(TRISENOX)); 아스파라기나제 (예를 들어, 엘스파르®(ELSPAR)); BCG 라이브 (예를 들어, 타이스®(TICE)BCG); 벡사로텐 (예를 들어, 타그레틴®(TARGRETIN)); 베바시주맙 (아바스틴®(AVASTIN)); 블레오마이신 (예를 들어, 블레녹산®(BLENOXANE)); 부술판 정맥내 (예를 들어, 부술펙스®(BUSULFEX)); 부술판 경구 (예를 들어, 밀레란®(MYLERAN)); 칼루스테론 (예를 들어, 메토사르브®(METHOSARB)); 카페시타빈 (예를 들어, 젤로다®(XELODA)); 카보플라틴 (예를 들어, 파라플라틴®(PARAPLATIN)); 카르무스틴 (예를 들어, BCNU®, BiCNU®); 폴리페프로산과의 카르무스틴 (예를 들어, 글리아델®(GLIADEL)웨이퍼); 셀레콕시브 (예를 들어, 셀레브렉스®(CELEBREX)); 클로람부실 (예를 들어, 류케란®(LEUKERAN)); 시스플라틴 (예를 들어, 플라티놀®(PLATINOL)); 클라드리빈 (예를 들어, 류스타틴®(LEUSTATIN), 2-CdA); 시클로포스파미드 (예를 들어, 사이톡산(CYTOXAN), 네오사르(NEOSAR)); 시타라빈 (예를 들어, 사이토사르-U®(CYTOSAR-U)); 리포좀 시타라빈 (예를 들어, 디포사이트®(DepoCyt)); 다카르바진 (예를 들어, DTIC-Dome®): 닥티노마이신 (예를 들어, 코스메겐®(COSMEGEN)); 다르베포에틴 알파 (예를 들어, 아라네스프®(ARANESP)); 리포좀 다우노루비신 (예를 들어, 다누옥솜®(DANUOXOME)); 다우노루비신/다우노마이신 (예를 들어, 세루비딘®(CERUBIDINE)); 데니류킨 디프티톡스 (예를 들어, 온타크®(ONTAK)); 덱스라족산 (예를 들어, 지네카드®(ZINECARD)); 도세탁셀 (예를 들어, 탁소테레®(TAXOTERE)); 독소루비신 (예를 들어, 아드리아마이신®(ADRIAMYCIN), 루벡스®(RUBEX)); 리포좀 독소루비신, 예를 들어 독소루비신 HCL 리포좀 주사 (예를 들어, 독실®(DOXIL)); 드로모스타놀론 프로피오네이트 (예를 들어, 드로모스타놀론®(DROMOSTANOLONE)및 마스터론®(MASTERONE)주사); 엘리엇 B 용액 (예를 들어, 엘리엇 B 용액®(Elliott's B Solution)); 에피루비신 (예를 들어, 엘렌스®(ELLENCE)); 에포에틴 알파 (예를 들어, 에포겐®(EPOGEN)); 에스트라무스틴 (예를 들어, 엠사이트®(EMCYT)); 에토포시드 포스페이트 (예를 들어, 에토포포스®(ETOPOPHOS)); 에토포시드 VP-16 (예를 들어, 베페시드®(VEPESID)); 엑세메스탄 (예를 들어, 아로마신®(AROMASIN)); 필그라스팀 (예를 들어, 뉴포겐®(NEUPOGEN)); 플록수리딘 (예를 들어, 푸드르®(FUDR)); 플루다라빈 (예를 들어, 플루다라®(FLUDARA)); 플루오로우라실, 예를 들어 5-FU (예를 들어, 아드루실(ADRUCIL)); 풀베스트란트 (예를 들어, 파슬로덱스(FASLODEX)); 겜시타빈 (예를 들어, 젬자(GEMZAR)); 겜투주맙/오조가미신 (예를 들어, 밀로타르그(MYLOTARG)); 고세렐린 아세테이트 (예를 들어, 졸라덱스(ZOLADEX)); 히드록시우레아 (예를 들어, 하이드레아(HYDREA)); 이브리투모맙/티욱세탄 (예를 들어, 제발린(ZEVALIN)); 이다루비신 (예를 들어, 이다마이신(IDAMYCIN)); 이포스파미드 (예를 들어, 이펙스(IFEX)); 이매티닙 메실레이트 (예를 들어, 글리벡(GLEEVEC)); 인터페론 알파-2a (예를 들어, 로페론-A(ROFERON-A)); 인터페론 알파-2b (예를 들어, 인트론 A(INTRON A)); 이리노테칸 (예를 들어, 캄프토사르(CAMPTOSAR)); 레트로졸 (예를 들어, 페마라(FEMARA)); 류코보린 (예를 들어, 웰코보린(WELLCOVORIN), 류코보린(LEUCOVORIN)); 레바미솔 (예를 들어, 에르가미솔(ERGAMISOL)); 로무스틴/CCNU (예를 들어, CeeBU); 메클로레타민/질소 머스타드 (예를 들어, 머스타겐(MUSTARGEN)); 메게스트롤 아세테이트 (예를 들어, 메가스(MEGACE)); 멜팔란/L-PAM (예를 들어, 알케란(ALKERAN)); 머캅토퓨린, 예를 들어 6-머캅토퓨린 (6-MP; 예를 들어 퓨리네톨(PURINETHOL)); 메스나 (예를 들어, 메스넥스(MESNEX)); 메토트렉세이트; 메톡살렌 (예를 들어, 우바덱스(UVADEX)); 미토마이신 C (예를 들, 뮤타마이신(MUTAMYCIN), 미토지트렉스(MITOZYTREX)); 미토탄 (예를 들어, 리소드렌(LYSODREN)); 미톡산트론 (예를 들어, 노반트론(NOVANTRONE)); 난드롤론 펜프로피오네이트 (예를 들어, 듀라볼린-50(DURABOLIN-50); 노페투모맙 (예를 들어, 베르루마®(VERLUMA)); 오프렐베킨 (예를 들어, 뉴메가®(NEUMEGA)); 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴®(ELOXATIN)); 파클리탁셀 (예를 들어, 팍센®(PAXENE), 탁솔®(TAXOL)); 파미드로네이트 (예를 들어, 아레디아®(AREDIA)); 페가데마제 (예를 들어, 아다겐®(ADAGEN)); 페가스파르가제 (예를 들어, 온카스파르®(ONCASPAR)); 페그필그라스팀 (예를 들어, 뉴라스타®(NEULASTA)); 펜토스타틴 (예를 들어, 니펜트®(NIPENT)); 피포브로만 (예를 들어, 베르사이트®(VERCYTE)); 플리카마이신/미트라마이신 (예를 들어, 미트라신®(MITHRACIN)); 포르피머 나트륨 (예를 들어, 포토프린®(PHOTOFRIN)); 프로카르바진 (예를 들어, 마튤란®(MATULANE)); 퀴나크린 (예를 들어, 아타브린®(ATABRINE)); 라스부리카제 (예를 들어, 엘리테크®(ELITEK)); 리툭시맙 (예를 들어, 리툭산®(RITUXAN)); 사르그라모스팀 (예를 들어, 프로카인®(PROKINE)); 스트렙토조신 (예를 들어, 자노사르®(ZANOSAR)); 수니티닙 말레이트 (예를 들어, 수텐트®(SUTENT)); 탈크 (예를 들어, 스클레로솔(SCLEROSOL)); 타목시펜 (예를 들어, 놀바덱스(NOLVADEX)); 테모졸로미드 (예를 들어, 테모다르®(TEMODAR)); 테니포시드/VM-26 (예를 들어, 부몬®(VUMON)); 테스토락톤 (예를 들어, 테슬락®(TESLAC)); 티오구아닌, 예를 들어 6-티오구아닌 (6-TG); 티오테파 (예를 들어, 티오플렉스®(THIOPLEX)); 토포테칸 (예를 들어, 하이캄틴®(HYCAMTIN)); 토레미펜 (예를 들어, 파레스톤®(FARESTON)); 토시투모맙 (예를 들어, 벡사르®(BEXXAR); 트라스투주맙 (예를 들어, 헤르셉틴®(HERCEPTIN)); 트레티노인/ATRA (예를 들어, 베사노이드®(VESANOID)); 우라실 머스타드; 발루비신 (예를 들어, 발스타르®(VALSTAR)); 빈블라스틴 (예를 들어, 벨반®(VELBAN)); 빈크리스틴 (예를 들어, 온코빈®(ONCOVIN)); 비노렐빈 (예를 들어, 나벨빈®(NAVELBINE)); 및 졸레드로네이트 (예를 들어, 조메타®(ZOMETA))가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에서, 항-히알루로난제, 예를 들어 PEG화 rHuPH20과 같은 변형된 히알루로니다제 등 히알루로난 분해 효소는, 도세탁셀(예컨대 TAXOTERE®), 독소루비신 리포조말(예컨대 DOXIL®), 수니티닙 말레이트(예컨대 SUTENT®) 또는 베바시주맙(AVASTIN®) 중 1종 또는 그 이상의 투여 후, 투여와 동시에 또는 투여 전에 대상에 투여될 수 있다. 본원의 방법에서, 코르티코스테로이드는 또한 항-히알루로난제의 투여로부터 유발된 또는 관련된 근골격계 부작용과 같은 부작용을 개선 또는 예방하기 위해 투여된다.
본 발명은 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난제의 용도와 관련된 방법으로서, 단일제 또는 조합으로 치료에 사용할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
I. 실시예
다음의 실시예들은 예증적 목적만을 위하여 포함된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1
rHuPH20 발현 세포주
A. 초기 가용성 rHuPH20-발현 세포주의 생산
중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포를 HZ24 플라스미드 (서열번호 52에 기재)로 트랜스펙션 하였다. 가용성 rHuPH20 발현을 위한 HZ24 플라스미드 벡터는 pCI 벡터 백본 (Promega), 인간 PH20 히알루로니다제 (서열번호:49)의 아미노산 1 내지 482를 암호화하는 DNA, ECMV 바이러스로부터 유래된 내부 리보솜 부착부위 (internal ribosomal entry site, IRES) (Clontech), 및 마우스 디히드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자를 함유한다. pCI 벡터 백본은 베타 락타마제 내성 유전자 (AmpR), f1 복제기점, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 전초기 인핸서(immediate-early enhancer)/프로모터 부위 (CMV), 키메릭 인트론 및 SV40 후기 폴리아데닐화 신호(SV40)을 포함한다. 가용성 rHuPH20 구축물을 암호화하는 DNA는 인간 PH20 고유의 35개의 아미노산으로 이루어진 신호 서열의 아미노산 위치 1의 메티오닌을 암호화하는 DNA의 전방에 위치하는 NheI 부위 및 코작 공통(Kozak consensus) 서열, 및 서열번호 1에 개시된 인간 PH20 히알루로니다제의 아미노산 위치 482에 해당하는 타이로신을 암호화하는 DNA 뒤의 정지코돈, 이어서 BamHI 제한부위를 함유한다. 따라서, 구축물 pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24)은 내부 리보솜 유입점(IRES)에 의해 분리되는, 인간 PH20의 아미노산 1 내지 482(서열번호 3에 개시) 및 마우스 디히드로폴레이트 리덕타제의 아미노산 1 내지 186(서열번호 53에 개시)을 암호화하는 , CMV 프로모터에 의해 유도되는 단일 mRNA 종을 생성한다.
4 mM 글루타민 및 18 ml/L 플루리오닉(Plurionic) F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포용 GIBCO 변형 CD-CHO 배지에서 성장하는 비-트랜스펙션된 CHO 세포를 트랜스펙션용으로 준비한 진탕 플라스크에 0.5 x 106 세포/ml로 접종하였다. 세포를 120 rpm으로 진탕시키면서, 습식배양기에서 5% CO2, 37℃에서 성장시켰다. 기하급수적으로 성장하는 비-트랜스펙션된 CHO 세포의 생존력을 트랜스펙션 전에 측정하였다.
비-트랜스펙션된 CHO 세포 배양물의 6천만 생존세포를 펠렛화하고, 2x 트랜스펙션 완충액(2x HeBS: 40 mM Hepes, pH 7.0, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.4 mM Na2HPO4, 12 mM 덱스트로스) 0.7 mL 내에 2×107 세포밀도로 재현탁시켰다. 재현탁된 세포의 각각의 분액에, 선형 HZ24 플라스미드(Cla I(New England Biolabs)로 밤새 소화시켜 선형화됨) 0.09 mL(250 μg)을 첨가하고, 상기 세포/DNA 용액을 실온에서 0.4 cm gap BTX(Gentronics) 전기천공 큐벳 내로 이동시켰다. 전기천공 음성대조군은 상기 세포와 플라스미드 DNA를 혼합하지 않고 실시하였다. 상기 세포/플라스미드 혼합물을 330V 및 960μF 또는 350V 및 960μF의 캐패시터 방전으로 전기천공하였다.
전기천공 후에 큐벳으로부터 상기 세포를 제거하여, 4 mM의 글루타민 및 18 ml/L의 플루리오닉 F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포용 변형된 CD-CHO 배지 5 mL 내로 옮기고, 습식배양기에서 5% CO2, 37℃에서 2일 동안 선별없이 6-웰 조직배양 플레이트의 웰 내에서 성장하도록 하였다.
전기천공 2일 후, 조직배양 배지 0.5 mL을 각각의 웰로부터 제거하고, 실시예 4에 기술된 미세탁도 분석법을 이용하여, 히알루로니다제 활성의 존재를 측정하였다. 히알루로니다제 활성을 가장 높게 나타내는 세포들을 조직 배양 웰로부터 수집하고, 계수하여 mL당 1×104 내지 2×104개의 생존세포가 되도록 희석하였다. 세포 현탁액 0.1 mL 분액을 5개의 96 웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트의 각각의 웰로 옮겼다. GlutaMAX™-1 보충물질(GIBCO™, Invitrogen Corporation) 4 mM 를 함유하고 하이포크산틴(hypoxanthine) 및 티미딘(thymidine) 보충물을 첨가하지 않은 CD-CHO 배지 (GIBCO) 100 마이크로리터를 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다(최종 부피는 0.2 mL).
10개의 클론을 메토트렉세이트(methotrexate) 부재하 성장시킨 5개의 플레이트로부터 확인하였다. 이중 6개의 HZ24 클론을 배양물 내에서 확장시키고, 단일세포 현탁액으로서 진탕 플라스크 내로 옮겼다. 클론 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 및 4D10을 맨위 왼쪽 웰에서 5000개 세포로 시작하여, 플레이트의 아래로 1:2로, 그리고 플레이트를 가로질러 1:3으로 세포를 희석하는 이차원 무한희석전략을 이용하여 96-웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트 내로 플레이팅하였다. 희석된 클론을 웰당 500개의 비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포의 백그라운드에서 성장시켜, 배양물내에 초기 몇일 동안 필수성장인자들을 제공하였다. 서브클론당, 50nM 메토트렉세이트를 함유한 플레이트 5개 및 메토트렉세이트 부재의 플레이트 5개를 가지는, 10개의 플레이트를 만들었다.
클론 3D3는 24개의 가시적인 서브클론을 생산하였다(메토트렉세이트 미처리로부터 13개 및 50 nM 메토트렉세이트 처리로부터 11개). 유의적인 히알루로니다제 활성이 24개 서브클론 중 8개의 상청액에서 측정되었으며(>50 유닛/mL), 상기 8개의 서브클론을 T-25 조직배양 플라스크 내로 확장시켰다. 메토트렉세이트 처리 프로토콜로부터 분리된 클론을 50nM 메토트렉세이트 존재하에 확장시켰다. 클론 3D35M을 진탕 플라스크에서 500nM 메토트렉세이트에서 추가로 확장시켜 1,000 유닛/ml 히알루로니다제 활성을 초과하는 생산하는 클론을 생성하였다(클론 3D35M; 또는 Gen1 3D35M). 그 다음 3D35M 세포의 마스터 세포은행(master cell bank, MCB)을 준비하였다.
B. 가용성 rHuPH20을 발현하는 제 2 세대 세포주 생산
실시예 1A에서 기술된 Gen1 3D35M 세포주를 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켜 2세대(Gen2) 클론을 생산하였다. 확립된 메토트렉세이트-함유 배양물로부터 4 mM GlutaMAX-1™ 및 1.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지 내로 3D35M 세포를 접종하였다. 세포를 37℃, 7% CO2 습식배양기에서 46일의 기간에 걸쳐 성장시키고, 이들을 9번 계대함으로써 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켰다. 상기 증폭된 세포집단을 2.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석으로 클로닝하였다. 약 4주 후, 클론을 확인하고, 확장을 위해 클론 3E10B를 선택하였다. 3E10B 세포를 20 계대 동안 4 mM GlutaMAX-1™ 및 2.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 성장시켰다. 3E10B 세포주의 마스터 세포은행(MCB)을 만들고, 후속연구를 위해 동결하여 사용하였다.
4 mM GlutaMAX-1™ 및 4.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 3E10B 세포를 배양함으로써 세포주를 계속 증폭하였다. 12 번째 계대후, 세포를 연구세포은행(research cell bank, RCB)으로서 바이알에 동결시켰다. RCB의 한 바이알을 해동하고, 8.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 배양하였다. 5일 후, 배지내 메토트렉세이트 농도를 16.0 μM로, 그리고나서 18일 후에는 20.0 μM로 증가시켰다. 20.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 배지내 8번째 계대로부터 세포를 4 mM GlutaMAX-1™ 및 20.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석으로 클로닝하였다. 5 내지 6주 후 클론을 확인하고, 20.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 확장을 위해 클론 2B2를 선택하였다. 11번째 계대후, 2B2 세포를 연구세포은행(RCB)으로서 바이알에 동결시켰다.
생성된 2B2 세포는 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)을 발현하는 디하이드로폴레이트 리덕타제 결핍(dhfr-) DG44 CHO 세포이다. 가용성 PH20은 약 206 카피(copy)/세포의 복제수로 2B2 세포에 존재한다. rHuPH20-특이적인 프로브를 이용한 Spe I-, Xba I- 및 BamH I/Hind III-소화된 게놈 2B2 세포 DNA의 서던블롯 분석은 다음의 제한효소분해 프로파일을 나타내었다: Spe I으로 소화된 DNA에서 ~7.7kb의 한개의 주된 혼성화밴드 및 네개의 작은 혼성화밴드(~13.9, ~6.6, ~5.7 및 ~4.6kb); Xba I으로 소화된 DNA에서 ~5.0 kb의 한개의 주된 혼성화밴드 및 두개의 작은 혼성화밴드(~13.9 및 ~6.5kb); BamH I/Hind III으로 소화된 2B2 DNA를 이용하여 관찰된 ~1.4kb의 한개의 단일 혼성화밴드. mRNA 전사물의 서열분석은 유래된 cDNA(서열번호 56)가 위치 1131에서, 예상했던 시토신(C) 대신에 티미딘(T)인 것으로 관찰되는, 하나의 염기쌍 차이를 제외하고 참조서열(서열번호 49)과 동일함을 나타내었다. 이는 아미노산 서열에는 영향이 없는, 침묵성 돌연변이(silent mutation)이다.
실시예 2
rHuPH20의 생산과 정제
A. 300L 생물반응기 세포배양물에서 Gen2 가용성 rHuPH20의 생산
HZ24- 2B2 바이알(실시예 1B)을 해동하고, 20 μM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX-1™(Invitrogen)이 보충된 CD- CHO 배지( Invitrogen , Carlsbad, CA)에서 진탕 플라스크로부터 36 L 스피너 (spinner) 플라스크를 통하여 확장시켰다. 요약하면, 세포의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 배지를 첨가하여 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20 mL이 있는 125 mL 진탕 플라스크에 재- 현탁시키고 , 37℃, 7% CO 2 배양기에 두었다. 세포를 125 mL 진탕 플라스크에서 40 mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5 x 10 6 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 100 mL 배양부피로 125 mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO 2 에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x10 6 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 200 mL 배양부피로 250 mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO 2 에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 x 10 6 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 800 mL 배양부피로 1 L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO 2 에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 x 10 6 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 5000 mL 배양부피로 6 L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO 2 에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 x 10 6 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 32L 배양부피로 36 L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO 2 에서 배양하였다.
400 L 반응기를 멸균하고, CD- CHO 배지 230 mL을 첨가하였다. 사용전 , 반응기의 오염을 점검하였다. 약 30 L의 세포를 36 L 스피너 플라스크로부터 접종 밀도가 mL당 4.0 x 10 5 개 생존세포가 되고 총부피가 260 L로, 400 L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 파라미터는 온도설정점 , 37℃; 임펠러속도 40 내지 55 RPM; 용기압력 3 psi ; 공기 분사( Sparge ) 0.5 내지 1.5 L/분; 공기 오버레이(Overlay): 3 L/분이었다. 세포계수 , pH 검사(verification), 배지분석 , 단백질 생산 및 체류(retention)를 위해 반응기를 매일 샘플링하였다. 또한 , 작동 동안에 영양분 피드(nutrient feeds)를 첨가하였다. 120 시간(5일)에, 피드 # 1 배지 (4×CD- CHO + 33 g /L 글루코스 + 160 mL /L Glutamax -1™ + 83 mL /L 이스톨레이트 ( Yeastolate ) + 33 mg /L rHuInsulin) 10.4 L를 첨가하였다. 168 시간( 7일차 )에, 피드 # 2 배지 (2×CD- CHO + 33 g/L 글루코스 + 80 mL /L Glutamax -1™ + 167 mL /L 이스톨레이트 ( Yeastolate ) + 0.92 g/L 부티르산 나트륨(Sodium Butyrate)) 10.8 L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 216 시간( 9일차 )에, 피드 # 3 배지 (1×CD- CHO + 50 g /L 글루코스 + 50 mL/L Glutamax -1™ + 250 mL /L 이스톨레이트 ( Yeastolate ) + 1.80 g/L 부티르산 나트륨) 10.8 L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 216 시간( 9일차 )에, 피드#3 배지(1×CD- CHO + 50 g /L 글루코스 + 50 mL /L Glutamax -1™ + 250 mL /L Yeastolate + 1.80 g/L 부티르산 나트륨) 10.8 L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 264 시간( 11일차 )에, 피드 # 4 배지 (1×CD- CHO + 33 g /L 글루코스 + 33 mL /L Glutamax -1™ + 250 mL /L 이스톨레이트 ( Yeastolate ) + 0.92 g/L 부티르산 나트륨) 10.8 L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 피드배지의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20의 생산을 크게 향상시키는 것으로 관찰되었다. 14일 또는 15일에, 또는 세포의 생존률이 40% 미만으로 감소했을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정은, 1200만 세포/mL의 최대세포밀도를 갖고 ml당 17000 유닛의 최종 생산성의 결과를 가져왔다. 수확시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마, 미생물부하도(bioburden), 내독소 및 바이러스, 투과전자현미경( TEM ) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
4- 8μm 등급의 규조토(diatomaceous earth) 층 및 1.4- 1.1μm 등급의 규조토 층을 각각 함유하는, 평행한 4 개의 밀리스택 여과시스템 모듈( Millistak filtration system module, Millipore)을 통하여 연동펌프에 의해 배양물을 펌핑한 다음, 이어서 셀룰로스 막을, 그다음 0.4- 0.11μm 등급의 규조토 층 및 0.1μm 미만 등급의 규조토 층을 함유하는 2번째 단일 밀리스택 여과시스템(Millipore)을 통과후 , 그다음 셀룰로스 막을, 그다음 350 L 용량의 멸균 일회용 연성 백 내로 0.22 μm 최종필터를 통과시켰다. 수확된 세포배양 유체를 10 mM EDTA 및 10 mM 트리스로 pH 7.5 까지 보충하였다. 4 개의 Sartoslice TFF 30kDa 분자량 차단( MWCO ) 폴리에테르 설폰 ( PES ) 필터( Sartorious )를 이용하여 접선유동여과 ( TFF ) 장치로 배양물을 10× 농축시킨 다음, 0.22 μm 최종필터 내로, 50 L 멸균 저장백 내로 10 mM 트리스 , 20 mM Na 2 SO 4 , pH 7.5로 10× 완충액-교환시켰다.
농축되고 정용여과(diafilter)된 수확물을 바이러스에 대하여 불활화시켰다. 바이러스 불활화 전에, 10% 트리톤 X-100, 3% 트리(n-부틸) 포스페이트 ( TNBP ) 용액을 준비하였다. 농축되고 정용여과된 수확물을 Q 컬럼에서 정제하기 직전 36 L 유리 반응용기에서 1 시간 동안 1% 트리톤 X-100, 0.3% TNBP에 노출시켰다.
B. Gen2 가용성 rHuPH20의 정제
Q 세파로스(Pharmacia) 이온교환 컬럼(9 L 레진, H=29 cm, D=20 cm)을 준비하였다. pH, 전도도 및 내독소(LAL) 분석을 위하여 세척시료를 수집하였다. 컬럼부피 5배의 10 mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5로 컬럼을 평형화하였다. 바이러스 불활성화후, 농축되고 정용여과된 수확물(실시예 2A)을 100 cm/시간의 유속으로 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼부피 5배의 10 mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 및 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0으로 0.22μm 최종필터 내로, 멸균백 내로 단백질을 용출시켰다. 용출물 시료의 미생물부하도, 단백질 농도, 히알루로니다제 활성을 측정하였다. 상기 교환의 시작과 끝에 A280 흡광도를 측정하였다.
페닐-세파로스(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피를 다음으로 실시하였다. 페닐-세파로스(PS) 컬럼(19-21 L 레진, H=29 cm, D=30 cm)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)를 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0으로 평형화시켰다. Q 세파로즈 컬럼으로부터 단백질 용출물을 2 M 암모늄 설페이트, 1 M 포타슘 포스페이트 및 1 M CaCl2 원액용액으로 보충하여, 최종농도가 각각 5 mM, 0.5 M 및 0.1 mM이 되었다. 단백질을 100 cm/시간의 유속으로 PS 컬럼 상에 로딩하고, 컬럼 통과유체(flow thru)을 수집하였다. 컬럼을 100 cm/시간으로 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트 및 0.1 mM CaCl2 pH 7.0으로 세척하고, 세척물을 수집된 통과유체에 첨가하였다. 컬럼 세척물과 합쳐진, 통과유체를 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다. 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 위하여 통과유체를 샘플링하였다.
아미노페닐 보로네이트 컬럼(ProMedics)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트로 평형화시켰다. 정제된 단백질을 포함한 PS 통과유체를 100 cm/시간의 유속으로 아미노페닐 보로네이트 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트, pH 7.0으로 세척하였다. 컬럼을 20 mM 비신, 0.5 M 암모늄 설페이트, pH 9.0으로 세척하였다. 컬럼을 20 mM 비신, 100 mM 염화나트륨, pH 9.0으로 세척하였다. 단백질을 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 6.9로 용출하고, 멸균백 내로 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 컬럼(BioRad)을 준비하였다. 상기 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)를 측정하였다. 5 mM 포타슘 포스페이트, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0으로 컬럼을 평형화하였다. 아미노페닐 보로네이트 정제 단백질을 5 mM의 포타슘 포스페이트 및 0.1 mM CaCl2의 최종 농도로 보충하고, 100 cm/시간의 유속으로 HAP 컬럼 상에 로딩하였다. 5 mM 포타슘 포스페이트, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 다음에 10 mM 포타슘 포스페이트, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 단백질을 70 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.0으로 용출시키고, 멸균백 내로 0.22 μm 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다.
그다음 HAP 정제된 단백질을 바이러스 제거필터를 통과시켰다. 멸균 Viosart 필터(Sartorius)를 먼저 2 L의 70 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.0 로 세척하여 준비하였다. 사용전, pH 및 전도도를 위하여 여과된 완충액을 샘플링하였다. HAP 정제된 단백질을 20 nM 바이러스 제거필터를 통하여 연동펌프를 거쳐 펌핑하였다. 70 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.0 내 여과된 단백질을 멸균백 내로 0.22 μm 멸균필터를 통과시켰다. 바이러스 여과된 시료의 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 및 시알산 프로파일링을 측정하였다. 또한 시료의 공정 관련 불순물(process related impurities)을 측정하였다.
실시예 3
rHuPH20의 PEG화의 준비
이 실시예에서, rHuPH20는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 부탄산(mPEG-SBA-30K)의 선형 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 (mPEG-SBA-30K)와 효소 반응에 의해 PEG화되었다.
A. mPEG-SBA-30K의 준비
PEGPH20을 생성시키기 위해, rHuPH20 (크기가 대략 60 KDa임)을 대략 30 kDa의 분자량을 갖는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 부탄산의 선형 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 (mPEG-SBA-30K)에 공유결합으로 컨주게이션시켰다. mPEG-SBA의 구조는 하기 반응식에 나타내었다. n
Figure 112017000450674-pat00007
681에 해당한다.
Figure 112017000450674-pat00008
rHuPH20을 PEG화하는데 사용된 mPEG-SBA-30K를 제조하기 위해 사용된 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,672,662호에 기재되어 있다. 요약하면, mPEG-SBA-30K를 하기 절차에 따라 제조하였다:
디옥산에 용해된 에틸 말로네이트 (2 당량)의 용액을 질소분위기 하에 수소화나트륨 (2 당량) 및 톨루엔에 적가하였다. mPEG 메탄 술포네이트 (1 당량, MW 30 kDa, 쉬어워터(Shearwater))를 톨루엔에 용해시키고, 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 대략 18 시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 원래 부피의 절반으로 농축시키고, 10% 수성 NaCl 용액으로 추출하고, 1% 수성 염산으로 추출하고, 수성 추출물을 혼합하였다. 수집된 수성층을 디클로로메탄 (3x)으로 추출하고, 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 건조물로 증발시켰다. 생성된 잔류물을 염화나트륨을 함유하는 1 N 수산화나트륨에 용해시키고, 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 6 N 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 대략 3으로 조정하였다. 혼합물을 디클로로메탄 (2x)으로 추출하였다.
유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 냉 디에틸 에테르에 부었다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공하에 건조시켰다. 생성된 화합물을 디옥산에 용해시키고, 8시간 동안 환류시킨 후, 건조물로 농축시켰다. 생성된 잔류물을 물에 용해시키고, 디클로로메탄 (2x)으로 추출하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용액을 회전식 증발에 의해 농축시킨 후, 냉 디에틸 에테르에 부었다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공하에 건조시켰다. 생성된 화합물 (1 당량)을 디클로로메탄에 용해시키고, N-히드록시숙신이미드(2.1 당량)를 첨가하였다. 용액을 0℃로 냉각하고, 디클로로메탄 중 디시클로헥실카르보디이미드 (2.1 당량)의 용액을 0℃로 냉각하고, 디클로로메탄 중 디시클로헥실카르보디이미드 (2.1 당량)의 용액을 적가하였다. 용액을 실온에서 대략 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 디에틸 에테르에서 침전시켰다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공하에 건조시켜, mPEG-SBA-30K 분말을 얻었고, 이를 ≤ -15 ℃에 보관하였다.
B. rHuPH20으로의 mPEG-SBA-30K의 컨주게이션
PEGPH20을 제조하기 위하여, 하기에서 나타낸 바와 같이, mPEG-SBA-30K을, rHuPH20 및 mPEG 사이에 안정한 아미드 결합을 제공하는 공유결합 컨주게이션(covalent conjugation)에 의해 rHuPH20의 아미노기(들)에 커플링시켰다. 하기에서 n
Figure 112017000450674-pat00009
681이다.
Figure 112017000450674-pat00010
컨주게이션 전에, 실시예 2B에서 얻은 정제된 rHuPH20 벌크 단백질을, 0.2 m2 여과 영역을 가진 10 kDa 폴리에테르설폰(PES) 접선유동여과(TFF) 카셋트(Sartorius)를 이용하여, 10 mg/mL로 농축하였고, 70 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.2에 대하여 완충액을 교환하였다. 농축된 단백질은 사용 전까지 2-8 ℃에서 보관하였다.
rHuPH20을 컨주게이션시키기 위해, mPEG-SBA-30K (Nektar)를 2시간 미만 동안 실온 암조건에서 해동시켰다. 배치(batch)의 크기에 맞추어, 멸균된 3" 교반 막대를 1 또는 3 리터의 엘렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 안에 넣고, 완충액을 교환시킨 rHuPH20 단백질을 첨가하였다. 진공 후드 하에서, rHuPH20 1 g 당 mPEG-SBA-30K 건조분말 5 g(mPEG-SBA-30K: rHuPH20가 10:1의 몰비)을 플라스크에 첨가하고 혼합물을 10 분간 또는 mPEG-SBA-30K 가 완전히 용해될때까지 혼합하였다. 교반 속도는 거품이 발생되지 않고 소용돌이가 발생하는 정도로 하였다.
그 후 class 100 후드 하에서 연동 펌프를 이용해 용액을 펌핑하여, 0.22 ㎛ 폴리스티렌, 셀룰로오스 아세테이트 필터 캡슐(Corning 50 mL Tubetop filter)을 통해 멸균된 3" 교반 막대가 들어있는 새 1 또는 3 리터 엘렌마이어 플라스크로 용액을 여과시켰다. PEGPH20 반응 혼합물의 부피는 질량(1 g/mL 밀도)에 의해 결정되어졌고, 여과에 사용한 0.22 ㎛ 필터는 후-사용 완전성 검사(post-use integrity test)를 거쳤다.
혼합물은 교반 플레이트에서 2-8 ℃에 보관되었고, 20±1 시간 동안 암실에서 혼합되었다. 교반 속도는 거품을 일으키지 않으면서 소용돌이가 발생할 정도로 설정되었다. 엘렌마이어 용기 전체를 호일로 싸서 용액을 빛으로부터 보호하였다. 혼합 후에, 1 M 글리신을 최종 농도가 25 mM이 될 때까지 첨가하여 반응을 억제시켰다(quenched). 용기로부터 시료를 제거하여 pH와 전도도(conductivity)를 측정하였다. 5 mM 트리스 염기(5.65 L/L) 및 5 mM 트리스의 용액, 10 mM NaCl, pH 8.0(13.35 L/L)을 첨가하여 Q 세파로스 정제를 진행할 수 있도록 pH와 전도도를 조정하였다.
컬럼부피 5배(36 L)의 5 mM 트리스, 10 mM NaCl, pH 8.0으로 QFF 세파로스(GE Healthcare) 이온 교환 컬럼 (높이 = 21.5-24.0 cm, 지름 = 20 cm)을 평형화하여 준비하였다. 컨주게이션 산물은 QFF 칼럼에 유속 95 cm/시간으로 적재되었다. 컬럼을 평형 완충액(5 mM 트리스, 10 mM NaCl, pH 8.0) 11 L로 유속 95 cm/시간으로 흘려 세척하고, 이어서 평형 완충액 25 L를 유속 268 cm/시간으로 흘려 세척하였다. 그 후 5 mM 트리스, 130 mM NaCl, pH 8.0을 유속 268 cm/시간으로 흘려 단백질 산물을 용출시켰다. 그 결과 얻은 정제된 PEGPH20을 0.2 m2 여과 영역을 가진 30 kDa 폴리에테르설폰(PES) 접선유동여과(TFF) 카셋트(Sartorius)를 이용하여, 3.5 mg/mL로 농축하였고, pH 6.5에서 10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl에 대하여 완충액을 교환하였다. 그 결과 얻은 물질은 하기 실시예 4에 기재된 바와 같이, 효소 활성을 측정하였다. PEG화된 rHuPH20 물질은 3.5 mg/mL의 농도로(최종 효소 활성 140,000 U/mL) 실리콘화된 브로모부틸 고무 스토퍼(stopper)와 알루미늄 플립 오프 밀봉(seal)이 장착된 5 mL 유리 바이알에 3 mL 부피가 되도록 채우고, 동결시켰다(－20 ℃ 냉동고에서 밤새 동결시키고, 장기보관을 위해 －80 ℃ 냉동고로 이동시킴). PEG화된 rHuHP20은 rHuHP20 1 몰당 약 4.5 몰의 PEG를 함유하고 있다.
실시예 4
가용성 rHuPH20의 히알루로니다제 활성 측정
세포배양물, 혈장, 정제 분획 및 정제된 용액과 같은 시료내의 가용성 rHuPH20의 히알루로니다제 활성을, 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때 불용성 침천물을 형성하는 것에 기초한 비탁법(turbidimetric assay) 또는 플라스틱 다중-웰 미세역가 플레이트에 비공유결합으로 결합된 비오틴화된 히알루론산(b-HA) 기질의 분해에 의한 효소적으로 활성인 rHuPH20 또는 PEGPH20의 양을 측정하는 비오틴화-히알루론산 기질 분석을 이용하여 측정하였다.
A. 미세탁도 분석
가용성 rHuPH20을 정해진 기간의 시간(10 분) 동안 히알루론산 나트륨(히알루론산)과 함께 배양한 다음, 산성화된 혈청 알부민을 첨가하여 소화되지 않은 히알루론산 나트륨(히알루론산)을 침전시킴으로써 가용성 rHuPH20의 히알루로니다제 활성을 측정하였다. 생성된 시료의 탁도를 30 분의 현상(development) 기간 후에 640 nm에서 측정하였다. 히알루론산 나트륨 기질에 대한 효소 활성에서 유래한 탁도 감소는 가용성 rHupH20 히알루로니다제 활성의 척도이다. 상기 방법은 가용성 rHuPH20 분석 상용표준품(working reference standard)의 희석물 생성된 검정곡선을 이용하여 수행되며, 이 검정곡선과 비교하여 시료활성 측정이 이루어졌다.
효소희석용액(Enzyme Diluent Solutions)에서 시료 희석물을 준비하였다. 가수분해된 젤라틴 33.0±0.05 mg을 50 mM PIPES 반응 완충액(140 mM NaCl, 50 mM PIPES, pH 5.5) 25.0 mL 및 멸균 주사용수(sterile water for injection; SWFI) 25.0 mL에 용해하고, 25% 부미네이트(Buminate) 용액 0.2 mL를 상기 혼합물 내로 희석하고 30 초간 볼텍싱(vortexing)하여 효소희석용액을 준비하였다. 이를 사용하기 2 시간 이내에 수행하고, 필요할 때까지 얼음위에서 보관하였다. 시료를 추산된 1-2 U/mL로 희석하였다. 일반적으로, 각 단계당 최대희석은 1:100을 초과하지 않았으며, 초기 희석을 위한 초기 시료의 크기는 20μL 이상이었다. 분석을 수행하는데 필요한 최소 시료 부피는 다음과 같았다: 공정 중 시료(In-process Samples), FPLC분획: 80μL; 조직배양 상청액: 1 mL; 농축된 물질(Material) 80 μL; 정제된 또는 최종단계의 물질(Material): 80μL. 저 단백질 결합(Low Protein Binding) 96-웰 플레이트에서 3반복적으로(triplicate)로 희석하고, 각각의 희석물 30μL를 Optilux 블랙/클리어 보텀 플레이트(BD BioSciences)로 옮겼다.
2.5 U/mL 농도의 공지의 가용성 rHuPH20의 희석물을 효소희석용액에서 준비하여 표준곡선(Standard Curve)를 작성하고, Optilux 플레이트에 3반복적으로 첨가하였다. 희석물은 0 U/mL, 0.25 U/mL, 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, 1.5 U/mL, 2.0 U/mL 및 2.5 U/mL을 포함하였다. 효소희석용액 60 μL를 포함한“매질바탕시료(Reagent blank)”웰은 음성대조군으로서 플레이트에 포함되었다. 그리고 나서 플레이트를 덮고, 37℃에서 5 분 동안 열블록(heat block)으로 가온하였다. 진탕 후, 플레이트를 열블록에 되돌려 두고, MULTIDROP 384 액체 핸들링 장비를 따뜻한 0.25 mg/mL 히알루론산 나트륨 용액(100 mg 히알루론산 나트륨을 20.0 mL SWFI에 용해함으로써 준비됨. 이는 2 내지 4 시간 동안 또는 완전히 용해될 때까지, 2 내지 8℃에서 부드럽게 회전시키거나/시키고 흔들어 혼합하였다)으로 프라이밍하였다. 반응 플레이트를 MULTIDROP 384로 옮기고, 시작키를 눌러서 각 웰 내로 히알루론산 나트륨 30 μL를 분주하여 반응을 개시하였다. 그 다음 플레이트를 MULTIDROP 384로부터 제거하고, 플레이트 덮개를 교체하고 열블록으로 옮기기 전에 10 초간 진탕하였다. 37℃에서 10 분간 플레이트를 배양하였다.
혈청 작업용액(serum working solution)으로 기계(machine)를 프라이밍하고 240 μL로 부피설정을 변경함으로써 반응이 정지되도록 MULTIDROP 384를 준비하였다 (500 mM 아세테이트 완충용액 75 mL 내에 혈청 저장용액(Stock Solution) 25 mL[1 부피의 말 혈청(Sigma)을 9 부피의 500 mM 아세테이트 완충용액으로 희석하고, 염산으로 pH를 3.1로 조정]). 플레이트를 열블록으로부터 제거하여 MULTIDROP 384 위에 놓고, 혈청 작업용액 240 μL를 웰로 분주하였다. 플레이트를 제거하고 10 초간 플레이트 리더에서 진탕하였다. 추가 15 분 후에, 시료의 탁도를 640 nm에서 측정하고, 각 시료의 히알루로니다제 활성(U/mL로)을 표준곡선에 맞춤(fitting)으로써 결정하였다.
히알루로니다제 활성(U/ml)을 단백질 농도(mg/mL)로 나눔으로써 특이적 활성(U/mg)을 계산하였다.
B. 비오틴화된 히알루로난 분석
비오틴화된 히알루론산 분석은 플라스틱 다중-웰 미세역가 플레이트에 비공유결합으로 결합된 큰 분자량[~ 1.2 메가돌턴(megadaltons)] 비오틴화된 히알루론산(b-HA) 기질의 분해에 의해 생물학적 시료 내의 효소적으로 활성인 rHuPH20 또는 PEGPH20의 양을 측정한다. 표준(Standards) 및 시료 내의 rHuPH20 또는 PEGPH20은 b-HA로 코팅된 플레이트에서 37℃에서 배양된다. 일련의 세척 과정을 거친 후에, 잔존하는 분해되지 않은/결합된 b-HA는 스트렙타비딘 호스래디쉬 퍼록시다제 컨주게이트(SA-HRP)로 처리한다. 고정화된(immobilized) SA-HRP와 발색기질(chromogenic substrate), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 간의 반응으로 푸른색의 용액이 생성된다. 산으로 반응을 정지시킨 후에, 가용성 황생 반응 생성물의 생성은 미세역가 플레이트 분광 광도계를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 읽음으로써 결정하였다. 비오틴화된 히알루론산(b-HA)기질에 대한 효소 활성에 기인한 450 nm에서의 흡광도 감소는 가용성 rHuPH20 히아루로니다제 활성의 척도이다. 상기 방법은 가용성 rHuPH20 또는 PEGPH20 표준품(reference standard)의 희석으로 생성한 검정곡선을 이용하여 수행되며, 시료 활성 측정은 이 검정곡선과 비교하여 이루졌다.
시료의 희석과 캘리브레이터(calibrator)는 분석 희석액(Assay Diluent)에서 준비되었다. 분석 희석액은 1% v/v 혼주 혈장(pooled plasma)(적절한 종으로부터 유래된)을 HEPES 내의 1%(w/v) BSA, pH 7.4에 첨가함으로써 준비되었다. 이는 매일 준비되었고, 2-8 ℃에서 보관되었다. 예상된 히알루니다제 수준 뿐만 아니라 종 유형(species type)에 의존하여, 단일 또는 다중 희석액을 준비하여 적어도 하나의 시료 희석이 검정 곡선 범위에 포함되도록 하였다. 시험 시료 희석액(들)의 선별을 가이드하기 위하여, 투여된 히알루니다제 투여량(dose), 투여 경로, 상기 종의 대략의 혈장 부피 및 시점(time point)에 관하여 공지된 정보가 히알루니다제 활성 수준을 추산하는데 이용되었다. 각 시료 희석액은 이를 짧은 펄스(brief pulse)-볼텍싱(vortexing)에 의해 준비하는 것과 같이 혼합하였고, 피펫 팁은 각 희석 사이에 교체하였다. 일반적으로, 희석은 최초 50 또는 100배 희석으로 시작하여, 추가전인 단계적 희석을 하였다. rHuPH20 또는 PEGPH20의 7-포인트 검정곡선(투여된 처리물 의존적)은 rHuPH20에 대해서는 0.004에서 3.0 U/mL의 농도 범위로, PEGPH20에 대해서는 0.037 에서 27 U/mL의 농도 범위로 준비되었다. 각 시험 시료 희석액 100 마이크로리터(100 μL)와 검정곡선 포인트를, 이전에 0.1 mg/mL로 웰 당 b-HA 100 μL로 코팅되고 PBS 내의 1.0 % (w/v)의 소 혈청 알부민으로 블록(block)되어 있었던 3배수의 96-웰 미세역가 플레이트 (Immulon 4HBX, Thermo)의 웰들에 적용하였다. 플레이트를 접착성 플레이트 밀봉으로 덮고 약 90분 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 기간 마지막에, 접착성 밀봉을 플레이트로부터 제거하고, 시료를 흡입하고 플레이트는 웰 당 300 μL의 세척 완충액(10 mM 인산염 완충액, 2.7 mM 염화칼륨, 137 mM 염화나트륨, pH 7.4, 0.5 % (v/v) 트윈 20을 갖는, PBST)으로 자동 플레이트 세척기(BioTek ELx405 Select CW, Program '4HBX1')로 5 회 세척하였다. 100 마이크로리터의 스트렙타비딘-HRP 컨주게이트 작업용액[20 mM 트리스-염산 내의 스트렙타비딘-HRP 컨주게이트(1:5,000 v/v), 0.025 % (v/v) 트윈 20, 0.1 %(w/v) 소혈청 알부민]을 웰마다 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 진탕 없이 빛으로부터 보호된 상태로 주위 온도(ambient temperature)에서 약 60분 동안 배양하였다. 배양 기간 마지막에, 접착성 밀봉을 플레이트로부터 제거하고, 시료를 흡입한 후 플레이트를 웰 당 300 μL의 전술한 세척 완충액으로 5 회 세척하였다. TMB 용액(주위 온도에서)을 각 웰마다 첨가하고 실온에서 약 5분간 빛으로부터 보호된 상태로 배양하였다. 그 후 TMB 정지 용액(KPL, Catalog # 50-85-06)을 웰 당 100 μL씩 첨가하였다. 미세역가 플레이트 분광 광도계를 이용하여 450 nm에서 각각의 웰의 흡광도를 결정하였다. 각 플레이트의 검정곡선 반응은 4-변수 로지스틱 곡선 피트(4-parameter logistic curve fit)를 이용하여 모델링하였다. 각각의 미지의 히알루로니다제 활성을 검정곡선의 내삽법(interpolation)에 의해 계산되었고, 시료 희석 인자로 보정하였고, U/mL로 보고하였다.
실시예 5
혈장 내 항- rHuPH20 항체의 검출을 위한 전기 화학적 발광 면역 분석법(electrochemiluminescent immunoassay)
이 실시예에서, 혈장 또는 혈청 내의 PEGPH20의 아미노산 부분에 대한 항체의 존재를 전기화학발광(ECL) 가교 분석(Mire-Sluis et al., Journal of Immunological Methods 289: 1-16, 2004 참조)을 이용하여 측정하였다.
A. 분석 개요
상기 방법은 일반적으로 3단계(Tiers)로 수행된다. 1단계에서, 최초 스크리닝이 시험할 시료에 대해 수행되었다. 산술적으로 결정된 컷 포인트를 상회하는 ECL 값을 산출한 시료들은 2단계에서 시험되는 반면, 컷 포인트를 상회하는 ECL 값을 산출하지 못한 시료는 항-rHuPH20항체에 대한 음성으로서 보고되었다. 2단계 분석은 경쟁적 저해제로서 비표지된(unlabled) rHuPH20를 이용하여 단계 1로부터의 양성 결과를 확인하였고, 3단계 분석은 시료의 어떤 희석에서 이 컷 포인트를 상회하여 남아있는지 확인하는데 이용되었다. 1단계와 2단계 평가는 동시에 수행될 수 있다.
B. 대조군 준비
2.45 mg/mL의 토끼 항-rHuPH20 다클론 항체 100 ㎕를 145 ㎕의 StartingBlock T20 (TBS) 차단 완충액(Thermo, catalog # 37543)에 희석하여 1 mg/mL의 토끼 항-rHuPH20 다클론 항체 작업 스톡(working stock)을 생성하였다. 이 스톡을 철저히 혼합하고 이어서 1 mg/mL의 토끼 항-rHuPH20 다클론 항체 100 ㎕를 900 ㎕의 StartingBlock T20 (TBS) 차단 완충액(Thermo, catalog # 37543)에 희석하여 2차 작업 스톡(100 ㎍/mL)을 제조하는데 사용하였다. 이 100 ㎍/mL의 작업 스톡은 하기 표 5에 서술된 바와 같이 저(low), 중(mid), 고(high)의 양성 대조군을 생성하는데 사용되었다. 이용된 음성 염기 풀(negative base pool)은 인간 K3-EDTA 혈장(Bioreclamation, Catalog # HMPLEDTA)이었다. 희석액은 StartingBlock 완충액이었다. 음성대조군은 상기 음성 염기 풀 인간 혈장 단독(스파이크가 없는(unspiked))이다. 각 개(dog)의 기준치(baseline) 시료가 후-PEGPH20 노출 시료(post-PEGPH20 exposure samples)에 대한 대조군으로 사용되었다.
Figure 112017000450674-pat00011
고, 중, 저 및 음성 대조군이 100 ㎕ 분액(aliquot)으로 피펫으로 취하여져 －70℃에서 사용 전까지 보관되었다(제조일로부터 1년까지).
C. 1단계 분석
항-rHuPH20 항체의 존재에 대해 시험될 혈액 혈청 시료를 수집하고 사용 전까지 －70℃에서 동결 보관하였다. 시료 시험 당일에, 고, 중, 저 및 음성 대조군 시료(실시예 5B)를 보관 장소(storage)로부터 옮겨져서 시험 시료와 함께 주위 온도, 얼음 위, 또는 2-8 ℃에서 해동하였다. 시험 시료와 대조군 시료를 부드럽게 혼합하고 각 시료를 StartingBlock T20 (TBS) 차단 완충액 (Thermo, catalog # 37543)에 1:100으로 희석하여 시료 당 총 200 ㎕가 되도록 하였다.
StartingBlock T20 (TBS) 차단 완충액 내에 250 ng/mL의 rHuPH20-Bt(재조합 인간 히알루로니다제-비오틴화; Millipore, 특별 주문) 및 250 ng/mL의 rHuPH20-Rt(재조합 인간 히알루로니다제-루테늄; Millipore, 특별 주문)을 포함하는 별개의 10 mL 용액을 준비하였다. 상기 용액을 부드럽게 혼합하고 200 ㎕를 각 200 ㎕의 시료 및 대조군 시료 튜브에 첨가하였다. 튜브들을 부드럽게 볼텍싱하고(Vortex Genie, Scientific Industries, Catalog# 14-961-26), 밀봉 후 부드럽게 흔들어 주며(Heidolph Rocking Platform Shaker, Model# Polymax 2040) 빛으로부터 보호된 상태로 2-8 ℃에서 16-24 시간 동안 밤새 배양하였다.
배양 중에, 스트렙타비딘으로 코팅된 표준 MA2400 96 플레이트(Meso Scale Discovery, Catalog# L15SA)를 300 ㎕/웰의 StartingBlock T20 (TBS) 차단 완충액 (Thermo, catalog # 37542)으로 1-4시간 동안 주위 온도에서 부드럽게 진탕하며 차단시켰다. 차단이 완료된 후에, StartingBlock(TBS) 차단 완충액을 흡입하여 제거하고 플레이트를 Bio-Tek 자동 플레이트 세척기(Model# ELx405)에서 300 ㎕/웰의 TBS-T 세척 완충액(25 mM 트리스, 137 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 0.05% 트윈, pH 7.4 ± 0.1을 주위 온도에서)으로 3회 세척하였다.
세척 완충액을 흡입한 후, 각 시료와 대조군 시료(각 시료를 2반복적으로 함(duplicate)) 100 ㎕/웰을 스트렙타비딘으로 코팅된 플레이트에 첨가하고 불투명한 플레이트 씰러(VWR International, Catalog# 14230-062)로 밀봉하였다. 빛으로부터 보호된 상태에서 부드럽게 진탕하면서 주위 온도 하에 30 ± 3 분간 결합이 진행되도록 두었다.
30분 배양하는 동안, 계면활성제를 갖는 리드 완충액 T(Read Buffer T)(4X 리드 완충액; Meso Scale Discovery, Catalog# R92TC)의 1X 용액 20 mL을 초고순도 물(ultrapure water)과 함께 준비하였다. 시료 배양 기간이 완료된 후, 시료 용액을 플레이트로부터 흡입하고(Bio-Tek 자동 플레이트 세척기, 흡입 높이 3.048 mm, 수평 흡입 위치 1.372 mm, 흡입 유속 3.0 mm/초), 플레이트를 Bio-Tek 자동 플레이트 세척기에서 300 ㎕/웰의 TBS-T 세척 완충액(분주 유속 5, 분주 높이 15.24 mm)으로 3회 세척하였다. 그리고나서 계면활성제를 갖는 리드 완충액 T(1X)을 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다(150 ㎕/웰). 리드 완충액 T를 첨가하고 30분 내에, 플레이트를 Meso Scale Discovery Sector Imager 2400으로 판독하였다. 데이터(전기화학발광 유닛(electrochemiluminescence units))를 Meso Scale Discovery 소프트웨어(Gaithersburg, MD)를 사용하여 Sector Imager 2400로부터 수집하였다.
(i) 데이터 검증
분석은 플레이트 상에서 함께 분석된 시료들로서 정의되었다. 최소 3개의 음성 대조군을 검사하였고(run)(플레이트의 앞쪽 근처에 하나, 플레이트의 중앙 근처에 하나 및 플레이트의 뒤쪽 근처에 하나로 분배하거나, 플레이트의 앞쪽 근처에 2개 및 플레이트의 뒤쪽 근처에 2개로 분배), 2개의 양성 대조군을 각각의 농도(고, 중, 저; 플레이트의 앞쪽 근처에 하나 및 플레이트의 뒤쪽 근처에 하나)에 대해 검사하였다.
각 분석법에 대한 시스템 적합성 사양(suitability specifications)을 확립하여 "시험 방법 요약 시트"에 기록하였다. 1단계 분석에서 만일 1) 대조군에 대한 복제물(replicates)의 반응(ECL 유닛)의 변이 계수(coefficient of variation) (% CV) 가 ≤20.0%(반응값이 ＞50 ECL 유닛인 경우에만); 2) 양성 대조군의 ≥66.0%에 대한 ECL 반응값이 시험 방법 요약 시트에 기술된 바와 같은 할당된 수용 범위(assigned acceptance range) 또는 예측된 ECL 반응값의 ±50% 이내; 3) 적어도 하나 이상의 양성 대조군에 대한 평균 ECL 반응값이 각각의 농도 수준(즉, 저, 중, 고농도 대조군)에서 시험 방법 요약 시트에 기술된 바와 같은 할당된 수용 범위 또는 예측된 ECL 반응값의 ±50% 이내; 4) 적어도 하나 이상의 양성 대조군에 대한 평균 ECL 반응값이 대조군의 각각의 세트(플레이트의 앞쪽 대(versus) 플레이트의 뒤쪽)에서 시험 방법 요약 시트에 기술된 바와 같은 할당된 수용 범위 또는 예측된 ECL 반응값의 ±50% 이내; 5) 음성 대조군에 대한 평균 ECL 반응값이 시험 방법 요약 시트에 기술된 바와 같은 할당된 수용 범위 이내; 및 6) 음성 대조군의 ≥66.0%에 대한 ECL 반응값이 시험 방법 요약 시트에 기술된 바와 같은 할당된 수용 범위 이내인 경우 분석이 받아들여질 수 있다.
2단계 분석에서, 1단계 분석에 대한 상기 기준(criteria) 이외에, 다음의 기준을 또한 만족한다면 분석이 받아들여질 수 있다: 1) 양성 대조군의 억제 퍼센트가 각각의 농도에서 양성 대조군의 적어도 50.0%에 대해 ≥ 50.0%; 2) 양성 대조군의 억제 퍼센트가 각각의 세트(플레이트 앞쪽 대 뒤쪽)에서 양성 대조군의 적어도 50.0%에 대해 ≥50.0%; 및 3) 억제 퍼센트가 모든 양성 대조군의 ≥75%에 대해 ≥50%.
연구 시료는 하기 이유 중 어느 하나에 대해 재분석되었다: 1) 장비 오작동; 2) 분석 과정에서 시험 시료가 소실된 경우; 3) 복제 ECL 값 간의 % CV가 ＞20.0%인 경우(이 기준은 양 시료 복제물의 ECL 반응이 분석 컷 포인트 아래거나, 양 시료 복제물의 ECL 반응이 분석 컷 포인트를 상회하는 경우 적용되지 않는다. 또한 이 기준은 복제물 ECL 반응 사이의 차이가 ≤ 50 ECL 유닛인 경우 적용되지 않는다.); 4) 시료의 평균 ECL 값이 ≥1단계 시험에서의 분석 컷 포인트. 2단계 시험이 동시에 수행되지 않는다면, 시료는 양성으로 추정되어 2단계 시험에 제시될 것이다; 및 5) 시험 시료를 다루는 것과 관련된 기록된 문제가 발견된 경우.
(ii) 데이터 분석
최소 3개의 음성 대조군이 각각의 단계에서 시험되었다. 음성 대조군에 대한 개개의 값은 "유동 컷 포인트(floating cut point)"를 계산하기 위해 사용되었다. 유동 컷 포인트"는 각각의 플레이트로부터, 3개의 음성 대조군의 기하평균값을 1.14(검증(validation) 데이터의 변수분석(parametric analysis)으로부터 유래됨)의 상수 정규화 인자(constant normalization factor)를 곱하여 계산되었다. 이 유동 컷 포인트는 "시험 방법 분석 정보 시트"에 의해 결정된 바와 같은 최대값을 가지고 있다. 계산된 컷 포인트가 "시험 방법 분석 정보 시트"에 나열된 최대 컷 포인트보다 큰 경우, 최대 ECL 유닛이 컷 포인트로 사용되었다(최대 ECL 값은 음성 염기 풀(negative base pool)의 각 롯트에 대해 평가되었다.).
컷 포인트에 기초하여, 각 시료가 평가되었다. 컷 포인트 미만의 평균 ECL 값을 갖는 시료는 rHuPH20 항체 음성인 것으로 보고되었다. 컷 포인트와 동일하거나 그 보다 큰 평균 ECL 값을 갖는 시료들은 "추정 양성(Putative Positive)"으로 분류되어 2단계 시험의 대상이 되었다(이는 동시에 수행될 수 있다). 컷 포인트와 동일하거나 이보다 큰 평균 ECL 값을 나타내지만 2단계 시험을 허용하기에는 불충분한 시료 부피를 갖는 시료들은 "추정 양성"으로 보고했지만 추가적인 시험을 하지는 않았다.
D. 2단계 분석
2단계 시험은 비표지된 과량의 rHuPH20의 표지된 rHUPH20에 결합하는 추정 항체(putative antibody)를 억제하는 능력을 시험하였다.
2단계 시험은 StartingBlock T20(TBS) 차단 완충액에서의 초기 1:100 시료 희석인 것을 제외하고 1단계 시험(실시예 5C)에 대한 것과 같이 필수적으로 수행되었다. 2단계에서, 각 시료 및 대조군 시료는 StartingBlock T20(TBS) 차단 완충액(Thermo, catalog # 37543)에 1:100으로 희석되어 전체 200 μL가 되도록 했고 또한 10 ㎍/mL의 rHuPH20을 함유하고 있는 StartingBlock T20(TBS) 차단 완충액(10 ㎍/mL 농도의 rHUPH20를 갖는 StartingBlock T20(TBS) 차단 완충액 8 mL의 마스터 믹스로서 제조)에 1:100으로 희석하여 총 200 μL로 만들었다.
실시예 5C에서와 같이 플레이트를 판독한 후, 다음 등식에 따라 억제 퍼센트를 계산하였다: 억제 퍼센트 = [{(억제되지 않은 시료의 평균 ECL 값) - (억제된 시료의 평균 ECL 값)}/(억제되지 않은 시료의 평균 ECL 값)]*100. 50% 또는 그 이상의 억제를 갖는 것으로 확인된 임의의 시료는 "항체 양성"으로 간주되었고, 3단게 시험을 위해 제시되었다. 50% 또는 그 이상의 억제를 갖으나, 3단계를 계속하는데 불충분한 시료는 "항체 양성"으로서 보고되었으나, 3단계 시험은 시험하지 않았다.
E. 3단계 분석
2단계에서 "항체 양성"으로 확인된 각 시료는 3단계 적정(titration)에 제시되었다. 3단계 적정과 시험은 시료가 StartingBlock T20(TBS) 차단 완충액에 처음에 1:100으로 희석되고 그리고나서 정상 혈장(음성 대조군에 이용된 것과 같은; 음성 염기 풀)에 연속적으로(serially)으로 희석된 것을 제외하고 1단계 시험(실시예 5C)에서와 같이 필수적으로 수행되었다.
희석 단계 이후에, 각 희석액은 추가적으로 StartingBlock T20(TBS) 차단 완충액(실시예 5C에서와 같은)에 1:100으로 희석되어 최종 분석 희석액(final assay dilution)이 제조되었다. 상기 분석법은 1단계와 마찬가지로 수행되었다.
플레이트를 판독한 후에, 분석 컷 포인트를 상회하는 평균 ECL 값을 산출한 역가(가장 높은 시료 희석액(the highest sample dilution))를 결정하였다. 평균 ECL 값 ≥ 컷 포인트 및 하나의 값 ＜ 컷 포인트를 갖는 적어도 하나의 희석액을 가진 적정은 "항체 양성"으로 보고되었고 역가는 ECL 값이 컷 포인트를 상회하는 최종 희석액으로서 보고되었다. 평균 ECL 값 ≥ 컷 포인트를 갖는 모든 희석액을 이용한 적정은 "항체 양성"으로 보고되었고 추가 희석액이 시험되었다. 원래의 1:100 희석액(1단계에서와 같이)이 평균 ECL 값 ≥ 컷 포인트을 가지는 적정은 "항체 양성-1:5"로서 보고되었다.
실시예 6
PH20이 근골격계에 미치는 효과
A. 사이노몰거스 원숭이
이 실시예는 사이노몰거스 원숭이에서 PEGPH20을 정맥내 투여(IV administration)한 후에 4주 반복 투여 독성 시험(4-week repeat-dose toxicity study)에서 관찰된 근골격계 관찰을 기술한다. 4개 군의 원숭이(성별 당 4마리 동물인 0.2 mg/kg/투여량(dose)의 PEGPH20를 투여한 군을 제외하고, 성별 당 6마리 동물)은, 4주 연속 기간동안, 각각 주당 2회씩 정맥내로(IV) 비히클(vehicle), 0.2, 2.0 또는 10.5 mg/kg/투여량의 PEGPH20을 투여하였다. 원숭이들은 매주 2회 정맥내 투여를 잘 견뎠으나, 사지 관절(limb joints)에서 변화가 관찰되었다. 원숭이들은 투여량-관련적으로(dose-related) 무릎과 팔꿈치에서 운동 범위 감소를 보였는데, 투여를 중지하자 부분적 내지 완전한 회복을 보였다. 방사선학적 검사에 의해 관찰된 단일 고-투여량 동물에서 연 조직 질량(골격근)이 약간 감소(moderate decrease)되었다. 이는 히알루로난(HA) 및 그것의 관련된 세포외 물을 조직으로부터 제거하는 PEGPH20의 약리학적 효과와 일치되는 것이다. 무릎 관절 또는 골격근의 조직병리학적 변화(연골, 힘줄, 인대)나 움직임의 범위가 제한됨에도 불구하고 무릎 관절 그 자체의 비정상의 방사선 소견과 관련되지 않았다. 이러한 관찰 결과는 PEGPH20 투여가 일시적인 근골격계 효과를 유도 또는 초래한다는 것을 가르킨다.
B. 인간
이 실시예는, 환자에서 혈장에서 증가된 효소 수준을 유지하고 HA 기질의 되돌아오는 것이 제한되도록 하기위해 PEGPH20의 투여량을 증가시키는 것을 평가하는, 임상 연구(1-101 상(Phase))의 결과를 기술한다. 환자 연령의 중간값은 61세(56-86세 범위)였고 조직구종, 대장암, 췌장암, 방광암, 암양종(carcinoid), 난소암을 포함하는 종양 유형을 갖고 있었다. 모든 경우에 있어서, 환자들은 약물과 관련된 통증 연구를 위해서가 아닌 그들의 현재 현재 상태와 관련된 통증 치료 하에서의 프로그램에 들어갔다.
1. 0.05 mg/kg의 PEGPH20의 단일 정맥내 투여(IV)
처음에, 두 환자는 0.05 mg/kg의 PEGPH20을 단일 정맥내 투여를 받았다. 이 실시예는 두 환자 모두는 투여 후 약 6-10 시간에 개시되어 뻣뻣함(stiffness) 및 심각한 근육 및 관절의 고통을 경험하였던 것을 기술한다. 통증은 뻣뻣함, 근육 및 관절의 고통 및 일상 생활의 활동에 지장을 주는 쇠약(weakness)을 경험하는 환자에서 9일 이상 지속되었다.
첫번째 환자는 4.6 mg(0.05 mg/kg)의 PEGPH20(환자 몸무게 92 kg)을 정맥내 투여받았다. 투여 후 약 10시간에, 환자는 보행의 어려움을 갖는, 양측 고관절(bilateral hip) 통증 및 중등도중증 인후염(moderately severe sore throat)을 보고했다. 상기 환자에게는 단일 투여 이후에 연구를 중지했다. 2일차에, 환자는 상하지에서의 근육 및 관절의 고통 및 뻣뻣함으로 인해 침대에서 일어날 수 없다고 보고했다. 팔꿈치 및 손목 관절을 굽히고 펴는 것이 가능하여 상지는 움직일 수 있었으나, 무릎이 강직되어 완전히 펼 수 없었다. 근/관절의 고통(severity)은 3등급(Grade 3)이었다. 3주 동안, 환자는 서서히 꾸준한 근골격 효과의 개선을 보였다.
두번째 환자는 4.9 mg(0.05 mg/kg)의 PEGPH20(환자 몸무게 98 kg)을 정맥 내 투여받았다. 투여 후 4시간에서 8시간 사이에, 환자는 근골격통을 보고했다. 그 환자에게는 단일 투여 이후에 연구를 중지했다. 2일차에, 환자는, 처음에는 무릎에서의, 그러나 또한 모든 근육 및 뼈에서의 심한 통증(profound pain)과 인후통을 보고했다. 근/관절의 고통은 3등급(Grade 3)이었다. 5일차에, 환자는 상태가 나아졌다고 보고했고 9일차에 근골격통이 상당히 개선되었다고 보고했다.
환자의 혈장 시료를 46가지 서로 다른 사이토카인, 케모카인, 급성기 반응물질(acute-phase reactants) 및 기타 혈장 염증 바이오마커의 인간 염증 다중-분석물 프로파일(multi-analyte profile; MAP)을 이용하여 분석하였다. 첫 두 환자의 시료에서는 일반적인 염증 또는 근손상을 제외하면, 주목할만한 발견은 관찰되지 않았다.
2. PEGPH20 0.5 ㎍/kg으로 주 2회 정맥내 투여(IV)
첫 두 환자의 증상의 심각함을 고려하여, 세 번째 환자는 주 2회 0.0005 mg/kg(0.5 ㎍/kg)으로 투여하였다. 1일차에, 이 환자에게 PEGPH20을 0.06155 mg의 투여량으로 정맥 내 투여했다. 3일차에, 이 환자는 1~2 분 동안 그의 오른쪽 종아리에 저절로 해결되는 경련을 경험하였다. 4일차에, 환자는 PEGPH20 0.06155mg의 두 번째 정맥내 투여량으로 투여받았다. 5일차에, 환자는 하루 약 6 내지 8회 발생하여 약 3~4분 동안 지속되는 발, 종아리, 허벅지의 반복적인 근경련을 보고했다. 경련은 전신의 근육통(muscle soreness)과 근압통(muscle tenderness)을 수반했지만 관절에는 영향이 없었다. 환자는 보행이 가능했지만 강직되어 있었다. 근/관절통의 통증은 3등급이었다. 이러한 근골격계 영향으로 인해, 환자는 용량-제한 독성이 발생했고 더이상 PEGPH20 투여를 받지 않았다. 근압통은 21일차에 해소되었고 근경련은 43일차에 해소되었다.
히알루로니다제 효소 수준 및 HA 이화물(catabolite) 수준은 또한 실시예 6B.1에 기술된 바와 같이 측정되었다. 0.5 ㎍/kg의 PEGPH20 투여 후 평균 효소 수준과 HA 이화물 수준에 대한 요약은 또한 실시예 11에 기술할 것이다.
3. 매 21일 마다 0.5 ㎍/kg의 PEGPH20을 단일 정맥내 투여(IV)
또한 추가적으로 3명의 환자에게 매 21일 마다 PEGPH20을 0.5 ㎍/kg의 투여량으로 정맥내 투여하였다. 2명의 환자는 첫 투여 후 21일차에, PEGPH20 0.5 ㎍/kg의 두 번째 투여량으로 투여받았다. 모든 환자들에게서 간헐적인 1등급 또는 일시적인 2등급 근골격계 유해사례(Adverse event)만이 관찰되었다. 용량 제한 독성(dose-limiting toxicities; DLTs)이 이 투여군(dose cohort)에서는 나타나지 않았다. 그럼에도 불구하고, 모든 환자들은 병의 진행으로 인하여 연구를 중단하였다.
히알루로니다제 효소 수준 및 HA 이화물 수준은 실시예 6B.1에 기술된 바에 따라 측정되었다. 0.5 ㎍/kg의 PEGPH20을 투여한 후의 평균 효소 수준 및 HA 이화물 수준에 대한 요약은 또한 실시예 11에 기술된다.
4. 매 21일마다 0.75 ㎍/kg의 PEGPH20을 단일 정맥내 투여(IV)
매 21일마다 0.5 ㎍/kg의 PEGPH20을 정맥 내 투여한 경우 근골격계에 미치는 영향이 약화된 것을 고려하여, PEGPH20 투여량을 증가시켰다. 4명의 환자는 뒤이어 매 21일마다 PEGPH20 0.75 ㎍/kg의 정맥내 투여량으로 투여되었고, 3회 투여까지 포함된 이 군에서의 투약요법은 이 투여량 수준으로 투여되었다. 일반적으로, 간헐적인 1등급 또는 일시적인 2등급 근골격계 부작용만이 관찰되었다. 모든 환자들은 병의 진행으로 인하여 연구를 중단하였다. 각각의 환자의 결과의 요약은 다음과 같다:
첫 번째 환자는 중등도로 분화된 췌장 선암종(moderately differentiated pancreatic adenocarcinoma)을 가졌고, 처음 주기 2 투여 후 2일에 1등급 근골격 통증을 경험하였다. 10일 후에는 그 정도가 3등급으로 높아졌다. 이는 첫 주기 이후에 발생한 것으로 보아 용량-제한 독성으로 생각되지는 않았다. 상기 사례는 총 14일 동안 지속되었고(1등급에서 10일 및 3등급에서 4일) 해소되었다. 이 환자는 병의 진행으로 인해 2주기 후에 연구에서 제외되었다.
이 군(cohort)의 두번째 환자는 소장 장간막 암양종 종양(small bowel mesenteric carcinoid tumor)를 가졌고 주기 1 투여 후에 7일차에 1등급 손경련을 경험하였다. 이 환자는 병의 진행으로 인해 연구를 중단하였다.
세 번째 환자는 난소 선암종(ovarian adenocarcinoma)이 있었고 2등급의 골통 부작용(천골, 흉골, 무릎) 및 근육통을 주기 1 투여 당일에 경험하였다. 근육통은 10일 후에 해소되었으며, 뼈통증은 추가적인 10일 이후에 1등급으로 정도가 경감되었고 총 49일 후에 해소되었다. 이 환자는 3주기 후에 병의 진행으로 인해 연구를 중단했다. 이 환자에서, 암 항원-125(CA-125)가 측정되었는데, 이는 정상 세포에 비해 난소암 세표에서 수준이 증가된 것으로 나타나는 단백질에 해당한다. 특히, CA-125는 103 U/mL(주기 1의 1일차)에서 64 U/mL(주기 1의 15일차)로 감소하였다. 마지막 값을 기록했던 주기 3의 1일차에, CA125는 116.4 U/mL 이었다.
네 번째 환자는 대장 선암종이 있었고 총 2주기를 투여했다. 첫 투여 후 2일에 상부 등에 1등급 근육경련이 발생하였고 하루동안 지속되었다. 양측 손, 무릎 및 어깨에 1등급의 뻣뻣함이 두 번째 투여 9일 후에 나타났다.
히알루로니다제 효소 수준 및 HA 이화물 수준은 실시예 6B.1에 기술한 바와 같이 측정되었다. 0.75 ㎍/kg의 PEGPH20을 투여한 후 평균 효소 수준 및 HA 이화물 수준의 요약은 또한 실시예 11에 기술된다.
5. 매 21일마다 PEGPH20 1.0 ㎍/kg을 단일 정맥내 투여(IV)
PEGPH20 투여량을 33% 증가시켜, 세 환자에게 매 21일마다 1.0 ㎍/kg의 PEGPH20을 정맥 내로 투여했다. 두 환자는 전립선 선암종이 있었고 한 환자는 비소세포 폐암(NSCLC)이 있었다. 용량 제한 독성(DLT)은 보고되지 않았다. 환자 중 한 명만이 근골격계 증상을 보고했는데, 이는 1등급 간헐적인 근경련(늑골, 발, 종아리), 간헐적 관절통 및 늑골통증으로서 분류되었다. 증상은 모두 주기 1 투여 후 1일 내지 3일에 시작되었다. 늑골통증은 9일 후에 해소되었고, 근경련은 43에서 44일 후에, 고관절(hip) 통증은 45일 후에 해소되었다.
6. 매 21일마다 PEGPH20 1.5 ㎍/kg을 단일 정맥내 투여(IV)
전립선 선암종이 있는 한 환자에게 1.5 ㎍/kg의 PEGPH20을 매 21일마다 정맥내로 투여하였다. 용량 제한 독성(DLT)은 보고되지 않았다.
7. 요약
치료를 받은 14명의 환자 중에서, 3명이 부작용으로 인해 처치를 중지했다: 50.0 ㎍/kg을 주 2회 투여받은 환자 한 명은 4등급의 근골격통로 인하여, 50.0 ㎍/kg을 주 2회 투여받은 환자 한명은 3등급의 근골격통으로 인하여, 0.5 ㎍/kg을 21일 주기로 투여받은 환자 한 명은 3등급의 근골격통으로 인하여. 0.5 ㎍/kg을 21일 주기로 투여받은 환자 한 명은 2주기의 치료를 마쳤고 그리고 나서 병의 진행으로 인해 처치를 중단했다. 다른 모든 환자들은 병의 진행으로 인해 연구를 중단했다.
실시예 7
비글견에서 근골격계에 대한 PEGPH20의 효과
A. 비글견에서의 내성 및 약동학 투여량 범위 연구
원숭이 및 인간에서 정맥 내로 투여된 PEGPH20에 대해 관찰된 반응을 고려하여, 이러한 근골격계 효과에 대한 비임상적 모델이 시도되었다. 유순한 성격과 절차 및 평가시에 핸들링이 쉽기 때문에, 비글견(Marshall Farms USA, Inc., North Rose, NY의 개로부터 기원된 BioTox Sciences 군의 개를 사용하는 BioTox Sciences Contract Research Organization, San Diego, CA)이 PEGPH20 투여에 대한 반응으로 사람에서 관찰된 것과 비슷한 근골격계 증상의 모델이 될 수 있는지 그 능력을 평가하였다. 비글견에서 PEGPH20을 단일 정맥내 투여했을 때의 내성 및 약동학적 연구가 평가되었다. 투여량 범위-발견 연구(dose range-finding study)가 3040 내지 47500 유닛/kg(0.08 내지 1.25 mg/kg)의 PEGPH20의 정맥내 투여량을 평가하기 위하여 수행되었다.
1일차에, 수컷 비글견 한마리는 3040 유닛/kg(0.08 mg/kg)의 초기 투여량으로 PEGPH20을 요측피정맥의 경피 바늘 천자를 통한 5 mL의 볼루스 주사(bolus injection)로 투여받았다. 상기 개는 2일차까지는 외관상 정상으로 보였으나 촉진(palpation)시 목, 등, 사지의 근육의 강직 및 운동성(걷거나 서 있는 능력의 감소)가 관찰되었다. 투여 후 48 시간에 이 동물의 운동성이 개선되었고, 3일차에는 거의 회복된 것으로 나타났다. PEGPH20에 대해 이러한 심한 근골격계 반응이 나타나는 것에 기초하여 투여량 증가 연구는 중단되었다.
B. 비글견에서의 정맥 내 PEGPH20 투여에 대한 근골격계 반응
PEGPH20에 대한 근골격계 반응을 확인하고 더 평가하기 위하여, 3마리의 수컷 비글견에 두 마리는 정맥 내로(IV), 한 마리는 피하로(SC), PEGPH20 80 ㎍/kg(3040 U/kg)을 투여하고, 근골격계 반응에 대해 시각적으로 관찰하였다(표 6). PEGPH20은 5 mL/동물(마리)로 정맥내 또는 피하 볼루스 주사로 투여되었다. 정맥내 투여는 요측피정맥의 경피 바늘 천자를 통하여 이루어졌고, 피하 투여는 어깨 근처의 등측 영역(dorsal back region)에 경피 바늘 천자로 이루어졌다. 투여 23 시간 경과 후(2일차), 세 마리 모두 운동성 감소(걷거나 서 있는 능력의 감소), 전반적인 활동 감소 및 촉진시 목, 등, 사지의 근육이 강직된 것으로 나타났다. 4일차에, 각 근골격계 반응은 해소되었다.
Figure 112017000450674-pat00012
이 연구는 실시예 7A에 기술된 연구에서 밝힌 근골격계 연구결과들(findings)를 확인했고 비글견이 사람에서 관찰되는 것과 유사한 PEGPH20에 의한 근골격계 효과에 대한 비임상적 모델임을 확립했다.
C. 비글견에서의 반복적 PEGPH20 투여
PEGPH20의 후속 용량(subsequent doses)에 개들을 적응시키기 위한 PEGPH20의 반복 투여 가능성을 조사하기 위하여, 실시예 7B의 투여받은 세 마리 개들에 표 7에 나타난 스케줄에 따라 1520 내지 60800 유닛/kg(0.04 내지 1.6 mg/kg)으로 PEGPH20 투여량을 매일 상승시키면서 요측피정맥을 통해 정맥내 투여(IV) 또는 어깨 근처의 등측 영역(dorsal back region)에 경피 바늘 천자를 통해 피하내(SC)로 재투여되었다.
Figure 112017000450674-pat00013
4일에서 6일차에, 세 마리 개 모두 운동성 감소(걷거나 서는 능력의 감소), 전체적인 활동 감소, 촉진시 목, 등, 사지말단의 근육 뻣뻣함을 포함하는 PEGPH20에 대한 근골격계 반응을 나타냈다. 4일에서 6일차에 근골격계 반응의 개시가 1일차(23시간)에 보인 근골격계 반응보다 더 빨랐으나(약간의 시간), 반응의 심각성은 4일 내지 6일에 감소하였다. 또한, 반응으로부터의 회복도 또한 1일차에 관찰된 것보다(2일) 4일에서 6일차에 더 신속하게(12 시간까지) 이루어졌다. 7일에서 9일차에 3마리 개들 모두에서 근골격계 반응이 관찰되지 않았다. 12일차에, 정맥내 투여(IV)를 투여받은 한 마리 개(개 288)는 60800 유닛/kg(1.6 mg/kg)을 투여받은 후 2시간에 감소된 운동성을 나타냈고 투여 후 10시간 이내에 완전한 회복을 보였다. 동일한 개는 또한 투여 후 10일에 구역질(retching)을 나타냈고, 11일 및 12일차에 구역질(retching) 및 구토(vomiting)를 나타냈다.
D. 비글견에서 PEGPH20의 면역원성 효과
휴약 후 수회 반복 투여는 상기 실시예 7C로부터의 3마리 수컷 비글견에서 시험되었다. 17일, 26일 또는 33일차에, 한 마리 개는 표 8의 스케줄에 따라 요측피정맥의 경피 천자 바늘을 통해 5 mL의 볼루스 주사(bolus injection)로 PEGPH20을 3040 유닛/kg(0.08 mg/kg) PEGPH20을 투여받았다.
Figure 112017000450674-pat00014
투여 직후에, 세 마리 개 각각이 전신적 아나필락시형-유사(anaphylactoid-like) 반응을 경험하는 것을 관찰하였다. 이 반응은 배뇨, 배변, 신체 활동 감소, 이동 장애(difficulty ambulating), 구역질 및/또는 구토, 및 호흡 빈도 및 심도의 증가를 포함했다. 10 분 내지 25 분 내에 두드러지게 회복이 일어났고 투여 후 24 시간 내에 완전한 회복이 이루어졌다. 투여 후 어떠한 후속 시점에서 동물 운동성, 활동성, 근육 긴장도에는 변화가 관찰되지 않았다(다음 투여까지, 동물들은 하루에 두 번 관찰되었다.).
상기 언급된 반응이 PEGPH20(인간 단백질) 투여에 대한 면역학적 반응에 의해 야기될 가능성 때문에, 17, 26 또는 33일에 전-투여(pre-dose) 채혈로부터의 혈청, 및 51일에 3마리 개 모두로부터의 채혈로부터의 혈청은 재조합 인간 히알루로니다제(rHupH20)에 대한 반응성을 시험하여 개들의 PHGPH20에 대한 체액의 면역 반응이 올라갔는지 여부를 확립했다.
17, 26, 33일차에, 그날 처리될 개로부터 투여 전에(1일차-12일차에 증가되는 PEGPH20 노출의 12일 후에) 혈액을 채취하였다. 혈액은 또한 51일차에 3마리 개 모두로부터 혈액이 채취되었다. 혈액으로부터 분리된 혈청은 상기 실시예 5에 기술된 바와 같이 항-rHuPH20 항체의 존재 여부를 확인하기 위해 시험하였다. 분석 결과는 표 9에 나타내었다. 이 결과는 세 마리 개 모두는 PEGPH20의 단백질 구성요소(component), rHuPH20에 대한 강한 항체 반응이 올라간 것을 확인하였고, 이는 PEGPH20이 비글견에 있어서 면역원성이라는 것을 가르킨다. PEGPH20의 단백질 구성요소는 인간 단백질이기 때문에, 이 연구결과는 예측되지 않는 것은 아니다.
Figure 112017000450674-pat00015
비글견에서 항체 반응이 PEGPH20의 잠재적인 제거 또는 중화를 초래하는 지 여부를 시험하기 위하여, PEGPH20의 재투여의 골격근으로부터의 히알루로난을 격감시키는 능력을 시험하였다.
동일한 세 마리 개(989, 153 및 288)에 59일째에 PEGPH20 3040 유닛/kg(0.08 mg/kg) 정맥내 투여(IV)로 처리하였다. 투약 직후, 한 마리(개 #288)가 구역질을 보였으나 5 분쯤 후 완전히 회복되었다. 근골격계 효과가 어떠한 후속 시점에서 관찰되지 않았다.
투여 후 24시간(60일차), 각각의 세 마리 처리된 개 및 비처리된 대조군 비글견으로부터 골격근 생검을 하였다. 내측 반건양근/내측 막근을 생검의 대상으로 하였다. 생검 부위는 전기 이발기를 이용하여 제모하고 클로르헥시딘(Chlorhexidine) 또는 포비돈-아이오딘(Povidine-Iodine) 용액으로 문질러 씻었다. 국소 무통증(analgesia)을 위해 생검 부위에 부피바카인 또는 리도카인(2-3 mg/kg)을 피하로(SC) 주사하였다. 근육 생검물은 2 mm 지름의 생검 바늘을 사용하여 채취하였다. 거즈(gauze) 스폰지를 약간 압력을 가하며 적용하여 지혈하였다. 메타캄(멜록시캄) 0.2 mg/kg을 피하로(SC) 주사하여 고통을 조절하였다. 생검 시료는 에펜도르프(Eppendorf) 튜브 또는 등가물에 10% 중성 완충 포르말린(neutral-buffered formalin; NBF) 약 200 μL와 함께 두었다.
생검된 조직 시료를 고도로 특이적인 조직화학적 염색 방법을 이용하여 조직 HA에 대해 염색하였다. 이 방법을 이용하여, 10% NBF에 48 시간 동안 고정된 조직 생검물은 파라핀에 포매되고, 절편화되고 비오틴화된 HA-결합 단백질(HABP; Seikagaku, Japan)을 이용하여 HA에 대해 탐색하였고, 그리고나서 검출을 위해 FITC-표지된 스트렙타비딘(Vector Labs, 캐나다)으로 조사하였다. 세포핵은 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 시약으로 대조염색되었다. 그 후 점 이미지 프로그램(Spot imaging program)(Diagnostic Instruments, Inc)이 설치된 Zeiss 현미경(Thornwood, NY)을 이용하여 현미경 사진을 찍었다.
절편에서의 히알루로난 발현은 녹색 형광강도의 수준에 의해 시각적으로 평가되었다. PEGPH20 처리된 동물 세 마리 모두로부터 얻은 골격근 시료의 세포주위 기질(pericellular matrix)의 히알루로난 염색이 비처리 대조군 동물로부터 얻은 조직 시료에 있어서의 히알루로난 염색과 시각적으로 동일하게 높은 강도 염색이 되었고, 이는 이들 동물에 있어서 PEGPH20 처리가 골격근 시료에 있어서의 세포외 히알루로난을 제거하지 않는다는 것을 밝혔다. 이는 반복된 PEGPH20 투여에 대한 반응으로 비글견에 생성되는 혈청 항-rHuPH20 항체가, PH20를 중화하는 활성을 가질 수 있음을 암시한다.
실시예 8
비글견에서 PEGPH20에 대한 덱사메타손의 영향
비글견은 PEGPH20 투여에 대한 반응으로, 개시 및 해소에 대한 그들의 외형(presentation) 및 시점(timing)의 관점에서, 인간에서 보고된 것과 유사한 근골격계 관찰을 나타내는 종으로서 확인되었다. 따라서, 비글견이 PEGPH20에 대한 인간의 근골격계 반응의 모델 및 증상의 치료를 시험하기 위한 모델로서 추가적으로 연구되었다.
A. 덱사메타손 전처치 요법(premedication regimen)
덱사메타손 전처치 요법을 최적화하기 위한 연구가 수행되었다.
한 연구에서, 4마리의 순수한(naive) 수컷 비글견에 PEGPH20 투여 당일에 1일 2회 덱사메타손을 4 mg/투여로 경구투여하였다. 첫 덱사메타손 투여는 PEGPH20을 정맥 내로 투여하기 직전에 경구로 투여되었다. 두 번째 덱사메타손 투여는 ~8시간 후에 경구로 이루어졌다. 1일차에, 개 한마리에 덱사메타손 투여 후에 3040 U/kg(0.08 mg/kg)의 PEGPH20을 투여하였다. 24 시간 후에(2일차), 두 번째 개에 덱사메타손 투여 후에 5700 U/kg(0.15 mg/kg)의 PEGPH20을 투여하였다. 24 시간 후에(3일차), 세 번째 개에 덱사메타손 투여 후에 11400 U/kg(0.3 mg/kg)의 PEGPH20을 투여하였다. 24 시간 후에(4일차), 네 번째 개에 덱사메타손 투여 후에 38000 U/kg(1.0 mg/kg)의 PEGPH20을 투여하였다. 전-PEGPH20 투여(pre-PEGPH20 administration) 및 0.5 시간, 4 시간 및 24 시간 후-PEGPH20 투여(0.5 hr, 4 h and 24 h post-PEGPH20 administration)에 채혈하였다. 전-투여 및 0.5, 4, 8 및 24 시간 후-투여에 동물들의 근골격계 효과를 관찰하였다. 네 마리 개는 시험된 어떠한 투여 수준 어떠한 시점에서도 PEGPH20에 대한 근골격계 반응을 나타내지 않았는데, 이는 덱사메타손 전처치가 PEGPH20의 근골격계 효과 발달(development)을 차단하는 것을 암시한다.
B. PEGPH20에 의해 유도된 근골격계 관찰에 대한 덱사메타손의 효과
PEGPH20의 근골격계 효과를 개선하는 덱사메타손의 능력을 추가적인 약리학적 연구를 통해 확인하였다. 4개의 처리군(각각은 3마리의 비글견을 가짐) 및 처리일은 하기 표 10에 나타내었다. PEGPH20은 연구 일 1일, 2일, 및/또는 5일에 요측피정맥의 경피 바늘 천자를 통해 5 mL 볼루스 주사로 정맥내 투여되었다. 덱사메타손은 PEGPH20 주사 직전 및 주사 후 약 8 시간 후에 경구로 투여되었다. 재투여를 하지 않은 PEG20 단독 처리군을 제외하면, 모든 동물들은 첫 주입 후 3일에 재투여되었다.
Figure 112017000450674-pat00016
PEGPH20을 처음 투여한 직후 및 투여 후 0.5, 2, 4, 7, 10, 12, 16, 20, 24, 48, 및 72 시간에 개들에게서 근골격계 반응을 관찰하였다. 두 번째 투여 후에, 두번 째 투여 후 0.5, 2, 4, 7, 10, 12, 16, 20, 24, 48, 72, 96 및 120 시간에 동물들을 관찰하였다. PEGPH20을 1회만 투여한 동물들은 투여 후 96 시간, 120 시간, 6, 7, 8 및 9일에 평가되었다.
PEGPH20 만을 투여받은 비글견(11400 유닛/kg; 0.3 mg/kg)에서 운동성 감소(걷거나 서는 능력의 감소), 전반적인 활동 감소 및 촉진시 목, 등, 사지의 근육 뻣뻣함으로 특지어지는 중등도 내지 고도의 근골격계 반응이 관찰되었다. 일반적으로, 이러한 근징골격계 관찰의 개시는 PEGPH20 투여 약 10 시간 후에 처음 관찰되어, PEGPH20 투여 후 12-20 시간 사이에 심각성이 점진적으로 증가하고, PEGPH20 투여 후 72 시간 후가 되면 완전히 해소되었다. 덱사메타손 전처리는 PEGPH20을 0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg 투여한 개에서 모든 관찰시점에서 이러한 근골격계 증상을 완화시켰다.
C. PEGPH20의 히알루로난 제거에 덱사메타손이 미치는 영향
덱사메타손 전처리가 PEGPH20에 의해 유도된 근골격계 반응을 개선시키는 것을 고려하고, 덱사메타손의 PEGPH20에 의한 히알루로난의 제거에 대한 효과를 골격근 및 피부 조직에서 시험하였다.
표 11에 서술한 각 처리군의 개 세 마리 각각으로부터, PEGPH20을 처음 정맥내 투여하기 24 시간 전 및 투여 24 시간 후에 골격근과 피부 조직을 생검하였다. 내측 반건양근/내측 막근(들)을 생검의 대상으로 하였다. 생검 부위는 전기 이발기를 이용하여 제모하고 클로르헥시딘 또는 포비돈-아이오딘 용액으로 문질러 씻었다. 국소 무통증(analgesia)을 위해 생검 부위에 부피바카인 또는 리도카인(2-3 mg/kg)을 피하로(SC) 주사하였다. 근육 생검물은 2 mm 지름의 생검 바늘을 사용하여 채취하였다. 거즈(gauze) 스폰지를 약간 압력을 가하며 적용하여 지혈하였다. 메타캄(멜록시캄) 0.2 mg/kg을 피하로(SC) 주사하여 고통을 조절하였다. 생검 시료는 에펜도르프(Eppendorf) 튜브 또는 등가물에 10% 중성 완충 포르말린(neutral-buffered formalin; NBF) 약 200 μL와 함께 두었다.
생검된 조직 시료를 조직 HA에 대해 염색하였다. 간단하게 설명하면, 10% NBF에 48 시간 동안 고정된 조직 생검물은 파라핀에 포매되고, 절편화되고 비오틴화된 HA-결합 단백질(HABP; Seikagaku, Japan)를 이용하여 HA에 대해 탐색하였고, 그리고나서 검출을 위해 FITC-표지된 스트렙타비딘(Vector Labs, 캐나다)으로 조사하였다. 세포핵은 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 시약으로 대조염색되었다. 그 후 점 이미지 프로그램(Spot imaging program)(Diagnostic Instruments, Inc)이 설치된 Zeiss 현미경(Thornwood, NY)을 이용하여 현미경 사진을 찍었다.
절편에서의 히알루로난 발현은 녹색 형광강도의 수준에 의해 시각적으로 평가되었다. 비히클 대조군(API 완충액) 처리된 동물들로부터의 골격근 및 피부 조직은 전-처리(pre-treatment) 및 후-처리(post-treatment) 시료들 모두에 있어서의 밝게 염색된 세포주위 히알루로난의 유사한 패턴을 보였다. PEGPH20 단독(0.3 mg/kg), PEGPH20(0.3 mg/kg) + 덱사메타손(4 mg/dose(투여) BID; 1일 2회) 및 PEGPH20(1.0 mg/kg) + 덱사메타손(4 mg/dose BID; 1일 2회)를 처리한 동물로부터의 골격근 및 피부 조직 각각이 전-처리 시료들에 있어서 밝게 염색된 세포주위 히알루로난이 나타났고, 이들 처리군으로부터의 후-처리 시료는 사실상 히알루로난 염색이 되지 않는 것으로 나타났다. 이러한 연구결과는 덱사메타손이 PEGPH20의 히알루로난 분해 활성을 억제하지 않음을 시사한다.
D. 덱사메타손이 PEGPH20 약동학에 미치는 효과
덱사메타손이 PEGPH20의 약동학에 미치는 효과를 시험하기 위해서, 상기 표 10에 있어서, 실시예 8B로부터의 각각의 개들로부터 혈액 시료를 채취하였다. 하기 표 11에 따라 PEGPH20 또는 비히클 대조군으로 투여한 후 혈액을 채취하였다.
Figure 112017000450674-pat00017
혈장 히알루로니다제 활성은 실시예 4B에 기술된 비오틴화된 히알루론산 분석법을 이용하여 각각의 시점에서 측정되었다. 채취한 혈액 시료로부터 혈장을 준비하여 분석 전까지 －70℃에서 동결 보관하였다. 분석법을 위한 최저정량 한계는(lower limit of quantitation)는 2.90 U/mL이었다. 혈장 농도 대 시간 데이터는 WinNonlin Pro 버전 5.1(Pharsight Corp., Mountain View, CA)을 사용하여 비구획 및 구획 방법에 의해 분석되었다. 이로부터 얻은 PK 파라미터는 AUC, Cmax, 및 Tmax를 포함한다. AUC 및 Cmax에 의해 정의되는 전신적 노출은 개에게 정맥내 투여되었을 때 PEGPH20 단독 투여군과 PEGPH20 + 덱사메타손 투여군 간에 유사하게 나타났고 세 PEGPH20 처리군으로부터의 일반적 PK 프로파일도 유사하여 덱사메타손이 PEGPH20의 약동학에 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있었다.
HA 이화물은 실시예 6에 기술된 방법으로 측정되었다. 결과는 PEGPH20에 의한 투여 후에 HA 이화물의 출현을 보여주며, 이는 덱사메타손의 존재에 의해 영향을 받지 않았다.
실시예 9
덱사메타손이 인간 전립선암 또는 인간 췌장암 이종이식 모델에서 PEGPH20의 항종양 활성 또는 히알루로난 분해 활성에 미치는 효과
덱사메타손이 PEGPH20의 항종양 또는 히알루로난 분해 활성을 저해하는지 여부를 확인하기 위하여, 인간 전립선암 또는 인간 췌장암 이종이식 모델을 평가하였다.
A. PC3 전립선암 이종이식 모델
1. PC3 전립선암 이종이식 모델에서의 항종양활성
PC3 전립선암 세포주로부터 암세포는 약 80% 컨플루언시(confluency)가 되도록 키운 후 트립신을 가하고, 수집하고, HBSS(행크스 균형 염 용액(Hank's balance salt solution), Mediatech Inc.)에 1회 세척한 후, 동물에 접종하기 전에 HBSS 내의 50% Matrigel® 용액에서 2 ×107 세포/mL로 얼음 위에서 재현탁했다. 무흉선 수컷 누드 마우스(Nu/Nu(Ncr); 타코닉 농장(Taconic Farms); 평균 몸무게 ~20 g)에 왼쪽 뒷다리에(경골 골막(tibia periosteum)에 인접한), 경골 주위로 이 세포 현탁액 0.05mL를 접종하였다. 동물에 있어서 이식물(implants)은 주당 2회 평가하였고 평균 종양 부피가 약 500 mm3(－2일차(Day -2); 표 12)로 자라도록 두었다. 실제 종양 부피는 2 수직축 차원(2 perpendicular axial dimension)을 이용하는, VisualSonic Vevo 770 고해상도 초음파를 이용하여 관찰하였다.
동물들은 무작위적으로 분류되어 군당 8마리(6마리 + 2마리의 위성 마우스(satellite mice))씩 6개의 군으로 나뉘어졌다. 처리군들은 비히클(API 완충액), PEGPH20(157,500 유닛/kg, 4.5 mg/kg), 저용량 덱사메타손(1.25 mg/kg), 고용량 덱사메타손(5 mg/kg), PEGPH20 (4.5 mg/kg) + 저용량 덱사메타손(1.25 mg/kg) 및 PEGPH20(4.5 mg/kg) + 고용량 덱사메타손(5 mg/kg)이었다. PEGPH20(또는 비히클)의 정맥내 주사의 투여량(dose) 및 빈도(frequency)는, 157,500 유닛/kg 또는 약 4.5 mg/kg씩, 0일차로부터 시작하여 매 세번째 날(0, 3, 6, 9, 12일차)에 0.1 mL의 투여 부피로 총 5 주사(Q3Dx5)이었다. 이러한 투여량 및 빈도 요법(dosing and frequency regimen)은 이전에 이종 이식 종양 성장을 약 34-70%까지 억제하는 것을 보였다. 덱사메타손 복강내 주사의 투여량 및 빈도는 저용량에서 1.25 mg/kg, 고용량에서 5 mg/kg, 0.1mL의 투여 부피로 13일까지(QDx13), 하루 1회이었다.
모든 마우스의 종양 부피는 VisualSonic 초음파 시스템을 이용하여 이미지를 캡처하고 초음파 이미징 소프트웨어 프로그램을 사용하여 종양 부피를 계산함으로써 전-처리 -2일(평균 종양 부피 ~500 mm3), 및 1, 6, 9, 13, 16 및 20일에 측정되었다(표 12). 종양 성장 억제 퍼센트(% TGI)는 다음 등식에 의해 계산되었다.
[1-(Tn-T0) / (Cn-C0)] x 100 %
상기 등식에서, Tn은 처리군에서 처리 후 지시된 시점에서 각 "n" 일차에 있어서 평균 종양 부피를 의미한다; T0은 처리 전 0일차에 처리군의 평균 종양 부피를 의미한다; Cn은 대조군에서 비히클로 처리한 후에 지시된 시점에서 각 "n" 일차에 있어서 평균 종양 부피를 의미한다; 또한 C0은 처리 전 0일차에서 대조군의 평균 종양 부피를 의미한다.
표 12의 데이터는 저용량을 투여한 경우나 고용량을 투여한 경우 모두 덱사메타손만을 투여한 경우 종양 성장 억제에 효과가 없음을 나타낸다. 이 결과는 PEGPH20만을 투여한 군 대 PEGPH20 및 덱사메타손을 투여한 군에서 종양 성장에 미치는 효과가 유사하다는 것을 보여준다. 따라서, PC3 전립선암 이종이식 모델로부터의 데이터는 덱사메타손이 PEGPH20이 종양 성장 억제에 갖는 효과를 저해하지 않는다는 것을 보여준다.
Figure 112017000450674-pat00018
2. PEGPH20 혈장 효소에 대한 덱사메타손의 효과
13일차에 최종 PEGPH20 및 덱사메타손을 투여한지 24 시간 경과 후에 대조군 및 처리군의 PC3 종양이 있는 위성 마우스 각 개체에서 혈장 시료를 채취하였다. 혈장 PEGPH20 히알루로니다제는 실시예 4B에 기술된 비오틴화된 히알루론산 분석법을 이용하여 평가되었다. PEGPH20, PEGPH20 + 저용량 덱사메타손, PEGPH20 + 고용량 덱사메타손을 투여받은 동물군 모두 유사한 혈장 히알루로니다제 활성을 보였는데, 이는 덱사메타손이 마우스 혈장에서 PEGPH20 활성의 수준을 저해하지 않는다는 것을 나타낸다.
혈장 시료는 대조군 및 각각의 처리군에서 가용성 혈장 히알루로난을 측정하는 데에 추가적으로 사용되었다(R&D Systems Catalog DY3614; ELISA assay). 비히클 대조군에서, 혈장 히알루로난 수준은 800,000 내지 900,000 ng/mL에 이르렀다. 저용량 덱사메타손 처리군은 혈장 히알루로난 농도에 있어서 높은 변화 범위를 가졌으나(고농도로 나타난 경우 1건 및 저농도로 나타난 경우 1건이 있었으나, 둘 다 측정은 가능했다), 고용량 덱사메타손 처리군은 23,000 내지 42,000 ng/mL 사이의 범위의 혈장 히알루로난 수준을 가졌다. PEGPH20 단독 또는 PEGPH20 + 덱사메타손(고용량 또는 저용량 중 어느 하나)을 처리한 마우스는 검출가능한 히알루로난을 가지지 않았고(정량 한계 미만), 이는 덱사메타손이 마우스에서 PEGPH20 혈장 활성을 변경시키지 않는다는 것을 입증한다.
따라서, 이 결과는 덱사메타손이 혈장에서의 PEGPH20 활성에 영향을 주지 않는다는 것을 보여준다.
3. PC3 전립선암 이종이식 모델에서 PEGPH20 히알루로난 분해활성에 있어서의 덱사메타손의 효과
상기 실시예 9A.1에서 6개의 처리군 모두로부터의 두 마리 위성 마우스로부터의 종양 조직은, 14일차에 조직 생검에 의하여 수확하였고, 히알루로난의 존재에 대하여 염색하였다. 종양 생검물은 10% NBF에 48 시간 동안 고정시켰고, 파라핀에 포매한 후, 절편화하였다. 비오틴화된 HA-결합 단백질(HABP)을 이용하여 HA에 대해 탐색하였고, 그리고나서 검출을 위해 FITC-표지된 스트렙타비딘으로 조사하였다. 세포핵은 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 시약으로 대조염색되었다. 그 후 점 이미지 프로그램(Spot imaging program) (Diagnostic Instruments, Inc)이 설치된 Zeiss 현미경(Thornwood, NY)을 이용하여 현미경 사진을 찍었다.
절편에서의 히알루로난 발현은 절편에서의 녹색 형광강도의 수준에 의해 평가되었다. 유의적인 세포주위 히알루로난 염색이 비히클, 고용량 덱사메타손 또는 저용량 덱사메타손을 처리한 동물로부터 취한 종양 절편에서 나타난 반면, 세포주위 히알루로난 염색은 PEGPH20 단독, PEGPH20 + 저용량 덱사메타손, 또는 PEGPH20 + 고용량 덱사메타손을 처리한 동물로부터 취한 종양절편에서 거의 완전하게 부존재하였다. PEGPH20을 단독으로 처리한 동물로부터의 조직 시료에 있어서 히알루로난 염색은, PEGPH20을 저용량 또는 고용량의 덱사메타손 중 어느 하나와 함께 처리한 동물로부터의 조직 시료에 있어서의 히알루로난 염색과 실질적으로 동일했는데, 이는 덱사메타손이 세포주위 히알루로난의 제거에 대한 PEGPH20의 활성을 변경시키지 않는다는 것을 의미한다.
B. BxPC3 췌장암 이종이식 모델
덱사메타손이 PEGPH20의 항종양 또는 히알루로난 분해 활성에 영향을 주는지 여부를 더 시험하기 위하여, 인간 췌장암 이종이식 모델을 평가하였다.
1. BxPC3 췌장암 이종이식 모델에서의 항종양 활성
BxPC3 췌장암 세포주로부터 암세포는 약 80% 컨플루언시(confluency)가 되도록 키운 후 트립신을 가하고, 수집하고, HBSS(행크스 균형 염 용액(Hank's balance salt solution), Mediatech Inc.)에 1회 세척한 후, 동물에 접종하기 전에 HBSS 내의 50% Matrigel® 용액에서 2 ×107 세포/mL로 얼음 위에서 재현탁했다. 무흉선 암컷 누드 마우스(평균 몸무게 ~20 g)에 왼쪽 뒷다리에(경골 골막(tibia periosteum)에 인접한), 경골 주위로 세포 현탁액 0.05mL를 접종하였다. 동물에 있어서 종양은 주당 2회 평가하였고 평균 종양 부피가 약 250 mm3(－1일차(Day -1); 표 13)로 자라도록 두었다. 실제 종양 부피는 VisualSonic Vevo 770 고해상도 초음파를 이용하여 결정하였다.
동물들은 무작위적으로 분류되어 군당 8마리(6마리 + 2마리의 위성 마우스)씩 6개의 군으로 나뉘어졌고, 비히클(API 완충액), PEGPH20(157,500 유닛/kg, 4.5 mg/kg), 저용량 덱사메타손(1.25 mg/kg), 고용량 덱사메타손(5 mg/kg), PEGPH20(4.5 mg/kg) + 저용량 덱사메타손(1.25 mg/kg) 및 PEGPH20(4.5 mg/kg) + 고용량 덱사메타손(5 mg/kg)이 처리되었다. PEGPH20(또는 비히클)의 정맥내 주사의 투여량(dose) 및 빈도(frequency)는, 157,500 유닛/kg 또는 약 4.5 mg/kg씩, 0일차로부터 시작하여 0, 3, 7, 10, 13 및 17일차에 0.1 mL의 투여 부피로 총 6 주사이었다. 덱사메타손 복강내 주사의 투여량 및 빈도는 저용량에서 1.25 mg/kg, 고용량에서 5 mg/kg, 0.1 mL의 투여 부피로 17일까지(QDx17), 하루 1회이었다.
모든 마우스의 종양 부피는 VisualSonic 초음파 시스템을 이용하여 이미지를 캡처하고 초음파 이미징 소프트웨어 프로그램을 사용하여 종양 부피를 계산함으로써 전-처리 －4일 및 －1일(평균 종양 부피 ~250 mm3), 및 4, 7, 11, 14 및 17일에 측정되었다(표 13). 종양 성장 억제 퍼센트(percent tumor growth inhibition(%TGI)은 실시예 9A에 기술된 대로 계산되었다.
하기 표 13의 데이터는 결과를 요약한다. 상기 결과는 덱사메타손을 고용량 또는 저용량으로, PEGPH20과 함께 투여되었을 때의 종양 부피에 대한 영향은 PEGPH20이 단독으로 투여되었을 때의 결과와 유사하였다는 것을 보여준다. BxPC3 췌장암 이종이식 모델로부터 얻은 데이터는 덱사메타손이 PEGPH20에 의해 매개되는 종양 성장 억제를 저해하지 않는다는 것을 보여준다.
Figure 112017000450674-pat00019
2. PEGPH20 혈장 효소에 대한 덱사메타손의 효과
17일차에 최종 PEGPH20 및 덱사메타손을 투여한지 24시간 경과 후에 대조군 및 처리군의 PC3 종양이 있는 위성 마우스 각 개체에서 혈장 시료를 채취하였다. 혈장 PEGPH20 히알루로니다제 활성은 실시예 4에 기술된 방법을 이용하여 측정하였다. PEGPH20, PEGPH20 + 저용량 덱사메타손, PEGPH20 + 고용량 덱사메타손을 투여받은 동물군 모두 유사한 혈장 히알루로니다제 활성을 보였는데, 이는 덱사메타손이 마우스 혈장에서 PEGPH20 활성의 수준을 저해하지 않는다는 것을 알 수 있다.
혈장 시료는 대조군 및 각각의 처리군에서 가용성 혈장 히알루로난을 측정하는 데에도 추가적으로 사용되었다(R&D Systems Catalog DY3614; ELISA assay). 비히클 대조군에서, 혈장 히알루로난 수준은 2,000 내지 4,000 ng/mL에 이르렀다. 고용량 덱사메타손 처리군은 혈장 히알루로난 농도에 있어서 높은 변화 범위를 가졌으나(고농도로 나타난 경우 1건 및 저농도로 나타난 경우 1건이 있었으나, 둘 다 측정은 가능했다), 저용량 덱사메타손 처리군은, 대조군과 유사하게, 2,000 내지 4,000 ng/mL 사이의 범위의 혈장 히알루로난 수준을 가졌다. PEGPH20 단독 또는 PEGPH20 + 덱사메타손(고용량 또는 저용량 중 어느 하나)를 처리한 마우스는 검출가능한 히알루로난을 가지지 않았고(정량 한계 미만), 이는 덱사메타손이 마우스에서 PEGPH20 혈장 활성을 변경시키지 않는다는 것을 입증한다.
BxPC3 췌장암 이종이식 모델로부터의 데이터는 덱사메타손이 또한 이 모델에서 혈장에서의 PEGPH20 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
3. BxPC3 췌장암 이종이식 모델에서 PEGPH20 히알루로난 분해활성에 있어서의 덱사메타손의 효과
상기 실시예 9B.1에서 6개의 처리군 모두로부터의 두 마리 위성 마우스로부터의 종양 조직은, 18일차에 조직 생검에 의하여 수확하였고, 히알루로난의 존재에 대하여 염색하였다. 종양 생검물은 10% NBF에 48시간 동안 고정시켰고, 파라핀에 포매한 후, 절편화하였다. 비오틴화된 HA-결합 단백질(HABP)를 이용하여 HA에 대해 탐색하였고, 그리고나서 검출을 위해 FITC-표지된 스트렙타비딘으로 조사하였다. 세포핵은 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 시약으로 대조염색되었다. 그 후 점 이미지 프로그램(Spot imaging program) (Diagnostic Instruments, Inc)이 설치된 Zeiss 현미경(Thornwood, NY)을 이용하여 현미경 사진을 찍었다.
절편에서의 히알루로난 발현은 절편에서의 녹색 형광강도의 수준에 의해 평가되었다. 유의적인 세포주위 히알루로난 염색이 비히클, 고용량 덱사메타손 또는 저용량 덱사메타손을 처리한 동물로부터 취한 종양 절편에서 나타난 반면, 세포주위 히알루로난 염색은 PEGPH20 단독, PEGPH20 + 저용량 덱사메타손, 또는 PEGPH20 + 고용량 덱사메타손을 처리한 동물로부터 취한 종양절편에서 거의 완전하게 부존재하였다. PEGPH20을 단독으로 처리한 동물로부터의 조직 시료에 있어서 히알루로난 염색은, PEGPH20 및 저용량 또는 고용량의 덱사메타손 중 어느 하나를 처리한 동물로부터의 조직 시료에 있어서의 히알루로난 염색과 실질적으로 동일했는데, 이는 PC3 이종이식 모델에서의 결과와 유사, 즉, BxPC3 이종이식 모델에서 덱사메타손이 세포주위 히알루로난의 제거에 대한 PEGPH20의 활성을 변경시키지 않는다는 것을 가르킨다.
실시예 10
인간에 있어서의 근골격계 영향에 대한 덱사메타손의 영향
이 실시예는 인간에 있어서 PEGPH20의 투여로 야기된 근골격계 부작용을 개선 또는 감소시키는 덱사메타손의 영향을 평가하는 연구를 기술한다. 덱사메타손은 PEGPH20 투여의 근골격계 영향을 제거하거나 개선하기 위한 전투약(premedication)으로서 투여 요법에 첨가하였다. 처리 주기는 28-일 기간으로 정의되었고, PEGPH20을 정맥내로 투여하고 덱사메타손을 경구로 투여하였다. PEGPH20 및 덱사메타손 투여는 28일의 주기에서 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 및 25일차에 이루어졌다. 각각의 투여일에, 4 mg의 덱사메타손의 전투약 요법이 PEGPH20 투여 1시간 전에 경구투여되었고, 이어서 PEGPH20 투여한 후 8-12 시간에 4 mg의 덱사메타손을 2차 투여하였다.
A. 포함 및 제외 기준
환자들은 인지 동의서(informed consent form)에 서명한 후, 이 연구에 등록되었다. 환자들은 적어도 하나의 확인된, 진행성, 고형 종양을 가졌고; 표준 치료에 대해 불응성이었고; RECIST 기준에 의해 측정 가능한 적어도 하나의 종양을 1개 이상 가졌고; 카르노프스키 수행 상태(Karnofsky performance status) ≥ 70%를 가졌고; 기준선에서 초음파 심장 진단도(echocardiogram)에 의해 결정된 것과 같이, 박출계수(ejection fraction) ≥ 50%를 가졌고; 적어도 3개월의 예상 수명을 가졌고; 임신한 상태가 아니고 피임법(contraception) 이용에 동의하였고; 및 혈액학(hematology), 간, 신장 및 응고 실험실 분석법에 의해 나타낸 바와 같은 허용가능한 기관 기능을 가졌다.
환자들은 추가적으로 다음 제외 조건을 어느 것도 가지지 않았다: 알려진 뇌 전이; 뉴욕 심장 협회 Class III 또는 IV 심장병, 심근경색, 또는 의학적 치료가 요구되는 심장 부정맥; 전신적 치료가 요구되는 활성 감염; 인슐린 치료가 요구되는 통제되지 않는 당뇨병; 헤파린 치료가 필요한 의학적 상태; 알려진 HIV, B형 간염 또는 C형 간염 감염; 알려진 히알루로니다제에 대한 알러지; 심각한 비악성(nonmalignant) 질환; 또는 덱사메타손 불내성. 환자들은 또한 프로토콜에 따르고, 다른 동시 개입 치료 연구(concurrent interventional therapeutic study)에 참가하지 않을 것에 동의하였다. 모든 케이스에서, 환자들은 진통제 투여하에서 프로그램에 임하였다. 예를 들어, 이 연구의 첫 번째 환자는 그녀의 현재 상태와 관련된 통증에 대한 옥시코돈-아세트아미노펜 & 옥시콘틴을 복약하였으나, 이는 연구 약물과 관련된 통증에 대한 것은 아니었다.
B. 투여량 및 평가
1. 첫 번째 환자
먼저, 상기 포함/제외 기준을 만족하였고 진행성 고형 종양이 가진 한 명의 환자에 PEGPPH20 + 덱사메타손을 28일 동안 주 2회 0.5 ㎍/kg의 초기 저용량으로 투여하였다. 첫번째 환자는 난소암을 갖는 55살, 68.6 kg의 여성 환자이었다.
PEGPH20 투여 약 1시간 전에, 덱사메타손(4 mg)을 경구투여하였다. 그리고 나서 적절한 게이지(gauge)의 바늘/카테터를 정맥내 위치시킨 후 PEGPH20을 5 분간 천천히 IV로 주입하였다. PEGPH20은, pH 6.5, 10 mM 히스티딘과 130 mM NaCl을 갖는 3.5 mg/mL PEGPH20을 포함하는 수성 용액으로서 수성 용액으로서 공급되었다. 투여량은 생리식염수에 희석하여 최종 부피가 10 mL이 되도록 하였다. 시작 투여량은 0.5 ㎍/kg으로 하여 투약 요법에 특정한 바와 같이 28일 동안 주 2회 투여하였다. 8-12 시간 경과 후에 덱사메타손을 2차적으로 투여하였다. NSAIDs(이부프로펜) 또는 사이클로벤자프린을, 만일 그것이 발생한다면, 근골격계 통증을 치료하는데 이용하였다.
28일 주기 동안, 환자는 일련의 의료적 및 실험실적 평가를 거쳤다. 이러한 평가 스케줄과 시점에 대해서는 표 14에 나타내었다. 각 시점에서 수집된 모든 데이터는 케이스 리포트 형식으로 기록되었다.
Figure 112017000450674-pat00020
a - 주입 전 3일차 또는 4일 차 및 주기 마지막에(25일 후)에 수행됨.
b - 만일 가능하다면, 2일 차 또는 그 너머의 아무때에, HA 염색을 위한 투여 후 종양 생검.
c - 투여 후(After administration)
d - 투여 전(Before administration)
e - 투여 중(During administration)
F/U - 추적 관찰(Follow-up)
근골격계 반응(musculoskeletal events) 및 다른 유해사례(adverse events)을 포함하는 유해사례 또는 부작용이 평가되었다. 임의의 원치않았던 의학적 사례는, 만일 이것의 개시가 PEGPH20 및 덱사메타손 병용에 대한 환자의 첫 번째 노출 동안 또는 노출 후, 그러나 최종 투여 후 늦어도 30일까지라면 유해사례(Adverse Event, AE)로 간주되었다(이것이 PEGPH20 + 덱사메타손과 관련된 것으로 간주되든 아니든).
AE는 NCI CTCAE Version 4.0 및 하기 표 15에 제시된 가이드라인을 이용하는 조사관에 의한 심각성(severity)(심각성(seriousness)의 척도가 아닌 강도(intensity))에 의해 카테고리화되었다. AE는 그 AE가 PEGPH20 및/또는 덱사메타손 투여에 대해 관련된(Related), 아마도 관련된(Probably Related), 가능하게 관련된(Possibly Related), 관련되지 않을 것 같은(Unlikely Related) 또는 특별히 관련 없는(Not Related specifically) 지 여부에 의존하여 조사관에 의해 추가적으로 분류되었다.
Figure 112017000450674-pat00021
환자는 또한 용량-제한 독성(DLT)에 대해서 모니터링되었다. DLT로서 자격이 되려면, 유해사례가 PEGPH20 + 덱사메타손 처리와 관련된 것으로 간주되었고, 치료의 첫 28일 동안에 나타났어야 했다. DLT는 임의의 국립 암 연구소(National Cancer Institute; NCI) 유해 사례에 대한 표준 용어 기준(Common Terminology Criteria for Adverse Events; CTCAE) 3등급 또는 그 이상(표 15 참조) 비-혈액학적 독성(non-hematologic toxicity)으로서 정의되었다. 이에 대한 예외는 예방적 항-구토 치료없이 발생되었으나, 이러한 치료에 의해 효과적으로 치료된 오심 및 구토, 빠르게 치료되어 2등급 또는 그 이하로 격하되거나 24 시간 이내에 해소되는 3등급 근골격 독성을 포함했다. DLT는 또한 21일이 넘은 후에도 해소되지 못하고 프로토콜 치료에 따르는 환자의 능력을 제한하는 어떠한 진행중이며 지속적인 2등급 독성으로서 정의됐다. 최종 DLT 정의는 4등급 또는 연장된 3등급 혈액학적 독성을 포함했다.
1일차 및 4일차에 PEGPH20 및 덱사메타손을 병용 투여한 후에, 환자는 1등급, 양측 무릎의 통증을 경험하였다. 8일차에 이루어진 3회차 투여는 합병증 없이 이루어졌다. 양측 무릎 통증은 1등급이 되어 계속되었고, 간헐적이었고, 치료가 필요하거나 이동을 제한하지 않았다. 무릎의 신체검사는 신체적인 변화나 관절의 움직임에 있어서의 제한이 없음을 의미했다. 유해 사례는 DLT로 간주되지 않았다.
환자는 추가적인 관련된 합병증 없이 투약 요법을 완료하였다(4주, 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 및 25일차에 주 2회 투여). 또한, 환자는 또한 설사, 복부팽만(3등급; 관련 없음) 및 양측 상부 및 하부 팔(2 등급; 관련 없음)에 화학선 발진(actinic rash) (2등급)을 가졌다. 환자는 임상 질환(난소암) 진행으로 인해 연구를 중단하고 종료시켰다.
2. 두 번째 환자
첫번째 환자가 PEGPH20 및 덱사메타손의 병용 투약 요법을 잘 견뎠으므로, 식도암이 있는 두번째 환자에게서 PEGPH20 투여량을 증가시켰다. 환자는 71세 남성으로, 1.6 ㎍/kg의 PEGPH20 + 덱사메타손을 28일동안 주 2회 투여받았다. 더 높은투여량을 제외하면, 투약 요법은 첫번째 환자에서와 동일하였다. 유해사례 및 DLT를 포함하는 의학적 및 실험실적 평가는 상기 첫번째 환자에서 기술한 것과 마찬가지로 행해졌다.
1등급 근골격계 부작용이 관찰되었다. 부작용, 모든 1등급은, 하부 등에 있어서의 약한 쑤심, 왼쪽 엉덩이에 있어서의 피로, 쑤심, 통증, 손 및 발에 있어서의 근육 경련을 포함했다. DLT는 보고되지 않았다. 환자는 피로(1등급; 관련됨), 왼쪽 엉덩이 쑤심(1등급; 연구 약물과 관련 없음); 근육 경련 및 하부 등 쑤심(1등급; 연구 약물과 관련 있을 가능성이 있음)를 포함하는 유해 사례를 가졌다.
환자는 주기 2까지 지속하였고, 주기 2에는 주마다 투여되었다. 환자는 주기 2의 15일차에 병의 진행으로 인해 연구를 중단하였다.
3. 세 번째 환자
세 번째 환자는 5.0 ㎍/kg PEGPH20 + 덱사메타손을 28일 동안 주 2회 투여받았다. 첫 번째 투여는 합병증 없이 투여받았다. 두 번째 투여일에, 환자는 손에 있어서의 1등급 근육 경련이 있었는데, 세 번째 투여 이후에는 손, 다리 발, 발가락에 있어서의 3등급 근육 경련으로 진행되었다. 환자는 추가적인 주입을 받지 않았고 연구로부터 중단되었다.
4. 네 번째 환자 및 다섯 번째 환자
5.0 ㎍/kg PEGPH20 세 번째 투여 후에 3등급 근육 경련을 경험하였기 때문에, 두 환자에 있어서 투여량은 1.6 ㎍/kg으로 줄였고, 각각은 28일 동안 주 2회 1.6 ㎍/kg의 PEGPH20 + 덱사메타손을 투여하였다.
네 번째 환자는 중등도로 분화된 대장 선암종이 있었는데, 손가락, 손, 발 및 종아리에 있어서의 1등급 양측 경련을 경험했다. 특히, 간의 전이성 병변(metastatic lesion)의 후-투여 생검은 보관된 조직생검과 비교할 때 세포주위 HA에 있어서의 감소된 것을 입증하였다(실시예 11 참조). 환자는 주기 2를 완료하였으나, 병의 진행으로 인해 주기 3 시작 전에 연구를 중단하였다.
다섯 번째 환자는 중등도로 분화된 대장 선암종이 있었는데, 두 번째 PEGPH20을 투여한 당일에 시작되어 진행된 양측 허벅지의 간헐적인 1등급 경련을 보고했다. 1등급 간헐적인 왼쪽 무릎 통증이 PEGPH20을 두번째 투여한 다음날 하루에 발생하였고 PEGPH20을 여섯 번째 투여한 날 1등급으로 재발생하였다. 이 환자는 손 및 하지의 근육에 있어서의 2등급의 간헐적인 양측성 경련을 보고했는데, 이는 PEGPH20을 네 번째 투여한 당일날 시작되었다.
C. 결과 요약
5.0 ㎍/kg 미만의 PEGPH20 및 덱사메타손을 병용투여한 환자의 연구에 있어서, 유해 효과는 주로 양측 무릎 통증, 오늘발 근경련, 좌우 손 근육 경련을 포함하는, 근골격계 현상이었고, 이 증상은 모두 연구 약물과 관련되었고, 모두 1등급이었다. 상기 5명의 환자는 병의 진행으로 인하여 연구를 중단하였다. 1.6 ㎍/kg을 주 2회 투여받은 한 명의 환자는 2주기의 치료를 마치고 병의 진행으로 인해 연구를 중단하였다.
요약하면, 결과는 PEGPH20 투여 당일날 전-PEGPH20 투여 및 후-PEGPH20 투여 (1 시간 전 및 8 내지 12 시간 후-PEGPH20 투여)에 4 mg 투여된 덱사메타손의 전투약(premedication)의 이용이 근골격계 사례(musculoskeletal events)의 심각성을 약화시킨다는 것을 보여준다. 따라서, 덱사메타손의 이용은 덱사메타손의 부존재 시에 PEGPH20에 의해 달성된 것보다 더 높은 투여량 및 투여 빈도로 PEGPH20의 견딜 수 있는 투여를 허용한다.
실시예 11
HA의 조직화학적 검출
HA의 조직화학적 검출을 위한 시료는 실시예 10에 기술한 바와 같이 1.6 ㎍/kg의 PEGPH20 + 덱사메타손을 4주간 투여한 환자로부터 채취한 주기 1 후 전이성 간(post-cycle 1 metastatic liver biopsy) 생검 시료 및 전-생검 종양 표본(pre-biopsy tumor specimen)으로부터 수득하였다. 2007년(PEGPH20 연구 3.5년 전)에 채취한 보관된 전-투여(pre-dose) 생검물(전 생검물(pre biopsy)) 및 PEGPH20 1주기 이후(마지막 투여 3일 후) 생검물(후 생검물(Post biopsy))을 간 전이가 있는 여성 대장암 환자로부터 얻었다. 환자의 처리 후 생검물은 덱사메타손의 공동-치료와 함께 1.6 ㎍/kg 주 2회 스케줄인 PEGPH20 치료의 주기 1 이후 수득하였다.
간단히 설명하면, 조직 생검물은 정상 완충 포르말린(NBF)에 고정되고, 5 ㎛로 절편화되고 비오틴으로 표지된 히알루로난-결합 단백질(HABP-bio)(Seikagaku, Japan)로 염색되었다. 1차 시약을 제거하기 위해 세척한 후, 표지된 2차 시약을 사용하였다. 핵은 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 시약으로 대조염색되었다. Insight FireWire 디지털 카메라(Diagnostic Instruments, Michigan)과 연결된 Nikon Eclipse TE2000U 도립 형광 현미경(inverted fluorescent microscope) 또는 동일한 이미징 시스템을 갖는 ZEISS 오버헤드 스코프(Carl Zeiss,Inc.)를 통해 현미경사진을 찍었다.
비오틴화된 HA 결합 단백질로 시료의 조직화학적 염색은 PEGPH20 치료의 1 주기 후 세포주위 및 기질(stromal) HA 수준의 감소를 입증하였다. 결과는 표 16에 요약하였다. H 점수는 세포주위 및 기질 HA의 상대적 강도를 나타낸다. 데이터는 종양과 관련된 HA를 분해하는 PEGPH20의 능력을 입증한다.
Figure 112017000450674-pat00022
** 종양 관련된 기질(tumor associated stroma)
실시예 12
혈장 내 히알루로난(HA) 수준 추산을 위한 HPLC 방법
이 실시예는 혈장 내 HA-이당류(HA-disaccharide)의 측정을 위한 방법을 기술한다. 상기 방법은 콘드로이티나제 ABC(Chondroitinase ABC)로 HA의 가수분해를 이용하여 HA-이당류가 유리되게 하고, 이를 2-아미노 아크리돈(2-amino acridone; AMAC)로 유도체화하고, 이들은 형광 검출기와 결합된 역상 HPLC 상에서 분석된다. HA-이당류의 정량은 HA-이당류 표준과 비교하여 달성된다.
1. 작업 표준(working standard)
이 방법에서, 작업 표준 용액을 제조하였다. 먼저, 희석 저장 용액(dilute stock solution; DSS)을 HA-이당류 저장 용액(SS)으로부터 제조하였다. HA 이당류 SS는 2 mg의 동결건조된 분말을 포함하는 HA-Disac(V-labs, Cat. No. C3209) 한 바이알에 1 mL의 물을 첨가하여 균질한 현탁액을 만듦으로써 제조하였다. 희석 저장 용액을 제조하기 위하여, SS 용액 5 ㎕을 125 ㎕의 물에 희석하여 DSS1 용액을 제조하였다((200 pmoles/㎕ HA-Disac; 200 mmoles/ml HA-Disac) 함유). 물 내에서 5배 순차적 희석이 DSS2(40 pmoles/㎕ HA-Disac; 40 nmoles/ml HA-Disac 함유) 및 그리고나서 DSS3(8 pmoles/㎕ HA-Disac; HA-Disac 8 nmoles/ml HA-Disac 함유)를 제조하였다. 그 후, 작업 표준 용액을 표 17 및 18에 기술한 바와 같이 25% 인간 혈청 알부민(HAS)(ABO Pharmaceuticals, Cat. No. 1500233) 또는 정상 마우스 혈장(Bioreclamation, Cat. No. MSEPLEDTA2-BALB-M)에서 기재한 바와 같이 제조하였다.
Figure 112017000450674-pat00023
2. 시료의 가수분해 및 유도체 합성
그 다음에, 시료를 가수분해하였다. 시료(예컨대 혈장)를 약 100 ㎍의 단백질을 폴리프로필렌 튜브에 취하고 물로 부피가 340 ㎕가 되도록 조정하여 준비하였다. 매질바탕시료(matrix blank)는 시료 부피와 동일한 희석 완충액(1.59 g HEPES, 5.07 g NaCl, 1800 mL의 물, pH 7.0) 을 취하고 340 ㎕로 부피를 조정하여 준비하였다. 시료 및 매질바탕시료의 가수분해는 시료 튜브 및 매질바탕시료 튜브에 60 ㎕의 TFA를 첨가함으로써 영향받았고, 상기 내용물은 혼합하고 4 시간동안 100 ℃에서 배양되었다. 바이알들은 실온에서 식혔다. 바이알들을 고속 진공기(speed vac)을 사용하여 증발 건조시켰다. 그 후, 물 300 ㎕를 각 튜브에 첨가하고 볼텍스하여 시료를 재현탁했다.
가수분해된 시료, 바탕 시료 및 작업 시료의 유도체 합성을 위해, 각 시료 45 ㎕(시료, 바탕 시료, 작업 시료)를 고속 진공기(speed vac)에서 증발 건조시켰다. 그 후, SAS 10 ㎕를 건조된 시료, 바탕 시료 표준 및 작업 표준에, 첨가하였다. 그 다음, 50 ㎕의 ABA/NaCBH3 표지 용액을 첨가하였다. 튜브를 볼텍스하고 짧게 원심분리하였다. 그리고 나서, 440 ㎕의 이동상 A를 첨가하고 튜브를 잘 혼합하였다. 이동상 A는 다음과 같이 준비되었다: 1 M 암모늄 아세테이트 완충액(Sigma, Cat. No. A7330) 132 mL를 1L 용량 플라스크(volumetric flask)에 첨가하고 물을 첨가하여 플라스크를 채웠다. 유도체 합성 후에, 작업 표준을 위한 20 ㎕ 주입 당 명목상의 온-칼럼 로드(nominal on-column loads)는 표 19에 기술된 바와 같다.
Figure 112017000450674-pat00024
3. HPLC
HPLC 칼럼을 표 20에 기술된 초기 이동상 세팅(initial mobile phase settings)과 함께 유속 1.0 mL/분에서 평형화시켰다. 이 시스템은 기준선이 일정해질 때까지 평형화시켰다. HPLC 분석은 표 20에 기술된 기구 파라미터에 따라 수행되었다.
Figure 112017000450674-pat00025
시료 분석 순서는 다음과 같다: 컬럼 컨디셔닝/평형화/검출기 획득을 위한 WSS5 (1회 주사); 물 주사(1회 주사); WSS3(3회 주사); WSS1 (1회 주사); WSS2 (1회 주사); WSS4 (1회 주사); WSS5 (1회 주사); 물 (1회 주사); 매질바탕시료 (1회 주사); 시료 1 (1회 주사); 시료 2 (1회 주사); WSS3 (3회 주사); 물 (1회 주사). 받아들여질만한 분리 품질(separation quality); WSS1 시료에서 더 짧은 단당류(monosaccharide) 피크에 대한 노이즈 비율에 대한 신호가 10 이상; WSS3 6회 주사에 대한 각 단당류 표준에 대한 피크 면적의 상대적 표준 편차(RSD)가 4% 이하; 상관 계수(correlation coefficient) (r)은 0.99 (r) (WSS3 표준의 첫 3회 주사를 이용하여 온-칼럼 로드(pmol로 표현됨)에 대한 각각의 작업 표준의 피크 면적을 그리기 위한 소프트웨어를 이용하고 선형 최소 제곱 회귀 모델을 이용하여 작업 표준에 대한 기울기(slop), 절편(intercept) 및 상관 계수를 계산하여 측정됨); 단당류에 대응하는 피크에 대한 피크 면적이 WSS5에 대해 측정된 피크 면적의 2% 이하; 및 물 주사에 있어서의 단당류에 상응하는 피크에 대한 피크 면적이 WSS5에 대해 측정된 피크 면적의 0.5% 이하일 때, 시스템이 적합한 것으로 간주되었다.
4. 시료 분석
각 시료 제제(sample preparation)에 있어서, 각 단당류에 대한 평균 보정 피크 면적이 결정되었다. 계곡 대 계속 적분(Valley-to-valley integration)은 GalN 피크에 대해 이용되었다. 이를 결정하기 위하여, 작업 표준으로부터 생성한 선형 곡선을 각각의 시료 제제에 대한 로드된 각각의 단당류의 양을 계산하는데 이용하였다. 각각의 유형의 단당류에 대하여, 각각의 시료에 대한 단백질 분자 당 단당류의 평균 몰비가 계산되었다. 그리고나서, 각각의 시료에 대하여, 모든 5종의 단당류에 대한 평균 몰비의 전체 합계가 결정되었다. 계산은 다음에 기초하여 수행되었다: 글리코실화되지 않은 히알루로니다제 단백질의 분자량(MW)은 51106 g/mol; 각 시료의 총 부피는 500 ㎕; 시료 희석 인자는 0.15; 각 주입액 부피는 20 ㎕; 및 mg 내지 pg의 변환인자는 109. 계산은 각 단당류에 대하여 다음과 같이 수행되었다:
각 제제(preparation)에 대한 단당류의 양은 다음 등식을 이용하여 계산되었다:
Figure 112017000450674-pat00026
단백질 분자당 단당류의 수는 다음 공식을 이용하여 계산되었다:
Figure 112017000450674-pat00027
각 시료에 대하여, 각 시료에 대한 결과는 5종의 단당류 비율의 합계와 더불어 단백질 당 단당류의 비율로서 보고되었다.
실시예 13
덱사메타손과 함께한 경우 또는 덱사메타손 없는 경우의 PEGPH20의 약동학
실시예 6(PEGPH20) 및 실시예 10(PEGPH20 + 덱사메타손)에 기술된 인간에서의 연구에 있어서, 환자로부터 예정된 시간에 혈액 시료를 채취하였다. 혈장 시료는 동결 보존되었고, PEGPH20 농도는 실시예 4에 기술된 변형된 비탁법을 이용하여 히알루로니다제 활성을 측정함으로써 결정되었다. 결정에 사용된 USP 비탁법은 HA가 산성화된 혈청에 결합할 때 생기는 불용성 침전물의 형성을 기초하였다. PEGPH20 농도는 검정곡선으로부터 내삽된 히알루로니다제 활성(U/mL)의 유닛으로 표현되었다. 활성은 1 U/mL 가까이로 보고되었고, 분석 방법은 0.3125 U/mL 만큼 낮은 혈장 히알루로니다제 농도를 측정하는데 적용할만 했다.
1. PEGPH20
0.5 ㎍/kg 내지 50 ㎍/kg의 범위의 투여량으로 PEGPH20의 1 내지 3회의 정맥내 투여로 투여받은 실시예 6에 있어서의 환자로부터의 혈액 시료가 PH20의 약동학에 대하여 분석되었다.
50 ㎍/kg(실시예 6B.1)의 단일 투여를 초기에 받은 두 명의 환자에 있어서, 시간에 따른 혈장 농도는 유사하였다. 혈장에서의 최대 PEGPH20 농도는 주입 직후에 측정되었고, 시간이 흐름에 따라 혈액 순환으로부터 서서히 사라졌다. 약동학적 분석은 작은 분포 부피(distribution volume), 느린 혈장 클리어런스(Plasma clearance) 및 약 2일의 최종 반감기(terminal half-life)를 나타낸다. 결과는 투여 후 초기에, 약 30 U/mL의 효소가 혈장에서 측정되었다는 것을 보여준다. 혈장 효소 수준은 시간의 흐름에 따라 꾸준히 감소 했으나, 투여 후 24시간 및 48시간에 검출가능하였고, 투여 후 72 시간에 약 2 U/mL 미만으로 존재하였다. PK 파라미터는 환자에서 혈장 반감기가 28-48시간의 혈장 반감기를 나타내었다. 표 21은 최대 관찰 혈장 농도(Cmax; U/mL), 절대/전신적 클리어런스(CL; mL/시간/kg), 분포 반감기(t1/2α), 소실 반감기(t1/ 2β), 및 중앙 구획(central compartment)의 부피(V1; mL/kg)를 포함하는 PK 파라미터의 요약을 기술한다.
Figure 112017000450674-pat00028
0.5 ㎍/kg 내지 1.5 ㎍/kg 범위의 PEGPH20을 1회 또는 다중 투여로 처리된 연구에 있어서 나머지 12 환자들에 대하여, 혈장 농도는 투여 후에 측정가능하였고(그러나 약 1.5 U/mL 또는 그 미만), 첫 날 동안에 농도가 정량 한계(limit of quantification; BQL) 아래로 떨어졌다. 혈장 농도가 보통 정량 한계 근처 또는 그 아래 이기 때문에, 혈장 농도의 시간 경과에 대한 충분한 정보를 이용할 수 없었다. 일반적으로, 0.5 ㎍/kg 내지 1.5 ㎍/kg 범위의 낮은 투여량으로 PEGPH20을 정맥 내 투여한 후 첫 번째 날 동안 전신적 노출에 있어서의 투여량 의존적 증가가 있었다.
실시예 6에 있어서의 연구에서 다중 투여를 받은 8명의 환자들에 대하여, 이 8명 중 4명에 있어서 반복된 투여 후에 측정가능한 혈장 농도가 검출되었다. 이 혈장 농도는 0.34 내지 0.83 U/mL의 범위로 낮았으며 첫 투여 이후에 검출된 것과 유사했다.
2. PEGPH20 + 덱사메타손
0.5 ㎍/kg 내지 5.0 ㎍/kg의 범위의 투여량으로 PEGPH20의 다중 투여 받은 실시예 10에 있어서의 환자로부터의 혈액 시료가 PH20의 약동학에 대하여 분석되었다.
전술한 덱사메타손 없이 PEGPH20만을 투여했을 경우의 약동학과 비교를 용이하게 하기 위하여, PEGPH20의 반복 투여 전에 혈장 농도 대 시간 데이터를 모았다. 0.5 ㎍/kg 또는 1.6 ㎍/kg로 처리된 환자들에 대하여, 최대 혈장 농도는 덱사메타손이 없는 연구에 있어서 관찰된 것과 일치하였다. 농도는 첫 번째 날 이내에 정량 한계로 떨어졌다. 5.0 ㎍/kg PEGPH20을 처리한 단일 환자로부터 측정된 최대 농도는 덱사메타손이 없는 연구에 있어서의 50 ㎍/kg PEGPH20을 처리한 환자에 대해 검출된 Cmax의 약 1/10이었다. 이 결과는 PEGPH20의 혈장 약동학이 덱사메타손의 존재 또는 부재에 있어서 유사하다는 것을 보여준다.
실시예 14
덱사메타손과 함께한 경우 또는 덱사메타손 없는 경우의 PEGPH20의 약력학
PEGPH20의 효소 활성은 혈액 순환에 있어서 존재하는 히알루로난의 농도를 모니터링함으로써 측정되었다. 실시예 12에 기술된 이당류 분석을 실시예 6(PEGPH20) 및 실시예 10(PEGPH20 + 덱사메타손)에 기술된 인간 연구에서의 환자에서 예정된 시간에 채취한 일련의 혈장 시료에서 HA 및 그것의 이화물의 농도를 측정하는데 사용하였다.
1. PEGPH20
0.5 ㎍/kg 내지 50 ㎍/kg의 범위의 투여량으로 PEGPH20을 3회 정맥내 투여로 투여받은 실시예 6에 있어서의 환자로부터의 혈액 시료가 HA 이화물에 대하여 분석되었다. PEGPH20 투여 전의 혈장 HA 농도는 본 연구에 있어서의 모든 환자들에 대하여 일반적으로 1 ㎍/mL 미만이었다.
단일의 50 ㎍/kg 투여량의 PEGPH20을 받은 환자들에 있어서, 히알루로난의 혈장 농도는 유의성 있게 증가하였다. 혈장으로부터 PEGPH20이 상대적으로 보다 더 빠른 소실에도 불구하고(실시예 12.1), 상승된 HA 농도는 더 느리게 축적되고 2주 초과의 기간 동안(400 시간 이상) 지속되는 것으로 보였다. HA 이화의 연장된 효과, 즉 혈액 순환에 있어서 지속된 HA 농도는, 말초 구획 또는 혈관외 조직에 있어서의 PEGPH20의 효소 활성과 일치한다.
0.5 ㎍/kg 내지 1.5 ㎍/kg 범위의 PEGPH20을 1회 또는 다중 투여로 처리된 나머지 12 환자들에 대하여, HA 이화물 수준은 1주 이상 동안 투여량 의존적 방식으로 증가하였다. 각 환자에서 약력학적 반응을 정량화하기 위해 최대 HA 농도(Cmax) 및 1주일의 곡선하 면적 추정값(AUC0-168h)을 결정하였다. 이 결과는 최대 혈장 농도 또는 곡선하 면적에 의해 측정된 HA 이화물에 대한 전신적 노출이 PEGPH20 투여량의 증가와 함께 증가하는 것으로 보인다는 것을 보여주었다.
2. PEGPH20 + 덱사메타손
0.5 ㎍/kg 내지 5.0 ㎍/kg의 범위의 투여량으로 PEGPH20의 다중 투여 받은 실시예 10에 있어서의 환자로부터의 혈액 시료가 HA 농도에 대하여 분석되었다. 전술한 단지 PH20만을 투여한 환자로부터의 시료에 있어서의 관찰과 일치하게, 혈장 HA 농도 vs. 시간 데이터는 PEGPH20 투여 후에 증가하였다. 투여의 1주 동안 측정된 혈장 HA 농도는 PEGPH20의 투여량의 증가와 함께 증가했다. 치료의 전주기(full cycle)를 완료하고 PEGPH20을 8회 투여받은 3명의 환자들에 있어서, 결과는 모든 3명의 환자로부터의 시료에 있어서의 지속된 증가된 혈장 HA 농도가 투여 기간 내내 측정되었다는 것을 보여주었다.
실시예 15
자기공명영상
겉보기 확산 계수에 대한 단위화소 값(pixel-by-pixel value)을 추정하기 위하여 단발 고속 스핀 에코 기법(single shot spin-echo sequence)을 이용하여 확산 강조 MRI(Diffusion weighted MRI)를 수행하였다. 역동적 조영-증강 자기공명영상(dynamic contrast-enhanced Magnetic Resonance Imaging; DCE-MRI)은 조영제(contrast agent)를 주입하는 동안에 이미징을 포함했다. 검증(Calibration)이 내부 튜브 및 얼음/물 혼합물을 함유하는 이 파트 팬텀(two part phantom)을 이용하여 달성되었다. 전-처리 및 후-처리에 스캔을 수행하였다.
1. 겉보기 확산 계수 자기공명영상(ADC-MRI)
겉보기 확산 계수 자기공명영상(ADC-MRI)는 전-처리 및 후-처리 스캔으로부터 유도된 계산을 기초로 세포막을 가로질러 이동한 물의 부피를 측정한다. ADC-MRI 스캔은 실시예 6에 기술된 연구에 있어서의 14명의 환자 중 총 10명 및 실시예 10에 기술된 연구에 있어서의 5명의 환자 중 4명에 대해 완료했다. 각 환자로부터 얻은 이미지 분석은 Imaging Endpoints (Scottsdale, AZ)의 방사선 전문의에 의해 수행되었고, ADC의 정량적 추정값은 각 환자들의 조직에 대해 계산되었다. 종양 부위와 관련된 ADC-MRI 연구결과의 요약은 표 22에 나타내었다. 표에서 나타난 바와 같이, ADC-MRI에서의 증가는 PEGPH20을 투여한 후 환자 14명 중 7명(50%)에서 관찰되었다. 증가된 ADC 값은 PEGPH20의 작용 메커니즘과 일치한다. 그러나 14명의 환자 중 5명에서 ADC 값은 변화가 없었으며, 14명의 환자 중 2명에서는 감소하였다.
Figure 112017000450674-pat00029
2. 역동적 조영-증강 자기공명영상(DCE-MRI)
역동적 조영-증강 자기공명영상(DCE-MRI)은 종양의 혈관 분포(tumor' vascularity) 변화를 의미하는 혈류를 측정한다. 스캔은 실시예 10에 기술된 연구에 있어서의 환자 5명 중 4명에서 완료하였다. 각 환자로부터 얻은 이미지 분석은 Imaging Endpoints (Scottsdale, AZ)에서 방사선 전문의에 의해 수행되었고, 부피이동계수(volume transfer coefficient; Ktrans), 혈관 부피(Vp) 및 세포외 부피 분율(extracellular volume fraction; Ve)의 정량적 추정치를 각각의 환자의 조직에 대하여 계산하였다. 종양 부위와 관련된 DCE-MRI 연구결과의 요약은 표 23에 기술된다. Ktrans 파라미터에 있어 유의성 있는 증가가 PEGPPH20 투여 당일날 스캔한 환자 2명에게서 관찰되었다. 투여하고 몇 시간 이내의 Ktrans 증가는 PEGPH20이 혈관 감압(vascular decompression) 및 증가된 혈류를 야기한다는 것을 보여주는 전임상 데이터(Thompson et al. (2010) Mol. Cancer Ther., 9:3052-64)와 일치한다.
Figure 112017000450674-pat00030
실시예 16
종간 스케일링 알고리즘(Interspecies Scaling Algorithm)
전임상 모델에 있어서, PEGPH20, 단독 또는 겜시타빈(gemcitabine)과의 병용은 0.01 내지 0.1 mg/kg와 같이 낮은 투여량으로 종양 성장을 효과적으로 억제하였다는 것이 관찰되었다. 이 투여량으로 동등한 인간 노출을 결정하기 위하여, 종간 스케일링 알고리즘은 몸무게에 비례하여 PEGPH20 스케일의 혈장 클리어런스를 추정하는데 이용하였다. 이를 기초로, 0.01 내지 0.1 mg/kg 스케일의 마우스에서의 유효 투여량은 인간에 있어 0.75 ㎍/kg 내지 7.5 ㎍/kg에 해당한다는 것이 밝혀졌다. 인간과 비교할 때 마우스는 HA의 순환 수준(circulating levels)을 약 20배로 가지므로, 동량의 PEGPH20은 환자들에 있어서 상대적으로 더 항-종양 활성을 가질 수 있다.
변형이 당업자에게 명백할 것이므로, 본 발명은 첨부된 청구항의 범위에 의해서만 제한되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Halozyme, Inc. Shepard, Harold Michael Thompson, Curtis B. Li, Xiaoming Frost, Gregory I. <120> Adverse Side-Effects Associated with Administration of an Anti-Hyaluronan Agent and Methods for Ameliorating or Preventing the Side-Effects <130> 33320.03084.WO01/3084PC <140> Not Yet Assigned <141> Herewith <150> 61/399,993 <151> 2010-07-20 <150> 61/455,260 <151> 2010-10-14 <160> 198 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor human PH20 <400> 1 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu 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(strain RCC307) <220> <223> hyaluronan lyase <400> 97 Met Gly Ala Pro Ala Ile Pro Lys Val Pro Arg Ser Pro Ser Lys Ser 1 5 10 15 Glu His Thr Thr Arg Pro Asn Ser Gly Glu Ser Glu Val Val Arg Gln 20 25 30 Ala Glu Glu Leu Phe Glu Gln Thr Leu Val Asn Val Arg Gly Gln Leu 35 40 45 Ala Gly Ala Val Ala Ala Leu Glu Ser Ser Val His Asp Ser Glu Leu 50 55 60 Asn Tyr Gly Glu Ile Phe Leu Arg Asp Asn Val Pro Val Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Leu Leu Arg Gly Arg Phe Glu Ile Val Arg His Phe Leu Asp Leu 85 90 95 Cys Leu Glu Leu Gln Ser Arg Ser Tyr Arg Thr Arg Gly Val Phe Pro 100 105 110 Thr Ser Phe Val Glu Glu Asp Asp Lys Ile Leu Ala Asp Tyr Gly Gln 115 120 125 Arg Ser Ile Gly Arg Ile Thr Ser Val Asp Ala Ser Leu Trp Trp Pro 130 135 140 Val Leu Cys Trp Met Tyr Val Arg Ala Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly 145 150 155 160 Thr Ser Pro Lys Val Gln Arg Ala Val Gln Leu Leu Leu Asp Leu Val 165 170 175 Leu Gln Pro Ser Phe Tyr Glu Pro Pro Val Leu Phe Val Pro Asp Cys 180 185 190 Ala Phe Met Ile Asp Arg Pro Met Asp Val Trp 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Claims (18)

  1. 암의 치료를 위한 가용성 인간 PH20 히알루로니다제의 전신 투여와 관련된 인간에서의 유해 근골격계 부작용을 개선하는 데에 사용하기 위한 글루코코르티코이드를 포함하는 약학적 조성물로서, 여기서,
    상기 가용성 인간 PH20 히알루로니다제는 중합체에 컨쥬게이트되고,
    상기 유해 근골격계 부작용은 근육 및 관절 통증, 상지의 뻣뻣함, 하지의 뻣뻣함, 경련, 근염, 전신의 근육통 및 근압통, 쇠약, 피로, 및 무릎 및 팔꿈치 관절의 운동 범위 감소 중에서 선택되고; 적어도 3등급 또는 그 초과인 유해 효과, 또는 치료를 계속하는 경우에도 해소되지 못하고 프로토콜 치료에 따르는 환자의 능력을 제한하는 적어도 진행중이거나 지속적인 2등급 독성인 유해 근골격계 부작용인, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 유해 근골격계 부작용은 근육 및 관절 통증, 상지의 뻣뻣함, 하지의 뻣뻣함, 경련, 근염 및 전신의 근육통 및 근압통 중에서 선택되는 것인 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 글루코코르티코이드가 코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 및 프레드니손 중에서 선택되는 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 글루코코르티코이드가 덱사메타손인 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 글루코코르티코이드가 경구 투여용으로 제형화된 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 글루코코르티코이드가 0.1 내지 20 mg 범위의 양으로 단일 투여량 투여용으로 제형화된 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 중합체가 PEG이고 인간 히알루로니다제가 PEG화된 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 히알루로니다제는 C-말단 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 부착 위치의 전부 또는 일부를 결여된 가용성 PH20인 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 히알루로니다제가 중성 활성이고 N-글리코실화되어 있고 하기 (a) 내지 (c) 중에서 선택되는 약학적 조성물:
    (a) 전장 PH20이 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, PH20의 C-말단이 절단된 형태인 히알루로니다제 폴리펩티드; 또는
    (b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열의 폴리펩티드 또는 절단된 형태와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 히알루로니다제 폴리펩티드; 또는
    (c) 상기 (a) 또는 (b)의 히알루로니다제 폴리펩티드가 아미노산 치환을 포함함으로써, 서열번호 2의 폴리펩티드 또는 이의 대응하는 절단된 형태와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지는 히알루로니다제 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 절단된 형태가 서열번호 1의 36 내지 467, 36 내지 468, 36 내지 469, 36 내지 470, 36 내지 471, 36 내지 472, 36 내지 473, 36 내지 474, 36 내지 475, 36 내지 476, 36 내지 477, 36 내지 478, 36 내지 479, 36 내지 480, 36 내지 481, 36 내지 482 또는 36 내지 483 아미노산을 포함하는 약학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 종양을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 종양은 고형 종양인 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 종양은, 동일한 조직 유형의 비암조직 또는 동일한 종양 유형의 비전이성 종양과 비교할 때, 히알루로난의 증가된 세포 발현, 히알루로난의 증가된 기질 발현 또는 양쪽 모두를 가지는, 약학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 말기암, 전이성 암 및 미분화된 암 중 어느 하나 또는 그 이상 중으로부터 선택된 약학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 난소암, 상피내암(in situ carcinoma (ISC)), 편평상피세포암(SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 뇌암 및 대장암 중 어느 하나 또는 그 이상 중으로부터 선택된 약학적 조성물.
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