CN102655853A - 透明质酸酶和免疫球蛋白的稳定的复合制剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供免疫球蛋白和透明质酸酶的稳定的复合制剂，其以液体形式在室温下稳定保存至少6个月并且在标准的冷藏温度下稳定保存1-2年。此类复合制剂可用于通过皮下给药治疗IG可治疗的疾病或病症的方法中。

Description

透明质酸酶和免疫球蛋白的稳定的复合制剂及其使用方法
相关申请
本申请主张2009年12月17日提交的标题为“透明质酸酶和免疫球蛋白的稳定的复合制剂及其使用方法”的美国临时申请61/277,045的优先权。
本申请还与同日提交的标题为“透明质酸酶和免疫球蛋白的稳定的复合制剂及其使用方法”的第12/807,991号美国申请相关，后者同样主张美国临时申请61/277,045的优先权。
在允许的情况下，上文提及的申请中的每一个的主题以其整体通过援引加入本文。
技术领域
本文提供免疫球蛋白和透明质酸酶的稳定的复合制剂，其以液体形式在室温下稳定保存至少6个月并且在标准的冷藏温度(refrigeratortemperatures)下稳定保存1-2年。此类复合制剂可用于通过皮下给药治疗IG可治疗的疾病或病症的方法中。
背景技术
来自人血浆的免疫球蛋白（IG）产品在1952年被首次用于治疗免疫缺陷。最初，可选用的方法是肌肉内或皮下给药IG。然而，为了注射有效治疗各种疾病所必需的较大量的IG，开发了具有较低浓度IG(50mg/mL)的可静脉内给药的产品。静脉内(IV)给药免疫球蛋白(IVIG)是用于免疫缺陷个体的主要治疗。尽管早期的IVIG制剂引起严重的副作用，但是目前可获得的IVIG制剂在大多数免疫缺陷患者中具有良好的耐受性。虽然如此，一小部分患者仍然具有不适的甚至瘫痪性的反应，例如头痛、疲倦和肌痛。发热和寒战的问题仍然存在，当患者具有并发性感染时更是如此。尽管尝试其他的IVIG制剂或者预先给药扑热息痛、苯海拉明和皮质类固醇，所述反应常常持续存在。另外，由于IV给药所需要的条件，存在患者依从性的问题。
免疫球蛋白的皮下（SQ）给药是静脉内给药的替代选择。与IV输注相比，免疫球蛋白的SQ给药具有几种优点。例如，其降低全身反应的发生率，不需要有时难以建立的IV通路，提高谷水平，以及给予患者更多的自主性。
对于任何IG制剂的治疗用途而言，对IG产品的另一个重要考量是它们在保存过程中的稳定性。安全地处理和给药包含蛋白质的制剂对药物制剂人员而言是巨大的挑战。蛋白质具有表现出稳定性问题的独特的化学和物理性质：蛋白质具有多种降解途径，这涉及到化学不稳定性和物理不稳定性。化学不稳定性包括脱氨、聚集、肽主链的剪切(clipping)和甲硫氨酸残基氧化。物理不稳定性包括许多现象，包括例如聚集。因此需要免疫球蛋白制品的稳定制剂。
发明概述
本文提供配制用来皮下给药稳定的液体复合制剂以治疗IG可治疗的疾病和病症的组合物、方法和药盒。本文提供配制成用于皮下给药的稳定的液体复合制剂组合物，其包含浓度至少为10%w/v的免疫球蛋白(IG)、浓度至少为50U/mL并且以至少100单位/克(U/g)IG的比例存在的可溶性透明质酸酶、浓度至少为50mM的NaCl并且pH为4-5。所述复合制剂在28℃-32℃下稳定保存至少6个月。
另外，可存在氨基酸稳定剂，例如丙氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸。在一些实施方案中，所述氨基酸以至少100mM的量存在。在一个实施方案中，所述氨基酸是甘氨酸并且以100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM或更多，或者至少100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM或更多的量存在。在另一实施方案中，所述甘氨酸的量是250mM。
本文提供的稳定的液体复合制剂包含至少10%-22%的IG，例如10%w/v、11%w/v、12%w/v、13%w/v、14%w/v、15%w/v、16%w/v、17%w/v、18%w/v、19%w/v、20%w/v、21%w/v、22%w/v或更多。在一些实施方案中，所述IG为10%w/v或20%w/v。所述复合制剂中使用的IG来自人血浆，例如，其可通过例如醇分级分离从人血浆纯化而来。在一些实施方案中，所述IG通过以下方法中的任何一种或多种被进一步纯化：化学改性、在存在或不存在胃蛋白酶的条件下于pH 4.0温育、聚乙二醇(PEG)沉淀、离子交换色谱法、酶裂解、溶剂/去污剂处理、渗滤或超滤。本文提供的复合制剂可使用包含IgG、IgA和IgM的IG。在一些实施方案中，所述IG包含大于95%的IgG。
另外，所述复合制剂可包含NaCl。在一些实施方案中，所述NaCl的浓度为50mM-220mM，例如50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210mM、220mM或更高。在一个实施方案中，所述NaCl的浓度是150mM。
本文提供的复合制剂包含可为PH20或其截短形式的可溶性透明质酸酶。例如，所述可溶性透明质酸酶可为羊PH20、牛PH20或截短的人PH20。在所述PH20为截短的人PH20的一些实施方案中，所述截短的人PH20可选自具有SEQ ID NO:4-9中任一序列所示的氨基酸序列的多肽、或者其等位基因变体或其他变体。在一个实施方案中，所述可溶性透明质酸酶是rHuPH20。
另外，所述可溶性透明质酸酶的浓度可为50U/mL-500U/mL，例如50U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL，或更高。例如，所述可溶性透明质酸酶的浓度可为100U/mL或300U/mL。在本文提供的复合制剂中，所述可溶性透明质酸酶可以100U/g IG-5000U/g IG的比例存在，例如100U/g IG、150U/g IG、200U/g IG、250U/g IG、300U/gIG、400U/g IG、500U/g IG、600U/g IG、700U/g IG、800U/g IG、900U/gIG、1000U/g IG、1200U/g IG、1500U/g IG、1800U/g IG、2000U/g IG、3000U/g IG、4000U/g IG、5000U/g IG或更高。在一些实施方案中，所述可溶性透明质酸酶的比例为500U/g IG、1000U/g IG、1500U/g IG或3000U/g IG。浓缩形式的所述复合制剂的pH可为4.4-4.9。
本文提供的复合制剂可配制成用于多剂量给药或单剂量给药。另外，在所述复合制剂用于单剂量给药的实施方案中，所述IG的量足以治疗IG可治疗的疾病或病症。可每日一次、每周一次、每两周一次、每2-3周一次、每3-4周一次或每月一次给药所述IG以治疗IG可治疗的疾病或病症。进行所述复合制剂的给药使得IG的给药量与静脉内给药治疗IG可治疗的疾病或病症时的单剂量给药的量基本相同。在一些实施方案中，所述复合制剂中的IG的量可为约1克(g)-200g，例如，1克(g)、2g、3g、4g、5g、10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g或200g。另外，所述组合物中透明质酸酶的量可为约500单位-100000单位，例如500单位、1000单位、2000单位、5000单位、10000单位、30000单位、40000单位、50000单位、60000单位、70000单位、80000单位、90000单位、100000单位或更多。
本文提供的液体复合制剂在28℃-32℃下稳定至少6个月-1年，例如6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。所述液体复合制剂还在0℃-10℃下稳定至少6个月-2年，例如6个月、1年、2年或更长。
本文还提供包含本文提供的稳定的液体复合制剂中的任何一种和任选存在的使用说明书的药盒。
本文提供包含本文提供的稳定的液体复合制剂的容器。所述容器可为管、瓶、小瓶或注射器。在所述容器是注射器的实施方案中，所述容器还包括注射针。因此，本文提供的容器包含用于单剂量给药或多剂量给药的稳定的液体复合制剂。
本文提供通过向个体皮下给药包含可溶性透明质酸酶和IG的稳定的液体复合制剂治疗IG可治疗的疾病或病症的方法。给药所述复合制剂使得IG的给药量与静脉内给药治疗IG可治疗的疾病或病症时的量基本相同。
另外，本文提供的方法用于治疗IG可治疗的疾病或病症，其选自原发性免疫缺陷病、继发性免疫缺陷病、炎性疾病、自身免疫疾病和急性感染。
在一些实施方案中，可使用本文提供的方法给药所述复合制剂来治疗原发性免疫缺陷病。所述原发性免疫缺陷病可为普通变异型免疫缺陷病(CVID)、选择性IgA缺陷、IgG亚类缺陷、特异性抗体缺陷、补体病、先天性无丙种球蛋白血症、共济失调性毛细血管扩张症、高IgM、维-奥二氏综合征、重症联合免疫缺陷(SCID)、原发性低丙种球蛋白血症、伴有抗体缺陷的原发性免疫缺陷病、X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)或婴儿低丙种球蛋白血症。
在其他实施方案中，所述IG可治疗的疾病或病症是继发于血液恶性肿瘤的获得性免疫缺陷病。所述血液恶性肿瘤可选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
在所述IG可治疗的疾病或病症是炎性疾病或自身免疫疾病的情况下，所述炎性疾病或自身免疫疾病可选自川崎病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、格林-巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、多肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎、朗-爱二氏肌无力综合征、多灶性运动神经病、重症肌无力以及默-沃二氏综合征。
在一些实施方案中，给药所述复合制剂治疗急性的细菌感染、病毒感染或真菌感染，例如B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；A型和B型铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；B型链球菌；1型、3型、4型、6型、7型、8型、9型、12型、14型、18型、19型和23型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；2型和5型腺病毒；巨细胞病毒；非洲淋巴细胞瘤病毒VCA；甲型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；单纯疱疹病毒-1；单纯疱疹病毒-2；A型流感病毒；麻疹；1型、2型和3型副流感病毒；脊髓灰质炎病毒；水痘带状疱疹病毒；曲霉菌属（Aspergillus）以及白色念珠菌(Candida albicans)。
另外，所述IG可治疗的疾病或病症可选自医源性免疫缺陷、急性播散性脑脊髓炎、ANCA-阳性系统性坏死性血管炎、自身免疫性溶血性贫血、大疱性类天疱疮、疤痕性类天疱疮、伊文思综合征（包括伴有免疫性血小板减少症的自身免疫性溶血性贫血）、胎-母/新生儿同种免疫性血小板减少症(FMAIT/NAIT)、噬血细胞综合征（haemophagocytic syndrome）、高风险同种异体造血干细胞移植、IgM副蛋白血症神经病（paraproteinaemicneuropathy）、肾移植、多发性硬化症、视性眼阵挛-肌阵挛共济失调、落叶性天疱疮、寻常型天疱疮、输血后紫癜、中毒性表皮坏死松解症/史-约综合征(TEN/SJS)、中毒性休克综合征、阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤、败血症、B细胞瘤、无抗体的副肿瘤性小脑变性以及骨髓移植。
发明详述
大纲
A.定义
B.免疫球蛋白(IG)和透明质酸酶的稳定的复合制剂
1.免疫球蛋白治疗
2.免疫球蛋白和透明质酸酶制剂的皮下给药
3.稳定的复合制剂
C.免疫球蛋白和免疫球蛋白的制备
1.制备和纯化
a.Cohn-Oncley法
b.改良的Cohn-Oncley操作
c.病毒处理
d.蛋白质浓缩
e.示例性的IG制剂
i.10%IG
ii.高浓度IG制剂（例如20%IG）
2.保存稳定性
a.稳定蛋白质的赋形剂
b.pH
D.透明质酸酶
1.PH20
2.可溶性透明质酸酶
a.可溶性人PH20
b.可溶性重组人PH20（rHuPH20）
3.糖基化
4.修饰透明质酸酶以提高它们的药动学性质
E.制备编码可溶性透明质酸酶及其多肽的核酸的方法
1.载体和细胞
2.表达
a.原核细胞
b.酵母细胞
c.昆虫细胞
d.哺乳动物细胞
e.植物
3.纯化技术
F.免疫球蛋白和可溶性透明质酸酶多肽的制备、制剂和给药
1.制剂和剂量
a.免疫球蛋白
b.透明质酸酶
c.氯化钠
d.氨基酸稳定剂
e.其他物质
2.剂型
3.给药
G.评价活性、稳定性、生物利用度和药动学的方法
1.分子大小
2.生物活性
a.免疫球蛋白
b.透明质酸酶
1.药动学和耐受性
H.治疗方法和治疗用途
1.原发性和继发性免疫缺陷
a.原发性免疫缺陷
b.继发性免疫缺陷
2.炎性疾病和自身免疫疾病
a.川崎病
b.慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病
c.格林-巴利综合征
d.特发性血小板减少性紫癜
e.炎性肌病
i.皮肌炎
ii.多肌炎
iii.包涵体肌炎
f.朗-爱二氏肌无力综合征
g.多灶性运动神经病
h.重症肌无力
i.默-沃二氏综合征。
3.急性感染
4.其他疾病和病症
I.制品和药盒
J.实施例
A.定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。除非另外指明，本文的完整公开内容通篇提及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、Genbank序列、数据库、网站以及其他公开材料以其整体通过援引加入本文。当本文术语存在多个定义时，以本章节的那些为准。当提及URL或其他此类标识符(identifier)或地址时，应理解此类标识符可发生变化并且因特网上的具体信息会不断变化，但是通过搜索因特网能够发现等同的信息。对它们的引用表明此类信息的可获得性和公开传播性。
本文中使用的“免疫球蛋白（immunoglobulin）”、“免疫球蛋白（immuneglobulin）”、“γ-球蛋白”指来自合并的成体供体的血浆的血浆蛋白的制剂。IgG抗体为主；存在其他抗体亚类，例如IgA和IgM。治疗性免疫球蛋白能够通过提高受者的循环抗体的血清水平提供被动免疫。IgG抗体能够例如结合并中和细菌毒素；对病原体起调理作用；活化补体；以及通过与细胞因子及其受体（例如CD5、白介素-1a(IL-1a)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和T-细胞受体）的相互作用抑制致病性细胞因子和吞噬细胞。治疗性免疫球蛋白能够抑制自身抗体的活性。免疫球蛋白制剂还包括但是不限于静脉内给药免疫球蛋白(IGIV)、免疫球蛋白IV、治疗性免疫球蛋白。免疫球蛋白制剂是公知的并且包括例如以下商品名：
Figure BDA00001645193200081
N、S/D、
Figure BDA00001645193200084
-P、
Figure BDA00001645193200085
EN、
Figure BDA00001645193200086
S/D、 -I、
Figure BDA000016451932000810
-S、
Figure BDA000016451932000811
SDF等。免疫球蛋白制剂可源自人血浆，或者其为重组制备的。
如本文所使用，“静脉内给药IgG”或“IVIG”治疗通常指向患者静脉内给药IgG免疫球蛋白的组合物来治疗多种病症例如免疫缺陷、炎性疾病和自身免疫疾病的治疗方法。所述IgG免疫球蛋白通常从血浆中合并和制备而来。可使用完整的抗体或片段。
如本文所使用，IG可治疗的疾病或病症指对其使用免疫球蛋白制剂的任何疾病或病症。此类疾病和病症包括但不限于其中循环抗体的增加具有改善作用的任何疾病，例如免疫缺陷、继发于血液恶性肿瘤的获得性低丙种球蛋白血症、川崎病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、格林-巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、炎性肌病、朗-爱二氏肌无力综合征、多灶性运动神经病、重症肌无力、默-沃二氏综合征、继发性低丙种球蛋白血症（包括医源性免疫缺陷）、特异性抗体缺陷、急性播散性脑脊髓炎、ANCA-阳性系统性坏死性血管炎、自身免疫性溶血性贫血、大疱性类天疱疮、疤痕性类天疱疮、伊文思综合征（包括伴有免疫性血小板减少症的自身免疫性溶血性贫血）、胎-母/新生儿同种免疫性血小板减少症(FMAIT/NAIT)、噬血细胞综合征、高风险同种异体造血干细胞移植、IgM副蛋白血症神经病、肾移植、多发性硬化症、视性眼阵挛-肌阵挛共济失调、落叶性天疱疮、寻常型天疱疮、输血后紫癜、中毒性表皮坏死松解症/史-约综合征(TEN/SJS)、中毒性休克综合征、阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤、败血症、B细胞瘤、创伤以及细菌感染、病毒感染或真菌感染。
如本文所使用，室温指一般约18℃或18℃--约32℃或32℃。本领域技术人员理解室温随地点和当前的气候条件而变化。例如，在较温暖的气候下例如在意大利或德克萨斯室温会较高。
如本文所使用，就本文提供的复合制剂而言，“稳定的”或“稳定性”指其中的蛋白质（IG和透明质酸酶）在最高32℃的温度下保存至少六个月后基本保持他们的物理和化学稳定性和完整性的复合制剂。就本发明而言，“室温下的稳定性”指在较温暖场所的典型室温的较高范围（即对于意大利或德克萨斯而言为28-32℃）内的稳定性。所述制剂在冷藏温度至室温的范围内即0-32℃或者在最高32℃下稳定至少六个月。在包括最高32℃或约32℃的温度的室温下保存至少六个月后，所述IG和透明质酸酶各自在所述复合制剂中表现出稳定性。评价各自的稳定性的测定法是本领域技术人员公知的并且描述于本文。
如本文所使用，IG稳定性指所述IG基本不会聚集、变性或片段化以致于至少90%的所述IG以单体或寡聚体/二聚体形式存在，其中所述IG的分子量为＞70kDa或约＞70kDa并且<450kDa。因此，少于约10%，例如少于约5%、少于约4%、少于约3%、少于约2%、少于约1%的所述IG蛋白在所述制剂中以聚集体（即分子大小大于或等于450kDa）形式存在。类似地，所述复合制剂中不多于5%-7%，例如7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0.5%或更少的IG被片段化（即分子大小低于70kDa）。
如本文所使用，所述透明质酸酶的稳定性指其保留了在保存前的初始透明质酸酶活性的至少50%、60%、70%、80%、90%或更多。评价透明质酸酶活性的测定法是本领域技术人员已知的并且描述于本文。
如本文所使用，“保存”指制剂在制备后没有被立即给药于个体，而是在使用前于特定的条件下（例如特定的温度；以液体或冻干形式）保存一段时间。例如，可将液体制剂在给药于个体之前在不同的温度下例如冷藏温度（0℃-10℃）或室温（例如最高32℃的温度）下保存数天、数周、数月或数年，一般至少六个月。
如本文所使用，给药方案指免疫球蛋白的给药量和给药频率。所述给药方案随被治疗的疾病或病症变化，并因此可不同。
如本文所使用，“基本与静脉内IG(IVIG)给药方案相同”指这样的方案，其中所述剂量和/或频率在有效治疗具体的疾病或病症的量的范围之内，通常为IV剂量或频率的约10%或10%。有效治疗具体的疾病或病症的IVIG的量是已知的或者可由本领域技术人员凭经验确定。例如，如下文所举例，300mg/kg（即，对于平均成人体重70kg为21克）-600mg/kg（即42克）是给药于患有原发性免疫缺陷病的患者的典型的IVIG每月剂量。因此，当与透明质酸酶联合给药时，以300mg/kg-600mg/kg或约300mg/kg-600mg/kg的剂量皮下给药IG用于治疗原发性免疫缺陷病。
如本文所使用，给药频率指免疫球蛋白的连续给药之间的时间。例如，频率可为一周、两周、三周、四周并且随被治疗的具体的疾病或病症而变化。频率通常为至少每两周一次或每三周一次，并且通常不低于每月一次。
如本文所使用，透明质酸酶指降解透明质酸的酶。透明质酸酶包括细菌透明质酸酶(EC 4.2.99.1)，来自水蛭、其他寄生虫和甲壳动物(EC 3.2.1.36)的透明质酸酶以及哺乳动物类型的透明质酸酶(EC 3.2.1.35)。透明质酸酶还包括任何非人来源（包括但不限于鼠科、犬科、猫科、兔属、鸟类、牛、羊、猪、马、鱼类、蛙类、细菌）的，和任何来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类动物的。示例性非人透明质酸酶包括，来自奶牛的透明质酸酶(SEQ IDNO:10和11)、来自黄蜂的(SEQ ID NO:12和13)、来自蜜蜂的(SEQ IDNO:14)、来自白脸大黄蜂的(SEQ ID NO:15)、来自胡蜂的(SEQ ID NO:16)、来自小鼠的(SEQ ID NO:17-19,32)、来自猪的(SEQ ID NO:20-21)、来自大鼠的(SEQ ID NO:22-24,31)、来自家兔的(SEQ ID NO:25)、来自绵羊的(SEQID NO:26和27)、来自猩猩的(SEQ ID NO:28)、来自食蟹猴的(SEQ IDNO:29)、来自豚鼠的(SEQ ID NO:30)、来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的(SEQ ID NO:33)、来自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）)的(SEQ ID NO:34)以及来自产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的(SEQ ID NO:35)的透明质酸酶。透明质酸酶也包括人源的那些。示例性人透明质酸酶包括HYAL1(SEQ ID NO:36)、HYAL2(SEQ ID NO:37)、HYAL3(SEQ ID NO:38)、HYAL4(SEQ ID NO:39)和PH20(SEQ ID NO:1)。透明质酸酶也包括可溶性透明质酸，包括羊和牛PH20、可溶性人PH20以及可溶性rHuPH20。
提到的透明质酸酶包括前体透明质酸酶多肽和成熟透明质酸酶多肽（例如已去除其中的信号序列的那些）、其具有活性的截短形式，并包括与SEQ ID NO:1和10-39中所示前体多肽或其成熟形式具有至少40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的等位基因变体和物种变体、由剪接变体编码的变体和其他变体，包括多肽。例如，提到的透明质酸酶也包括SEQ ID NO:50-51所示的人PH20前体多肽变体。透明质酸酶也包括包含化学或翻译后修饰的那些以及不包含化学或翻译后修饰的那些。这些修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化(albumination)、糖基化、法尼基化、羧基化、羟基化、磷酸化和其他本领域已知的多肽修饰。
如本文所使用，可溶性透明质酸酶指以其在生理条件下的可溶性为特征的多肽。通常，可溶性透明质酸酶缺失全部或部分的糖基磷脂酰锚蛋白(GPI)，或者与细胞膜的锚定不足。因此，可溶性透明质酸酶在由细胞表达后被分泌到培养基中。可溶性透明质酸酶可通过例如其分配在加热到37℃的Triton X-114溶液的水相中进行区分(Bordier等人,(1981)J.Biol.Chem.,256:1604-7)。膜锚定的例如脂质锚定的透明质酸酶会分配到富含去污剂的相中，但是用磷脂酶C处理后会分配到去污剂含量少的相中或水相中。可溶性透明质酸酶包括这样的膜锚定透明质酸酶，其中的该透明质酸酶锚定至膜相关的一个或多个区域已被去除或修饰，其中该可溶性形式保持了透明质酸酶活性。可溶性透明质酸酶包括重组可溶性透明质酸酶和那些包含于或纯化自天然来源例如来自绵羊或奶牛的睾丸提取物的那些。这样的可溶性透明质酸酶的实例是可溶性人PH20。其他可溶性透明质酸酶包括羊(SEQ ID NO:27)和牛(SEQ ID NO:11)PH20。
如本文所使用，可溶性人PH20或sHuPH20包括成熟多肽，所述多肽在C-端缺乏全部或部分糖基磷脂酰肌醇（GPI）附着位点，使得表达后所述多肽为可溶性的。示例性sHuPH20多肽包括具有SEQ ID NO:4-9和47-48中任一序列所示氨基酸序列的成熟多肽。这样的示例性sHuPH20多肽的前体多肽包括信号序列。所述前体的示例为SEQ ID NO:3和40-46所示的那些，其中每一个均在氨基酸位点1-35包含35个氨基酸的信号序列。可溶性HuPH20多肽也包括在本文所述的生产和纯化方法之中或之后降解的那些。
如本文所使用，可溶性重组人PH20(rHuPH20)指重组表达于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的可溶形式的人PH20。可溶性rHuPH20由包含所述信号序列并由SEQ ID NO:49所示的核酸编码。也包括作为其等位基因变体和其他可溶性变体的DNA分子。编码可溶性rHuPH20的核酸表达于分泌所述成熟多肽的CHO细胞中。当产生于培养基中时，在C-端存在异质性使得该产物包含不同种（species）的混合物，其可包含各种丰度的一个或多个SEQ ID NO.4-9。也包括对应的等位基因变体和其他变体，包括对应于SEQ ID NO:50-51中所示前体人PH20多肽的那些。其他变体可与SEQ IDNO:4-9和47-48中任一序列具有60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列相同性，只要它们保持透明质酸酶活性并且为可溶的。
如本文所使用，活性指与全长（完整）蛋白相关的多肽或其部分的一种或多种功能活性。功能活性包括但不限于生物学活性、催化或酶活性、抗原性（与多肽结合或竞争以结合抗-多肽抗体的能力）、免疫原性、形成多聚体的能力以及特异结合至所述多肽的受体或配体的能力。
如本文所使用，透明质酸酶活性指透明质酸酶裂解透明质酸的能力。测定透明质酸酶例如可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性的体外测定法是本领域已知的并且描述于本文。示例性的测定法包括下文描述的微浊度测定（参见例如实施例3），其通过检测未裂解的透明质酸与血清白蛋白结合时形成的不溶性沉淀间接测定透明质酸酶对透明质酸的裂解。
本文使用的术语“超滤(UF)”包括多种膜过滤法，其中静水压力迫使液体通过半透膜。悬浮的固体和高分子量溶质被截留，而水和低分子量溶质通过所述膜。该分离过程通常被用于纯化和浓缩大分子(103-106Da)溶液，特别是蛋白质溶液。根据它们所截留的分子的大小可获得多种超滤膜。超滤的典型特征为膜孔径为1-1000kDa以及操作压力为0.01-10bar，并且特别适用于将胶体例如蛋白质与小分子例如糖和盐分离。
本文使用的术语“渗滤”是使用与超滤相同的膜来进行的并且是切向流过滤。在渗滤过程中，将缓冲液引入循环槽同时从单元操作移除滤液。在产物是在渗余物（例如IgG）中的方法中，渗滤将组分从产物池洗到滤液中，由此交换缓冲液并降低了不利物质的浓度。
本文使用的术语“混合”描述通过任何形式的搅拌引起两种或更多种不同的化合物或物质在溶液或悬浮液中平均分布的行为。当本申请中使用该术语时，“混合”的结果不要求为所有成分在溶液或悬浮液中完全平均的分布。
本文使用的术语“溶剂”包括能够溶解或分散一种或多种其他物质的任何液体物质。溶剂的性质可为无机的，例如水，或者其可为有机液体，例如乙醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、石油醚等。如术语“溶剂去污剂处理”中所使用，溶剂表示有机溶剂（例如磷酸三正丁酯），其为用于灭活溶液中的脂包膜病毒的溶剂去污剂混合物的一部分。
本文使用的术语“去污剂”在本申请中与“表面活性剂”或“表面作用剂”互换使用。表面活性剂通常是两亲性的（即包含疏水基团（“尾部”）和亲水基团（“头部”））的有机化合物，这使得表面活性剂可溶于有机溶剂和水。可通过表面活性剂头部的有效电荷基团的存在将其分类。非离子型表面活性剂在其头部无带电荷的基团，而离子型表面活性剂在其头部携带静电荷。两性离子型表面活性剂包含携带两种带相反电荷的基团的头部。常用表面活性剂的一些实例包括：阴离子型（基于硫酸根、磺酸根或羧酸根阴离子）：全氟辛酸盐（PFOA或PFO）、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸铵和其他烷基硫酸盐、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠（还称作月桂基醚硫酸钠或SLES）、烷基苯磺酸盐；阳离子型（基于季铵阳离子）：鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)（还称作十六烷基三甲基溴化铵），和其他烷基三甲基铵盐、十六烷基氯化吡啶鎓(CPC)、聚乙氧基化牛油脂肪胺(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)；两性离子型（两性的）：十二烷基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺两性基甘氨酸盐(cocoampho glycinate)；非离子型：烷基聚(氧化乙稀)、烷基酚聚(氧化乙稀)、聚(氧化乙稀)和聚(氧化丙烯)的共聚物（商品为Poloxamers或Poloxamines）、烷基聚葡糖苷，包括辛基葡糖苷、癸基麦芽苷、脂肪醇（例如十六烷醇和油醇）、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、聚山梨酯（吐温20，吐温80等）、Triton去污剂以及十二烷基二甲基氧化胺。
如本文所使用，天然存在的α-氨基酸的残基为那些自然届发现的20个α-氨基酸的残基，其通过人体中加载的（charged）tRNA分子与其同族的mRNA密码子的特异性识别而并入蛋白质中。
如本文所使用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可为单链或双链的。当指探针或引物（其任选地被例如可检测标记如荧光或放射标记进行标记）时，单链分子是被涵盖的。这些分子通常具有的长度使得在用于探测或引导文库时它们的靶点是统计学上独特的或具有低拷贝数（通常小于5，一般小于3）。通常探针或引物包含至少14、16或30个与感兴趣的基因互补或相同的连续核苷酸序列。探针和引物的长度可为10、20、30、50、100或更多核酸。
如本文所使用，肽指长度为2-40个氨基酸的多肽。
如本文所使用，出现在本文提供的各种氨基酸序列中的氨基酸根据它们已知的三字母或单字母缩写（表1）进行识别。出现在各种核酸片段中的核苷酸以本领域常规使用的标准的单字母名称进行命名。
如本文所使用，“氨基酸”为包含氨基和羧基的有机化合物。多肽包含两个或多个氨基酸。用于本文目的，氨基酸包括所述二十个天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物（即，其中的α-碳具有侧链的氨基酸）。
如本文所使用，“氨基酸残基”指多肽在其肽键处的化学消化（水解）所形成的氨基酸。假定本文描述的氨基酸残基为“L”异构形式。如此命名的“D”异构形式的残基可由任何L-氨基酸残基取代，只要所述多肽保留期望的功能性质。NH2指存在于多肽氨基端的游离氨基。COOH指存在于多肽羧基端的游离羧基。为了与J.Biol.Chem.,243:3557-3559(1968)中描述并在37C.F.R.§§1.821-1.822中采用的标准多肽命名法保持一致，氨基酸残基的缩写显示于表1。
表1–对照表
Figure BDA00001645193200151
Figure BDA00001645193200161
应注意本文以表达式显示的所有氨基酸残基序列在从氨基端到羧基端的常规方向中具有从左到右的定向。此外，短语“氨基酸残基”广泛定义为包括对照表（表1）中列出的氨基酸以及经修饰的和稀有的氨基酸，例如37C.F.R.§§1.821-1.822中提到的那些，并通过援引将其纳入本文。而且，应注意氨基酸残基序列的开头或结尾处的破折号表示肽键，其与一个或多个氨基酸残基的进一步的序列连接，或者与例如NH2的氨基端基团或与例如COOH的羧基端基团连接。
如本文所使用，“天然氨基酸”指出现在多肽中的20种L-氨基酸。
如本文所使用，“非天然氨基酸”指具有与天然氨基酸相似的结构但是经结构修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。因此非天然氨基酸包括例如除所述20种天然氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，并包括但不限于氨基酸的D-立体异构体。示例性非天然氨基酸描述于本文并是本领域技术人员已知的。
如本文所使用，等功能混合物是这样的混合物，其中氨基酸的摩尔比已基于它们已报道的反应速率进行了调节（参见例如Ostresh等人,(1994)Biopolymers 34:1681）。
如本文所使用，修饰指多肽的氨基酸序列的修饰或核酸分子中核苷酸序列的修饰，并且分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和取代。修饰多肽的方法对于本领域技术人员是常规的，例如通过使用重组DNA方法。
如本文所使用，适合的氨基酸保守取代是本领域技术人员已知的并且通常可在不改变所得分子的生物活性的条件下进行。本领域技术人员通常会认识到多肽的非必要区域的单个氨基酸取代基本不改变生物活性(参见例如,Watson等人,Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,TheBenjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。可根据下文表1A中列出的那些进行取代：
表1A
还允许进行其他取代并且可凭经验或根据已知的保守取代来确定。
如本文所使用，DNA构建体为包含以自然界不存在的方式结合和并列的DNA区段的单链或双链、线性或环状的DNA分子。DNA构建体由于人为操作而产生并包括所操作分子的克隆和其他拷贝。
如本文所使用，DNA区段为较大DNA分子的具有特定属性的部分。例如编码特定多肽的DNA区段为较长DNA分子的部分，例如质粒或质粒片段，当从5’至3’方向阅读时其编码所述特定多肽的氨基酸序列。
如本文所使用，术语多聚核苷酸指从5’至3’端阅读的脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的单链或双链聚合物。多聚核苷酸包括RNA和DNA，且可分离自天然来源、在体外合成或从自天然和合成分子的组合制备。本文以核苷酸（缩写为“nt”）或碱基对（“缩写为bp”）的方式给出多聚核苷酸分子的长度。当上下文允许时将术语核苷酸用于单链和双链分子。当将该术语用于双链分子时，其用于表示完整长度并理解为等同于术语碱基对。本领域技术人员会意识到双链多聚核苷酸的两条链的长度可略有差异并因此这些末端可为交错的；因此双链多聚核苷酸分子中的核苷酸可以不全是配对的。这些未配对末端的长度一般不超多20个核苷酸。
如本文所使用，两个蛋白质或核酸之间的“相似性”指所述蛋白质的氨基酸序列或所述核酸的核苷酸序列之间的相关性。相似性可基于残基序列及其中所包含残基的相同性和/或同源性的程度。评价蛋白质或核酸之间相似性的程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，在一种评价序列相似性的方法中，以得到序列之间最大相同性水平的方式比对两个氨基酸或核苷酸序列。“相同性”指氨基酸或核苷酸序列无变化的程度。氨基酸序列的比对以及某种程度上核苷酸序列的比对，也可以考虑氨基酸（或核苷酸）中的保守性差异和/或经常性取代。保守性差异是那些保持所涉及残基的理化性质的差异。比对可为全局性的（所比对序列在这些序列全长上的比对并包括所有残基）或局部性的（仅包括最相似的一个或多个区域的一部分序列的比对）。
“相同性”本身具有本领域认可的含义并可采用已公开的技术计算。（参见，例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversity Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,eds.,HumanaPress,New Jersey，1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;和Sequence Analysis Primer,Gribskov，M.和Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991）。尽管存在许多测定两个多聚核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”为本领域技术人员熟知(Carillo,H.&Lipton,D.,SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。
如本文所使用，同源的（就核酸和/或氨基酸序列而言）意指约大于或等于25%的序列同源性，通常大于或等于25%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列同源性；必要时可指定精确的百分数。用于本文目的，术语“同源性”和“相同性”通常可替换使用，除非另外指明。一般而言，为了测定同源性或相同性百分数，将序列进行比对以得到最高等级的匹配（参见，例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I，Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey，1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;和Sequence Analysis Primer,Gribskov，M.和Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991;Carillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073）。就序列同源性而言，保守氨基酸的数量通过标准比对算法程序来测定，并且可与各供应商建立的默认空位罚分(gappenalties)一起使用。基本上同源的核酸分子通常会沿着所感兴趣的核酸的长度以中等的严格性或高度的严格性杂交。也涵盖包含取代杂交核酸分子中密码子的简并密码子的核酸分子。
任何两个分子是否具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%“相同”或“同源”的核苷酸序列或氨基酸序列可采用已知的计算机算法例如"FASTA"程序，使用例如Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA 85:2444中的默认参数来测定(其他程序包括GCG程序包(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research 12(I):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等人,J Molec Biol 215:403(1990));Guide toHuge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,和Carillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，National Center forBiotechnology Information数据库的BLAST功能可用于测定相同性。其他可商购的或可公开获得的程序包括DNAStar"MegAlign"程序(Madison,WI)和University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG)"Gap"程序(Madison WI)。蛋白质和/或氨基酸分子的同源性或相同性百分数可通过例如采用GAP计算机程序(例如，Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443,由Smith和Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2:482修改)比较序列信息来测定。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号（即核苷酸或氨基酸）的数量除以两个序列中较短序列的符号的总数。用于GAP程序的默认参数可以包括：（1）一元比较矩阵（comparison matrix）（包括相同为数值1，不相同为0）和Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff，eds.,ATLAS OF PROTEIN SEQUENCEAND STR UCTURE,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)所述；（2）每一个空位罚分3.0和每一个空位中每一个符号另外罚分0.10；以及（3）末尾空位不罚分。
因此，如本文所使用，术语“相同性”或“同源性”表示待测和参比多肽或多聚核苷酸之间的比较。如本文所使用，术语至少“90%相同”指相对于多肽的参比核酸或氨基酸序列从90到99.99的相同性百分数。90%或更高水平的相同性表明下列事实：假设为了举例说明，比较长度为100个氨基酸的待测和参比多肽。待测多肽中不多于10%（即100中的10个）的氨基酸与参比多肽的不同。可在待测和参比多聚核苷酸之间进行相似的比较。这些差异可表现为随机分布在多肽全长中的点突变，或者它们聚集在长度变化的一个或多个位置，所述长度变化可长至最大允许的值，例如10/100氨基酸差异（约90%相同性）。差异定义为氨基酸取代、插入或缺失。在同源性或相同性大于约85-90%的水平时，该结果应不依赖于程序或所设定的空位参数；这样的高水平相同性可容易地进行评价，通常通过手工比对而不依赖于软件。
如本文所使用，被比对的序列指使用同源性（相似性和/或相同性）比对核苷酸或氨基酸序列中的对应位点。通常，比对由50%或更高相同性相关联的两个或多个序列。序列的比对集合指在对应位置比对的2个或多个序列并可包括比对衍生自RNA的序列，例如与基因组DNA序列比对的EST和cDNA。
如本文所使用，“引物”指在适当条件下（例如，存在四种不同的三磷酸核苷和聚合剂例如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶），在适当的缓冲液中以及在合适的温度下可作为模板引导的DNA合成的起始点的核酸分子。应理解某些核酸分子可作为“探针”和“引物”。然而，引物具有用于延伸的3’羟基基团。引物可用于各种方法中，包括例如聚合酶链式反应（PCR）、逆转录酶(RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多重PCR、锅柄(panhandle)PCR、捕获(capture)PCR、表达PCR、3'和5'RACE、原位PCR、连接介导的PCR和其他扩增方案。
如本文所使用，“引物对”指包括与预扩增（例如，通过PCR）序列的5'端杂交的5'（上游）引物和与预扩增序列3'端互补序列（complement）杂交的3'（下游）引物的集合。
如本文所使用，“特异性杂交”指核酸分子（例如，寡聚核苷酸）与目标核酸分子通过互补碱基配对的退火（annealing）。本领域技术人员熟知影响特异性杂交的体外和体内参数，例如特定分子的长度和组成。与体外杂交尤其相关的参数另外包括退火和洗脱温度、缓冲液组成和盐浓度。用于去除非特异结合的核酸分子的示例性的高度严格性洗脱条件为0.1xSSPE、0.1%SDS、65°C，中度严格性洗脱条件为0.2x SSPE、0.1%SDS、50°C。等效严格性条件是本领域已知的。本领域技术人员可轻易地调整这些参数以达到核酸分子和目标核酸分子的特异杂交以用于具体应用。当指两个核苷酸序列时，互补指两个核苷酸序列能够杂交，通常相对的核苷酸之间的错配（mismatches）低于25%、15%或5%。必要时可指定互补性百分数。通常选择两个分子使得它们会在高度严格性条件下杂交。
如本文所使用，与产物基本相同指足够相似，从而使感兴趣的性质基本未改变，使得该基本相同的产物可替代该产物使用。
如本文所使用，也应理解术语“基本相同”或“相似”如相关领域技术人员所理解随语境而变化。
如本文所使用，等位基因变体或等位基因变异指占据相同染色体基因座的基因的两种或多种可替换形式的任一种。等位基因变异通过突变自然产生并可在群体中引起表型多态性。基因突变可以是沉默的（所编码的多肽无变化）或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语“等位基因变体”也用于本文以表示由基因的等位基因变体编码的蛋白。通常基因的参比形式编码来自物种的群体或单一参比成员的多肽的野生形式和/或主要形式。通常，包括物种间或物种内变体的等位基因变体通常与来自相同物种的野生型和/或主要形式具有至少80%、90%或更高的氨基酸相同性；相同性的程度取决于该基因以及比较为物种间还是物种内。一般地，种内等位基因变体与多肽的野生型和/或主要形式具有至少约80%、85%、90%或95%相同性或更高，包括与多肽的野生型和/或主要形式具有96%、97%、98%、99%或更高的相同性。本文提及等位基因变体一般指相同物种成员之间的蛋白质中的变异。
如本文所使用，在本文中与“等位基因变体”可替换使用的“等位基因”指基因或其部分的可替换形式。等位基因占据同源染色体上的相同基因座或位置。当个体具有基因的两个相同等位基因时，认为该个体就该基因或等位基因而言是纯合的。当个体具有基因的两个不同等位基因时，认为该个体就该基因而言是杂合的。具体基因的等位基因可在单个核苷酸或数个核苷酸上彼此不同，并且可包括核苷酸取代、缺失和插入。基因的等位基因也可为包含突变的基因形式。
如本文所使用，物种变体指不同物种包括不同的哺乳动物物种例如小鼠和人之间的多肽的变体。
如本文所使用，剪接变体指由可得到多于一种mRNA的基因组DNA的初级转录的差异加工（differential processing）产生的变体。
如本文所使用，术语启动子指包含提供RNA聚合酶结合并起始转录的DNA序列的基因部分。启动子序列通常，但不总是，存在于基因的5'非编码区。
如本文所使用，分离的或纯化的多肽或蛋白质或其生物活性部分基本不含来自于产生该蛋白的细胞或组织的细胞物质或其他污染性蛋白质，或者当为化学合成的时基本不含化学前体或其他化学物质。如果制剂表现为不含用标准分析方法可轻易检测的杂质（所述标准分析方法如本领域技术人员用来评价这些杂质的薄层色谱法（TLC）、凝胶电泳和高效液相色谱法（HPLC）），则它们可被确定为基本上不含该杂质，或者足够纯以致于进一步纯化不能可检测地改变该物质的物理和化学性质，例如酶和生物学活性。用于纯化化合物以生产基本化学纯的化合物的方法是本领域技术人员已知的。然而，基本上化学纯的化合物可为立体异构体的混合物。在这些情况下，进一步纯化可增加该化合物的比活。
术语基本不含细胞物质包括其中的蛋白分离自细胞的细胞组分的蛋白制剂，该蛋白从所述细胞中分离或者在该细胞中重组产生。在一个实施方案中，术语基本不含细胞物质包括包含小于约30%（以干重计）非酶蛋白质（本文也称作污染性蛋白），一般小于约20%非酶蛋白质或10%非酶蛋白质或小于约5%非酶蛋白质的酶蛋白制剂。当该酶蛋白为重组产生时，它也基本不含培养基，即，以该酶蛋白制剂的体积计，培养基小于约20%、10%或5%或者为20%、10%或5%。
如本文所使用，术语基本不含化合物前体或其他化合物包括酶蛋白的制备品，其中所述蛋白分离自参与所述蛋白的合成的化合物前体或其他化合物。该术语包括包含小于约30%（以干重计）、20%、10%、5%或更少的化合物前体、非酶化合物或组分的酶蛋白制备品。
如本文所使用，当提及例如合成的核酸分子或合成的基因或合成的肽时，合成的指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
如本文所使用，使用重组DNA方法通过重组方式产生意指使用熟知的分子生物学方法表达由克隆DNA编码的蛋白质。
如本文所使用，载体（或质粒）指为了异源核酸的表达或复制而将其引入细胞中所使用的分离的元件（element）。这些载体通常保持为附加体，但是可经设计实现基因或其部分整合入基因组的染色体中。也涵盖作为人工染色体的载体，例如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这些载体的选择和用途为本领域技术人员所熟知。
如本文所使用，表达载体包括能够表达通过操作（operatively）与调控序列连接的DNA的载体，所述调节序列(例如启动子区)能够实现这些DNA片段的表达操作。这些额外的区段可包含启动子和终止子序列，并任选地可以包含一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或可包含二者的元件。因此，表达载体指在引入合适的宿主细胞后可引起克隆的DNA表达的重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体。合适的表达载体为本领域技术人员所熟知并包括可在真核细胞和/或原核细胞中复制的那些以及保持为附加体的那些或整合入宿主细胞基因组的那些。
如本文所使用，载体也包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒载体为通过操作与异源基因操作连接以将所述异源基因转移（作为载体或穿梭质粒（shuttle））进细胞的工程化病毒。
如本文所使用，当提及DNA区段时，操作性地（operably）连接或通过操作操作连接意指该区段经排列使得它们为了其预期目的一致发挥功能，例如转录在启动子中起始并沿着编码区段前进到达终止子。
如本文所使用，术语评价，就获得存在于样品中的蛋白质例如酶或蛋白酶、或其结构域的活性的绝对值以及就获得表明该活性的水平的指数、比例、百分数、直观的或其他数值指示而言，意在包括定量和定向测定。评价可以是直接的或间接的，并且实际检测的化学个体（species）本身不一定是反应的终产物例如蛋白酶解产物，但可以是例如其衍生物或一些另外的物质。例如，评价可以是通过例如SDS-PAGE和考马斯蓝蛋白质染色检测蛋白的裂解产物。
如本文所使用，生物活性指化合物的体内活性或体内给药化合物、组合物或其他混合物后引起的生理学反应。因此生物学活性涵盖这些化合物、组合物和混合物的疗效和药物活性。可在被设计用于试验或使用这些活性的体外系统中观察生物活性。因此，用于本文目的，蛋白酶的生物学活性为催化活性，多肽因之被水解。
如本文使用，当提及两个核酸序列时，相同意指所讨论的两个序列编码相同的氨基酸序列或相同的蛋白。当相同用于指两个蛋白或肽时，其意指这两个蛋白或肽具有基本相同的氨基酸序列，仅具有基本不改变该蛋白或肽的活性或功能的氨基酸取代。当相同指性质时，该性质不需要以相同的程度存在（例如，两个肽可显示不同速率的相同类型的酶活性），但是所述活性通常是基本相同的。
如本文所使用，“调节（modulate）”和“调节（modulation）”或“改变”指分子例如蛋白质的活性的改变。示例性的活性包括但不限于生物学活性，例如信号转导。调节可包括增加活性（即上调或激动剂活性）、降低活性（即下调或抑制）或活性的任何其他改变（例如周期性、频率、持续时间、动力学或其他参数的变化）。调节可为语境相关的并且通常将调节与指定状态例如野生型蛋白比较，该蛋白为组成型状态或该蛋白表达于指定的细胞类型或条件。
如本文所使用，组合物指任何混合物。其可为溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
如本文所使用，组合（combination）指两个或多个项目之间的任何关联。所述组合可为两个或多个分离的项目例如两种组合物或两个集合，可为其混合物，例如两个或多个项目的单一混合物或其任何变型。组合的要素通常在功能上关联或相关。
如本文所使用，药盒是任选包括其他要素例如另外的试剂和所述组合或其要素的使用说明书的被包装的组合。
如本文所使用，“疾病或病症”指由包括但不限于感染、获得性状况、遗传状况的病因或状况引起的生物体的病理状态，以可识别的症状为特征。本文感兴趣的疾病和病症为免疫球蛋白可治疗的那些。
如本文所使用，“治疗”患有疾病或病症的个体意指该个体的症状得到部分或全部缓解或在治疗后保持稳定。因此，治疗涵盖预防、治疗和/或治愈。预防指防止可能的疾病和/或防止症状的恶化或疾病的进展。治疗也涵盖本文提供的免疫球蛋白制剂和组合物的任何药物用途。
如本文所使用，药学上有效的药剂包括任何治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂、常规治疗药物包括小分子药物和治疗性蛋白质。
如本文所使用，治疗意指缓解或在其他方面有利地改变病症、障碍或疾病或其他适应症的症状的任何方式。
如本文所使用，疗效意指对个体的治疗引起的作用，所述治疗改变（通常为改善或缓解）疾病或病症的症状或者治愈疾病或病症。治疗有效量指在给药于个体后引起疗效的组合物、分子或化合物的量。
如本文所使用，术语“个体”指动物，包括哺乳动物，例如人。
如本文所使用，患者指人类个体。
如本文所使用，通过治疗例如通过给药药物组合物或其他治疗药改善具体疾病或病症的症状，意指可归因于或与所述组合物或治疗药的给药相关的所述症状的任何减少，不论是持久的或暂时的，永久的或短暂的。
如本文所使用，预防或防止指降低发生疾病或病症的风险的方法。
如本文所使用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指药剂、化合物、物质或包含化合物的组合物至少足以产生疗效的量。因此，其为用于预防、治疗、缓解、阻止或部分阻止疾病或病症的症状所必需的量。
如本文所使用，单位剂量形式指如本文领域已知的适用于人或动物个体并单独包装的物理不连续的单位。
如本文所使用，单一剂量制剂指用于直接给药的制剂。
如本文所使用，“制品”为生产和出售的产品。如本申请全文所使用，该术语意在涵盖包含于包装品（article of packaging）中的IG和透明质酸酶组合物。
如本文所使用，流体指任何可以流动的组合物。因此流体涵盖为半固体、糊剂、溶液剂、含水混合物、凝胶、洗剂、乳膏形式的组合物和其他这样的组合物。
如本文所使用，“药盒”指本文提供的组合物和另一用于包括但不限于活化、给药、诊断和评价生物学活性或性质的物品（item）。药盒任选包括使用说明书。
如本文所使用，细胞提取物或溶胞产物指从裂解的或破裂的细胞制备的制剂或部分(fraction)。
如本文所使用，动物包括任何动物，例如但不限于包括人、大猩猩和猴子在内的灵长类动物；啮齿类，例如小鼠和大鼠；家禽，例如鸡；反刍动物，例如山羊、奶牛、鹿、绵羊；羊，例如猪以及其他动物。非人类动物排除人作为所涵盖的动物。本文提供的酶来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。绝大多数酶为动物来源，包括哺乳动物来源。
如本文所使用，对照指除了未受试验参数处理外与受试样品基本相同的样品，或者，如果其为血浆样品，其可来自未受所感兴趣的病症影响的健康志愿者。对照也可为内部对照。
如本文所使用，单数形式英文单词“a”、“an”和“the”包括复数指示物，除非上下文明确另外指明。因此，例如，提及的包含“胞外结构域”的化合物包括具有一个或多个胞外结构域的化合物。
如本文所使用，范围和量可表示为“约”某具体的值或范围。也包括精确的量。因此“约5个碱基”意指“约5个碱基”并且也指“5个碱基”。
如本文所使用，“任选的”或“任选地”意指后续描述的事件或条件发生或未发生，并且该描述包括所述事件或条件发生的情况或其未发生的情况。例如，任选地取代的基团意指该基团未被取代或被取代。
如本文所使用，除非另外指明，任何保护基、氨基酸和其他化合物的缩写与它们的常见用法、公认的缩写或者IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature（参见，(1972)Biochem.11:1726）一致。
B.免疫球蛋白（IG）和透明质酸酶的稳定的复合制剂
本文提供包含免疫球蛋白(IG)和透明质酸酶的稳定的复合制剂。所述复合制剂在以液体形式在室温下（例如28-32℃）长期保存至少六个月后保持IG分子大小分布和透明质酸酶活性。一般而言，所述复合制剂还在标准的冷藏温度下保持IG分子大小分布和透明质酸酶活性持续至少1-2年。所述复合制剂可用于治疗IG可治疗的疾病和病症。特别地，将本文提供的稳定的复合制剂配制成用于皮下给药。
1.免疫球蛋白治疗
免疫球蛋白是主要被用来治疗具有免疫缺陷的个体的治疗剂。免疫球蛋白缺陷病是免疫缺陷病的亚类，其特征为血清免疫球蛋白缺失或水平降低，这导致对细菌感染的易感性增加，对于窦肺道更是如此。免疫缺陷病或为原发性的（遗传的），或为继发性的（获得性的）。原发性免疫缺陷病是少见的并且包括X-连锁无丙种球蛋白血症、免疫球蛋白重链缺失、选择性免疫球蛋白G(IgG)亚类缺乏、普通变异型免疫缺陷病或X-连锁高免疫球蛋白M血症。免疫球蛋白水平降低还见于患有由T细胞和B细胞缺陷引起的联合免疫缺陷的个体中，例如但不限于重症联合免疫缺陷或维-奥二氏综合征(IUIS Scientific Committee,1999)。继发性免疫缺陷更为常见，其诱导因素包括但不限于营养不良、病毒、衰老和白血病。患有这些疾病的个体需要使用免疫球蛋白产品进行替代治疗以预防感染或降低感染的严重度。
免疫球蛋白替代治疗在1952年被首次使用并且是经肌肉内和皮下给药。然而，为了有效地治疗疾病需要较大量的IG，这导致开发了具有较低IG浓度(50-100mg/mL)的可静脉内给药的产品。自1981年以来，可在美国获得的大多数免疫球蛋白产品为静脉内给药。IG制剂通常为包含免疫球蛋白G（IgG、IgM、IgA或它们的组合）的无菌、纯化的产品。IG产品通常包含95-99%IgG并且仅包含微量的免疫球蛋白A(IgA)、M(IgM)、D(IgD)和E(IgE)。通常以3-12%IG配制用于IV给药的IG制剂。
最近已开发了用于皮下给药的免疫球蛋白制剂（Gardulf等人,(2006)Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.6:434-42;Gardulf等人,(2006)J.Clin.Immunol.26:177-85;Ochs等人,(2006)J.Clin.Immunol.26:265-73），并且有至少一种产品，在美国被批准用于皮下给药。IG的皮下给药途径与IV途径相比具有数个优点，例如更好的耐受性和家庭护理治疗的可能性。
皮下给药的免疫球蛋白的生物利用度通常低于静脉内输注的免疫球蛋白。IV给药后，免疫球蛋白立即出现在血液中并且在3-5天内缓慢地平衡至血管外房室（Schiff等人,(1986)J.Clin.Immunol.6:256-64）。皮下给药的免疫球蛋白从皮下空间缓慢地吸收进入血液并且同时与血管外房室达到平衡，无高IV浓度峰（spike）。人们已对其生物利用度进行了广泛的研究，但是在近期的对ZLB-Behring制剂（即
Figure BDA00001645193200281
）的试验中，通过测量曲线下面积(AUC)测得仅67%的免疫球蛋白被吸收，并且因此推荐剂量为IV剂量的137%（Ochs等人,(2006)J.Clin.Immunol.26:265-73）。尽管比较两种不同的给药途径和给药频率的AUC存在技术困难，但是在兔子中进行的对皮内给药的免疫球蛋白的研究表明经皮下途径时生物利用度降低。这可能归因于大蛋白质分子的吸收方式，其不能容易地扩散通过毛细血管壁并且必须通过淋巴系统吸收（Supersaxo等人,(1990)Pharm.Res.7:167-9）。
目前用于皮下给药的所有免疫球蛋白制剂均以16%IG配制，相比而言，IVIG制剂以5-12%IG配制。皮下制剂比IV制剂更高的IG浓度使得输注体积更小；此类制剂不能静脉内输注。免疫球蛋白替代治疗的这些皮下方法被认为是有效、安全的并且还得到患者的高度评价，因为其全身不良反应的风险低并且与每月IV输注相比引起更高的谷血清IgG浓度（Gardulf等人,(1995)J.Adv.Nurs.,21:917-27;Gardulf等人,(1993)Clin.Exp.Immunol.,92:200-4;Gardulf等人,(1991)Lancet,338:162-6）。
除了与IG的皮下给药相关的生物利用度降低，SC和IV给药的另一差异在于在每一个位点仅能进行小体积的皮下输注，使得每周或每两周（每隔一周）必须使用多个位点。然而，成人通常只能在一个皮下位点输注20-40mL，儿童每个位点的体积更小。目前，被接受的IG给药实践是静脉内给药300-600mg/kg，每3-4周一次，或者皮下给药100-200mg/kg/wk（Berger(2008)Immunol.Allergy Clin.North Am.28(2):413-438）。因此，每周皮下给药多达15g IG。这意味着需要每周在至少3个位点给药16-20%IG制剂。尽管每周一次或每两周一次给药与每月一次IV输注相比具有维持更好的谷水平的附加优点，但是需要多次刺入注射针对于许多患者而言难以接受。
虽然如此，免疫球蛋白替代治疗的皮下方法逐渐成为IVIG治疗的越来越受欢迎的替代选择。对IVIG输注具有严重反应的患者通常能够耐受皮下给药的IG。皮下给药被认为是有效、安全的并且受到患者的高度评价，因为其全身不良反应的风险低并且可在家中或在医院中给药（Gardulf等人,(1995)J.Adv.Nurs.21:917-27;Gardulf等人,(1993)Clin.Exp.Immunol.92:200-4;Gardulf等人,(1991)Lancet 338:162-6）。
2.免疫球蛋白和透明质酸酶制剂的皮下给药
与透明质酸酶联合给药提高皮下给药的IG的生物利用度，由此允许以与IVIG治疗相似的剂量和频率皮下给药免疫球蛋白（参见例如，第2010-0074885号美国专利申请和国际PCT申请WO 2009-117085，各自通过援引加入本文）。由充满透明质酸这种凝胶样物质的胶原网状结构形成的皮下(SC)空间是引起流体流经组织时的阻力的主要原因。透明质酸酶是天然存在的降解透明质酸的酶家族，透明质酸是存在于胞外基质和诸如皮肤和眼的人体各处组织中的填充间隙的“凝胶”样物质。透明质酸酶通过裂解透明质酸内N-乙酰葡糖胺基团的C1和葡糖醛酸基团的C4之间的葡萄糖胺键（glucosaminidic bond）发挥作用。这暂时降低了细胞粘合质的粘性并促进注射的流体的扩散，由此有助于它们的吸收。之后，透明质酸在24小时内自然再生。因此提高了包含透明质酸酶的复合制剂的生物利用度、药动学和/或药效学特性。基于动物实验，流体分散增加允许通过皮下途径给药多达1L/小时，这是类似IV的流速。
在透明质酸酶的存在下，皮下给药的IG的生物利用度提高，通常达到大于IVIG治疗后的IG生物利用度的90%。另外，与可溶性透明质酸酶联合给药允许在单个皮下位点进行大体积输注。例如，可一次在单个位点给药多达600mL或更多体积的IG，例如可在一次给药中在单个位点给药200mL、300mL、400mL、500mL、600mL或更多。例如，可以等于每月一次IVIG给药的剂量将以5-12%（包括端值）例如以10%蛋白质配制的IG制剂（通常仅用于IVIG治疗）与可溶性透明质酸酶联合给药，所述剂量例如是100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg或更高，或者约100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg或更高。还可在透明质酸酶的存在下皮下给药具有更高浓度的蛋白质的IG制剂，例如12-25%IG，例如15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%或更高。所述剂量可以作为单次剂量给药，或者可分为每日或每周给药的多次剂量，例如每周一次或每两周一次、每三周一次或每四周一次，或者它们的组合。因此，当在透明质酸酶的存在下进行皮下给药时，可以用于具体适应症的普遍使用的IVIG剂量每月一次给药IG。另外，由于透明质酸酶的功能是打开皮肤内的流动通道，所以其可加快输注速率。因此，与透明质酸酶一起给药的IG皮下给药加快输注速率并由此减少IG治疗的药物递送时间。
通过在透明质酸酶的存在下皮下给药IG解决了与IG皮下给药相关的一种或所有的顾虑和问题。因此，由于透明质酸酶的分散性质，在可溶性透明质酸酶的存在下皮下给药IG允许以每月一次的IVIG频率给药IVIG剂量，同时维持IVIG生物利用度。
3.稳定的复合制剂
由于可皮下给药的免疫球蛋白制剂具有家庭护理治疗的优点，所以设想IG和透明质酸酶的稳定的即用制剂。用于治疗的蛋白质通常在加工和保存的过程中经受一系列的条件，包括低pH、温度的波动、各种缓冲组分和离子强度，并常常经受最终制剂中的高蛋白质浓度。然而，为了实现疗效，所述复合制剂应保持足够的IG活性和透明质酸酶活性。因此，为了以水溶液形式长期稳定保存而不会变质，必须将IG和透明质酸酶的复合制剂提供为稳定的溶液的形式。因此，本文提供IG和透明质酸酶的稳定的液体复合制剂。将所述复合制剂提供为可用于直接注射（即在使用前不需要稀释）的剂型。
本文中已发现通过在给药前向IG制剂加入被命名为rHuPH20的透明质酸酶制备的复合制剂产品在室温下不稳定。盐的加入提高该制剂的稳定性，特别是通过维持所述制剂中透明质酸酶的活性来实现提高。因此，除了包含有效量的IG和透明质酸酶以外，本文提供的稳定的制剂还包含至少50mM碱金属盐酸盐，例如NaCl或KCl。通常，所述稳定的复合制剂还包含作为稳定剂的氨基酸例如甘氨酸，并且以约4-5或4-5的pH提供。一般而言，复合配制的产品中的透明质酸酶与IG的比例大于例如在LeadingEdge给药中将相同的产品（IG和透明质酸酶）和相同量的IG单独皮下给药时的比例。
所述稳定的复合制剂通常为液体制剂。直接以液体形式保存所述复合制剂具有以下优点：便于具有以液体形式时的保存稳定性、易于给药无需复溶、以及能够以预填充的、即用型注射器的形式或以多剂量制剂的形式提供所述制剂。因此，所述液体复合制剂提供用于向个体皮下给药的IG和透明质酸酶的即用型制剂，无需在向所述个体给药所述制剂前准确地并在无菌操作下复溶所述制剂并等待一段时间直到溶液澄清。它为医疗护理人员简化了向个体给药所述制剂的操作。另外，由于生产所述液体制剂的所有阶段均在水溶液中进行而不涉及诸如冻干和冷冻干燥的干燥过程，所以所述液体制剂的生产过程是简化的并且比冻干形式的生产过程效率更高。因此，它也具有更高的成本效益。可将所述稳定的复合制剂提供为容器内或注射器内的液态溶液。可方便地将此类复合制剂作为药物分发给人或其他哺乳动物物种而无需由医生或患者进一步复溶。
另外，由于在保存过程中具有高度稳定性，所以所述复合制剂可包含约10%-22%IG例如10%-20%IG的高蛋白质浓度，而不会由于长期保存过程中的蛋白质聚集和/或片段化引起对IG的生物学活性的不良反应。这样的稳定性不仅确保所述IG复合制剂的功效，还降低了可能存在的在个体中引起不良反应的风险。因此，本文提供的稳定的复合制剂保持透明质酸酶的酶活性和IG活性，同时将IG自缔合和聚集降至最低。通常，在最高32℃，例如0℃-32℃或约0℃-32℃，通常为28℃-32℃或约28℃-32℃的温度下保持所述活性。所述复合制剂的稳定性维持较长的时间，例如一天、一周、一月、一年或更长的时间。所述复合制剂还具有以下优点：它们以液体形式在至少6个月的长期保存期间维持稳定。在一个实施方案中，所述稳定的复合制剂以液体形式在标准的冷藏温度（约4±2℃，或约2-8℃，或者更常见地，约0-10℃）下维持稳定达至少1年或更长的时间，例如1年-2年，例如1年、2年或更长的时间。在另一实施方案中，所述复合制剂以液体形式在于室温（18-32℃，例如28℃-32℃）保存期间维持稳定达至少六个月。例如，当保存于室温下时，所述稳定的复合制剂的保质期通常为至少6个月-18个月或约6个月-18个月，例如6个月、12个月、18个月，或更长。
以下章节描述本文提供的制剂包括所述制剂中示例性的免疫球蛋白和透明质酸酶、它们的制备方法以及使用所述稳定的复合制剂治疗IG可治疗的疾病和病症的方法。
C.免疫球蛋白和免疫球蛋白的制备
本文提供能够与透明质酸酶一起配制于稳定的组合物中的免疫球蛋白（IG，还称作免疫球蛋白、γ-球蛋白或IgG）。所述稳定的复合制剂可用于治疗IG可治疗的疾病和病症。
免疫球蛋白是由体液免疫系统产生的γ球蛋白并且存在于高等动物的血浆中。IG的功能是通过调节补体的活性增强免疫系统，抑制自身抗体的产生，饱和或阻断巨噬细胞和B淋巴细胞上的Fc受体以及抑制炎症介质例如细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶的产生。IG包括五类或五个同种型的抗体（IgG、IgA、IgM、IgD和IgE）以及各种不同的亚类，各自具有不同的特异性。IgG是存在于血液中的最主要的IG类型并且在二次免疫应答和保护组织免受感染中具有重要作用。表2列出了存在于血清中的免疫球蛋白的典型的量，然而用于治疗的IG的制备可采用纯化步骤以改变一种或多种特定免疫球蛋白类型的比例。例如，可使用蛋白质A、蛋白质G或蛋白质H琼脂糖色谱法富集免疫球蛋白混合物中的IgG或特异的IgG亚型（参见例如，Harlow和Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring HarborLaboratory Press;Harlow和Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press;第5,180,810号美国专利）。
表2.血清免疫球蛋白
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1.制备和纯化
可从任何适合的原料制备本文提供的免疫球蛋白制剂。例如，可从人血或动物血例如从人类供者的血清分离免疫球蛋白，或者通过其他方法例如通过重组DNA技术或杂交瘤技术制备。因此，免疫球蛋白制剂可包含单克隆或重组免疫球蛋白。例如，可采用任何适合的操作例如沉淀（Cohn醇分级分离或聚乙二醇分级分离）、色谱法（离子交换色谱法、亲和色谱法、免疫亲和色谱法）；超速离心或电泳制备，从组织、淋巴细胞杂交瘤培养物、血浆或血清或重组细胞培养物获得免疫球蛋白（参见例如，Cohn等人,(1946)J.Am.Chem.Soc.68:459-75;Oncley等人,(1949)J.Am.Chem.Soc.,71:541-50;Barandern等人,(1962)Vox Sang.,7:157-74;Koblet等人,(1967)Vox Sang.,13:93-102;第5,122,373和5,177,194号美国专利）。通常从通过本领域技术人员公知的醇分级分离和/或离子交换色谱法和亲和色谱法制备的含γ球蛋白的产物制备免疫球蛋白。
制备步骤可用于富集特定的免疫球蛋白同种型或亚型。例如可使用蛋白质A、蛋白质G或蛋白质H琼脂糖色谱法富集免疫球蛋白混合物中的IgG或特定的IgG亚型（一般性参见Harlow和Lane,Using Antibodies,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1999);Harlow和Lane,Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988);第5,180,810号美国专利）。
a.Cohn-Oncley法
从血浆纯化免疫球蛋白的常规工业方法基于冷乙醇分级分离，其在低于零度的温度下基于蛋白质在特定醇浓度下的等电点将多个蛋白质群共沉淀，该方法最早被Cohn采用并经Oncley改良（参见例如，Cohn等人,(1946)J.Am.Chem.Soc.68:459-75;Oncley等人,(1949)J.Am.Chem.Soc.71:541-50）。在所述纯化过程中使用醇能够灭活潜在的污染性病毒，然而，随着温度和乙醇浓度不断升高，该Cohn-Oncley法可导致产生变性的和聚集的蛋白质。这些高分子量形式能够充当具有自由地锚定补体的能力的抗体-抗原复合物。
b.改良的Cohn-Oncley操作
为了避免Cohn-Oncley法的不利作用，已开发了改良的Cohn-Oncley法用于制备和纯化IG。已知多种此类操作并且可经调整和改良用于制备本文的IG制剂。参考本领域已知的和可获得的详细的方法制备IG制剂在本领域技术人员的能力之内。
通常使用可包括例如以下步骤中的任何一个或多个步骤的初次冷乙醇分级分离和二次分级分离来获得具有低抗补体活性(ACA)的产品：通过常规技术例如超速离心或排阻色谱法分离IG聚集体；通过醇化、烷基化、磺化和用还原剂处理（参见例如美国专利6,875,848）对IG分子进行化学修饰；在存在或不存在胃蛋白酶、纤溶酶和固定化胰蛋白酶的条件下，在中等酸度的pH(pH 4.0)下温育；通过使用乙二醇聚合物将人血浆分级分离（Polson等人,(1964)Biochim.Biophys.Acta.82:463-475），向分离自Cohn分级分离的材料中加入作为纯化剂的聚乙二醇(PEG)（部分II或II+III，参见例如第4,093,606和4,165,370号美国专利）、使用聚乙二醇作为沉淀剂的分离分级法以及第4,093,606、4,126,605、3,966,906和4,124,576号美国专利中记载的其他技术，以及使用聚乙二醇的其他相似的纯化方法(EP0246579)；B-丙内酯处理；从被用来获得所述IG制剂的原料中除去不利的污染物的离子交换色谱法（参见例如，第3,869,436号美国专利、EP 91300790和WO 94/29334）。EP 0440483记载了基于离子交换色谱法和在弱酸性pH下渗滤；酶裂解；溶剂/去污剂处理以及渗滤和超滤的可用于辅助制备静脉内制剂的技术的组合。本领域还记载了其他方法并且是本领域技术人员已知的（参见例如美国专利5,177,194和6,875,848）。
通常使用纯化的Cohn部分II。起始的Cohn部分II糊状物通常包含约95%IgG并且还包含四种IG亚型。不同亚型在部分II中的存在比例与它们在用于获得它们的合并的人血浆中的比例大致相同。在配制成可给药的产品之前进一步纯化部分II。例如，可将所述部分II溶解于冷的经纯化的含水醇溶液中并通过沉淀和过滤除去杂质。在最终过滤后，可将免疫球蛋白悬浮液透析或渗滤（例如使用标称分子量限度低于或等于100000道尔顿的超滤膜）以除去乙醇。可将所述溶液浓缩或稀释以获得期望的蛋白质浓度并且可通过本领域技术人员公知的技术进一步纯化。
c.病毒处理
应处理所述IG制剂以除去病毒载量。有两种病毒处理方法：病毒灭活和病毒隔离或清除。病毒灭活通过例如化学改变脂质或蛋白质外壳或者通过使病毒完全变性从而使病毒失活。示例性的病毒灭活方法包括但不限于加热（巴斯德灭菌法）、溶剂/去污剂(S/D)处理和暴露于酸性环境（低pH）。所述S/D方法是血浆制品工业中最为广泛使用的病毒灭活法，其用于灭活包含脂包膜的病毒。例如，所述S/D方法已被证明对VSV（水泡性口炎病毒）、辛德比斯病毒、HIV、HBV（乙肝病毒）和HCV（丙肝病毒）具有杀病毒作用。
病毒清除是从样品中完全清除所有病毒的方法。示例性的病毒隔离或清除包括但不限于冷乙醇分级分离、相分配法或PEG沉淀、亲和色谱法、离子交换色谱法或凝胶排阻色谱法以及纳米过滤。
d.蛋白质浓缩
可制备各种浓度的免疫球蛋白。例如，可以3-25%或约3-25%IG的蛋白质浓度制备IG，所述蛋白质浓度通常为10-22%或约10-22%，例如10%-20%w/v。例如，IG制剂可为18%-22%IG w/v或约18%-22%IG w/v。通常以10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%或更高，或者约10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%或更高的IG浓度制备本文提供的IG制剂。最终的蛋白质浓度主要取决于制备和纯化方法。本文预期任何免疫球蛋白制剂均可在本文中用于与透明质酸酶形成稳定的复合制剂。凭经验确定用于包含在本文的稳定的复合制剂中的IG的适合的浓度在本领域技术人员的能力之内。IG制剂的选择将取决于各种因素，例如给药途径、待治疗的患者和被治疗的病症的类型。
例如，可使用任何已知的或现有的IG制剂。这些包括通常用于IV给药(IVIG)的IG制剂。一般而言，用于静脉内给药的最终IG制剂的蛋白质浓度为约3-12%w/v，或者通常为10%w/v。例如，
Figure BDA00001645193200351
NF、
Figure BDA00001645193200352
5%、
Figure BDA00001645193200353
Liquid、S/D、
Figure BDA00001645193200355
Figure BDA00001645193200356
EN、
Figure BDA00001645193200357
和
Figure BDA00001645193200358
S/D是市售的IVIG。这些制剂通常使用冷醇分级分离法，但是在用于分离和纯化所述免疫球蛋白的方法方面以及降低潜在的病毒污染的方法方面存在差异。
另外，目前被配制用于肌肉内或皮下给药的其他制剂可用于本文提供的组合物和方法中。例如，
Figure BDA00001645193200359
S/D和
Figure BDA000016451932003510
是市售的用于肌肉内给药和皮下给药的IG制剂。这些制剂通常使用来自人血浆的冷乙醇分级分离物并且IgG浓度分别为约15-18%或10-22%。第61/181,606号美国临时专利申请记载了从合并的血浆制备用于皮下给药的高度纯化并浓缩的免疫球蛋白组合物。
e.示例性IG制剂
i.10%IG
示例性的IG制剂是Immune Globulin Intravenous(Human),10%（IVIG，由Baxter Healthcare公司以
Figure BDA00001645193200361
liquid销售），其为液体的未修饰的IgG制剂，具有与健康血浆相似的IgG亚类分布。该制剂包含完整的可结晶片段（Fc）和抗原结合(Fab)片段区。该制剂包含100mg/mL蛋白质，至少98%为IgG；IgA以37μg/mL的浓度存在，并且仅存在微量的IgM。其具有与生理重量克分子渗透浓度相似的重量克分子渗透浓度，并且不含添加的糖、钠或防腐剂。在pH 4.6-5.1下将其与具有稳定化作用的甘氨酸一起配制。其生产过程采用改良的Cohn-Oncley冷醇分级分离操作并使用弱阳离子交换色谱法和弱阴离子交换色谱法通过连续过程进一步纯化。所述生产过程还包括3个独立的病毒灭活或清除步骤：溶剂/去污剂(S/D)处理、纳米过滤和在低pH和升高的温度下温育。10%IVIG制剂的制备描述于实施例1。
ii.高浓度IG制剂（例如20%IG）
高浓度免疫球蛋白制剂的制备记载于第61/181,606号美国临时专利申请。包含18-22%IG的示例性的制剂是在pH 4.4-4.9下配制于0.25mM甘氨酸中的高度纯化的、等渗的液体免疫球蛋白制剂（至少95%IgG），其描述于下文实施例中。
通过与制备常规IVIG制剂（例如10%IG）的方法具有许多相同或相似步骤的方法制备本文描述的高浓度IgG产品。在接近制备过程的终点时进行的额外的步骤，即使用开放通道膜的超滤/渗滤以及专门设计的后洗涤和制剂，使得所得IG组合物的蛋白质浓度约是现有技术的IVIG（例如Gammagard Liquid）的蛋白质浓度的两倍，并且不会影响收率和保存稳定性。使用大多数可商购的超滤膜均不能在无明显的蛋白损失的条件下达到200mg/mL IgG的浓度。这些膜很快被阻塞，因此难以实现充分的后洗涤。因此需要使用开放通道膜构造。另外，采用专门设计的后洗涤操作来获得所需的IG浓度而无显著的蛋白损失（损失低于2%）；较高的200mg/mL的蛋白浓度不影响低pH保存步骤的病毒灭活能力。
制备所述高浓度IG组合物的一般方法包括进一步详细描述于实施例2中的以下步骤。首先，从预先冷冻的血浆中分离冷沉淀以得到液体的“去冷沉淀血浆(cryo-poor plasma)”，在下一步骤中对其进行处理以获得上清（或分级分离I）。调节pH和乙醇浓度，通常分别调节至7和25%v/v，然后在降低温度的同时离心，将液体和固体分离。萃取来自该步骤的沉淀并与热解法二氧化硅混合并过滤，所有步骤均在通常为2-8℃的低温下进行。接着在于2-8℃搅拌的同时将滤液与聚山梨酯80和无水柠檬酸钠混合。然后通过与Cohn II的沉淀步骤相似的方法（其中调节pH和乙醇浓度）获得沉淀G。将沉淀G溶解并用标称孔径为0.2μm的深层滤器（例如Cuno VR06滤器或等同滤器）过滤以获得澄清的滤液。通常于18-25℃使用1.0%(v/v)Triton X-100、0.3%(v/v)Tween-80和0.3%(v/v)TNBP将后续的溶剂/去污剂处理进行至少60分钟，然后进行阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法以及使用例如Asahi Planova 35N滤器或等同滤器进行纳米过滤。纳米过滤之后，通过超滤将滤液浓缩至5±1%w/v的蛋白浓度。在一些实施方案中，在具有开放通道筛网的盒式超滤器（cassette）内进行所述超滤并且超滤膜的标称截留分子量(NMWCO)为50kDa或更低。在超滤步骤结束后，用具有低pH的0.25M甘氨酸溶液将浓缩物渗滤。通常，最小交换体积是初始浓缩物体积的6倍，并且将所述溶液浓缩至超过20%w/v的蛋白质浓度。在渗滤和浓缩过程的最后，所述溶液的pH通常为4.4-4.9。为了进行制剂，接着用渗滤缓冲液将所述溶液的蛋白质浓度调节至刚好超过20%w/v，例如20.4±04%w/v。通过首先经由绝对孔径为0.2微米或更小的膜滤器过滤将配制的总溶液进一步灭菌。接着在无菌操作下将该溶液分装到终容器内并进行适当的密封，取样用于试验。最后的步骤是将密封的容器于30-32℃保存长期的时间例如21-22天。
与之前使用的IG纯化和浓缩方法相比，在所述生产过程中并入超滤和制剂步骤是一个改进，得到具有较高IG浓度的制剂而无显著的IG活性损失，同时维持了最终制剂的低pH。通常，所述产品的蛋白质浓度为至少18%重量/体积(w/v)，其中绝大部分（通常不低于95%）是IgG，并且pH范围为pH 3-6，这有助于灭活可能存在于血浆中的病原体例如病毒。由于高IG浓度和因此减小的给药体积，所述高浓度制剂适用于皮下给药。在一些实施方案中，所述IG产品的粘度不超过18毫帕斯卡·秒并且因此也可适用于静脉内给药。简单的稀释也可允许进行静脉内给药。
2.保存稳定性
最后，必须将纯化的IG制剂制备成保持所述IG的活性并且避免过度聚集。在保存IG制剂时，可通过例如加入稳定蛋白质的赋形剂或调节溶液的pH将聚集降至最低并提高稳定性。
a.稳定蛋白质的赋形剂
本领域公知的增加IG制剂稳定性的方法是向IG制剂中加入稳定蛋白质的赋形剂。已知的赋形剂包括但不限于糖、多元醇、氨基酸、胺、盐、聚合物和表面活性剂。例如，美国专利4,499,073记载了由保存溶液的离子强度和pH引起的稳定作用；日本专利54020124公开了向肌肉内给药制剂中加入氨基酸使得所述制剂对于保存而言是稳定且安全的；JP 57031623和JP 57128635公开了在5-15%IG制剂中使用精氨酸和/或赖氨酸以及NaCl实现肌肉内给药制剂的长期稳定性；JP 4346934公开了低导电率（低于1mmho）、pH 5.3-5.7和任选一种或多种包括PEG、人血清白蛋白和甘露醇在内的稳定剂的用途；US 4,439,421教导加入亲水性大分子、多元醇和另一种蛋白质来稳定抗补体生成；US 5,945,098公开了通过加入氨基酸（0.1-0.3M甘氨酸）和非离子型去污剂（聚山梨酯和PEG）稳定等渗溶液；US4,186,192公开了包括氨基酸在内的各种添加剂；WO 2005/049078公开了用麦芽糖并另外加入甘氨酸至0.1M实现稳定化；US 4,362,661公开了使用中性和碱性氨基酸使5%IG制剂具有稳定性。还可使用具有非常低的离子强度并且pH为4.25（美国专利4,396,608）或者具有5-6的弱酸性pH（EP0278422）的水性介质中的碳水化合物制备稳定的液体制剂。
还可控制IG制剂的二聚体形成。例如，第5,871,736号美国专利公开了包含一种或多种对抗二聚体形成的两亲性稳定剂的IG制剂，特别是液体制剂。所述两亲性稳定剂包括烟酸及其衍生物，特别是烟酰胺，并且主要与具有不带电荷的亲脂性侧链的氨基酸例如苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸结合。
b.pH
可通过本领域已知的方法例如本文描述的任何方法制备IG制剂。然而，通常将最终制剂的pH调节至相对高的pH，即，约pH 4.0-7.4。已发现免疫球蛋白制剂的pH是与最终产品的IgG单体含量相关的非常重要的因素。5%免疫球蛋白制剂的pH通常为4.2±0.5。10%制剂在pH 5.2±0.2下最稳定。通过本领域技术人员公知的制剂技术获得最佳pH。例如，可从各种制剂在不同pH条件下的尺寸排阻色谱法测定结果以及热稳定性数据和抗补体效价方面确定最佳pH。
D.透明质酸酶
本文提供包含免疫球蛋白和透明质酸酶(通常是可溶性透明质酸酶)的稳定的复合制剂。透明质酸酶是降解透明质酸的一大酶家族的成员，透明质酸是胞外基质的主要成分和间质屏障的主要组分。通过催化间质屏障的主要组分透明质酸的水解，透明质酸酶降低透明质酸的粘性，由此增加组织可渗透性。因此，透明质酸酶已被用作与其他药剂、药物和蛋白质联用的扩散剂或分散剂以增强它们的分散和递送。本文提供的复合制剂中的示例性透明质酸酶是可溶性透明质酸酶。
有三大类透明质酸酶：哺乳动物透明质酸酶、细菌透明质酸酶和来自水蛭、其他寄生虫和甲壳动物的透明质酸酶。
哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)为水解乙酰透明质酸的β-1→4糖苷键产生各种寡糖长度例如四糖和六糖的内切-β-N-乙酰-己糖胺酶。它们具有水解和转糖苷酶活性，并可降解乙酰透明质酸和硫酸软骨素（CS）（一般为C4-S和C6-S）。这一类型的透明质酸酶包括但不限于来自奶牛（牛）的透明质酸酶(SEQ ID NO:10和11)、来自小鼠的(SEQ ID NO:17-19,32)、来自猪的(SEQ ID NO:20-21)、来自大鼠的(SEQ ID NO:22-24,31)、来自家兔的(SEQ ID NO:25)、来自绵羊（绵羊）的(SEQ ID NO:26和27)、来自猩猩的(SEQ ID NO:28)、来自食蟹猴的(SEQ ID NO:29)、来自豚鼠的(SEQ IDNO:30)，和人透明质酸酶。
哺乳动物透明质酸酶可进一步细分为主要存在于睾丸提取物中中性活性的那些和主要存在与器官例如肝脏中的酸性活性的那些。示例性的中性活性透明质酸酶包括PH20，包括但不限于得自不同物种的PH20例如得自羊的(SEQ ID NO:27)、得自牛的(SEQ ID NO:11)和得自人的(SEQ IDNO:1)。人PH20（也称作SPAM1或精子表面蛋白PH20）通常通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚蛋白与质膜结合。其天然地参与精子-卵子粘附并通过消化透明质酸辅助精子穿过卵丘细胞层。
除人PH20（也称作SPAM1）外，已在人类基因组中鉴定出五个透明质酸酶样基因，HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和HYALP1。HYALP1为假基因，HYAL3(SEQ ID NO:38)未显示具有对任何已知底物的酶活性。HYAL4(显示于SEQ ID NO:39的前体多肽)为软骨素酶并显示很小的对乙酰透明质酸的活性。HYAL1(显示于SEQ ID NO:36的前体多肽)为原型的酸性活性酶，PH20(显示于SEQ ID NO:1的前体多肽)为原型的中性活性酶。酸性活性透明质酸酶例如HYAL1和HYAL2(显示于SEQ ID NO:37的前体多肽)一般在中性pH（即pH7）时缺乏催化活性。例如，HYAL1在大于pH4.5时几乎无体外催化活性(Frost等人(1997)Anal.Biochemistry251:263-269)。HYAL2为具有很低的体外特异性活性的酸性活性酶。透明质酸酶样酶也由通常通过糖基磷脂酰肌醇锚蛋白与质膜结合的那些（例如人HYAL2和人PH20(Danilkovitch-Miagkova等人(2003)Proc Natl Acad SciUSA.100(8):4580-5)），以及一般为可溶的那些（例如人HYAL1(Frost等人(1997)Biochem Biophys Res Commun.236(1):10-5)）来表征。
1.PH20
与其他哺乳动物透明质酸酶一样，PH20也为可水解透明质酸的β-1→4糖苷键产生各种寡糖长度例如四糖和六糖的内切-β-N-乙酰-己糖胺酶。它们具有水解和转糖苷酶活性，并可降解透明质酸和硫酸软骨素（CS）（一般为C4-S和C6-S）。PH20天然地参与精子-卵子粘附并通过消化透明质酸辅助精子穿过卵丘细胞层。PH20位于精子表面，并在溶酶体衍生的顶体中，在那里其与顶体内膜结合。质膜PH20仅在中性pH下具有透明质酸酶活性，而顶体内膜PH20在中性和酸性pH下都具有活性。除了为透明质酸酶外，PH20也显示为HA-诱导的细胞信号转导的受体并为环绕卵母细胞的透明带的受体。
示例性PH20蛋白包括但不限于人PH20多肽(显示于SEQ ID NO:1的前体多肽,显示于SEQ ID NO:2的成熟多肽)、牛PH20多肽(SEQ ID NO:11)、家兔PH20多肽(SEQ ID NO:25)、羊PH20(SEQ ID NO:27)、食蟹猴PH20多肽(SEQ ID NO:29)、豚鼠PH20多肽(SEQ ID NO:30)、大鼠PH20多肽(SEQ ID NO:31)和小鼠PH20多肽(SEQ ID NO:32)。
牛PH20为553个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO:11)。牛PH20与人PH20的比对显示仅存在弱同源性，从氨基酸470到各自的羧基端存在多个空位，这归因于牛多肽中无GPI锚蛋白(见例如Frost GI(2007)Expert Opin.Drug.Deliv.4:427-440)。事实上，在除人之外的许多其他PH20种类中未预测出明确的GPI锚蛋白。因此，从羊和牛产生的PH20多肽天然以可溶形式存在。尽管牛PH20非常松散地与质膜结合，但是其并未通过磷脂酶敏感的锚蛋白连接(Lalancette等人(2001)Biol Reprod.65(2):628-36)。牛透明质酸酶的这一特性允许使用可溶性牛睾丸透明质酸酶作为提取物用于临床用途
Figure BDA00001645193200411
人PH20mRNA转录物正常情况下下翻译生成509个氨基酸的前体多肽（SEQ ID NO:1），其包含在N-端的35个氨基酸信号序列（氨基酸残基位点1-35）和在C-端的19个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚蛋白结合信号序列（氨基酸位点491-509）。因此，成熟的PH20为显示于SEQ ID NO:2的474个氨基酸的多肽。在将前体多肽转运至ER并去除信号肽后，C-端GPI-结合信号肽被裂解以促进GPI锚蛋白与位于对应于SEQ ID NO:1所示前体多肽的490位点的氨基酸位点处新形成的C-端氨基酸共价结合。因此，产生了具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的474个氨基酸的GPI-锚定的成熟多肽。
与包括蜜蜂毒液透明质酸酶以及小鼠PH20、猴PH20和豚鼠PH20在内的其他透明质酸酶相比，人PH20包含具有57个保守氨基酸的340个氨基酸的共有区(参见例如Arming等人,(1997)Eur.J.Biochem.247:810-814)。所述保守氨基酸包含在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的氨基酸残基25、189、203和316（对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的残基60、224、238和351）处形成二硫键桥的四个半胱氨酸残基。半胱氨酸残基C60和C351之间以及C224和C238之间形成的二硫键形成透明质酸酶的核心结构域。然而，中性酶催化活性需要羧基端存在额外的半胱氨酸使得SEQ IDNO:1的氨基酸36-464包含具有最小活性的人PH20透明质酸酶结构域。另外的四个二硫键形成于SEQ ID NO:1所示多肽的半胱氨酸残基C376和C387之间;C381和C435之间;C437和C443之间;以及C458和C464之间（分别对应于SEQ ID NO:2所示成熟多肽的残基C341和C352之间;C346和C400之间;C402和C408之间;以及C423和C429之间）。
另外，其他保守残基可能参与了底物结合和催化。对应于SEQ ID NO:2中的残基的氨基酸位点111、113、176、249和252处的氨基酸残基表现出与PH20的活性有关，因为这些位点的突变使得该酶失去酶活性或者与不含所述突变的野生型PH20相比仅剩余残留的活性（参见例如Arming等人,(1997)Eur.J.Biochem.,247:810-814）。
在SEQ ID NO:1中例举的人PH20的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490处存在七个潜在的N-连接糖基化位点。半胱氨酸残基C60和C351之间以及C224和C238之间形成的二硫键形成透明质酸酶的核心结构域。由于SEQ ID NO:1的氨基酸36-464包含具有最小活性的人PH20透明质酸酶结构域，所以适当的透明质酸酶活性不需要N-连接糖基化位点N-490。
2.可溶性透明质酸酶
本文提供的稳定的复合制剂中的透明质酸酶通常是可溶性透明质酸酶。当在细胞内表达时，可溶性透明质酸酶被分泌进入培养基。可通过将所述蛋白分配到Triton X-114溶液的水相中来证明溶解性。因此，应理解可溶性透明质酸酶不包括任何包含GPI锚蛋白的透明质酸酶，所述GPI锚蛋白使得所述多肽与细胞膜结合。例如，全长人PH20（其成熟形式列于SEQID NO:2）包含GPI锚蛋白并且不是可溶性的。相反，牛和羊PH20多肽不包含足以结合至所述GPI锚蛋白的GPI锚蛋白，并且因此被视作可溶性蛋白。另外，包含于本文提供的复合制剂中的可溶性透明质酸酶通常是基本上纯的蛋白。并且，可溶性透明质酸酶保持透明质酸酶活性。例如，可溶性人PH20保持中性活性。
可溶性透明质酸包括天然地不包含GPI锚蛋白或足以与膜结合的锚蛋白的透明质酸酶，包括但不限于Hyal1、牛PH20和羊PH20、它们的等位基因变体和其他变体。可溶性透明质酸酶还包括被修饰成可溶性的任何透明质酸酶。例如，在正常情况下通过GPI锚蛋白与膜结合的人PH20可通过将C-端的GPI锚蛋白截短或去除全部或部分的GPI锚蛋白而成为可溶性的。可溶性透明质酸酶还包括中性活性和酸性活性透明质酸酶，然而预期将中性活性透明质酸酶用于本文中进行皮下给药。
因此，示例性的可溶性透明质酸酶是来自任何物种的PH20，例如SEQID NO:1、2、11、25、27、30、31和32中的任一序列所示的任何透明质酸酶或它们的缺失全部或部分C-端GPI锚蛋白的截短形式，只要所述透明质酸酶是可溶性的并且保持透明质酸酶活性。可溶性透明质酸酶还包括SEQ ID NO:1、2、11、25、27、30、31和32中任一序列的可溶形式的等位基因变体或其他变体，例如它们的截短形式。等位基因变体和其他变体是本领域技术人员已知的并且包括与SEQ ID NO:1、2、11、25、27、30和31中的任一序列具有60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%或更高的序列相同性的多肽，或其截短形式。
本文的复合制剂通常包含可溶性人PH20。虽然可使用来自其他动物的PH20，但是由于此类制剂是动物蛋白所以它们具有潜在的免疫原性。例如，较大比例的患者表现出继发于摄入的食物的先期致敏，并且由于这些是动物蛋白，所有患者具有后续致敏的风险。因此，非人源制剂可能不适于长期使用。如果需要非人源制剂，则本文包括可将此类多肽制备成具有降低的免疫原性。此类修饰在本领域技术人员的能力之内。
a.可溶性人PH20
示例性的可溶性透明质酸酶是可溶性人PH20。已制备了重组人PH20的可溶形式并可包含于本文描述的复合制剂中。PH20的这些可溶形式的制备记载于第2005-0260186和2006-0104968号美国专利申请。可溶形式包括但不限于具有C-端截短以生成包含氨基酸1-氨基酸464或具有SEQ IDNO 1中所述的氨基酸序列的多肽的任何可溶形式。例如，可溶性形式包括但不限于具有C-端截短以生成包含氨基酸1-氨基酸464-483（例如467、477、478、479、480、481、482和483）的任何可溶形式。当在哺乳动物细胞中表达时，所述35个氨基酸N-端信号序列在加工过程中被裂解，并且分泌所述蛋白质的成熟形式。因此，成熟的可溶性多肽至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸36-464。例如，成熟的可溶性多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸36-467或36-483，例如SEQ ID NO:1的36-467、477、478、479、480、481、482和483。末端位于氨基酸位点477-483的缺失型突变体（对应于SEQ IDNO:1所示的前体多肽）表现出比全长GPI-锚定形式更高的分泌型透明质酸酶活性。因此，示例性的可溶性透明质酸酶是例如SEQ ID NO:4-9中的任一序列所示的长度为442、443、444、445、446或447个氨基酸的那些，或者它们的等位基因变体、物种变体或其他变体。
b.重组可溶性人PH20(rHuPH20)
已生成了被命名为rHuPH20的人PH20的重组可溶形式并且可使用本文描述的方法制备和纯化。此类可溶形式的rHuPH20的生成记载于的美国专利申请11/065,716和11/238,171（公布为美国专利申请公布US20050260186和US 20060104968）和下文的实施例3中。示例性的此类多肽是由编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸1-482的核酸分子生成的那些。翻译后加工去除了35个氨基酸的信号序列，导致分泌447个氨基酸的可溶性rHuPH20(SEQ ID NO:4)。由于培养基中存在肽酶，所以在制备和纯化后得到的纯化的rHuPH20可能是不均一的。rHuPH20通常产生于有助于正确的N-糖基化以保持活性的细胞例如CHO细胞（例如DG44CHO细胞）中。
3.糖基化
一些透明质酸酶的糖基化包括N-和O-联糖基化对于它们的催化活性和稳定性是非常重要的。尽管改变修饰糖蛋白的聚糖的类型对蛋白质的抗原性、结构折叠、溶解度和稳定性具有显著作用，但是认为为了最佳的酶活性，大多数酶不需要糖基化。此类透明质酸酶在这一方面是独特的，，因为去除N-联糖基化可引起透明质酸酶活性接近完全失活。对于此类透明质酸酶，N-联聚糖的存在对于生成活性的酶是必需的。
N-联寡糖分属几种主要类型（寡甘露糖型、复合型、杂合型（hybrid）、硫酸化型），其全部具有通过属于-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不为Pro)的Asn残基的酰胺氮连接的(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核心。对于凝固蛋白C（coagulation protein C）在-Asn-Xaa-Cys-位点的糖基化已有报道。在某些情况下,透明质酸酶可既含有N-糖苷键也含有O-糖苷键。例如，PH20具有O-联寡糖以及N-联寡糖。在SEQ ID NO:1所示的人PH20的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490处存在七个潜在的N-联糖基化位点。如上文所述，N490处的N-联糖基化不是透明质酸酶活性必需的。
4.修饰透明质酸酶以改善它们的药动学性质
可以修饰所述复合制剂中提供的透明质酸酶以改善它们的药动学性质，例如增加它们的体内半衰期和/或活性。用于本文提供的复合制剂中的透明质酸酶的修饰可包括直接或通过接头间接连接，例如共价地或通过其他稳定的键、聚合物（例如葡聚糖、聚乙二醇（聚乙二醇化(PEG)）或唾液酸基（sialyl）部分）或其他这样的聚合物（例如天然的或糖聚合物）连接。
已知药物的聚乙二醇化可增加对蛋白质水解的抗性、增加血浆半衰期并减少抗原性和免疫原性。因此，聚合物分子例如聚乙二醇部分（PEG）与透明质酸酶的共价或其他稳定连接（缀合）可赋予所得的酶-聚合物复合物（composition）有益的性质。这些性质包括提高的生物相容性、在个体血液、细胞和/或其他组织中的蛋白质（和酶活性）的半衰期延长、有效保护蛋白质不被蛋白酶作用和水解、提高生物分布、增强药动学和/或药效学以及增加水溶性。
可与透明质酸酶缀合的示例性聚合物包括天然的和合成的同聚物，例如多元醇（即，多-OH）、多胺（即，多-NH2）和多羧酸（即，多-COOH），以及另外的杂聚物，即包含一种或多种不同的偶联基团例如羟基和氨基的聚合物。合适的聚合物分子的实例包括选自以下的聚合物分子：聚亚烷基氧化物(PAO)，例如聚亚烷基二醇（PAG），包括聚丙二醇（PEG）、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、支链聚丙二醇(PEGs)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、聚-D,L-氨基酸、聚乙烯-马来酸酐共聚物、聚苯乙烯-马来酸酐共聚物、葡聚糖包括羧甲基葡聚糖、肝素、同源白蛋白、纤维素包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素、壳聚糖的水解产物、淀粉例如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉、糖原、琼脂糖及其衍生物、瓜尔胶、芽霉菌糖（pullulan）、胰岛素、黄原胶、角叉菜胶、果胶、藻酸水解物和生物聚合物。
通常，所述聚合物为聚亚烷基氧化物（PAO），例如聚氧化乙稀，如PEG，典型的为mPEG，其与多糖例如葡聚糖、芽霉菌糖等相比具有很少的能够交联的反应性基团。通常，所述聚合物为无毒性的聚合物分子例如可以使用相对简单的化学方法与乙酰透明质酸降解酶共价缀合（例如与蛋白质表面的基团结合）的(m)聚乙二醇(mPEG)。
用于与乙酰透明质酸降解酶连接的合适的聚合物分子包括但不限于聚乙二醇（PEG）和PEG衍生物例如甲氧基聚乙二醇（mPEG）、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、支链PEGs和聚氧化乙烯(见，例如Roberts等人,Advanced Drug Delivery Review 2002,54:459-476;Harris和Zalipsky，S(eds.)"Poly(ethylene glycol),Chemistry and BiologicalApplications"ACS Symposium Series 680,1997;Mehvar等人,J.Pharm.Pharmaceut.Sci.,3(1):125-136,2000;Harris,Nature Reviews 2:215et seq.(2003);以及Tsubery,J Biol.Chem 279(37):38118-24,2004)。所述聚合物分子的分子量通常可以是约3kDa至约60kDa。在一些实施方案中，与蛋白质例如rHuPH20缀合的聚合物分子具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或大于60kDa的分子量。
通过共价连接（缀合）PEG或PEG衍生物（即“PEG化”）来修饰多肽的多种方法为本领域已知的（见，例如U.S.2006/0104968;U.S.5,672,662;U.S.6,737,505;和U.S.2004/0235734）。PEG化技术包括但不限于专门的接头和偶联化学（参见，例如Harris,Adv.Drug Deliv.Rev.54:459-476,2002)，将多个PEG部分连接到单个缀合位点(例如通过使用支链PEG;见，例如Veronese等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.12:177-180,2002)，位点特异性PEG化和/或单-PEG化(见，例如Chapman等人,Nature Biotech.17:780-783,1999）和定点酶促PEG化（参见，例如Sato,Adv.Drug Deliv.Rev.,54:487-504,2002）（也见，例如Lu和Felix (1994)Int.J.Peptide Protein Res.43:127-138;Lu和Felix(1993)Peptide Res.6:142-6,1993;Felix等人(1995)Int.J.PeptideRes.46:253-64;Benhar等人(1994)J.Biol.Chem.269:13398-404;Brumeanu等人(1995)J Immunol.154:3088-95;也见，Caliceti等人(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55(10):1261-77以及Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8Pt2):3S-8S）。本领域描述的方法和技术可产生具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个PEG或PEG衍生物与单个蛋白质分子结合的蛋白质（参见，例如U.S.2006/0104968）。
本领域记载了许多用于PEG化的试剂。这些试剂包括但不限于N-羟基琥珀酰亚氨基（NHS）活化的PEG、琥珀酰亚氨基mPEG、mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺、mPEG琥珀酰亚氨基α-甲基丁酸酯、mPEG琥珀酰亚氨基丙酸酯、mPEG琥珀酰亚氨基丁酸酯、mPEG羧甲基3-羟基丁酸琥珀酸亚氨基酯、同基双功能PEG-琥珀酰亚氨基丙酸酯、同基双功能PEG-丙醛、同基双功能PEG-丁醛、PEG马来酰亚胺、PEG酰肼、邻-硝基苯基-羧酸酯PEG、mPEG-苯并三唑羧酸酯、丙醛PEG、mPEG丁醛、支链mPEG2丁醛、乙酰基mPEG、mPEG哌啶酮、mPEG甲基酮、mPEG"无接头"马来酰亚胺、mPEG乙烯砜、mPEG硫醇、mPEG正吡啶基硫代酸酯、mPEG正吡啶基二硫化物、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、乙烯砜PEG-NHS、丙烯酸酯PEG-NHS、荧光素PEG-NHS和生物素PEG-NHS(参见，例如Monfardini等人,Bioconjugate Chem.6:62-69,1995;Veronese等人,J.Bioactive CompatiblePolymers 12:197-207,1997;U.S.5,672,662;U.S.5,932,462;U.S.6,495,659;U.S.6,737,505;U.S.4,002,531;U.S.4,179,337;U.S.5,122,614;U.S.5,183,550;U.S.5,324,844;U.S.5,446,090;U.S.5,612,460;U.S.5,643,575;U.S.5,766,581;U.S.5,795,569;U.S.5,808,096;U.S.5,900,461;U.S.5,919,455;U.S.5,985,263;U.S.5,990,237;U.S.6,113,906;U.S.6,214,966;U.S.6,258,351;U.S.6,340,742;U.S.6,413,507;U.S.6,420,339;U.S.6,437,025;U.S.6,448,369;U.S.6,461,802;U.S.6,828,401;U.S.6,858,736;U.S.2001/0021763;U.S.2001/0044526;U.S.2001/0046481;U.S.2002/0052430;U.S.2002/0072573;U.S.2002/0156047;U.S.2003/0114647;U.S.2003/0143596;U.S.2003/0158333;U.S.2003/0220447;U.S.2004/0013637;US 2004/0235734;U.S.2005/000360;U.S.2005/0114037;U.S.2005/0171328;U.S.2005/0209416;EP 01064951;EP 0822199;WO 00176640;WO 0002017;WO 0249673;WO 9428024;和WO 0187925)。
E.制备编码可溶性透明质酸酶及其多肽的核酸的方法
本文所述透明质酸酶的多肽可通过本领域熟知的用于蛋白质纯化和重组蛋白质表达的方法获得。可使用本领域技术人员已知的任何用于鉴定编码期望的基因的核酸的方法。可使用本领域可用的任何方法从例如细胞或组织来源获得编码透明质酸酶的全长（即包含完整的编码区域）cDNA或基因组DNA克隆。经修饰的可溶性透明质酸酶或可溶性透明质酸酶的变体可从野生型多肽通过例如定点突变经工程化获得。通常用于本文提供的复合制剂中的包括可溶性透明质酸酶例如rHuPH20在内的透明质酸酶可为重组制备的或者可从天然来源例如睾丸提取物纯化或部分纯化而来。
可使用本领域已知的任何可获得的用于克隆和分离核酸分子的方法克隆和分离多肽。这些方法包括核酸的PCR扩增和文库筛选，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选和基于活性的筛选。
可使用用于核酸扩增的方法来分离编码期望的多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链式反应（PCR）法。可将包含核酸的材料用作起始材料，由其可分离期望的编码多肽的核酸分子。例如，DNA和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物、流体样品（例如血液、血清、唾液）、来自健康和/或患病个体的样品可用于扩增方法。核酸文库也可用作起始材料的来源。可设计引物以扩增期望的多肽。例如，可基于产生期望的多肽的表达的序列来设计引物。可基于多肽氨基酸序列的回译来设计引物。可对通过扩增生成的编码期望的多肽的核酸分子进行测序和验证。
另外的核苷酸序列可结合至编码多肽的核酸分子，包括接头序列，其包含用于将合成基因克隆到载体例如蛋白表达载体或设计用于扩增核心蛋白编码DNA序列的载体的限制性内切核酸酶位点。此外，可通过操作将限定（specify）功能DNA元件的另外的核苷酸序列与编码多肽的核酸分子操作连接。这些序列的实例包括但不限于设计用于促进胞内蛋白表达的启动子序列，设计用于促进蛋白质分泌的分泌序列例如异源信号序列。这些序列为本领域技术人员已知的。也可将另外的核苷酸残基序列例如限定蛋白质结合区域的碱基序列与编码酶的核酸分子连接。这些区域包括但不限于促进或编码这样的蛋白质的残基序列，所述蛋白质促进将酶摄取入到特异靶细胞，或者改变合成基因的产物的药动学。例如，可将酶与PEG部分连接。
此外，可加入标记或其他部分例如以辅助多肽的检测或亲和纯化。例如，也可将另外的核苷酸残基序列例如限定表位标记或其他可检测标记的碱基序列与编码酶的核酸分子连接。示例性的这些序列包括编码His标记的核酸序列（例如，6xHis,HHHHHH;SEQ ID NO:54）或Flag Tag（DYKDDDDK;SEQ ID NO:55）。
接着可将已鉴定和分离的核酸插入合适的克隆载体中。可使用本领域已知的大量的载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或经修饰的病毒，但是载体系统必须与所用宿主细胞相容。这些载体包括但不限于噬菌体例如λ衍生物，或质粒例如pCMV4、pBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript载体(Stratagene,La Jolla,CA)。其他表达载体包括本文举例说明的HZ24表达载体。插入到克隆载体中可例如通过将DNA片段连接到具有互补粘性末端的克隆载体来实现。可使用TOPO克隆载体(INVITROGEN,Carlsbad,CA)实现插入。如果克隆载体中不存在用于片段化DNA的互补限制性位点，可酶法修饰该DNA分子的末端。或者，可通过连接核苷酸序列（接头）至该DNA末端来产生任何所需的位点；这些连接的接头可包含编码限制性内切核酸酶识别序列的特定的化学合成的寡核苷酸。在备选方法中，被裂解的载体和蛋白质基因可通过同聚物加尾来修饰。可通过例如转化、转染、感染、电穿孔和超声穿孔将重组分子引入宿主细胞中。
在特定的实施方案中，用包含分离的蛋白质基因、cDNA、或合成DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞能够产生该基因的多个拷贝。因此，通过使转化体生长、从所述转化体中分离所述重组DNA分子，并且必要时从所述分离的重组DNA中回收插入的基因，可大量获得该基因。由于糖基化对于透明质酸酶的催化活性和稳定性是重要的，所以通常使用有助于正确的N-糖基化的蛋白表达系统来生产包括可溶形式的PH20在内的透明质酸酶以确保该多肽保持活性。此类细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞（例如DG44CHO）细胞。
1.载体和细胞
为了一个或多个期望的蛋白质例如本文所述的任何蛋白质的重组表达，可将包含编码该蛋白质的核苷酸序列的全部或部分的核酸插入到合适的表达载体中，即包含用于所插入的蛋白质编码序列的转录和翻译所必需的元件的载体。也可由酶基因和/或它们的侧翼区的天然启动子提供必要的转录和翻译信号。
本文也提供包含编码酶的核酸的载体。本文也提供包含所述载体的细胞。所述细胞包括真核细胞和原核细胞，并且所述载体为任何适合用于其中的载体。
本文提供了包含所述载体的原核细胞和真核细胞，包括内皮细胞。这些细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、Archea、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。通过使以上所述的细胞在该细胞表达编码的蛋白质的条件下生长并回收表达的蛋白质，将所述细胞用于产生其蛋白质。用于本文目的，例如，所述酶可被分泌到培养基中。
本文提供包含编码与天然或异源信号序列偶联的可溶性透明质酸酶多肽的核苷酸序列以及其多个拷贝的载体。可选择所述载体用于将所述酶蛋白表达在细胞中或使所述酶蛋白表达为分泌型蛋白。
可使用多种宿主-载体系统表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于用病毒（例如牛痘病毒、腺病毒和其他病毒）感染的哺乳动物系统；用病毒（例如杆状病毒）感染的昆虫细胞系统；包含酵母载体的微生物例如酵母；或用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件具有不同的长度和特异性。根据所使用的宿主-载体系统，可使用许多合适的转录和翻译元件中的任一种。
可使用本领域技术人员已知的任何用于将DNA片段插入载体的方法构建包含嵌合基因（包含合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列）的表达载体。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组体（遗传重组）。编码蛋白质或其结构域、衍生物、片段或同系物的核酸序列的表达可用另一核酸序列来调控，从而使该基因或其片段表达于用重组DNA分子转化的宿主中。例如，可用本领域已知的任何启动子/增强子来控制蛋白质的表达。在特定的实施方案中，启动子对于期望的蛋白的基因而言不是天然的。可使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子(Bernoist和Chambon,Nature 290:304-310(1981))、包含于劳氏肉瘤病毒3'长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等人Cell 22:787-797(1980))、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1441-1445(1981))、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等人,Nature 296:39-42(1982));原核表达载体例如β-内酰胺酶启动子(Jay等人,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:5543)或tac启动子(DeBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25(1983));也参见“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”:in Scientific American242:79-94(1980))；包含胭脂碱合成酶启动子的植物表达载体(Herrara-Estrella等人,Nature 303:209-213(1984))或花椰菜花叶病毒35SRNA启动子(Garder等人,Nucleic Acids Res.9:2871(1981))，以及光合酶二磷酸核酮糖羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等人,Nature 310:115-120(1984));来自酵母和其他真菌的启动子例如Gal4启动子、乙醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子以及下列显示组织特异性并已用于转基因动物中的动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人,Cell 38:639-646(1984);Ornitz等人,ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409(1986);MacDonald,Hepatology7:425-515(1987))；在胰脏β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan等人,Nature 315:115-122(1985)),在淋巴样细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人,Cell 38:647-658(1984);Adams等人,Nature318:533-538(1985);Alexander等人,Mol.Cell Biol.7:1436-1444(1987))，在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区(Leder等人,Cell 45:485-495(1986))，在肝脏中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinckert等人,Genes and Devel.1:268-276(1987))，在肝脏中具有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648(1985);Hammer等人,Science 235:53-581987))，在肝脏中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人,Genes andDevel.1:161-171(1987))，在髓样细胞中具有活性的β珠蛋白基因控制区(Magram等人,Nature315:338-340(1985);Kollias等人,Cell 46:89-94(1986))，在脑少突胶质细胞中具有活性的髓磷脂碱蛋白基因控制区(Readhead等人,Cell 48:703-712(1987))，在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani,Nature314:283-286(1985))以及在下丘脑的促性腺激素细胞中具有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人,Science 234:1372-1378(1986))。
在特定的实施方案中，所使用的载体包含与编码期望的蛋白或其结构域、片段、衍生物或同系物的核酸操作性地连接的启动子、一个或多个复制起点以及任选的一个或多个可选标记（例如抗生素抗性基因）操作。用于转化大肠杆菌（E.coli）细胞的示例性质粒载体包括例如pQE表达载体(得自Qiagen,Valencia,CA;也可参见Qiagen出版的描述该系统的文献)。pQE载体具有用于提供重组蛋白在大肠杆菌中的严格调控的、高水平的表达的噬菌体T5启动子(由大肠杆菌RNA聚合酶识别)和两个lac操作子阻抑模块，用于有效翻译的合成核糖体结合位点(RBS II)、6XHis标记编码序列、t0和T1转录终止子、ColE1复制起点以及用于使其具有氨苄西林抗性的β内酰胺酶基因。pQE载体能够将6xHis标记置于重组蛋白的N-或C-端。这些质粒包括为所有三个阅读框提供多克隆位点并提供N-端6xHis标记的蛋白的表达的pQE 32、pQE 30和pQE 31。用于转化大肠杆菌细胞的其他示例性质粒载体包括例如pET表达载体(见美国专利4,952,496;可获自NOVAGEN,Madison,WI;也可见Novagen出版的描述该系统的文献)。这些质粒包括pET 11a，其包含T7lac启动子、T7终止子、可诱导的大肠杆菌lac操作子以及lac阻遏基因；pET 12a-c，其包含T7启动子、T7终止子和大肠杆菌ompT分泌信号；以及pET 15b和pET19b(NOVAGEN,Madison,WI)，其包含用于使用His柱纯化的His-TagTM前导序列和允许在所述柱上纯化后进行裂解的凝血酶裂解位点、T7-lac启动子区和T7终止子。
示例性哺乳动物细胞表达载体为HZ24表达载体。该HZ24表达载体衍生自pCI载体骨架(Promega)。它包含编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、F1复制起点、巨细胞病毒即时早期增强子/启动子区(CMV)以及SV40晚期多聚腺苷酸化信号(SV40)。该表达载体也具有来自ECMV病毒(Clontech)的内部核糖体进入位点和小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。
2.表达
可通过本领域技术人员已知的包括体内和体外方法在内的任何方法产生可溶性透明质酸酶多肽。可在适于产生必需的量和形式的蛋白质（例如给药和治疗所需的）的任何生物体中表达所需蛋白。表达宿主包括原核生物和真核生物例如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞，包括人细胞系和转基因动物。表达宿主可在它们的蛋白质产生水平以及所表达蛋白质上存在的翻译后修饰类型上存在差异。可根据这些和其他因素例如管理和安全考虑、生产成本和纯化的需要和方法等选择表达宿主。
许多表达载体是本领域技术人员可用的和已知的，并可用于蛋白质表达。表达载体的选择会受到宿主表达系统的选择的影响。一般而言，表达载体可包含转录启动子和任选的增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体通常具有允许进行转化细胞的筛选和维持的选择标记。在一些情况下，可使用复制起点来扩增所述载体的拷贝数量。
可溶性透明质酸酶多肽也可被用作或表达为蛋白融合物。例如，可生成酶融合物以向酶添加另外的功能性。酶融合物蛋白的实例包括但不限于信号序列、例如用于定位的标记（如his6标记或myc标记）、或用于纯化的标记（例如GST融合物），以及用于引导蛋白质分泌和/或膜结合的序列的融合物。
a.原核细胞
原核生物尤其是大肠杆菌提供用于产生大量蛋白质的系统。大肠杆菌的转化是本领域技术人员熟知的简单和快捷的技术。用于大肠杆菌的转化载体可包含诱导型启动子，这些启动子可用于诱导高水平的蛋白质表达和用于表达显示对宿主细胞的某种毒性的蛋白质。诱导型启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子以及温度调控的λPL启动子。
蛋白质例如本文提供的任何蛋白质可表达于大肠杆菌的胞质环境中。胞质为还原性环境并且对于一些分子而言，这可引起不溶性包涵体的形成。还原剂例如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇以及变性剂例如盐酸胍和尿素可用于重新溶解蛋白质。另一种方法为将蛋白质表达于细菌的周质空间，其提供氧化环境以及类伴侣蛋白和二硫化物异构酶，并可引起可溶性蛋白的产生。通常，将引导蛋白质到周质的前导序列与待表达的蛋白质融合。然后通过周质内的信号肽酶去除前导序列。靶向周质的前导序列的实例包括来自果胶酶基因的pelB前导序列和得自碱性磷酸酶基因的前导序列。在一些情况下，周质表达使表达的蛋白可以渗漏到培养基中。蛋白质的分泌使得可以从培养基上清中快速并简单地纯化。非分泌型的蛋白可通过渗透裂解从周质获得。与胞质表达相似，在一些情况下，蛋白质可变成不溶的，可使用变性剂和还原剂促进溶解和重新折叠。诱导和生长的温度也可影响表达水平和溶解度，通常使用25℃至37℃的温度。通常细菌产生非糖基化的（aglycosylated）蛋白质。因此，如果蛋白质的功能需要糖基化，可在从宿主细胞纯化后在体外增加糖基化。
b.酵母细胞
酵母例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）为可用于产生蛋白质例如本文所述的任何蛋白质的熟知的酵母表达宿主。可用附加型复制载体或通过利用同源重组进行的稳定的染色体整合来转化酵母。通常，使用诱导型启动子调控基因表达。该类启动子的实例包括GAL1、GAL7和GAL5以及金属硫蛋白启动子，例如CUP1、AOX1或其他毕赤酵母或其他酵母启动子。表达载体经常包括用于筛选和维持转化的DNA的选择标记例如LEU2、TRP1、HIS3和URA3。表达于酵母中的蛋白质通常为可溶的。与伴侣蛋白例如Bip和蛋白质二硫化物异构酶的共表达可提高表达水平和溶解度。此外，使用分泌信号肽融合物例如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号以及与酵母细胞表面蛋白例如Aga2p交配型粘附受体或Arxula adeninivorans的葡萄糖淀粉酶的融合物可引导表达于酵母中的蛋白质以进行分泌。可以改造蛋白质酶裂解位点例如Kex-2蛋白酶的裂解位点，以在它们退出分泌途径时从表达的多肽去除融合的序列。酵母也能够在Asn-X-Ser/Thr模体进行糖基化。
c.昆虫细胞
昆虫细胞，特别是使用杆状病毒表达的昆虫细胞，可用于表达多肽例如透明质酸酶多肽。昆虫细胞表达高水平的蛋白并且能够进行高等真核生物使用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有限制性宿主范围，这提高了安全性，并减少了对真核表达调控方面的担忧。典型的表达载体使用启动子进行高水平表达，例如杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒例如苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica）核型多角体病毒（AcNPV）和家蚕（Bombyx mori）核型多角体病毒（BmNPV）以及昆虫细胞系，例如来自于草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）的Sf9、美洲粘虫(Pseudaletia unipuncta)（A7S）和君主斑蝶(Danaus plexippus)（DpN1）。为了高水平表达，紧接于多角体蛋白起始密码子的下游将待表达的分子的核苷酸序列融合。在昆虫细胞中，哺乳动物的分泌信号被准确加工并可用于将表达的蛋白质分泌到培养基中。此外，美洲粘虫（A7S）和君主斑蝶（DpN1）细胞系产生具有与哺乳动物细胞系相似的糖基化模式（pattern）的蛋白质。
昆虫细胞中的另一表达系统为使用稳定转化的细胞。细胞系例如Schneider2（S2）细胞系、Kc细胞（黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)）和C7细胞（白纹伊蚊(Aedes albopictus)）可用于表达。在用镉或铜进行重金属诱导的情况下，果蝇的金属硫蛋白启动子可用于诱导高水平表达。通常通过使用选择标记例如新霉素和潮霉素来维持表达载体。
d.哺乳动物细胞
哺乳动物细胞表达系统可用于表达包括可溶性透明质酸酶多肽在内的蛋白质。通过病毒感染例如腺病毒，或通过直接DNA转移例如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖以及通过物理方法例如电穿孔和显微注射，可将表达构建体转移到哺乳动物细胞中。哺乳动物细胞的表达载体通常包含mRNA加帽位点、TATA盒、翻译起始序列（Kozak共有序列）和多聚腺苷酸化元件。也可加入IRES元件，以允许与另一个基因例如选择标记的进行双顺反子表达。该类载体常常包含用于高水平表达的转录启动子-增强子，例如SV-40启动子-增强子、人巨细胞病毒（CMV）启动子和Rous肉瘤病毒（RSV）的长末端重复序列。这些启动子-增强子在许多细胞类型中具有活性。组织型和细胞型的启动子和增强子区也可用于表达。示例性启动子/增强子区包括但不限于来自基因例如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β珠蛋白、髓磷脂碱蛋白、肌球蛋白轻链2和促性腺激素释放激素控制区的那些。选择标记可用于包含表达构建体的细胞的筛选和维持。选择标记基因的例子包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶（DHFR）和胸苷激酶。例如，可在甲氨蝶呤存在下进行表达以仅筛选出表达DHFR基因的那些细胞。与细胞表面信号转导分子例如TCR-ζ和FcεRI-γ的融合可引导蛋白以活性状态在细胞表面直接表达。
许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。示例性细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌型)和其他骨髓瘤细胞系、杂交瘤细胞系和异种杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、SP2/0、COS、NIH3T3、293、293S、2B8和HKB细胞。还可用适应无血清培养基的细胞系，无血清培养基有助于从细胞培养基中纯化分泌的蛋白。实例包括CHO-S细胞（Invitrogen,Carlsbad,CA,cat#11619-012）和无血清EBNA-1细胞系（Pham等人,(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332-42。）。还可用适于在经优化用于最大表达的特殊培养基中生长的细胞系。例如，DG44CHO细胞适于在化学成分明确的、不含动物产品的培养基中悬浮培养生长。
e.植物
转基因植物细胞和植物可用于表达蛋白质，如本文所描述的任何蛋白质。通常使用直接DNA转移例如微粒轰击和PEG介导转移进入原生质体以及用农杆菌介导的转化将表达构建体转移到植物中。表达载体可包含启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译控制元件。通常将表达载体和转化技术在双子叶植物宿主例如拟南芥（Arabidopsis）和烟草以及单子叶植物宿主例如玉米和水稻之间进行区分。用于表达的植物启动子的实例包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合成酶启动子、核糖二磷酸羧化酶、泛素和UBQ3启动子。经常使用选择标记例如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶来辅助转化细胞的筛选和维持。可将转化的植物细胞以细胞、聚集物（愈伤组织）维持在培养物中或再生成完整植物。转基因植物细胞也可包括经工程化以产生透明质酸酶多肽的藻类。因为植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，这可能影响在这些宿主中产生的蛋白质的选择。
3.纯化技术
从宿主细胞中纯化包括可溶性透明质酸酶多肽或其他蛋白质在内的多肽的方法取决于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌型分子，通常在去除细胞后从培养基中纯化蛋白。对于胞内表达，可裂解细胞，然后从提取物中纯化蛋白质。当将转基因生物例如转基因植物和动物用于表达时，组织或器官可作为制备裂解细胞提取物的起始材料。此外，转基因动物生产可包括产生在牛奶或鸡蛋中的多肽，它们可被收集，如有必要，可使用本领域的标准方法提取蛋白并进一步纯化。
可使用本领域中已知的标准蛋白质纯化技术来纯化蛋白质例如可溶性透明质酸酶多肽，这些技术包括但不仅限于SDS-PAGE、体积分级和尺寸排阻色谱法、硫酸铵沉淀和离子交换色谱法，例如阴离子交换。也可采用亲和纯化技术以提高效率和制备物的纯度。例如，结合透明质酸酶的抗体、受体和其他分子可用于亲和纯化。也可改造表达构建体以给蛋白质添加亲和标记，如myc表位、GST融合蛋白或His6，分别使用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂进行亲和纯化。可通过包括凝胶电泳、染色和分光光度技术在内的本领域任何已知的方法评价纯度。
F.免疫球蛋白和可溶性透明质酸酶多肽的制备、制剂和给药
本文提供IG和透明质酸酶的复合制剂，其作为液体制剂在最高32℃的温度(例如约0℃-32℃或约0℃-32℃)下，稳定达至少6个月的长期时间。提高的稳定性的特征在于延长保存时间、减少片段化、减少聚集体形成、减少二聚体形成和/或减少脱色，同时维持所述IG和透明质酸酶的活性。还可将此类制剂提供为无需进一步复溶和/或无需进一步稀释的“即用”型液体制剂。可将所得的稳定复合制剂以用于直接注射或给药的剂型方便地分配给医生或患者。例如，可在家中或任何地方输注或注射所述复合制剂。
与免疫球蛋白复合配制的可溶性透明质酸酶能够通过增加所述免疫球蛋白的生物利用度来增强免疫球蛋白向体内期望位点的递送。因此，与常规的皮下给药方法相比，所述复合制剂在皮下给药后实现所述免疫球蛋白的提高的浓度和/或更快速达到的浓度，从而提供例如特定剂量的更有效和/或更快速的反应。另外，包含可溶性透明质酸酶的IG复合制剂还允许给药较低剂量的IG，用较低的IG给药剂量实现特定的反应。最后，可溶性透明质酸酶增强注射或输注位点或其附近的液体团块流动的能力还可改善相关的药物递送的其他方面。例如，液体团块流动的增加还可有助于使注射的流体体积更容易从所述注射位点分散（减轻潜在的疼痛或其他不良注射后果）。这对于允许给药较高剂量的皮下输注尤为重要。除了增加生物利用度，IG与透明质酸酶的复合制剂提供比常规的静脉内给药途径更安全或者更方便的给药途径。
本文提供的复合制剂长期稳定，包括在不同的温度下。例如，本文提供的复合制剂在最高32℃的温度下稳定并保留所述IG和透明质酸酶的活性达至少六个月。例如，所述复合制剂在冷藏温度（例如2℃-8℃，如4℃或约4℃）下，稳定达至少6个月-4年，例如1年-2年，如6个月、至少1年、至少2年、至少3年、或者至少4年或更长时间。在另一实施方案中，所述复合制剂在室温（例如18℃-32℃，通常为20℃-32℃，如28℃-32℃）下，稳定达至少6个月-1年，例如6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月，或至少一年或更长的时间。
特别地，所述稳定的复合制剂在保存特定的时间后表现出低水平至不可检出水平的IG聚集和/或片段化。评价聚集和片段化的方法是本领域技术人员已知的并且举例说明于下文的章节G。一般而言，在保存了上文所述的确定的时间后，通过HPSEC或其他方法测定，所述复合制剂中不多于0.5%-5%IG，例如不多于5%、不多于4%、不多于3%、不多于2%、不多于1%、通常不多于0.5%的IG形成聚集体。
另外，本文提供的稳定的复合制剂中的IG和透明质酸酶保持保存前的所述IG和透明质酸酶的初始活性的一种或多种活性。本领域的技术人员熟知IG和透明质酸酶的活性并且可评价此类活性。章节G提供示例性的活性和评价活性的测定法。通常，本文提供的稳定的液体复合制剂在保存后保留所述蛋白在保存前的初始活性的至少50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多，通常保留至少70%-95%的所述初始活性。例如，所述稳定的液体复合制剂在保存后保留各种蛋白在保存前的初始活性的多于70%、多于80%、多于85%、多于90%、多于95%、多于98%、多于99%或多于99.5%。
1.制剂和剂量
将本文提供的复合制剂配制为液体。所述复合制剂包含免疫球蛋白、透明质酸酶、至少0.05M碱金属盐酸盐，例如至少0.05M氯化钠（NaCl或盐）或0.05M氯化钾(KCl)。还调节所述复合制剂的pH以限制聚集并保持所述IG和透明质酸酶的活性。在一些实施方案中，所述复合制剂不包含除水或适合的溶剂以外的其他成分。在其他实施方案中，所述复合制剂还包含稀释剂、载体或其他赋形剂。
通常，使用本领域公知的技术和操作将所述化合物配制于药物组合物中（参见例如Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,FourthEdition,1985,126）。在管理机构或其他机构的批准下制备药学可接受的组合物，按照公认的用于动物和人的药典制备。所述制剂应适合给药方式。
可将所述复合制剂提供为液体形式的药物制剂，例如溶液剂、糖浆剂或混悬剂。在液体形式中，可将所述药物制剂提供为在使用前稀释至治疗有效浓度的浓缩制剂。通常，将所述制剂提供为使用时不需要稀释的剂型。可通过常规方法使用例如以下的药学可接受的添加剂来制备此类液体制剂：助悬剂（例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪）；乳化剂（例如卵磷脂或阿拉伯胶）；非水溶剂（例如杏仁油、油酯或分馏的植物油）；和防腐剂（例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸）。在另一实施方案中，可将药物制剂提供为在使用前用水或其他适合的媒介物复溶的冻干形式。
本文提供的稳定的复合制剂的pH使得所述复合制剂中的IG不聚集且/或所述IG和透明质酸酶保持章节G中描述的活性。可通过本领域技术人员已知的制剂技术获得最佳pH。例如，可使用本领域技术人员已知的各种方法例如章节G中描述的方法，通过评价不同pH条件下的聚集和活性来确定最佳pH。此类测定法或评价包括但不限于各种制剂的尺寸排阻色谱法、HSPEC测定、热稳定性数据、抗补体效价和/或透明质酸酶活性测定法。通常，在本文提供的复合制剂中，当在所述复合制剂的浓溶液中测定时，所述pH可为4.0-8.0。然而，通常需要该范围内的较低的pH以确保最大单体含量。因此，本文提供的复合制剂的pH通常为至少4.0-7.4或约4.0-7.4，一般为至少4.0-6.0或约4.0-6.0，并且典型地是4.4-4.9。应注意，所指明的pH是在所述制剂的浓溶液中测得。可使用酸化剂调节pH来降低所述pH或使用碱化剂增加所述pH。示例性的酸化剂包括但不限于乙酸、柠檬酸、硫酸、盐酸、磷酸二氢钠溶液和磷酸。示例性的碱化剂包括但不限于磷酸氢二钠溶液、碳酸钠或氢氧化钠。
可将任何缓冲剂用于本文提供的液体制剂的制备中，只要其对所述复合制剂的稳定性没有不利的影响并且有助于实现所需要的必要pH范围。特别适合的缓冲剂的实例包括琥珀酸盐、乙酸盐、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐、乌头酸盐、苹果酸盐和碳酸盐。然而，本领域技术人员会认识到本文提供的制剂不受限于特定的缓冲剂，只要所述缓冲剂提供可接受程度的pH稳定性或所指明范围内的“缓冲能力”。缓冲剂通常在其pK的约1pH单位内具有足够的缓冲能力（Lachman等人,1986）。可根据已出版的pH列表估算或通过本领域公知的方法凭经验测定缓冲剂适合性。例如使用任何可接受的酸或碱可将溶液的pH调节至在上文所述范围内的期望的终点。
a.免疫球蛋白
提供于所述复合制剂中的IG的浓度为5%-22%w/v或约5%-22%w/v，例如为50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、120mg/mL、150mg/mL、180mg/mL、200mg/mL、220mg/mL、250mg/mL或更高，或者约50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、120mg/mL、150mg/mL、180mg/mL、200mg/mL、220mg/mL、250mg/mL或更高。通常，提供于所述复合制剂中的IG的量至少是10%(100mg/mL)-20%(200mg/mL)，例如10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%或更高。
可将本文提供的免疫球蛋白制剂配制成供单剂量使用或多剂量使用的药物组合物。通常，如本文其他部分所述，以能够使所述复合制剂成为即用的并且不需要进一步稀释的量将所述IG配制于所述复合制剂中。根据是否将所述复合制剂提供为单剂量或多剂量制剂，本领域技术人员可凭经验确定所述复合制剂中的IG的精确量。
通常以特定治疗方案的治疗有效量提供所述免疫球蛋白。可通过在已知的体外或体内系统中试验所述化合物（例如本文提供的测定法），凭经验确定治疗有效浓度。所选择的免疫球蛋白在所述组合物中的浓度取决于复合物的吸收、灭活和排泄速率、所述复合物的物理化学特性、剂量方案、给药量以及本领域技术人员已知的其他因素。例如，应理解，精确的剂量和疗程随被治疗的组织而变化，并且可使用已知的试验方案或通过从体内或体外试验数据外推来确定。应注意，浓度和剂量值还可随受治疗个体的年龄而变化。还应理解，对于任何特定的个体，应根据个体的需要和给药所述制剂或监控所述制剂的给药的人员的专业判断随时调节特定的剂量方案，并且本文所述的浓度范围仅为示例性的并且不应认为对本发明的范围具有限制性。可通过标准的临床技术确定所选择的待给药以治疗疾病或病症例如IG可治疗的疾病或病症的免疫球蛋白制剂的量。另外，可采用体外测定法和动物模型来辅助确定最佳剂量范围。因此，可凭经验判断的精确剂量可取决于特定的免疫球蛋白制剂、使用所述可溶性透明质酸酶的治疗方案和给药方案、给药途径、被治疗的疾病的类型和所述疾病的严重度。
例如，可将IG制剂配制于药物组合物中以实现制备并给药现有的静脉内(IVIG)制剂所要实现的剂量方案（剂量和频率），用于特定的IG可治疗的疾病或病症。本领域的技术人员熟悉用于特定疾病或病症的IVIG给药的剂量方案。例如，下文的章节H提供用于特定的疾病和病症的示例性IG剂量方案（剂量和频率）。其他剂量方案是本领域技术人员公知的。必要时可凭经验确定或外推具体的剂量和疗程以及治疗方案。
例如，可使用静脉内给药的免疫球蛋白的示例性剂量作为起点来确定适合的剂量。可基于多种因素确定剂量水平，所述因素例如个体的体重、整体健康状况、年龄、所使用的特定化合物的活性、性别、饮食、给药时间、排泄速率、药物组合、疾病的严重度和病程以及患者对疾病的倾向（disposition）和治疗医师的判断。免疫球蛋白的剂量一般为100mg/kg体重（即100mg/kg BW）-2g/kg BW或约100mg/kg体重-2g/kg BW。应理解，给药量随被治疗的适应症并可能随需要耐受的副作用而变化。可使用用于每一种病症的公认的模型凭经验确定剂量。
在一个实施方案中，所提供的IG的量允许皮下给药与用于具体的被治疗适应症的每月一次IV给药的剂量相等的剂量。在此实施方案中，可将免疫球蛋白制剂以足以提供每月一次给药的剂量的量配置成用于单剂量给药，但是可以更少的量提供该免疫球蛋白制剂用于多剂量给药。例如，可每日一次、每周一次、每两周一次或每月一次给药IG制剂的每月一次给药的剂量。剂量方案可持续数月或数年。具体的每月一次IV给药的剂量随被治疗的疾病而变化，并且因此可有不同。
特别是对于IG皮下给药，示例性的单次剂量的范围是1克(g)-200g或约1克(g)-200g，例如1克(g)、5g、10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g或200g。因此其具体的剂量和制剂取决于适应症和个体。例如，给药剂量可为50mg/kg体重(BW)-600mg/kg BW，例如50mg/kg体重(BW)、100mg/kg BW、200mg/kg BW、300mg/kg BW、400mg/kg BW、500mg/kg BW、600mg/kg BW或更高，可视需要凭经验确定剂量。为了达到这些剂量，皮下给药的含IG的复合制剂的体积可为10mL-700mL或约10mL-700mL，例如100mL-500mL，如200mL-400mL。例如，用于单剂量给药的皮下给药的含IG的复合制剂的体积可为10mL、20mL、30mL、40mL、50ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml或更大，或者约10mL、20mL、30mL、40mL、50ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml或更大。例如，可以200ml-700ml的体积给药用于本文所述的适应症的10%液体IG复合制剂(100mg/ml)以实现20g-70g IG的单次剂量。在另一实施方案中，可以100mL-350mL的体积给药用于本文所述的适应症的20%液体IG复合制剂(200mg/ml)以实现20g-70g IG的相似的单次剂量。应注意，可以更少的量将IG提供于所述复合制剂中用于多剂量给药。
b.透明质酸酶
包含于所述复合制剂中的所选择的透明质酸酶（特别是可溶性透明质酸酶，例如rHuPH20）的浓度是50U/mL-300U/mL或约50U/mL-300U/mL，例如50U/ml、75U/mL、100U/ml、150U/ml、200U/ml、300U/mL、400U/ml或500U/ml，典型地为至少100U/mL-300U/mL，一般为75U/mL-350U/mL的浓度。可视需要以更浓缩的形式提供所述透明质酸酶，例如1000U/mL-5000U/mL或约1000U/mL-5000U/mL，例如1000U/ml、1500单位/ml、2000U/ml、4000U/ml或5000U/ml。
可将所述复合制剂中的透明质酸酶配制成用于单剂量或多剂量给药的药物组合物。如上文关于IG所述，通常以能够使所述复合制剂成为即用的从而不需要进一步稀释的量配制所述复合制剂中的透明质酸酶。根据是否将所述制剂提供为单剂量或多剂量形式，本领域技术人员可凭经验确定包含于所述复合制剂内的透明质酸酶的精确量。
通常，所述复合制剂包含的所选择的透明质酸酶（特别是可溶性透明质酸酶，例如rHuPH20）的量足以对受治疗的患者发挥IG的治疗有效作用而没有不利的副作用。例如，可通过使用本文提供的或本领域已知的测定法在已知的体外和体内系统中试验所述多肽（参见例如Taliani等人,(1996)Anal.Biochem.,240:60-67;Filocamo等人,(1997)J Virology，71:1417-1427;Sudo等人,(1996)Antiviral Res.32:9-18;Buffard等人,(1995)Virology，209:52-59;Bianchi等人,(1996)Anal.Biochem.,237:239-244;Hamatake等人,(1996)Intervirology 39:249-258;Steinkuhler等人,(1998)Biochem.,37:8899-8905;D’Souza等人,(1995)J Gen.Virol.,76:1729-1736;Takeshita等人,(1997)Anal.Biochem.247:242-246;还可参见例如Shimizu等人,(1994)J.Virol.68:8406-8408;Mizutani等人,(1996)J.Virol.70:7219-7223;Mizutani等人,(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.,227:822-826;Lu等人,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci(USA),93:1412-1417;Hahm等人,(1996)Virology，226:318-326;Ito等人,(1996)J.Gen.Virol.,77:1043-1054;Mizutani等人,(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.,212:906-911;Cho等人,.(1997)J.Virol.Meth.65:201-207），然后从其外推用于人的剂量，来凭经验确定治疗有效浓度。
例如，用于单剂量给药的透明质酸酶的治疗有效剂量为500单位-500000单位或约500单位-500000单位，例如1000单位-100000单位透明质酸酶。例如，特别是对于皮下给药，可以500单位、1000单位、2000单位、5000单位、10000单位、30000单位、40000单位、50000单位、60000单位、70000单位、80000单位、90000单位、100000单位或更多单位，或者约500单位、1000单位、2000单位、5000单位、10000单位、30000单位、40000单位、50000单位、60000单位、70000单位、80000单位、90000单位、100000单位或更多单位给药透明质酸酶。应注意，可以更少的量将透明质酸酶提供于所述复合制剂中用于多剂量给药。
在一些实施方案中，可将剂量表示为与所给药的IG的比例。例如，可以10U/克(g)-2000U/g或更多的IG给药透明质酸酶，例如10U/g、20U/g、30U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g、200U/g、250U/g、300U/g、400U/g、500U/g、1000U/g、1500U/g、2000U/g、3000U/g IG或更高，或者约10U/g、20U/g、30U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g、200U/g、250U/g、300U/g、400U/g、500U/g、1000U/g、1500U/g、2000U/g、3000U/g IG或更高。一般而言，复合制剂产品中的透明质酸酶与IG的比例高于例如在Leading Edge给药中将相同的产品（IG和透明质酸酶）和相同量的IG单独皮下给药时的比例。因此，所述比例一般为至少100U/g并且通常为250U/g或更高，例如100U/g-3000U/g IG，例如250U/g-1000U/g，特别是250U/g-750U/g，如500U/g IG。例如，当与20%IG(200mg/mL)复合配制时，以500U/g IG或约500U/gIG的比例提供包含100U/mL透明质酸酶的复合制剂。通常，用于单剂量给药的皮下给药体积可为10mL-700mL或约10mL-700mL，例如50mL-500mL，如100mL-400mL。例如，用于单剂量给药的皮下给药体积可为10mL、20mL、30mL、40mL、50ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml或更大，或约10mL、20mL、30mL、40mL、50ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml或更大。
c.碱金属盐酸盐
本文提供的复合制剂包含至少0.05M的碱金属盐酸盐。所述碱金属盐酸盐包括但不限于氯化钠(NaCl)或氯化钾(KCl)。通常，提供所述碱金属盐酸盐例如NaCl或KCl以保持所述透明质酸酶的稳定性和活性。本领域技术人员可凭经验确定盐的精确量。例如，可使用本领域技术人员已知的各种方法例如章节G中描述的方法，通过评价在不同盐条件下的聚集和活性来确定所述制剂中盐的量。通常，在本文提供的复合制剂中，所提供的氯化钠的量为0.05M-0.3M或约0.05M-0.3M，例如0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M或更多，或者约0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M或更多。盐的量通常为0.05M-0.25M，例如0.15M。
d.氨基酸稳定剂
本文提供的复合制剂包含氨基酸稳定剂，其有助于所述制剂的稳定性。所述稳定剂可为非极性氨基酸和碱性氨基酸。示例性的非极性氨基酸和碱性氨基酸包括但不限于丙氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸和脯氨酸。例如，所述氨基酸稳定剂是甘氨酸或脯氨酸，通常是甘氨酸。所述稳定剂可为一种氨基酸或者其可为两种或多种此类氨基酸的组合。所述氨基酸稳定剂可为中性氨基酸、氨基酸类似物、改性的氨基酸或氨基酸等同物。所述氨基酸一般为L-氨基酸。例如，当使用脯氨酸作为所述稳定剂时，其一般为L-脯氨酸。还可能使用氨基酸等同物，例如脯氨酸类似物。
通常向所述溶液中加入有效地将所述免疫球蛋白维持为单体形式的量的一种或多种氨基酸。包含于所述液体复合制剂中的氨基酸稳定剂例如甘氨酸的浓度为0.1M-1M氨基酸，通常为0.1M-0.75M，一般为0.2M-0.5M，例如至少为0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.6M、0.7M、0.75M或更多，或者约0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.6M、0.7M、0.75M或更多。所述氨基酸例如甘氨酸可以药学可接受的盐的形式使用，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、乙酸盐等。所述氨基酸例如甘氨酸的纯度应为至少98%、至少99%，或者至少99.5%或更高。
e.其他物质
任选地，所述复合制剂可包含与透明质酸酶或IG一起给药的载体，例如稀释剂、助剂、赋形剂或媒介物。适合的药学载体的实例记载于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。此类组合物会包含治疗有效量的一般为纯化形式或部分纯化形式的所述化合物，以及适合量的载体从而提供用于适当地给药于患者的形式。此类药学载体可为无菌的液体例如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。当静脉内给药所述药物组合物时，水是典型的载体。可还将盐溶液以及右旋糖和甘油水溶液用作液体载体，特别是用于注射液的液体载体。
例如，用于肠胃外制剂中的药学可接受的载体包括水性媒介物、非水媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、助悬剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂（sequestering agent）或螯合剂以及其他药学可接受的物质。水性媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗右旋糖注射液、无菌注射用水、右旋糖和乳酸盐林格注射液。非水性肠胃外媒介物包括植物来源的非挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油以及花生油。可将抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂加入到包装于多剂量容器中的肠胃外制剂中，所述抗微生物剂包括酚类或甲酚类、汞制剂、苄醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵以及苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。助悬剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯80（TWEEN 80）。金属离子的掩蔽剂或螯合剂包括EDTA。药物载体还包括用于水混溶性媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇以及用于调节pH的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
组合物除活性成分外还可包含：稀释剂例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或羧甲基纤维素；润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；以及粘合剂例如淀粉、天然树胶例如阿拉伯胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交联聚维酮以及本领域技术人员已知的其他此类粘合剂。
例如，可向所述复合制剂内加入赋形剂蛋白，其可为多种药学可接受的蛋白质或肽中的任何一种。通常，选择赋形剂蛋白是因为其给药于哺乳动物个体而不引起免疫应答的能力。例如，人血清白蛋白非常适合用于药物制剂中。其他已知的药物蛋白质赋形剂包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水以及乙醇。以足以防止蛋白质吸附至贮藏容器或小瓶的浓度将所述赋形剂包含于所述制剂中。所述赋形剂的浓度会根据所述赋形剂的性质和所述蛋白在所述复合制剂中的浓度而变化。
组合物还可视需要包含少量的润湿剂或乳化剂，或者pH缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯以及其他此类物质。
2.剂型
可将本文提供的复合制剂配制成单剂量形式或多剂量形式。例如，由于本文提供的复合制剂长期稳定，所以可将所述复合制剂提供为多剂量形式用于在间隔数天、数周、数月或数年的时间内给药。因此，可将所述液体复合制剂制备成单位剂量形式。调节药学活性化合物的浓度以使注射提供有效的量从而产生期望的药理学作用。例如，各单位剂量包含足以产生期望疗效的预定量的治疗活性化合物以及所需要的药物载体、媒介物或稀释剂。如本领域所知，精确的剂量取决于患者或动物的年龄、体重和病症。
单位剂量形式可以其部分或倍数的形式给药。多剂量形式是包装于一个容器内以分离的单位剂量形式给药的多个相同的单位剂量形式。因此，多剂量形式是在包装上不分离的多个单位剂量。
将单位剂量肠胃外制剂包装在安剖瓶、小瓶或具有针头的注射器内。包含药学活性化合物的液态溶液的体积随被治疗的疾病和选择进行包装的具体的制品而变化。如本领域已知并付诸实践的，用于肠胃外给药的所有制剂必须是无菌的。当以多剂量制剂提供时，所述制剂可包含抑菌剂。
3.给药
通常将本文提供的复合配制的组合物配制成用于例如通过皮下途径的肠胃外给药。由于与透明质酸酶复合配制的IG的生物利用度提高，可以制备和给药现有静脉内(IVIG)制剂的剂量和频率皮下给药免疫球蛋白。与现有的IG皮下制剂相比的优点在于复合配制的透明质酸酶/IG能够实现更有利的给药方案，例如更低的给药频率。通过较低的给药频率或较低的给药剂量可减少与毒性相关的副作用。一般而言，皮下IG治疗具有提高的药代动力学和/或药效学。另外，与现有的静脉内输注相比，IG的皮下给药也具有优点。例如，皮下输注允许由患者或家人进行输注而无需有经验的护士；能够以较高的速率进行输注使得在1-3小时内输注IG，相对而言，常规IVIG治疗需要5-10小时；不需要功能性静脉；不存在与输注相关的副作用，例如血栓症、头痛、血栓性静脉炎和恶心，而且不良事件的可能性更低；以及可在家庭或任何地方进行输注。
还需要进行皮下给药以确保给药透明质酸酶使得它们达到皮肤和组织的间质，由此降解间质空间以进行后续的免疫球蛋白递送。因此，考虑例如通过皮下给药方法在皮肤下直接给药。
给药可为局部的（local）、局部（topical）的或全身的，视治疗位点而定。可通过例如但不限于局部输注、例如在外科手术后与伤口敷料联合的局部施用、通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入剂的方式实现向需要治疗的区域局部给药。通常通过注射实现局部给药，例如从注射器或包含注射装置例如针头的其他制品进行注射。在另一实施方案中，可通过输注实现局部给药，可使用泵或其他相似的装置辅助输注。
还包括其他给药方式。可将药物组合物配制于适合各种给药途径的剂型中。任何特定情况下最适合的途径取决于多种因素，例如疾病的性质、疾病的进展、疾病的严重性以及所使用的具体的组合物。其他给药途径例如本领域技术人员已知的任何途径包括但不限于肌肉内、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射、硬膜外、鼻内、口腔、阴道、直肠、局部（topical）、局部（local）、眼内、吸入、含服（例如舌下）和经皮给药或任何途径。适合此类途径的制剂是本领域技术人员已知的。
还可将组合物与其他生物活性剂连续地、间歇地或在同一组合物中给药。给药还可包括控释系统，包括控释制剂和例如通过泵实现的由装置控制的释放。
本文还包括一般以注射或输注为特征的皮下给药。可将注射剂制备成常规形式，或为液态溶液剂或为混悬剂、适合在注射前在液体中形成溶液剂或混悬剂的固体形式，或者为乳剂。通常将本文提供的复合制剂制备成液体。注射剂被设计用于局部和全身给药。就本发明而言，需要局部给药以直接给药于患病的间质。用于肠胃外给药的制剂包括供注射的无菌溶液剂，无菌干燥的可溶性产品例如供在临用前与媒介物混合的冻干粉，包括皮下注射片、供注射的无菌混悬剂、供在临前与媒介物混合的无菌干燥不溶性产品以及无菌乳剂。所述溶液剂可为水性的或非水性的。如果是静脉内给药，适合的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及包含增稠剂和增溶剂例如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。
给药方法可用于减少所选化合物暴露于降解过程，例如蛋白质水解降解和通过抗原应答和免疫原应答的免疫干扰。此类方法的实例包括在治疗部位局部给药。已报道治疗剂的聚乙二醇化增加对蛋白质水解的抗性、延长血浆半衰期并降低抗原性和免疫原性。聚乙二醇化方法的实例是本领域已知的（参见例如，Lu和Felix,Int.J.Peptide Protein Res.,43:127-138,1994;Lu和Felix,Peptide Res.,6:142-6,1993;Felix等人,Int.J.Peptide Res.,46:253-64,1995;Benhar等人,J.Biol.Chem.,269:13398-404,1994;Brumeanu等人,J Immunol.,154:3088-95,1995;还可参见,Caliceti等人,(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10):1261-77和Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8Pt2):3S-8S）。聚乙二醇化还可用于体内核酸分子递送。例如，腺病毒的聚乙二醇化可提高稳定性和基因转移（参见例如Cheng等人,(2003)Pharm.Res.20(9):1444-51）。
当给药大体积时，通常通过输注给药。向个体给药的输注速率可为0.5ml/kg/BW/h-5ml/kg/BW/h或约0.5ml/kg/BW/h-5ml/kg/BW/h，例如0.5ml/kg/BW/h、1ml/kg/BW/h、2ml/kg/BW/h、3ml/kg/BW/h、4ml/kg/BW/h或5ml/kg/BW/h，或者约0.5ml/kg/BW/h、1ml/kg/BW/h、2ml/kg/BW/h、3ml/kg/BW/h、4ml/kg/BW/h或5ml/kg/BW/h。可凭经验确定输注速率，并且通常随个体的耐受性而变化。如果在输注过程中出现不良反应，可将输注速率减慢至刚好低于出现所述不良反应的速率。如果所述不良事件响应速率降低而消失，可根据医生的慎重判断缓慢地增加所述输注速率。可通过重力输注、泵输注或注射期望的剂量例如完整的20-30克剂量来辅助IG复合制剂的皮下输注。通常可使用静脉输注泵进行输注。可以5ml/h、10ml/h、30ml/h、60ml/h、120ml/h、240ml/h或300ml/h，或者约5ml/h、10ml/h、30ml/h、60ml/h、120ml/h、240ml/h或300ml/h的速率输注IG/透明质酸酶复合制剂。只要患者耐受所述输注，可在疗程中增加输注速率。输注的给药时间一般为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h或更长，或者约0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h或更长。由于通过皮下给药与透明质酸酶复合配制的IG所实现的高输注速率，所述输注时间显著短于常规的IVIG治疗。当输注时间超过了预计的极限，可在医生和患者的选择下开始在第二个输注位点进行输注。所述第二个位点通常与第一个位点相距至少10cm。
输注技术是本领域技术人员已知的并且在治疗医师的能力之内。一般可将IG/透明质酸酶复合制剂的适合剂量混合于标准的IV袋中。例如，可使用在靠近其末端处具有Y-形分叉的无通气管的输液器。可将24号皮下输液针插入个体选择的位点，但是考虑到输注溶液的体积，推荐的位点为腹部，其次为大腿。可将所述透明质酸酶和IG提供在同一个Y-形分叉装置内。本文中还可使用其他制品来通过重力或泵进行输注，并且包括但不限于输液管、输液瓶、注射器或其他容器。
在不能耐受输注的情况下（例如其引起中度至严重的局部反应），可开始在第二个输注位点进行输注以使个体接受完整的剂量。
另外，应理解，本文提供的稳定的复合制剂顺应涉及周期性给药频率的剂量方案。例如，所述剂量频率可为在一定的时段内例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天内每日给药，在连续数日内或隔日给药。在其他实施方案中，所述剂量方案为按周计的（weekly），例如每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次或更长的间隔。因此，IG/透明质酸酶制剂可一次性给药或者可分为多个更小的剂量以一定时间间隔给药。可在疗程内例如在数小时、数日、数周或数月内，以一次或多次剂量给药所选IG/透明质酸酶制剂。在一些情况下使用连续给药。应理解的是精确的剂量和给药时间取决于适应症和患者的耐受性。
而且，应理解，精确的剂量和疗程随被治疗的疾病变化，并且可使用已知的试验或通过从体内或体外试验数据外推来经验性地确定。应注意的是，浓度和剂量值还可随待缓解的病症的严重度变化。还应理解对于任何具体的个体，应根据个体的需要和管理或监督所述组合物的给药的人员的专业判断随时调整具体的剂量方案，并且本文中列出的浓度值域仅为示例性的并且不应认为对包含它们的组合物和组合的范围或用途具有限制性。可每小时一次、每日一次、每周一次、每月一次、每年一次或一次性给药所述组合物。通常选择剂量方案以限制毒性。应注意的是，临床医生会知道由于毒性或骨髓、肝或肾或其他组织的功能障碍，如何以及何时终止治疗、中断治疗或将其调节至较低的剂量。相反，当临床反应不足时（排除毒性副作用），所述临床医生还会知道如何以及何时将治疗调节至较高水平。
G.评价稳定性、活性、生物利用度和药动学的方法
可使用本领域技术人员已知的多种体外或体内测定法评价所述制剂中的IG和透明质酸酶的稳定性和活性。本领域已有多种用于测量蛋白质稳定性的分析技术并且综述于Peptide and Protein Drug Delivery，247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.DrugDelivery Rev.10:29-90(1993)。可在所选择的温度下在所选择的时间段内测定稳定性。
评价IG的分子大小（例如由聚集、变性和/或片段化引起）的测定是评价所述复合制剂的稳定性的重要考量。另外，还可通过测定所述制剂中的IG和透明质酸酶的生物活性的任何测定法评价所述液体制剂的稳定性。此类测定法是本领域公知的。除了评价所述复合制剂的稳定性，此类测定法还可用于例如为治疗确定免疫球蛋白和透明质酸酶的适合剂量和给药频率。另外，还可进行本领域技术人员已知的测定法以评价皮下给药的免疫球蛋白的包括生物利用度在内的药动学性质和耐受性。
1.分子大小
主要的稳定性指示参数是分子大小，并且分子大小的变化可由变性引起的降解、聚集或片段化引起。IG聚集是IG产品保存过程中的普遍问题。由于聚集体能够与患者血液中的补体结合并产生抗补体反应，所以引起问题。变性特别是通过与高分子量物质聚集导致IG结合补体的能力大大增加。这些聚集体的补体结合机制表现为与抗原-抗体复合物的结合机制相同。Marcus,D.M.,(1960)J.Immunol.84:273-284。对于IgG而言，已知补体结合位点需要两个分子靠近。因此可能需要所述分子的临界堆积而不是任何必要的构象变化。
本领域已有监测IG稳定性的方法，包括本文和本文公开的实施例中描述的那些方法。有多种方法可用于基于蛋白质的物理和化学结构以及它们的生物活性来评价包括抗体或免疫球蛋白制剂在内的蛋白质制剂的稳定性。例如，为了研究蛋白质的聚集、片段化和变性，可使用例如以下方法：电荷转移吸附、热分析、荧光光谱法、圆二色性、NMR、还原型毛细管凝胶电泳(rCGE)以及高效尺寸排阻色谱法(HPSEC)。参见例如Wang等人,1988,J.of Parenteral Science&Technology 42(supp):S4-S26。rCGE和HPSEC是评价由蛋白质聚集体的形成、蛋白质降解和蛋白质片段化引起的分子大小的最常用和最简便的方法。另外，可直接测定抗补体活性(ACA)。
例如，可通过HPSEC或rCGE评价所述液体制剂的稳定性，其中峰面积百分比表示未降解的蛋白质。在一个实施方案中，将蛋白质进样于TosoHBiosep TSK G3000SW 600x7.5mm柱。洗脱蛋白质。使用280nm处的UV吸收检测洗脱的蛋白。在所述测定中检测参比标准品作为对照，并且将结果报告为产品的单体峰相对于不包括内含容积峰的所有其他峰的面积百分比。将在所述单体峰之前洗脱的峰记录为聚集体百分比。
还可如欧洲药典（European Pharmacopeia,1997,2nd ed.Part II.Maisonneuve,S.A.,Saint Ruffine,France）所述测定ACA效价。ACA效价一般是静脉内(IV)给药的标准指标，并且与所述复合制剂的皮下给药无关。因此，就本发明而言，ACA效价一般不是被配制成用于皮下给药的复合制剂的决定性指标。
一般而言，所述ACA测定法测定被标准量的补体和蛋白质的混合物结合的补体的量（参见例如，Palmer,D.F.和Whaley，S.D.,Complement FixationTest,Manual of Clinical Laboratory Immunology(Ed.N.R.Rose,等人,American Society for Microbiology，Washington,D.C.,1986)pp.57-66.;Mayer,M.M.,Quantitative C'Fixation Analysis,Complement and ComplementFixation,in Experimental Immunochemistry(Ed.E.A.Kabat和M.M.Meyer，Thomas,Springfield,III.,1961),pp.214-216,227-228.）。简而言之，将通过与红细胞抗体预温育而被致敏的红细胞加入补体/蛋白混合物中。在游离补体（还未被所述蛋白质结合）的存在下，这些致敏的细胞将溶胞，释放出血红蛋白，可将其定量作为溶胞程度的量度。平行地，还将致敏的红细胞加入缓冲液对照-补体混合物中，将其溶胞程度定义为100%。得到100%溶胞所需的补体的实际量与在蛋白质的存在下保持未结合的补体的量的差异等于实际被所述蛋白质结合的补体的量，或者补体活性。一单位ACA活性（一CH50单位）是能够活化具有最佳效价的补体和红细胞/溶血素系统中的50%补体的蛋白质的量。一般而言，可接受的ACA效价为每mg蛋白质消耗低于50%CH50单位。
在另一实施方案中，可通过测量溶液中可溶性蛋白随时间的变化来容易地测定在液体复合制剂的保存过程中由于聚集体形成而引起的分子大小分布。可通过多种分析测定法定量溶液中可溶性多肽的量。此类测定法包括例如反相(RP)-HPLC和UV吸收光谱法。可使用例如分析型超速离心将以可溶性聚集体形式存在的可溶性多肽部分与以非聚集的生物活性分子形式存在的部分区分开来，从而实现对液体制剂保存过程中的可溶性和不溶性聚集体的测定。
在另一实施方案中，可通过将终产品加热至57℃的温度并将该温度维持数小时，同时检查所述产品的可见沉淀来评价复合制剂的稳定性（参见例如Code ofFederal Regulations 21,Food and Drugs,640.101a(1978年4月修订)）。在该方法的修改版中（参见例如Fernandes和Lundblad,Vox Sang39:101-112(1980)），将约2毫升的受试产品于57℃加热四小时，然后评价通过使用实验室分光光度计记录580nm处的透光度测定的乳光度的百分比改变（还可参见第4,597,966号美国专利）。
还可将SDS-PAGE用于评价聚集和/或片段化。可测量被染色的或用放射同位素标记的每一个条带的光密度或放射性并且可获得表示未降解蛋白的条带的光密度%或放射性%。
一般而言，经任何上述测定法例如HPSEC或rCGE测量，所述复合制剂表现出低水平至不可检出水平的聚集。例如，以蛋白质的重量计，所述聚集不高于5%、不高于4%、不高于3%、不高于2%、不高于1%，并且一般不高于0.5%聚集体，以及低至不可检出水平的片段化，即，表示完整抗体或其片段的峰占80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、98%或更高、或者99%或更高的总峰面积。例如，可接受的聚集通常包括≥90%的单体和寡聚体/二聚体；≤5%的聚集物以及≤5%的片段。
2.生物活性
a.免疫球蛋白
可在体外或体内评价免疫球蛋白作为治疗剂的能力。例如，可进行体外测定来评价免疫球蛋白中和病毒或细菌感染性的能力（Hiemstra等人,(1994)J Lab Clin Med 123:241-6）。可利用其他体外测定法评价免疫球蛋白的其他生物活性。例如，可通过本领域已知的任何方法包括但不限于ELISA、蛋白质印迹法、RNA印迹法以及评价标记表达的流式细胞计量术来测定免疫球蛋白与补体活化产物相互作用并调节补体活化产物、结合基因型抗体、结合巨噬细胞上的Fc受体以及抑制包括细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶在内的各种炎症介质的能力。例如，可使用流式细胞计量术评价免疫球蛋白对趋化因子受体在外周血单核细胞上的表达的作用（Trebst等人,(2006)Eur J Neurology 13(12):1359-63）。在另一实施方案中，可使用RNA印迹分析评价免疫球蛋白对金属蛋白酶在巨噬细胞中的表达的作用（Shapiro等人,(2002)Cancer 95:2032-2037）。
还可进行使用动物模型的体内研究来评价免疫球蛋白的治疗活性。可将免疫球蛋白给药于用一种或多种微生物感染的动物模型，并且例如通过测定微生物的数量或测定作为疾病标记的体重来评价对感染进展的作用。还可使用考虑对其进行免疫球蛋白治疗的疾病和病症的动物模型评价免疫球蛋白的疗效。此类动物模型是本领域已知的，并且包括但不限于用于X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、SCID、维-奥二氏综合征、川崎病、格林-巴利综合征、ITP、多肌炎、朗-爱二氏肌无力综合征、重症肌无力和默-沃二氏综合征的小动物模型（Czitrom等人,(1985)J Immunol 134:2276-2280,Ellmeier等人,(2000)J Exp Med.192:1611-1624,Ohno(2006)DrugDiscovery Today:Disease Models 3:83-89,Oyaizu等人,(1988)J Exp Med2017-2022,Hansen等人,(2002)Blood 100:2087-2093,Strongwater等人,(1984)Arthritis Rheum.27:433-42,Kim等人,(1998)Annals NY Acad Sci841:670-676,Christadoss等人,(2000)Clin.Immunol.94:75-87,Sommer等人,(2005)Lancet 365:1406-1411以及第7,309,810号美国专利）。
b.透明质酸酶
可使用本领域公知的方法评价透明质酸酶的活性。在一个实施方案中，使用微浊度测定法测量活性。该方法基于当透明质酸结合血清白蛋白时形成的不溶性沉淀。通过将透明质酸酶与透明质酸钠（透明质酸）温育设定的时间段（例如10分钟），然后通过加入酸化的血清白蛋白使未被降解的透明质酸钠沉淀，来测量所述活性。在进一步的显色时间后，在640nm处测量所得样品的浊度。由透明质酸酶对透明质酸钠底物的活性引起的浊度降低是透明质酸酶的酶活性的量度。在另一实施方案中，使用微量滴定测定法测量透明质酸酶活性，其中在与透明质酸酶温育后测量残留的生物素化的透明质酸（参见例如Frost和Stern(1997)Anal.Biochem.251:263-269,第20050260186号美国专利公布）。将透明质酸的葡糖醛酸上的游离羧基生物素化，并且使生物素化的透明质酸底物共价偶联到微量滴定板上。与透明质酸酶温育后，使用卵白素-过氧化物酶反应检测残留的生物素化的透明质酸底物，并和与已知活性的透明质酸酶标准品反应后所获得的进行比较。其他测量透明质酸酶活性的测定法也为本领域已知并且可用于本文的方法中（参见例如，Delpech等人,(1995)Anal.Biochem.229:35-41;Takahashi等人,(2003)Anal.Biochem.322:257-263）。
还可评价透明质酸酶作为分散剂或扩散剂的能力。例如，可在有或无透明质酸酶的条件下将台盼蓝染料皮下注射到裸鼠每一侧的侧面皮肤中。然后例如使用测微计(microcaliper)测量染料面积来测定透明质酸酶作为分散剂的能力（第20060104968号美国专利）。
3.药动学和耐受性
可使用动物模型进行药动学和耐受性研究或者可在临床试验过程中在患者中进行。动物模型包括但不限于小鼠、大鼠、兔、犬、豚鼠和非人灵长类模型，例如短尾猴或猕猴。在一些情况下，可使用健康动物进行药动学和耐受性研究。在其他实施方案中，使用考虑对其进行免疫球蛋白治疗的疾病的动物模型例如下文描述的任何疾病和病症的动物模型进行所述研究。
可通过在给药后测量如下参数来评价皮下给药的免疫球蛋白的药动学：最大（峰）血浆免疫球蛋白浓度(Cmax)、峰时（即，最大血浆免疫球蛋白浓度出现的时间；Tmax）、最小血浆免疫球蛋白浓度（即，免疫球蛋白给药之间的最低血浆浓度；Cmin）、消除半衰期(T1/2)以及曲线下面积（即，通过用时间对血浆免疫球蛋白浓度作图生成的曲线下的面积，AUC）。通过比较皮下递送后免疫球蛋白的曲线下面积(AUCsc)与静脉内递送后的免疫球蛋白的AUC(AUCiv)测定皮下给药的免疫球蛋白的绝对生物利用度。可使用公式：F=([AUC]sc×剂量sc)/([AUC]iv×剂量iv)计算绝对生物利用度(F)。可通过使用本领域已知的适合用于评价血液样品中的免疫球蛋白浓度的任何方法测定皮下给药后血浆中的免疫球蛋白的浓度。示例性的方法包括但不限于ELISA和散射比浊法。
可在所述药动学研究中施用一系列的剂量和不同的给药频率来评价增加或降低所述剂量中的免疫球蛋白和/或透明质酸酶的浓度的作用。还可在有或无透明质酸酶联合给药的条件下评价皮下给药的免疫球蛋白的药动学性质例如生物利用度。例如，可向犬例如比格犬皮下给药与透明质酸酶组合的或单独的免疫球蛋白。还向另一组比格犬给药静脉内剂量的免疫球蛋白。然后在不同的时间点采集血样并通过例如散射比浊法测定血浆中的免疫球蛋白的量。然后可测定AUC，并且可测定在有或无透明质酸酶的条件下给药的皮下给药的免疫球蛋白的生物利用度。可进行此类研究来评价与透明质酸酶联合给药对皮下给药的免疫球蛋白的药动学性质例如生物利用度的作用。
评价安全性和耐受性的研究是本领域已知的并且可用于本文中。在有或无透明质酸酶联合给药的条件下皮下给药免疫球蛋白后，可监测任何不良反应的形成。不良反应可包括但不限于注射部位反应例如水肿或肿胀、头痛、发热、疲劳、寒战、潮红、头晕、荨麻疹、喘鸣或胸部紧迫感、恶心、呕吐、僵直、背部疼痛、胸痛、肌肉痉挛、癫痫发作或惊厥、血压变化以及过敏反应或严重的过敏反应。在所述安全性和耐受性研究中，通常给药一系列的剂量和不同的给药频率来评价增加或降低所述剂量中的免疫球蛋白和/或透明质酸酶的浓度的作用。
H.治疗方法和治疗用途
本文描述的IG/透明质酸酶复合制剂可用于治疗使用免疫球蛋白的任何病症。可在包含透明质酸酶的复合制剂中皮下给药免疫球蛋白(IG)来治疗顺应免疫球蛋白治疗的任何病症。本章节提供IG/透明质酸酶复合制剂的示例性的治疗用途。应理解的是，本文提供的IG/透明质酸酶复合制剂可用于治疗下文描述的任何疾病和病症以及本领域技术人员已知的可通过IG治疗的其他疾病和病症的方法、过程或用途中。特别关注所述复合制剂的皮下给药。IG的给药剂量与静脉内给药剂量相同或相似并且是本领域技术人员已知的。剂量方案和频率可与本文其他部分描述的静脉内给药方案不同。下文描述的治疗用途是示例性的并且不应认为对本文所述方法的应用具有限制性。
例如，本文提供的复合制剂可用于治疗免疫缺陷例如原发性免疫缺陷，例如X连锁无丙种球蛋白血症、低丙种球蛋白血症，和获得性的免疫力受损的病症（继发性免疫缺陷），例如特征为低抗体水平的那些；炎性疾病和自身免疫疾病；以及急性感染。治疗用途包括但不限于用于各种免疫学、血液学、神经学、炎性、皮肤病学和/或感染性疾病和病症的免疫球蛋白替代治疗和免疫调节治疗。在一些实施方案中，例如在可能暴露于感染性疾病（例如意外的针刺伤）后给药免疫球蛋白以增强健康患者中的免疫应答。本文提供的IG复合制剂还可用于治疗多发性硬化（特别是复发-缓解型多发性硬化或RRMS）、阿尔茨海默病和帕金森病。鉴定此类疾病或病症在治疗医生的能力之内。
可将免疫球蛋白/透明质酸酶复合制剂与用于这些疾病和病症的治疗中的其他药剂组合给药。例如，可给药的其他药剂包括但不限于抗生素、化学治疗剂、甾体类抗炎药、非甾体类抗炎药以及其他免疫调节剂，例如细胞因子、趋化因子和生长因子。
必要时可凭经验确定或外推得到具体的剂量和疗程以及治疗方案。例如，可将静脉内给药的免疫球蛋白的示例性剂量用作起点来确定适当的剂量。可基于多种因素确定剂量水平，所述因素例如个体的体重、整体健康状况、年龄、所使用的具体化合物的活性、性别、饮食、给药时间、排泄速率、药物组合、所述疾病的严重度和病程以及患者对疾病的倾向和治疗医师的判断。免疫球蛋白和透明质酸酶的示例性的剂量提供于本文其他部分。应理解的是，给药剂量会随被治疗的适应症并且可能随需要耐受的副作用而变化。可使用每一种病症的被认可的模型凭经验确定剂量。
在患者的病症得到改善后，可视需要皮下给药与透明质酸酶组合的维持剂量的免疫球蛋白，并可改变其剂量、剂型或给药频率或它们的组合。在一些情况下，对于疾病症状的任何复发，个体可能需要长期的间歇治疗。
1.原发性和继发性免疫缺陷
a.原发性免疫缺陷
世界卫生组织已确认了超过80种原发性免疫缺陷病并且每10,000人中约有1人患有此类疾病。这些疾病的特征为免疫系统的固有缺陷，其中在一些情况下人体不能产生任何或足够的对抗感染的抗体。在其他情况下，对抗感染的细胞防御不能正常发挥功能。免疫球蛋白可用于治疗伴有抗体缺陷的原发性免疫缺陷。因此，可将免疫球蛋白作为免疫球蛋白替代治疗给药于表现出此类疾病的患者。
原发性免疫缺陷通常为遗传性病症。示例性的原发性免疫缺陷包括但不限于普通变异型免疫缺陷病(CVID)、选择性IgA缺陷、IgG亚类缺陷、X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、重症联合免疫缺陷(SCID)、补体病、共济失调性毛细血管扩张症、高IgM以及维-奥二氏综合征。可以与用于免疫球蛋白的静脉内给药使用的剂量相似的剂量向患有伴有抗体缺陷的原发性免疫缺陷病的患者给药免疫球蛋白/透明质酸酶。示例性的剂量包括例如在四周的时间段内给药100mg/kg BW-800mg/kg BW免疫球蛋白。可根据临床反应增加或减少该剂量，也可增加或降低所述剂量的频率。
b.继发性免疫缺陷
继发性或获得性免疫缺陷不是由遗传性基因异常引起的，而是出现在免疫系统由于免疫系统之外的因素而受损的个体中。实例包括但不限于外伤、病毒、化疗、毒素和污染。获得性免疫缺陷综合症(AIDS)是由病毒即人免疫缺陷病毒(HIV)引起的继发性免疫缺陷病的实例，其中T细胞缺失导致人体不能对抗感染。
另一实例低丙种球蛋白血症是由缺少B-淋巴细胞引起的，其特征为血液中的抗体水平低，并且由于白血病相关的免疫功能障碍和治疗相关的免疫抑制可出现在患有慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)以及其他相关恶性肿瘤的患者中。患有继发于此类血液恶性肿瘤的获得性低丙种球蛋白血症的患者和接受造血干细胞移植后的那些患者易患细菌感染。体液免疫缺陷是这些患者中感染相关的发病率和死亡率（特别是由包膜微生物引起的）的风险增加的主要原因。例如，肺炎葡萄球菌、流感嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌以及军团杆菌属和诺卡氏菌属是在CLL患者中引起肺炎的常见细菌病原体。已观察到由例如卡氏肺囊虫、真菌、病毒和分枝杆菌引起的机会性感染。可通过给药免疫球蛋白显著降低这些患者中的感染的数量和严重度（Griffiths等人,(1989)Blood73:366-368;Chapel等人,(1994)Lancet 343:1059-1063）。
因此，可将免疫球蛋白/透明质酸酶复合制剂皮下给药于此类患者以预防复发性感染。示例性的剂量包括用于向患有继发于血液恶性肿瘤的获得性低丙种球蛋白血症的患者静脉内给药免疫球蛋白的那些剂量。例如，可每3-4周皮下给药包含约400mg/kg BW免疫球蛋白的复合制剂。在另一实施方案中，在患者的血清IgG低于4g/L的情况下，可在治疗的第一个月额外给药400mg/kg BW的剂量。可适当地增加或减少免疫球蛋白的给药量以及所述剂量的频率。
2.炎性疾病和自身免疫疾病
a.川崎病
川崎病是儿童和婴幼儿中的急性、发热的多系统疾病，常常累及冠状动脉。它还被称作淋巴结综合征、粘膜皮肤淋巴结病、婴儿型多动脉炎和川崎综合征。川崎病是不为人所了解的自限性血管炎，其累及多种器官，包括皮肤、粘膜、淋巴结、血管壁以及心脏。在恢复阶段中，从疾病的第二周可能出现管状动脉瘤。尽管该病症的原因未知，有证据表明特征性的血管炎是由具有以下特征的免疫反应引起的：T细胞和巨噬细胞被未知抗原活化、分泌细胞因子、多克隆B-细胞过度活跃以及形成抗内皮细胞和平滑肌细胞的自身抗体。在具有遗传易感性的个体中，一种或多种未被表征的可能具有超抗原活性的常见感染性物质可诱发该疾病。
在川崎病的早期给药的免疫球蛋白可防止冠状动脉病。向患有与川崎病相关的未愈的炎症的患者皮下给药免疫球蛋白/透明质酸酶复合制剂能够改善症状。示例性的剂量包括用于向患有川崎病的患者静脉内给药免疫球蛋白的那些剂量。例如，可向川崎病症者给药约1-2g/kg患者体重的免疫球蛋白。这可在连续四天内以四个400mg/kg BW剂量给药。在另一实施方案中，在10小时内以单次剂量给药1g/kg BW免疫球蛋白。可适当地增加或减少免疫球蛋白的给药量。
b.慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病
慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)是特征为腿和手臂的进行性虚弱和感觉功能受损的神经性病症。该病症有时被称作慢性复发性多发性神经病，其是由外周神经的髓鞘损伤引起的。尽管其可出现在任何年龄和所有性别的人群中，但是CIDP更常见于青少年中，并且在男性中比在女性中更常见。其通常表现出包括以下的症状：麻刺感或麻木（从脚趾和指头开始）、手臂和腿无力、深腱反射消失（反射消失）、疲劳和感觉异常。CIDP与格林-巴利综合征紧密相关并且被视作该急性疾病的慢性表现形式。该疾病无特异的诊断试验，但是特征性临床和实验室发现有助于将该病症与其他免疫介导的神经病性综合征区分开来。
研究表明用免疫球蛋白进行治疗减少症状（van Schaik等人,(2002)Lancet Neurol.1:497-498）。因此，可使用本文描述的方法向表现出CIPD的患者皮下给药免疫球蛋白/透明质酸酶复合制剂。示例性的剂量包括用于向CIPD患者静脉内给药免疫球蛋白的那些剂量。在一个实施方案中，向CIPD患者皮下给药与透明质酸酶组合的约2g/kg BW免疫球蛋白。这可在连续五天内以五个400mg/kg BW剂量给药。可适当地增加或减少免疫球蛋白的给药量。
c.格林-巴利综合征
格林-巴利综合征是涉及外周神经的炎性脱髓鞘的神经系统自身免疫病。主要症状包括腿部各种程度的无力或刺痛感，其可扩散至手臂和上半身。这些症状的强度会增加直到肌肉功能完全丧失并且患者几乎完全瘫痪，导致危及生命的病症。尽管大多数患者一般可较好地或者完全地康复，但是已在约20%的全部患者中报道了持续的残疾并且在4-15%的患者中报道了死亡。格林-巴利综合征可在呼吸系统或胃肠道病毒感染的症状后数天或数周出现。在一些情况下，手术或免疫接种可诱发该综合征。该病症可在数小时或数天内形成并且延续3-4周。神经传导速度(NCV)试验能够为医生提供辅助诊断的线索。在一些情况下，可在诊断中使用腰椎穿刺，因为格林-巴利综合征患者的脑脊液中通常包含比健康个体更多的蛋白质。
尽管对于格林巴利综合征无已知的治愈方法，但是用免疫球蛋白进行治疗可减轻该疾病的严重度并加速康复。可以适合的IG剂量例如与向格林巴利综合征患者静脉内给药免疫球蛋白所使用的剂量相似的剂量向患者皮下给药免疫球蛋白/透明质酸酶复合制剂。例如，可向格林巴利综合征患者皮下给药与透明质酸酶组合的约2g/kg BW免疫球蛋白。这可在例如连续五天内以五个400mg/kg BW剂量给药。根据例如本领域技术人员能够容易地评价的疾病严重度和对治疗的临床反应，可增加或减少免疫球蛋白的给药量。
d.特发性血小板减少性紫癜
特发性血小板减少性紫癜(ITP)也称作原发性免疫性血小板减少性紫癜和自身免疫性血小板减少性紫癜，其为由抗血小板抗体引起的血小板存活时间缩短而导致的血小板计数降低（血小板减少症）。当血小板计数非常低时（例如<30×109/L），会出现皮肤出血（紫癜）和粘膜出血。ITP患者骨髓产生的血小板在形态学上是正常的。在一些情况下，存在与结合至血小板表面的糖蛋白的抗体相关的另外的血小板功能受损。ITP可表现为慢性和急性形式。约80%的ITP成年患者患有该疾病的慢性形式。虽然一些报道表明发病率随年龄增加，但是慢性ITP的在15-50岁的女性中发病率最高。ITP在HIV患者中较为常见。虽然ITP可见于感染的任何阶段，但是其流行率随HIV疾病的进展而增加。
研究已表明免疫球蛋白可用于治疗ITP患者（Godeau等人,(1993)Blood 82(5):1415-21;Godeau等人,(1999)Br.J.Haematol.107(4):7169）。可以与用于静脉内给药免疫球蛋白治疗ITP患者的剂量相似的IG剂量向患者皮下给药免疫球蛋白/透明质酸酶复合制剂。例如，可向ITP患者皮下给药与透明质酸酶组合的约1-2g/kg BW免疫球蛋白。这可在数天内给药，或者可以一次剂量给药。在一些实施方案中，连续数天给药五个剂量的400mg/kg BW免疫球蛋白。在另一实施方案中，在1天-连续2天内给药1g/kgBW，视血小板计数和临床反应而定。根据例如可由本领域技术人员容易地评价的血小板计数和对治疗的临床反应，可增加或减少免疫球蛋白的给药量和剂量的频率。
e.炎性肌病
炎性肌病是涉及骨骼肌组织发炎和退化的一类肌病。这些获得性病症均表现出明显的肌无力和肌肉内存在炎性反应。
i.皮肌炎
皮肌炎(DM)由于其特有的皮疹是炎性肌病中最容易识别的，所述皮疹以斑驳的、暗色的、红色的或淡紫色的皮疹出现在眼睑、面颊和鼻梁以及背部或上胸部、肘部、膝盖和指关节。在一些患者中，在皮下形成钙化性结节或硬肿块。皮疹常常出现在肌无力之前，肌无力通常在数周内形成，但是可能在数月或者甚至数天内形成。皮肌炎可出现在从儿童到成年人的任何年龄的人群中并且在女性中比在男性中更常见。约三分之一的DM患者报告吞咽困难。超过50%的患有DMA的儿童主诉肌肉疼痛和压痛，而这一情况一般出现在少于25%的成年DM患者中。
ii.多肌炎
多肌炎(PM)不具有皮肌炎特有的皮疹并且肌无力的进展常常慢于DM。许多PM患者具有吞咽困难。在一些情况下，由于肌肉功能丧失（muscle failure），患者还具有呼吸困难。多达三分之一的PM患者具有肌肉痛。该疾病的女性患者多于男性，并且20岁以下的人群很少患有该疾病，然而已报道了儿童和婴儿多肌炎的病例。
iii.包涵体肌炎
包涵体肌炎(IBM)与多肌炎非常相似。IBM中肌无力的发作通常非常缓慢，在数月或数年内出现。其与PM的差异在于近端和远端肌肉均会受累，而在PM中通常只有近端肌肉受累。典型的发现包括腰屈肌和指屈肌无力。前臂肌肉和四头肌萎缩是该疾病特有的，在其他肌肉中具有不同程度的无力。约一半的患有IBM的患者具有吞咽困难。IBM的症状通常在50岁以后开始出现，然而不排除任何年龄的人群。IBM在男性中比在女性中更常见。约十分之一的IBM是遗传性的。
研究表明给药免疫球蛋白可有益于患有这些炎性肌病的患者。免疫球蛋白能够提高肌肉强度，减少炎症并降低疾病进展和严重度（Dalakas等人,(1993)N.Engl.J.Med.329(27):1993–2000;Dalakas等人,(2001)Neurology56(3):323–7;Dalakas(2004)Pharmacol.Ther.102(3):177–93;Walter等人,(2000)J.Neurol.247(1):22–8）。可以与用于静脉内给药免疫球蛋白的剂量相似的IG剂量向患有DM、OM或IBM的患者皮下给药免疫球蛋白/透明质酸酶复合制剂。例如，通常可在数天内给药2g/kg BW免疫球蛋白，例如在连续数天内给药五个剂量的400mg/kg BW。
f.朗-爱二氏肌无力综合征
朗-爱二氏肌无力综合征(LEMS)是罕见的神经肌肉传递的自身免疫病，其在与肺癌相关的情况下首次在临床上得到确认，并接着在未检测到肿瘤的病例中得到确认。LEMS患者具有突触前神经肌肉接点缺失。这一疾病的临床特征为近端肌肉无力，运动后可增强肌肉力量，轻度的眼球运动体征、深腱反射受抑制以及自主神经功能障碍（口干、便秘、勃起障碍）。
向LEMS患者皮下给药免疫球蛋白/透明质酸酶复合制剂可改善症状。所述复合制剂中的示例性的IG剂量包括用于向LEMS患者静脉内给药免疫球蛋白的那些剂量。例如，可在数次给药中向LEMS患者给药2g/kg BW免疫球蛋白。例如，可在连续五天内给药五个剂量的400mg/kg BW免疫球蛋白。可适当地增加或减少免疫球蛋白的给药量。
g.多灶性运动神经病
伴有传导阻滞的多灶性运动神经病(MMN)是获得性免疫介导的脱髓鞘性神经病，其伴有进展缓慢的无力、肌束震颤和痉挛，无明显的感觉神经受累（sensory involvement）。疾病在得到诊断前可持续数月至超过15年。MMN的明确病因未知。组织病理学和电诊断研究表明存在脱髓鞘损伤和轴突损伤。主要受累的是运动神经，然而还证明了感觉神经中存在轻度的脱髓鞘。免疫调节和免疫抑制治疗的功效进一步证明了MMN的免疫性质。超过一半的MMN患者的抗-GM1抗体效价升高。尽管未知抗-GM1抗体在该疾病中的作用，但是可将它们的存在用作MMN的诊断标记。
向MMN患者皮下给药免疫球蛋白/透明质酸酶可改善症状。所述复合制剂中的示例性的IG剂量包括用于向MMN患者静脉内给药免疫球蛋白的那些。例如，可在数次给药中向MMN患者给药2g/kg BW免疫球蛋白。例如，可在连续五天内给药五个剂量的400mg/kg BW免疫球蛋白。在另一实施方案中，可在连续两天内给药1g/kg BW。可向一些患者给予维持治疗，其可包括例如每2-6周给药400mg/kg BW-2g/kg BW的剂量。可根据患者的反应适当地增加或减少免疫球蛋白的给药量。
h.重症肌无力
重症肌无力(MG)是慢性自身免疫性神经肌肉病，其特征为身体骨骼肌的不同程度的无力。其与神经肌肉接点存在抗乙酰胆碱受体(AChR)或肌肉特异性酪氨酸激酶(MuSK)的抗体相关，然而一些患者为抗体阴性。MG的临床特征包括随意肌特别是提上睑肌、眼外肌、球茎肌、肢体肌肉和呼吸肌的震颤性无力和易疲劳。患者通常表现出一只或双眼的眼皮下垂（上睑下垂）、复视（复视）、咽下困难（吞咽困难）以及近端肌肉无力。在严重的病例中或者在急性、严重的恶化中（肌无力危象），呼吸肌无力可导致呼吸衰竭。重症肌无力出现在所有种族的人群和所有性别中。它最常发生在40岁以下的成年女性中和60岁以上的老年男性中，但是其可发生于所有年龄。在一些情况下，行胸腺切除术来减少症状。
可将免疫球蛋白用作例如患有中度-严重MG的患者的维持治疗，特别是当其他治疗无效或引起严重的副作用时，并且还可在胸腺切除术之前或在该疾病的急性恶化（肌无力危象）的过程中给药。可使用本文所述的方法向MG患者皮下给药免疫球蛋白/透明质酸酶复合制剂。所述复合制剂中的示例性的IG剂量包括用于向MG患者静脉内给药免疫球蛋白的那些剂量。例如，可向MG患者每4-6周给药400mg/kg BW-2g/kg BW的剂量用于维持治疗。在胸腺切除术之前或在肌无力危象的过程中，可在数次给药中给药1-2g/kg BW，例如连续五天给药五个剂量的400mg/kg BW。在另一实施方案中，可连续2天给药1g/kg BW。
i.默-沃二氏综合征
默-沃二氏综合征也称作僵人综合征（stiff person syndrome）(SPS)或僵人综合征（stiff man syndrome），其为罕见的具有自身免疫病特征的神经病。患者表现出与肌强直和层叠样阵发性痉挛相关的症状。肌强直扩散至累及轴向肌肉主要是腹部肌肉和胸腰肌肉以及近端肢体肌肉。通常，躯干主动肌和拮抗肌的协同收缩导致脊柱前凸过度的板样姿势。导致呼吸困难的呼吸肌累及和导致面具脸的面部肌肉累及较为少见。
免疫球蛋白治疗可在默-沃二氏综合征患者中实现的强直减少和敏感性评分提高（Dalakas等人,(2001)N.Engl.J.Med.345(26):1870–6）。可使用本文所述的方法向默-沃二氏综合征患者皮下给药免疫球蛋白/透明质酸酶复合制剂。所述复合制剂中的示例性的IG剂量包括用于向默-沃二氏综合征患者静脉内给药免疫球蛋白的那些。例如，可连续五天以400mg/kgBW的剂量给药免疫球蛋白。可向一些患者给予维持治疗，其可包括例如每4-6周1-2g/kg免疫球蛋白。可适当地增加或减少免疫球蛋白的给药量。
3.急性感染
还证明了免疫球蛋白具有对抗多种细菌感染、病毒感染和真菌感染的抗微生物活性，包括但不限于由以下引起的感染：B型流感嗜血杆菌；A型和B型铜绿假单胞菌；金黄色葡萄球菌；B型链球菌；1型、3型、4型、6型、7型、8型、9型、12型、14型、18型、19型和23型肺炎链球菌；2型和5型腺病毒；巨细胞病毒；非洲淋巴细胞瘤病毒VCA；甲型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；单纯疱疹病毒-1；单纯疱疹病毒-2；A型流感；麻疹；1、2和3型副流感病毒；脊髓灰质炎病毒；水痘带状疱疹病毒、曲霉菌属以及白色念珠菌。因此可向患有细菌感染、病毒感染和真菌感染的患者皮下给药免疫球蛋白/透明质酸酶复合制剂以增强患者的免疫系统并治疗所述疾病。在一些实施方案中还给药抗生素或其他的抗微生物剂。
4.其他疾病和病症
IG治疗可治疗的并且未在上文中描述的其他疾病和病症的示例包括但不限于医源性免疫缺陷、特异性抗体缺陷、急性播散性脑脊髓炎、ANCA-阳性系统性坏死性血管炎、自身免疫性溶血性贫血、大疱性类天疱疮、疤痕性类天疱疮、伊文思综合征（包括伴有免疫性血小板减少症的自身免疫性溶血性贫血）、胎-母/新生儿同种免疫性血小板减少症(FMAIT/NAIT)、噬血细胞综合征、高风险同种异体造血干细胞移植、IgM副蛋白血症神经病、肾移植、多发性硬化症、视性眼阵挛-肌阵挛共济失调、落叶性天疱疮、寻常型天疱疮、输血后紫癜、中毒性表皮坏死松解症/史-约综合征(TEN/SJS)、中毒性休克综合征、系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤、败血症、骨髓移植、B细胞瘤以及阿尔茨海默病。
例如可使用静脉内免疫球蛋白治疗阿尔茨海默病（参见例如Dodel等人,(2004)J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 75:1472-4;Solomon等人,(2007)Curr.Opin.Mol.Ther.9:79-85;Relkin等人,(2008)Neurobiol Aging）。IG包括与β-淀粉状蛋白(AB)结合的抗体，所述β-淀粉状蛋白是阿尔茨海默病症者脑内斑块的主要成分。因此，IG可有助于促进从脑中清除AB并阻断AB对脑细胞的毒性作用。因此，可使用本文描述的方法向阿尔茨海默病症者皮下给药免疫球蛋白/透明质酸酶复合制剂。待治疗的个体包括患有轻度、中度或晚期阿尔茨海默病的患者。鉴别进行治疗的患者在治疗医生的能力之内。可每周一次、每两周一次或每月一次给药免疫球蛋白/透明质酸酶复合制剂。治疗可持续数月或数年。可每周一次或每两周一次以200mg/kgBW-2g/kg BW（包括端值）的IG剂量给药所述复合制剂，并且一般为至少200mg/kg BW-2g/kg BW，至少每月一次。与治疗前的水平相比，免疫球蛋白治疗可提高患者的抗-β-淀粉状蛋白的抗体水平。
I.制品和药盒
可将免疫球蛋白和透明质酸酶复合制剂的药物组合物包装为包括包装材料、有效治疗IG可治疗的疾病或病症的药物组合物以及标明所述组合物是要用于治疗IG可治疗的疾病和病症的标签的制品。示例性的制品为容器，包括单室和两室的容器。所述容器包括但不限于管、瓶和注射器。所述容器还可进一步包含用于皮下给药的注射针。
本文提供的制品包括包装材料。用于包装药品的包装材料是本领域技术人员公知的。参见例如第5,323,907、5,033,252和5,052,558号美国专利，均以其整体加入本文。药品包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶子、管、吸入器、泵、袋子、小瓶、容器、注射器、瓶以及适合所选择的制剂和预期的给药方式和治疗的任何包装材料。预期将多种本发明提供的化合物和组合物的多种制剂作为用于任何IG可治疗的疾病或病症的各种治疗。
还可将免疫球蛋白和可溶性透明质酸酶复合制剂的组合物提供为药盒。药盒可包含本文描述的药物组合物和用于给药的物品。例如可将组合物与用于给药的装置例如注射器、吸入器、量杯、滴管或涂敷器一起包装。所述药盒可任选地包含使用说明书，其包含剂量、给药方案和给药方式的说明。药盒还可包含本文描述的药物组合物和用于诊断的物品。例如，此类药盒可包含用于测定IG的浓度、量或活性的物品。
J.实施例
提供以下实施例仅用于举例说明并且不应认为对本发明的范围具有限制性。
实施例1
制备Gammagard Liquid(10％免疫球蛋白(IG)制剂)
Gammagard Liquid(10％IG)是从大量的合并人血浆制备而来，在整个制备过程中筛查是否存在感染性物质。使用改良的Cohn-Oncley冷乙醇分级分离法(Cohn等人，(1946)J.Am.Chem.Soc.68：459-467)以及阳离子和阴离子交换色谱法(Teschner等人，(2007)Vox Sang。92：42-55)从合并的血浆中纯化免疫球蛋白。进一步对纯化的蛋白质进行三个独立的病毒灭活/清除步骤：溶剂/去污剂(S/D)处理(Horowitz等人，(1994)Blood Coagul.Fibrin.5(3)：S21-S28；Kreil等人，(2003)Transfusion 43：1023-1038)、35nm纳米过滤(Hamamoto等人，(1989)Vox Sang.56：230-236；Yuasa等人，(1991)J.Gen.Virol.72：2021-2024)以及在升高的温度进行的低pH温育(Kempf等人，(1991)Transfusion 31：423-427；Louie等人，(1994)Biologicals 22：13-19)。所述S/D操作包括于18-25℃用磷酸三正丁酯、辛苯昔醇-9和聚山梨酯-80的有机混合物处理最少60分钟(
Figure BDA00001645193200851
等人，(2008)Vox Sang.94：184-192)。
所述研究中使用的最终制剂是在pH 4.6-5.1(在浓缩液中测量)下配制于0.25mM甘氨酸中的高度纯化并浓缩的免疫球蛋白G(IG)抗体的10％液体制剂。甘氨酸充当稳定剂和缓冲剂，并且未添加糖、钠或防腐剂。所有批次的10％IG(例如批号LE12H020、LE12H062、LE12H173、LE12F047)基本上相似。渗透压为240-300mosmol/kg，其与生理渗透压相似。根据上述方法制备的产品的IG亚类的分布与正常血浆的IG亚类分布相似：至少98％的蛋白质制剂为IgG，平均IgA浓度为37μg/mL(这些批次的IgA浓度均不大于140μg/mL)并且仅存在微量的IgM。Fc和Fab的功能得以维持。未检测到前激肽释放酶活化剂活性。
实施例2
制备SUBQ NG 20％(20％IG)
A.制备浓缩的、纯化的IG组合物
a.概要
将预先冷冻的来自血液供者的合并血浆分离成去冷沉淀血浆样品用于分离各种凝血因子粗品和抑制剂，之后使用Teschner等人,(2007)Vox Sang.92:42-55描述的改良的Cohn分级沉淀操作进行后续的冷乙醇分级分离。醇分级分离操作得到主要的中间IG部分，称作沉淀G，进一步使用色谱纯化将其加工成终产品。下游制备涉及阳离子交换(快流速CM-Sepharose)和阴离子交换色谱法(快流速ANX-Sepharose)。为了提供与潜在的病毒传染相关的宽安全范围，在所述制备方法中整合了相互之间的作用机制具有互补性的三个专门的病毒灭活/清除步骤，即：溶剂/去污剂处理（磷酸三正丁酯、辛苯昔醇-9和聚山梨酯-80的混合物）、纳米过滤(Asahi Planova 35nm)和在升高的温度下在低pH(4.7)下保存3周。
b.分离冷沉淀
在不高于6℃的温度下使已进行了安全性检查和质量评定的预先冷冻的来自血液供者的合并血浆融化。在冷冻离心机中离心以分离固体和血浆融化后形成的液体。然后将液体部分（还称作“去冷沉淀血浆”，通过离心从新鲜的融化血浆除去冷-不溶性蛋白后）冷却至0±1℃，并将其pH调节至7。在后续的冷乙醇分级分离之前将去冷沉淀血浆用于分离各种凝血因子粗品和抑制剂。在SUBQ NG 20%纯化之前选择了七个通路用于从去冷沉淀血浆成批吸附凝血因子粗品和抑制剂，并且在表3中称作通路1-7。
表3.用于从去冷沉淀血浆成批吸附凝血因子和抑制剂的通路
Figure BDA00001645193200861
Figure BDA00001645193200871
对于临床前SUBQ NG 20%的生产，选择来自通路1（无吸附步骤的US源血浆）、3（FEIBA、AT-III吸附后的US源血浆）和6（F-IX、F-VII、AT-III吸附后的US源血浆）的Cohn原料以覆盖醇分级分离前的各种不同的吸附步骤。各种吸附方法记载于Teschner等人,(2007)Vox Sang.92:42-55;Polsler等人,(2008)Vox Sang.94:184-192;第6,395,880和5,409,990号美国专利;以及Prothrombin complex:Brummelhuis in Methods of Plasma ProteinFractionation(J.M.Curling Editor,Academic Press,1980)。
c.分级分离
i.获得分级分离I的上清
在搅拌血浆的同时加入预冷的乙醇以达到8%v/v乙醇的目标浓度，并且进一步将温度降低至-2-0℃使沉淀。离心后收集上清（或分级分离I）。
ii.分级分离II和III的沉淀
将分级分离I调节至pH 7和20-25%v/v乙醇浓度，同时进一步降低温度。接着进行离心将液体（分级分离II+III上清）和固体分离。
iii.从分级分离II和III的沉淀萃取
以1:15的沉淀:萃取缓冲液比例用冷萃取缓冲液（5mM磷酸二氢钠、5mM乙酸、pH 4.5±0.2、电导率0.7-0.9mS/cm）将分级分离II+III重悬。于2-8℃进行萃取过程。
iv.热解法二氧化硅处理和过滤
向悬浮液中加入热解法二氧化硅（例如Aerosil 380或等同物）至约40g/kg悬浮液的浓度（或等于1.8g/L去冷沉淀血浆），并于2-8℃混合50-70分钟。通过使用助滤剂(Hyflo Super-Cel,World Minerals Inc.,0.5kg/kg悬浮液)于2-8℃过滤，将液体和固体分离，然后用萃取缓冲液对压滤机进行后洗涤。
v.分级分离沉淀G
将滤液与聚山梨酯80混合达到约0.2%w/v的浓度，于2-8℃搅拌至少30分钟。然后以8g/L向该溶液中混合入无水柠檬酸钠，于2-8℃另搅拌30分钟。然后用1M氢氧化钠或1M乙酸将pH调节至7.0±0.1。然后向该溶液中加入冷乙醇至约25%v/v的浓度，并进行与Cohn II相似的沉淀步骤(Cohn等人,(1946)J.Am.Chem.Soc.68:459-467)。
vi.悬浮沉淀G和溶剂/去污剂处理
将沉淀溶解并且用标称孔径为0.2μm的深层滤器（例如Cuno VR06滤器或等同滤器）过滤以获得澄清的滤液，将其用于溶剂/去污剂(S/D)处理。
病毒灭活的第一步是重悬沉淀G的S/D处理。S/D处理混合物包含1.0%(v/v)Triton X-100、0.3%(v/v)Tween-80和0.3%(v/v)磷酸三正丁酯，并且将该混合物于18-25℃维持至少60分钟。
d.阳离子交换色谱法
然后使包含S/D的蛋白质溶液通过阳离子交换柱（快流速Carboxymethyl(CM)-Sepharose）以除去溶剂和去污剂。用S/D试剂洗涤后，接着用高pH洗脱缓冲液(pH 8.5±0.1)洗脱吸附的蛋白。
e.阴离子交换色谱法
然后将洗出液调节至pH 6并且稀释至适合的电导率，然后使该溶液通过经平衡的阴离子交换柱(快流速ANX-Sepharose)。收集上样和洗涤过程中的流出液用于进一步加工。
f.纳米过滤
在三个病毒灭活步骤的第二步中，对最后一步的柱流出液进行纳米过滤(Asahi Planova 35nm滤器)以得到纳米过滤液。
g.超滤和渗滤
将纳米过滤液的甘氨酸浓度调节至0.25M并通过超滤将所述纳米过滤液进一步浓缩至5±1%w/v的蛋白质浓度并将pH调节至5.2±0.2。为了达到用于皮下给药的较高蛋白质浓度，在为高粘度产品专门设计的具有开放通道筛网和标称截留分子量为50kDa或更低的超滤膜(Millipore PelliconBiomax)的盒式超滤器内进行超滤。
用pH为4.2±0.2的0.25M甘氨酸溶液将浓缩物渗滤。最小交换体积为10x初始浓缩物体积。在整个超滤/透析操作中将溶液维持于4-20℃。渗滤后，将溶液浓缩至最低22%w/v的蛋白质浓度并调节至2-8℃。
为了回收系统中全部的残留蛋白由此提高蛋白质浓度，在再循环模式下用至少2x死体积对第一个较大型的超滤系统进行后洗涤以确保将所有的蛋白质洗出。然后用安装了尺寸为第一个膜的十分之一或更小的相同类型的膜的第二个超滤/渗滤系统将第一个超滤系统的后洗涤洗出液浓缩到至少22%w/v的蛋白质浓度。将后洗涤洗出液浓缩物加入总溶液中。然后对第二个超滤系统进行后洗涤并将溶液温度调节至2-8℃。
h.制剂
为了进行制剂，用第二个较小型的超滤系统的后洗涤洗出液和/或用渗滤缓冲液将溶液的蛋白质浓度调节至20.4±0.4%w/v。视需要将pH调节至4.4-4.9。
i.进一步灭菌
通过以下方式将已配制的总溶液进一步灭菌：首先通过绝对孔径为0.2微米或更小的膜滤器过滤，然后在无菌条件下分装至终容器内并进行适当的密封，取样用于试验。通过将密封的容器于30-32℃保存21-22天进行最后的病毒灭活/清除步骤。
因此，所得20%IG制剂是在pH 4.4-4.9下配制于0.25mM甘氨酸中的高度纯化的、等渗的免疫球蛋白制剂。用于所述研究中的最终制剂为批次SC00107NG、SC00207NG和SC00307NG。
B.临床前批次的表征
以200L的规模制备临床前批次SC00107NG、SC00207NG和SC00307NG并根据表4进行表征。在最终的体积水平（bulk level）下，通过远低于总IgG的0.1%的主要杂质的低水平来表示制剂的纯度。所述方法最后阶段的20%IG产品的分子大小分布(MSD)与10%IG（GammagardLiquid）终容器的MSD相似。这表明将浓度增加至20%蛋白质对IgG分子的完整性无负面影响。
表4.SUBQ NG 20%批次的表征
Figure BDA00001645193200901
基于美国和欧洲当局（FDA和EMEA）对皮下给药的人免疫球蛋白的要求、用于皮下给药的现有产品的最终容器标准（SUBCUVIA，在欧洲被批准用于皮下给药）和Gammagard Liquid标准来确定预定的最终容器合格标准（preliminary final container release criteria）。完成对三种最终容器的相关抗体谱的表征并与临床前10%IG Triple Virally Reduced(TVR)批次的结果比较。表5比较了三种临床前SUBQ NG 20%最终容器和临床前Gammagard Liquid批次的抗体效价和富集因子的结果。两个批次的这些结果在相同的数量级。
表5.SUBQ NG 20%和10%IG TVR的合格数据的比较
进行另外的质量控制试验来评价产品和/或方法相关杂质的水平。表6显示了三种SUBQ NG 20%最终容器的质量控制数据。产品和方法相关杂质的去除是令人满意的，并且所有三个批次满足关于产品的所有预定规范。
表6.SUBQ NG 20%最终容器的质量控制试验
Figure BDA00001645193200912
Figure BDA00001645193200931
在临床前产品的生产过程中监测的方法参数和对中间体和终产品的表征显示三个批次之间无可检测的明显差异。所有的最终容器满足产品相关的预定标准，而与所选择的原料类型（沉淀G VNELG171、VNELG173或LB0790301）无关。
C.20%IG制剂的保存研究
为了评价20%IG最终容器的保存稳定性，将上述3个临床前批次(SC00107NG、SC00207NG、SC00307NG)和一个可行性批次(IgGSC 62/1)于2-8℃和28-30℃（仅可行性批次）保存长达18个月。使用高效尺寸排阻色谱法测定分子大小分布(MSD)和样品的稳定性。主要的稳定性指示参数为分子量，并且分子大小的变化可由变性引起的降解、聚集或片段化引起。
所述临床前最终容器于2-8℃保存长达12个月后的MSD显示于表7。表8显示了可行性批次IgGSC 62/1于2-8℃和28-30℃保存长达18个月后的MSD。数据验证了所述产品符合2-8℃和28-30℃下长达18个月的保存所研究的参数的预定规范。
表7.2-8℃下临床前20%IG批次的MSD
Figure BDA00001645193200932
Figure BDA00001645193200941
表8.2-8℃和28-30℃下可行性批次IgGSC 62/1的MSD
Figure BDA00001645193200942
Figure BDA00001645193200951
D.各种IG浓度和制剂的稳定性研究
比较具有低pH（0.25M甘氨酸，pH 4.4–4.9）的高蛋白质浓度制剂(14-20%)和目前用于可肌肉内和静脉内注射的免疫球蛋白的具有中性pH(22.5g/L甘氨酸、3g/LNaCl,pH 7.0)的高蛋白质浓度制剂的保存稳定性。
所有的试验从将纳米过滤液浓缩至5%蛋白质开始。用0.15M甘氨酸（被研究的最低甘氨酸浓度）进行10x缓冲液交换，然后使用截留分子量为30K（标准筛网）的0.5m2聚醚砜Millipore膜进行最终浓缩，至超过20%蛋白质的目标值。配制终容器并以低pH(4.7)保存，或者大批进行低pH保存然后在中性pH(7.0)下配制，然后于2-8℃或28-30℃保存3个月。三个月后，通过高效尺寸排阻色谱法测定分子大小分布以测定聚集体和片段的含量。将可接受标准确定为：单体和寡聚体/二聚体≥90%；聚集体≤5%，片段≤5%。如欧洲药典中所述测试ACA效价。将可接受的ACA效价确定为每mg蛋白质消耗低于50%CH50单位。
表9和10显示具有不同蛋白质浓度的标准制剂（pH 4.7,0.25M甘氨酸；或pH 7.0,22.5g/L甘氨酸,3g/L NaCl）分别于2-8℃和28-30℃保存3个月后聚集体和片段的含量以及ACA效价。数据明确显示于28-30℃保存3个月后，低pH制剂具有更少的聚集体和更低的ACA效价。所有pH 7.0制剂的ACA效价均高于为该试验确定的可接受标准。
2-8℃的结果验证了于28-30℃观察到的趋势。ACA效价均低于被确定为可接受标准的限度，然而pH 7.0制剂表现出具有更高的值。蛋白质的值不影响被测试参数的结果。
表9.以不同的蛋白质浓度在pH 4.7和pH 7.0下于28-30℃保存3个月后的片段、聚集体和ACA值
Figure BDA00001645193200961
表10.以不同的蛋白质浓度在pH 4.7和pH 7.0下于2-8℃保存3个月后的片段、聚集体和ACA数值
研究不同浓缩操作对MSD和ACA效价的影响。第一个操作使用了如上所述的截留分子量为30K（标准筛网）的0.5m2聚醚砜Millipore膜，第二个操作使用了适用于较高粘度溶液的具有开放筛网的0.5m2聚醚砜Millipore膜。通过具有较小膜表面（0.1m2，开放筛网）的第二个超滤/渗滤装置浓缩后洗涤部分以降低收率损失。
表11和12显示具有不同浓度的低pH (4.7)制剂分别于28-30℃或2-8℃保存3个月后的MSD和ACA效价。该数据显示了两个浓度模式在保存3个月后相似的结果。于2-8℃获得的值验证了于28-30℃获得的结果。浓缩方法不影响产品的稳定性，然而只有使用开放筛网膜才能获得充分的后洗涤。
表11.对于不同的蛋白质浓缩方法，在pH 4.7下于28-30℃保存3个月后的片段、聚集体和ACA数值
表12.对于不同的蛋白质浓缩方法，在pH 4.7下于2-8℃保存3个月后的片段、聚集体和ACA数值
Figure BDA00001645193200972
实施例3
制备可溶性重组人rHuPH20(rHuPH20)
A.表达可溶性rHuPH20的细胞系的产生
用HZ24质粒(显示于SEQ ID NO:52)转染中国仓鼠卵巢（CHO细胞）（参见，例如申请第10,795,095、11/065,716和11/238,171号）。用于表达可溶性rHuPH20的HZ24质粒载体包含pCI载体骨架(Promega)、编码人PH20透明质酸酶的氨基酸1-482(SEQ ID NO:49)的DNA、来自ECMV病毒(Clontech)的内部核糖体进入位点(IRES)以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。pCI载体骨架也包含编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、f1复制起点、巨细胞病毒即时早期增强子/启动子区(CMV)、嵌合体内含子以及SV40晚期多聚腺苷酸化信号(SV40)。编码可溶性rHuPH20构建体的DNA包含在编码人PH20的天然35个氨基酸信号序列的氨基酸位点1处的甲硫氨酸的DNA之前的NheI位点和Kozak共有序列，以及在编码对应于SEQ ID NO:1所示人PH20透明质酸酶的氨基酸位点482的酪氨酸的DNA之后的终止密码子，之后为BamHI限制酶切位点。因此，构建体pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)得到由CMV启动子驱动的单一mRNA个体（species），其编码被内部核糖体进入位点(IRES)分隔开的人PH20的氨基酸1-482（列于SEQ ID NO:3）和小鼠二氢叶酸还原酶氨基酸1-186（列于SEQ ID NO:53）。
将生长在添加了4mM谷氨酰胺和18mL/L Pluronic F68/L(Gibco)的用于DHFR(-)细胞的GIBCO改良CD CHO培养基中的未转染DG44CHO细胞以0.5x106细胞/mL接种至准备用于转染的摇瓶中。使细胞在加湿培养箱中于37°C、在5%CO2中、120rpm的摇动下生长。在转染前试验指数生长的未转染DG44CHO细胞的活力。
将未转染的DG44CHO细胞培养物的六千万个活细胞沉淀（pelleted）并在0.7mL 2x转染缓冲液(2x HeBS:40mM Hepes、pH 7.0、274mM NaCl、10mM KCl、1.4mM Na2HPO4、12mM右旋糖)中重悬至2×107个细胞的密度。向每一等份重悬细胞中加入0.09mL(250μg)线性HZ24质粒（通过用Cla I(New England Biolabs)过夜消化进行线性化），然后将细胞/DNA溶液在室温下转移至0.4cm电极间距的BTX (Gentronics)电穿孔小槽中。用与细胞混合的无质粒DNA进行阴性对照电穿孔。以330V和960μF或350V和960μF的电容放电对细胞/质粒混合物进行电穿孔。
电穿孔后将细胞从小槽移出并转移至5mL添加了4mM谷氨酰胺和18mL/L Pluronic F68/L(Gibco)的用于DHFR(-)细胞的改良CD CHO培养基中，使细胞在加湿培养箱中在六孔组织培养板的孔中于37°C、在5%CO2中生长2天而不进行筛选。
电穿孔后两天，从各孔除去0.5mL组织培养基并使用实施例4描述的微浊度测定法试验透明质酸酶活性的存在。
表13.转染后40小时HZ24转染的DG44 CHO细胞的起始透明质酸酶活性
Figure BDA00001645193200991
从组织培养孔收集来自转染2(350V)的细胞、计数并稀释至1×104至2×104个活细胞每mL。将0.1mL的等份细胞悬浮液转移至五个96孔圆底组织培养板的每一个孔中。将一百微升包含4mM GlutaMAXTM-1添加物(GIBCOTM,Invitrogen Corporation)并且不含次黄嘌呤和胸苷添加物的CDCHO培养基(GIBCO)加入包含细胞的孔中（终体积0.2mL）。
鉴定来自5个培养板的在无甲氨蝶呤的情况下生长的十个克隆。
表14.所鉴定的克隆的透明质酸酶活性
  平板/孔ID   相对透明质酸酶
  1C3   261
  2C2   261
  3D3   261
  3E5   243
  3C6   174
  2G8   103
  1B9   304
  2D9   273
  4D10   302
在培养基中扩增六个HZ24克隆并以单细胞悬液形式转移至摇瓶中。使用二维无限稀释法将克隆3D3、3E5、2G8、2D9、1E11和4D10接种至96-孔圆底组织培养板中，其中相对于板从上到下1:2且横向1:3稀释细胞，从左上角的孔以5000个细胞起始。使稀释的克隆生长于每孔500个未转染DG44 CHO细胞的背景中以提供在培养基中最初几天必要的生长因子。每个亚克隆制备10板，5个板包含50nM甲氨蝶呤，5个板不含甲氨蝶呤。
克隆3D3产生了24个可见的亚克隆（13个来自无甲氨蝶呤处理，11个来自50nM甲氨蝶呤处理）。在24个亚克隆中的8个的上清中测量到显著的透明质酸酶活性(>50单位/mL)并将这8个亚克隆扩增至T-25组织培养瓶中。在50nM甲氨蝶呤存在下扩增分离自甲氨喋呤处理方案的克隆。在摇瓶中在500nM甲氨喋呤中进一步扩增克隆3D35M得到产生超过1000单位/mL的克隆(克隆3D35M;或Gen13D35M)。然后制备3D35M细胞的原始细胞库（MCB）。
B.Gen1人sPH20的产生和纯化
a.5L生物反应器法
溶解一小瓶3D35M并在添加了100nM甲氨喋呤和GlutaMAXTM-1(Invitrogen)的CD CHO培养基(Invitrogen,Carlsbad Calif.)中通过1L旋转瓶从摇瓶扩增。以4×105活细胞/mL的接种密度将细胞从旋转瓶转移到5L生物反应器(Braun)中。参数为：温度设定点37°C、pH 7.2（起始设定点）、溶氧设定点25%以及0-100cc/min的空气覆盖（air overlay）。第168hr时，加入250mL Feed#1Medium(含50g/L葡萄糖的CD CHO)。第216hr时加入250mL Feed#2Medium(含50g/L葡萄糖和10mM丁酸钠的CD CHO)，以及第264小时加入Feed#2Medium。这一方法得到1600单位/mL的终产率，最大细胞密度为6×106细胞/mL。加入丁酸钠显著是为了在生产的最后阶段增加可溶性rHuPH20的产生。
通过深层过滤（depth filtration）和切线流透析过滤至10mM Hepes pH7.0中使来自3D35M克隆的条件培养液澄清。然后通过在Q Sepharose(Pharmacia)离子交换、Phenyl Sepharose(Pharmacia)疏水作用色谱、苯基硼酸酯(Prometics)和羟基磷灰石色谱法(Bio-Rad,Richmond,CA)的顺序色谱法纯化可溶性rHuPH20。
可溶性rHuPH20结合至Q Sepharose并在相同的缓冲液中以400mMNaCl洗脱。用2M硫酸铵稀释洗出液至500mM硫酸铵终浓度并通过PhenylSepharose(低取代)柱，然后在相同条件下结合至苯基硼酸酯树脂。于pH 9.0在不含硫酸铵的50mM N-二[羟乙基]甘氨酸中洗涤后，将可溶性rHuPH20从Hepes pH 6.9中的Phenyl Sepharose树脂洗脱。在5mM磷酸钾和1mMCaCl2中于pH 6.9将洗出液上样至陶瓷羟基磷灰石树脂上，并用含0.1mMCaCl2的80mM磷酸钾pH 7.4洗脱。
所得纯化的可溶性rHuPH20具有通过使用USP参比标准的微浊度测定法（实施例3）测定的超过65,000USP单位/mg蛋白的比活。用0.1%TFA/H2O和0.1%TFA/90%乙腈/10%H2O之间的梯度从Pharmacia 5RPC苯乙烯-二乙烯苯柱将纯化的可溶性rHuPH20在24至26分钟以单峰洗脱并通过SDS电泳分辨为61kDa的一条带，其经PNGASE-F处理后减小至清晰的51kDa条带。N-端氨基酸测序表明前导肽已被有效去除。
b.形成100L生物反应器细胞培养物的上游细胞培养扩增法
使用放大方法从四个不同的3D35M细胞小瓶中分别纯化可溶性rHuPH20以产生4个单独批次的可溶性rHuPH20;HUA0406C、HUA0410C、HUA0415C和HUA0420C。分别扩增各小瓶并经125L生物反应器培养，然后使用柱色谱法纯化。在整个过程中取样以评价这些参数例如酶产率。下文提供的该方法的描述列出了代表性技术要求例如生物反应器起始和补料培养基体积、转移细胞密度以及洗涤和洗脱体积。每一批的具体数字略微变化并详细记录于表15-22。
在37°C的水浴中融化4瓶3D35M细胞，加入包含100nM甲氨喋呤和40mL/L GlutaMAXTM-1的CD CHO并将细胞离心。将细胞重悬于含20mL新鲜培养基的125mL摇瓶中并置于37°C、7%CO2培养箱中。在125mL摇瓶中将细胞扩增至40mL。当细胞密度达到1.5–2.5x106细胞/mL时，将培养物扩增至125mL旋转瓶中，培养物体积为100mL。将烧瓶于37°C、7%CO2温育。当细胞密度达到1.5-2.5x106细胞/mL时，将培养物扩增至250mL旋转瓶中，培养物体积为200mL，并将烧瓶于37°C、7%CO2温育。当细胞密度达到1.5–2.5x106细胞/mL时，将培养物扩增至1L旋转瓶中，培养物体积为800mL，并于37°C、7%CO2温育。当细胞密度达到1.5–2.5x106细胞/mL时，将培养物扩增至6L旋转瓶中，培养物体积为5L，并于37°C、7%CO2温育。当细胞密度达到1.5-2.5x106细胞/mL时，将培养物扩增至36L旋转瓶中，培养物体积为20L，并于37°C、7%CO2温育。
将125L生物反应器用121oC、20psi蒸汽灭菌并加入65L CD CHO培养基。使用前，检查反应器是否被污染。当36L旋转瓶中的细胞密度达到1.8-2.5x106细胞/mL时，将20L细胞培养物从36L旋转瓶转移到125L生物反应器中(Braun)，得到85L终体积和约4×105细胞/mL的接种密度。参数为：温度设定点37°C;pH:7.2;溶氧:25%±10%;搅拌叶轮速度50rpm;发酵罐气压3psi;空气喷射（air sparge）1L/min.;空气覆盖:1L/min。每天从生物反应器取样用于细胞计数、pH验证、培养基分析、蛋白质产生和保留。在运行中加入营养物补料。第6天加入3.4L Feed#1Medium(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAXTM-1)，并将培养温度改变至36.5°C。第9天加入Feed#2(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAXTM-1+1.1g/L丁酸钠)，并将培养温度改变至36°C。第11天，加入3.7L Feed#3(CDCHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAXTM-1+1.1g/L丁酸钠)并将培养温度改变至35.5°C。在14天或当细胞活力下降至低于50%时收获反应器。该方法得到具有1600单位/mL酶活性并具有8百万细胞/mL的最大细胞密度的可溶性rHuPH20的生产。收获时，取样培养物用于支原体、生物负载、内毒素、体外和体内病毒、用于病毒颗粒的透射电子显微术（TEM）以及酶活性。
将100VL的生物反应器细胞培养收获物通过一系列的具有聚醚砜介质(Sartorius)的一次性胶囊式滤器进行过滤：首先通过8.0μm厚的胶囊、0.65μm厚的胶囊、0.22μm胶囊，最后通过0.22μm Sartopore 2000cm2滤器并进入100L无菌储存袋。使用两个具有螺旋式聚醚砜30kDa MWCO滤器(Millipore)的TFF将培养物浓缩为10×，然后通过与10mM Hepes、25mMNa2SO4、pH 7.0的6×缓冲液交换进入0.22μm末端滤器进入20L无菌储存袋中。表15提供与细胞培养、收获、浓度和缓冲液交换步骤相关的监测数据。
表15.细胞培养、收获、浓度和缓冲液交换步骤的监测数据
Figure BDA00001645193201021
制备Q Sepharose(Pharmacia)离子交换柱(3L树脂,高=20cm,直径=14cm)。采集洗涤样品用于pH测定、电导率和内毒素（LAL）测定。用5个柱体积的10mM Tris、20mM Na2SO4、pH 7.5平衡柱子。将已浓缩的、透析过滤的收获物以100cm/hr的流速上样至Q柱。用5个柱体积的10mMTris、20mM Na2SO4、pH 7.5和10mM Hepes、50mM NaCl、pH 7.0洗涤柱子。用10mM Hepes、400mMNaCl、pH 7.0洗脱蛋白并过滤通过0.22μm末端滤器进入无菌袋。
接下来进行Phenyl Sepharose(Pharmacia)疏水作用色谱法。制备PhenylSepharose(PS)柱(9.1L树脂,高=29cm,直径=20cm)。用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵、0.1mM CaCl2、pH 7.0平衡柱子。向来自上一步的蛋白洗出液中加入2M硫酸铵、1M磷酸钾和1M CaCl2储备液至终浓度分别为5mM、0.5M和0.1mM。以100cm/hr的流速将蛋白质上样至PS柱。以100cm/hr加入5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵和0.1mM CaCl2 pH 7.0。使流出液通过0.22μm末端滤器进入无菌袋。
接下来将PS-纯化的蛋白质上样至用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵平衡过的氨基苯基硼酸酯柱(ProMedics)(6.3L树脂,高=20cm,直径=20cm)。以100cm/hr的流速使蛋白质通过柱子并用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵、pH 7.0洗涤柱子。然后用20mM N-二[羟乙基]甘氨酸、100mMNaCl、pH 9.0洗涤柱子，并用50mM Hepes、100mM NaCl、pH 6.9洗脱蛋白质，通过无菌滤器进入20L无菌袋。检测洗出液的生物负载、蛋白质浓度和酶活性。
用5mM磷酸钾、100mM NaCl、0.1mM CaCl2 pH 7.0平衡羟基磷灰石(HAP)柱(Bio-Rad)(1.6L树脂,高=10cm,直径=14cm)。采集洗涤样品并检测pH、电导率和内毒素（LAL）。向氨基苯基硼酸酯纯化的蛋白质中加入磷酸钾和CaCl2，得到5mM磷酸钾和0.1mM CaCl2的终浓度，然后以100cm/hr的流速上样至HAP柱。用5mM磷酸钾pH 7.0、100mM NaCl、0.1mMCaCl2，然后用10mM磷酸钾pH 7.0、100mM NaCl、0.1mM CaCl2 pH洗涤柱子。用70mM磷酸钾pH 7.0洗脱蛋白并过滤通过0.22μm滤器进入5L无菌储存袋。检测洗脱液的生物负载、蛋白浓度和酶活性。
然后通过压力罐将HAP-纯化的蛋白泵过20nM病毒去除滤器。将蛋白质加入DV20压力罐和滤器(Pall Corporation),通过具有20nm孔的UltiporDV20滤器(Pall Corporation)进入无菌20L储存袋。检测滤液的蛋白质浓度、酶活性、寡糖、单糖和唾液酸特征以及与方法相关的杂质。然后使用10kDa分子量截留(MWCO)Sartocon Slice正切流动过滤(TFF)系统(Sartorius)将滤液中的蛋白浓缩至1mg/mL。首先通过用Hepes/盐水溶液(10mM Hepes、130mM NaCl、pH 7.0)洗涤制备滤器，取样渗透液检测pH和电导率。浓缩后，取样浓缩蛋白并检测蛋白质浓度和酶活性。对浓缩蛋白进行6×缓冲液交换进入终末缓冲液：10mM Hepes、130mM NaCl、pH 7.0。使浓缩蛋白通过0.22μm滤器至20L无菌储存袋。取样蛋白质并检测蛋白浓度、酶活性、游离巯基、寡糖特征和同渗浓度。
表16-22提供了各3D35M细胞批次的与上文所述各纯化步骤相关的监测数据。
表16.Q Sepharose柱数据
表17.Phenyl Sepharose柱数据
Figure BDA00001645193201052
表18.氨基苯基硼酸酯柱数据
表19.羟基磷灰石柱数据
Figure BDA00001645193201062
表20.DV20过滤数据
Figure BDA00001645193201071
表21.终浓度数据
Figure BDA00001645193201072
表22.缓冲液交换至最终制备物数据
Figure BDA00001645193201073
将经纯化和浓缩的可溶性rHuPH20蛋白无菌填充至无菌小瓶中，填充体积为5mL和1mL。使蛋白质通过0.22μm滤器进入由控制器控制的泵，其用于利用比重测定读出装置填充小瓶。用塞子将小瓶密闭并用波纹帽（crimped caps）保护。目视检查密闭小瓶是否包含外源性颗粒然后贴上标签。标记后，通过浸入液氮不超过1分钟将小瓶速冻并保存于≤-15oC(-20±5oC)。
C.产生包含可溶性人PH20(rHuPH20)的Gen2细胞
使上描述的Gen1 3D35M细胞系适应更高的甲氨蝶呤水平以产生第2代(Gen2)克隆。从已建立的包含甲氨蝶呤的培养物中将3D35M细胞接种至包含4mM GlutaMAXTM-1和1.0μM甲氨蝶呤的CD CHO培养基中。通过在37°C、7%CO2加湿培养箱中在46天的时间里生长和传代9次使细胞适应更高的甲氨蝶呤水平。通过在包含含有2.0μM甲氨蝶呤的培养基的96-孔组织培养板中进行有限稀释克隆出已扩增的细胞群。约4周后，鉴定克隆并选择克隆3E10B用于扩增。使3E10B细胞在包含4mM GlutaMAXTM-1和2.0μM甲氨蝶呤的CD CHO培养基中生长20代。产生3E10B细胞系的原始细胞库(MCB)并冷冻，用于后续试验。
通过在包含4mM GlutaMATMX-1和4.0μM甲氨喋呤的CD CHO培养基中培养3E10B细胞继续进行细胞系的扩增。在第12次传代后，将细胞冷冻在小瓶中作为研究细胞库(RCB)。融化一小瓶RCB并培养在包含8.0μM甲氨蝶呤的培养基中。5天后，培养基中的甲氨蝶呤浓度增加到16.0μM，接着18天后增加到20.0μM。通过在包含含有4mM GlutaMAXTM-1和20.0μM甲氨蝶呤的CD CHO培养基的96孔组织培养板中进行有限稀释克隆出来自包含20.0μM甲氨蝶呤的培养基中的第8次传代的细胞。5-6周后鉴定克隆并选择克隆2B2用于在包含20.0μM甲氨蝶呤的培养基中扩增。第11次传代后，将2B2细胞冷冻在小瓶中用作研究细胞库(RCB)。
所得2B2细胞为可表达可溶性重组人PH20(rHuPH20)的二氢叶酸还原酶缺陷(dhfr-)DG44CHO细胞。可溶性rHuPH20以约206拷贝/细胞的拷贝数存在于2B2细胞中。使用rHuPH20-特异性探针对Spe I-消化的、Xba I-消化的和BamH I/Hind III-消化的基因组2B2细胞DNA进行的DNA印记分析显示以下限制酶切消化特征：用Spe I消化的DNA具有~7.7kb的一条主要杂交带和四条小杂交带(~13.9、~6.6、~5.7和~4.6kb)；用Xba I消化的DNA具有~5.0kb的一条主杂交带和两条小杂交带(~13.9和~6.5kb)；用BamH I/Hind III消化的2B2 DNA观察到~1.4kb的一条单一杂交带。mRNA转录物的序列分析表明所得到的cDNA(SEQ ID NO:56)与参比序列(SEQID NO:49)一致，除了1311位处的一个碱基对差异，经观察其为胸苷（T）而不是预期的胞嘧啶（C）。这是沉默突变，不影响氨基酸序列。
D.在300L生物反应器细胞培养物中产生Gen2可溶性rHuPH20
融化一瓶HZ24-2B2并通过36L旋转瓶在添加了20μM甲氨蝶呤和GlutaMAXTM-1(Invitrogen)的CD CHO培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中从摇瓶扩增。简而言之，在37°C水浴中融化细胞小瓶，加入培养基并将细胞离心。将细胞重悬于包含20mL新鲜培养基的125mL摇瓶中并置于37°C、7%CO2培养箱中。在125mL摇瓶中将细胞扩增至40mL。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，将培养物扩增至125mL旋转瓶中，培养物体积为100mL。将烧瓶在37°C、7%CO2温育。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，将培养物扩增至250mL旋转瓶中，培养物体积为200mL，并将烧瓶在37°C、7%CO2温育。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，将培养物扩增至1L旋转瓶中，培养物体积为800mL，并于37°C、7%CO2温育。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，将培养物扩增至6L旋转瓶中，培养物体积为5000mL，并于37°C、7%CO2温育。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，将培养物扩增至36L旋转瓶中，培养物体积为32L，并于37°C、7%CO2温育。
将400L生物反应器灭菌并加入230mL CD CHO培养基。使用前，检查是否污染。将约30L细胞从36L旋转瓶转移至400L生物反应器(Braun中，接种密度为4.0×105活细胞每mL且总体积为260L。参数为：温度设定点，37°C;搅拌叶轮速度40-55rmp;发酵罐压力3psi;空气喷射0.5-1.5L/Min.;空气覆盖:3L/min。每天从生物反应器取样用于细胞计数、pH验证、培养基分析、蛋白质产生和保留。而且，在运行期间加入营养物补料。第120hr（第5天），加入10.4L Feed#1Medium(4×CD CHO+33g/L葡萄糖+160mL/L GlutaMAXTM-1+83mL/L Yeastolate+33mg/L rHuInsulin)。第168小时（第7天），加入10.8L Feed#2(2×CD CHO+33g/L葡萄糖+80mL/L GlutaMAXTM-1+167mL/L Yeastolate+0.92g/L丁酸钠)，并将培养温度改变至36.5°C。第216小时（第9天），加入10.8L Feed#3(1×CD CHO+50g/L葡萄糖+50mL/L GlutaMAXTM-1+250mL/L Yeastolate+1.80g/L丁酸钠)并将培养温度改变至36°C。第264小时（第11天），加入Feed#4(1×CD CHO+33g/L葡萄糖+33mL/L GlutaMAXTM-1+250mL/L Yeastolate+0.92g/L丁酸钠)，并将培养温度改变至35.5°C。观察到加入补料培养基显著增加生产最后阶段可溶性rHuPH20的产生。在第14天或15天或当细胞活力下降至低于40%时收获生物反应器。该方法得到17,000单位/mL的终生产率并具有一千两百万细胞/mL的最大细胞密度。收获时，对培养物取样用于支原体、生物负载以及体外和体内病毒、透射电子显微术（TEM）和酶活性。
通过蠕动泵将培养物泵出通过四个并行的Millistak过滤系统模块(Millipore)，各包含一层4-8μm级的硅藻土和一层1.4-1.1μm级的硅藻土，然后为纤维素膜，接着通过第二个单一的Millistak过滤床系统(Millipore)，其包含一层0.4-0.11μm级的硅藻土和一层<0.1μm级的硅藻土，之后通过纤维素膜，然后通过0.22μm终端滤器进入具有350L容量的无菌一次性软袋。向收集的细胞培养液中添加10mM EDTA和10mM Tris至pH 7.5。使用四个Sartoslice TFF 30kDa分子量截留(MWCO)聚醚砜(PES)滤器(Sartorious)通过正切流动过滤(TFF)设备将培养物浓缩10×，然后通过与10mM Tris、20mM Na2SO4、pH 7.5的10×缓冲液交换进入0.22μm终端滤器进入50L无菌储存袋。
将已浓缩和透析过滤的收获产物进行病毒灭活。病毒灭活前，制备10%Triton X-100、3%磷酸三正丁酯(TNBP)的溶液。在临近Q柱纯化前在36L玻璃反应器中将已浓缩、透析过滤的收获产物暴露至1%Triton X-100、0.3%TNBP 1小时。
E.Gen2可溶性rHuPH20的纯化
制备Q Sepharose(Pharmacia)离子交换柱(9L树脂,H=29cm,D=20cm)。采集洗涤样品用于pH、电导率和内毒素（LAL）测定。用5个柱体积的10mM Tris、20mM Na2SO4、pH 7.5平衡柱子。病毒灭活后，将已浓缩、透析过滤的收获产物以100cm/hr的流速上样至Q柱。用5个柱体积的10mM Tris、20mM Na2SO4、pH 7.5和10mM Hepes、50mM NaCl、pH7.0洗涤柱子。用10mM Hepes、400mM NaCl、pH 7.0将蛋白质洗脱至0.22μm终端滤器进入无菌袋。检测洗出液样品的生物负载、蛋白质浓度和透明质酸酶活性。在交换开始和结束时读取A280吸光度。
接下来进行Phenyl Sepharose(Pharmacia)疏水作用色谱法。制备PhenylSepharose(PS)柱(19-21L树脂,H=29cm,D=30cm)。收集洗涤液并取样用于pH、电导率和内毒素（LAL测定）测定。用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵、0.1mM CaCl2,pH 7.0平衡柱子。向来自Q Sepharose柱的蛋白质洗出液中添加2M硫酸铵、1M磷酸钾和1M CaCl2储备液以分别得到5mM、0.5M和0.1mM的终浓度。以100cm/hr的流速将蛋白质上样至PS柱并收集柱流出液。用5mM硫酸钾、0.5M硫酸铵和0.1mM CaCl2pH 7.0以100cm/hr洗涤柱子，并将洗涤液加入收集的流出液中。与柱洗涤液合并，使流出液通过0.22μm终端滤器进入无菌袋。对流出液进行取样用于生物负载、蛋白质浓度和酶活性检测。
制备氨基苯基硼酸酯柱(Prometic)。收集洗涤液并取样用于pH、电导率和内毒素（LAL测定）测定。用5个柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵平衡柱子。以100cm/hr的流速将包含纯化的蛋白质的PS流出液上样至氨基苯基硼酸酯柱。用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵，pH 7.0洗涤柱子。用20mMN-二[羟乙基]甘氨酸、0.5M硫酸铵、pH 9.0洗涤柱子。用20mM N-二[羟乙基]甘氨酸、100m M NaCl、pH 9.0洗涤柱子。用50mM Hepes、100mM NaCl、pH 6.9洗脱蛋白质并通过无菌滤器进入无菌袋。检测洗脱液样品的生物负载、蛋白质浓度和酶活性。
制备羟基磷灰石(HAP)柱(Bio-Rad)。收集洗涤液并检测pH、电导率和内毒素（LAL测定）。用5mM磷酸钾、100mM NaCl、0.1mM CaCl2、pH7.0平衡柱子。向氨基苯基硼酸酯纯化的蛋白质中加入终浓度5mM磷酸钾和0.1mM CaCl2并以100cm/hr的流速上样至HAP柱。用5mM磷酸钾、pH 7.0、100mM NaCl、0.1mM CaCl2洗涤柱子。接着用10mM磷酸钾、pH7.0、100mM NaCl、0.1mM CaCl2洗涤柱子。用70mM磷酸钾，pH 7.0洗脱蛋白质并通过0.22μm无菌滤器进入无菌袋。检测洗脱液样品的生物负载、蛋白质浓度和酶活性。
接着使HAP纯化的蛋白质通过病毒去除滤器。首先，通过用2L 70mM磷酸钾，pH 7.0洗涤制备无菌Viosart滤器(Sartorius)。使用前，对已过滤的缓冲液进行取样用于pH和导电率检测。通过蠕动泵将HAP纯化的蛋白质泵出通过20nM病毒去除滤器。将70mM磷酸钾、pH 7.0中的已过滤蛋白通过0.22μm终端滤器进入无菌袋。检测已过滤病毒的样品的蛋白质浓度、酶活性、寡糖、单糖和唾液酸特征。也检测样品的与方法相关的杂质。
然后使用10kD分子量截留(MWCO)Sartocon Slice正切流动过滤(TFF)系统(Sartorius)将滤液中的蛋白质浓缩至10mg/mL。首先通过用10mM组氨酸、130mM NaCl,pH 6.0洗涤来制备滤器，并对渗透物进行取样用于pH和电导率检测。浓缩后，取样浓缩的蛋白质并检测蛋白质浓度和酶活性。对浓缩蛋白质进行6×缓冲液交换至终缓冲液：10mM组氨酸、130mMNaCl，pH 6.0。缓冲液交换后，使浓缩的蛋白质通过0.22μm滤器进入20L无菌储存袋。对蛋白质取样并检测蛋白质浓度、酶活性、游离巯基、寡糖特征和同渗浓度。
然后将无菌的、过滤的全部蛋白以20mL无菌分装至30mL无菌Teflon小瓶(Nalgene)中。然后将小瓶迅速冷冻并保存于20±5°C。
F.比较Gen1可溶性rHuPH20和Gen2可溶性rHuPH20的生产和纯化
与在100L生物反应器细胞培养物中的Gen1可溶性rHuPH20的生产和纯化相比，在300L生物反应器细胞培养物中的Gen2可溶性rHuPH20的生产和纯化包含一些变化。表23列出了除单纯的放大变化之外两种方法之间的示例性差异。
表23.Gne1和Gen2方法的比较
Figure BDA00001645193201141
实施例4
使用微浊度测定法测定可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性
使用浊度测定法测定样品例如细胞培养物、纯化组分和纯化溶液中的可溶性重组人PH20(rHuPH20)的透明质酸酶活性，所述浊度测定法基于当透明质酸结合血清白蛋白时形成不可溶的沉淀。通过将可溶性rHuPH20与透明质酸钠（透明质酸）温育预定的时间（10分钟）然后加入酸化的血清白蛋白沉淀未消化的透明质酸钠来测量活性。30分钟形成时间后，在640nm测量所得样品的浊度。由对透明质酸钠底物的酶活性引起的浊度降低为可溶性rHuPH20透明质酸酶活性的量度。使用通过可溶性rHuPH20测定法工作参比标准的稀释液生成的校正曲线进行该方法，并相对于这一校正曲线进行样品活性的测定。
在酶稀释液中制备样品的稀释液。通过将33.0±0.05mg水解明胶溶解于25.0mL 50mM PIPES Reaction Buffer (140mM NaCl、50mM PIPES、pH5.5)和25.0mL无菌冲洗用水(SWFI)中，并将0.2mL 25%人血清白蛋白溶液稀释至该混合物中并涡旋30秒，来制备酶稀释液(EDS)。这在使用的2小时内进行并保存于冰上直到使用。用EDS将样品稀释至约1-2U/mL。通常，每一步的最大稀释不超过1:100并且第一次稀释的起始样品体积不小于20μL。进行该测定所需的最小样品体积为：正在处理的样品、FPLC组分:80μL;组织培养物上清:1mL;浓缩材料80μL;纯化的或最后一步的材料:80μL。在低蛋白结合96孔板中一式三份进行稀释，将30μL的各稀释液转移至Optilux黑色/透明底平板中(BD BioSciences)。
在酶稀释溶液中制备浓度为2.5U/mL的已知可溶性的rHuPH20的稀释液以生成标准曲线并一式三份加入Optilux板中。稀释液包括0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1.0U/mL、1.5U/mL、2.0U/mL和2.5U/mL。该板包括包含60μL酶稀释溶液的“试剂空白”孔作为阴性对照。然后将板子覆盖并在加热块上在37oC温热5分钟。去除覆盖物并将板子振摇10秒钟。振摇后，将板子放回加热块，并用温热的0.25mg/mL透明质酸钠溶液（通过将100mg的透明质酸钠(LifeCore Biomedical)溶解于20.0mL SWFI中制备。通过在2-8°C轻轻旋转和/或振摇2-4小时将其混合或直到完全溶解。通过将9mL SWFI、10mL PIPES和1mL 5mg/mL透明质酸混合来制备底物溶液）。使MULTIDROP 384 Liquid Handling Device做好准备。将反应板转移至MULTIDROP 384并通过按压启动键将30μL透明质酸钠底物溶液分配至各孔来起始反应。然后将板子从MULTIDROP 384移出并振摇10秒钟，然后重新放上板盖转移至加热块上。将板子在37oC温育10分钟。
通过用血清工作溶液（在75mL 500mM乙酸盐缓冲液中的25mL血清储备液[用9个体积的pH 4.3的500mM乙酸盐缓冲液稀释1个体积的马血清(Sigma)，并用盐酸将pH调节至3.1]，pH4.3）使仪器做好准备并将体积设置变为240μL，使MULTIDROP 384准备停止反应。（25mL血清储备液[用9体积的500mM醋酸盐缓冲液稀释1体积的马血清(Sigma)并用盐酸将pH调节至3.1]稀释于75mL 500mM醋酸盐缓冲液中）。将板子从加热块移除并放置于MULTIDROP 384上并将240μL血清工作溶液分配至孔中。移除板子并在读板仪上振摇10秒钟。又15分钟后，在640nm测量样品的浊度并通过拟合标准曲线测定各样品的透明质酸酶活性（以U/mL计）。
通过用透明质酸酶活性(U/mL)除以蛋白质浓度(mg/mL)计算比活(单位/mg)。
实施例5
氯化钠对rHuPH20的稳定性的作用
所述rHuPH20在pH 6.5的包含10mg/mL组氨酸/HCl和130mM氯化钠(NaCl)的溶液中。如表24中所示，总共制备6种不同的包含以下组分的制剂：pH 7.3的25mM Tris、100μg/mL rHuPH20、0.01%Tween 80和NaCl(0、50、100、150、200或250mM)。将该溶液等分至具有橡胶塞的2mL I型玻璃小瓶内并用铝帽密封。将一组小瓶于40℃保存四天，并且将另一组于2-8℃保存于冰箱内。
表24.含NaCl的rHuPH20制剂
  制剂#   NaCl
  1   0mM
  2   50mM
  3   100mM
  4   150mM
  5   200mM
  6   250mM
保存4天后，使用实施例4中描述的微浊度测定法检测表24中提及的每一种制剂的透明质酸酶的酶活性。进行尺寸排阻色谱法(SEC)评价聚集体的水平，使用以下条件：1X PBS,Toso BioScience G2000 SWXL柱,流速=1mL/min。
表25显示了该研究的结果，包括各制剂的透明质酸酶活性(U/mL)、主峰面积%（包含在所述主峰面积内的rHuPH20的百分比）和聚集体峰面积%（包含在由聚集体引起的峰面积内的rHuPH20的百分比）。结果表明，当于40℃温育时，rHuPH20的稳定性依赖于NaCl浓度：NaCl浓度的增加导致rHuPH20的酶活性增加。保存于2-8℃的样品在整个研究过程中保留了相似水平的rHuPH20酶活性，与制剂无关。在温度升高（40℃）且不存在NaCl的条件下，rHuPH20的全部酶活性丧失。
表25中的结果还显示NaCl浓度对rHuPH20的聚集体水平的作用。在保存于40℃的样品中，聚集体水平随NaCl浓度降低而增加。在保存于2-8℃的样品中基本无变化。
因此，该结果表明，在所试验的NaCl浓度范围内（0-250nM），NaCl浓度和增加的rHuPH20稳定性之间存在直接关系，这表明应在溶解度和张力限度内维持尽可能高的NaCl浓度以增加rHuPH20在升高的温度下的稳定性。
表25.于40℃和28℃保存4天的样品的酶活性和SEC结果
Figure BDA00001645193201181
实施例6
复合配制的rHuPH20和IG的稳定性
A.与rHuPH20复合配制的10%IG或20%IG的稳定性
如下配制rHuPH20：1mL包含来自在pH 6.0的10mM组氨酸和130mM氯化钠(NaCl)中的批次HUB0702CA（使用实施例3描述的Gen2生产方法制备）的1048071单位的重组人透明质酸酶。在与免疫球蛋白混合前，使用pH 6.0的10mM组氨酸+130mM NaCl将rHuPH20稀释至100000U/mL。为此，用1896μL pH 6.0的组氨酸/NaCl缓冲液稀释200μL rHuPH20储备液。
将预先稀释的rHuPH20加入配制于0.25M甘氨酸中的pH 4.4-4.9的不同IG制剂中，以在溶液中达到100U/mL或300U/mL的终浓度。根据表26使用来自大规模生产的三个不同的10%IG批次（LE12H020、LE12H062和LE12H173）中的一个批次或三个不同的临床前20%IG批次（SC00107NG、SC00207NG和SC00307NG）中的一个批次。将溶液通过0.2μm滤器过滤并以1mL的部分转移至无菌的5mL玻璃小瓶内。将小瓶保存于2-8℃或28-32℃。因此，所得rHuPH20和IG的复合制剂被配制于0.25M甘氨酸中，pH 4.4-4.9。
表26.rHuPH20与10%IG或20%IG的复合制剂
Figure BDA00001645193201191
在保存了0（起始）、1、3、6、12、24和36周（仅2-8℃）后，从温育中取出来自表26中提及的6种制剂中的每一种和来自每一个保存室（2-8℃和28-32℃）的样品，并使用实施例4描述的微浊度测定法分析透明质酸酶活性。为了评价对IG的作用，使用TSK G 3000SW 600x7.5mm柱(TosohBioscience)和含DMSO的缓冲系统通过高效尺寸排阻色谱法(HP-SEC)（Kolarich等人,(2006)Transfusion,46:1959-1977）在第0（起始）和第6个月测定包含20%IG的制剂中的IG的分子大小分布。
表27显示保存于2-8℃的各复合制剂在7个时间点（第0、1、3、6、12、24和36周）的透明质酸酶活性(U/mL)。表28显示保存于28-32℃的复合制剂在6个时间点（第0、1、3、6、12和2周）的透明质酸酶活性(U/mL)。于28-32℃保存24周后，在10%IG和20%IG复合制剂的存在下观察到透明质酸酶活性的显著、稳定的丧失，表明rHuPH20的不稳定性。所述10%IG复合制剂在于2-8℃保存9个月后是稳定的，而20%IG复合制剂中的rHuPH20活性略有降低。在两个温度下保存6个月后，包含20%IG的制剂中的IG分子大小分布无变化（表29和30）。
表27.于2-8℃保存后的复合制剂的透明质酸酶活性(U/mL)
Figure BDA00001645193201201
表28.于28-32℃保存后的复合制剂的透明质酸酶活性(U/mL)
Figure BDA00001645193201202
表29.于2-8℃保存后，与rHuPH20复合配制的20%IG中的IG的分子大小分布
Figure BDA00001645193201212
表30.于28-32℃保存后，与rHuPH20复合配制的20%IG中的IG的分子大小分布
Figure BDA00001645193201221
B.含rHuPH20和氯化钠(0-150mM)的复合配制的10%IG的稳定性
为了提高所述复合制剂中rHuPH20的稳定性，研究加入氯化钠(NaCl)的作用。如上文实施例7A中所述制备300U/mL rHuPH20（批号HUB0702CA；使用实施例3中描述的Gen2生产方法制备）在10%IG（批号LE12F047）中的复合制剂，并以4种浓度（0、50、100和150mM）加入NaCl。将所述复合制剂保存于2-8℃或28-32℃。因此，所得rHuPH20和IG的复合制剂是在不同量的NaCl的存在下配制于0.25M甘氨酸中，pH4.6-5.1（在稀释液中测量）。
在保存0（起始）、1、3、6、12、18和24周后，从温育中取出来自每一种复合制剂（含浓度为0、50、100和150mM的氯化钠）和来自每一个保存室（2-8℃和28-32℃）的样品，并且使用实施例4描述的微浊度测定法分析透明质酸酶活性。使用TSK G 3000SW 600x7.5mm柱和含DMSO的缓冲液系统，通过高效尺寸排阻色谱法(HP-SEC)测定分子大小分布(MSD)从而测定IG的聚集（Kolarich等人,(2006)Transfusion,46:1959-1977）。
表31和32显示各复合制剂在7个时间点（第0、1、3、6、12、18和24周）的透明质酸酶活性(U/mL)。结果显示在50、100或150mM NaCl的存在下，于2-8℃保存长达24周后，与10%IG复合配制的rHuPH20的稳定性未发生改变，而保存于28-32℃的那些样品的rHuPH20稳定性提高。然而，当保存于28-32℃时，NaCl浓度为0mM的复合制剂中的透明质酸酶活性快速降低。
表33和34显示NaCl略微增强了两个温度下的IG二聚体化（~350kDa）和28-32℃下的IG聚集（>450kDa），并且所有值在6个月后仍然保持在MSD标准限度之内（≥90%单体/二聚体，≤5%聚集体，≤5%片段）。
尽管加入NaCl对保存于28-32℃的IG制剂的抗补体活性(ACA)效价具有负面影响（增加），但是ACA效价是用于静脉内(IV)给药的标准指标并且与所述复合制剂的皮下给药无关。
表31.于2-8℃保存后，含NaCl的10%IG/rHuPH20复合制剂的透明质酸酶活性(U/mL)
Figure BDA00001645193201231
表32.于28-32℃保存后，含NaCl的10%IG/rHuPH20复合制剂的透明质酸酶活性
Figure BDA00001645193201241
表33.于2-8℃保存后，含NaCl的10%IG/rHuPH20复合制剂中IG的分子大小分布
Figure BDA00001645193201242
表34.于28-32℃保存后，含NaCl的10%IG/rHuPH20复合制剂中IG的分子大小分布
Figure BDA00001645193201243
C.与rHuPH20和氯化钠(0-50mM)复合配制的10%IG或20%IG的稳定性
研究加入如氯化钠对保存于28-32℃的含rHuPH20的10%IG或20%IG复合制剂的稳定性的作用。使用0、5、10、20、30、40和50mM的NaCl浓度，如上文实施例6B中所述制备300U/mL rHuPH20（批号HUB0702CA；使用实施例1中描述的Gen2生产方法制备）在10%IG（批号LE12F047）中的复合制剂和300U/mL rHuPH20（批号HUB0702CA；使用实施例1中描述的Gen2生产方法制备）在20%IG（批号SC00108NG）中的复合制剂。因此，所得rHuPH20和IG的复合制剂是在不同量的NaCl的存在下配制于0.25M甘氨酸中，pH 4.6-5.1（在稀释液中测量）。
在保存0（起始）、1、3、6、12和24周后，从每一种复合制剂（含浓度为0、5、10、20、30、40和50mM的氯化钠）的温育物中取样，并且使用实施例4中描述的微浊度测定法分析透明质酸酶活性。使用TSK G3000SW 600x7.5mm柱和含DMSO的缓冲液系统，通过高效尺寸排阻色谱法(HP-SEC)测定分子大小分布(MSD)从而测定IG聚集。
表35和36显示各复合制剂在各时间点（第0、1、3、6以及12和24周）的透明质酸酶活性(U/mL)。结果显示，在较高NaCl浓度（20、30、40或50mM）的存在下，与10%IG复合配制的rHuPH20的稳定性在保存于28-32℃的整个24周内未发生改变。当保存于28-32℃时，在NaCl浓度低于20mM的复合制剂中的透明质酸酶活性快速降低。在所有NaCl浓度下，与20%IG复合配制的rHuPH20的稳定性在保存于28-32℃的整个24周内未发生改变。
NaCl略微增强了28-32℃下10%IG和20%IG复合制剂的IG二聚体化（~350kDa）和聚集。在20%IG（即更高的IG浓度）中，对IG聚集的作用较不明显（表37和38）。
表35.于28-32℃保存后，含NaCl的10%IG/rHuPH20复合制剂的透明质酸酶活性(U/mL)
Figure BDA00001645193201261
表36.于28-32℃保存后，含NaCl的20%IG/rHuPH20复合制剂的透明质酸酶活性(U/mL)
Figure BDA00001645193201262
表37.于28-32℃保存后，含NaCl的10%IG/rHuPH20复合制剂中IG的分子大小分布
Figure BDA00001645193201271
表38.于28-32℃保存后，含NaCl的20%IG/rHuPH20复合制剂中IG的分子大小分布
Figure BDA00001645193201272
D.在氯化钠(100-250mM)或氨基酸(500mM)的存在下含10%IG或20%IG的复合制剂中的rHuPH20的稳定性
研究对包含10%IG或20%IG和rHuPH20以及氯化钠或氨基酸稳定剂的复合制剂中rHuPH20稳定性的作用。如上文实施例6A中所述制备100U/mL或300U/mL rHuPH20（批号HUB0702CA；使用实施例3中描述的Gen2生产方法制备）在10%IG（含0.25mM甘氨酸，pH4.4）（批号LE12F047）或20%IG（批号SC00108NG）中的复合制剂。样品包含NaCl（浓度为100、150或250mM）、甘氨酸(500mM)或脯氨酸(500mM)。将所述复合制剂保存于2-8℃或28-32℃。因此，所得rHuPH20和IG的复合制剂是在不同量的NaCl、甘氨酸或脯氨酸的存在下配制于0.25M甘氨酸中，pH 4.6-5.1。
在保存0（起始）、1、2、3、6和12周后，从温育中取出来自所述复合制剂（含浓度为100、150和250mM的氯化钠、浓度为500mM的甘氨酸或浓度为500mM的脯氨酸）中的每一种的样品，并且使用实施例4中描述的微浊度测定法分析透明质酸酶活性。使用TSK G 3000SW 600x7.5mm柱和含DMSO的缓冲液系统（Kolarich等人,(2006)Transfusion,46:1959-1977），通过高效尺寸排阻色谱法(HP-SEC)测定第0（起始）周和第12周的分子大小分布(MSD)，从而测定IG聚集。
表39和41分别显示包含100U/mL rHuPH20和10%或20%IG的复合制剂在5个时间点（第0、1、2、3和6周）的透明质酸酶活性(U/mL)。表40和42分别显示包含300U/mL rHuPH20和10%或20%IG的复合制剂在6个时间点（第0、1、2、3、6和12周）的透明质酸酶活性(U/mL)。结果显示，在包含rHuPH20的10%或20%IG复合制剂中，高氨基酸浓度（500mM甘氨酸或500mM脯氨酸）对rHuPH20的稳定化作用低于NaCl。
在所有研究的浓度下，氯化钠在所有复合制剂中增加了28-32℃保存后的IG聚集(>450kDa)。包含500mM脯氨酸的所有复合制剂在于28-32℃保存6周后IG二聚体含量(~350kDa)降低并且单体含量(~160kDa)增加。含甘氨酸的复合制剂中的IG二聚体含量也降低，然而不像脯氨酸复合制剂中那样明显（表43和44）。已证明高浓度的脯氨酸通过有效阻断蛋白质之间的非特异性疏水相互作用有效地抑制重折叠过程中的蛋白质聚集（Kumar等人,(1998)Biochem.Mol.Biol.Int.4:59-517）。
表39.于28-32℃保存后，含稳定剂的10%IG和100U/mL rHuPH20复合制剂的透明质酸酶活性(U/mL)
Figure BDA00001645193201291
表40.于28-32℃保存后，含稳定剂的10%IG和300U/mL rHuPH20复合制剂的透明质酸酶活性(U/mL)
Figure BDA00001645193201292
表41.于28-32℃保存后，含稳定剂的20%IG和100U/mL rHuPH20复合制剂的透明质酸酶活性(U/mL)
Figure BDA00001645193201293
表42.于28-32℃保存后，含稳定剂的20%IG和300U/mL rHuPH20复合制剂的透明质酸酶活性(U/mL)
Figure BDA00001645193201301
表43.于28-32℃保存后，含NaCl、甘氨酸或脯氨酸的10%IG/rHuPH20复合制剂中IG的分子大小分布
Figure BDA00001645193201302
Figure BDA00001645193201311
表44.于28-32℃保存后，含NaCl、甘氨酸或脯氨酸的20%IG/rHuPH20复合制剂中IG的分子大小分布
Figure BDA00001645193201312
实施例7
复合配制的rHuPH20和10%IG或20%IG在Yucatan小型猪中的作用
A.实验设计
确定在Yucatan小型猪中皮下给药与10%或20%免疫球蛋白(IG)溶液(130mM NaCl、10mM组氨酸,pH 6.6)复合配制的rHuPH20的可行性，并与Leading Edge给药（先rHuPH20然后IG溶液的连续给药）比较。还评价了使用数种rHuPH20浓度时各IG溶液的剂量反应。
将十八只体重为18.4–23.2kg的雄性Yucatan小型猪分配到表45显示的十一个治疗组中的一组或两组中，以使每一组使用三只猪。用10号90度软弯曲Huber针（soft bend Huber needle）将所有的制剂皮下给药于被麻醉的雄性猪的背部。对于Leading Edge给药，简单地变换注射器后，使用相同的针在相同的位置连续地先后注射rHuPH20和IgG。rHuPH20和IgG给药之间不需要或未进行延迟。以每注射部位110mL的最大体积在每一只猪上试验分别来自不同治疗组的最多两种不同的制剂。复合制剂的输注持续约20分钟而Leading Edge制剂的输注持续约22-28分钟。
表45.实验设计概要
Figure BDA00001645193201321
Figure BDA00001645193201331
给药后评价注射部位的观察结果。用压力传感器测量注射各制剂所施加的连续压力(mmHg)，并且采集血样用于全血细胞计数(CBC)和γ免疫球蛋白(IgG)分析。在研究结束时（即，给药后3天），对所有动物实施安乐死，并且从注射部位1、注射部位2和对照（从远离所述两个注射部位的位点采集）中的每一个位点采集两份切片样品（A和B）并且保存于10%的缓冲中性福尔马林中，并且通过光学显微镜(Nova Pathology，PC,San Diego,CA)来评价。位点A为穿过注射部位中心的2-3mm厚的切片。并且位点B是从所采集的注射部位末端采集的2-3mm厚的切片。
B.注射部位的观察结果
在单独给药10%IG的5分钟内（输注~25mL；组1），在所有三只猪上观察到明显的“水泡”。在单独给药10%IG后约10分钟（输注~25mL；组5），观察到明显的水泡。与单独给药IG相比，所观察到的所有包含rHuPH20的制剂（包括Leading Edge）的水泡形成面积增加，这表明当使用rHuPH20时存在更强的液体分散（表46）。
rHuPH20与10%和20%IG的复合制剂在所有rHuPH20浓度下引起皮肤硬化显著减轻（注射部位保持柔软），并且在所有rHuPH20浓度下皮肤的粉红/发红减轻。Leading Edge比较给药引起与复合制剂相似的粉红/发红观察结果。对于所有组而言，给药后观察到的注射部位出现的粉红/发红在24小时内完全恢复（表46）。
表46.注射部位的形态和分析
Figure BDA00001645193201332
Figure BDA00001645193201341
C.压力测量观察结果
表47总结了平均压力测量值。在2.5分钟时或单独给药20%IG后不久（组5），所有三只猪的压力均在可测量范围之外(>460mmHg)。在组6中，三只猪中的两只在可测量的压力范围之外，并且组7和组8各有一只猪在范围之外。组1和组2各有一只猪在范围之外。该结果表明，对于包含rHuPH20的所有复合制剂，完成注射所需要的压力降低。
表47.平均压力测量值分析
Figure BDA00001645193201342
Figure BDA00001645193201351
N/A=未获得，>460mmHg
N/A*=难以解释的压力记录的升高曲线
D.全血细胞计数和IgG血浆分析
在给药前(~2.0mL)和给药后30分钟将血采集到K3EDTA管内用于全血细胞计数(CBC)分析。将样品保存于4℃直到分析(Bioquant,Inc.,San Diego,CA)。CBC结果未表明任何与产品相关的具体安全问题。大多数猪保持在正常的CBC水平之内（参考SNS农场的正常CBC范围）。十八只猪中的五只的样品中无可见的血块并且不能进行评价。
给药前(~2.0mL)和实验结束时(~4.0mL)将用于γ免疫球蛋白(IgG)分析的血液采集到柠檬酸钠试管内以验证人IgG在皮下给药后的全身利用度。于4℃将样品于3000rpm离心10分钟，将血浆等分并将样品于-20℃保存直到进行分析。给药后3天，在所有动物中观察到IgG的整体增加，如表48所示。每一只猪的IgG血浆水平表示向每一只猪给药的两次不同治疗的平均值（除了猪7-9仅接受单次治疗）。
表48.IgG分析
Figure BDA00001645193201352
Figure BDA00001645193201361
E.组织病理学结果
组织学检查所见存在于表皮、真皮和皮下组织中并且包括混合白细胞型炎症、水肿和出血。基于以下方案将各组织学表现划定严重度等级。
不存在：0；存在，无等级的：0；极微：1；轻度：2；中度：3；明显：4。
将组织学检查所见根据发病率和平均组严重度评分总结于表49-51中。
表49.组织学检查所见总结：10%IG+rHuPH20
Figure BDA00001645193201362
Figure BDA00001645193201371
*受累切片的数量/所评价的切片的数量
**组内严重度评分总和除以该组内评价的切片数量
表50.组织学检查所见总结：20%IG+rHuPH20
Figure BDA00001645193201372
*受累切片的数量/所评价的切片的数量
**组内严重度评分总和除以该组内评价的切片数量
表51.组织学检查所见总结：Leading Edge给药
Figure BDA00001645193201381
*受累切片的数量/所评价的切片的数量
**组内严重度评分总和除以该组内评价的切片数量
定性而言，在本研究的每一个剂量组中，对IG和rHuPH20给药的反应是相似的。这些反应的特点为注射部位中皮下组织内的混合白细胞型炎症、水肿和出血。表52比较了所有剂量组的平均组严重度评分。
表52.平均组严重度评分总结
Figure BDA00001645193201382
基于平均组严重度评分，最严重的注射部位反应与100mL 10%IG（组1）的单独给药以及和300U/mL rHuPH20复合配制的50mL 20%IG的给药（组8）相关。与50、100和300U/mL rHuPH20复合配制的100mL 10%IG（组2-4）的给药反应与以下药剂的给药反应相似：单独的50mL 20%IG（组5）、与50和100U/mL rHuPH20复合配制的20%IG（组6和7），以及先10mL rHuPH20(150U/mL)然后100mL 10%IG的Leading Edge给药（组9）。然而，给药10或20mL rHuPH20(150U/mL)然后给药50mL 20%IG的Leading Edge给药（组10和11）比相似的复合制剂（组6和7）引起更严重的反应。对照皮肤的切片包含很少的组织学检查所见（这可归因于被注射的制剂从受试品注射部位的扩散）和与所述制剂无关的偶然发现。
F.总结
所述结果验证了在Yucatan小型猪中皮下给药与10%或20%IG复合配制的rHuPH20的可行性。虽然引起皮肤的中度至重度的硬化和粉红/发红，但是单独给药IG（10%或20%）是可行的。含rHuPH20的复合制剂导致完成注射所需要的压力降低，显著减轻了皮肤硬化并减轻了皮肤的粉红/发红。与单独给药IG相比，所观察到的包含rHuPH20的所有制剂的水泡形成面积相似或增加，这验证了当使用rHuPH20时存在较大的液体分散。Leading Edge给药是可行的，并且观察到与复合制剂相似的压力、粉红/发红和水泡面积。由给药引起的存在于深层皮下组织中的组织病理学检查所见包括混合白细胞型炎症、水肿和出血，最严重的反应与10%IG的单独给药以及和rHuPH20(300U/mL)复合配制的20%IG的给药相关。
由于修改对于本领域技术人员而言是显而易见的，所以应认为本发明仅受限于随附的权利要求的范围。
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Claims (55)

1.配制用来皮下给药的稳定的液体复合制剂组合物，其中所述组合物的pH为4或约4-5或约5，包括端值，并且包含：
浓度至少为10%w/v的免疫球蛋白(IG)；
浓度至少为50U/mL的可溶性透明质酸酶，并且其存在量足以供以下之用：以等于或大于静脉免疫球蛋白的静脉输注速率的输注速率在单个注射部位皮下给药所述组合物；以及
浓度至少为0.05M的碱金属盐酸盐，
由此所述复合制剂在最高32℃的温度下稳定至少6个月。
2.配制用来皮下给药的稳定的液体复合制剂组合物，其中所述组合物的pH为4或约4-5或约5，包括端值，并且包含：
浓度至少为10%w/v的免疫球蛋白(IG)；
浓度至少为50U/mL并且以至少100单位/克(U/g)IG的比例存在的可溶性透明质酸酶；以及
浓度至少为0.05M的碱金属盐酸盐，
由此所述复合制剂在最高32℃的温度下稳定至少6个月。
3.权利要求1或权利要求2的稳定的液体复合制剂，其还包含至少0.1M的量的氨基酸稳定剂。
4.权利要求3的稳定的液体复合制剂，其中所述氨基酸稳定剂选自丙氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸和脯氨酸。
5.权利要求3或权利要求4的稳定的液体复合制剂，其中所述氨基酸稳定剂是甘氨酸或脯氨酸。
6.权利要求1-5中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述氨基酸稳定剂的量为0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.6M、0.7M或0.75M，或者至少为0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.6M、0.7M或0.75M。
7.权利要求1-6中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述氨基酸稳定剂的量为0.25M。
8.权利要求1-7中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述IG为至少10%w/v、11%w/v、12%w/v、13%w/v、14%w/v、15%w/v、16%w/v、17%w/v、18%w/v、19%w/v、20%w/v、21%w/v、22%w/v或更多。
9.权利要求1-8中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述IG为10%w/v或约10%w/v-20%w/v或约20%w/v。
10.权利要求1-9中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述IG来自人血浆。
11.权利要求1-10中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述IG是通过包括醇分级分离在内的纯化方法从人血浆纯化而来的。
12.权利要求1-11中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述IG通过聚乙二醇(PEG)沉淀、离子交换色谱法、酶裂解、渗滤或超滤中的任何一种或多种被进一步纯化。
13.权利要求1-12中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述IG接受选自在有或无胃蛋白酶的条件下于pH 4.0温育、溶剂去污剂处理和纳米过滤的病毒清除步骤。
14.权利要求1-13中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述IG包含IgG、IgA和IgM。
15.权利要求1-14中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述IG包含大于95%的IgG。
16.权利要求1-15中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述碱金属盐酸盐选自KCl和NaCl。
17.权利要求1-16中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述碱金属盐酸盐是NaCl并且所述NaCl的浓度为0.025M、0.03M、0.04M、0.05M、0.08M、0.09M、0.1M、0.15M、0.2M或0.25M。
18.权利要求1-17中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述NaCl的浓度为0.15M。
19.权利要求1-18中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述可溶性透明质酸酶是PH20或其截短形式。
20.权利要求1-19中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述PH20选自羊PH20、牛PH20或截短的人PH20。
21.权利要求1-20中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述PH20是截短的人PH20并且所述截短的人PH20选自具有SEQ ID NO:4-9中任一序列所示的氨基酸序列的多肽、或者其等位基因变体或其他变体。
22.权利要求1-21中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述可溶性透明质酸酶的命名为rHuPH20。
23.权利要求1-22中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述可溶性透明质酸酶的浓度为50U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL或更高。
24.权利要求1-23中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述可溶性透明质酸酶的浓度为75U/mL或约75U/mL-350U/mL或约350U/mL。
25.权利要求1-24中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述可溶性透明质酸酶的比例为100U/g IG、150U/g IG、200U/g IG、250U/g IG、300U/g IG、400U/g IG、500U/g IG、600U/g IG、700U/g IG、800U/g IG、900U/g IG、1000U/g IG、1200U/g IG、1500U/g IG、1800U/g IG、2000U/g IG、3000U/g IG、4000U/g IG或5000U/g IG。
26.权利要求1-25中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述可溶性透明质酸酶的比例为250U/g、500U/g IG、1000U/g IG、1500U/g IG或3000U/g IG。
27.权利要求1-26中任一项的稳定的液体复合制剂，其为pH 4.4-4.9的浓缩形式。
28.权利要求1-27中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述复合制剂用于多剂量给药。
29.权利要求1-28中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述复合制剂用于单剂量给药。
30.权利要求1-27和权利要求29中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述IG的量足以用于单剂量给药以治疗IG可治疗的疾病或病症。
31.权利要求1-27和29-30中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述IG的量是足以用于每日、每周、每两周、每2-3周、每3-4周或每月单剂量给药以治疗IG可治疗的疾病或病症的量。
32.权利要求1-31中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述复合制剂中IG的量与静脉内给药治疗IG可治疗的疾病或病症时的单剂量给药的量基本相同。
33.权利要求1-32中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述复合制剂用于单剂量给药并且所述IG的量为1克(g)、2g、3g、4g、5g、10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g或200g，或为约1克(g)、2g、3g、4g、5g、10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g或200g，或为至少1克(g)、2g、3g、4g、5g、10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g或200g，或者为1-200、1-100、10-100、5-50、6-50、5-100g或约1-200、1-100、10-100、5-50、6-50、5-100g。
34.权利要求1-33中任一项的稳定的液体复合制剂，其中所述复合制剂用于单剂量给药并且所述组合物中透明质酸酶的量为500单位、1000单位、2000单位、5000单位、10000单位、30000单位、40000单位、50000单位、60000单位、70000单位、80000单位、90000单位、100000单位或更多，或者约500单位、1000单位、2000单位、5000单位、10000单位、30000单位、40000单位、50000单位、60000单位、70000单位、80000单位、90000单位、100000单位或更多，或者至少500单位、1000单位、2000单位、5000单位、10000单位、30000单位、40000单位、50000单位、60000单位、70000单位、80000单位、90000单位、100000单位或更多。
35.权利要求1-34中任一项的稳定的液体复合制剂，其在28℃-32℃下稳定6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间。
36.权利要求1-35中任一项的稳定的液体复合制剂，其还在0℃-10℃下稳定6个月、1年、2年或更长的时间。
37.药盒，其包含权利要求1-36中任一项的稳定的液体复合制剂和任选存在的使用说明书。
38.容器，其包含权利要求1-36中任一项的稳定的液体复合制剂。
39.权利要求38的容器，其为管、瓶子或小瓶。
40.权利要求38的容器，其为注射器。
41.权利要求38-40中任一项的容器，其还包括注射针。
42.权利要求38-41中任一项的容器，其中将所述稳定的液体复合制剂提供用于单剂量给药或多剂量给药。
43.药盒，其包含权利要求38-42中任一项的容器和用于输注所述组合的装置。
44.治疗IG可治疗的疾病或病症的方法，其包括向个体皮下给药权利要求1-36中任一项的稳定的液体复合制剂。
45.权利要求44的方法，其中给药所述复合制剂使得IG的给药量与静脉内给药治疗IG可治疗的疾病或病症时的量基本相同。
46.权利要求44-45的方法，其中所述IG可治疗的疾病或病症选自原发性免疫缺陷病、继发性免疫缺陷病、炎性疾病、自身免疫疾病和急性感染。
47.权利要求44-46中任一项的方法，其中所述IG可治疗的疾病或病症是原发性免疫缺陷病并且所述原发性免疫缺陷病选自普通变异型免疫缺陷病(CVID)、选择性IgA缺陷、IgG亚类缺陷、特异性抗体缺陷、补体病、先天性无丙种球蛋白血症、共济失调性毛细血管扩张症、高IgM、维-奥二氏综合征、重症联合免疫缺陷(SCID)、原发性低丙种球蛋白血症、伴有抗体缺乏的原发性免疫缺陷病、X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)或婴儿低丙种球蛋白血症。
48.权利要求44-47中任一项的方法，其中所述IG可治疗的疾病或病症是继发于血液恶性肿瘤的获得性免疫缺陷病并且所述血液恶性肿瘤选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
49.权利要求44-48中任一项的方法，其中所述IG可治疗的疾病或病症是炎性疾病或自身免疫疾病并且所述炎性疾病或自身免疫疾病选自川崎病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、格林-巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、多肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎、朗-爱二氏肌无力综合征、多灶性运动神经病、重症肌无力以及默-沃二氏综合征。
50.权利要求44-49中任一项的方法，其中所述IG可治疗的疾病或病症是急性的细菌感染、病毒感染或真菌感染并且所述急性的细菌感染、病毒感染或真菌感染选自B型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）；A型和B型铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；B型链球菌；1型、3型、4型、6型、7型、8型、9型、12型、14型、18型、19型和23型肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）；2型和5型腺病毒；巨细胞病毒；非洲淋巴细胞瘤病毒VCA；甲型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；单纯疱疹病毒-1；单纯疱疹病毒-2；A型流感病毒；麻疹；1型、2型和3型副流感病毒；脊髓灰质炎病毒；水痘带状疱疹病毒；曲霉菌属（Aspergillus）以及白色念珠菌（Candida albicans）。
51.权利要求44-50中任一项的方法，其中所述IG可治疗的疾病或病症选自医源性免疫缺陷、急性播散性脑脊髓炎、ANCA-阳性系统性坏死性血管炎、自身免疫性溶血性贫血、大疱性类天疱疮、疤痕性类天疱疮、伊文思综合征（包括伴有免疫性血小板减少症的自身免疫性溶血性贫血）、胎-母/新生儿同种免疫性血小板减少症(FMAIT/NAIT)、噬血细胞综合征、高风险同种异体造血干细胞移植、IgM副蛋白血症神经病、肾移植、多发性硬化症、视性眼阵挛-肌阵挛共济失调、落叶性天疱疮、寻常型天疱疮、输血后紫癜、中毒性表皮坏死松解症/史-约综合征(TEN/SJS)、中毒性休克综合征、阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤、败血症、B细胞瘤、无抗体的副肿瘤性小脑变性以及骨髓移植。
52.权利要求1-36中任一项的稳定的液体复合制剂用于配制治疗IG可治疗的疾病或病症的药物的用途。
53.权利要求52的用途，其中所述IG可治疗的疾病或病症选自原发性免疫缺陷病、继发性免疫缺陷病、炎性疾病、自身免疫疾病和急性感染。
54.权利要求1-36中任一项的稳定的液体复合制剂，其用于治疗IG可治疗的疾病或病症。
55.权利要求54的稳定的液体复合制剂，其中所述IG可治疗的疾病或病症选自原发性免疫缺陷病、继发性免疫缺陷病、炎性疾病、自身免疫疾病和急性感染。
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