CN109415714A - 体内使用软骨素酶和/或透明质酸酶以增强药剂的递送 - Google Patents

体内使用软骨素酶和/或透明质酸酶以增强药剂的递送 Download PDF

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Abstract

本文公开了向受试者递送药剂的方法。本文还公开了治疗受试者的疾病或病症的方法。所述方法可包括以足以降解糖胺聚糖的量向所述受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸，并向所述受试者施用所述药剂。所述方法还可包括施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶的多核苷酸。

Description

体内使用软骨素酶和/或透明质酸酶以增强药剂的递送
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年4月29日提交的美国临时申请号62/329,593、2016年5月13日提交的美国临时申请号62/336,501和2017年4月21日提交的美国临时申请号62/488,605的优先权，所述临时申请各自以引用的方式整体并入。
技术领域
本公开涉及药剂的递送。本公开还涉及预防和/或治疗受试者的疾病。方法可包括施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂。方法可包括施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。方法可包括施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸、透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸，和药剂。
背景技术
糖胺聚糖(GAG)是细胞外基质(ECM)的复杂线性多糖。GAG的特征在于N-取代的己糖胺和糖醛酸(在例如透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)、软骨素(C)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(H)中)或半乳糖(在例如硫酸角质素(KS)中)的重复二糖结构。除透明质酸之外，所有存在均与核心蛋白共价结合。具有其核心蛋白的GAG在结构上被称为蛋白聚糖(PG)。
硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)是细胞外基质的主要组分，并且具有多种功能作用。例如，CSPG通常从细胞分泌并且是多种人组织(包括软骨)的结构组分，并且已知参与某些细胞过程，诸如细胞粘附、细胞生长、受体结合、细胞迁移和与其他细胞外基质组分相互作用。这些其他细胞外基质组分可以是层粘连蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白和/或胶原蛋白。透明质酸也是细胞外基质的主要组分中的一种，尤其是在软结缔组织中。在结缔组织中，与透明质酸相关的水合水在组织之间产生空间，由此产生有利于细胞运动和增殖的环境。透明质酸在与细胞运动相关的生物现象(包括快速发育、再生、修复、胚胎发生、胚胎发育、伤口愈合、血管生成、细胞调节、细胞发育、细胞分化和细胞迁移)中起关键作用。透明质酸的产生增加了增殖细胞，并可在肿瘤发生中起作用。
细胞外基质包括蛋白质和多糖分子，其组装在大多数组织的细胞外空间中的密集、有组织的网络中。作为细胞外基质的主要组分中的一种，CSPG和透明质酸通过其粘性溶液形成特性对细胞外基质的特征施加影响。本领域仍需要一种穿过组织和细胞外基质以便以安全、成本有效和高效的方式向受试者递送药剂的方法。
发明内容
本发明的方面包括用于向受试者递送药剂的方法，其中所述方法包括以足以降解硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)的量向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸，并且向受试者施用药剂。CSPG可以是例如，聚集蛋白聚糖(Aggrecan)(CSPG1)、多功能蛋白聚糖(Versican)(CSPG2)、神经蛋白聚糖(Neurocan)(CSPG3)、CSPG4(黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖，NG2)、CSPG5、SMC3(CSPG6，染色体3的结构维持)、短蛋白聚糖(Brevican)(CSPG7)、CD44(CSPG8，分化簇44)、磷酸蛋白聚糖(Phosphacan)或其组合。药剂可在受试者中诱发免疫应答或增强免疫应答。
本发明的其他方面包括治疗受试者的疾病或病症的方法，其中所述方法包括向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸；并且向受试者施用药剂。
在本文所述的任何方法中，药剂可以是例如多核苷酸、多肽、小分子或其组合。药剂可包括多核苷酸。多核苷酸可编码单克隆抗体。药剂可包括多肽。多肽可包括单克隆抗体。单克隆抗体可在体内表达。药剂可通过电穿孔向受试者施用。
软骨素酶多肽和单克隆抗体可由相同的多核苷酸或单独的多核苷酸编码。编码软骨素酶多肽的多核苷酸和编码单克隆抗体的多核苷酸可包含在相同的载体或单独的载体中。
在本文所述的任何方法中，可在施用药剂之前向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸。可在施用药剂之前至少约15分钟至约24小时向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸。可并行地向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂。可通过皮下或肌肉内向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂。软骨素酶多肽或由多核苷酸编码的软骨素酶多肽水解CSPG并导致受试者的细胞外基质的解体。
本发明的其他方面还包括以足以降解糖胺聚糖的量在本文所述的任何方法中施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。糖胺聚糖可包括透明质酸。透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸可与软骨素酶同时施用。可在施用药剂之前向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。可在施用药剂之前至少约15分钟至约24小时向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。可并行地向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。可通过皮下或肌肉内向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。
可在施用之前共配制软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂。可在施用之前共配制软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸、透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。
本公开提供了根据以下详细描述和附图将显而易见的其他方面和实施方案。
附图说明
图1示出了第1组至第4组(Balb/c小鼠，6-7周)中在0-7天之间通过ELISA测量的hIgG水平(ng/ml)。第1组(灰色)PBS和pGX9214，第2组透明质酸酶预处理和pGX9214(蓝色)，第3组软骨素酶和pGX9214(绿色)，第4组透明质酸酶/软骨素酶预处理和pGX9214(棕色)。
图2示出了第1组至第4组(C57BL/6，6-7周)中在0-7天之间通过ELISA测量的hIgG水平(ng/ml)。第1组(灰色)PBS和pGX9214，第2组透明质酸酶预处理和pGX9214(蓝色)，第3组软骨素酶和pGX9214(绿色)，第4组透明质酸酶/软骨素酶预处理和pGX9214(棕色)。
图3示出了第1组至第4组中在0-21天之间通过ELISA测量的hIgG水平(ng/ml)。第1组(灰色)PBS和pGX9214，第2组透明质酸酶预处理和pGX9214(暗红色)，第3组软骨素酶和pGX9214(亮红色)，第4组透明质酸酶/软骨素酶预处理和pGX9214(玫瑰色-Hartley豚鼠)。
图4示出了第1组至第4组中单个豚鼠中在0-21天之间通过ELISA测量的hIgG水平(ng/ml)。图4A：第1组PBS。图4B：第2组用400U/ml的透明质酸酶预处理。图4C：第3组软骨素酶(0.5U/ml)。图4D：第4组透明质酸酶400U/ml和软骨素酶0.5U/ml预处理。
图5示出了软骨素酶增强了Balb/c小鼠中质粒编码的hlgG表达。(a)第1组和第2组(Balb/c小鼠，6-7周)中在0-7天之间通过ELISA测量的hIgG水平[ng/ml]。第1组(灰色)PBS和pGX9214，第2组软骨素酶预处理和pGX9214(黑色)。(b)在第7天通过软骨素酶显著增强hIgG。通过曼-惠特尼(Mann Whitney)检验进行统计，P＝0.0079。
图6示出了软骨素酶增强了C57BL/6小鼠中质粒编码的hIgG表达。(a)第1组和第2组(Balb/c小鼠，6-7周)中在0-7天之间通过ELISA测量的hIgG水平[ng/ml]。第1组(灰色)PBS和pGX9214，第2组软骨素酶预处理和pGX9214(黑色)。(b)在第7天通过软骨素酶显著增强hIgG。通过曼-惠特尼检验进行统计，P＝0.0079。
图7示出了不同形式(version)的软骨素酶增强DMAb表达的能力的研究。图表示第1-4组(Balb/c)中在第7天通过ELISA测量的hIgG水平(ng/ml)。用PBS(对照组1)、软骨素酶AC、临床级软骨素酶ABC或重组蛋白GALNS处理小鼠。所有组均接受pGX9203注射，随后进行电穿孔。通过Kruskal-Wallis检验进行统计，**P＝0.0026。
图8示出了增加的软骨素酶ABC剂量进一步增强了基于DNA的蛋白质表达。在pDNA(pGX9207)注射和电穿孔前30分钟，用增加剂量的软骨素酶ABC处理Balb/c小鼠。通过ELISA测量hIgG的水平。通过Kruskal-Wallis检验进行统计，*P＝0.0357。
图9示出了软骨素酶施用导致增强的荧光蛋白表达。(a)用软骨素酶或PBS进入骨骼肌处理Balb/c小鼠的左后肢和右后肢。通过荧光成像仪(Protein Simple)进行报告蛋白表达的可视化。(b)任意单位荧光强度平行报告基因表达，并通过使用AlphaView SA软件定量。通过曼-惠特尼检验进行统计，P＝0.0022。
图10示出了通过H&E染色进行的鼠后肢骨骼肌的代表性组织病理学。顶图示出了仅用PBS(对照)或仅用软骨素酶ABC处理的组织。在pDNA递送之前用软骨素酶或PBS(对照)预处理(30分钟)的肌肉在底图中呈现。通过幻灯片扫描仪和CaseViewer软件(3DHISTECH)分析结果。比例尺＝200μm。
图11示出了软骨素酶ABC增强了新西兰兔(9周)中质粒编码的hIgG表达。(a)呈现的是第2组(软骨素酶预处理，灰色)和第1组(PBS对照，黑色)中在第0天与第6天之间通过ELISA测量的hIgG水平[ng/ml]。(b)图示出了通过ELISA测量的第6天的hIgG水平。通过曼-惠特尼检验进行的统计，P＝0.0043。
图12示出了小鼠(Balb/c；每组14只小鼠)中软骨素酶与pDNA(pGX9207)的共配制剂。图示出了通过ELISA测量的第6天的hIgG水平[ng/ml]。通过曼-惠特尼检验进行统计，****P<0.0001。
图13示出了软骨素酶施用导致增强的荧光蛋白表达。(a)用软骨素酶或PBS进入骨骼肌处理Balb/c小鼠的左后肢和右后肢。通过荧光成像系统进行报告蛋白表达的可视化。(b)任意单位荧光强度平行报告基因表达，并通过使用AlphaView SA软件定量。通过曼-惠特尼检验进行的统计，**P＝0.0004。
图14示出了兔(新西兰兔；每组6只兔)中软骨素酶与pDNA(pGX9207)的共配制。(a)图示出了通过ELISA测量的第0天至第5天的血清hIgG水平[ng/ml]。第1、2和4组的比较。(b)在第5天测量的所有组的兔血清hIgG水平。通过曼-惠特尼检验进行统计，****P<0.0001。
图15示出了软骨素酶(2.5U/ml)/pDNA(pGX9207，250ng/孔)共配制样品的琼脂糖凝胶电泳。(a)偶数泳道呈现含有软骨素酶ABC的pDNA样品，奇数泳道是指PBS阴性对照。泳道1-2：在凝胶电泳前没有孵育样品，泳道3-4：在室温(21℃)下孵育10分钟，泳道5-6：6℃，120分钟，泳道7-8：室温，120分钟，泳道9-10：6℃，24小时，泳道11-12：室温，24小时，泳道13-14：6℃，10分钟。M1＝标准。(b)超螺旋DNA梯，2-10kb(New England Biolabs)。
图16示出了储存软骨素酶/pDNA共配制剂24小时不影响Balb/c小鼠中增强的基因表达。图表示在第6天通过ELISA测量的血清hIgG水平(ng/ml)。用共配制剂进入左后肢骨骼肌中处理小鼠，并在药物注射1分钟后进行电穿孔。在处理之前，将共配制剂样品在4℃下孵育10分钟、120分钟和24小时。对照：在pDNA施用和电穿孔之前30分钟用软骨素酶或PBS预处理小鼠。通过Kruskal-Wallis检验进行统计，****P＝0.0001。
图17示出了第1、2和3组中在0-28天之间通过ELISA测量的hIgG水平(ng/ml)。第1组用pDVSF-1和透明质酸酶预处理，第2组仅用pDVSF处理，并且第3组仅用PBS处理。
图18示出了第1组和第2组的抗hIgG结合效价。
图19示出了实施例2中第1-3组PBMC中对流感NP肽库的平均(+/-SEM)IFN-γ(斑点/百万)响应。
图20示出了实施例2中第1-3组的抗流感NP IgG结合效价。
图21示出了铜绿假单胞菌急性肺炎模型。抗PcrV或DMAb-抗体1-2质粒DNA的电穿孔在小鼠中产生活性IgG的表达。观察到抗假单胞菌DMAb和DMAb-抗体1-2IgG两者的有效保护活性。
图22示出了血清中DMAb表达的IgG定量。在铜绿假单胞菌感染之前评估血清的DMAb表达。尽管存活率相似，但抗PcrV DMAb表达比DMAb-抗体1-2高5倍。
图23示出了抗假单胞菌DMAb降低了器官负荷。DMAb-抗体1-2和IgG降低了肺部负荷。抗PcrV和DMAb抗体1-2显著减少了细菌的全身传播。感染后24小时收集组织。LOD＝检测限；*＝通过Kruskal-Wallis和Dunn多重比较检验与对照IgG DMAb相比P<0.05。
图24示出了感染后48小时的急性肺炎的组织学(H&E)。A.对照IgG肺表现出由中性粒细胞和巨噬细胞和出血构成的严重肺泡浸润区域(10x)。C.轻度肺炎和偶尔的细支气管碎片(10x)。E.具有轻度肺泡炎的DMAb-抗体1-2DNA组(10x)。B、D、F。分别距离A.C.D.40x处插入。
图25示出了DMAb-抗体1-2表现出浓度依赖性保护活性。A.在EP之前，动物在1、2或3个部位处接受DNA。B.血清IgG的定量。*表示通过Log-Rank检验P<0.05。
图26示出了亚治疗剂量的DMAb-抗体1-2和美罗培南(MEM)表现出增强的针对铜绿假单胞菌肺炎的活性。在EP之前，动物在1、2或3个部位处接受DNA。B.血清IgG的定量。*表示通过Log-Rank检验P<0.05。
图27示出了pGX2013免疫后14天脾细胞中对NP55和NP147肽表位的平均(+/-SEM)IFN-γ(斑点/百万)响应。
图28示出了用pGX2013免疫后7和14天所述组的抗NP IgG结合效价。
图29示出了抗MERS-CoV人IgG的体外表达。(a)抗MERS-CoV抗原DMAb质粒DNApMERS的示意图。CMV启动子位于由弗林蛋白酶和2A切割位点分开的抗体重链和轻链序列的上游。(b和c)用1μg/ml pVax或pMERS转染293T细胞培养物，并且在48小时后收获培养上清液。(b)通过ELISA测定上清液中的人IgG水平。(c)通过ELISA测量IgG与MERS CoV抗原的结合。
图30示出了在BALB/c小鼠中DMAb的体内表达增强
(a)通过仅注射(无EP)、(b)用EP注射(EP)和(c)用EP注射到透明质酸酶处理的肌肉中(EP+透明质酸酶)，将6.25至100μg的pMERS施用到BALB/c小鼠(每组4-8只小鼠)的TA肌肉内。(a-c)在pMERS递送后第6天通过ELISA定量血清人IgG水平(数据点代表平均值+/-SEM)。(d)在pMERS递送后第0天和第6天通过ELISA测量的倒数血清稀释度的MERS CoV抗原结合。(e)在分别使用(a)、(b)或(c)中采用的方案或在插图1-4中不进行处理施用pRFP(25μg)报告基因后72小时收获BALB/c小鼠TA肌肉。图像说明报告基因表达。用由EP+透明质酸酶递送的pMERS或pVax(100μg)处理并在72小时后收获的TA肌肉切片的免疫荧光图像(f)。用抗人IgG检测hIgG，随后用FITC标记的二抗(绿色)检测。DAPI染成蓝色。图1.不进行处理。图2.pVax。图3和4.pMERS。图1-3显示了垂直于肌纤维的横截面图像，并且在图4中，所述图像沿着肌纤维显示。
图31示出了在Crl:Nu-Foxn1nu小鼠中增加和持续的DMAb表达。用EP将6.25至100μg pMERS施用到Crl:Nu-Foxn1nu小鼠(每组8只小鼠)的透明质酸酶预处理的TA肌肉内。在第0至第160天通过ELISA定量血清hIgG(a)。(b)如(a)中向1(左侧TA)、2(右侧和左侧TA)、3(右侧和左侧TA，以及左侧四头肌)或4(右侧和左侧TA，以及左侧和右侧四头肌)肌肉施用100μgpMERS。在第21天通过ELISA定量血清hIgG。
图32示出了新西兰白兔的体内DMAb表达。(a)在PBS-(顶图)或透明质酸酶-(底图)处理的肌肉中用EP递送pGFP(0.2mg)后72小时兔TA肌肉切片中的报告基因表达。(b和c)用EP将2mg pMERS施用到兔(每组6只)的四头肌(用PBS或透明质酸酶预处理)内。在第3、5和6天定量血清hIgG(a)，并在递送后第6天通过ELISA测量MERS CoV抗原结合(b)。(c)在20至65V的电压设定下，用EP将2mg pMERS施用到兔(每组6只)的四头肌(用透明质酸酶处理)内，并在递送后第5天定量血清hIgG。(c和d)值表示为平均值+/-SEM(n＝6/组)。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，并且ns＝不显著。P值来自非配对的双尾曼-惠特尼检验。
图33示出了恒河猴的体内DMAb表达。用EP将13.5mg pMERS施用到恒河猴(每组5只)的四头肌(用透明质酸酶预处理)内。定量血清hIgG(a)并在第0至第35天通过ELISA测量MERS CoV抗原结合(b)，并且对于每只恒河猴，在第17天测量倒数血清稀释度(c)。(d)通过直接ELISA在恒河猴的血清中测量对人IgG(ADA)的抗体应答。(e)描绘了血清中DMAb水平和抗人IgG抗体结合水平的相关性。绘制的是在每只恒河猴中达到峰值hIgG(μg/ml)值之后并包括其的数据点(hIgG(μg/ml)与相应的ADA(OD450nm))。使用GraphPad Prism 6软件计算的P值和Spearman相关系数。
图34示出了BALB/c小鼠中DMAb的体内表达动力学。(a-c)(a)通过仅注射(无EP)、(b)用EP注射(EP)和(c)用EP注射到透明质酸酶处理的肌肉中(EP+透明质酸酶)，将6.25至100μg的pMERS施用到BALB/c小鼠(每组4-8只小鼠)的TA肌肉内。(a-c)在pMERS递送后第0至第14天通过ELISA定量血清人IgG水平(数据点代表平均值+/-SEM)。
图35示出了pMERS处理的BALB/c小鼠中对人IgG的抗抗体应答。在用EP递送pMERS后第0至第14天，通过直接ELISA在BALB/c小鼠血清中测量对人IgG的抗体应答(ADA)。
图36示出了报告的pDNA递送试剂的筛选以增强基因表达。将100μg pMERS施用到BALB/c小鼠(每组5只小鼠)的TA肌肉内。分别在第1、2、5、7、8和9组中在pMERS递送之前30分钟用PBS、透明质酸酶、7％蔗糖、胶原酶D、弹性蛋白酶或MMP7预处理靶TA肌肉。将pMERS与聚-L-谷氨酸(第3组)或Tempol(第4组)或(OH)3D3(第6组)共配制，并且不进行预处理。在pMERS递送后第6天通过ELISA定量血清人IgG水平(数据点代表平均值+/-SEM)。
图37示出了兔中的DMAb表达。(a和b)用EP将2mg pGX9207施用到新西兰白兔(每组6只)的四头肌(用透明质酸酶预处理)内。在第0至第10天通过ELISA测定血清hIgG(a)和抗人IgG(ADA)结合(b)。
图38示出了兔中透明质酸酶与pDNA的共配制剂的研究。每组六只新西兰白兔。左侧四头肌中2mg pGX9207。两个部位。透明质酸酶(Intropharma)200U/部位。-5P pDNA/透明质酸酶在施用前5分钟共配制。在第5天采血样。实验编号INO-16-158b。
图39示出了具有EP延迟的兔中透明质酸酶与pDNA的共配制剂。每组六只新西兰白兔。左侧四头肌中2mg pGX9207。两个部位。透明质酸酶(Intropharma)200U/部位。-5P pDNA/透明质酸酶在施用前5分钟共配制。在第5天采血样。实验编号INO-16-158a。
图40示出了恒河猴中透明质酸酶与pDNA的共配制剂。用-5P将pGX9207(pMERS)递送至四头肌内。4个部位。1mg pDNA/部位。Intropharma(牛睾丸纯化透明质酸酶)。pDNA/透明质酸酶在施用前5分钟共配制。实验编号INO-16-194。
图41示出了用Hylenex(人重组透明质酸酶)优化EP延迟。pGX9207透明质酸酶共配制剂。左侧四头肌中的两个处理。描绘了第5天hIgG血清水平。实验编号INO-16-279。
图42示出了透明质酸酶共配制剂的DNA疫苗剂量节约效应。BALB/c小鼠。第0天流感pNP IM CELLECTRA-3P，第7天和第14天ELISA。实验编号INO-16-218。
图43示出了用DNA疫苗透明质酸酶制剂增强对肿瘤抗原的免疫应答。B6小鼠。第0天和第14天pmTERT IM-3P，第21天针对天然小鼠TERT肽库的IFN-γELISpot。实验编号INO-17-018。
具体实施方式
本发明涉及组合物和向受试者递送药剂的方法。所述方法可包括以足以水解CSPG的硫酸酯基团的量向受试者施用药剂和软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸。软骨素酶可水解受试者中CSPG的硫酸酯基团。这种解体可能导致细胞外基质的解体，并且从而促进药剂的递送。方法还可包括向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。
本发明还涉及将透明质酸酶与药剂一起向受试者施用。透明质酸酶可作为多肽或作为编码透明质酸酶或其片段或变体的核酸施用。透明质酸酶可促进药剂向受试者的递送。因此，透明质酸酶可增强受试者中的免疫应答和/或增强受试者中药剂的表达。
1)定义
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语均具有本领域的普通技术人员通常理解的相同含义。当发生冲突时，以本文件(包括定义)为准。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述了优选的方法和材料。本文提及的所有公布、专利申请、专利以及其他参考文献以引用的方式整体并入。本文公开的材料、方法和实施例仅是示例性的，并不意图为限制性的。
如本文所用，术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”以及其变化形式意图是不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语或词语。除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数个指示物。本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方案或要素”、“由本文所呈现的实施方案或要素组成”以及“主要由本文所呈现的实施方案或要素组成”的其他实施方案，无论是否明确地阐述。
如本文所用的术语“约”在应用于一个或多个感兴趣的值时，是指与所说明参考值类似的值。在某些方面中，术语“约”是指在所说明的参考值的任一方向上的(大于或小于)20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文显而易见(除了这样的数值将超过可能值的100％)。
“抗体”可意指类别IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd以及单链抗体及其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样品中分离出的抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，其对所需的表位或从其衍生的序列表现出足够的结合特异性。抗体可以是如本文所述的合成抗体。
如本文可互换使用的“抗体片段(Antibody fragment)”或“抗体片段(fragmentof an antibody)”是指包含抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分。所述部分不包括完整抗体Fc区的恒定重链结构域(即CH2、CH3或CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、双抗体、单链Fv(scFv)分子、仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽、含有轻链可变结构域的三个CDR的单链多肽、仅含有一个重链可变区的单链多肽，以及含有重链可变区的三个CDR的单链多肽。
如本文所用的“片段”意指编码能够在哺乳动物中引发免疫应答的多肽的核酸序列或其部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白质片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。“片段”还可指能够在哺乳动物中引发免疫应答的多肽序列或其部分。
如本文所用的“免疫应答”意指响应于抗原的引入而产生的宿主的免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)的活化。所述免疫应答可以是细胞应答或体液应答或两者的形式。
如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况下进行调整。
如本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的或天然与合成的修饰或组合。
如本文所用的“多核苷酸”或“寡核苷酸”或“核酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。多核苷酸可以是单链或双链的，或者可以含有双链或单链序列两者的部分。多核苷酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体。多核苷酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤)的组合，以及合成或非天然存在的核苷酸和核苷。多核苷酸可以通过化学合成方法或通过重组方法来获得。
如本文所用的“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可以包含一个或多个特定的转录调控序列以进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可包含远端增强子或阻遏元件，它们可位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以调控基因组分相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达所处的发育阶段或响应于外部刺激(诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地或差异性地表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40后期启动子以及CMV IE启动子。
如本文所用的“受试者”可以意指哺乳动物。哺乳动物可以是人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。
如本文所用的“治疗(Treatment)”或“治疗(treating)”可以意指通过预防、抑制、阻遏的手段保护动物免于疾病或完全消除疾病。预防疾病可以包括在疾病发作之前向动物施用本发明的组合物。抑制疾病涉及在疾病诱发之后但在其临床出现之前向动物施用本发明的组合物。阻遏疾病涉及在疾病的临床出现之后向动物施用本发明的组合物。
如关于核酸在本文中使用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列大致相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其大致相同的序列杂交的核酸。
“变体”还可以定义为通过氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上有所不同但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体还可以意指具有与参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述参考蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。这些微小变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水性指数来鉴定，如本领域中所理解的(Kyte等,J.Mol.Biol.1982,157,105-132)。所述氨基酸的亲水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。在一个方面，亲水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以用于揭示将产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用度量。如本领域所了解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可以用具有彼此在±2内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者均受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于所述氨基酸的相对相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其他特性所揭示的。
变体可以是在全基因序列或其片段的全长上大致相同的核酸序列。核酸序列可在基因序列的全长或其片段上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变体可以是在氨基酸序列的全长或其片段上大致相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在氨基酸序列的全长或其片段上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA质粒。
对于本文数值范围的叙述来说，明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于范围6-9，除6和9之外还涵盖数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
2)使用软骨素酶以增强药剂递送
本发明涉及将软骨素酶与药剂一起向受试者施用。软骨素酶可作为多肽或作为编码软骨素酶或其片段或变体的核酸施用。软骨素酶可促进药剂向受试者的递送。因此，软骨素酶可增强受试者中的免疫应答和/或增强受试者中药剂的表达。
a)软骨素酶
可向受试者施用软骨素酶或其片段。软骨素酶可以是任何软骨素酶。例如，软骨素酶可以是N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶或软骨素ABC裂解酶。软骨素酶可以是软骨素酶AC。软骨素酶可以是重组软骨素酶。软骨素酶可催化硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)的水解。软骨素酶可水解硫酸软骨素和/或硫酸皮肤素的N-乙酰基-D-半乳糖胺4-硫酸酯单元的4-硫酸酯基团。软骨素酶可水解N-乙酰葡糖胺4-硫酸酯的4-硫酸酯基团。软骨素酶可水解硫酸软骨素的N-乙酰基-D-半乳糖胺6-硫酸酯单元和硫酸角蛋白的D-半乳糖-6-硫酸酯单元的6-硫酸酯基团。软骨素ABC裂解酶可催化含有1,4-β-D-己糖胺基和1,3-β-D-葡糖醛酰基或1,3-α-L-艾杜糖醛酸基键的多糖降解为含有4-脱氧-β-D-葡萄糖-4-醛酸糖基的二糖。软骨素ABC裂解酶可作用于4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素和硫酸皮肤素。
CSPG可以是聚集蛋白聚糖(CSPG1)、多功能蛋白聚糖(CSPG2)、神经蛋白聚糖(CSPG3)、CSPG4(黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖，NG2)、CSPG5、SMC3(CSPG6，染色体3的结构维持)、短蛋白聚糖(CSPG7)、CD44(CSPG8，分化簇44)、磷酸蛋白聚糖及其组合。
通过催化CSPG(细胞外基质(ECM)的组分)的水解，软骨素酶降低CSPG和细胞外基质的粘度，从而增加组织渗透性。施用软骨素酶或编码软骨素酶的多核苷酸可导致CSPG水解，从而导致受试者细胞外基质的解体。由此，受试者的细胞外基质的解体可促进药剂的递送或施用。
软骨素酶可以是源自细菌的软骨素酶。细菌可以是例如肝素黄杆菌。软骨素酶可在细菌中重组产生。
在一些实施方案中，可施用软骨素酶多肽或其片段。
在一些实施方案中，可施用编码软骨素酶多肽或其片段的多核苷酸。软骨素酶多肽可由编码软骨素酶多肽的多核苷酸体内表达。
3)透明质酸酶的使用
所述方法还可包括以降解糖胺聚糖(诸如透明质酸)的量向受试者进一步施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。例如，施用软骨素酶和透明质酸酶可导致对受试者血清中的药剂表达、免疫应答或药剂浓度产生累加或协同效应。例如，与用单一软骨素酶或透明质酸酶处理的受试者中的药剂血清水平相比，在暴露于软骨素酶和透明质酸酶组合处理的受试者血清中检测到的药剂浓度可更高。
本发明还涉及将透明质酸酶与药剂一起向受试者施用。透明质酸酶可作为多肽或作为编码透明质酸酶或其片段或变体的核酸施用。透明质酸酶可促进药剂向受试者的递送。因此，透明质酸酶可增强受试者中的免疫应答和/或增强受试者中药剂的表达。向受试者施用透明质酸酶的方法可包括或不包括施用软骨素酶。药剂可以是如本文所述的任何药剂。如本文所述，透明质酸酶的使用可与任何药剂、所述的施用时间、施用模式、治疗方法或递送方法结合。
可并行地向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸可与软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂并行地施用。递送方法和施用时间可与本文所述的那些相同或相似。例如，参见章节4b)。
可连续地向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。可连续地向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸以及药剂。递送方法和施用时间可与本文所述的那些相同或相似。例如，参见章节4b)。可在施用之前共配制软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸、透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。可在施用之前共配制软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸、透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂的任何共配制可在施用之前例如1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、45分钟、1小时、5小时、10小时、24小时、5天、7天、20天、30天、40天、50天、100天、200天、300天、1年、400天、1.5年或2年进行。软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂的任何共配制可在施用之前例如1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、45分钟、1小时、5小时、10小时、24小时、5天、7天、20天、30天、40天、50天、100天、200天、300天、1年、400天、1.5年或2年进行。透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂的任何共配制可在施用之前例如1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、45分钟、1小时、5小时、10小时、24小时、5天、7天、20天、30天、40天、50天、100天、200天、300天、1年、400天、1.5年或2年进行。软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸的任何共配制可在施用之前例如1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、45分钟、1小时、5小时、10小时、24小时、5天、7天、20天、30天、40天、50天、100天、200天、300天、1年、400天、1.5年或2年进行。
可以通过电穿孔(EP)，诸如通过美国专利号7,664,545中所述的方法来施用软骨素酶和/或透明质酸酶和/或药剂，所述专利的内容以引用的方式并入本文。电穿孔可以通过美国专利号6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所述的方法和/或装置来进行，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。可通过微创设备来进行电穿孔。例如，电穿孔可在施用软骨素酶和/或透明质酸酶和/或药剂之前或之后进行。例如，电穿孔可伴随施用软骨素酶和/或透明质酸酶和/或药剂进行。软骨素酶、透明质酸酶、药剂或其任何共配制剂的施用与EP之间可能存在延迟。例如，EP可在施用软骨素酶、透明质酸酶、药剂、抗原或其任何共配制剂后5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或5分钟施用
透明质酸酶可指降解透明质酸的多肽。“透明质酸(hyaluronic acid)”和“透明质酸(hyaluronan)”在本文中可互换使用。透明质酸是一种阴离子、非硫酸化的糖胺聚糖。透明质酸是二糖的聚合物，每种二糖包含D-葡糖醛酸和D-N-乙酰葡糖胺，通过交替的β-1,4和β-1,3糖苷键连接。透明质酸在长度上可包含数千个二糖重复。透明质酸可具有约1kDa至约5,000kDa或更高的分子量。
透明质酸酶是糖胺聚糖内切氨基葡萄糖苷酶家族，其中透明质酸酶中的谷氨酸残基通过酸碱催化机制水解透明质酸和硫酸软骨素的β-1,4键。
通过催化透明质酸(细胞外基质(ECM)的组分)的水解，透明质酸酶降低透明质酸和细胞外基质的粘度，从而增加组织渗透性。施用透明质酸酶或编码透明质酸酶的多核苷酸可导致透明质酸水解，从而导致受试者细胞外基质的解体。由此，受试者的细胞外基质的解体可促进药剂的递送或施用。
透明质酸酶可以是源自哺乳动物来源、爬行动物或膜翅目昆虫透明质酸聚糖水解酶、来自水蛭唾液腺的透明质酸聚糖水解酶或细菌来源的透明质酸酶。细菌透明质酸酶可包括例如链球菌、肺炎球菌和梭菌透明质酸酶。
4)药剂
可向受试者施用药剂。药剂可包括多肽、多核苷酸、小分子、抗原或其任何组合。药剂可包括编码抗体、其片段、其变体或其组合的重组核酸序列，如详述于例如PCT/US2014/070188中，其通过引用并入本文。药剂可以是DNA编码的单克隆抗体(DMAb)。
i)多肽
在一些实施方案中，药剂包括多肽。多肽可包括抗体、抗原、酶或其他蛋白质或其任何组合。多肽可源自哺乳动物、动物、细菌或病毒来源。多肽可以是异源多肽，即源自不同来源或生物体。在一些实施方案中，多肽包括抗体。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。
(1)抗体
如上所述，多肽可以包括抗体、其片段、其变体或其组合。抗体可以与所需靶分子结合或反应，所述靶分子可以是抗原(其在以下更详细地描述)、配体(包括受体的配体)、受体(包括受体上的配体结合位点)、配体-受体复合物和标志物(包括癌症标志物)。
抗体可包含重链和轻链互补决定区(“CDR”)组，分别插入为CDR提供支持并限定CDR相对于彼此的空间关系的重链与轻链框架(“FR”)组之间。CDR组可含有重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N-末端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可包括六个CDR，其包含来自重链和轻链V区中的每个的CDR组。
蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，其中两个(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供几个片段，包括包含两个抗原结合位点的F(ab’)2片段。因此，抗体可以是Fab或F(ab’)2。Fab可以包括重链多肽和轻链多肽。Fab的重链多肽可以包括VH区和CH1区。Fab的轻链可以包括VL区和CL区。
抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白可以包括重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可以包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可以包括VL区和CL区。
所述抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、人源化抗体或完全人抗体。人源化抗体可以是结合所需抗原的来自非人物种的抗体，其具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。
抗体可以是双特异性抗体、其片段、其变体或其组合。双特异性抗体可以与两种抗原(例如，以下更详细描述的抗原中的两种)结合或反应。双特异性抗体可以由本文所述抗体中的两种的片段构成，从而允许双特异性抗体与两种所需靶分子结合或反应，所述靶分子可包括抗原(其在以下更详细地描述)、配体(包括受体的配体)、受体(包括受体上的配体结合位点)、配体-受体复合物和标志物(包括癌症标志物)。
抗体可以是双功能抗体、其片段、其变体或其组合。双功能抗体可以与下述抗原结合或反应。还可以修饰双功能抗体以赋予抗体除识别和结合抗原之外的另外功能。这种修饰可以包括但不限于与因子H或其片段偶联。因子H是补体激活的可溶性调节剂，并且因此可通过补体介导的裂解(CML)促成免疫应答。
如上所述，在向受试者施用组合物后，抗体可以在受试者中产生。抗体可在受试者体内具有半衰期。在一些实施方案中，可修饰抗体以延长或缩短其在受试者体内的半衰期。以下更详细地描述此类修饰。
ii)多核苷酸
在一些实施方案中，药剂包括多核苷酸。在一些实施方案中，药剂是由多核苷酸编码的多肽，如上文详述。多核苷酸可编码抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。编码单克隆抗体的多核苷酸可促进单克隆抗体的体内表达和形成。
在一些实施方案中，软骨素酶多肽和单克隆抗体由相同的多核苷酸编码。在一些实施方案中，软骨素酶多肽和单克隆抗体由单独的多核苷酸编码。
(1)载体
一种或多种载体可包括多核苷酸。在一些实施方案中，编码软骨素酶多肽的多核苷酸和编码药剂的多核苷酸包含在同一载体内。在一些实施方案中，编码软骨素酶多肽的多核苷酸和编码药剂的多核苷酸包含在单独的载体中。一种或多种载体可以能够表达药剂。一种或多种载体可以是表达构建体，其通常是用于将特定基因引入靶细胞中的质粒。一旦表达载体在细胞内，则由所述基因编码的多肽由细胞转录和翻译结构核糖体复合物产生。质粒经常经过工程改造以含有调控序列，所述调控序列充当增强子和启动子区域，并且导致表达载体上携带的基因的有效转录。在一个实施方案中，本发明的载体可以表达大量稳定的信使RNA，和因此形成的多肽。
(a)表达载体
载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够指导适当受试者细胞中的特定核苷酸序列的表达。载体可以具有可操作地连接至编码抗原的核苷酸序列或编码佐剂的核苷酸序列的启动子，这些核苷酸序列可以可操作地连接至终止信号。载体还可以含有核苷酸序列的正确翻译所需的序列。包含感兴趣核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着其组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时起始转录。在多细胞有机体的情况下，启动子还可以是对特定组织或器官或发育阶段特异性的。
(b)环状载体和线性载体
载体可以是环状质粒，所述环状质粒可通过整合至细胞基因组中来转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。
载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码药剂的DNA并且使细胞能将序列翻译成药剂的任何其他表达载体。
本文还提供了一种能够通过电穿孔有效递送至受试者且表达一种或多种所需药剂的线性核酸或线性表达盒(“LEC”)。LEC可以是没有任何磷酸骨架的任何线性DNA。DNA可编码一种或多种药剂。LEC可含有启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。药剂的表达可受启动子控制。LEC可不含有任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可不含有与所需药剂基因表达无关的其他核酸序列。
LEC可源自能够线性化的任何质粒。质粒可能够表达药剂。质粒可以是pNP(PuertoRico/34)或pM2(New Caledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码药剂的DNA并且使细胞能将序列翻译成药剂的任何其他表达载体。
LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别源自pNP(PuertoRico/34)和pM2(New Caledonia/99)。
(c)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号
载体可具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达并且调控所分离核酸的表达的任何启动子。这种启动子是通过DNA依赖性RNA聚合酶进行转录所需的顺式作用序列元件，所述RNA聚合酶转录本文所述的药剂序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于具体应用。在载体中，启动子可定位在距离转录起始点与其天然环境中距离转录起始位点大约相同的位置上。然而，可接纳这个距离的变化而不损失启动子功能。
启动子可以可操作地连接至编码药剂和转录物的高效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号的核酸序列。启动子可以可操作地连接至编码药剂和转录物的高效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号的核酸序列。
启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯(Rous)肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子，或对于真核细胞中的表达显示有效的另一种启动子。
载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。载体可在结构基因下游含有转录终止区以提供有效终止。可从与启动子序列相同的基因获得或可从不同的基因获得终止区。
iii)小分子
药剂可包括小分子。小分子可包括，例如，药品或药物、有机化合物、有机金属化合物、抗原、激素、维生素、抗生素、辅因子、细胞因子、类固醇、碳水化合物、糖、醇、多烯、生物碱、糖苷、类黄酮、羧酸盐、吡咯类、吩嗪类、脂肪酸、胺、核碱基及其衍生物(例如，核苷酸和核苷)、氨基酸和细胞代谢物。
iv)抗原
可向受试者施用抗原。“抗原”可以是具有在受试者中产生免疫应答能力的任何物质。抗原可以是多核苷酸、多肽或其组合。多核苷酸还可以包括编码通过肽键连接至抗原的接头序列或标签序列的另外序列。如上文详述，抗原可以包括小分子。
抗原可以含于来自任何数量的有机体(例如，病毒、寄生虫、细菌、真菌或哺乳动物)的多核苷酸、多肽、或其片段、或其变体或其组合中。抗原可以与自身免疫疾病、过敏或哮喘相关。在其他实施方案中，抗原可以与癌症、疱疹、流感、乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头瘤病毒(HPV)或人免疫缺陷病毒(HIV)相关。
抗原可被抗体识别和结合。一些抗原可以诱导强免疫应答。其他抗原可以诱导弱免疫应答。抗原可源于体内或外部环境。抗原可以是外来抗原或自身抗原。
在一些实施方案中，如上所述的抗体可以与抗原结合或反应。
在一些实施方案中，软骨素酶多肽和包含多核苷酸的药剂由相同的多核苷酸或单独的多核苷酸编码。在一些实施方案中，软骨素酶多肽、包含多核苷酸的药剂和抗原包含在相同的载体或单独的载体中。
抗原可以是在受试者中诱导免疫应答的任何物质。纯化的抗原通常其自身不是强免疫原性的，并且因此如上所述与佐剂组合。当与佐剂组合时可以增强或增加由抗原诱导的免疫应答。此类免疫应答可以是体液免疫应答和/或细胞免疫应答。在一些实施方案中，佐剂和抗原的组合可以增强或增加受试者的细胞免疫应答。
抗原可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸序列还可以包含编码通过肽键连接至抗原的接头序列或标签序列的另外序列。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。
抗原可以含于来自任何数量的有机体(例如，病毒、寄生虫、细菌、真菌或哺乳动物)的蛋白质、核酸、或其片段、或其变体或其组合中。抗原可以与自身免疫疾病、过敏或哮喘相关。在其他实施方案中，抗原可以与癌症、疱疹、流感、乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头瘤病毒(HPV)或人免疫缺陷病毒(HIV)相关。优选地，抗原可以与流感或HIV相关。
一些抗原可以诱导强免疫应答。其他抗原可以诱导弱免疫应答。当与佐剂组合时，抗原可以引发更大的免疫应答。
(1)病毒抗原
抗原可以是病毒抗原或其片段或其变体。病毒抗原可以来自一种病毒，所述病毒来自以下家族中的一种：腺病毒科(Adenoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、纤丝病毒科(Filoviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、副粘液病毒科(Paramyxoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)或披膜病毒科(Togaviridae)。病毒抗原可以来自乳头瘤病毒，例如人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、天花病毒(重型天花和轻型天花)、痘苗病毒、流感病毒、鼻病毒、登革热病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、黄热病病毒、诺沃克病毒(Norwalk virus)、甲型肝炎病毒、人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、多毛细胞白血病病毒(HTLV-II)、加州脑炎病毒、汉坦病毒(Hanta virus)(出血热)、狂犬病病毒、埃博拉热病毒(Ebola fever virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、单纯性疱疹1(口腔疱疹)、单纯性疱疹2(生殖器疱疹)、带状疱疹(水痘-带状疱疹，也称为水痘)、巨细胞病毒(CMV)(例如，人CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)(EBV)、黄病毒、口蹄疫病毒、基孔肯亚病毒(chikungunya virus)、拉沙病毒(lassa virus)、沙粒病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)或致癌病毒。
(a)肝炎抗原
抗原可以是肝炎病毒抗原(即肝炎抗原)，或其片段或其变体。肝炎抗原可以是来自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和/或戊型肝炎病毒(HEV)的抗原或免疫原。在一些实施方案中，肝炎抗原可以是编码来自HAV、HBV、HCV、HDV和HEV的一种或多种抗原的异源核酸分子(诸如质粒)。肝炎抗原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。
肝炎抗原可以包含共有序列和/或用于改善表达的一种或多种修饰。包括密码子优化、RNA优化和添加高效免疫球蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性的基因修饰可以包括在经过修饰的共有序列中。共有肝炎抗原可包含信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽(诸如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。可以设计免疫原，以引发比相应密码子优化的免疫原更强并且更广泛的细胞免疫应答。
肝炎抗原可以是来自HAV的抗原。肝炎抗原可以是HAV衣壳蛋白、HAV非结构蛋白、其片段、其变体或其组合。
肝炎抗原可以是来自HCV的抗原。肝炎抗原可以是HCV核衣壳蛋白(即，核心蛋白)、HCV包膜蛋白(例如，E1和E2)、HCV非结构蛋白(例如，NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b)、其片段、其变体或其组合。
肝炎抗原可以是来自HDV的抗原。肝炎抗原可以是HDVδ抗原、其片段或其变体。
肝炎抗原可以是来自HEV的抗原。肝炎抗原可以是HEV衣壳蛋白、其片段或其变体。
肝炎抗原可以是来自HBV的抗原。肝炎抗原可以是HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBVDNA聚合酶、由基因X编码的HBV蛋白、其片段、其变体或其组合。肝炎抗原可以是HBV基因型A核心蛋白、HBV基因型B核心蛋白、HBV基因型C核心蛋白、HBV基因型D核心蛋白、HBV基因型E核心蛋白、HBV基因型F核心蛋白、HBV基因型G核心蛋白、HBV基因型H核心蛋白、HBV基因型A表面蛋白、HBV基因型B表面蛋白、HBV基因型C表面蛋白、HBV基因型D表面蛋白、HBV基因型E表面蛋白、HBV基因型F表面蛋白、HBV基因型G表面蛋白、HBV基因型H表面蛋白、其片段、其变体或其组合。肝炎抗原可以是共有HBV核心蛋白或共有HBV表面蛋白。
在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型A共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型A核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型A共有核心蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型B共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型B核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型B共有核心蛋白序列。
在仍其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型C共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型C核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型C共有核心蛋白序列。
在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型D共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型D核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型D共有核心蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型E共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型E核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型E共有核心蛋白序列。
在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型F共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型F核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型F共有核心蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型G共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型G核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型G共有核心蛋白序列。
在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型H共有核心DNA序列构建体、连接至HBV基因型H核心蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型H共有核心蛋白序列。
在仍其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型A共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型A表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型A共有表面蛋白序列。
在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型B共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型B表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型B共有表面蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型C共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型C表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型C共有表面蛋白序列。
在仍其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型D共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型D表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型D共有表面蛋白序列。
在一些实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型E共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型E表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型E共有表面蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型F共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型F表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型F共有表面蛋白序列。
在仍其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型G共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型G表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型G共有表面蛋白序列。
在其他实施方案中，肝炎抗原可以是HBV基因型H共有表面DNA序列构建体、连接至HBV基因型H表面蛋白的共有序列的IgE前导序列，或HBV基因型H共有表面蛋白序列。
(b)人乳头瘤病毒(HPV)抗原
抗原可以是人乳头瘤病毒(HPV)抗原或其片段或其变体。HPV抗原可以来自引起宫颈癌、直肠癌和/或其他癌症的16型、18型、31型、33型、35型、45型、52型和58型HPV。HPV抗原可以来自引起生殖器疣并且已知为头颈癌原因的6型和11型HPV。
HPV抗原可以是来自每种HPV类型的HPV E6或E7结构域。例如，对于16型HPV(HPV16)，HPV16抗原可以包括HPV16 E6抗原、HPV16 E7抗原、其片段、其变体或其组合。类似地，HPV抗原可以是HPV 6 E6和/或E7、HPV 11E6和/或E7、HPV 18 E6和/或E7、HPV 31 E6和/或E7、HPV 33 E6和/或E7、HPV 52 E6和/或E7或HPV 58 E6和/或E7、其片段、变体或组合。
(c)RSV抗原
抗原可以是RSV抗原或其片段或其变体。RSV抗原可以是人RSV融合蛋白(本文中还称为“RSV F”、“RSV F蛋白”和“F蛋白”)或其片段或变体。人RSV融合蛋白在A亚型RSV与B亚型RSV之间可以是保守的。RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23994.1)的RSV F蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是来自RSV A2链(GenBank AAB59858.1)的RSV F蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是RSV F蛋白或其片段或变体的单体、二聚体或三聚体。RSV抗原可以是优化的氨基酸RSV F氨基酸序列或其片段或变体。
RSV F的融合后形式在经过免疫的动物中引发高效价中和抗体，并且保护动物免于RSV攻击。本发明在所要求的疫苗中利用这种免疫应答。根据本发明，RSV F蛋白可以呈融合前形式或融合后形式。
RSV抗原还可以是人RSV附着糖蛋白(本文中还称为“RSV G”、“RSV G蛋白”和“G蛋白”)或其片段或变体。人RSV G蛋白在A亚型RSV与B亚型RSV之间有所不同。抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23993)的RSV G蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是来自以下的RSVG蛋白：B亚型RSV分离物H5601、B亚型RSV分离物H1068、B亚型RSV分离物H5598、B亚型RSV分离物H1123或其片段或变体。RSV抗原可以是优化的氨基酸RSV G氨基酸序列或其片段或变体。
在其他实施方案中，RSV抗原可以是人RSV非结构蛋白1(“NS1蛋白”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23987.1)的RSV NS1蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV非结构蛋白2(“NS2蛋白”)或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23988.1)的RSV NS2蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV核衣壳(“N”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBankAAX23989.1)的RSV N蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是人RSV磷蛋白(“P”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23990.1)的RSV P蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV基质蛋白(“M”)蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23991.1)的RSV M蛋白或其片段或变体。
在仍其他实施方案中，RSV抗原可以是人RSV小疏水(“SH”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23992.1)的RSV SH蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV基质蛋白2-1(“M2-1”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23995.1)的RSV M2-1蛋白或其片段或变体。RSV抗原还可以是人RSV基质蛋白2-2(“M2-2”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23997.1)的RSV M2-2蛋白或其片段或变体。RSV抗原可以是RSV聚合酶L(“L”)蛋白或其片段或变体。例如，RSV抗原可以是来自RSV长链(GenBank AAX23996.1)的RSV L蛋白或其片段或变体。
在另外的实施方案中，RSV抗原可以具有NS1、NS2、N、P、M、SH、M2-1、M2-2或L蛋白的优化的氨基酸序列。RSV抗原可以是人RSV蛋白或重组抗原，如由人RSV基因组编码的蛋白质中的任一种。
在其他实施方案中，RSV抗原可以是但不限于：来自RSV长链的RSV F蛋白、来自RSV长链的RSV G蛋白、优化的氨基酸RSV G氨基酸序列、RSV长链的人RSV基因组、优化的氨基酸RSV F氨基酸序列、来自RSV长链的RSV NS1蛋白、来自RSV长链的RSV NS2蛋白、来自RSV长链的RSV N蛋白、来自RSV长链的RSV P蛋白、来自RSV长链的RSV M蛋白、来自RSV长链的RSV SH蛋白、来自RSV长链的RSV M2-1蛋白、来自RSV长链的RSV M2-2蛋白、来自RSV长链的RSV L蛋白、来自B亚型RSV分离物H5601的RSV G蛋白、来自B亚型RSV分离物H1068的RSV G蛋白、来自B亚型RSV分离物H5598的RSV G蛋白、来自B亚型RSV分离物H1123的RSV G蛋白，或其片段或其变体。
(d)流感抗原
抗原可以是流感抗原或其片段或其变体。流感抗原是能够在哺乳动物中引发针对一种或多种流感血清型的免疫应答的那些流感抗原。抗原可以包含全长翻译产物HA0、亚单位HA1、亚单位HA2、其变体、其片段或其组合。流感血凝素抗原可以是源自多种甲型流感血清型H1株的共有序列、源自多种甲型流感血清型H2株的共有序列、含有源自不同组的多种甲型流感血清型H1株的两个不同的共有序列的部分的杂交序列或源自多种乙型流感株的共有序列。流感血凝素抗原可以来自乙型流感。
流感抗原还可以含有至少一种抗原表位，所述抗原表位可以有效对抗特定流感免疫原，针对所述流感免疫原的免疫应答可以被诱导。抗原可提供存在于完整流感病毒中的免疫原性位点和表位的全部谱系。抗原可以是可以源自血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列，所述血凝素抗原序列来自一种血清型的多种甲型流感病毒株，如血清型H1或血清型H2的多种甲型流感病毒株。抗原可以是可以通过组合两个不同的共有血凝素抗原序列或其部分获得的杂交共有血凝素抗原序列。两个不同的共有血凝素抗原序列各自可以源自不同组的一种血清型的多种甲型流感病毒株，如血清型H1的多种甲型流感病毒株。抗原可以是可以源自血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列，所述血凝素抗原序列来自多种乙型流感病毒株。
在一些实施方案中，流感抗原可以是H1HA、H2HA、H3HA、H5HA或BHA抗原。或者，流感抗原可以是包含共有H1氨基酸序列或共有H2氨基酸序列的共有血凝素抗原。共有血凝素抗原可以是合成的杂合共有H1序列，其包含两个不同共有H1序列的部分，其各自源自来自另一个的不同序列组。共有HA抗原(合成的杂合共有H1蛋白)的实例是包含U2氨基酸序列的蛋白质。共有血凝素抗原可以是源自来自乙型流感株的血凝素序列的共有血凝素蛋白，如包含共有BHA氨基酸序列的蛋白质。
共有血凝素抗原还可包含一种或多种另外的氨基酸序列元件。共有血凝素抗原还可在其N-末端上包含IgE或IgG前导氨基酸序列。共有血凝素抗原还可包含免疫原性标签，其是可以通过容易获得的抗体检测的独特免疫原性表位。这种免疫原性标签的实例是可连接在共有血凝素C末端上的9个氨基酸的流感HA标签。在一些实施方案中，共有血凝素抗原可进一步在其N-末端上包含IgE或IgG前导氨基酸序列并且在其C末端上包含HA标签。
共有血凝素抗原可以是由共有流感氨基酸序列或其片段和变体组成的共有血凝素蛋白。共有血凝素抗原可以是包含非流感蛋白质序列和流感蛋白质序列或其片段和变体的共有血凝素蛋白。
共有H1蛋白的实例包括可由共有H1氨基酸序列组成的那些共有H1蛋白或还包含另外元件(如IgE前导序列或HA标签、或IgE前导序列和HA标签二者)的那些共有H1蛋白。
共有H2蛋白的实例包括可由共有H2氨基酸序列组成的那些共有H2蛋白或还包含IgE前导序列或HA标签、或IgE前导序列和HA标签二者的那些共有H2蛋白。
杂交共有H1蛋白的实例包括可由共有U2氨基酸序列组成的那些杂交共有H1蛋白或还包含IgE前导序列或HA标签、或IgE前导序列和HA标签二者的那些杂交共有H1蛋白。
杂交共有乙型流感血凝素蛋白的实例包括可以由共有BHA氨基酸序列组成的那些杂交共有乙型流感血凝素蛋白或它可包含IgE前导序列或HA标签，或IgE前导序列和HA标签二者。
共有血凝素蛋白可以由共有血凝素核酸、其变体或其片段编码。与可以是源自来自不同株和变体的多种不同的血凝素序列的共有序列的共有血凝素蛋白不同，共有血凝素核酸是指编码共有蛋白质序列的核酸序列，并且所使用的编码序列可以不同于用于编码共有血凝素蛋白序列所源自的多个不同的血凝素序列中的特定氨基酸序列的那些编码序列。共有核酸序列可以是密码子优化的和/或RNA优化的。共有血凝素核酸序列可包含位于5’非翻译区域中的Kozak序列。共有血凝素核酸序列可包含编码前导序列的核酸序列。N末端前导序列的编码序列是血凝素编码序列的5’。N末端前导序列可以促进分泌。N末端前导序列可以是IgE前导序列或IgG前导序列。共有血凝素核酸序列可以包含编码免疫原性标签的核酸序列。免疫原性标签可以位于蛋白质的C末端上并且编码它的序列是HA编码序列的3’。免疫原性标签提供独特表位，存在针对所述表位的可容易获得的抗体，以使得可以在测定中使用所述抗体来检测和证实蛋白质的表达。免疫原性标签可以是位于蛋白质的C-末端处的HA标签。
(e)人免疫缺陷病毒(HIV)抗原
抗原可以是HIV抗原或其片段或其变体。HIV抗原可以包括免疫原的经过修饰的共有序列。包括密码子优化、RNA优化和添加高效免疫球蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性的基因修饰可包括在经过修饰的共有序列中。可以设计新的免疫原，以引发比相应密码子优化的免疫原更强并且更广泛的细胞免疫应答。
在一些实施方案中，HIV抗原可以是A亚型共有包膜DNA序列构建体、连接至A亚型包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列，或A亚型共有包膜蛋白序列。
在其他实施方案中，HIV抗原可以是B亚型共有包膜DNA序列构建体、连接至B亚型包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列，或B亚型共有包膜蛋白序列。
在仍其他实施方案中，HIV抗原可以是C亚型共有包膜DNA序列构建体、连接至C亚型包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列，或C亚型共有包膜蛋白序列。
在另外的实施方案中，HIV抗原可以是D亚型共有包膜DNA序列构建体、连接至D亚型包膜蛋白的共有序列的IgE前导序列，或D亚型共有包膜蛋白序列。
在一些实施方案中，HIV抗原可以是B亚型Nef-Rev共有包膜DNA序列构建体、连接至B亚型Nef-Rev蛋白的共有序列的IgE前导序列，或B亚型Nef-Rev共有蛋白序列。
在其他实施方案中，HIV抗原可以是A、B、C和D亚型DNA序列构建体的Gag共有DNA序列、连接至Gag共有A、B、C和D亚型蛋白的共有序列的IgE前导序列，或共有Gag A、B、C和D亚型蛋白序列。
在仍其他实施方案中，HIV抗原可以是MPol DNA序列或MPol蛋白序列。HIV抗原可以是Env A、Env B、Env C、Env D、B Nef-Rev、Gag以及其任何组合的核酸或氨基酸序列。
(f)淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)抗原
抗原可以是LCMV抗原或其片段或其变体。LCMV抗原可以包含共有序列和/或用于改善表达的一种或多种修饰。包括密码子优化、RNA优化和添加高效免疫球蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性的基因修饰可以包括在经过修饰的序列中。LCMV抗原可以包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽(例如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。可以设计免疫原，以引发比相应密码子优化的免疫原更强并且更广泛的细胞免疫应答。
LCMV抗原可以是来自LCMV Armstrong的抗原。LCMV抗原可以是来自LCMV克隆13的抗原。LCMV抗原可以是来自LCMV的核蛋白(NP)、来自LCMV的糖蛋白(GP；例如GP-1、GP-2和GP-C)、来自LCMV的L蛋白、来自LCMV的Z多肽、其片段、其变体或其组合。
(2)寄生虫抗原
抗原可以是寄生虫抗原或其片段或变体。寄生虫可以是原生动物、蠕虫或外寄生物。蠕虫(即，肠虫(worm))可以是扁形虫(例如，吸虫和绦虫)、棘头虫或蛔虫(例如，蛲虫)。外寄生物可以是虱子、跳蚤、壁虱和螨虫。
寄生虫可以是引起以下疾病的任何寄生虫：棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔虫病、焦虫病、小袋虫病、贝蛔虫病(Baylisascariasis)、查加斯病、华支睾吸虫病、锥蝇病(Cochliomyia)、隐孢子虫病、裂头绦虫病、麦地那龙线虫病、包虫病、象皮病、蛲虫病、片吸虫病、姜片吸虫病、丝虫病、贾第鞭毛虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、钉螺热、利什曼病、莱姆病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡病、类圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形体病、旋毛虫病以及鞭虫病。
寄生虫可以是棘阿米巴属(Acanthamoeba)、异尖线虫(Anisakis)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、马蝇(Botfly)、肠袋虫属、臭虫、多节绦虫亚纲(Cestoda)(绦虫)、恙螨、螺旋蝇(Cochliomyia hominivorax)、痢疾内变形虫、肝片吸虫(Fasciolahepatica)、兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、钩虫、利什曼虫属(Leishmania)、锯齿状舌形虫(Linguatula serrata)、肝吸虫、罗阿丝虫(Loa loa)、并殖吸虫属(Paragonimus)-肺吸虫、蛲虫、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、血吸虫属(Schistosoma)、肠类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、螨、绦虫、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、锥虫属(Trypanosoma)、鞭虫或班氏线虫(Wuchereria bancrofti)。
(a)疟疾抗原
抗原可以是疟疾抗原(即PF抗原或PF免疫原)或其片段或其变体。抗原可以来自引起疟疾的寄生虫。引起疟疾的寄生虫可以是恶性疟原虫。恶性疟原虫抗原可以包括环子孢子(CS)抗原。
在一些实施方案中，疟疾抗原可以是编码恶性疟原虫免疫原CS、LSA1、TRAP、CelTOS和Ama1中的一个或多个的核酸分子(诸如质粒)。免疫原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。免疫原包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。
在其他实施方案中，疟疾抗原可以是自GenBank数据库中的所有全长恶性疟原虫TRAP/SSP2序列(总共28个序列)设计的TRAP(也称为SSP2)的共有序列。共有TRAP免疫原(即，ConTRAP免疫原)可包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。
在仍其他实施方案中，疟疾抗原可以是CelTOS，其也称为Ag2并且是高度保守的疟原虫抗原。共有CelTOS抗原(即，ConCelTOS免疫原)可包含信号肽(诸如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。
在另外的实施方案中，疟疾抗原可以是Ama1，其为高度保守的疟原虫抗原。疟疾抗原还可以是Ama1(即，ConAmaI免疫原)的共有序列，其在一些情况下包含信号肽(诸如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。
在一些实施方案中，疟疾抗原可以是共有CS抗原(即，共有CS免疫原)，其在一些情况下包含信号肽(诸如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。
在其他实施方案中，疟疾抗原可以是包含本文所述的两种或更多种PF蛋白的组合的融合蛋白。例如，融合蛋白可包含直接彼此相邻地连接或者以之间具有间隔子或一个或多个氨基酸连接的共有CS免疫原、ConLSA1免疫原、ConTRAP免疫原、ConCelTOS免疫原和ConAma1免疫原中的两种或更多种。在一些实施方案中，融合蛋白包含两个PF免疫原；在一些实施方案中，融合蛋白包含三个PF免疫原；在一些实施方案中，融合蛋白包含四个PF免疫原；并且在一些实施方案中，融合蛋白包含五个PF免疫原。具有两个共有PF免疫原的融合蛋白可包含：CS和LSA1、CS和TRAP、CS和CelTOS、CS和Ama1、LSA1和TRAP、LSA1和CelTOS、LSA1和Ama1、TRAP和CelTOS、TRAP和Ama1或者CelTOS和Ama1。具有三个共有PF免疫原的融合蛋白可包含：CS、LSA1和TRAP；CS、LSA1和CelTOS；CS、LSA1和Ama1；LSA1、TRAP和CelTOS；LSA1、TRAP和Ama1；或者TRAP、CelTOS和Ama1。具有四个共有PF免疫原的融合蛋白可包含：CS、LSA1、TRAP以及CelTOS；CS、LSA1、TRAP以及Ama1；CS、LSA1、CelTOS以及Ama1；CS、TRAP、CelTOS以及Ama1；或者LSA1、TRAP、CelTOS以及Ama1。具有五个共有PF免疫原的融合蛋白可包含CS或CS-alt、LSA1、TRAP、CelTOS以及Ama1。
在一些实施方案中，融合蛋白包含连接至N末端的信号肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含连接至每个共有PF免疫原的N末端的多个信号肽。在一些实施方案中，间隔子可包含在融合蛋白的PF免疫原之间。在一些实施方案中，融合蛋白的PF免疫原之间的间隔子可以是蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，间隔子可以是由在意图向其施用疫苗和/或摄取疫苗的细胞内发现的蛋白酶识别的蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，间隔子可包含在融合蛋白的PF免疫原之间，其中间隔子是由在意图向其施用疫苗和/或摄取疫苗的细胞内发现的蛋白酶识别的蛋白水解切割位点，并且融合蛋白包含连接至每个共有PF免疫原的N末端的多个信号肽，以使得在切割时，每个共有PF免疫原的信号肽使共有PF免疫原转移至细胞外。
(3)细菌抗原
抗原可以是细菌抗原或其片段或变体。细菌可以来自以下门中的任一种：酸杆菌门、放线菌门、产水菌门、拟杆菌门、嗜热丝菌门、衣原体门、绿菌门、绿弯菌门、产金菌门、蓝藻菌门、脱铁杆菌门、异常球菌-栖热菌门、网团菌门、迷踪菌门、纤维杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门、黏胶球形菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、变形菌门、螺旋菌门、互养菌门、无壁菌门、热脱硫杆菌门、热袍菌门以及疣微菌门。
细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。细菌可以是好氧细菌或厌氧细菌。细菌可以是自氧细菌或异氧细菌。细菌可以是嗜温菌、嗜中性菌、嗜极菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜热菌、嗜冷菌、嗜盐菌或嗜高渗菌。
细菌可以是炭疽细菌、耐抗生素细菌、致病细菌、食物中毒细菌、传染性细菌、沙门氏菌属细菌、葡萄球菌属细菌、链球菌属细菌或破伤风细菌。细菌可以是分枝杆菌(mycobacteria)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、鼠疫杆菌(Yersinia pestis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus)(MRSA)或艰难梭菌(Clostridium difficile)。细菌可以是结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。
(a)结核分支杆菌抗原
抗原可以是结核分支杆菌抗原(即TB抗原或TB免疫原)或其片段或其变体。TB抗原可来自TB抗原的Ag85家族，例如Ag85A和Ag85B。TB抗原可来自TB抗原的Esx家族，例如EsxA、EsxB、EsxC、EsxD、EsxE、EsxF、EsxH、EsxO、EsxQ、EsxR、EsxS、EsxT、EsxU、EsxV以及EsxW。
在一些实施方案中，TB抗原可以是编码来自Ag85家族和Esx家族的一种或多种结核分支杆菌免疫原的核酸分子(诸如质粒)。免疫原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。免疫原可包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。共有免疫原可包含信号肽(诸如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG信号肽)，并且在一些实施方案中，可包含HA标签。
(4)真菌抗原
抗原可以是真菌抗原或其片段或变体。真菌可以是曲霉菌属种(Aspergillusspecies)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、假丝酵母(Candida yeasts)(例如，白色念珠菌(Candida albicans))、球孢子菌属(Coccidioides)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)、皮肤真菌(dermatophyte)、镰刀菌属种(Fusarium species)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、毛霉菌亚门(Mucoromycotina)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、明脐菌属(Exserohilum)或枝孢菌属(Cladosporium)。
b)施用
软骨素酶和药剂可以根据制药领域技术人员熟知的标准技术配制。软骨素酶和药剂可包含在相同或单独的组合物中。透明质酸酶和药剂可以根据制药领域技术人员熟知的标准技术配制。透明质酸酶和药剂可包含在相同或单独的组合物中。此类组合物可以由医学领域的技术人员在考虑了如具体受试者的年龄、性别、体重和病状以及施用途径的此类因素之后，按其熟知的剂量和技术进行施用。
可以预防性或治疗性地施用软骨素酶和药剂。在预防性施用中，可以足以诱导免疫应答的量施用软骨素酶和药剂。在治疗性应用中，以足以引起治疗效果的量向有需要的受试者施用软骨素酶和药剂。可以预防性或治疗性地施用透明质酸酶和药剂。在预防性施用中，可以足以诱导免疫应答的量施用透明质酸酶和药剂。在治疗性应用中，以足以引起治疗效果的量向有需要的受试者施用透明质酸酶和药剂。将足够实现此目标的量定义为“治疗有效剂量”。对于这种用途有效的量将取决于例如所施用的疫苗方案的具体组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况以及处方医师的判断。
例如，可以通过本领域熟知的方法施用软骨素酶和药剂，或透明质酸酶和药剂，所述方法如Donnelly等(Ann.Rev.Immunol.1997,15,617-648)；美国专利号5,580,859；美国专利号5,703,055；和美国专利号5,679,647中所述，所有这些参考文献的内容以引用的方式整体并入本文。可以例如使用疫苗枪将多核苷酸与可以施用至个体的颗粒或珠粒进行复合。本领域的技术人员将知道药学上可接受的载剂(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于(例如)表达载体的施用途径。
可以通过多种途径来递送软骨素酶和药剂。可以通过多种途径来递送透明质酸酶和药剂。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如，皮内、肌肉内、脂肪组织递送或皮下递送。其他途径包括口服施用、鼻内和阴道内途径。特别是对于多核苷酸，可以将软骨素酶和药剂，或透明质酸酶和药剂递送至个体组织的间隙空间(美国专利号5,580,859和5,703,055，所有所述专利的内容以引用的方式整体并入本文)。还可以将软骨素酶和药剂，或透明质酸酶和药剂施用至肌肉，或可以通过皮内或皮下注射或经皮(诸如通过离子电渗疗法)施用。还可以采用表皮施用。表皮施用可以涉及机械地或化学地刺激表皮的最外层，以刺激对刺激物的免疫应答(美国专利号5,679,647，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文)。
软骨素酶和药剂可以是液体制剂，诸如混悬剂、糖浆或酏剂。软骨素酶和药剂还可以是用于肠胃外、皮下、脂肪组织、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，诸如无菌混悬剂或乳剂。透明质酸酶和药剂可以是液体制剂，诸如混悬剂、糖浆或酏剂。透明质酸酶和药剂还可以是用于肠胃外、皮下、脂肪组织、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，诸如无菌混悬剂或乳剂。
软骨素酶和药剂，或透明质酸酶和药剂可以掺入脂质体、微球体或其他聚合物基质中(美国专利号5,703,055；Gregoriadis,Liposome Technology,第I卷至第III卷(第二版，1993)，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文)。脂质体可以由磷脂或其他脂质组成，并且可以是制造和施用相对简单的无毒的、生理学上可接受的和可代谢的载剂。
可以通过电穿孔，诸如通过美国专利号7,664,545中所述的方法来施用软骨素酶和药剂，或透明质酸酶和药剂，所述专利的内容以引用的方式并入本文。电穿孔可以通过美国专利号6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所述的方法和/或装置来进行，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。可通过微创设备来进行电穿孔。
微创电穿孔设备(“MID”)可以是用于将上述免软骨素酶和药剂以及相关流体注射到身体组织内的装置。所述设备可包括中空针、DNA盒和流体递送部件，其中所述设备适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中并行地(例如，自动地)将DNA注射到所述身体组织中。这具有以下优点：在插入针的同时逐渐注射DNA和相关流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。由于注射的DNA分布在较大面积上，可减少注射过程中经受的疼痛。
MID可在不使用针的情况下将软骨素酶和药剂注射到组织中。MID可将疫苗作为小的流或射流以使得疫苗穿透组织的表面并且进入下层组织和/或肌肉的力进行注射。小的流或射流之后的力可由压缩气体(诸如在几分之一秒内通过微小孔的二氧化碳)的膨胀提供。微创电穿孔设备的实例和使用它们的方法在公布的美国专利申请号20080234655；美国专利号6,520,950；美国专利号7,171,264；美国专利号6,208,893；美国专利号6,009,347；美国专利号6,120,493；美国专利号7,245,963；美国专利号7,328,064；和美国专利号6,763,264中描述，每个所述专利的内容以引用的方式并入本文。
MID可包括产生无痛地穿透组织的液体的高速射流的注射器。此类无针注射器可商购获得。本文可以利用的无针注射器的实例包括美国专利号3,805,783；4,447,223；5,505,697；和4,342,310中所述的那些，每个所述专利的内容以引用的方式并入本文。
可使用无针注射器将呈适用于直接或间接电转运形式的所需软骨素酶和药剂，透明质酸酶和药剂引入(例如注射)到待治疗的组织中，通常通过将组织表面与注射器接触，以便以足以导致渗透到组织中的力致动药剂射流的递送。例如，如果待治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，则将药剂朝向粘膜或皮肤表面以足以导致药剂渗透穿过角质层并且进入真皮层中或分别进入下层组织和肌肉中的力进行喷射。
无针注射器非常适合于递送至所有类型的组织，特别是递送至皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可用于将含有软骨素酶和药剂的液体推送至表面并且进入受试者的皮肤或粘膜中。可以使用本发明方法治疗的各种类型组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。
MID可具有对组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列(例如设置成矩形或正方形图案)中的多对电极之间脉冲来提供优于在一对电极之间脉冲的结果的改良的结果。例如，在标题为“Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes”的美国专利号5,702,359中公开的是针阵列，其中多对针可在治疗性治疗过程中进行脉冲。在所述应用中(其以引用的方式并入本文，如同其全文陈述一样)，针被安置在环形阵列中，但具有连接器和转换装置，从而实现相对成对的针电极之间的脉冲。可使用用于将重组表达载体递送至细胞的一对针电极。这种设备和系统描述于美国专利号6,763,264中，所述专利的内容以引用的方式并入本文。可替代地，可使用单针设备，所述设备允许DNA注射和使用类似于正常注射针的单针进行电穿孔并且施加比通过目前所使用设备递送的电压低的电压的脉冲，从而减少患者经受的电感觉。
MID可包括一个或多个电极阵列。阵列可包括具有相同直径或不同直径的两个或更多个针。针可均匀或不均匀地间隔开。针可介于0.005英寸与0.03英寸之间、0.01英寸与0.025英寸之间，或0.015英寸与0.020英寸之间。针的直径可以是0.0175英寸。针可间隔开0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。
MID可由脉冲发生器和在单个步骤中递送疫苗和电穿孔脉冲的两个或更多个针疫苗注射器组成。脉冲发生器可允许通过闪存卡操作的个人计算机灵活编程脉冲和注射参数，以及全面记录和储存电穿孔和患者数据。脉冲发生器可在短的时间段期间递送多种伏特脉冲。例如，脉冲发生器可递送100ms持续时间的三个15伏特脉冲。这种MID的实例是Inovio Biomedical Corporation的Elgen 1000系统，所述系统描述于美国专利号7,328,064中，所述专利的内容以引用的方式并入本文。
MID可以是CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals,Plymouth Meeting,PA)设备和系统，其是便于将大分子(诸如DNA)引入身体或植物中选定组织的细胞中的模块化电极系统。所述模块化电极系统可包括多个针电极；皮下注射针；提供从可编程的恒定电流脉冲控制器到多个针电极的传导性连接的电连接器；以及电源。操作者可以抓住固定在支撑结构上的多个针电极并将它们坚固地插入到身体或植物中所选定的组织中。接着通过皮下注射针将大分子递送至所选定组织中。启动可编程的恒定电流脉冲控制器，并将恒定电流电脉冲施加至多个针电极中。所施加的恒流电脉冲促进将大分子引入多个电极之间的细胞中。由于细胞的过热造成的细胞死亡通过借助于恒流脉冲来限制组织中的功率消耗而得以最小化。CELLECTRA设备和系统描述于美国专利号7,245,963中，所述专利的内容以引用的方式并入本文。
MID可以是Elgen 1000系统(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen 1000系统可包括提供中空针的设备；和流体递送部件，其中装置适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中并行地(例如，自动地)将流体(本文所述的疫苗)注射到所述身体组织中。优点是：在插入针时逐渐注射流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。还据信，由于注射的流体的体积分布在较大面积上，减少了在注射过程中经受的疼痛。
此外，流体的自动注射有助于所注射流体的实际剂量的自动监测和配准。如果需要，可以出于文件编制目的由控制单元储存这个数据。
应理解，注射速率可以是线性或非线性的，并且可在已经将针插入穿过待治疗的受试者皮肤之后并且在将所述针进一步插入身体组织中时进行注射。
可将流体注射到其中的适合组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但也可以是肌肉组织。
用于施用的装置还可包括用于引导针插入身体组织中的针插入部件。通过针插入的速率来控制流体注射的速率。这具有以下优点：既可以控制针插入，又可以控制流体的注射，以使得可以根据需要使插入速率与注射速率相匹配。它还使装置更易于使用者操作。如果需要，可以提供用于将针自动地插入身体组织中的部件。
使用者可以选择何时开始流体的注射。然而，理想地，在针的尖端到达肌肉组织时开始注射，并且装置可包括用于感测针何时插入至足以开始注射流体的深度的部件。这意味着当针达到所需深度(其将通常是肌肉组织开始处的深度)时，可以提示自动地开始流体的注射。肌肉组织开始处的深度可以例如被视为为预设针插入深度(诸如4mm的值)，所述深度将被认为是对于针穿过皮肤层来说是足够的。
感测部件可包括超声探针。感测部件可包括用于感测阻抗或电阻变化的部件。在这种情况下，部件可不如此记录针在身体组织中的深度，而将相反适于随着针从不同类型的身体组织移动到肌肉中来感测阻抗或电阻的变化。这些替代方案中的任一个提供相对准确和简单地操作的感测可开始注射的部件。如果需要，可以进一步记录针的插入深度，并且所述深度可以用于控制流体的注射，以使得根据正被记录的针的插入深度来确定待注射的流体体积。
施用装置还可包括：用于支撑针的底座；和用于在其中接纳底座的壳体，其中底座可相对于壳体移动，以使得当底座相对于壳体处于第一向后位置时，针缩回壳体内，并且当底座在壳体内处于第二向前位置时，针伸出壳体外。由于壳体可以在患者的皮肤上对准，并且然后可以通过相对于底座移动壳体来将针插入到患者的皮肤中，所以这对于使用者是有利的。
如上所述，希望实现流体注射的受控速率，以使得在将针插入到皮肤中时，流体在针的长度上均匀分布。流体递送部件可包括适于以受控速率注射流体的活塞驱动部件。可以例如通过伺服马达来激活活塞驱动部件。然而，可通过在轴向方向上相对于壳体移动的底座来致动活塞驱动部件。应理解，可以提供用于流体递送的替代部件。因此，例如，可以提供可以被挤压用于以受控或非受控速率进行流体递送的封闭容器来代替注射管和活塞系统。
可使用任何类型的注射。然而，设想到它在电穿孔的领域中尤其有用，并且因此它可还包括用于向针施加电压的部件。这允许针不仅用于注射，而且还用作电穿孔过程中的电极。这是尤其有利的，因为这意味向与注射流体相同的区域施加电场。传统上电穿孔存在以下问题：很难准确地将电极与先前注射的流体对准，并且因此使用者倾向于在较大的区域上注射体积大于所需的流体，并且在较高的区域上施加电场，以试图确保所注射的物质与电场之间的重叠。使用本发明，可减少所注射流体的体积和所施加电场的大小，同时实现电场与流体之间的良好配合。
软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂的施用可以是并行的或连续的。
i)并行施用
可并行地向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂。如本文所用，“并行地”和“同时地”可互换使用。例如，可共配制软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂。当共配制时，可在单个步骤中向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂。当共配制时，例如可在单个注射步骤中向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂。
可并行地向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。如本文所用，“并行地”和“同时地”可互换使用。例如，可共配制透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。当共配制时，可在单个步骤中向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。当共配制时，例如可在单个注射步骤中向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。
ii)连续施用
可连续地向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂。如本文所用，“连续地”和“随时间交错”可互换使用。在一些实施方案中，在施用药剂之前向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸。可连续地向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。如本文所用，“连续地”和“随时间交错”可互换使用。在一些实施方案中，在施用药剂之前向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。可在施用药剂之前至少约3分钟、5分钟、15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、至少约35分钟、至少约40分钟、至少约45分钟、至少约50分钟、至少约55分钟、至少约1小时、至少约15小时、至少约2小时、至少约25小时、至少约3小时、至少约3.5小时、至少约4小时、至少约4.5小时、至少约5小时、至少约5.5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时、至少约12小时、至少约15小时、至少约18小时、至少约21小时或至少约24小时向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和/或软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸。可在施用药剂之前少于约24小时、少于约21小时、少于约18小时、少于约15小时、少于约12小时、少于约11小时、少于约10小时、少于约9小时、少于约8小时、少于约7小时、少于约6小时、少于约5.5小时、少于约5小时、少于约4.5小时、少于约4小时、少于约3.5小时、少于约3小时、少于约2.5小时、少于约2小时、少于约1.5小时、少于约1小时、少于约55分钟、少于约50分钟、少于约45分钟、少于约40分钟、少于约35分钟、少于约30分钟、少于约25分钟、少于约20分钟、少于约10分钟、少于约5分钟或少于约15分钟向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和/或软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸。可在施用药剂之前至少约5分钟至约24小时向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和/或软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸。
c)方法
i)递送药剂的方法
本发明还涉及一种向受试者递送药剂的方法。所述方法可包括以足以降解糖胺聚糖的量向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸，并向所述受试者施用药剂。所述方法还可包括向受试者施用编码抗原的多核苷酸。
本发明还涉及一种向受试者递送药剂的方法。所述方法可包括以足以降解糖胺聚糖的量向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸，并向所述受试者施用药剂。所述方法还可包括向受试者施用编码抗原的多核苷酸。
ii)治疗疾病或病症的方法
本发明还涉及一种治疗受试者的疾病或病症的方法。所述方法可包括向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸，并向所述受试者施用药剂。所述方法可包括向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸，并向所述受试者施用药剂。
疾病可包括但不限于心血管疾病，诸如冠心病、动脉粥样硬化、高血压、心脏肥大、心肌梗塞、心室或心房颤动和心肌病；神经疾病，诸如神经病或神经退行性疾病；代谢疾病，诸如糖尿病；炎性病症，包括炎性肠病，诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎；皮肤病症；自身免疫性疾病，诸如阿尔茨海默病、多发性硬化症、牛皮癣、全身性皮肌炎、对抗原的免疫应答恶化、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和红斑狼疮；骨质疏松症；骨关节炎；由病毒、细菌、寄生虫或真菌感染引起的疾病；以及癌症。例如，病毒性疾病可以是中东呼吸综合症。与施用药剂的受试者相比，施用药剂和软骨素酶的受试者可以具有增加或增强的免疫应答。增加的免疫应答可以用于治疗和/或预防受试者的疾病。
所述疾病可以是癌症，例如，HPV相关癌症、HBV相关癌症、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、咽喉癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、骨癌、黑素瘤、转移癌、hTERT相关癌症、FAP抗原相关癌症、非小细胞肺癌、血癌、食道鳞状细胞癌、宫颈癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌、肛门癌、滑膜癌、睾丸癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌、胶质母细胞瘤、肝癌、胃癌、急性髓性白血病、三阴性乳腺癌和原发性皮肤T细胞淋巴瘤。
所述方法还可以包括减小受试者中已确定的肿瘤或病变的大小。例如，与在没有软骨素酶和/或透明质酸酶的情况下施用药剂相比，肿瘤的大小可以减小约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％、约80％至约95％、约90％至约95％、约50％至约90％、约60％至约约90％、约70％至约90％或约80％至约90％。例如，与在没有软骨素酶和/或透明质酸酶的情况下施用药剂相比，肿瘤的大小可以减小约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。
与在没有软骨素酶和/或透明质酸酶的情况下施用药剂的受试者相比，所述方法还可以包括增加受试者的肿瘤消退。例如，与在没有软骨素酶和/或透明质酸酶的情况下施用药剂相比，施用药剂与软骨素酶和/或透明质酸酶可以使肿瘤消退增加约40％至约60％、约45％至约55％或约50％。施用药剂与软骨素酶和/或透明质酸酶还可以增加肿瘤消退的速率。与在没有软骨素酶和/或透明质酸酶的情况下施用药剂相比，施用药剂与软骨素酶和/或透明质酸酶还可以在受试者中实现约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约80％至约90％或约85％至约90％的肿瘤消退。与仅施用药剂相比，施用药剂与软骨素酶和/或透明质酸酶的受试者中的肿瘤消退可以是约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。施用药剂与软骨素酶和/或透明质酸酶的受试者中的肿瘤消退还可以是约90％或约100％。
所述方法还可以包括在施用药剂与软骨素酶的受试者中预防癌症或肿瘤生长。这种预防可以使施用药剂与软骨素酶的受试者在未来的癌症中存活。换句话说，药剂与软骨素酶为施用药剂与软骨素酶的受试者提供抗癌保护。与仅施用药剂相比，施用药剂与软骨素酶的受试者可以具有约90％至约100％的癌症存活率。与仅施用药剂相比，施用药剂与软骨素酶的受试者可以具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的癌症存活率。
本发明具有多个方面，所述方面通过以下非限制性实施例说明。
5)实施例
实施例1
实施例2和3的方法
将研究INO-16-056(Balb/c)或INO-16-057(C57BL/6)的总共20只小鼠分成4组，每组5只雌性小鼠(6-7周龄)并用pGX9214(一种编码对铜绿假单胞菌具有反应性的人抗体(DMAb)的DNA质粒)免疫。
在pGX9214递送前30分钟，用30μl透明质酸酶(400单位/ml；从牛睾丸中纯化)预处理第2实验组中每只小鼠的左侧TA肌肉(参见表1)。第3组小鼠接受用30μl来自肝素黄杆菌的软骨素酶AC的预处理，并且给予第4组小鼠含有相同浓度的透明质酸酶和软骨素酶组合的预处理到其左侧TA肌肉中，随后在30分钟后进行pGX9214加EP。在DNA递送和EP之前，用PBS注射对照组(第1组)的小鼠。
在接受酶预处理的部位(第2、3和4组)或未预处理的部位(第1组)处以于30μl SSC中0.1mg的浓度肌肉内施用质粒DNA，并且在注射后立即进行电穿孔。使用-3P(2mm电极)设备(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)将电穿孔应用于注射部位。参数为：
·脉冲数＝2组2个脉冲(2x2)，
·电流强度＝0.1安培，
·最大电压＝200V，
·电穿孔脉冲持续时间＝52毫秒，
·脉冲之间的间隔分离脉冲＝0.2秒，并且每组脉冲之间的间隔分离脉冲＝3秒。
在第0、3、7天，将小鼠放血(50μl)并通过ELISA测量血清中的人IgGκ(DMAbPseudoV2L2MD)水平。
为了分析针对hIgG的体液应答，进行针对hIgGκ标准蛋白的ELISA。
实施例2
pMAb疫苗递送之前肌肉的软骨素酶处理-Balb/c
测定用pGX9214(Pseudo V2L2MD)处理的Balb/c小鼠血清中DNA编码的单克隆抗体的表达水平。用来自肝素黄杆菌的软骨素酶AC(类似于源自牛睾丸的透明质酸酶)预处理肌肉递送部位，显著增强检测到的hIgG全身血清水平。
表1：实施例2的实验细节
*透明质酸酶：Sigma Aldrich；目录号H4272–30mg；400U/ml；4μl/100μl PBS。
**软骨素酶；Sigma Aldrich；目录号C2780；0.5U/ml；于PBS中从储备液稀释1:10。
在DMAb递送前30分钟进行酶的处理。
表2：实施例2的质粒细节
实施例3
pDNA疫苗递送之前肌肉的软骨素酶处理-C57BL/6
类似于Balb/c小鼠，与仅接受pGX9214加PBS的小鼠相比，用软骨素酶和pGX9214处理的C57BL/6小鼠显示其血清中DNA编码的单克隆抗体的表达水平增加。在DNA注射和EP之前，hIgG水平与用透明质酸酶预处理的小鼠相当，因此显示用软骨素酶预处理小鼠TA肌肉递送部位显著增强hIgG的全身血清水平。参见图2。
表3：实施例3的实验细节
*透明质酸酶：Sigma Aldrich；目录号H4272–30mg；400U/ml；4μl/100μl PBS。
**软骨素酶；Sigma Aldrich；目录号C2780；0.5U/ml；于PBS中从储备液稀释1:10。
在DMAb递送前30分钟进行酶的处理。
表4：实施例2的质粒细节
实施例2和3的总结这些研究表明，在递送DMAb加EP之前，向Balb/c小鼠以及C57BL/6小鼠的TA肌肉中施用软骨素酶增强了血清中hIgG的表达。图1示出了与第1组(平均值为214.86ng/ml)相比，在用软骨素酶预处理的第3组中，峰值时间点(第7天)处Balb/c小鼠中的hIgG血清表达(平均值为2904.53ng/ml)增加了13.5倍。接受相同处理(研究INO-16-057)的C57BL/6显示，与第1对照组(平均值为618.21ng/ml)相比，在用软骨素酶预处理的第3组中，在第7天时hIgG血清表达(平均值为5428.49ng/ml)增加了8.8倍。在两种鼠品系中，用软骨素酶预处理的组的hIgG血清表达水平与用透明质酸酶预处理的组中显示的hIgG血清表达水平相当。
肌肉的软骨素酶预处理可用于增强小鼠血清中的DMAb表达。
实施例4
实施例5的方法
对各自含有5只动物的四组雌性豚鼠施用pGX9207(一种编码对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-coV)具有反应性的人抗体(DMAb)的DNA质粒)。在所有组的四头肌中进行DNA注射，随后进行电穿孔。
在DMAb递送前90分钟，将第3组的豚鼠用200μl软骨素酶AC(0.5单位/ml)处理到每个肌肉中。用PBS(第1组)或透明质酸酶(第2组；400单位/ml；从牛睾丸中纯化)预处理对照组。为了测试软骨素酶在用透明质酸酶递送时是否显示出降解四头肌的细胞外基质的累加效应，在第4组中在DMAb递送和EP前90分钟用透明质酸酶和软骨素酶两种酶预处理动物。
在接受酶预处理的部位(第2、3和4组)或未预处理的部位(第1组)处以于200μlSSC中0.45mg的浓度肌肉内注射PGX 9207，并且在注射后立即进行EP。使用-3P(8mm电极)设备(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)将电穿孔应用于注射部位。
参数为：
脉冲数：2组2个脉冲(2x2)；
电流强度：0.2安培；
最大电压：200V；
电穿孔脉冲持续时间：52毫秒；
脉冲之间的间隔分离脉冲：0.2秒，并且每组脉冲之间的间隔分离脉冲：3秒。
在第0、3、7、10、14、17和21天，将豚鼠放血(200μl)并通过ELISA测量血清中的人IgGκ(DMAb MERS-hIgG)水平。
表5：实施例5的实验细节
*透明质酸酶：400U/ml。
**软骨素酶：0.5U/ml。
在DMAb递送前90分钟进行酶的处理。
表4：实施例2的质粒细节
实施例5
用软骨素酶处理增强全身性基于DNA的抗体表达
在通过注射和电穿孔(EP)施用pGX9207后，源自细菌肝素黄杆菌的软骨素酶AC的作用增强豚鼠中的hIgG全身血清水平。
Hartley豚鼠中血清hIgG水平的动力学在图3中显示。在每组中，在第7天观察到峰值表达。在DMAb递送和EP前90分钟以200μl用0.5单位/ml软骨素酶AC处理到四头肌中的Hartley豚鼠在其血清中具有比用对照试剂PBS预处理(第7天平均值为98.79ng/ml；参见图3)的那些豚鼠高8.6倍的hIgG水平(第7天平均值为485.39ng/ml)。与用透明质酸酶预处理(第7天平均值为278.41ng/ml)作为阳性对照相比，用软骨素酶预处理导致hIgG水平高1.74倍。在DMAb递送和EP前90分钟同时施用两种酶(平均值为849.57ng/ml)表明累加效应(与透明质酸酶相比增加3倍，并且与软骨素酶相比增加1.75倍)。
当与用单一酶预处理的豚鼠中的水平相比时，暴露于透明质酸酶和软骨素酶组合的动物的豚鼠血清中检测到的IgG浓度更高。pGX9207的实例表达动力学在图4中描绘。
实施例6
软骨素酶增强小鼠(INO-16-056和INO-16-057)中质粒编码的蛋白质表达
将INO-16-056(Balb/c)或INO-16-057(C57BL/6)的总共10只小鼠分成2组，每组5只雌性小鼠(6-7周龄)并接受注射pGX9214(PseudoV2L2MD(批号D150827))(一种编码对铜绿假单胞菌具有反应性的人抗体(DMAb)的DNA质粒)。
在pGX9214递送前30分钟，用30μl软骨素酶AC(从肝素黄杆菌纯化；SigmaAldrich)预处理第2实验组中每只小鼠的左侧骨骼肌(表6)。在DNA递送和EP之前，用PBS注射对照组(第1组)的小鼠。
表6：实施例6的实验细节
*表6方案INO-16-056-软骨素酶AC(Sigma Aldrich；目录号C2780；0.5U/ml；在pDNA递送前30分钟进行酶处理。小鼠品系：Balb/c。
表7：实施例6的另外的实验细节
*表7方案INO-16-057-软骨素酶AC(Sigma Aldrich；目录号C2780；0.5U/ml；在pDNA递送前30分钟进行酶处理。小鼠品系：C57BL/6。
在接受酶预处理的部位(第2组)或未预处理的部位(第1组)处以于30μl SSC中0.1mg的浓度肌肉内施用质粒DNA，并且在注射后立即进行电穿孔。使用-3P(2mm电极)设备(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)将电穿孔应用于注射部位。
本报告中所有实验的小鼠参数为：
脉冲数＝2组2个脉冲(2x2)，
电流强度＝0.1安培，
最大电压＝200V，
电穿孔脉冲持续时间＝52毫秒，
脉冲之间的间隔分离脉冲＝0.2秒，并且每组脉冲之间的间隔分离脉冲＝3秒。
在第0、3、7天，将小鼠放血(50μl)并通过ELISA测量血清中的人IgGκ(DMAbPseudoV2L2MD)水平。
结果INO-16-056：
这里报告了用pGX9214(PseudoV2L2MD)处理的Balb/c小鼠血清中DNA编码的单克隆抗体的表达水平。用来自肝素黄杆菌的软骨素酶AC预处理肌肉递送部位，显著增强检测到的hIgG全身血清水平(图5)。
结果INO-16-057：
类似于Balb/c小鼠，与仅接受pGX9214加PBS的小鼠相比，用软骨素酶和pGX9214处理的C57BL/6小鼠显示其血清中DNA编码的单克隆抗体的表达水平增加(图6)。
研究INO-16-056和INO-16-057的结论：
这些研究表明，在递送DMAb加EP之前，向Balb/c小鼠以及C57BL/6小鼠的骨骼肌中施用软骨素酶增强了血清中hIgG的表达。图5示出了与第1组(平均值为214.86ng/ml)相比，在用软骨素酶预处理的第2组中，峰值时间点(第7天)处Balb/c小鼠中的hIgG血清表达(平均值为2904.53ng/ml)增加了13.5倍。接受相同处理(研究INO-16-057)的C57BL/6显示，与第1对照组(平均值为618.21ng/ml)相比，在用软骨素酶预处理的第2组中，在第7天时hIgG血清表达(平均值为5428.49ng/ml)增加了8.8倍。
鉴于前述内容，肌肉的软骨素酶预处理可以用于增强pDNA表达。
实施例7
临床级软骨素酶-ABC导致质粒编码的蛋白质的水平增加(INO-16-083B和INO-16-097)
为了最终将软骨素酶的基本临床前研究转移到临床，测试了临床级软骨素酶ABC。根据制造商的说法，此产品通过阳离子交换色谱法从普通变形杆菌中纯化，具有低内毒素水平并且不显示污染物诸如软骨硫酸酯酶、蛋白酶、肝素酶(heparinase)和类肝素酶(heparitinase)。所述酶显示出与来自Seikagaku的软骨素酶ABC(Condoliase)相似的活性。此外，我们在我们的测定中添加了GALNS(一种人重组软骨素酶(R&D系统))。这种酶(也称为溶酶体N乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GalNAc6S))水解硫酸软骨素的N-乙酰基-D-半乳糖胺6-硫酸酯单元和硫酸角蛋白的D-半乳糖-6-硫酸酯单元的6-硫酸酯基团。在临床中，这种酶用于治疗Morquio A综合征或粘多糖贮积病4A(一种溶酶体贮积病症)。所述疾病的特征在于由于缺乏GalNAc6S而导致硫酸角质素和6-硫酸软骨素的细胞内积累。这种蛋白质的来源是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、Sf 21(杆状病毒)衍生的Ala27-His522，具有N-末端6-His标签。
目的是确定软骨素酶AC(肝素黄杆菌，Sigma Aldrich)、临床级软骨素酶ABC(普通变形杆菌，Amsbio)和GALNS(人重组软骨素酶，R&D系统)增强pDNA表达的能力。随后，检查了各种剂量的软骨素酶ABC的效果。
INO-16-083B：为了评估三种不同类型的软骨素酶的有效性，将Balb/c小鼠分成4组，其中每组5只小鼠。每只小鼠接受注射0.1mg编码登革热病毒特异性单克隆抗体hIgG-DVSF-1的质粒DNA pGX9203(批号D160222A)到左侧骨骼肌中，随后进行电穿孔。如研究1所述进行程序的参数。如表2.1所示，在DNA施用前30分钟用各自的酶或作为对照的PBS处理小鼠。在第0、3和7天收集血液样品，并通过ELISA测量血清人IgGλ水平。
数据表明，软骨素酶AC和软骨素酶ABC两种酶均增强基因表达(图7)。然而，重组蛋白GALNS没有。
INO-16-097：为了决定后续实验的最佳浓度，测试了各种剂量的临床级软骨素酶ABC的效果。详细的实验策略在表2.3中描述。在将pGX9207基因转移到左侧骨骼肌中之前，将范围从0.1U/ml至5U/ml的四种不同剂量的软骨素酶ABC应用于Balb/c小鼠(第2-5组)，并与PBS第1对照组进行比较。
增加软骨素酶ABC浓度进一步增强转基因的表达，其中2.5U/ml作为我们动物模型的最佳剂量(图8)。
对于研究INO-16-083B和INO-16-097：当用各自的软骨素酶预处理动物时，临床级酶导致与在先前实验中成功显示的软骨素酶AC相似的基因表达增加。通过在注射pGX9207之前应用2.5U/ml的浓度，我们发现与PBS对照组相比，人血清IgG水平增加了4倍。此观察结果证实，软骨素酶ABC导致质粒编码的蛋白质水平显著升高，并为进一步测试提供了良好的起点。
表8：实施例7的实验细节。
方案INO-16-083B。*软骨素酶AC(肝素黄杆菌)；Sigma Aldrich；目录号C2780；0.5U/ml；**软骨素酶ABC(普通变形杆菌)；Amsbio，目录号AMS.E1028-10；0.5U/ml，重组人GALNS蛋白，R&D系统，目录号8269-SU-050；20μg/ml。在pDNA递送前30分钟进行酶处理；小鼠品系：Balb/c。
表9：实施例7的另外的实验细节。
方案INO-16-097软骨素酶ABC(普通变形杆菌)；Amsbio，目录号AMS.E1028-10；在pDNA递送前30分钟进行酶处理；小鼠品系：Balb/c。pGX9207(MERS IgG)-批号63682。
实施例8
软骨素酶-ABC施用导致蛋白质表达增强(INO-16-188)
先前的实验表明临床级软骨素酶ABC适用于增强小鼠中质粒依赖性基因表达。为了进一步证实这一发现，下一步是提供软骨素酶处理的骨骼小鼠肌肉中这种增强的基因表达的视觉图像。因此，报告基因和测量的蛋白质表达基于荧光。
为了定量报告基因表达酶(2.5U/ml；30分钟标准预处理)，通过电穿孔将PBS(对照)和pDNA(；pGX9902，每条腿50μg剂量)递送至左侧和右侧鼠骨骼肌中(表10)。在72小时后，解剖鼠后肢并取出皮肤。通过荧光成像系统(ProteinSimple)测量处理的小鼠肌肉中的荧光强度，并通过AlphaView SA定量。
数据揭示，用软骨素酶ABC处理(30分钟)后小鼠肌肉中的报告基因表达增强(图9)。
产生的证据显示，在处理72小时后，通过蛋白质的可视化，软骨素酶显著增强了基因表达。与对照组相比，通过在用报告pDNA处理之前应用酶，我们实现了6.7倍的改善。临床前小鼠实验的这一发现进一步确定了软骨素酶ABC可能潜在地促进基于DNA的免疫疗法。
表10：实施例8的实验细节。
方案INO-16-188。在pDNA(pGX9902)注射前30分钟，将小鼠用软骨素酶ABC(2.5U/ml)或PBS(对照)预处理到左侧和右侧的骨骼肌中。小鼠品系：Balb/c。
实施例9
软骨素酶ABC处理的肌肉的组织学分析(INO-16-195)
为了测试软骨素酶ABC是否导致鼠肌肉组织的形态变化，检查了注射部位处处理的后肢的组织病理学。
四组小鼠接受用软骨素酶(第2组和第3组)或用PBS(第1组和第4组)处理到其后肢的左侧和右侧骨骼肌中(表11)。通过电穿孔将质粒DNA(pGX9207-MERS IgG(批号163682))递送至属于第1组和第2组的小鼠肌肉中。在72小时后，解剖鼠后肢，并且分离骨骼肌用于苏木精和伊红(H&E)染色。H&E染色以及幻灯片的扫描由合同研究组织(Reveal Biosciences)进行。在获得整个肌肉的图像之后，通过使用软件CaseViewer选择肌肉组织病理学的代表性实例。
实验动物在其行为中没有显示出任何变化的迹象，并且在实验处理程序期间和之后看起来是健康的。在完成分析后，与PBS对照相比，当仅用软骨素酶处理小鼠肌肉时，未观察到自发炎症的证据，并且未观察到组织损伤或其他明显的组织学变化(图10)。当通过电穿孔渗入免疫细胞另外递送pDNA时，观察软骨素酶和PBS预处理的小鼠。
这些数据显示电穿孔而不是酶导致组织形态的可逆变化，从而表明酶的施用不介导严重的不良事件(SAE)。
软骨素酶加pDNA/EP组中的浸润细胞数量略高可能是由于较高的pDNA转染效率。
表11：实施例9的另外的实验细节。
实施例10
软骨素酶-ABC增强新西兰兔中的质粒编码的蛋白表达(INO-16-157)
为了进一步研究软骨素酶在基于DNA的免疫疗法中的作用，研究了用软骨素酶ABC肌肉内预处理是否有效增强兔中的蛋白质表达。
向12只新西兰兔(第1组和第2组，动物年龄：9周，表12)施用2mg pGX9207(MERSIgG(批号63682))。使用设备将电穿孔应用于骨骼肌中的注射部位。
兔的参数适用于本报告中所有实验：
·脉冲数＝3个脉冲
·电流强度＝0.5安培，
·电穿孔脉冲持续时间＝52毫秒，
·脉冲之间的间隔分离脉冲＝1秒
将第2组的动物用软骨素酶预处理到与pDNA递送相同的部位中，并且将第1组的动物用作PBS对照。在第0、3、5和6天进行放血。通过ELISA测量人IgG水平。
数据证明，与PBS处理相比，其肌肉用酶预处理的组中hIgG血清水平显著增强。
通过注射基质降解酶显著改善兔中基于DNA的基因表达(与对照相比4.9倍)与小鼠数据一致，并进一步巩固了在基于质粒DNA的基因疗法中使用软骨素酶ABC的效力。
表12.实施例10的实验细节。
实施例11
小鼠中软骨素酶ABC与pDNA的共配制剂(INO-16-99B、INO-16-201、INO-16-188)
先前的实验显示，软骨素酶的准确预处理时间对于最佳基因表达不是必需的。当我们在pDNA递送和EP之前5分钟、15分钟、30分钟、2小时、24小时或48小时预处理小鼠时，未看到小鼠的显著差异。这提出了以下问题：是否有可能共配制软骨素酶ABC与pDNA而不对基因表达产生负面影响。
为此目的，以一个单次注射(第3组)用酶(2.5U/ml)和pDNA(pGX9702，MERS IgG(批号：63682和72883))处理14只小鼠。由于软骨素酶的必要反应时间，在注射后1分钟进行EP。在此实验中包括两个对照组：用PBS预处理第1组的小鼠，并且组的小鼠接受酶的注射(第2组)。在30分钟后，在两组中进行通过电穿孔递送pDNA。
本报告中用于所有共配制剂实验的小鼠参数为：
·脉冲数＝2组2个脉冲(2x2)，
·电流强度＝0.1安培，
·最大电压＝200V，
·电穿孔脉冲持续时间＝52毫秒，
·脉冲之间的间隔分离脉冲＝0.2秒，并且每组脉冲之间的间隔分离脉冲＝3秒。
在第0、3、6天，将小鼠放血(50μl)并通过ELISA测量血清中的人IgGκ(DMAbPseudoV2L2MD)水平。
与PBS对照组(第1组)相比，接受共配制药物的动物在其血清中显示出高度显著的hIgG增加。值得注意的是，经历标准程序(30分钟预处理；第2组)与接受新基因转移程序(第3组)的动物之间的蛋白质产生没有显著差异。
结果显示，软骨素酶与pDNA的共配制剂是可行的。接受单次注射(酶/pDNA)的动物中的基因表达比PBS对照组中的表达水平高5.6倍。增强的蛋白质表达水平等同于原始组织预处理程序。共配制剂技术和方法可以是较不复杂、较少技术挑战性和节省时间的。
表13：实施例11的实验细节
实施例12
软骨素酶与pDNA的共配制剂导致荧光蛋白表达增强(INO-16-188)
下一个后续步骤是用荧光报告质粒验证观察结果。
为了使报告基因表达可视化，通过电穿孔将软骨素酶(2.5U/ml)、PBS(对照)和pDNA(pGX9902)作为单次注射递送至左侧和右侧鼠骨骼肌中(表14)。在处理后72小时进行后肢的解剖。通过成像仪(FluorChem M系统，ProteinSimple)测量处理的小鼠肌肉中的荧光强度，并通过AlphaView SA定量。
与先前的数据一致，与PBS对照相比，软骨素酶ABC和pDNA的共配制剂导致增强的基因表达。在第3组(共配制剂)与第2组(30分钟标准预处理)之间未看到基因表达的显著差异。
通过使用报告质粒可视化基因表达证实单次注射中酶和pDNA的共配制剂在小鼠模型中是有益的。
表14：实施例12的实验细节。
方案INO-16-188。第3组小鼠在EP前1分钟接受单次注射软骨素酶ABC(2.5U/ml)和pDNA(pGX9902)进入左侧和右侧的骨骼肌中。在标准方案后处理对照组小鼠：在pDNA递送和EP之前30分钟用软骨素酶或PBS预处理它们。小鼠品系：Balb/c。CoF＝共配制剂。
实施例13
兔中软骨素酶ABC与pDNA的共配制剂(INO-16-180)
为了评估共配制的软骨素酶ABC/pDNA对大肌肉基因表达的影响，对兔骨骼肌进行了实验。此外，测试了此模型中电穿孔的延迟是否有利。最后，研究了酶与pDNA孵育1小时是否对体内基因表达有影响。
为此目的，将3组兔(新西兰兔，每组6只动物，12周龄)用酶/pDNA(pGX9207)共配制剂注射到左侧骨骼肌中(两次注射；表15)。在第3组中，在酶/pDNA递送后立即进行EP。在第4组和第5组中，延迟电穿孔并在酶/pDNA施用后1分钟进行。第5组的动物接受软骨素酶和pDNA的混合物，所述混合物在处理前1小时在冰上孵育。第1组的动物用作PBS对照，并且第2组的动物根据我们的30分钟标准方案预处理。使用设备将电穿孔应用于骨骼肌中的注射部位。在第0、4和5天进行放血。通过ELISA测量人IgG水平。
通过测量兔血清中的人IgG水平，与对照相比，施用共配制剂的兔中蛋白质产生显著增加(图14)。此外，1分钟EP延迟与增强的人IgG血清水平相关，并且显示在递送前1小时共配制剂与在递送前几分钟共配制剂的等效表达。
结果证明了共配制软骨素酶与pDNA增强基因表达的能力。与对照相比，通过添加1分钟的EP延迟进一步推进此新方案导致表达增加6.41倍。在酶/pDNA共配制剂孵育1小时后，与制剂后的立即注射相比，实现了等效的基因表达水平。
在这项临床前研究中，共配制酶和pDNA改善了蛋白质产生。
表15：实施例13的实验细节。
实施例14
软骨素酶ABC与pDNA的共配制剂-体外pDNA稳定性测试(INO-16-252A)
为了进一步测试一次性组合软骨素酶和pDNA的可能性，评估了在不同条件下共配制剂时的pDNA稳定性。稳定性测试的目的是提供有关产品质量如何在环境因素(诸如温度)的影响下随时间变化的证据，以及建立未来药物产品的保质期和推荐的储存条件。
为了测试pDNA在与软骨素酶孵育时的稳定性和质量，通过琼脂糖凝胶电泳检查pDNA的分子量和构象。7个样品含有pDNA(pGX9207，250ng)与软骨素酶ABC(2.5U/ml，表9.1)。另外7个样品用作对照并且由pDNA和PBS组成。在配制后，通过凝胶电泳(TAE，1％琼脂糖，EmbiTec)测试第1-2组样品，将第3-4组在室温(RT，定义为21℃)下孵育10分钟。以PCR循环在室温下进行孵育。如下进行进一步孵育：5-6：6℃，120分钟，7-8：室温，120分钟，9-10：6℃，24小时，11-12：室温，24小时，以及13-14：6℃，10分钟。在凝胶电泳后，通过Gene Sys软件分析凝胶(无像素组合，EDR，120ms暴露)。
构建体pGX9207具有超螺旋构象，并且分子量为5171bp。所有DNA样品(含酶和对照样品)在原始构象下具有原始重量。分别在条带与样品之间未看到差异(图15)。
由于所有样品的条带代表具有原始分子量的超螺旋DNA，因此这种初始pDNA稳定性方法表明软骨素酶分别对质粒结构和药物质量没有影响。
表16：实施例14的实验细节。
实施例15
软骨素酶ABC与pDNA的共配制剂-体内pDNA稳定性研究(INO-16-237)
研究了是否可以在体内递送之前长达24小时制备与pDNA的软骨素酶共配制剂。因此，测试了在递送前10、120分钟或24小时制备的共配制剂对小鼠中基因表达的影响。
在药物注射(肌肉内)和电穿孔(延迟1分钟，表10.1)之前10分钟、120分钟和24小时制备酶(2.5U/ml)和pDNA(pGX9207，0.1mg)的共配制剂。作为对照，两组小鼠接受软骨素酶(第2组)或PBS(第1组)30分钟预处理。在第0、3、6天收集血液，并且通过ELISA测定血清hIgG水平。
当酶/pDNA共配制剂储存24小时时，确实没有发生小鼠基因表达的下降。
此数据证明，我们的含有软骨素酶ABC和pDNA的试剂可以储存至少24小时。参见图16。
表17：实施例15的实验细节。
实施例16
实施例17和18的方法
对全身性单克隆抗体表达的透明质酸酶处理
将9只豚鼠分成2组，每组3只雌性Hartley豚鼠(6周龄)并用pGX9203(一种编码对登革病毒具有反应性的人抗体(DMAb)的DNA质粒)免疫，而对照组仅接受PBS。
在pGX9203递送前3小时，在6个单独部位处用0.2ml透明质酸酶((0.4单位/ml)从牛睾丸中纯化)预处理实验组I的腿部肌肉(参见下表)。在接受透明质酸酶预处理的部位(第1组)或未预处理的部位(第2组)处，通过肌肉内注射于200μl SSC中的0.33mg质粒进行pGX9203递送，并且在注射后立即进行电穿孔。使用-3P(5mm电极)设备(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)将电穿孔应用于注射部位。参数为：
·脉冲数＝2组2个脉冲(2x2)，
·电流强度＝0.1安培，
·最大电压＝200V，
·电穿孔脉冲持续时间＝52毫秒，和
·脉冲之间的间隔分离脉冲＝0.2秒，并且每组脉冲之间的间隔分离脉冲＝3秒。
在第0、7、10、14、17、21和24天，将豚鼠放血(250μl)并通过ELISA测量血清中的人IgGλ(DMAb DVSF-1)水平。
为了分析针对hIgG的体液应答，进行针对hIgGκ标准蛋白的ELISA。
表1.
表2.
代码 名称 R&D批号 Mfg.日期
PGX9203 pVAX中的DVSF-1 D150408A 2015年8月8日-
报告了用pGX9203(pDVSF-1)处理的豚鼠血清中DNA编码的单克隆抗体的表达水平。用透明质酸酶预处理肌肉递送部位显著增强检测到的hIgG全身血清水平。参见图17和18。向dNAb加EP免疫方案添加透明质酸酶(透明质酸酶)预处理豚鼠腿部肌肉增强了血清中hIgG的表达。图17示出了与第2组(平均值为92ng/ml)相比，在用透明质酸酶预处理的第1组中，峰值时间点(第14天)处hIgG血清表达(平均值为1.700ng/ml)增加了18倍。在第28天检测到的第1组(16.66结合效价)和第2组(216.66结合效价)中针对hIgGλ产生的宿主体液应答均是最小的。肌肉的透明质酸酶预处理可用于增强血清中的DMAb表达。
实施例17
pDNA疫苗递送之前肌肉的透明质酸酶处理
用pGX2013(一种编码流感NP PR8的DNA质粒)免疫两组4只雌性Hartley豚鼠(10周龄)，而对照组仅接受PBS。在疫苗递送前约2小时，用大约0.2ml透明质酸酶((约0.4单位/ml)从牛睾丸中纯化)预处理第1实验组的左侧TA肌肉(参见下表3)。在第1天和第15天进行免疫。通过在TA中肌肉内注射约20μg于大约200μl SSC中的质粒进行疫苗递送，并在注射后立即进行电穿孔。使用-3P(5mm电极)设备(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)将电穿孔应用于注射部位。参数为：
-脉冲数＝2组2个脉冲(2x2)，
-电流强度＝0.1安培，
-最大电压＝200V，
-电穿孔脉冲持续时间＝52毫秒，和
-脉冲之间的间隔分离脉冲＝0.2秒，并且每组脉冲之间的间隔分离脉冲＝3秒。
在第一次免疫后14天和第二次免疫后第7天，将豚鼠放血(约3ml)，并通过IFNγELISpot在收获的PBMC群体中测量抗原特异性细胞应答，所述IFNγELISpot使用跨越流感NP PR8抗原的重叠肽。根据修改的ELISpot方案进行测定。
简而言之，使用的ELISpot方案如下：抽取3ml外周血并立即转移到冰上的EDTA+(Lavender盖)管中。用平衡盐溶液以1:1稀释血液。在15ml管中将血液缓慢地铺在4.5mlFicoll密度梯度上。在无制动的情况下，将细胞以2000rpm在室温下旋转30分钟。收获血沉棕黄层并在R10中稀释至15ml。然后通过在4℃下以1500rpm离心5分钟沉淀细胞。将细胞洗涤两次并通过另一70μm筛、计数并在具有10％(v/v)FBS和2x抗生素-抗真菌剂的RPMI培养基中稀释至1×106个活细胞/ml。通过台盼蓝染色测定活力。在4℃下将2x 96孔MilliporeIP板(Millipore，Billerica，MA)的孔用100μl抗IFN-γ一抗溶液(5μg/ml于PBS中，pH 7.4，X-D11，以1.78mg/ml储存)包被24小时。在室温下将非特异性结合用200μl阻断缓冲液封闭2小时。在封闭和洗涤后，一式三份地将1×105个于100μl RPMI中的脾细胞与50μl刺激物混合。在37℃下在潮湿的5％CO2中孵育18小时后，通过洗涤除去细胞并且向每个孔中加入100μl于封闭缓冲液中的生物素酰化的抗IFN-γ二抗(2μg/ml，N-G3)。在孵育2小时并洗涤后，将碱性磷酸酶缀合的链霉抗生物素蛋白(SEL002,R&D Systems Inc.,Minneapolis,MN)在封闭缓冲液中以1:100稀释，并将孔用100μl在室温下孵育1小时。在洗涤后，将孔在室温下与100μl BCIP/NBT检测试剂(SEL002，R&D系统)孵育20分钟。使用的NP肽库是流感核衣壳蛋白(甲型流感病毒(A/Puerto Rico/8.34(H1N1))，其被分成大约40个15-mer的库。将每个NP肽库(1-3)在豚鼠R10中以1比66稀释，2ml中30μl。通过ImmunoSpot分析仪(ShakerHeights,OH的Cellular Technology Ltd.)对斑点形成单位(SFU)进行计数和分析。
计算各单个豚鼠的每百万个脾细胞的SFU和每组小鼠的平均值+/-SEM。使用产生特定P值的双尾非配对t检验评估一对免疫组之间的统计学差异。P值<0.05被认为是统计学上不同的，并且因此是显著的。
对于分析体液应答，从全血制剂中收集血浆级分。进行针对流感NP抗原的ELISA并测定结合效价。
表3：实施例2的实验细节
*在疫苗递送前2小时在TA肌肉中用大约0.2ml透明质酸酶(约0.4单位/μl)处理
表4：实施例2的质粒细节
代码 名称 R&D批号
pGX2013 流感NP D141202B
图19示出了在用跨越流感NP PR8抗原长度的重叠肽库刺激后PBMC中的IFN-γ应答，如通过第一次(初次)后14天或第二次免疫(加强)后7天的ELISpot分析所检测。通过ELISA测定针对流感NP(IMR-274)抗原的血浆IgG结合效价，并在图20中示出。
此实施例证明，向pDNA加EP免疫方案添加TA肌肉的透明质酸酶(HYA)预处理增强了引发的宿主免疫应答。图19示出了与未处理的pNP疫苗组(约258SFU/百万)相比，用透明质酸酶预处理的pNP疫苗组中IFN-γ斑点/百万(约922SFU/百万)增加了约3.5倍；在初次免疫后14天测量这些应答。这种增加在加强后7天为大约3倍(约3012对比约1032SFU/百万)。图20证明，与未用透明质酸酶预处理的pNP疫苗组相比，pNP疫苗透明质酸酶预处理组中的体液应答也增加了。
实施例18
靶向铜绿假单胞菌的单特异性和双特异性单克隆抗体的DNA递送保护小鼠免于致死性肺炎
机会性细菌病原体铜绿假单胞菌经常具有多重耐药性并且与不良临床结果相关。增加的耐药性和开发中缺乏新的机制抗生素需要替代的抗微生物策略，包括病原体特异性单克隆抗体(mAb)。靶向铜绿假单胞菌III型分泌蛋白PcrV(V2L2-MD)和Ps1胞外多糖(EPS)的MAb(各自在临床前感染模型中赋予有效的个体和协同组合保护活性)是双特异性临床候选抗体1-1的组分。此类mAb的DNA递送在临床应用中可以具有显著优势。探索了这些mAbDNA序列的使用以确定通过经由电穿孔的质粒DNA递送(DMAb)的替代mAb递送策略的可行性，所述mAb DNA序列被工程改造用于在体内表达全长人IgG1的抗体重链和轻链。
肌肉内注射(IM)部位由胫骨前肌和右股二头肌两者组成。平行于肌肉组织施用注射。在电穿孔之前1小时，以每个部位30μL中8U，通过IM注射递送透明质酸酶。在先前注射透明质酸酶的所有三个确切部位处通过IM注射递送100μg于30μL中的每种DMAb中，然后立即电穿孔。在电穿孔程序后5天，用铜绿假单胞菌鼻内攻击小鼠。在感染之前评估DMAb体内IgG表达水平。
将抗PcrV单特异性V2L2-MD和双特异性抗体1-1重链和轻链序列克隆到质粒pGX001中，从而得到DMAb-V2L2-MD和DMAb-抗体1-2。证实每个候选物在肌肉内注射前在HEK293T细胞中表达，随后在BALB/c小鼠中进行电穿孔(IM-EP)。在IM-EP后长达7天监测体内抗体表达，表达的mAb的功能活性(抗PcrV抗细胞毒活性)也是如此监测。还在铜绿假单胞菌急性肺炎模型中评估了DMAb-V2L2MD和DMAb-抗体1-2。
在IM-EP后第7天，来自DMAb-V2L2-MD和DMAb-抗体1-2处理的动物的血清抗体浓度与测量的离体抗细胞毒活性相关，这表明V2L2-MD和抗体1-1两者均表达并具有功能性。此外，在急性鼠铜绿假单胞菌肺部感染模型中，与对照IgG DMAb相比，DMAb-V2L2MD和DMAb-抗体1-2两者均表现出显著的体内保护活性(分别为90％和100％存活率相比于0％；P<0.0001)。
示出了DMAb-V2L2-MD和DMAb-抗体1-2在体内防止鼠肺部感染模型中的致死率。此外，我们的结果表明，全长IgG mAb的DNA递送可能是用于预防严重细菌感染的可行平台策略，并且可能适用于预防针对其已经鉴定和表征的高效mAb的其他感染剂。
实施例19
与透明质酸酶掺入疫苗制剂中相关的剂量节约效应
为了确定pDNA疫苗与透明质酸酶的共配制剂是否对引发的宿主免疫应答具有剂量节约效应，将总共12组BALB/c小鼠(每组6只)用10与0.125μg之间剂量的pGX2013(编码流感核蛋白(NP)的pDNA)进行处理。第1-6组接受与透明质酸酶(200U/ml)共配制的pGX2013，并且第7-12组接受仅与SSC缓冲液共配制的pGX2013。第13组仅接受SSC(无疫苗)。细节在表1中呈现。在第0天进行免疫。通过肌肉内注射30μl制剂(TA腿部肌肉)进行疫苗递送，并且在没有透明质酸酶和具有透明质酸酶组中分别在注射后立即或60秒进行电穿孔。使用-3P(3mm电极)设备(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)将电穿孔应用于注射部位。参数为：
脉冲数＝2组2个脉冲(2x2)，
电流强度＝0.1安培，
最大电压＝200V，
电穿孔脉冲持续时间＝52毫秒，
脉冲之间的间隔分离脉冲＝0.2秒，并且每组脉冲之间的间隔分离脉冲＝3秒。
在第7天和第14天，将小鼠放血并收获血清。使用针对A/PR8/34(H1N1)流感病毒核蛋白重组抗原的ELISA检测体液应答。绘制终点结合效价。
在第14天，处死小鼠并收获脾脏。通过IFNγELISpot测量对A/PR8/34(H1N1)流感病毒核蛋白H2d限制性表位NP55-69(II类)和NP147-155(I类)的抗原特异性细胞应答。通过ImmunoSpot分析仪(Shaker Heights,OH的Cellular Technology Ltd.)对斑点形成单元(SFU)进行计数和分析。计算各单个小鼠的每百万个脾细胞的SFU和每组小鼠的平均值+/-SEM并绘图。使用产生特定P值的双尾非配对t测试评估一对免疫组之间的统计学差异。P值<0.05被认为是统计学上不同的，并且因此是显著的。
表5.
*接受200U/ml与pDNA共配制的透明质酸酶(Intrapharma)
表6：实施例4的质粒细节
代码 名称 R&D批号
pGX2013 流感NP D160926A
在用PR8核蛋白NP55(CD4+T细胞)和NP147(CD8+T细胞)肽表位刺激后计数脾细胞群体中的ELISpot IFN-γ应答(图27)。通过ELISA测定针对PR8核蛋白重组抗原的血清IgG结合效价(图28)。
示出了通过共配制pDNA疫苗与透明质酸酶在BALB/c小鼠中引发的对宿主免疫应答的累加效应。这里证明了这种递送策略的剂量节约效应。用或不用透明质酸酶的情况下用递送的0.125至10μg pNP疫苗免疫BALB/c小鼠组。图27示出了用高于0.5μg的pNP剂量免疫的组中的等效细胞免疫应答，然而在较低剂量下，在没有透明质酸酶免疫的组中，在0.25和0.125μg剂量下对NP147的CD8+T细胞应答，以及在0.125ug下对NP55的CD4+T细胞应答显著降低。在第14天还观察到透明质酸酶共配制剂对针对pNP疫苗的体液应答的剂量节约效应(图28)。此外，在免疫后第7天，我们可以在用更高剂量的pNP与透明质酸酶处理的小鼠血清中检测到显著抗NP抗原结合效价，但在没有透明质酸酶的小鼠中未检测到。
剂量节约效应与透明质酸酶在pDNA疫苗制剂中的掺入相关。此外，此共配制剂可能与较高剂量下的加速的免疫应答相关。还参见图42。
实施例20
实施例21-24的材料和方法
DNA编码的单克隆抗体构建和体外表达。如先前所述的14、15工程改造质粒DNA编码的单克隆抗体(DMAb)构建体。通过使用合成的寡核苷酸产生pMERS，所述寡核苷酸具有编码全长抗MERS包膜糖蛋白单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)的几种修饰，并且将最终序列克隆到人CMV驱动的启动子表达系统中。对所得修饰和增强的免疫原进行密码子和RNA优化，随后通过GenScript(Picastaway,NJ)克隆到pVax1表达载体中，随后大规模生产这些构建体。将VH和VL基因插入BamH1与Xho1限制性位点之间。为了证实体外DMAb表达，使用3000转染试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)，用3μg/1x106个pMERS细胞转染人胚胎肾293T细胞(ATCC)。在48小时后，收获培养上清液的MERS-CoV结合抗体，并通过ELISA测量hIgG水平(如下所述)。
动物。雌性BALB/c和Crl:Nu-Foxn1nu小鼠(7-8周龄)购自Charles RiverLaboratories(Wilmington,MA)。雌性新西兰白兔(10-12周龄，2至2.5kg)购自CharlesRiver Laboratories。恒河猴2.35至4.20kg购自WWP,Inc.(Miami,FL)，并在研究开始前隔离检疫33天。将小鼠分组饲养，并将兔和恒河猴单独饲养，随意获取食物和水。根据机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee；IACUC)的标准在BTS Research(San Diego,CA)饲养和处理所有动物。
肌肉内pDNA递送。在盐水-柠檬酸钠(SSC)中配制纯化的质粒DNA以便随后向动物施用。对于预处理，动物接受肌肉内预注射200U/ml于1xDPBS(Thermofisher,MA)中的从牛睾丸纯化的透明质酸酶(Sigma)。小鼠接受30μl进入TA肌肉，兔和恒河猴接受1ml进入四头肌。在30分钟后，在同一部位处注射质粒DNA，随后立即进行IM电穿孔处理。用3P辅助pDNA递送至小鼠TA肌肉中，并将5P用于处理兔和恒河猴。
人IgG定量ELISA。将96孔测定板(Thermo ScientificTMNuncTM)用100μl/孔10μg/ml于1x DPBS(Thermofischer,MA)中的山羊抗huIgG Fc片段抗体(Bethyl,TX)在4℃下包被过夜。第二天，用0.2％(v/v)于1×PBS洗涤缓冲液中的TWEEN洗涤板，并在室温下用10％(v/v)于1xDPBS中的FBS封闭1小时。将血清样品在1％(v/v)于0.2％(v/v)TWEEN-1xPBS中的FBS中稀释，并在另一洗涤步骤后将100μl此混合物加入到测定板中。另外，如制备在稀释缓冲液中以500ng/ml开始的1:2连续稀释液，制备纯化的人κ轻链(Bethyl,TX)的标准稀释液，并一式两份加入到每个测定板中。将样品和标准品在室温下孵育1小时。在洗涤后，将板与1:10,000稀释的山羊抗人IgGκ轻链HRP(Bethyl,TX)在室温下孵育1小时。为了检测，将100μl/孔SureBlue底物溶液(KPL,MD)加入到洗涤的板中。通过在6分钟后向测定板中加入100μl/孔TMB终止溶液(KPL,MD)来终止反应。在450nm处读取O.D.。使用符合浓度对数的S形四参数逻辑曲线，从标准曲线内插血清水平表达。
抗原结合ELISA。将测定板用100μl/孔1μg/ml于1xDPBS(Thermofisher,MA)中的MERS-CoV Spike蛋白S1(SinoBiological,China)在4℃下包被过夜。用具有0.05％TWEEN的1xPBS缓冲液洗涤板。加入250μl/孔3％(w/v)于1xPBS(具有0.05％TWEEN)中的BSA，并在室温下孵育1小时。将血清样品在1％(w/v)于1xPBS(具有0.05％TWEEN)中的BSA中稀释。在洗涤后，用100μl/孔1％BSA PBS/TWEEN缓冲液填充测定板。对于倒数血清稀释液的抗原结合，在测定板上用预稀释的血清样品进行1:3 50μl连续稀释。将板在室温下孵育1小时。在洗涤后，加入100μl 1:10000稀释的山羊抗人IgG重链和轻链猴吸附抗体(bethyl,TX)，并在室温下孵育1小时。为了显色，使用SureBlue/TMB终止溶液(KPL,MD)并且在450nm处记录O.D.。
ADA ELISA。将测定板用100μl/孔0.3μg/ml MERS DMAb在4℃下包被过夜，所述MERS DMAb从体外转染的细胞培养上清液中纯化。用1xPBS 0.05％TWEEN洗涤缓冲液洗涤板，并且加入250μl/孔3％BSA/PBS/TWEEN封闭缓冲液，并在室温下孵育1小时。将血清样品在1％BSA/PBS/TWEEN稀释缓冲液中以1:25预稀释。在洗涤测定板后，加入100μl/孔预稀释样品并在室温下孵育2小时。为了检测恒河猴中的ADA应答，加入100μl/孔1:10000山羊抗人λ轻链HRP抗体(Bethyl,TX)并在室温下孵育1小时。之前证实了此检测抗体与恒河猴IgG的充分交叉反应性和与包被蛋白质pMERS的低交叉反应性(数据未示出)。对于小鼠样品中的ADA检测，将用于兔山羊抗兔IgG(Sigma)的山羊抗小鼠IgG过氧化物酶(Sigma)以1:10000稀释。将SureBlue/TMB终止溶液用于板显色，并在450nm处记录O.D.值。
实施例21
DMAb的设计、体外和体内表征以及递送增强策略
DMAb定义为编码单克隆抗体的轻和重免疫球蛋白(Ig)链的DNA质粒。具体地，DNA盒含有全长mAb的可变轻(VL)和重(VH)Ig链的编码序列的cDNA，其已被优化用于表达并克隆到pVax1哺乳动物表达载体中。为了有效分离重链和轻链以允许从单个开放阅读框架形成全长抗体，在设计中包括弗林蛋白酶切割位点和2A自加工肽(图29a)。
对于这些递送优化研究，选择了编码人抗中东呼吸综合征(MERS)-冠状病毒(CoV)mAb的质粒DNA构建体(pMERS)。通过使用合成的寡核苷酸产生pMERS，所述寡核苷酸具有编码全长抗MERS包膜糖蛋白单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)的几种修饰，将最终序列克隆到人CMV驱动的启动子表达系统中。掺入免疫球蛋白重链和轻链前导序列以便改善表达。对所得修饰和增强的免疫原进行密码子和RNA优化，并克隆到pVax1表达载体中(图29a)。
最初在体外证实了从pMERS转染的细胞产生mAb。用pMERS或空pVax质粒转染人293T细胞。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)在转染后48小时在上清液中定量分泌的抗体的水平，图29b。为了证实功能性抗体的产生，在收获的上清液中通过ELISA测量针对MERS-CoV抗原的抗MERS抗体结合水平(图29c)。总之，数据证明功能性MERS-CoV抗原结合抗体在体外由转染的细胞分泌。
研究了在BALB/c小鼠中肌肉内递送后抗MERS DMAb的体内表达。将6.25与100μg之间的裸pDNA剂量递送至胫骨前肌(TA)肌肉中未能产生高于背景的血清人IgG(hIgG)水平(图30a)。为了增加血清中的全身hIgG水平，研究了已被证明增强体内基因转移的基因递送策略。先前的DMAb研究证明，采用体内EP作为递送辅助增强了表达。电穿孔(EP)是针对pDNA建立的体内递送辅助，其将基因表达增加超过单独裸pDNA递送100倍。EP背后的理论是它增加了细胞膜的渗透性，以允许大分子(例如pDNA)有效地进入细胞。在所采用的低电参数下，对细胞的EP效应是瞬时的，并且细胞保留完全功能。这里，将-3P EP用于靶向BALB/c小鼠的TA肌肉。在DMAb注射后立即在TA肌肉递送部位处施用EP导致血清hIgG水平增加(在递送后第6天50μg pMERS剂量的平均670ng/ml，图30b)。血清hIgG水平的药代动力学分析揭示治疗后第6天的峰值表达(图34)。在第6天后hIgG水平迅速下降，这与针对外来人IgG蛋白的宿主免疫应答的引发一致(图35)。
先前已证明在体内pDNA+EP递送方案中使用透明质酸酶(HYA)可增强基因表达。透明质酸酶催化ECM中透明质酸的水解，从而允许组织渗透性的瞬时增加。这允许注射的pDNA在肌肉组织中的更大分散，以及可用于转染的肌细胞数量的增加。因此，将透明质酸酶添加到递送方案中，其目的是进一步增加hIgG血清浓度。在用电穿孔基因递送前30分钟用200U/ml透明质酸酶预处理TA肌肉导致血清hIgG的显著更高水平(平均值2160ng/ml(递送后第6天100μg剂量的pMERS))(图30c)。在不存在EP的情况下使用透明质酸酶预处理递送pMERS与增强的血清hIgG浓度无关(数据未示出)。通过ELISA进行功能性抗体(与MERS CoV抗原结合的血清)的体内产生。在pMERS递送后第6天绘制倒数血清稀释度结合(图30d)。另外，研究其他试剂以确定它们是否增强细胞内基因递送(诸如维生素D、蔗糖和聚合物)或具有ECM结构修饰能力(诸如弹性蛋白酶和胶原酶)，并确定它们包含在DMAb递送方案中是否可以显著提高hIgG水平。向EP+pMERS递送方案中加入这些试剂未能显著增强血清hIgG水平(图36)。此外，向EP+透明质酸酶pMERS递送方案中加入任何这些试剂后，血清hIgG水平没有增加(数据未示出)。
在将报告基因(pRFP)递送至小鼠TA肌肉后，肉眼观察到透明质酸酶预处理递送肌肉对基因表达的显著影响(图30e)。另外，在测定处理部位处的肌细胞中的hIgG表达后观察到强免疫荧光信号(图30f)，这证实了pMERS递送部位处由肌细胞产生抗体。总之，以上呈现的数据描绘了包括EP和透明质酸酶的DMAb递送方案，其可以用于增强BALB/c小鼠模型中功能性hIgG的表达。
实施例22
免疫缺陷小鼠中持续的DMAb表达
在BALB/c或B6小鼠中的研究成功地证明了DMAb的体内表达以及递送助剂在增强组织转染和因此全身性hIgG水平中的重要性。然而，宿主免疫系统对外来hIgG蛋白的反应负面影响表达动力学(图34和35)。为了避免宿主免疫应答对DMAb表达的负面影响，我们研究了免疫缺陷BALB/c裸小鼠中血清hIgG水平的PK。在不存在功能性适应性免疫系统的情况下，hIgG血清水平在第6天后没有崩溃，但在第21天与第35天之间继续上升和稳定(图31a)。这导致在裸小鼠中观察到的血清hIgG浓度高于BALB/c小鼠(12.5μg/ml相比于2.2μg/ml，在100μg pMERS剂量下的平均峰值)。DMAb表达也得以持续。表达分析的持续时间揭示在递送后160天时hIgG血清水平在0.77μg/ml(12.5μg剂量组)与3.84μg/ml(100μg剂量组)之间(图31a)。
据推测，增加转染的肌细胞数量将导致全身hIgG水平更高。因此，靶向多个肌肉部位将是有利的。将每个部位100μg的pMERS递送至1、2、3或4个肌肉。图31b证明增加靶向的肌肉组织部位的数量是有利的。将pMERS递送至左侧和右侧TA和四头肌(总共4个部位)导致在第21天在血清中检测到28.8μg/ml的hIgG。向单个TA肌肉递送高于100μg的剂量未能进一步增加血清hIgG水平。总之，本节中的数据表明，在不存在抗hIgG应答的情况下，DNA编码的单克隆抗体的全身水平增加并持续。此外，靶向多个递送部位优于增加局部剂量。
实施例23
免疫缺陷小鼠中持续的DMAb表达
放大过程的第一步是从小鼠(体重大约20g，其中外周血总体积为2ml)到兔(体重大约2.5kg，其中外周血总体积为140ml)，兔是一种在系统发育上比啮齿动物更接近灵长类动物的物种。此外，大尺寸的兔四头肌与-5P相容，-5P是目前用于临床试验的人体肌肉内EP设备。
根据血清人IgG在新西兰白兔中测定pMERS表达动力学。用总共2mg由-5P EP递送到透明质酸酶预处理的四头肌中的pMERS处理兔。稳健的血清hIgG水平在第6天达到峰值(图37a)，然后在第7天快速降至背景。血清hIgG的这种快速损失与在第6天与第7天之间产生的强抗药物抗体(ADA)一致(图37b)。然而，在此模型中使用5P递送系统获得了在此早期时间点(第6天)处的稳健且一致的系统表达。然后证明了透明质酸酶预处理肌肉递送部位对hIgG表达的影响。与PBS预处理相比，增强的血清hIgG水平与肌肉的透明质酸酶预处理相关(图32a)，在第6天分别为770相比于122ng/ml(p<0.0001)(图32b)。此外，如通过MERS CoV抗原结合测定，所得hIgG是功能性的(图32c)。
5P IM EP设备的电气设置先前针对DNA疫苗(而非DMAb质粒)的递送和免疫原性进行了优化。研究了在透明质酸酶预处理的情况下关于用于DMAb递送的电压的最佳EP电参数。分析了在20、35、50和65伏特下与pMERSIM递送相关的hIgG血清水平。为了进行此电压过程，将5P阵列和脉冲模式设置传输到BTS-12盒-一种能够递送宽范围电压的设备。65伏设置与-5P设备在兔四头肌中递送的电压相当。结果清楚地证明了与电压降低相关的hIgG血清水平的显著损失(图32d)。由于可能增加组织损伤和降低治疗耐受性，因此未研究更高的电压。
综上所述，在用我们的优化递送方案递送pMERS后在早期时间点(第6天)处存在功能性hIgG的稳健血清水平支持了DMAb平台向较大动物的推进。
实施例24
DMAb递送优化对非人类灵长类动物的应用
通过与人类相当的生理学和免疫系统，非人类灵长类动物提供了一种特殊模型来研究抗体药物候选进入临床的转化潜力。应用在较小动物模型中描绘的DMAb递送优化，评估恒河猴(Maccaca mulatto)血清中hIgG的水平。用5P EP将pMERS递送至5只恒河猴的透明质酸酶预处理的四头肌中。在所有NHP的血清中检测到hIgG的全身水平(图33a)。血清hIgG水平在第11天与第21天之间达到峰值，其范围为1.30至4.97μg/ml。为了证实功能性抗体的产生，通过ELISA证实了与MERS CoV抗原结合的血清抗体。MERS抗原结合值显示出与血清中hIgG水平相当的动力学特征(图33b)，并且在第17天绘制了每只恒河猴的倒数血清稀释度结合(图33c)。这些结果一起证实了在NHP中产生稳健水平的人抗MERS-CoV抗体。
为了确定引发对外来hIgG的ADA应答是否影响NHP中DMAb表达的药代动力学，通过ELISA测定了与pMERS编码的纯化蛋白hIgG结合的血清抗体。检测到在其他实验动物模型中的对hIgG的ADA应答(图35和37b)。在所有NHP中，我们检测到针对DMAb的抗体的引发(图33d)，然而，在五个NHP中的四个中，与先前在其他动物中的观察相比，这些ADA被延迟。ADA的大小与hIgG血清水平反相关(Spearman r＝-0.5811(p＝0.0072)，图33e)。这强烈表明针对“非自身”人IgG的宿主免疫应答在恒河猴中负面影响DMAb表达水平。
总之，描绘了可以用于显著增强递送至小型和大型临床前动物模型的肌肉的基于DNA的单克隆抗体的全身性表达的递送方案的开发。如这里所示，EP和透明质酸酶在递送部位处的组合使用允许人们在非人类灵长类动物中实现μg/ml范围内的全身血清hIgG水平。
实施例25
在兔和恒河猴中透明质酸酶与pDNA的共配制剂
数据显示，与标准透明质酸酶预处理方案相比，pDNA/透明质酸酶(HYA)共配制剂可以递送至兔肌肉中而没有表达损失。参见图38。注射pDNA/透明质酸酶后60秒的EP延迟与增加的DMAb表达相关。参见图39。
数据还显示，与标准透明质酸酶预处理方案相比，pDNA/透明质酸酶共配制剂可以递送至NHP肌肉中而没有表达损失。注射pDNA/透明质酸酶后60秒的EP延迟与增加的DMAb表达相关。参见图40。
实施例26
Ep延迟的优化
进行实验以优化共配制后的EP延迟。数据显示共配制剂注射后20秒的EP延迟可能是最佳的。参见图41。因此，与使用透明质酸酶方案的组织预处理相比，在药物递送与EP之间引入时间延迟后显著增强了基因表达。当与使用透明质酸酶方案的组织预处理相比时，观察到等效水平的基因表达而没有时间延迟。
实施例27
用DNA疫苗透明质酸酶制剂增强对肿瘤抗原的免疫应答
据推测，将透明质酸酶包含在疫苗制剂中将增强引发的针对编码肿瘤相关自身抗原的疫苗的宿主免疫应答。实验结果在图43中示出。
对公开的实施方案的各种变化和修改将为本领域技术人员显而易知。可在不背离本发明的精神和范围的情况下做出此类变化和修改，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用的方法有关的那些变化和修改。
出于完整性的原因，本发明的各个方面在以下编号的条款中阐述：
条款1：一种向受试者递送药剂的方法，所述方法包括：
以足以降解硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)的量向所述受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸；以及
向所述受试者施用所述药剂。
条款2：如条款1所述的方法，其中所述CSPG选自由以下组成的组：聚集蛋白聚糖(CSPG1)、多功能蛋白聚糖(CSPG2)、神经蛋白聚糖(CSPG3)、CSPG4(黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖，NG2)、CSPG5、SMC3(CSPG6，染色体3的结构维持)、短蛋白聚糖(CSPG7)、CD44(CSPG8，分化簇44)、磷酸蛋白聚糖及其组合。
条款3：一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸；以及
向所述受试者施用药剂。
条款4：如条款1-3中任一项所述的方法，其中所述药剂选自由以下组成的组：多核苷酸、多肽和小分子。
条款5：如条款4所述的方法，其中所述药剂包括多核苷酸。
条款6：如条款5所述的方法，其中所述多核苷酸编码单克隆抗体。
条款7：如条款4所述的方法，其中所述药剂包括多肽。
条款8：如条款7所述的方法，其中所述多肽包括单克隆抗体。
条款9：如条款6所述的方法，其中所述单克隆抗体在体内表达。
条款10：如条款6所述的方法，其中软骨素酶多肽和单克隆抗体由相同的多核苷酸或单独的多核苷酸编码。
条款11：如条款6所述的方法，其中编码软骨素酶多肽的多核苷酸和编码单克隆抗体的多核苷酸包含在相同的载体或单独的载体中。
条款12：如以上条款中任一项所述的方法，其中在施用药剂之前向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸。
条款13：如条款12所述的方法，其中在施用药剂之前至少约15分钟至约24小时向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸。
条款14：如条款1-11中任一项所述的方法，其中并行地向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂。
条款15：如以上条款中任一项所述的方法，其中通过皮下或肌肉内向受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂。
条款16：如以上条款中任一项所述的方法，其中软骨素酶多肽或由多核苷酸编码的软骨素酶多肽水解CSPG并导致受试者的细胞外基质的解体。
条款17：如以上条款中任一项所述的方法，其还包括以足以降解糖胺聚糖的量施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。
条款18：如条款17所述的方法，其中糖胺聚糖包括透明质酸。
条款19：如条款17所述的方法，其中在施用药剂之前向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。
条款20：如条款19所述的方法，其中在施用药剂之前至少约15分钟至约24小时向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。
条款21：如条款17所述的方法，其中并行地向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。
条款22：如条款17所述的方法，其中通过皮下或肌肉内向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。
条款23：如条款17所述的方法，其中透明质酸酶与软骨素酶同时施用。
条款24：如以上条款中任一项所述的方法，其中通过电穿孔向受试者施用药剂。
条款25：如条款14所述的方法，其中在施用之前共配制软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸和药剂。
条款26：如条款17所述的方法，其中在施用之前共配制软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸、透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。
条款27：如条款17所述的方法，其中在施用之前共配制透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸。
条款28：一种向受试者递送药剂的方法，所述方法包括：
以足以降解糖胺聚糖的量向所述受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸；以及
向所述受试者施用所述药剂。
条款29：如条款29所述的方法，其中糖胺聚糖包括透明质酸。
条款30：一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸；以及
向所述受试者施用药剂。
条款31：如条款28-30中任一项所述的方法，其中所述药剂选自由以下组成的组：多核苷酸、多肽和小分子。
条款32：如条款31所述的方法，其中所述药剂包括多核苷酸。
条款33：如条款32所述的方法，其中所述多核苷酸编码单克隆抗体。
条款34：如条款31所述的方法，其中所述药剂包括多肽。
条款35：如条款36所述的方法，其中所述多肽包括单克隆抗体。
条款36：如条款33所述的方法，其中所述单克隆抗体在体内表达。
条款37：如条款33所述的方法，其中透明质酸酶多肽和单克隆抗体由相同的多核苷酸或单独的多核苷酸编码。
条款38：如条款33所述的方法，其中编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和编码单克隆抗体的多核苷酸包含在相同的载体或单独的载体中。
条款39：如以上条款中任一项所述的方法，其中在施用药剂之前向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。
条款40：如条款39所述的方法，其中在施用药剂之前至少约15分钟至约24小时向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。
条款41：如条款39所述的方法，其中在施用药剂之前一小时向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。
条款42：如条款28-38中任一项所述的方法，其中并行地向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。
条款43：如以上条款中任一项所述的方法，其中通过皮下或肌肉内向受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。
条款44：如以上条款中任一项所述的方法，其中透明质酸酶多肽或由多核苷酸编码的透明质酸酶多肽水解透明质酸并导致受试者的细胞外基质的解体。
条款45：如以上条款中任一项所述的方法，其中通过电穿孔向受试者施用药剂。
条款46：如条款28或条款30所述的方法，其中在施用之前共配制透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸和药剂。
条款47：如以上权利要求中任一项所述的方法，其还包括电穿孔。
应理解先前详细描述和随附实施例仅是说明性的，并且不应视为对本发明的范围的限制，所述范围仅由随附权利要求和它们的等效物限定。

Claims (47)

1.一种向受试者递送药剂的方法，所述方法包括：
以足以降解硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)的量向所述受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸；以及
向所述受试者施用所述药剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述CSPG选自由以下组成的组：聚集蛋白聚糖(CSPG1)、多功能蛋白聚糖(CSPG2)、神经蛋白聚糖(CSPG3)、CSPG4(黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖，NG2)、CSPG5、SMC3(CSPG6，染色体3的结构维持)、短蛋白聚糖(CSPG7)、CD44(CSPG8，分化簇44)、磷酸蛋白聚糖及其组合。
3.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用软骨素酶多肽或编码软骨素酶多肽的多核苷酸；以及
向所述受试者施用药剂。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述药剂选自由以下组成的组：多核苷酸、多肽和小分子。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述药剂包括多核苷酸。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述多核苷酸编码单克隆抗体。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述药剂包括多肽。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述多肽包括单克隆抗体。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述单克隆抗体在体内表达。
10.如权利要求6所述的方法，其中所述软骨素酶多肽和所述单克隆抗体由相同的多核苷酸或单独的多核苷酸编码。
11.如权利要求6所述的方法，其中编码所述软骨素酶多肽的所述多核苷酸和编码所述单克隆抗体的所述多核苷酸包含在相同的载体或单独的载体中。
12.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中在施用所述药剂之前向所述受试者施用所述软骨素酶多肽或编码所述软骨素酶多肽的所述多核苷酸。
13.如权利要求12所述的方法，其中在施用所述药剂之前至少约15分钟至约24小时向所述受试者施用所述软骨素酶多肽或编码所述软骨素酶多肽的所述多核苷酸。
14.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中并行地向所述受试者施用所述软骨素酶多肽或编码所述软骨素酶多肽的所述多核苷酸，和所述药剂。
15.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中通过皮下或肌肉内向所述受试者施用所述软骨素酶多肽或编码所述软骨素酶多肽的所述多核苷酸，和所述药剂。
16.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述软骨素酶多肽或由所述多核苷酸编码的所述软骨素酶多肽水解CSPG并导致所述受试者的细胞外基质的解体。
17.如以上权利要求中任一项所述的方法，其还包括以足以降解糖胺聚糖的量施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述糖胺聚糖包括透明质酸。
19.如权利要求17所述的方法，其中在施用所述药剂之前向所述受试者施用所述透明质酸酶多肽或编码所述透明质酸酶多肽的所述多核苷酸。
20.如权利要求19所述的方法，其中在施用所述药剂之前至少约15分钟至约24小时向所述受试者施用所述透明质酸酶多肽或编码所述透明质酸酶多肽的所述多核苷酸。
21.如权利要求17所述的方法，其中并行地向所述受试者施用所述透明质酸酶多肽或编码所述透明质酸酶多肽的所述多核苷酸，和所述药剂。
22.如权利要求17所述的方法，其中通过皮下或肌肉内向所述受试者施用所述透明质酸酶多肽或编码所述透明质酸酶多肽的所述多核苷酸，和所述药剂。
23.如权利要求17所述的方法，其中所述透明质酸酶与所述软骨素酶同时施用。
24.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中通过电穿孔向所述受试者施用所述药剂。
25.如权利要求14所述的方法，其中在施用之前共配制所述软骨素酶多肽或编码所述软骨素酶多肽的所述多核苷酸，和所述药剂。
26.如权利要求17所述的方法，其中在施用之前共配制所述软骨素酶多肽或编码所述软骨素酶多肽的所述多核苷酸，所述透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸，和所述药剂。
27.如权利要求17所述的方法，其中在施用之前共配制所述透明质酸酶多肽或编码所述透明质酸酶多肽的所述多核苷酸，和所述软骨素酶多肽或编码所述软骨素酶多肽的所述多核苷酸。
28.一种向受试者递送药剂的方法，所述方法包括：
以足以降解糖胺聚糖的量向所述受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸；以及
向所述受试者施用所述药剂。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述糖胺聚糖包括透明质酸。
30.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用透明质酸酶多肽或编码透明质酸酶多肽的多核苷酸；以及
向所述受试者施用药剂。
31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述药剂选自由以下组成的组：多核苷酸、多肽和小分子。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述药剂包括多核苷酸。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述多核苷酸编码单克隆抗体。
34.如权利要求31所述的方法，其中所述药剂包括多肽。
35.如权利要求36所述的方法，其中所述多肽包括单克隆抗体。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述单克隆抗体在体内表达。
37.如权利要求33所述的方法，其中所述透明质酸酶多肽和所述单克隆抗体由相同的多核苷酸或单独的多核苷酸编码。
38.如权利要求33所述的方法，其中编码所述透明质酸酶多肽的所述多核苷酸和编码所述单克隆抗体的所述多核苷酸包含在相同的载体或单独的载体中。
39.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中在施用所述药剂之前向所述受试者施用所述透明质酸酶多肽或编码所述透明质酸酶多肽的所述多核苷酸。
40.如权利要求39所述的方法，其中在施用所述药剂之前至少约15分钟至约24小时向所述受试者施用所述透明质酸酶多肽或编码所述透明质酸酶多肽的所述多核苷酸。
41.如权利要求39所述的方法，其中在施用所述药剂之前一小时向所述受试者施用所述透明质酸酶多肽或编码所述透明质酸酶多肽的所述多核苷酸。
42.如权利要求28-38中任一项所述的方法，其中并行地向所述受试者施用所述透明质酸酶多肽或编码所述透明质酸酶多肽的所述多核苷酸，和所述药剂。
43.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中通过皮下或肌肉内向所述受试者施用所述透明质酸酶多肽或编码所述透明质酸酶多肽的所述多核苷酸，和所述药剂。
44.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述透明质酸酶多肽或由所述多核苷酸编码的所述透明质酸酶多肽水解透明质酸并导致所述受试者的细胞外基质的解体。
45.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中通过电穿孔向所述受试者施用所述药剂。
46.如权利要求28或权利要求30所述的方法，其中在施用之前共配制所述透明质酸酶多肽或编码所述透明质酸酶多肽的所述多核苷酸，和所述药剂。
47.如以上权利要求中任一项所述的方法，其还包括电穿孔。
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