CN110177570A - 包含Sbi蛋白的免疫原性组合物及其用途 - Google Patents

包含Sbi蛋白的免疫原性组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于刺激针对靶抗原之免疫应答的方法和组合物。更具体地，其涉及葡萄球菌Sbi蛋白的结构域III和IV作为免疫佐剂用于增强针对靶抗原之免疫应答的用途。

Description

包含Sbi蛋白的免疫原性组合物及其用途
技术领域
本发明涉及用于刺激针对靶抗原之免疫应答的方法和组合物。更具体地，其涉及葡萄球菌Sbi蛋白的结构域III和IV作为免疫佐剂用于增强针对共同施用的靶抗原之免疫应答的用途。
发明背景
许多细菌病原体已经进化出适应其宿主环境并通过产生多种免疫调节因子而幸免于宿主免疫系统攻击的方式。
革兰氏阳性人病原体金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有大量的内在因子武器库，其可调节多种宿主中的适应性免疫系统和固有免疫系统，且另外还已进化出使细菌能够操纵宿主免疫调节剂从而使其能够在宿主环境中持续存在的要素。
目前已鉴定和表征了由金黄色葡萄球菌分泌的六种内在补体调节剂。它们包括葡萄球菌补体抑制剂(Staphylococcal complement inhibitor，SCIN)，其与细菌表面处的经典(C4b2a)和旁路(C3bBb)途径C3转化酶结合，使它们稳定并抑制它们的酶活性。胞外纤维蛋白原结合蛋白EFb-C及其同源物Ehp的C端片段与中心补体组分C3的C3d区结合，抑制C3b在靶表面上的沉积。葡萄球菌超抗原样蛋白7(staphylococcal superantigen-likeprotein7，SSL7)通过与C5结合影响终末途径，且通过这样做，最可能的是通过阻止通过C5转化酶的C5裂解而抑制人血清的补体介导的杀菌活性。金黄色葡萄球菌的趋化性抑制蛋白(Chemotaxis inhibitory protein of S aureus，CHIPS)以阻止通过炎性过敏毒素C5a的信号传导的方式与吞噬细胞上存在的C5a受体结合。
最近表征为金黄色葡萄球菌(S.aureus)免疫调节剂的“金黄色葡萄球菌免疫球蛋白结合剂”(S.aureus binder of immunoglobulin，Sbi)通过形成不溶性复合物隔离宿主IgG，从而影响适应性免疫系统(Atkins等，2008，Mol Immunol 45，1600-1611)。除免疫球蛋白结合结构域I和II之外，Sbi包含另外两个结构域(Sbi-III和IV)，其可结合C3d(在天然C3、iC3b和C3dg中)，并且经由与被激活的C3b的共价加合物通过引起最丰富的的补体组分C3的无效流体相消耗(futile fluid phase consumption)(Burman等，2008，J Biol Chem283，17579-17593)来协同抑制旁路途径。
WO2007/138328提出了包含Sbi-III和IV结构域的构建体用于通过消耗补体组分下调炎症性免疫应答的用途。
发明简述
本发明利用Sbi结构域III和IV协同作用的能力来激活关键补体蛋白C3。
金黄色葡萄球菌采用这种活性以通过使C3消耗并由此阻止补体途径的有效激活来抑制宿主的固有免疫系统。
然而，本发明人已发现Sbi-III-IV与靶抗原的共同施用实际上可增强针对该靶抗原的免疫应答。因此，实际上，Sbi-III-IV能够发挥佐剂的作用。不希望受任何特定理论的束缚，据信Sbi-III-IV的存在引起C3的局部激活，这可导致靶抗原的调理作用(例如通过C3分解产物(例如C3b和C3d))，从而增强针对靶抗原所产生的免疫应答。
因此，本发明以其最广泛的形式提供了包含Sbi-III-IV的补体激活部分，其用作免疫佐剂。
通常来说，用作免疫佐剂需要将补体激活部分与靶抗原联合施用于对象，以在对象中增强针对该靶抗原的免疫应答。
因此，本发明提供了包含Sbi-III-IV的补体激活部分，其用于免疫刺激的方法，其中该方法包括将所述补体激活部分与靶抗原联合施用于对象，用于在对象中增强针对靶抗原的免疫应答。
这可作为替代地描述为提供包含Sbi-III-IV的补体激活部分，其用于在对象中增强针对靶抗原之免疫应答的方法，其中所述补体激活部分与靶抗原联合施用于对象。
本发明还提供了包含Sbi-III-IV的补体激活部分，其用于刺激针对靶抗原之免疫应答的方法，其中所述方法包括将所述补体激活部分与靶抗原联合施用于对象，其中补体激活部分在对象中增强针对靶抗原的免疫应答。
本发明还提供了免疫刺激的方法，其包括施用包含Sbi-III-IV的补体激活部分作为免疫佐剂。
本发明还提供了免疫刺激的方法，其中所述方法包括将包含Sbi-III-IV的补体激活部分与靶抗原联合施用于对象，以在对象中增强针对靶抗原的免疫应答。
本发明还提供了在对象中增强针对靶抗原之免疫应答的方法，其中所述方法包括将包含Sbi-III-IV的补体激活部分与靶抗原联合施用于对象。
本发明还提供了刺激针对靶抗原之免疫应答的方法，其中所述方法包括将包含Sbi-III-IV的补体激活部分与靶抗原联合施用于对象，其中补体激活部分在对象中增强针对靶抗原的免疫应答。
本发明还提供了涉及包含Sbi-III-IV的补体激活部分在制备用作免疫佐剂的药物中的用途。
本发明还提供了包含Sbi-III-IV的补体激活部分在制备用于免疫刺激的方法的药物中的用途，其中所述方法包括将所述补体激活部分与靶抗原联合施用于对象以在对象中增强针对靶抗原的免疫应答。
本发明还提供了包含Sbi-III-IV的补体激活部分在制备用于在对象中增强针对靶抗原之免疫应答的方法的药物中的用途，其中所述方法包括将补体激活部分与靶抗原联合施用于对象。
本发明还提供了包含Sbi-III-IV的补体激活部分在制备用于刺激针对靶抗原之免疫应答的方法的药物中的用途，其中所述方法包括将所述补体激活部分与靶抗原联合施用于对象，其中补体激活部分在对象中增强针对靶抗原的免疫应答。
在上述任何方面中，补体激活部分和靶抗原可在同一组合物中(例如在混合物中)或在分开的组合物中提供。通常将期望它们在同一组合物中提供。然而，根据具体组分，这可以是不可能的，例如如果它们对配制的要求是不相容的。如果补体激活部分和靶抗原在分开的组合物中提供，它们通常将在基本上同一部位、通过同一途径并且在彼此的一小时内(更优选在彼此的30分钟内、15分钟内、5分钟内或1分钟内，例如基本上同时)施用。所述组合物可包含载体，例如可药用载体。
在另外的方法中，靶抗原可在施用于接受者对象之前在体外或离体进行调理。
因此，本发明还提供了增强靶抗原之免疫原性的方法，其包括使靶抗原与补体和包含Sbi-III-IV的补体激活部分在体外或离体接触以产生经调理的靶抗原。
再次，据信通过Sbi-III-IV激活补体导致靶抗原的调理作用。当将经调理的靶抗原施用于对象时，对象针对靶抗原的免疫应答与通过等同施用未经过这样的体外或离体调理作用的相同靶抗原来刺激的免疫应答相比通常将增强。
因此，该方法可包括将靶抗原施用于对象的后续步骤。
在施用之前，经调理的靶抗原可与调理作用混合物的其他组分分离。例如，经调理的靶抗原可在施用之前与其他补体组分基本上分离。作为替代或补充，经调理的靶抗原可基本上与补体激活部分分离，尤其是当靶抗原和补体激活部分未共价连接时。
无论是否进行任何这样的分离，该方法还可包括配制经调理的靶抗原(例如，配制为药物组合物)用于向对象施用的步骤。
本发明还提供了刺激针对靶抗原之免疫应答的方法，其中所述方法包括向所述对象施用先前已与补体和包含Sbi-III-IV的补体激活部分在体外或离体接触的靶抗原。
本发明还提供了组合物(例如药物组合物)，其包含已通过与补体和包含Sbi-III-IV的补体激活部分在体外或离体接触而进行调理的靶抗原。
本发明还提供了包含经调理的靶抗原的组合物，其用于刺激针对靶抗原之免疫应答的方法，其中所述靶抗原先前已与补体和包含Sbi-III-IV的补体激活部分在体外或离体接触。
本发明还提供了包含靶抗原的组合物在制备用于刺激针对靶抗原之免疫应答的药物中的用途，其中所述靶抗原先前已与补体和包含Sbi-III-IV的补体激活部分在体外或离体接触。
调理作用可通过将靶抗原和补体激活部分与包含补体的系统在体外或离体混合来实现。
该系统可包含全血、血浆、血清、或其级分。全血、血浆或血清可来源于与预期接受者对象相同的物种、来源于对象自身、或来源于与对象同基因的个体。这降低了针对免疫原性外源补体组分的任何不期望的免疫应答的风险。
或者，该系统可在体外(例如从分离的(例如重组的)补体蛋白和/或能够表达和分泌补体蛋白的细胞)进行组装。
该系统通常将至少包含C3蛋白。其还可至少包含因子I，以及因子H、可溶性补体受体1(soluble complement receptor 1，sCR1)和C4结合蛋白(C4binding protein，C4BP)中的一种或更多种。在通过补体激活部分激活补体之后，可按期望添加其他补体组分，以实现靶抗原的期望调理作用。
此外，补体组分可从与预期接受者对象相同的物种、从对象自身、或从与对象同基因的个体获得，或者它们可以是其重组形式。
当靶抗原和补体激活部分未物理连接但可与这些组分的任意排列一起使用时，体外或离体的调理作用可以是特别地可用的。
在本发明的所有方面中，靶抗原可以是针对其期望引起免疫应答(尤其是抗体应答)的任何合适的分子。
抗原可以是肽抗原。术语“肽”是指抗原的性质，即其是由通过肽键连接的氨基酸形成的，并且不应该被认为意指任何特定的尺寸或长度。通常来说，肽抗原的长度将为至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或至少14个氨基酸，并且可长至10个氨基酸长、长至20个氨基酸长、长至30个氨基酸长、长至50个氨基酸长、长至100个氨基酸、长至200个氨基酸，或者甚至更长。肽抗原可由适于由MHC I类或II类分子呈递的肽组成，或者可包含适于由MHC I类或II类分子呈递的肽的序列并且能够在胞内进行加工以产生这样的肽。通过MHC I类分子呈递的肽通常长度为8或9个氨基酸，而通过MHC II类分子呈递的肽通常长度为14至20个氨基酸。
或者，抗原可以是或可包含任何其他生物分子，包括碳水化合物、多糖、脂质、脂多糖等。实例包括来自感染性生物的细胞膜、细胞壁或荚膜的多糖或脂多糖，例如来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的多糖Pn6B。
靶抗原可与补体激活部分共价连接(例如化学缀合)。
当靶抗原是肽时，其可与补体激活部分一起作为融合蛋白的一部分来提供；即抗原和补体激活部分是同一肽链的一部分。
当靶抗原不是肽，并且未与补体激活部分共价连接时，其可与载体肽共价连接。此外，术语“肽”不旨在限制载体分子的尺寸，而仅是为了表明其性质。
载体肽通常将在预期接受者中具有免疫原性。例如，其可由适于由MHC I类或II类分子呈递的肽组成，或者可包含适于由MHC I类或II类分子呈递的肽的序列并且能够在胞内进行加工以产生这样的肽，其中肽在接受者中是免疫原性的(即，肽被预期接受者的免疫系统识别为免疫外源的或“非自身的”)。为避免疑义，载体肽不是本说明书中限定的补体激活部分。
合适的载体包括匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)及其能够由MHC I类或II类分子呈递或能够加工成这样的肽的片段。其他合适的载体将是本领域技术人员已知的。因此，载体的长度通常为至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或至少14个氨基酸，并且可长至10个氨基酸长、长至20个氨基酸长、长至30个氨基酸长、长至50个氨基酸长、长至100个氨基酸、长至200个氨基酸，或者甚至更长。
本发明还提供了增强靶抗原之免疫原性的方法，其包括将所述靶抗原与包含Sbi-III-IV的补体激活部分相缔合。靶抗原可通过例如以下与补体激活部分相缔合：
(i)将靶抗原与补体激活部分相混合；
(ii)将靶抗原与补体激活部分共价连接；或
(iii)使靶抗原与补体激活部分作为融合蛋白表达。
靶抗原可来源于感染性生物，例如细菌、真菌细胞、病毒、原虫或其他寄生虫。
因此，本发明的方法和组合物可用于预防或治疗被相关感染性生物感染。
靶抗原可以是在肿瘤细胞(neoplastic cell)(例如癌细胞)上特异性或优先表达的标志物。
因此，本发明的方法和组合物可用于预防或治疗瘤形成(例如癌症)。
待施用补体激活部分和靶抗原的对象通常是哺乳动物。例如，对象可以是灵长类(例如旧世界猴(Old World monkey)、新世界猴(New World monkey)、猿或人)、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、犬类动物(canine)(例如家犬)、猫类动物(feline)(例如家猫)、马类动物(equine)(例如马)、牛类动物(bovine)(例如牛)、山羊类动物(caprine)(例如山羊)、绵羊类动物(ovine)(例如绵羊)或兔类动物(lagomorph)(例如兔)。
该方法可包括单次施用，或通过合适确定的时间间隔分隔的一系列两次或更多次施用。该方法可包括致敏(priming)步骤(即第一次施用)，随后是一个或更多个加强步骤(后续施用)。例如，第一次施用(“致敏”)和第二次施用(“加强”)可分隔一天或更多天、一周或更多周，或者一个月或更多个月，优选两周至一个月。后续施用(进一步“加强”施用)可在一周或更多周或者一个月或更多个月之后提供。致敏和加强步骤二者都需要施用靶抗原。补体激活组分可仅在致敏步骤中、仅在加强步骤中，或在致敏和加强步骤二者中施用。
补体激活部分与靶抗原联合的施用增强了对象针对靶抗原的免疫应答。在该上下文中，“增强”不要求对象具有针对靶抗原的预先存在的免疫力。相反，其意味着针对靶抗原所产生的免疫应答大于会在没有补体激活部分提供的另外的补体激活(和随后的免疫刺激)的情况下所实现的免疫应答。例如，免疫应答大于没有补体激活部分或者具有补体激活部分的无活性类似物的等同施用方案所实现的免疫应答。
可根据期望的免疫应答的性质以任何合适的方式测量免疫应答的增强。例如，可提高对靶抗原具有特异性的免疫球蛋白(例如IgG)的效价。
等同施用方案将通常采用相同剂量的靶抗原、载体肽(如果有的话)、施用途径和给药模式。补体激活部分可不存在，或者由非活性类似物替代。
靶抗原可与一种或更多种另外的佐剂(即除补体激活部分之外)联合施用。
可使用任何合适的佐剂。例如，佐剂可以是CD40的激动剂(例如可溶性CD40配体或对CD40具有特异性的激动剂抗体)；CD28、CD27或OX40的激动剂(例如对这些分子之一具有特异性的激动剂抗体)；CTLA-4拮抗剂(例如对CTLA-4具有特异性的阻断抗体)；Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)激动剂；5’三磷酸RNA；β-葡聚糖(例如凝胶多糖(curdlan)(β-1，3-葡聚糖))；或促炎细胞因子(例如TNF-α或IL-1)。
TLR激动剂是激活Toll样受体(例如TLR3、TLR4、TLR5、TLR7或TLR8)的物质。已知的TLR激动剂包括结合TLR4的MPL(单磷酰脂质A)；结合TLR2的LTA(脂磷壁酸)；结合TLR3的聚I∶C(聚肌苷-聚胞苷酸)；结合TLR5的鞭毛蛋白；在小鼠中结合TLR7且据信在人中结合TLR8的瑞喹莫德(R-848；1-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇1-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇)或聚U RNA；结合TLR9的CpG(DNA CpG基序)。对于更多的细节，参见Reis e Sousa，Toll-like receptorsand dendritic cells.Seminars in Immunology 16：27，2004。
现在将通过参照附图和实施例，通过实施例而非限制的方式更详细地描述本发明。
附图说明
图1：补体激活测定。将新鲜的CD21-/-血清添加至Sbi-III-IV-Ag85b或Sbi-III-IV中。在多个时间点(0、30、60、120分钟)时中止反应。用1/1000的兔抗C3和1/2000的山羊抗兔对Western印迹进行显色。C3d显示为确认C3已被激活和分解。(-)是用盐水孵育120分钟的CD21-/-。
图2：实验1(I.P.1)。如通过ELISA所检测的，在用1μg Ag85b或1.35μg Sbi-III-IV-Ag85b腹膜内免疫接种和加强(第28天)时，在WT小鼠中随时间的血清IgG对Ag85b的反应性。将血清以1/50稀释并示出了每个小鼠组的平均吸光度±SEM。所有数据已相对于所有WT小鼠的第0天平均值进行归一化。tOD450＝在450nm处读数取的归一化值。
图3：实验2(I.V.)。如通过ELISA所检测的，在用1μg Ag85b或1.35μg Sbi-III-IV-Ag85b静脉内免疫接种和加强(第28天)时，在WT小鼠中随时间的血清IgG对Ag85b的反应性。将第0至28天的血清以1/50稀释并将第35至50天的血清以1/100稀释并乘以2。示出了每组小鼠的平均吸光度±SEM。所有数据已相对于所有WT小鼠的第0天平均值进行归一化。注意，由于疫苗的IV施用，在加强日第28天没有采集血样。
图4：实验3(I.P.2)。如通过ELISA所检测的，在用150mM NaCl溶液中的2.7μg Sbi-III-IV-Ag85b蛋白、2μg Ag85b或0.7μg Sbi-III-IV加2μg Ag85b腹膜内免疫接种和加强(第28天)时，在WT小鼠中随时间的血清IgG对Ag85b的反应性。将血清以1/50稀释并示出了每组小鼠的平均吸光度±SEM。所有数据已相对于所有WT小鼠的第0天平均值进行归一化。
图5：
A：实验1(I.P.1)和实验3(I.P.2)。如通过ELISA所检测的，在用1.35μg Sbi-III-IV-Ag85b或2.7μg Sbi-III-IV-Ag85b腹膜内免疫接种和加强(第28天)时，在WT小鼠中随时间的血清IgG对Ag85b的反应性。
B：实验1(I.P.1)和实验2(I.V)。如通过ELISA所检测的，在用1.35μg Sbi-III-IV-Ag85b静脉内或腹膜内免疫接种和加强(第28天)时，在WT小鼠中随时间的血清IgG对Ag85b的反应性。
将血清以1/50稀释并示出了每组小鼠的平均吸光度±SEM。所有数据已相对于所有WT小鼠的第0天平均值进行归一化。(注意，实验I.P.1在第42天而不是第50天终止)。
图6：
A：实验2(I.V)。如通过ELISA所检测的，在用1μg Ag85b或1.35μg Sbi-III-IV-Ag85b静脉内免疫接种和加强(第28天)时，在WT、C3-/-和CD21-/-小鼠中随时间的血清IgG对Ag85b的反应性。
B：实验2(I.V)。如通过ELISA所检测的，在用1μg Ag85b或1.35μg Sbi-III-IV-Ag85b静脉内免疫接种和加强(第28天)时，在WT、C3-/-和CD21-/-小鼠中在第42天时血清IgG对Ag85b的反应性。
C：实验3(I.P.2)。如通过ELISA所检测的，在用1μg Ag85b或1.35μg Sbi-III-IV-Ag85b静脉内免疫接种和加强(第28天)时，在WT和C3-/-小鼠中在第42天时血清IgG对Ag85b的反应性。将来自所有IV的第0至28天的血清和所有IP的血清以1/50稀释并将来自IV的第35至50天的血清以1/100稀释并乘以2。示出了每组小鼠的平均吸光度±SEM。所有数据已相对于每组中所有小鼠的第0天平均值进行归一化。注意，由于疫苗的IV施用，在加强日第28天没有采集血样。
图7：
A：实验2(I.V.)。如通过ELISA所检测的，在用1.35μg Sbi-III-IV-Ag85b静脉内免疫接种和加强(第28天)时，在WT小鼠中随时间的血清IgG对Ag85b或Sbi-III-IV-Ag85b的反应性。
B：实验3(I.P.2)。如通过ELISA所检测的，在用2.7μg Sbi-III-IV-Ag85b腹膜内免疫接种和加强(第28天)时，在WT小鼠中随时间的血清IgG对Ag85b或Sbi-III-IV-Ag85b的反应性。
将第0至28天的血清以1/50稀释并将第35至50天的血清以1/100稀释并乘以2。示出了每组小鼠的平均吸光度±SEM。所有数据已相对于所有WT小鼠的第0天平均值进行归一化。
图8：
A：实验2(I.V.)。在IV实验中对于所有小鼠在第50天时血清IgG对Sbi-III-IV的反应性。阳性对照1/100多克隆抗Sbi血清。
B：实验3(I.P.2)。在IP2实验中对于所有小鼠在第50天时血清IgG对Sbi-III-IV的反应性。阳性对照1/100多克隆抗Sbi血清。
将血清以1/50稀释并将数据相对于每组中所有小鼠的第0天平均值进行归一化。示出了每组小鼠的平均吸光度±SEM。
图9：
通过由体内抗原施用致敏的鼠脾细胞的T细胞活化。
A：实验设计示意图。
B：Th1细胞的活化。
C：IFN-γ的产生。
图10：
在体外用Toll样受体配体(Toll-like receptor ligand，TLR)和Sbi-III-IV的多种组合处理的PBMC亚组中的胞内细胞因子产生。第一组：通过单核细胞、经典树突细胞和浆细胞样树突细胞的TNFα产生。第二组：通过单核细胞的IL-1β和IL-10产生，通过浆细胞样树突细胞的IFNα产生。
图11：
Pn6B的(→2-α-D-吡喃半乳糖-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-D-核糖醇-5-磷酸→)重复单元的图示。
图12：
示出了用于产生Sbi-III-IV(V80C)-Pn6B缀合物的合成方法的方案。
图13：
通过与针对经典补体途径(CP)、甘露糖结合凝集素补体途径(MBLP)和旁路补体途径(AP)的Sbi-III-IV、Pn6B和Sbi-III-IV(V80C)-Pn6B缀合物一起孵育来确定补体消耗之后的剩余补体(剩余活性％)。补体消耗(剩余活性％)由以下等式进行量化：(样品-阴性对照)/(阳性对照-阴性对照)×100％。
发明详述
补体
补体系统是固有免疫系统的关键部分，且由一组约20种大多数存在于血清中的蛋白质组成。当该系统被激活时，发生依次酶激活的级联，其中一个反应的产物本身是催化下一个激活阶段的酶。因此，级联包含许多发生指数信号放大的点，可能导致来自非常小的初始刺激的大量应答。
该系统具有三种已知的激活机制，被称为经典途径、旁路途径和凝集素途径。简单地说，这三种途径汇聚成共同的下游效应物或“终末”途径。
通过这三种机制中的任何一种机制的激活具有三个主要作用。首先，其导致产生被称为过敏毒素的小的蛋白质片段，其充当趋化因子以将免疫细胞募集至激活位点。过敏毒素包括组分C3a和C5a。其次，触发补体级联的外源物质(例如微生物、病毒等)通过包被有与外源表面上的羟基和胺基团共价结合的所谓的调理素而被标记用于破坏。这些调理素(包括在下面更详细地描述的C3b)被吞噬细胞(例如中性粒细胞)识别。第三，包含补体组分C5b至C9的被称为攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)的复合物可在外源细胞的膜中形成，导致膜裂解。
蛋白质C3是所有三种补体激活途径中的关键组分。在其完整形式中，其由经二硫键连接的α链和β链组成。α链在Cys1010与Gln1013之间包含不寻常的内部硫酯键，其在补体激活过程中通过C3的裂解而暴露。然后该硫酯键可通过来自合适基团(例如羟基或胺基团)的亲核攻击而裂解，导致在C3b和亲核体之间形成共价加合物，其是调理作用过程的重要部分。
C3b还参与形成能够进一步C3裂解的酶(“C3转化酶”)。iC3b是当C3b被防止补体级联的过度激活的控制蛋白裂解时形成的C3b的失活形式。C3c、C3dg和C3d是iC3b的进一步下游裂解产物。C3d也可发挥调理素的作用。
因此，在给定位点处激活补体通常导致产生补体激活产物(例如过敏毒素和调理素)，其为在这里被称为“应答”细胞的多种免疫细胞类型提供信号。应答细胞主要是免疫系统的细胞，例如嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞。过敏毒素和调理素在这些细胞类型中引发多种功能，例如趋化性(朝向补体激活位点)、肥大细胞脱颗粒、呼吸爆发的激活、经调理靶标的吞噬作用等。特定靶标的调理作用通常导致针对该靶标的抗体的产生增强。
任何包含C3的系统总是通过C3的自发水解而显示低水平的补体激活(被称为“低速(tick-over)”C3激活)。然而，该级联通常受到强大调节机制的控制。
补体激活部分
补体激活部分包含Sbi-III结构域和Sbi-IV结构域，它们一起能够激活补体级联。不希望受理论的束缚，据信当协同作用时，这些结构域与C3一起经历反式酰化反应，因此与C3b形成共价加合物。由此形成的加合物能够驱动局部化补体激活(其可涉及并入因子B、因子D和另外的C3b组分的C3转化酶的形成)，导致靶抗原的调理作用。
天然Sbi蛋白由以下构成(从N端至C端)：前导肽；结构域Sbi-I、II、III和IV；推定的壁锚定序列(WR)和所谓的Y区。其序列(包括信号序列)如下：
“Sbi-III结构域”意指至少包含野生型Sbi序列的第150至197位氨基酸的多肽序列、其片段或与相应的Sbi序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性的变体。Sbi-III结构域的长度可以是至少30、至少35、至少40或至少45个氨基酸。在一些实施方案中，Sbi-III结构域与野生型Sbi-III序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，Sbi-III结构域包含野生型Sbi-III序列。
可能期望不对残基K173进行修饰，因为在该位点的修饰可对Sbi激活补体的能力产生不利影响。
野生型Sbi-III(上文所示分子的第150至197位残基)具有以下序列：
“Sbi-IV结构域”意指至少包含Sbi序列的第198至266位氨基酸的多肽序列、其片段或与相应的Sbi序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性的变体。Sbi-IV结构域保留与C3蛋白(尤其是C3的C3d部分)结合的能力。Clark等，Mol.Immunol.48(2011)，452-462描述了Sbi-IV与C3之间的相互作用。Sbi-IV结构域的长度可以是至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、或至少65个氨基酸。在一些实施方案中，Sbi-IV结构域与野生型Sbi-IV序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。在一些实施方案中，Sbi-IV结构域包含野生型Sbi-IV序列。
可能期望不对S199、S226、R231、N238、K250、K259、K263和/或K264位残基进行修饰，因为在这些位点的修饰可对Sbi与C3b形成共价加合物和/或以其他方式对Sbi激活补体的能力产生不利影响。
野生型Sbi-IV(上文所示分子的第198至266位残基)具有以下序列：
Sbi-III和Sbi-IV序列可如在天然蛋白质中一样是连续的。例如，上文显示的Sbi分子的第150至266位残基(即野生型Sbi-III-IV)具有以下序列：
因此，Sbi-III-IV部分可包含所示Sbi序列的第150至266位残基或其能够与C3进行所需的转酰化反应的片段，或者由其组成。或者，补体激活部分可包含与相应的Sbi序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性和保留与C3进行所需的转酰基反应的能力的变体。在一些实施方案中，Sbi-III-IV部分与野生型Sbi-III-IV序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。
对野生型Sbi-III-IV序列进行修饰的一个实例是引入半胱氨酸残基，例如以促进与靶抗原、尤其是非肽靶抗原(例如碳水化合物、多糖、脂多糖或脂质)的共价连接。例如，邻近Sbi-III-IV蛋白的C端的缬氨酸残基(Sbi-IV的V68；Sbi-III-IV的V116)可突变为半胱氨酸以产生构建体，其在下面的实例中被命名为Sbi-III-IV(V80C)，其具有以下序列：
在一些实施方案中，Sbi-III-IV部分包含野生型Sbi-III-IV序列。
或者，Sbi-III和Sbi-IV结构域可通过接头序列分开。如其他地方所述，肽接头长度通常为12至30个氨基酸，并且小的亲水性氨基酸残基(例如甘氨酸和丝氨酸)的比例高，以在不损害溶解度的情况下提供所需的柔性，并且可包含另外的元件，例如聚-His序列(例如His6至His10)。
在一些实施方案中，补体激活部分不能与免疫球蛋白Fc区结合，即其对免疫球蛋白Fc区基本上没有亲和力。例如，其不包含对Fc具有亲和力的结构域。
在一些实施方案中，补体激活部分不包含除Sbi-III结构域和Sbi-IV结构域之外的任何另外的Sbi序列。例如，其既不包含Sbi-I结构域也不包括Sbi-II结构域。然而，如果期望的话，其可包含Sbi-I结构域或Sbi-II结构域。
“Sbi-I结构域”意指包含上文所示Sbi序列的第42至90位氨基酸的多肽序列、其片段、或与相应的Sbi序列具有至少80％序列同一性的变体。Sbi-I结构域可保留与免疫球蛋白结合(特别是通过Fc区)的能力。
“Sbi-II结构域”意指至少包含上文所示Sbi序列的第92至149位氨基酸的多肽序列、其片段、或与相应的Sbi序列具有至少80％序列同一性的变体。Sbi-II结构域可保留结合免疫球蛋白(特别是通过Fc区)的能力。
关于参照序列的氨基酸序列同一性百分比(％)被限定为在比对序列并引入缺口(如果需要的话)以实现最大百分比序列同一性之后，且不考虑将任何保守替换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。％同一性值可通过WU-BLAST-2(Altschul等，Methods in Enzymology，266：460-480(1996))确定。WU-BLAST-2使用数个搜索参数，其中大多数设置为默认值。可调的参数设置为以下值：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝11。如下确定％氨基酸序列同一性的值：通过用如由WU-BLAST-2确定的匹配相同残基的数目除以参照序列残基的总数(通过WU-BLAST-2被引入到参照序列中以使被忽略的比对得分最大化的缺口)，乘以100。
对“相应的Sbi序列”的引用应当理解为当查询序列与全长Sbi序列最佳比对时，与该查询序列比对的Sbi序列的部分。因此，例如，认为与Sbi-III的连续40个氨基酸区段相同的40个氨基酸序列与该区段相应的Sbi序列具有100％的同一性。
可期望(尽管不是必需的)用于本发明目的的Sbi结构域与仅通过保守替换显示的Sbi序列不同。
保守替换可限定为以下氨基酸组内的替换：
I.Asp和Glu(酸性氨基酸)；
II.Arg、Lys和His(碱性氨基酸)；
III.Asn、Gln、Ser、Thr和Tyr(不带电荷的极性氨基酸)；
IV.Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、Trp和Cys(非极性氨基酸)。
在此描述的补体激活部分可结合来自包括以下的任何哺乳动物物种的C3(并与C3b形成加合物)：啮齿动物(例如小鼠、大鼠)、兔类动物(例如兔)、猫类动物(例如猫)、犬类动物(例如犬)，马类动物(例如马)、牛类动物(例如牛)、山羊类动物(例如山羊)、绵羊类动物(例如绵羊)，其他家畜、牲畜或实验动物，或灵长类(例如旧世界猴、新世界猴、猿或人)。优选地，它们结合人C3蛋白。
如本说明书中其他地方所讨论的，与不存在补体激活部分的等同施用或用补体激活部分的灭活类似物(即不能够激活补体的那些)的等同施用相比，补体激活部分能够增强针对靶抗原的免疫应答。这样的类似物可具有与补体激活部分相同但是已经物理灭活(例如通过不正确的折叠、热处理或其他变性模式)的氨基酸序列。或者，类似物可与补体激活部分在Sbi-III-IV序列中的一个或更多个点突变(例如在K173、S199、R213、N238位置中的一个或更多个)处不同。替换基氨基酸可以是Ala或导致无活性类似物的任何其他残基，即合适的替换包括K173A、S199A、R213A和N238A。因此，任何给定的补体激活部分的参照灭活类似物可通过引入这些修饰中的一个或更多个(如果期望的话)而产生。优选地，类似物仅在一种这样的修饰处而与所讨论的补体激活部分不同。
靶抗原
靶抗原可以是期望针对其引起免疫应答的任何抗原，并且尤其是期望针对其刺激抗体(特别是IgG)产生的任何抗原。
靶抗原可以是肽抗原。如上所述，在此术语“肽”是指抗原的性质，即其是由通过肽键连接的氨基酸形成的，并且不应该被认为隐含任何特定的尺寸或长度。通常来说，肽抗原的长度将为至少8个氨基酸，并且可长至30个氨基酸长、长至50个氨基酸长、长至100个氨基酸、长至200个氨基酸、或者甚至更长。其可以是完整的蛋白质、分离的蛋白质结构域或蛋白质的肽片段。
或者，抗原可以是非肽抗原。其可包含任何其他类型的生物分子(包括碳水化合物、多糖、脂质、脂多糖等)或由其组成。例如，非肽抗原可以是来自感染性生物的细胞膜、细胞壁或荚膜的多糖或脂多糖，例如来自肺炎链球菌的多糖Pn6B。
靶抗原可与补体激活部分共价连接(例如化学缀合)。化学缀合可通过任何合适的方式进行，并且技术人员将充分知晓合适的技术，包括但不限于：(1)通过蛋白质官能团直接偶联(例如，硫醇-硫醇键联、胺-羧基键联、胺-醛键联；酶直接偶联)；(2)胺类的同双官能偶联(例如，使用双醛)；(3)硫醇类的同双官能偶联(例如，使用双马来酰亚胺)；(4)通过光激活试剂的同双官能偶联；(5)胺类与硫醇类的异双官能偶联(例如，使用马来酰亚胺)；(6)通过光激活试剂(例如，β-羰基重氮(β-carbonyldiazo)家族)的异双官能偶联；(7)通过溴化氰激活或羧甲基化将胺反应性基团引入到多糖或寡糖中；(8)通过异双官能化合物(例如马来酰亚胺-酰肼)将硫醇反应性基团引入到多糖或寡糖中；(9)通过将疏水基团引入到蛋白质中的蛋白质-脂质缀合和(10)通过将反应性基团引入到脂质中的蛋白质-脂质缀合。此外，考虑异双官能“非共价偶联”技术，例如生物素-亲和素相互作用。对于缀合技术的全面综述，参见Aslam和Dent(1998)。因此，抗原可与Sbi-III-IV部分的残基的侧链共价连接，例如，与半胱氨酸残基的侧链共价连接。
当靶抗原是肽抗原时，其可作为融合蛋白的一部分与补体激活部分一起提供；即抗原和补体激活部分是同一肽链的一部分。
在融合蛋白中，靶抗原可以是补体激活部分的N端，或者补体激活部分可以是靶抗原的N端。
融合蛋白可包含其他组分。例如，其可包含补体激活部分与靶抗原之间的接头肽。
肽接头长度通常为12至30个氨基酸，小的亲水性氨基酸残基(例如甘氨酸和丝氨酸)的比例高，以在不损害分子的水溶解度的情况下提供所需的柔性。例如，其可包含至少50％的甘氨酸和丝氨酸残基、至少60％的甘氨酸和丝氨酸残基、至少70％的甘氨酸和丝氨酸残基、至少80％的甘氨酸和丝氨酸残基、或至少90％的甘氨酸和丝氨酸残基。
作为替代或补充，融合蛋白可包含肽标签(例如聚-His序列(例如His6至His10))以有利于纯化。例如，这样的标签可位于融合蛋白的N端或C端，或位于接头序列内。通过举例说明，在下面的实施例中，在补体激活部分(Sbi-III-IV)与包含聚-His标签的靶抗原(Ag85b)之间采用接头，并且其序列为GTSGGGGSHHHHHHHHHHSGGGGS。
将根据所期望的免疫应答的性质选择靶抗原自身。
可期望产生针对感染性生物的免疫应答，例如，用于预防或治疗通过该生物的感染。因此，靶抗原可来源于感染性生物，例如细菌、真菌细胞、病毒、原虫或其他寄生虫。在本文中，“来源于”意指由感染性生物遗传编码、表达或以其他方式合成。通常来说，靶抗原将在该生物的表面上表达或以其他方式显示。
细菌靶抗原可来自革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。
细菌靶抗原可来自以下属或种之一的细菌，其包括常见的人病原体：放线菌属(Actinomyces)(例如以色列放线菌(Actinomyces israelii))；芽孢杆菌属(Bacillus)(例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus))；
拟杆菌属(Bacteroides)(例如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis))；
巴尔通体属(Bartonella)(例如汉氏巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana))；
博德特菌属(Bordetella)(例如百日咳博德特菌(Bordetella pertussis))；疏螺旋体属(Borrelia)(例如布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、嘎氏疏螺旋体(Borreliagarinii)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、回归热疏螺旋体(Borreliarecurrentis))；
布鲁氏菌属(Brucella)(例如流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucellasuis))；
弯曲杆菌属(Campylobacter)(例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni))；衣原体属(Chlamydia)和嗜衣原体属(Chlamydophila)(例如肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热嗜衣原体Chlamydophilapsittaci))；
梭菌属(Clostridium)(例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium pgrfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani))；
棒状杆菌属(Corynebacterium)(例如白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae))；
隐球菌属(Cryptococcus)(例如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans))；埃立克体属(Ehrlichia)(例如犬埃立克体(Ehrlichia canis)、恰菲埃立克体(Ehrlichiachaffensis))；
肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium))；
埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli))；
弗朗西斯菌属(Francisella)(例如土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis))；
嗜血杆菌属(Haemophilus)(例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))；
螺杆菌属(Helicobacter)(例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))；
克雷伯菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae))；
军团菌属(Legionella)(例如嗜肺军团菌(Legionella pneumophila))；
钩端螺旋体属(Leptospira)(例如问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、圣地罗西钩端螺旋体(Leptospira santarosai)、韦氏钩端螺旋体(Leptospira weilii)、野口钩端螺旋体(Leptospira noguchii))；
李斯特菌属(Listeria)(例如单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes))；
分枝杆菌属(Mycobacterium)(例如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans))；
支原体属(Mycoplasma)(例如肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae))；
奈瑟菌属(Neisseria)(例如淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis))；
诺卡菌属(Nocardia)(例如星形诺卡菌(Nocardia asteroides))；
假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))；
立克次体属(Rickettsia)(例如立氏立克次体(Rickettsia rickettsii))；
沙门菌属(Salmonella)(例如伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、肠道沙门菌(Salmonella enterica))；
志贺菌属(Shigella)(例如宋内志贺菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri))；
葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus))；
链球菌属(Streptococcus)(例如无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans))；
密螺旋体属(Treponema)(例如苍白密螺旋体(Treponema pallidum))；
脲原体属(Ureaplasma)(例如解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum))；
弧菌属(Vibrio)(例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae))；
耶尔森菌属(Yersinia)(例如鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis))。
在一些实施方案中，抗原不来源于葡萄球菌(Staphylococcus)物种(即，其不是葡萄球菌抗原)。在一些实施方案中，抗原不来源于金黄色葡萄球菌或不来源于表皮葡萄球菌。
真菌靶抗原可来自以下属或种之一，其包括常见的人病原体：
念珠菌属(Candida)(例如白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、皱落念珠菌(Candida rugosa)、近光滑念珠菌(Candida parapsilosis)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、杜氏念珠菌(Candida dubliniensis))；
曲霉属(Aspergillus)(例如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus))；
隐球菌属(Cryptococcus)(例如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans))；
组织胞浆菌属(Histoplasma)(例如荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum))；
肺孢子菌属(Pneumocystis)(例如耶氏肺孢子菌(Pneumocystis firovecii)、卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii))；
葡萄穗霉属(Stachybotrys)(例如纸葡萄穗霉(Stachybotrys charatum))。
病毒靶抗原可来源于以下病毒科或种之一，其包括常见的人病原体：腺病毒科(例如腺病毒)；
疱疹病毒科(例如1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、EB病毒、人巨细胞病毒、8型人疱疹病毒)；
乳头瘤病毒科(例如人乳头瘤病毒)；
多瘤病毒科(例如BK病毒、JC病毒)；
痘病毒科(例如天花)；
嗜肝DNA病毒科(例如乙型肝炎病毒)；
细小病毒科(例如细小病毒B19)；
星状病毒科(例如人星状病毒)；
杯状病毒科(例如诺瓦克病毒)；
微小RNA病毒科(例如柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)；
冠状病毒科(例如严重急性呼吸综合征病毒)；
黄病毒科(例如丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革病毒、西尼罗病毒、TBE病毒)；
披膜病毒科(例如风疹病毒)；
肝炎病毒科(例如戊型肝炎病毒)；
逆转录病毒科(例如人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)，I型、II型、III型和IV型人T细胞白血病病毒(Human T-cell leukaemia virus，HTLV))；
正黏病毒科(例如流感病毒)；
沙粒病毒科(例如拉沙病毒)；
布尼亚病毒科(例如克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒)；
丝状病毒科(例如埃博拉病毒、马尔堡病毒)；
副黏病毒科(例如麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒)；
弹状病毒科(例如狂犬病毒)；
丁型肝炎病毒；
呼肠弧病毒科(例如轮状病毒、环状病毒、科罗拉多蜱传热病毒(Coltivirus)、版纳病毒)。
原虫靶抗原可来源于以下原虫的属或种之一，其包括常见的人病原体：
疟原虫属(Plasmodium spp.)(引起疟疾，例如恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)和诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesii))
内阿米巴属(Entamoeba)(引起阿米巴痢疾的溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica))；
贾第虫属(Giardia)(引起贾第虫病，例如兰伯贾第虫(Giardia lamblia))；
锥虫(ttypanosome)(例如引起非洲睡眠病的布氏锥虫(Trypanosoma brucei)，以及克氏锥虫(Trypanosoma cruzi))；
利什曼原虫属(Leishmania)(例如利什曼原虫属(Leishmania spp.)和墨西哥利什曼原虫(Leishmania mexicana))；
弓形体属(Toxoplasma)(例如鼠弓形体(Toxoplasma gondii))；
棘阿米巴属(Acanthamoeba)；
巴贝虫属(Babesia)；
巴拉姆阿米巴属(Balamuthia)(例如狒狒巴拉姆阿米巴(Balamuthiamandrillaris))
隐孢子虫属(Cryptosporidium)；
环孢子虫属(Cyclospora)；
耐格里原虫属(Naegleria)(例如福氏耐格里原虫(Naegleria fowleri))。
这些生物中的一些(例如疟原虫、锥虫、利什曼原虫和鼠弓形体)也可感染宿主细胞。
可从中获得靶抗原的其他寄生虫包括蠕虫(例如似蚓蛔线虫(Ascarislumbricoides)、蛲虫、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、弓蛔虫属(Toxocara)、麦地那龙线虫(guinea worm)、钩虫、绦虫、鞭虫)和吸虫(例如血吸虫属(Schistosoma)、腭口线虫属(Gnathostoma)、并殖吸虫属(Paragonimus)、肝片吸虫(Fasciola hepatica)、毛毕属血吸虫(Trichobilharzia regenti))。
刺激针对肿瘤细胞的免疫应答也可以是有益的。肿瘤细胞可以是良性或恶性的。其可以是癌细胞。
因此，靶抗原可以是在肿瘤细胞(例如癌细胞)上特异性或优先表达的标志物。这样的标志物可被称为“肿瘤特异性标志物”或“肿瘤特异性抗原”，尽管它们的表达不限于实体瘤。
在肿瘤细胞上表达的标志物可以是“自身”抗原。因此，靶抗原可来源于与其待施用的对象相同的物种，或来源于对象自身。
“自身”癌抗原的实例包括：甲胎蛋白(AFP，见于生殖细胞肿瘤和肝细胞癌)、癌胚抗原(CEA，见于肠癌以及某些肺和乳腺癌)、CA-125(见于卵巢癌)、MUC-1(见于乳腺癌)、上皮肿瘤抗原(ETA，见于乳腺癌)、酪氨酸酶(见于恶性黑素瘤)、黑素瘤相关抗原(MAGE，见于恶性黑素瘤)以及Ras和p53的变体。
瘤形成的标志物可作为替代地是“非自身”的，例如，来源于与瘤形成相关(或引起瘤形成)的感染性生物。许多瘤形成和癌症与肿瘤病毒相关或由其引起。这样的病症及其相关病毒包括肝细胞癌(肝炎病毒，包括乙型肝炎和丙型肝炎)；热带痉挛性轻截瘫(tropicalspastic paraparesis)和成人T细胞白血病(人嗜T淋巴细胞病毒[HTLV]；子宫颈癌、肛门癌、阴茎癌、外阴/阴道癌和口咽癌(人乳头瘤病毒)；卡波西肉瘤、多中心卡斯尔曼病(multicentric Castleman’s disease)和原发性渗出性淋巴瘤(卡波西肉瘤相关疱疹病毒[HHV-8])；梅克尔细胞癌(梅克尔细胞多瘤病毒)；以及伯基特淋巴瘤(Burkitt’slymphoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、移植后淋巴细胞增生性疾病和鼻咽癌(EB病毒[EBV])。因此，靶抗原可以是来源于这些病毒之一的抗原。
为避免任何疑义，靶抗原不是Sbi。例如，抗原通常与Sbi蛋白具有小于60％的序列同一性。(也就是说，当与上述Sbi序列最佳比对时，抗原与重叠区中相应的Sbi序列具有小于60％的序列同一性)。优选地，抗原与相应的Sbi序列具有小于50％、小于40％、小于30％、小于25％或小于20％的序列同一性。
补体激活部分包含Sbi-III-IV。如上所讨论，其还可包含另外的Sbi序列，包括Sbi-I结构域和/或Sbi-II结构域。这些序列不应被解释为构成靶抗原。
药物组合物和治疗方法
本文中描述的分子可配制成药物组合物。除上述物质之一之外，这些组合物还可包含可药用赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。这样的材料应该是无毒的并且不应干扰活性成分的效力。载体或其他材料的精确性质可取决于施用途径，其可以是任何合适的途径，并且可以是经口或肠胃外的。由于用经口递送肽试剂所遇到的困难，肠胃外施用可被证明是最合适的。合适的肠胃外途径包括但不限于静脉内、肌内、腹膜内、经皮肤、皮下、透皮和其他黏膜途径，例如经鼻、含服、经直肠和经阴道途径。合适的组合物和施用方法的一些实例在Esseku和Adeyeye(2011)以及Van den Mooter G(2006)中提供。
用于经口施用的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、散剂或液体形式。片剂可包含固体载体，例如明胶或辅料。液体药物组合物通常包含液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或者合成的油。可包含生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液，或者二醇类(例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。
用于静脉内、经皮肤或皮下注射，或在病痛部位注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，其是无热原的并且具有合适的pH、等张性和稳定性。本领域相关技术人员能够很好地使用例如等张载剂(例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液)制备合适的溶液。可根据需要包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
无论待给予个体的活性剂的性质如何(例如细胞、多肽、核酸分子、根据本发明的其他药学上可用的试剂)，优选以“预防有效量”或“治疗有效量”施用(视情况而定，尽管预防可被视为治疗)，这足以显示对个体的益处。实际施用量以及施用的速率和时间过程将取决于被治疗的性质和严重程度。治疗处方(例如剂量决定等)在一般从业者和其他医生的职责范围内，并且通常考虑待治疗的疾病、个体患者的情况、递送部位、施用方法以及从业者已知的其他因素。以上提及的技术和方案的一些实例可见于Remington’s PharmaceuticalSciences，第20版，2000，pub.Lippincott，Williams&Wilkins。
实施例
刺激针对肽抗原的免疫应答
单独和作为融合蛋白表达Sbi-III-IV和来自结核分枝杆菌的Ag85b蛋白。
为了有利于与Pn6B抗原的共价附接，将邻近Sbi-III-IV蛋白的C端的缬氨酸残基(Sbi-IV的V68；Sbi-III-IV的V116)突变为半胱氨酸。将得到的构建体命名为Sbi-III-IV(V80C)。
所有蛋白质都表达有聚-His标签，以有助于纯化。在大肠杆菌(E.coli)和CHO表达系统二者中表达Sbi-III-IV、Ag85b和Sbi-III-IV-Ag85b融合蛋白。Sbi-III-IV(V80C)仅在大肠杆菌中表达。无论使用何种表达系统，都获得了一致的结果。
受试蛋白质
Shi-III-IV
[Sbi序列以斜体示出。]
Ag85b
[全长前体序列。信号肽用下划线示出。Ag85b序列以斜体示出。]
Sbi-III-IV-Ag85b融合
[全长前体序列。信号肽用下划线示出。Sbi和Ag85b序列以斜体示出。]
Sbi-III-IV(V80C)
[Sbi-III-IV(V80C)序列以斜体示出。V至C的替换以粗体和下划线示出。]
重组蛋白表达
为了在CHO细胞中表达，使用转染试剂(Polyplus Transfection)将编码受试蛋白质的质粒转染到CHO细胞中。将细胞在RPMI 1640(Lonza)培养基中保持在37℃下。转染之后一天，通过添加0.8μg/ml潮霉素对细胞进行选择。约1周之后，细胞在维持水平为0.2mg/ml潮霉素的培养基中培养。当分离细胞时收集上清液并在-20℃下保持冷冻。
如Burman等，2008，J Biol Chem 283，17579-17593中所述进行大肠杆菌中的表达。
确认蛋白质产生
收集来自经转染CHO细胞培养物的上清液并与镍-琼脂糖珠(Thermo)混合。将其在4℃下在持续摇动下放置过夜。用镍-His结合缓冲液(包含40至80mM咪唑的0.5M NaCl/0.1M Tris-HCl，pH 8.0)将珠洗涤两次。除去缓冲液并将珠与非还原性PAGE缓冲液1∶1混合，并煮沸5分钟。将样品上样到12.5％SDS-PAGE凝胶上，转移至硝酸纤维素并用抗His和HRPO进行显色。如果显示His标签存在于约48.5kDa处(Sbi-III-IV-Ag85b的尺寸)，则将细胞在96孔板中连续稀释至允许单个集落生长。然后如上所述使用免疫沉淀测试单个集落，并允许阳性集落在更大的T175烧瓶中生长。
通过质谱法和使用多克隆抗Sbi抗体的Western印迹确定细菌表达的Sbi_III-IV蛋白的身份。
上清液的蛋白质纯化
当烧瓶分开时，定期收集来自经转染CHO细胞的上清液。在收集到足够的上清液之后，将其与平衡缓冲液(pH 7.4，50mM NaH2PO4，300mM NaCl，25mM咪唑)1∶1混合，过滤灭菌，并在4℃下以1ml/分钟的速率通过钴柱(GE)。然后用洗涤缓冲液(pH 7.4，50mM NaH2PO4，300mM NaCl，25mM咪唑)洗涤柱，并在(GE)蛋白质纯化系统上用洗脱缓冲液(pH7.4，50mM NaH2PO4，300mM NaCl，300mM咪唑)洗脱。收集在高至100％洗脱缓冲液的梯度下洗脱的蛋白质的级分，并在用考马斯染色剂染色的SDS-PAGE上进行分析，或转移用于用小鼠抗多组氨酸抗体(anti-poly histidine antibody)进行显色的western印迹以确定经纯化的经His-标记的蛋白质的存在。
如Burman等，2008，J Biol Chem 283，17579-17593中所述，使用类似的方法纯化细菌表达的蛋白质。
缓冲液交换和经纯化蛋白质的浓缩
合并包含经纯化的经His-标记的蛋白质的合适级分，并使用30,000kDa截留的旋转柱(Vivaspin)浓缩至最终体积为2.5ml。然后使用PD-10柱(GE)将浓缩的蛋白质进行缓冲液交换到磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。通过纳米滴测量最终产率。
通过Sbi-III-IV-Ag85b的体外补体激活
进行Western印迹分析以确定经纯化的Sbi-III-IV-Ag85b蛋白能够在体外激活补体系统。将新鲜小鼠血清(CD21-/-)添加至Sbi-III-IV或Sbi-III-IV-Ag85b，确保每个制剂中Sbi-III-IV的量等同。通过添加还原样品缓冲液，在0、30、60和120分钟时中止反应，煮沸5分钟并在10％SDS-PAGE凝胶上运行。将其转移至硝酸纤维素膜并用兔抗C3(1/1000)和山羊抗兔HRPO(1/2000)进行显色。
确保疫苗制剂中蛋白质的化学计量
为确保施用等同量的抗原蛋白，用Sbi-III-IV-Ag85b进行免疫接种的小鼠接受1.35μg蛋白质，并且用Ag85b进行免疫接种的小鼠接受1μg。(Sbi-III-IV的分子量为17kDa，且Ag85b的分子量为3.15kDa。)
实验1(I.P.1)
为确定用Sbi-III-IV-Ag85b进行免疫接种的小鼠对Ag85b的免疫应答是否比单独用Ag85b进行免疫接种的小鼠更高，将小鼠通过腹膜内(I.P.)注射进行免疫接种。单独接受抗原Ag85b的动物用200μl 150mM NaCl中的1μg Ag85b进行注射，且接受Sbi-III-IV-Ag85b的动物用200μl 150mM NaCl中的1.35μg Sbi-III-IV-Ag85b进行注射。阴性对照是用200μl150mM NaCl进行免疫接种的小鼠。阳性对照是用1μg Ag85b加完全弗氏佐剂(CompleteFreund’s Adjuvant，CFA)进行免疫接种的WT小鼠。C3-/-小鼠用作内部阴性对照。
在第0天对小鼠进行一次免疫接种并在第28天进行加强。每周收集血清样品(来自约70μl血液)用于ELISA分析直至在第42天通过心脏穿刺处死。
表1：实验1(I.P.1)中使用的小鼠
基因型 免疫接种 n＝
WT(C57BL/6) 200μl 150mM NaCl(阴性对照) 1
WT(C57BL/6) 100μl 0.1mg/ml Ag85b加100μl CFA(阳性对照) 1
WT(C57BL/6) 200μl 150mM NaCl中的1μg Ag85b 4
WT(C57BL/6) 200μl 150mM NaCl中的1.35μg Sbi-III-IV-Ag85b 4
C3<sup>-/-</sup>(C57BL/6) 200μl 150mM NaCl(阴性对照) 2
C3<sup>-/-</sup>(C57BL/6) 200μl 150mM NaCl中的1μg Ag85b 3
C3<sup>-/-</sup>(C57BL/6) 200μl 150mM NaCl中的1.35μg Sbi-III-IV-Ag85b 3
实验2(I.V.)
为确定替代施用途径是否会改善对Ag85b的应答，将小鼠通过静脉内(I.V)注射进行免疫接种。单独接受抗原Ag85b的动物用50μl 150mM NaCl中的1μg Ag85b进行注射，且接受Sbi-III-IV-Ag85b的动物用50μl150mM NaCl中的1.35μg Sbi-III-IV-Ag85b进行注射。C3-/-和CD21-/-小鼠用作内部阴性对照。
在第0天对小鼠进行一次免疫接种并在第28天进行加强。每周收集血清样品(来自约70μl血液)用于ELISA分析直至在第50天通过心脏穿刺处死。由于免疫接种的I.V.途径，在加强日第28天没有采集样品。
表2：实验2(I.V.)中使用的小鼠
实验3(I.P.2)
为确定使Sbi-III-IV-Ag85b的剂量加倍是否会改善对Ag85b的免疫应答，将小鼠通过腹膜内(I.P.)注射进行免疫接种。在该实验中，Ag85b和Sbi-III-IV也作为分开的蛋白质一起施用。
单独接受抗原Ag85b的动物用200μl 150mM NaCl中的2μg Ag85b注射，且接受Sbi-III-IV-Ag85b蛋白的动物用200μl 150mM NaCl中的2.7μg Sbi-III-IV-Ag85b进行注射。用Sbi-III-IV和Ag85b作为分开的蛋白质进行免疫接种的小鼠用包含0.7μg Sbi-III-IV和2μg Ag85b二者的200μl150mM NaCl进行注射以允许等同量的Ag85b。C3-/-小鼠用作内部阴性对照。
在第0天对小鼠进行一次免疫接种并在第28天进行加强。每周收集血清样品(来自约70μl血液)用于ELISA分析直至在第50天通过心脏穿刺处死。
表3：实验3(I.P.2)中使用的小鼠
用于测试对Ag85b之免疫应答的ELISA测定
将96孔板(NUNC Maxisorb)用碳酸盐缓冲液中的1μg/ml Ag85b或1.35μg/ml Sbi-III-IV-Ag85b以50μl/孔包被，并在4℃孵育过夜。用0.01％PBS-吐温洗涤板，并将1％BSA封闭溶液在室温下孵育1小时，并随后进行洗涤。将血清样品在0.01％PBS-吐温中稀释至1/50或1/100，以每孔50μl添加并在室温下孵育1小时。将板洗涤并以1/100稀释度以50μl/孔添加二抗(绵羊抗小鼠IgG HRPO)，并在室温下孵育1小时。制备TMB底物(DMSO中的200μl TMB(10mg/ml)，9.9ml磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，3μl H2O2)。将板洗涤板并添加50μl/孔TMB底物并使其显色6分钟。用50μl/孔的10％H2SO4中止反应，并将板于450nm处读数。
对每个血清样品进行重复，每周进行收集。
为了归一化目的，计算整组小鼠的平均基线“第0天”值并计算每个单独治疗组的分开的“第0天”平均值。在研究过程中，将每个数据点相对于所有小鼠的总体“第0天”平均值除以相关治疗组的“第0天”OD450读数进行归一化。
Sbi-III-IV对针对Ag85b之Th1应答的影响
向雄性小鼠腹膜内注射摩尔当量的在PBS中稀释的Sbi(n＝2)、Ag85b(n＝3)、Sbi-Ag85b(n＝3)、单独的PBS(n＝3)或在常用的佐剂Alum中稀释的Ag85b(n＝2)。有关实验的示意图概要，参见图9A。注射的所有体积均为200μl。实验分两块进行。注射之后5天，使小鼠安乐死并取出脾。处理脾用于体外脾细胞培养物，并添加至包含树突细胞(1×106细胞/孔；克隆DC2.4)的6孔板(2×106细胞/孔)，所述树突细胞已在24小时之前用1μg/孔的Ag85b致敏。将培养物孵育72小时并收集上清液用于根据制造商的说明书(R&D System)在细胞因子特异性ELISA中的分析。然后用新鲜培养基中的50ng PMA(Calbiochem)、500ng离子霉素(Sigma)和1μl BD高尔基封闭(Golgi block)(BD Biosciences)处理细胞。孵育5小时之后(37℃，5％CO2)使细胞沉淀，在PBS中清洗并重悬于2.4G2Fc封闭(BD Pharmingen)中并将小鼠Ig(均在PBS中1/100)在冰上热灭活30分钟。
使用标准流式细胞术分析(即将以1∶200稀释于25μl流式缓冲液中的抗体根据需要添加至96孔ELISA板的每个孔)，使用正向和侧向散射(单峰)结合与CD3-PE和CD4-PerCPCy5.5抗体的阳性反应(且对于CD8-APCH7是阴性的)鉴定活的(Aqua活死阴性)T辅助细胞(Th)。向每个孔中添加100μl封闭的细胞，并在黑暗中在冰上孵育30分钟。然后将细胞在4％甲醛溶液中固定20分钟。为了对胞内蛋白质进行染色，将细胞在100μl BD Perm中透化(BD Biosciences，在冰上孵育15分钟)，然后在黑暗中在冰上与胞内抗体(IFN-γ-pEcy7或IgG2b-APC同种型对照)孵育30分钟。最后，将细胞重悬于250μl的流式缓冲液中，并在FACSCANTO II机器(BD Biosciences)上读数。使用FCS express 6流式研究编辑软件(DeNovoSoftware)分析流式细胞术数据。所有数据均表示为相对于PBS对照培养物中T细胞数的百分比，并在GraphPad Prism7.0上进行统计分析。
由SbiIII-IV-Ag85b缀合物刺激的Th1增殖显著高于单独通过Ag85b刺激或与Alum组合刺激的Th1增殖(图9C)。用Sbi-III-IV-Ag85b致敏的脾细胞的组织培养上清液中分泌的IFN-γ与单独用Ag85b致敏的细胞相比提高了4倍(图9D)。
Sbi-III-IV对树突细胞激活和功能的影响
在存在或不存在聚(I∶C)(10μg/ml，Invivogen)、脂多糖(LPS，10ng/ml，Sigma)、CL075(1μg/ml，Invivogen)和CpG(ODN 2216，7.5μg，Invivogen)的情况下，在有或没有SBI(10μg/ml；确认无内毒素)的情况下，将通过标准密度离心分离的3×106个健康供体PBMC在RPMI加50％自体血清中培养。细胞在37℃，5％CO2下培养14小时，在3小时之后添加布雷菲德菌素A(10μg/ml，eBioscience)。将细胞在根据制造商的方案进行固定和透化(eBioscience)之后，用用于死细胞排除(通常＜30％)的僵尸胺染料(Zombie amine dye)(Biolegend)、表面标志物和随后的胞内细胞因子进行染色。用运行BD FACSDIVATM8.0.1软件并用FlowJo 10.1r5(Tree Star，Inc)进行分析的LSRFortessa X-20进行分析。用PrismV5(GraphPad software Inc)绘图。
谱系-(CD3、16、19、20)HLA-DR+群体是从活的单峰细胞内鉴定出来的。该级分包含CD14+单核细胞以及CD14-树突细胞(DC)群体。CD14-DC被细分为CD123+浆细胞样树突细胞(pDC)和CD123-CD141+(cDC1)或CD2+CD1c+CD11c+(cDC2)经典树突细胞。细胞因子的产生被量化为阳性细胞/亲本群体的百分比。
除非另有说明，否则抗体来自Biolegend(Bio)或BD Biosciences(BD)，表示为抗原-荧光染料，克隆(制造商)：CD11c-BV711，B-ly6(BD)；CD123-BUV395，7G3(BD)；CD14-BV650，M5E2(Bio)，CD141-BV510，1A4(BD)；CD19-AF700，H1B1(Bio)；CD20-AF700，2H7(Bio)；CD3-AF700，SK7(Bio)；CD16-AF700，3G8(Bio)；CD1c-PERCP-Cy5.5，L161(Bio)；CD303-BV605，201A(Bio)；CD304-BV605，U21-1283(BD)；HLAODR-BV780，L243(Bio)；IFNa-PE，LT27：295(MACS Miltenyi Biotec)；IL-10-APC，JES3-9D7(Bio)；IL-12p40/p70-BV421，C8.6(BD)；IL-1b-FITC，JK1B-1(Bio)；IL-8-PE-Cy7，E8N1(Bio)；TNF-APCCy7，Mab11(Bio)。
通过检测特定单核细胞和树突细胞亚群响应于TLR激动剂的混合物(cocktail)(聚(I∶C)、脂多糖、CL075和CpG)的胞内细胞因子产生来研究Sbi-III-IV的佐剂作用。在添加和不添加TLR激动剂混合物的情况下，在10μg/ml Sbi-III-IV存在下的培养均提高了所有检测的细胞亚群中产生TNFα的细胞的百分比。在TLR激动剂的存在下，Sbi-III-IV增强了IL-1b的单核细胞产生和来自浆细胞样DC的IFNα加工(elaboration)。来自单核细胞的IL-10产生降低，因而示出了Sbi-III-IV对人初级免疫效应细胞的佐剂作用，如炎性细胞因子的产生提高和来自单核细胞的抗炎IL-10的降低所证明。与TLR激动剂刺激无关，来自所有细胞的TNFα产生和来自浆细胞样DC的IFNα产生也提高。
Sbi-III-IV(V80C)-Pn6B缀合物的合成
选择来自病原体肺炎链球菌的外保护性荚膜的抗原性多糖Pn6B作为用于对Sbi-III-IV蛋白进行功能化的配体，因为其是用于疫苗生产以防止来自肺炎链球菌感染的常见抗原。Pn6B是0.9至1.5Mda的碳水化合物，且由(→2-a-D-吡喃半乳糖-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-D-核糖醇-5-磷酸→)的重复单元组成。
将Pn6B(20mg)添加至2mL的水并在室温下搅拌直至碳水化合物已溶解(3至6小时)。然后将溶液上样到离子交换柱(Dowex 50W X4-200，四丁基铵形式)上并孵育30分钟，然后使其进行洗脱。合并包含碳水化合物的级分，并随后冷冻干燥以产生白色固体。将固体添加至5mL无水DMSO并在30℃下在N2下搅拌过夜以溶解碳水化合物。将1，1’-羰基二咪唑(1至2mg)的无水DMSO溶液(1mL)添加至碳水化合物溶液并使其搅拌1小时。添加三乙胺(0.05mL)，随后添加N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-乙基)-3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺(100mg)，并将反应物搅拌2小时。将溶液转移至透析袋(12至14KDa截留)并针对1)5升0.1M磷酸钠缓冲液(pH＝7)；2)5升0.01M磷酸钠缓冲液(pH＝7)；3)5升的水进行透析。然后用离子交换树脂(Dowex 50W X8-100，H+形式)处理透析袋中的溶液。通过离心除去树脂。将上清液冷冻干燥以产生24mg白色固体。通过NMR波谱法分析部分产物以确定碳水化合物上的烷基化试剂负载。这是通过比较马来酰亚胺的烯烃质子信号与岩藻糖的甲烷质子信号的积分来确定的。
将Sbi-III-IV(V80C)(0.5mg，3.57×10-2mmol)溶于脱氧磷酸钠缓冲液(0.5mL，200mM，pH＝7，包含1mM EDTA和5当量THPP)中。将反应物在25℃下孵育24小时。随后添加5-叠氮基戊酸(5当量)以使溶液中剩余的膦氧化并孵育30分钟。最后，将Pn6B-马来酰亚胺(0.5mg)的脱氧溶液(0.5ml，水)添加至刚还原的蛋白质，并在环境温度下孵育长至24小时。使用SDS PAGE分析生物缀合反应。将等分试样的溶液(10μL)添加至还原性SDS PAGE上样缓冲液(10μL)。将该溶液的样品(10μL)上样到预制凝胶(precast gel)中用于SDS PAGE电泳(Invitrogen，NuPage 4％至12％Bis-Tris梯度凝胶，NuPage MOPS SDS运行缓冲液，BioRad PowerPac HV，200V，45至55分钟)。随后用考马斯染色剂对凝胶进行染色，随后浸泡在脱色溶液(水∶乙醇∶乙酸，16∶3∶1)中。在凝胶的上样孔内存在染色材料提供了高分子量碳水化合物-蛋白质缀合物的阳性指示。还使用尺寸排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC，sizeexclusion high performance liquid chromatography)来确认缀合物的产生。将反应物的样品(10μL)注射到配备有TOSOH TSKgel SEC-柱(G5000PWXL，7.8mm I.D.X 30.0cm L)的Dionex Ultimate 3000 HPLC仪器中。用包含氯化钠(150mM)的磷酸钠缓冲液(50mM，pH＝7)以0.5ml/分钟洗脱样品，其中检测器设定在280nm处。缀合物由宽峰示出，从12至20分钟洗脱，而未反应的Sbi蛋白在23至24分钟时洗脱。
通过添加半胱胺(cysteamine)(5mM)淬灭缀合反应，并通过旋转过滤器离心(30kDa截留膜)除去反应混合物中未反应的Sbi蛋白。
通过Sbi-III-IV(V80C)-Pn6B的体外补体激活
使用由Seelen等描述的Wielisa总补体系统筛选(Wieslab)检测通过经典补体途径(CP)、甘露糖结合凝集素补体途径(MBLP)和旁路补体途径(AP)的Sbi-III-IV、Pn6B和Sbi-III-IV(V80C)-Pn6B的消耗。每1μl人血清(阳性对照血清，随试剂盒提供)添加1μg Sbi或Sbi缀合物，并在37℃下预孵育30分钟之后测定补体活性。根据制造商的说明书，一式两份完成测定，并包括空白、阳性对照(来自健康个体的人血清)和阴性对照(热灭活血清)。使用以下等式从405nm处的吸光度对剩余补体活性抑制(即消耗之后剩余的补体活性)进行量化：(样品-阴性对照)/(阳性对照-阴性对照)×100％。
通过暴露于Sbi-III-IV(V80C)-Pn6B的T细胞激活
将健康人志愿者捐献的外周血在注射器中肝素化(10单位/ml)，并与RPMI 1640培养基以1∶1的比例混合。将35ml血液/RPMI铺在50ml Falcon管中的15ml Lymphoprep(Greiner Bio One)的顶部。将它们以1500RPM离心30分钟，其中在减速时关闭制动。然后使用Pasteur移液管从管中提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)层并在RPMI1640培养基中清洗三次。将PBMC重悬于具有补体的RPMI培养基+10％人血清中。然后用200μl Sbi-III-IV或Sbi-III-IV(V80C)-Pn6B缀合蛋白(10μg/ml)处理PBMC，然后在37℃(5％CO2)下孵育24小时。然后将细胞在冰冷的PBS中清洗一次，悬浮在100μlPBS中，并随后用10μl经标记的抗体(抗CD69)处理。然后将抗体标记的细胞在4℃下孵育30分钟，然后在冰冷的PBS中清洗两次，重悬于400μl PBS中并使用FACSCanto流式细胞仪(BDBioscience)进行分析并使用DIVA软件进行处理。
CD69是T细胞活化的重要指标。与未缀合的Pn6B抗原相比，淋巴细胞暴露于Sbi-III-IV(V80C)-Pn6B缀合物导致CD69的表面表达显著提高，表明与未缀合的抗原相比，针对缀合物的T细胞应答增强(数据未示出)。
虽然本发明已结合上述示例性实施方案进行描述，但是当给出本公开内容时，许多等同的修改和变化对于本领域技术人员将是明显的。因此，所阐述的本发明的一些示例性实施方案被认为是举例说明性的而非限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所描述的实施方案进行多种改变。本文中引用的所有文献均明确地通过引用并入。

Claims (33)

1.包含Sbi-III-IV的补体激活部分，其用作免疫佐剂。
2.包含Sbi-III-IV的补体激活部分，其用于在对象中增强针对靶抗原之免疫应答的方法，其中将所述补体激活部分与所述靶抗原联合施用于对象。
3.根据权利要求2所述应用的补体激活部分，其中所述靶抗原是肽抗原。
4.根据权利要求2所述应用的补体激活部分，其中所述靶抗原包含碳水化合物、糖、多糖、脂质或脂多糖。
5.根据权利要求2至4中任一项所述应用的补体激活部分，其中所述靶抗原与所述补体激活部分相混合。
6.根据权利要求2或权利要求3所述应用的补体激活部分，其中所述靶抗原与所述补体激活部分共价连接。
7.根据权利要求6所述应用的补体激活部分，其中所述靶抗原与所述补体激活部分形成融合蛋白。
8.根据权利要求4所述应用的补体激活部分，其中所述靶抗原与载体肽共价连接。
9.增强靶抗原免疫原性的方法，其包括使所述靶抗原与补体和包含Sbi-III-IV的补体激活部分在体外或离体接触以产生经调理的靶抗原。
10.根据权利要求9所述的方法，其还包括将所述经调理的靶抗原与其他补体组分和/或所述补体激活部分分离的步骤。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其还包括配制所述经调理的靶抗原用于向对象施用的步骤。
12.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其还包括向对象施用所述靶抗原。
13.包含经调理的靶抗原的组合物，其用于刺激针对所述靶抗原之免疫应答的方法，其中所述靶抗原先前已与补体和包含Sbi-III-IV的补体激活部分在体外或离体接触。
14.根据权利要求2至8中任一项所述应用的补体激活部分、根据权利要求10至12中任一项所述的方法、或根据权利要求13所述应用的组合物，其中所述靶抗原来源于感染性生物。
15.根据权利要求14所述应用的补体激活部分、所述的方法或所述应用的组合物，其中所述感染性生物是细菌、真菌细胞、病毒、原虫、蠕虫或吸虫。
16.根据权利要求15所述应用的补体激活部分、所述的方法或所述应用的组合物，其中所述细菌是：
放线菌属(Actinomyces)(例如以色列放线菌(Actinomyces israelii))；
芽孢杆菌属(Bacillus)(例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus))；
拟杆菌属(Bacteroides)(例如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis))；
巴尔通体属(Bartonella)(例如汉氏巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana))；
博德特菌属(Bordetella)(例如百日咳博德特菌(Bordetella pertussis))；
疏螺旋体属(Borrelia)(例如布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、嘎氏疏螺旋体(Borrelia garinii)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、回归热疏螺旋体(Borreliarecurrentis))；
布鲁氏菌属(Brucella)(例如流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucellasuis))；
弯曲杆菌属(Campylobacter)(例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni))；
衣原体属(Chlamydia)和嗜衣原体属(Chlamydophila)(例如肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophilapsittaci))；
梭菌属(Clostridium)(例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani))；
棒状杆菌属(Corynebacterium)(例如白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae))；
隐球菌属(Cryptococcus)(例如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans))；
埃立克体属(Ehrlichia)(例如犬埃立克体(Ehrlichia canis)、恰菲埃立克体(Ehrlichia chaffensis))；
肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium))；
埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli))；
弗朗西斯菌属(Francisella)(例如土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis))；
嗜血杆菌属(Haemophilus)(例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))；
螺杆菌属(Helicobacter)(例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))；
克雷伯菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae))；
军团菌属(Legionella)(例如嗜肺军团菌(Legionella pneumophila))；
钩端螺旋体属(Leptospira)(例如问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、圣地罗西钩端螺旋体(Leptospira santarosai)、韦氏钩端螺旋体(Leptospira weilii)、野口钩端螺旋体(Leptospira noguchii))；
李斯特菌属(Listeria)(例如单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes))；
分枝杆菌属(Mycobacterium)(例如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans))；
支原体属(Mycoplasma)(例如肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae))；
奈瑟菌属(Neisseria)(例如淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis))；
诺卡菌属(Nocardia)(例如星形诺卡菌(Nocardia asteroides))；
假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))；
立克次体属(Rickettsia)(例如立氏立克次体(Rickettsia rickettsii))；
沙门菌属(Salmonella)(例如伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、肠道沙门菌(Salmonella enterica))；
志贺菌属(Shigella)(例如宋内志贺菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)；弗氏志贺菌(Shigella flexneri))；
葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus))；
链球菌属(Streptococcus)(例如无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans))；
密螺旋体属(Treponema)(例如苍白密螺旋体(Treponema pallidum))；
脲原体属(Ureaplasma)(例如解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum))；
弧菌属(Vibrio)(例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae))；或
耶尔森菌属(Yersinia)(例如鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis))。
17.根据权利要求15所述应用的补体激活部分、所述的方法或所述应用的组合物，其中所述真菌细胞是：
念珠菌属(Candida)(例如白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、皱落念珠菌(Candida rugosa)、近光滑念珠菌(Candida parapsilosis)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、杜氏念珠菌(Candida dubliniensis))；
曲霉属(Aspergillus)(例如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillusflavus))；
隐球菌属(Cryptococcus)(例如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans))；
组织胞浆菌属(Histoplasma)(例如荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum))；
肺孢子菌属(Pneumocystis)(例如耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)、卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii))；或
葡萄穗霉属(Stachybotrys)(例如纸葡萄穗霉(Stachybotrys charatum))。
18.根据权利要求15所述应用的补体激活部分、所述的方法或所述应用的组合物，其中所述病毒属于以下类型：
腺病毒科(例如腺病毒)；
疱疹病毒科(例如1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、EB病毒、人巨细胞病毒、8型人疱疹病毒)；
乳头瘤病毒科(例如人乳头瘤病毒)；
多瘤病毒科(例如BK病毒、JC病毒)；
痘病毒科(例如天花)；
嗜肝DNA病毒科(例如乙型肝炎病毒)；
细小病毒科(例如细小病毒B19)；
星状病毒科(例如人星状病毒)；
杯状病毒科(例如诺瓦克病毒)；
微小RNA病毒科(例如柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)；
冠状病毒科(例如严重急性呼吸综合征病毒)；
黄病毒科(例如丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革病毒、西尼罗病毒、TBE病毒)；
披膜病毒科(例如风疹病毒)；
肝炎病毒科(例如戊型肝炎病毒)；
逆转录病毒科(例如人类免疫缺陷病毒(HIV)，I型、II型、III型和IV型人T细胞白血病病毒(HTLV))；
正黏病毒科(例如流感病毒)；
沙粒病毒科(例如拉沙病毒)；
布尼亚病毒科(例如克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒)；
丝状病毒科(例如埃博拉病毒、马尔堡病毒)；
副黏病毒科(例如麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒)；
弹状病毒科(例如狂犬病毒)；
丁型肝炎病毒；
呼肠弧病毒科(例如轮状病毒、环状病毒、科罗拉多蜱传热病毒、版纳病毒)。
19.根据权利要求15所述应用的补体激活部分、所述的方法或所述应用的组合物，其中所述原虫是：
疟原虫属(Plasmodium spp.)(引起疟疾，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)和诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesii))
内阿米巴属(Entamoeba)(引起阿米巴痢疾的溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica))；
贾第虫属(Giardia)(引起贾第虫病，例如兰伯贾第虫(Giardia lamblia))；
锥虫(例如引起非洲睡眠病的布氏锥虫(Trypanosoma brucei)，以及克氏锥虫(Trypanosoma cruzi))；
利什曼原虫属(Leishmania)(例如利什曼原虫属和墨西哥利什曼原虫(Leishmaniamexicana))；
弓形体属(Toxoplasma)(例如鼠弓形体(Toxoplasma gondii))；
棘阿米巴属(Acanthamoeba)；
巴贝虫属(Babesia)；
巴拉姆阿米巴属(Balamuthia)(例如狒狒巴拉姆阿米巴(Balamuthia mandrillaris))
隐孢子虫属(Cryptosporidium)；
环孢子虫属(Cyclospora)；
耐格里原虫属(Naegleria)(例如福氏耐格里原虫(Naegleria fowleri))。
20.根据权利要求2至15中任一项所述应用的补体激活部分、所述的方法或所述应用的组合物，其中所述靶抗原是在肿瘤细胞上特异性或优先表达的标志物。
21.根据前述权利要求中任一项所述应用的补体激活部分、所述的方法或所述应用的组合物，其中所述补体激活部分不结合免疫球蛋白Fc。
22.根据前述权利要求中任一项所述应用的补体激活部分、所述的方法或所述应用的组合物，其中所述补体激活部分不包含Sbi-I或Sbi-II。
23.根据前述权利要求中任一项所述应用的补体激活部分、所述的方法或所述应用的组合物，其中所述补体激活部分包含与野生型Sbi-III序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的Sbi-III结构域。
24.根据前述权利要求中任一项所述应用的补体激活部分、所述的方法或所述应用的组合物，其中所述补体激活部分包含与野生型Sbi-IV序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的Sbi-IV结构域。
25.根据前述权利要求中任一项所述应用的补体激活部分、所述的方法或所述应用的组合物，其中所述补体激活部分包含与野生型Sbi-III-IV序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的Sbi-III-IV部分。
26.增强靶抗原免疫原性的方法，其包括将所述靶抗原与包含Sbi-III-IV的补体激活部分相缔合。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述靶抗原通过以下与所述补体激活部分相缔合：
(i)将所述靶抗原与所述补体激活部分相混合；
(ii)将所述靶抗原与所述补体激活部分共价连接；或
(iii)使所述靶抗原与所述补体激活部分作为融合蛋白表达。
28.免疫刺激的方法，其包括施用包含Sbi-III-IV的补体激活部分作为免疫佐剂。
29.在对象中增强针对靶抗原之免疫应答的方法，其中所述方法包括将包含Sbi-III-IV的补体激活部分与所述靶抗原联合施用于所述对象。
30.包含Sbi-III-IV的补体激活部分在制备用作免疫佐剂的药物中的用途。
31.包含Sbi-III-IV的补体激活部分在制备用于在对象中增强针对靶抗原之免疫应答的方法的药物中的用途，其中所述方法包括将所述补体激活部分与所述靶抗原联合施用于所述对象。
32.刺激针对靶抗原之免疫应答的方法，其中所述方法包括向所述对象施用先前已与补体和包含Sbi-III-IV的补体激活部分在体外或离体接触的靶抗原。
33.包含经调理的靶抗原的组合物在制备用于刺激针对所述靶抗原之免疫应答的药物中的用途，其中所述靶抗原先前已与补体和包含Sbi-III-IV的补体激活部分在体外或离体接触。
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