JP2020500861A - Ｓｂｉタンパク質を含む免疫原性組成物およびその使用 - Google Patents

Ｓｂｉタンパク質を含む免疫原性組成物およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、標的抗原に対する免疫応答を刺激することにおいて使用するための方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、標的抗原に対する免疫応答を強化するための免疫学的なアジュバントとしての、ブドウ球菌のＳｂｉタンパク質のドメインＩＩＩおよびＩＶの使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、標的抗原に対する免疫応答を刺激することにおいて使用するための方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、共に投与される標的抗原に対する免疫応答を強化するための免疫学的なアジュバントとしての、ブドウ球菌のＳｂｉタンパク質のドメインＩＩＩおよびＩＶの使用に関する。
多くの細菌性病原体は、様々な免疫調節因子を産生することにより、それらの宿主環境に適応するための、そして宿主免疫系による攻撃から生き延びるための手段を進化させてきた。
グラム陽性のヒト病原体黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は、様々な宿主における適応および自然免疫系の両方を制御できる内因子の莫大な備蓄を有し、加えて、細菌が宿主免疫制御因子を横取りして宿主環境中で存続し続けることを可能にする進化したエレメントを有する。
現在、黄色ブドウ球菌によって分泌された６種の固有の補体調節因子が、同定され特徴付けられている。そのようなものとしては、ブドウ球菌の補体阻害剤（ＳＣＩＮ）が挙げられ、これは、細菌表面で古典経路（Ｃ４ｂ２ａ）および副経路（Ｃ３ｂＢｂ）のＣ３コンバターゼに結合し、それらを安定化し、それらの酵素活性を阻害する。細胞外フィブリノーゲン結合タンパク質ＥＦｂ−Ｃおよびその相同体ＥｈｐのＣ末端フラグメントは、中央の補体成分であるＣ３のＣ３ｄ領域に結合し、標的表面上のＣ３ｂ蓄積を阻害する。ブドウ球菌の超抗原様タンパク質７（ＳＳＬ７）は、Ｃ５に結合することによって終末経路に影響を与え、その際、ほとんどの場合おそらくＣ５コンバターゼによるＣ５切断を防ぐことによって補体が媒介するヒト血清の殺菌活性を阻害する。黄色ブドウ球菌の走化性阻害タンパク質（ＣＨＩＰＳ）は、炎症性のアナフィラトキシンＣ５ａを介したシグナル伝達を防ぐようにして食細胞上に存在するＣ５ａ受容体に結合する。
「免疫グロブリンの黄色ブドウ球菌結合因子」（Ｓｂｉ）は、黄色ブドウ球菌の免疫調節因子のなかでもごく最近特徴付けられたものであり、不溶性複合体の形成を介して宿主ＩｇＧを隔離することによって適応免疫系に影響を与える（Atkinsら、2008、Mol Immunol 45、1600〜1611）。免疫グロブリンの結合ドメインＩおよびＩＩに加えて、Ｓｂｉは、Ｃ３ｄと結合することができる（天然のＣ３、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄｇにおいて）２つのさらなるドメイン（Ｓｂｉ−ＩＩＩおよびＩＶ）を含有し、活性化されたＣ３ｂとの共有結合の付加物を介して最も豊富な補体成分であるＣ３の無益な流体相の消費を引き起こすことによって、副経路を協調して阻害する（Burmanら、2008、J Biol Chem 283、17579〜17593）。
ＷＯ２００７／１３８３２８は、補体成分を消費することによって炎症性免疫応答を下方制御するためのＳｂｉ−ＩＩＩおよびＩＶドメインを含有するコンストラクトの使用を提唱する。
ＷＯ２００７／１３８３２８
Atkinsら、2008、Mol Immunol 45、1600〜1611 Burmanら、2008、J Biol Chem 283、17579〜17593
本発明は、主要な補体タンパク質であるＣ３を活性化するように協調して作用するＳｂｉドメインＩＩＩおよびＩＶの能力を利用する。
黄色ブドウ球菌は、この活性を採用して、Ｃ３を枯渇させて補体経路の有効な活性化を防ぐことによって宿主の自然免疫系を阻害する。
しかしながら、本発明者らは、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶと標的抗原との共投与が、実際にその標的抗原に対する免疫反応を強化することができることを見出した。したがって、事実上、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶは、アジュバントとして作用することが可能である。いかなる特定の理論に縛られることは望まないが、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶの存在が、Ｃ３の局所的活性化を引き起こし、それが標的抗原のオプソニン化を引き起こすことが可能であり（例えばＣ３の分解生成物、例えばＣ３ｂおよびＣ３ｄによって）、結果として標的抗原に対して生じた免疫応答が強化されると考えられる。
したがって、本発明は、その最も広い形態において、免疫学的なアジュバントとして使用するための、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分を提供する。
典型的には、免疫学的なアジュバントとしての使用は、対象におけるその標的抗原に対する免疫応答を強化するために、補体活性化部分を標的抗原と共に対象に投与することを必然的に伴う。
したがって、本発明は、免疫刺激方法における使用のためのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分であって、前記方法は、対象における標的抗原に対する免疫応答を強化するために、前記補体活性化部分を、標的抗原と共に対象に投与することを含む、上記部分を提供する。
これは、代替として、標的抗原に対する対象における免疫応答を強化する方法における使用のための、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分であって、前記補体活性化部分は、前記標的抗原と共に対象に投与される、上記部分を提供することとしても記載することができる。
本発明はまた、標的抗原に対する免疫応答を刺激する方法における使用のためのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分であって、前記方法は、前記補体活性化部分を、標的抗原と共に対象に投与することを含み、補体活性化部分は、対象における標的抗原に対する免疫応答を強化する、上記部分も提供する。
本発明はさらに、免疫学的なアジュバントとしてＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分を投与することを含む、免疫刺激方法を提供する。
本発明はさらに、対象における標的抗原に対する免疫応答を強化するために、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分を、標的抗原と共に対象に投与することを含む、免疫刺激方法を提供する。
本発明はさらに、標的抗原に対する対象における免疫応答を強化する方法であって、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分を、標的抗原と共に対象に投与することを含む、上記方法を提供する。
本発明はまた、標的抗原に対する免疫応答を刺激する方法であって、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分を、標的抗原と共に対象に投与することを含み、補体活性化部分は、対象における標的抗原に対する免疫応答を強化する、上記方法も提供する。
本発明はさらに、免疫学的なアジュバントとして使用するための医薬の調製における、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分の使用を提供する。
本発明はさらに、免疫刺激方法における使用のための医薬の調製における、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分の使用であって、前記方法は、対象における標的抗原に対する免疫応答を強化するために、前記補体活性化部分を、標的抗原と共に対象に投与することを含む、上記使用を提供する。
本発明はさらに、標的抗原に対する対象における免疫応答を強化する方法における使用のための医薬の調製における、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分の使用であって、補体活性化部分を、標的抗原と共に対象に投与することを含む、上記方法を提供する。
本発明はまた、標的抗原に対する免疫応答を刺激する方法における使用のための医薬の調製における、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分の使用であって、前記補体活性化部分を、標的抗原と共に対象に投与することを含み、補体活性化部分は、対象における標的抗原に対する免疫応答を強化する、上記方法も提供する。
上述した形態のいずれかにおいて、補体活性化部分および標的抗原は、同じ組成物中に（例えば混合剤中に）提供されてもよいし、または別個の組成物中に提供されてもよい。典型的には、それらが同じ組成物中に提供されることが望ましいと予想される。しかしながらこれは、具体的な成分に応じて、例えばそのような成分の調合のための必要条件が相容れない場合、不可能な場合がある。補体活性化部分および標的抗原が別個の組成物中に提供される場合、それらは、典型的には、実質的に同じ部位に、同じ経路によって、互いに１時間以内に、より好ましくは、互いに３０分以内、１５分以内、５分以内または１分以内に、例えば実質的に同時に投与されると予想される。１種または複数の組成物は、担体、例えば医薬的に許容される担体を含んでいてもよい。
代替のアプローチにおいて、標的抗原は、レシピエントである対象に投与される前に、インビトロまたはエクスビボでオプソニン化されてもよい。
したがって本発明はさらに、標的抗原の免疫原性を強化する方法であって、インビトロまたはエクスビボで標的抗原を、補体およびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分と接触させて、オプソニン化された標的抗原を得ることを含む、上記方法を提供する。
ここでも、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶによる補体の活性化が、標的抗原のオプソニン化をもたらすと考えられる。オプソニン化された標的抗原が対象に投与されると、対象の標的抗原に対する免疫応答は、典型的には、このようなインビトロまたはエクスビボでのオプソニン化に晒されなかった同一な標的抗原を同様に投与することによって刺激されると予想される免疫応答と比較して、強化されると予想される。
したがって本方法は、標的抗原を対象に投与する後続の工程を含んでいてもよい。
投与の前、オプソニン化された標的抗原は、オプソニン化混合物の他の成分から単離されていてもよい。例えば、オプソニン化された標的抗原は、投与の前に、他の補体成分から実質的に単離されていてもよい。加えて、または代替として、オプソニン化された標的抗原は、特に標的抗原および補体活性化部分が共有結合で連結されていない場合、補体活性化部分から実質的に単離されていてもよい。
このような単離のいずれが実行されるかにかかわらず、本方法は、対象に投与するために、例えば医薬組成物として、オプソニン化された標的抗原を製剤化する工程をさらに含んでいてもよい。
本発明はまた、標的抗原に対する免疫応答を刺激する方法であって、インビトロまたはエクスビボで補体およびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分と予め接触させた標的抗原を対象に投与することを含む、上記方法も提供する。
本発明はさらに、インビトロまたはエクスビボでの補体およびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分との接触によってオプソニン化された標的抗原を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。
本発明はまた、オプソニン化された標的抗原に対する免疫応答を刺激する方法における使用のための、オプソニン化された標的抗原を含む組成物であって、前記標的抗原は、インビトロまたはエクスビボで補体およびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分と予め接触させている、組成物も提供する。
本発明はまた、標的抗原に対する免疫応答を刺激するための医薬の調製における、標的抗原を含む組成物の使用であって、標的抗原は、インビトロまたはエクスビボで補体およびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分と予め接触させている、使用も提供する。
オプソニン化は、標的抗原および補体活性化部分を、補体を含む系と、インビトロまたはエクスビボで混合することによって達成することができる。
系は、全血、血漿、血清、またはそれらの画分を含んでいてもよい。全血、血漿または血清は、意図されたレシピエントである対象と同じ種、対象それ自身、または対象と同一遺伝子型の個体に由来するものであってもよい。これは、免疫原性的に外来補体成分に対するいかなる不要な免疫応答のリスクも低減させる。
代替として、系は、インビトロで、補体タンパク質および／または例えば補体タンパク質を発現および分泌することが可能な単離された（例えば、組換え）細胞から、集合化させることができる。
系は、典型的には少なくともＣ３タンパク質を含むと予想される。系はまた、少なくとも因子Ｉ、ならびに因子Ｈの１種またはそれより多く、可溶性補体受容体１（ｓＣＲ１）およびＣ４結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）を含んでいてもよい。補体活性化部分による補体活性化後の望ましい標的抗原のオプソニン化を達成するために、要求に応じて他の補体成分が添加されてもよい。
ここでも補体成分は、意図されたレシピエントである対象と同じ種、対象それ自身、または対象と同一遺伝子型の個体から得たものでもよいし、またはそれらの組換え形態であってもよい。
インビトロまたはエクスビボでのオプソニン化は、標的抗原および補体活性化部分が物理的に連結されていない場合、特に有用な場合があるが、これらの成分のあらゆる配置で使用することができる。
本発明の全ての形態において、標的抗原は、それに対する免疫応答、特に抗体応答を生じさせることが望ましいあらゆる好適な分子であってもよい。
抗原は、ペプチド抗原であってもよい。用語「ペプチド」は、抗原の性質を指し、すなわち抗原がペプチド結合によって連結されたアミノ酸から形成されていることを指し、何らかの特定のサイズまたは長さを含意すると解釈されるべきではない。典型的には、ペプチド抗原は、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３または少なくとも１４個のアミノ酸長さであると予想され、さらに、最大１０個のアミノ酸長さ、最大２０個のアミノ酸長さ、最大３０個のアミノ酸長さ、最大５０個のアミノ酸長さ、最大１００個のアミノ酸、最大２００個のアミノ酸であるか、またはそれよりさらに長くてもよい。ペプチド抗原は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子による提示に好適なペプチドからなっていてもよいし、またはＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子による提示に好適なペプチドの配列を含んでいてもよく、このようなペプチドが得られるように細胞内でプロセシングすることも可能である。ＭＨＣクラスＩ分子を介して提示されるペプチドは、典型的には８または９個のアミノ酸長さであるが、ＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示されるペプチドは、典型的には１４〜２０個のアミノ酸長さである。
代替として、抗原は、炭水化物、多糖、脂質、リポ多糖などの他のあらゆる生体分子であってもよいし、またはそれらを含んでいてもよい。その例としては、感染性生物の細胞膜、細胞壁または莢膜由来の多糖またはリポ多糖、例えば肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）由来の多糖Ｐｎ６Ｂが挙げられる。
標的抗原は、補体活性化部分に共有結合で連結されていてもよい（例えば、化学的にコンジュゲートしていてもよい）。
標的抗原がペプチドである場合、標的抗原は、補体活性化部分との融合タンパク質の一部として提供されてもよく、すなわち抗原および補体活性化部分は、同じペプチド鎖の一部である。
標的抗原がペプチドではなく、補体活性化部分に共有結合で連結されていない場合、標的抗原は、担体ペプチドに共有結合で連結されていてもよい。ここでも用語「ペプチド」は、担体分子のサイズを限定することは意図されておらず、単にその性質を示すに過ぎない。
担体ペプチドは、典型的には、意図されたレシピエントにおいて免疫原性であると予想される。例えば、担体ペプチドは、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子による提示に好適なペプチドからなっていてもよいし、またはＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子による提示に好適なペプチドの配列を含んでいてもよく、このようなペプチドが得られるように細胞内でプロセシングすることも可能であり、ここでペプチドは、レシピエントにおいて免疫原性である（すなわちペプチドは、意図されたレシピエントの免疫系によって免疫学的に外来または「非自己」として認識される）。誤解を避けるために言えば、担体ペプチドは、本明細書で定義されるような補体活性化部分ではない。
好適な担体としては、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子によって提示されること、またはこのようなペプチドにプロセシングされることが可能な、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびそれらのフラグメントが挙げられる。他の好適な担体は、当業者公知であると予想される。したがって担体は、典型的には、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３または少なくとも１４個のアミノ酸長さであると予想され、最大１０個のアミノ酸長さ、最大２０個のアミノ酸長さ、最大３０個のアミノ酸長さ、最大５０個のアミノ酸長さ、最大１００個のアミノ酸、最大２００個のアミノ酸であるか、またはそれよりさらに長くてもよい。
本発明はさらに、標的抗原の免疫原性を強化する方法であって、前記標的抗原を、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分と会合させることを含む、上記方法を提供する。
例えば：
（ｉ）標的抗原を、補体活性化部分と混合すること；
（ｉｉ）標的抗原を、補体活性化部分に共有結合で連結すること；または
（ｉｉｉ）標的抗原を、補体活性化部分との融合タンパク質として発現させること
によって標的抗原を補体活性化部分と会合させてもよい。
標的抗原は、細菌、真菌細胞、ウイルス、原生動物、または他の寄生体などの感染性生物由来であってもよい。
したがって本発明の方法および組成物は、関連する感染性生物による感染の予防または処置のために採用することができる。
標的抗原は、新生細胞、例えばがん細胞上で特異的または優先的に発現されたマーカーであってもよい。
したがって本発明の方法および組成物は、新生物、例えばがんの予防または処置のために採用することができる。
補体活性化部分および標的抗原が投与されることになる対象は、典型的には哺乳動物である。例えば、対象は、霊長類（例えば、旧世界ザル、新世界ザル、類人猿またはヒト）、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、イヌ科動物（例えば、家イヌ）、ネコ科動物（例えば、家ネコ）、ウマ科動物（例えば、ウマ）、ウシ属動物（例えば、ウシ）、ヤギ属動物（例えば、ヤギ）、ヒツジ属動物（例えば、ヒツジ）またはウサギ目動物（例えば、ウサギ）であってもよい。
本方法は、単回投与、または好適に決定された時間間隔で隔てられた一連の２回またはそれより多くの投与を含んでいてもよい。本方法は、プライミング工程（すなわち第１の投与）とそれに続く１回またはそれより多くのブースティング工程（それに続く１回または複数の投与）を含んでいてもよい。例えば、第１の投与（「プライム」）と第２の投与（「ブースト」）とは、１日またはそれより多くの日数、１週またはそれより多くの週数、または１ヶ月またはそれより多くの月数、好ましくは２週間〜１ヶ月、隔てられていてもよい。１週もしくは１ヶ月またはそれより多くの週数もしくは月数の後に、それに続く投与（さらなる「ブースト」投与）が提供されてもよい。プライミングおよびブースティング工程はどちらも、標的抗原の投与を必要とする。補体を活性化する成分は、プライミング工程でのみ、ブースティング工程でのみ、またはプライミングおよびブースティング工程の両方で投与されてもよい。
補体活性化部分を標的抗原と共に投与することは、対象の標的抗原に対する免疫応答を強化する。この文脈における「強化」は、対象が標的抗原に対する既存の免疫性を有することを必要としない。そうではなく、「強化」は、標的抗原に対して生じた免疫応答が、補体活性化部分が提供する追加の補体活性化（およびその結果としての免疫刺激）なしで達成されたと予想される免疫応答より大きいことを意味する。例えば、免疫応答は、補体活性化部分を用いない、または補体活性化部分の不活性な類似体を用いた同等の投与計画によって達成されたと予想される免疫応答より大きい。
免疫応答の強化は、望ましい免疫応答の性質に応じてあらゆる適切な方式で、測定することができる。例えば、標的抗原に特異的な免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）のタイターが増加する可能性がある。
等価な投与計画は、典型的には、同じ用量の標的抗原、担体ペプチド（存在する場合）、投与経路、および投与パターンを採用すると予想される。補体活性化部分は、存在していなくてもよいし、または不活性な類似体で置き換えられていてもよい。
標的抗原は、１種またはそれより多くのさらなるアジュバントと共に、すなわち補体活性化部分に加えて、投与されてもよい。
あらゆる適切なアジュバントを使用することができる。例えば、アジュバントは、ＣＤ４０のアゴニスト（例えば可溶性ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ４０に特異的なアゴニスト抗体）、ＣＤ２８、ＣＤ２７またはＯＸ４０のアゴニスト（例えば、それらの分子の１つに特異的なアゴニスト抗体）、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ−４に特異的なブロッキング抗体）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、５’三リン酸ＲＮＡ、β-グルカン、例えばカードラン（β−１，３−グルカン）、または炎症促進性サイトカイン、例えばＴＮＦ−αまたはＩＬ−１であってもよい。
ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８などのＴｏｌｌ様受容体を活性化する物質である。公知のＴＬＲアゴニストとしては、ＴＬＲ４と結合するＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）；ＴＬＲ２と結合するＬＴＡ（リポタイコ酸）；ＴＬＲ３と結合するポリＩ：Ｃ（ポリイノシン−ポリシチジル酸）；ＴＬＲ５と結合するフラジェリン；レシキモド（Ｒ−８４８；１−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール１−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール）またはマウスにおいてＴＬＲ７と結合し、ヒトにおいてＴＬＲ８と結合すると考えられるポリＵ ＲＮＡ；ＴＬＲ９と結合するＣｐＧ（ＤＮＡ ＣｐＧモチーフ）が挙げられる。さらなる詳細については、Reis e Sousa、Toll-like receptors and dendritic cells. Seminars in Immunology 16：27、2004を参照されたい。
ここで本発明を、添付の図面および実施例を参照することによって限定としてではなく一例としてより詳細に説明する。
補体活性化アッセイ。新鮮なＣＤ２１−／−血清をＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂまたはＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶに添加した。様々なタイムポイント（０、３０、６０、１２０分）で反応を止めた。ウサギ抗Ｃ３を１／１０００で、ヤギ抗ウサギを１／２０００で用いて、ウェスタンブロットを展開した。Ｃ３ｄは、Ｃ３が活性化され分解したことの確認として示される。（−）は、塩類溶液と共に１２０分インキュベートしたＣＤ２１−／−である。 実験１（Ｉ．Ｐ．１）。ＥＬＩＳＡによって検出された、１μｇのＡｇ８５ｂまたは１．３５μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂのいずれかを用いて腹腔内で免疫化およびブーストした場合（２８日目）のＷＴマウスにおける経時的なＡｇ８５ｂに対する血清ＩｇＧの反応性である。血清を１／５０に希釈した。各マウスグループの平均吸光度±ＳＥＭを示す。全てのデータを、全てのＷＴマウスの０日目の平均に正規化した。ｔＯＤ４５０＝４５０ｎｍで読み取った正規化した値。 実験２（Ｉ．Ｖ．）。ＥＬＩＳＡによって検出された、１μｇのＡｇ８５ｂまたは１．３５μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂのいずれかを用いて静脈内で免疫化およびブーストした場合（２８日目）のＷＴマウスにおける経時的なＡｇ８５ｂに対する血清ＩｇＧの反応性である。０日目〜２８日目からの血清を１／５０に希釈し、３５日目〜５０日目からの血清を１／１００に希釈し、２を掛けた。各マウスグループの平均吸光度±ＳＥＭを示す。全てのデータを、全てのＷＴマウスの０日目の平均に正規化した。２８日目のブーストではワクチンのＩＶ投与のために血液サンプルは採取されなかったことに留意されたい。 実験３（Ｉ．Ｐ．２）。ＥＬＩＳＡによって検出された、１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液中の、２．７μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂタンパク質、２μｇのＡｇ８５ｂ、または０．７μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶに加えて２μｇのＡｇ８５ｂのいずれかを用いて腹腔内で免疫化およびブーストした場合（２８日目）のＷＴマウスにおける経時的なＡｇ８５ｂに対する血清ＩｇＧの反応性である。血清を１／５０に希釈した。各マウスグループの平均吸光度±ＳＥＭを示す。全てのデータを、全てのＷＴマウスの０日目の平均に正規化した。 実験１（Ｉ．Ｐ．１）および実験３（Ｉ．Ｐ．２）。ＥＬＩＳＡによって検出された、１．３５μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂまたは２．７μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂのいずれかを用いて腹腔内で免疫化およびブーストした場合（２８日目）のＷＴマウスにおける経時的なＡｇ８５ｂに対する血清ＩｇＧの反応性である。 実験１（Ｉ．Ｐ．１）および実験２（Ｉ．Ｖ）。ＥＬＩＳＡによって検出された、１．３５μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂを用いて静脈内または腹腔内のいずれかで免疫化およびブーストした場合（２８日目）のＷＴマウスにおける経時的なＡｇ８５ｂに対する血清ＩｇＧの反応性である。 血清を１／５０に希釈した。各マウスグループの平均吸光度±ＳＥＭを示す。全てのデータを、全てのＷＴマウスの０日目の平均に正規化した。（実験Ｉ．Ｐ．１を、５０日目とは異なり、４２日目に終わらせたことに留意されたい）。 実験２（Ｉ．Ｖ．）。ＥＬＩＳＡによって検出された、１μｇのＡｇ８５ｂまたは１．３５μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂのいずれかを用いて静脈内で免疫化およびブーストした場合（２８日目）の、ＷＴ、Ｃ３−／−、およびＣＤ２１−／−マウスにおける経時的なＡｇ８５ｂに対する血清ＩｇＧの反応性である。 実験２（Ｉ．Ｖ．）。ＥＬＩＳＡによって検出された、１μｇのＡｇ８５ｂまたは１．３５μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂのいずれかを用いて静脈内で免疫化およびブーストした（２８日目）場合の、ＷＴ、Ｃ３−／−、およびＣＤ２１−／−マウスにおける４２日目のＡｇ８５ｂに対する血清ＩｇＧの反応性である。 実験３（Ｉ．Ｐ．２）。ＥＬＩＳＡによって検出された、１μｇのＡｇ８５ｂまたは１．３５μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂのいずれかを用いて腹腔内で免疫化およびブーストした場合（２８日目）の、ＷＴおよびＣ３−／−マウスにおける４２日目のＡｇ８５ｂに対する血清ＩｇＧの反応性である。全てのＩＶ０日目〜２８日目からの血清および全てのＩＰを１／５０に希釈し、ＩＶ３５日目〜５０日目からの血清を１／１００に希釈し、２を掛けた。各マウスグループの平均吸光度±ＳＥＭを示す。全てのデータを、各グループ中の全てのマウスの０日目の平均に正規化した。２８日目のブーストではワクチンのＩＶ投与のために血液サンプルは採取されなかったことに留意されたい。 実験２（Ｉ．Ｖ．）。ＥＬＩＳＡによって検出された、１．３５μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂを用いて静脈内で免疫化およびブーストした場合（２８日目）のＷＴマウスにおける経時的なＡｇ８５ｂまたはＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂに対する血清ＩｇＧの反応性である。 実験３（Ｉ．Ｐ．２）。ＥＬＩＳＡによって検出された、２．７μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂを用いて腹腔内で免疫化およびブーストした場合（２８日目）の、ＷＴマウスにおける経時的なＡｇ８５ｂまたはＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂに対する血清ＩｇＧの反応性である。 ０日目〜２８日目からの血清を１／５０に希釈し、３５日目〜５０日目からの血清を１／１００に希釈し、２を掛けた。各マウスグループの平均吸光度±ＳＥＭを示す。全てのデータを、全てのＷＴマウスの０日目の平均に正規化した 実験２（Ｉ．Ｖ．）。ＩＶ実験における全てのマウスの５０日目におけるＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶに対する血清ＩｇＧの反応性である。陽性対照１に対して、ポリクローナル抗Ｓｂｉ血清を１００とした。 実験３（Ｉ．Ｐ．２）。ＩＰ２実験における全てのマウスの５０日目におけるＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶに対する血清ＩｇＧの反応性である。陽性対照１に対して、ポリクローナル抗Ｓｂｉ血清を１００とした。 血清を１／５０に希釈し、データを各グループ中の全てのマウスの０日目の平均に正規化した。各マウスグループの平均吸光度±ＳＥＭを示す。 インビボでの抗原投与によってプライミングされたマウス脾細胞によるＴ細胞活性化である。Ａ：実験設計の略図。 インビボでの抗原投与によってプライミングされたマウス脾細胞によるＴ細胞活性化である。Ｂ：Ｔｈ１細胞の活性化。 インビボでの抗原投与によってプライミングされたマウス脾細胞によるＴ細胞活性化である。Ｃ：ＩＦＮ−γの生産。 インビトロにおけるＴｏｌｌ様受容体リガンド（ＴＬＲ）およびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶの様々な組合せで処置されたＰＢＭＣのサブセットにおける細胞内サイトカイン生産である。第１のパネル：単球、古典的樹状細胞、および形質細胞様樹状細胞によるＴＮＦα生産。第２のパネル：単球によるＩＬ−１βおよびＩＬ−１０生産、ならびに形質細胞様樹状細胞によるＩＦＮα生産。 Ｐｎ６Ｂの（→２−α−Ｄ−ガラクトピラノース−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノース−（１→３）−α−Ｌ−ラムノピラノース−（１→４）−Ｄ−リビトール−５−ホスフェート→）繰り返し単位の図解である。 Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）−Ｐｎ６Ｂコンジュゲートの生産に採用された合成方法を示すスキームである。 補体の古典経路（ＣＰ）、マンノース結合レクチン経路（ＭＢＬＰ）、および副経路（ＡＰ）に関する、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ、Ｐｎ６ＢおよびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）−Ｐｎ６Ｂコンジュゲートとのインキュベーションによる補体枯渇後に残留した補体の決定（残存する活性の％）である。補体枯渇（残存する活性の％）を、方程式：（サンプル−陰性対照）／（陽性対照−陰性対照）×１００％により定量した。
補体
補体系は、自然免疫系の重要な部分であり、主として血清中に見出されるおよそ２０種のタンパク質のグループからなる。補体系が活性化されると、１つの反応の生成物それ自身が次の活性化の段階を触媒する酵素である逐次的な酵素活性化のカスケードが起こる。したがってカスケードは、指数関数的なシグナル増幅が起こる多数のポイントを含有することから、結果として非常に小さい最初の刺激から大量の応答が生じる可能性がある。
補体系は、古典経路、副経路、およびレクチン経路と称される３つの公知の活性化メカニズムを有する。簡単に言えば、これらの３つの経路は、共通の下流エフェクターまたは「終末」経路に収束する。
３つのメカニズムのいずれか１つによる活性化は、３つの主要な作用を有する。まず第一に、そのような活性化により、アナフィラトキシンと称される低分子量タンパク質フラグメントの生成が起こり、アナフィラトキシンは、活性化部位に免疫細胞を補充するための化学誘引物質として役立つ。アナフィラトキシンとしては、成分Ｃ３ａおよびＣ５ａが挙げられる。第二に、補体カスケードを始動させる外来物質（例えば微生物、ウイルスなど）は、いわゆるオプソニンでコーティングされることによる破壊のために選定され、それにより外来表面上のヒドロキシル基およびアミン基に共有結合するようになる。これらのオプソニン（Ｃ３ｂなど、以下でより詳細に説明する）は、好中球などの食細胞によって認識される。第三に、外来細胞の膜中に、補体成分Ｃ５ｂ〜Ｃ９を含む膜侵襲複合体（ＭＡＣ）と称される複合体が形成されて、膜の溶解を引き起こすことができる。
タンパク質Ｃ３は、全ての３つの補体活性化経路の重要な成分である。タンパク質Ｃ３は、その無傷の形態において、ジスルフィド架橋によって連結されたアルファ鎖およびベータ鎖からなる。アルファ鎖は、Ｃｙｓ１０１０とＧｌｎ１０１３との間に通常とは異なる内部チオエステル結合を含有し、これは、補体活性化プロセス中にＣ３の切断によって露出する。次いでこのチオエステル結合は、好適な基（例えば、ヒドロキシルまたはアミン基）による求核性攻撃によって切断することができ、それによりオプソニン化プロセスの重要な部分であるＣ３ｂと求核剤との間で共有結合付加物の形成が起こる。
Ｃ３ｂはまた、さらなるＣ３切断が可能な酵素（「Ｃ３コンバターゼ」）の形成にも参加する。ｉＣ３ｂは、補体カスケードの過剰な活性化を防ぐ制御タンパク質によってＣ３ｂが切断されるときに形成されたＣ３ｂの不活性型である。Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄｇおよびＣ３ｄは、ｉＣ３ｂのさらに下流の切断産物である。またＣ３ｄは、オプソニンとしても作用する。
したがって、所与の部位における補体の活性化は、典型的にはアナフィラトキシンやオプソニンなどの補体活性化生成物の生成を引き起こし、それにより、ここでは「レスポンダー」細胞と称される様々な免疫細胞型にシグナルが提供される。レスポンダー細胞は、主として、好塩基球、好中球、肥満細胞およびマクロファージなどの免疫系の細胞である。アナフィラトキシンおよびオプソニンは、これらの細胞型において、例えば走化性（補体活性化部位への）、肥満細胞の脱顆粒、呼吸バーストの活性化、オプソニン化された標的の貪食などの様々な機能を始動させる。特定の標的のオプソニン化は、典型的には、その標的に対する抗体の生成の強化を引き起こす。
Ｃ３を含むいずれの系も常に、Ｃ３の自発的な加水分解（「チックオーバー」Ｃ３活性化と称される）を介した低レベルの補体活性化を示す。しかしながらカスケードは、強力な調節メカニズムによるチェックにおいて正常に維持される。
補体活性化部分
補体活性化部分は、一緒に補体カスケードを活性化することが可能なＳｂｉ−ＩＩＩドメインおよびＳｂｉ−ＩＶドメインを含む。理論に制限されることは望まないが、これらのドメインは、協調して作用すると、Ｃ３とのトランスアシル化反応を受け、したがってＣ３ｂと共有結合の付加物を形成すると考えられる。次いでこのようにして形成された付加物は、局在化した補体活性化（これは、Ｂ因子、Ｄ因子およびさらなるＣ３ｂ成分を取り込むＣ３コンバターゼの形成を含んでいてもよい）を駆動させて、標的抗原のオプソニン化を引き起こすことができる。
天然のＳｂｉタンパク質は、（Ｎ末端からＣ末端へ）リーダーペプチド、Ｓｂｉ−Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶドメイン、推定の壁を固定する配列（ＷＲ）およびいわゆるＹ領域で構成される。その配列は、シグナル配列を含めて以下の通りである：
「Ｓｂｉ−ＩＩＩドメイン」は、少なくとも野生型Ｓｂｉ配列のアミノ酸１５０〜１９７を含むポリペプチド配列、そのフラグメント、または対応するＳｂｉ配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％のいずれかの配列同一性を有するバリアントを意味する。Ｓｂｉ−ＩＩＩドメインは、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、または少なくとも４５個のアミノ酸長さであってもよい。一部の実施態様において、Ｓｂｉ−ＩＩＩドメインは、野生型Ｓｂｉ−ＩＩＩ配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施態様において、Ｓｂｉ−ＩＩＩドメインは、野生型Ｓｂｉ−ＩＩＩ配列を含む。
残基Ｋ１７３が改変されていないことが望ましい場合があり、これは、この部位における改変は、補体を活性化するＳｂｉの能力に有害作用を与える可能性があるためである。
野生型Ｓｂｉ−ＩＩＩ（上記で示した分子の残基１５０〜１９７）は、以下の配列：
ＥＲＱＮＩＥＮＡＤＫＡＩＫＤＦＱＤＮＫＡＰＨＤＫＳＡＡＹＥＡＮＳＫＬＰＫＤＬＲＤＫＮＮＲＦＶＥＫ
を有する。
「Ｓｂｉ−ＩＶドメイン」は、Ｓｂｉ配列の少なくともアミノ酸１９８〜２６６を含むポリペプチド配列、そのフラグメント、または対応するＳｂｉ配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％のいずれかの配列同一性を有するバリアントを意味する。Ｓｂｉ−ＩＶドメインは、Ｃ３タンパク質、特にＣ３のＣ３ｄ部分に結合する能力を保持する。Ｓｂｉ−ＩＶとＣ３との相互作用は、Clarkら、Mol．Immunol．48（2011）、452〜462によって説明されている。Ｓｂｉ−ＩＶドメインは、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、または少なくとも６５個のアミノ酸長さであってもよい。一部の実施態様において、Ｓｂｉ−ＩＶドメインは、野生型Ｓｂｉ−ＩＶ配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施態様において、Ｓｂｉ−ＩＶドメインは、野生型Ｓｂｉ−ＩＶ配列を含む。
残基Ｓ１９９、Ｓ２２６、Ｒ２３１、Ｎ２３８、Ｋ２５０、Ｋ２５９、Ｋ２６３および／またはＫ２６４が改変されていないことが望ましい場合があり、これは、これらの部位における改変は、Ｃ３ｂと共有結合の付加物を形成したり、および／またはそれ以外の方法で補体を活性化したりするＳｂｉの能力に有害作用を与える可能性があるためである。
野生型Ｓｂｉ−ＩＶ（上記で示した分子の残基１９８〜２６６）は、以下の配列：
ＶＳＩＥＫＡＩＶＲＨＤＥＲＶＫＳＡＮＤＡＩＳＫＬＮＥＫＤＳＩＥＮＲＲＬＡＱＲＥＶＮＫＡＰＭＤＶＫＥＨＬＱＫＱＬＤＡＬＶＡＱＫＤＡＥＫＫＶＡ
を有する。
Ｓｂｉ−ＩＩＩおよびＳｂｉ−ＩＶ配列は、天然のタンパク質での状況のように、連続していてもよい。例えば、上記で示したＳｂｉ分子（すなわち野生型Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ）の残基１５０〜２６６は、以下の配列：
ＥＲＱＮＩＥＮＡＤＫＡＩＫＤＦＱＤＮＫＡＰＨＤＫＳＡＡＹＥＡＮＳＫＬＰＫＤＬＲＤＫＮＮＲＦＶＥＫＶＳＩＥＫＡＩＶＲＨＤＥＲＶＫＳＡＮＤＡＩＳＫＬＮＥＫＤＳＩＥＮＲＲＬＡＱＲＥＶＮＫＡＰＭＤＶＫＥＨＬＱＫＱＬＤＡＬＶＡＱＫＤＡＥＫＫＶＡ
を有する。
それゆえにＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ部分は、示されたＳｂｉ配列の残基１５０〜２６６、またはＣ３との必要なアシル基転移反応を受けることが可能なそのフラグメントを含んでいてもよいし、またはそれからなっていてもよい。代替として、補体活性化部分は、対応するＳｂｉ配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、Ｃ３との必要なアシル基転移反応を受ける能力を保持するいずれかのバリアントを含んでいてもよい。一部の実施態様において、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ部分は、野生型Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
野生型Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ配列への改変の例は、システイン残基の導入であり、これは例えば、標的抗原、特に非ペプチド標的抗原、例えば炭水化物、多糖、リポ多糖または脂質への共有結合による連結を容易にするためである。例えば、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶタンパク質のＣ末端に隣接するバリン残基（Ｓｂｉ−ＩＶのＶ６８；Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶのＶ１１６）を、システインに突然変異させて、以下の実施例ではＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）と名付けられたコンストラクトを得てもよく、このコンストラクトは、以下の配列：
ＥＲＱＮＩＥＮＡＤＫＡＩＫＤＦＱＤＮＫＡＰＨＤＫＳＡＡＹＥＡＮＳＫＬＰＫＤＬＲＤＫＮＮＲＦＶＥＫＶＳＩＥＫＡＩＶＲＨＤＥＲＶＫＳＡＮＤＡＩＳＫＬＮＥＫＤＳＩＥＮＲＲＬＡＱＲＥＶＮＫＡＰＭＤＶＫＥＨＬＱＫＱＬＤＡＬＶＡＱＫＤＡＥＫＫＣＡ
を有する。
一部の実施態様において、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ部分は、野生型Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ配列を含む。
代替として、Ｓｂｉ−ＩＩＩおよびＳｂｉ−ＩＶドメインは、リンカー配列によって分離されていてもよい。他所で記載されるように、ペプチドリンカーは、典型的には１２〜３０個のアミノ酸長さであり、溶解性を弱めることなく必要なフレキシビリティーを提供するために、低分子で親水性のアミノ酸残基（例えば、グリシンおよびセリン）の高い比率を有し、ポリＨｉｓ配列（例えば、Ｈｉｓ６〜Ｈｉｓ１０）などの追加のエレメントを含んでいてもよい。
一部の実施態様において、補体活性化部分は、免疫グロブリンＦｃ領域に結合することができず、すなわちこれは、免疫グロブリンＦｃ領域への親和性を実質的に有さない。例えば、補体活性化部分は、Ｆｃへの親和性を有するドメインを含まない。
一部の実施態様において、補体活性化部分は、Ｓｂｉ−ＩＩＩドメインおよびＳｂｉ−ＩＶドメイン以外のいかなるさらなるＳｂｉ配列も含まない。例えば、補体活性化部分は、Ｓｂｉ−ＩドメインまたはＳｂｉ−ＩＩドメインのどちらも含まない。しかしながら、必要に応じて、補体活性化部分は、Ｓｂｉ−ＩドメインまたはＳｂｉ−ＩＩドメインを含んでいてもよい。
「Ｓｂｉ−Ｉドメイン」は、上記で示したＳｂｉ配列のアミノ酸４２〜９０を含むポリペプチド配列、そのフラグメント、または対応するＳｂｉ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するいずれかのバリアントを意味する。Ｓｂｉ−Ｉドメインは、特にＦｃ領域を介して、免疫グロブリンと結合する能力を保持していてもよい。
「Ｓｂｉ−ＩＩドメイン」は、上記で示したＳｂｉ配列の少なくともアミノ酸９２〜１４９を含むポリペプチド配列、そのフラグメント、または対応するＳｂｉ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するいずれかのバリアントを意味する。Ｓｂｉ−ＩＩドメインは、特にＦｃ領域を介して、免疫グロブリンと結合する能力を保持していてもよい。
参照配列に対するアミノ酸配列同一性パーセント（％）は、最大限のパーセント配列同一性が達成されるように配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入し、いずれの保存的置換も配列同一性の一部としての考慮から外した後の、参照配列中のアミノ酸残基と同一な候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。同一性値％は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Altschulら、Methods in Enzymology, 266：460〜480（1996））によって決定することができる。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、数種の検索パラメーターを使用し、それらのほとんどはデフォルト値に設定される。調整可能なパラメーターは、以下の値：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１を用いて設定される。アミノ酸配列同一性値％は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定した場合に一致した同一な残基の数を、参照配列の残基の総数（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって参照配列に導入されたギャップは無視される）で割った値に１００を掛けることによって決定される。
「対応するＳｂｉ配列」との言及は、クエリー配列が全長Ｓｂｉ配列と共に最適にアラインメントされている場合の、そのクエリー配列とアラインメントされるＳｂｉ配列の一部を意味すると解釈されるものとする。したがって、例えば、Ｓｂｉ−ＩＩＩの連続する４０個のアミノ酸ストレッチと同一な４０個のアミノ酸配列は、対応するＳｂｉ配列のそのストレッチに１００％の同一性を有するとみなされると予想される。
本発明の目的のために使用されるＳｂｉドメインが、示されるＳｂｉ配列とは、保存的置換でのみ異なることが望ましい場合がある（ただし必ずしもその限りではない）。
保存的置換は、以下のアミノ酸グループ内の置換と定義することができる：
Ｉ．ＡｓｐおよびＧｌｕ（酸性アミノ酸）；
ＩＩ．Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓ（塩基性アミノ酸）；
ＩＩＩ．Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒ（非荷電極性アミノ酸）；
ＩＶ．Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＴｒｐおよびＣｙｓ（非極性アミノ酸）。
本明細書で記載される補体活性化部分は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ウサギ目動物（例えば、ウサギ）、ネコ科動物（例えば、ネコ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）、ウマ科動物（例えば、ウマ）、ウシ属動物（例えば、ウシ）、ヤギ属動物（例えば、ヤギ）、ヒツジ属動物（例えば、ヒツジ）、他の家用、家畜または実験用動物、または霊長類（例えば、旧世界ザル、新世界ザル、類人猿またはヒト）などの哺乳類種からのＣ３と結合する（そしてＣ３ｂとの付加物を形成する）ことができる。好ましくは、それらは、ヒトＣ３タンパク質と結合する。
本明細書の他所で論じられた通り、補体活性化部分は、補体活性化部分の非存在下における等価な投与、または補体活性化部分の不活性化類似体、すなわち補体を活性化できないものを用いた等価な投与と比較して、標的抗原に対する免疫応答を強化することが可能である。このような類似体は、補体活性化部分と同一なアミノ酸配列を有する場合があるが、例えば不正確なフォールディング、熱処理、または他の変性様式によって物理的に不活性化されている。代替として、類似体は、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ配列中の、例えばＫ１７３位、Ｓ１９９位、Ｒ２１３位、Ｎ２３８位の１つまたはそれより多くにおける１つまたはそれより多くの点突然変異によって、補体活性化部分と異なっていてもよい。置換基のアミノ酸は、Ａｌａまたは不活性な類似体が生じる他のあらゆる残基であってもよく、すなわち好適な置換としては、Ｋ１７３Ａ、Ｓ１９９Ａ、Ｒ２１３ＡおよびＮ２３８Ａが挙げられる。したがって、これらの改変の１つ、または必要に応じてそれより多くを導入することによって、あらゆる所与の補体活性化部分の参照不活性類似体を生成することができる。好ましくは、類似体は、１つのこのような改変でのみ、問題の補体活性化部分と異なる。
標的抗原
標的抗原は、それに対する免疫応答を生じさせることが望ましいあらゆる抗原、特にそれに対する抗体、特にＩｇＧの生産を刺激することが望ましいあらゆる抗原であってもよい。
標的抗原は、ペプチド抗原であってもよい。上述したように、用語「ペプチド」はここで、抗原の性質を指し、すなわち抗原がペプチド結合によって連結されたアミノ酸から形成されていることを指し、何らかの特定のサイズまたは長さを含意すると解釈されるべきではない。典型的には、ペプチド抗原は、少なくとも８個のアミノ酸長さであると予想され、さらに、最大３０個のアミノ酸長さ、最大５０個のアミノ酸長さ、最大１００個のアミノ酸、最大２００個のアミノ酸、またはそれよりさらに長くてもよい。ペプチド抗原は、全長タンパク質、タンパク質の単離されたドメイン、またはタンパク質のペプチドフラグメントであってもよい。
代替として、抗原は、非ペプチド抗原であってもよい。抗原は、炭水化物、多糖、脂質、リポ多糖などの他のあらゆるタイプの生体分子を含んでいてもよいし、またはそれらからなっていてもよい。例えば非ペプチド抗原は、感染性生物の細胞膜、細胞壁または莢膜からの多糖またはリポ多糖、例えば肺炎連鎖球菌からの多糖Ｐｎ６Ｂであってもよい。
標的抗原は、補体活性化部分に共有結合で連結されていてもよい（例えば、化学的にコンジュゲートしていてもよい）。化学的なコンジュゲーションは、あらゆる好適な手段によって実行することができ、当業者は、好適な技術をよく認識していると予想され、このような技術としては、これらに限定されないが、（１）タンパク質官能基を介した直接のカップリング（例えば、チオール−チオール連結、アミン−カルボキシル連結、アミン−アルデヒド連結；酵素の直接のカップリング）；（２）アミンのホモ二官能性のカップリング（例えば、ビス−アルデヒドの使用）；（３）チオールのホモ二官能性カップリング（例えば、ビス−マレイミドの使用）；（４）光活性化された試薬を介したホモ二官能性のカップリング（５）アミンのチオールへのヘテロ二官能性のカップリング（例えば、マレイミドの使用）；（６）光活性化された試薬を介したヘテロ二官能性のカップリング（例えば、β−カルボニルジアゾファミリー）；（７）臭化シアン活性化またはカルボキシメチル化を介して多糖またはオリゴ糖にアミン反応性基を導入すること；（８）マレイミド−ヒドラジドなどのヘテロ二官能性化合物を介して多糖またはオリゴ糖にチオール−反応性基を導入すること；（９）タンパク質に疎水性基を導入することによるタンパク質−脂質コンジュゲーション、および（１０）脂質に反応性基を取り込ませることによるタンパク質−脂質コンジュゲーションなどが挙げられる。また、ビオチン−アビジン相互作用のようなヘテロ二官能性「非共有結合カップリング」技術も予期される。コンジュゲーション技術の総論については、AslamおよびDent（1998）を参照されたい。したがって抗原は、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ部分の残基の側鎖に、例えばシステイン残基の側鎖に、共有結合で連結されていてもよい。
標的抗原がペプチド抗原である場合、標的抗原は、補体活性化部分との融合タンパク質の一部として提供されてもよく、すなわち抗原および補体活性化部分は、同じペプチド鎖の一部である。
融合タンパク質において、標的抗原は、補体活性化部分のＮ末端であってもよいし、または補体活性化部分が、標的抗原のＮ末端であってもよい。
融合タンパク質は、他の成分を含んでいてもよい。例えば、融合タンパク質は、補体活性化部分と標的抗原との間にリンカーペプチドを含んでいてもよい。
ペプチドリンカーは、典型的には１２〜３０個のアミノ酸長さであり、分子の水溶性を弱めることなく必要なフレキシビリティーを提供するために、低分子で親水性のアミノ酸残基（例えば、グリシンおよびセリン）の高い比率を有する。例えば、ペプチドリンカーは、少なくとも５０％のグリシンおよびセリン残基、少なくとも６０％のグリシンおよびセリン残基、少なくとも７０％のグリシンおよびセリン残基、少なくとも８０％のグリシンおよびセリン残基、または少なくとも９０％のグリシンおよびセリン残基を含んでいてもよい。
加えて、または代替として、融合タンパク質は、精製を容易にするために、ペプチドタグ（例えば、ポリＨｉｓ配列、例えばＨｉｓ６〜Ｈｉｓ１０）を含んでいてもよい。このようなタグは、例えば、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に、またはリンカー配列内に配置されていてもよい。例証として、以下の実施例において、リンカーは、補体活性化部分（Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ）と標的抗原（Ａｇ８５ｂ）との間に採用され、このようなリンカーは、ポリＨｉｓタグを含有し、配列ＧＴＳＧＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＳＧＧＧＧＳを有する。
標的抗原それ自身は、望ましい免疫応答の性質に応じて選択されることになる。
例えば感染性生物による感染の予防または処置のために、その生物に対する免疫応答を生じさせることが望ましい場合がある。したがって標的抗原は、細菌、真菌細胞、ウイルス、原生動物、または他の寄生体などの感染性生物由来であってもよい。この文脈において、「〜由来の」は、感染性生物によって遺伝学的にコードされる、発現される、またはそれ以外の方法で合成されることを意味する。典型的には、標的抗原は、その生物の表面上に発現されるかまたはそれ以外の方法で提示されると予想される。
細菌の標的抗原は、グラム陽性細菌由来であってもよいし、またはグラム陰性細菌由来であってもよい。
細菌の標的抗原は、一般的なヒト病原体を含む以下の属または種のうち１つの細菌由来であってもよい：
放線菌属（例えば、アクチノマイセス・イスラエリイ（Actinomyces israelii））；
バチルス属（例えば、炭疽菌（Bacillus anthracis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）；
バクテロイデス属（例えば、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis））；
バルトネラ属（例えば、バルトネラ・ヘンセラ（Bartonella henselae）、バルトネラ・クインターナ（Bartonella quintana））；
ボルデテラ属（例えば、百日咳菌（Bordetella pertussis））；
ボレリア属（例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ボレリア・ガリニ（Borrelia garinii）、ボレリア・アフゼリ（Borrelia afzelii）、回帰熱ボレリア（Borrelia recurrentis））；
ブルセラ属（例えば、ブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）、ブルセラ・カニス（Brucella canis）、ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）、ブルセラ・スイス（Brucella suis）；
カンピロバクター属（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni））；
クラミジア属およびクラミドフィラ属（例えば、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、クラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）、クラミドフィラ・シタッシ（Chlamydophila psittaci））；
クロストリジウム属（例えば、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani））；
コリネバクテリウム属（例えば、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae））；
クリプトコックス属（例えば、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans））；
エーリキア属（例えば、エーリキア・カニス（Ehrlichia canis）、エーリキア・シャフェンシス（Ehrlichia chaffensis））；
エンテロコッカス属（例えば、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium））；
エシェリキア属（例えば、大腸菌（Escherichia coli））；
フランシセラ属（例えば、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis））；
ヘモフィルス属（例えば、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae））；
ヘリコバクター属（例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori））；
クレブシエラ属（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae））；
レジオネラ属（例えば、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila））；
レプトスピラ属（例えば、レプトスピラ・インタロガンス（Leptospira interrogans）、レプトスピラ・サンタロサイ（Leptospira santarosai）、レプトスピラ・ウェイリイ（Leptospira weilii）、レプトスピラ・ノグチイ（Leptospira noguchii））；
リステリア属（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes））；
マイコバクテリウム属（例えば、マイコバクテリウム・レプラ（Mycobacterium leprae）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Mycobacterium ulcerans））；
マイコプラスマ属（例えば、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae））；
ナイセリア属（例えば、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis））；
ノカルジア属（例えば、ノカルジア・アステロイデス（Nocardia asteroides））；
シュードモナス属（例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa））；
リケッチア属（例えば、リケッチア・リケッチイ（Rickettsia rickettsii））；
サルモネラ属（例えば、チフス菌（Salmonella typhi）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella typhimurium））；
シゲラ属（例えば、ソンネ菌（Shigella sonnei）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri））；
スタフィロコッカス属（例えば、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Staphylococcus saprophyticus））；
連鎖球菌属（例えば、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridans））；
トレポネーマ属（例えば、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum））；
ウレアプラスマ属（例えば、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealyticum））；
ビブリオ属（例えば、コレラ菌（Vibrio cholerae））；
エルシニア属（例えば、ペスト菌（Yersinia pestis）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、偽結核菌（Yersinia pseudotuberculosis））。
一部の実施態様において、抗原は、スタフィロコッカス属の種由来ではない（すなわち抗原は、ブドウ球菌抗原ではない）。一部の実施態様において、抗原は、黄色ブドウ球菌またはスタフィロコッカス・エピデルミディス由来ではない。
真菌の標的抗原は、一般的なヒト病原体を含む以下の属または種のうちの１つ由来であってもよい：
カンジダ属（例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、カンジダ・パラシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・ドゥブリニエンシス（Candida dubliniensis））；
アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラーブス（Aspergillus flavus））；
クリプトコックス属（例えば、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans））；
ヒストプラスマ属（例えば、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum））；
ニューモシスチス属（例えば、ニューモシスチス・ジロベシ（Pneumocystis jirovecii）、ニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carinii））；
スタキボトリス属（例えば、スタキボトリス・チャルタルム（Stachybotrys charatum））。
ウイルスの標的抗原は、一般的なヒト病原体を含む以下のウイルスファミリーまたは種のうちの１つ由来であってもよい：
アデノウイルス科（例えば、アデノウイルス）；
ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型）；
パピローマウイルス科（例えば、ヒトパピローマウイルス）；
ポリオーマウイルス科（例えば、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス）；
ポックスウイルス科（例えば、天然痘）；
ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；
パルボウイルス科（例えば、パルボウイルスＢ１９）；
アストロウイルス科（例えば、ヒトアストロウイルス）；
カリチウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス）；
ピコルナウイルス科（例えば、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス）；
コロナウイルス科（例えば、重症急性呼吸器症候群ウイルス）；
フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ＴＢＥウイルス）；
トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス）；
ヘペウイルス科（例えば、Ｅ型肝炎ウイルス）；
レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型）；
オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；
アレナウイルス科（例えば、ラッサウイルス）；
ブニヤウイルス科（例えば、クリミア−コンゴ出血性熱ウイルス、ハンターンウイルス）；
フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス）；
パラミクソウイルス科（例えば、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス）；
ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス）；
Ｄ型肝炎ウイルス；
レオウイルス科（例えば、ロタウイルス、オルビウイルス、コルティウイルス、バンナウイルス）。
原生動物の標的抗原は、一般的なヒト病原体を含む原生動物の以下の属または種のうちの１つ由来であってもよい：
プラスモジウム属の種（マラリアに関与するもの、例えば熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、プラスモジウム・ベルゲイ（Plasmodium berghei）、プラスモディウム・ヨエリ（Plasmodium yoelii）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）および二日熱マラリア原虫（Plasmodium knowlesii））；
エントアメーバ属（赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）は、アメーバ赤痢に関与する）；
ジアルジア属（ランブル鞭毛虫症に関与するもの、例えばランブル鞭毛虫（Giardia lamblia））；
トリパノソーマ属（例えば、アフリカ睡眠症の原因となるトリパノソーマ-ブルーセイ（Trypanosoma brucei）、およびトリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi））；
リーシュマニア属（例えば、リーシュマニア属の種およびメキシコリーシュマニア（Leishmania mexicana））；
トキソプラズマ属（例えば、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii））；
アカントアメーバ属；
バベシア属；
バラムチア属（Balamuthia）（例えば、バラムチア・マンドリルリス（Balamuthia mandrillaris））
クリプトスポリジウム属；
サイクロスポーラ属；
ネグレリア属（例えば、ネグレリア・フォーレリ（Naegleria fowleri））。
これらの生物の一部（例えば、プラスモジウム属、トリパノソーマ属、リーシュマニア属およびトキソプラズマ原虫）は、宿主細胞に感染している場合もある。
標的抗原の由来となる他の寄生虫としては、蠕虫（例えば、回虫（Ascaris lumbricoides）、蟯虫、糞線虫（Strongyloides stercoralis）、トキソカラ属、ギニア虫、鉤虫、条虫、鞭虫）および吸虫（例えば、住血吸虫属、顎口虫属、肺吸虫、肝蛭（Fasciola hepatica）、トリコビルハルジア・レジェンティ（Trichobilharzia regenti））が挙げられる。
新生細胞に対する免疫応答を刺激することが有益な場合がある。新生細胞は、良性であってもよいし、または悪性であってもよい。新生細胞は、がん細胞であってもよい。
したがって、標的抗原は、新生細胞、例えば、がん細胞上で特異的または優先的に発現されたマーカーであってもよい。このようなマーカーは、「腫瘍特異的なマーカー」または「腫瘍特異的な抗原」と称することもできるが、それらの発現は、固形腫瘍に限定されない。
新生細胞上に発現されるマーカーは、「自己」抗原であってもよい。したがって標的抗原は、それが投与されることになる対象と同じ種由来であってもよいし、または対象それ自身由来であってもよい。
「自己」がん抗原の例としては、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ、生殖細胞の腫瘍および肝細胞癌に見出される）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ、腸のがんや特定の肺および乳がんに見出される）、ＣＡ−１２５（卵巣がんに見出される）、ＭＵＣ−１（乳がんに見出される）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ、乳がんに見出される）、チロシナーゼ（悪性黒色腫に見出される）、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ、悪性黒色腫に見出される）、ならびにＲａｓおよびｐ５３のバリアントが挙げられる。
新生物のマーカーは、代替として、「非自己」であってもよく、例えば新生物に関連する（またはその原因となる）感染性生物由来であってもよい。多くの新生物およびがんは、オンコウイルスに関連するかまたはそれによって引き起こされる。このような状態およびそれらに関連するウイルスとしては、肝細胞癌（Ｂ型およびＣ型肝炎などの肝炎ウイルス）、熱帯性痙性不全対麻痺および成人Ｔ細胞白血病（ヒトＴリンパ球向性ウイルス［ＨＴＬＶ］）、子宮頸、肛門、陰茎、陰門／膣のがん、および口腔咽頭がん（ヒトパピローマウイルス）、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病および原発性滲出液リンパ腫（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス［ＨＨＶ−８］）、メルケル細胞癌（メルケル細胞ポリオーマウイルス）、ならびにバーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患および上咽頭癌（エプスタインバーウイルス［ＥＢＶ］）が挙げられる。したがって標的抗原は、これらのウイルスのうちの１つ由来の抗原であってもよい。
あらゆる疑義を回避するために言えば、標的抗原は、Ｓｂｉではない。例えば、抗原は、典型的には、Ｓｂｉタンパク質と６０％未満の配列同一性を有する。（すなわち、上記で詳述したＳｂｉ配列と最適にアラインメントされた場合、抗原は、オーバーラップの領域において対応するＳｂｉ配列と６０％未満の配列同一性を有する）。好ましくは、抗原は、対応するＳｂｉ配列と、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満または２０％未満の配列同一性を有する。
補体活性化部分は、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む。上記で論じられたように、これはまたＳｂｉ−Ｉドメインおよび／またはＳｂｉ−ＩＩドメインなどの追加のＳｂｉ配列を含んでいてもよい。これらの配列は、標的抗原を構成すると解釈されないものとする。
医薬組成物および処置方法
本明細書に記載される分子は、医薬組成物中に配合することができる。これらの組成物は、上記の物質のいずれか１つに加えて、医薬的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または当業者周知の他の材料を含んでいてもよい。このような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の効能に干渉しないものであるべきである。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路によって決めてもよく、投与経路は、あらゆる好適な経路によるものでもよく、経口でもよいし、または非経口でもよい。ペプチド薬剤の経口送達で見られる難点のために、非経口投与が最も好適と示される場合がある。好適な非経口経路としては、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮膚、皮下、経皮、および他の粘膜経路、例えば鼻、頬側、直腸および膣の経路が挙げられる。好適な組成物および投与方法の例は、EssekuおよびAdeyeye（2011）およびVan den Mooter G.（2006）に提供される。
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形態であってもよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固形担体を包含していてもよい。液体医薬組成物は、一般的に、液体担体、例えば水、石油、動物性または植物性油、鉱油または合成油を包含する。生理的食塩水、デキストロースまたは他の糖溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが包含されていてもよい。
静脈内、皮膚もしくは皮下注射、または苦痛を伴う部位における注射の場合、活性成分は、パイロジェンフリーであり、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容できる水溶液の形態であると予想される。当業界における関連する技術を有する者は、例えば等張のビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液を使用した適切な溶液の調製が十分に可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤および／または他の添加剤が包含されていてもよい。
個体に与えられる活性物質（例えば、本発明に係る細胞、ポリペプチド、核酸分子、他の医薬的に有用な物質）の性質にかかわらず、投与は、好ましくは「予防有効量」または「治療有効量」でなされ（場合によっては予防が療法とみなされる場合もあるが）、これは、個体への利益を示すのに十分な量である。投与される実際の量、ならびに投与の頻度および時間経過は、処置しようとするものの性質および重症度によって決まると予想される。処置の処方、例えば投薬時の決定などは、一般開業医や他の医師の責務の範囲内であり、典型的には処置しようとする障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および医師にとって公知の他の要因を考慮に入れる。上述の技術およびプロトコールの例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第20版、2000、Lippincott, Williams & Wilkins出版に見出すことができる。
ペプチド抗原に対する免疫応答の刺激
Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶおよびヒト型結核菌からのＡｇ８５ｂタンパク質を、単独で、さらに融合タンパク質として発現させた。
Ｐｎ６Ｂ抗原への共有結合を容易にするために、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶタンパク質のＣ末端に隣接するバリン残基（Ｓｂｉ−ＩＶのＶ６８；Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶのＶ１１６）をシステインに突然変異させた。得られたコンストラクトをＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）と名付けた。
精製を助けるために、全てのタンパク質をポリＨｉｓタグと共に発現させた。Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ、Ａｇ８５ｂ、およびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂ融合タンパク質を、大腸菌およびＣＨＯ発現系の両方で発現させた。Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）を大腸菌でのみ発現させた。どちらの発現系を使用しても矛盾のない結果が得られた。
試験タンパク質
Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ
［Ｓｂｉ配列はイタリックで示した］。
Ａｇ８５ｂ
［全長前駆体配列。シグナルペプチドは下線で示した。Ａｇ８５ｂ配列はイタリックで示した］。
Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂ融合体
［全長前駆体配列。シグナルペプチドは下線で示した。ＳｂｉおよびＡｇ８５ｂ配列はイタリックで示した］。
Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）
［Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）配列はイタリックで示した。ＶからＣへの置換は太字と下線で示した］。
組換えタンパク質発現
ＣＨＯ細胞での発現のために、試験タンパク質をコードするプラスミドを、ｊｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（ポリプラストランスフェクション（Polyplus Transfections））を使用してＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。細胞をＲＰＭＩ１６４０（ロンザ（Lonza））培地中で３７℃で維持した。トランスフェクションの１日後、０．８／ｍｌハイグロマイシンの添加によって細胞を選択した。およそ１週間後、０．２ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン培地の維持レベルで細胞を増殖させた。細胞を分けたときに上清を収集し、−２０℃で凍結した状態を維持した。
大腸菌での発現を、Burmanら、2008、J Biol Chem 283、17579〜17593に記載されたようにして実行した。
タンパク質生産の確認
トランスフェクトされたＣＨＯ細胞培養物からの上清を収集し、ニッケル−アガロースビーズ（Thermo）と混合した。これを一定して振盪しながら４℃で一晩そのままにした。ビーズをニッケル−Ｈｉｓ結合緩衝液（４０〜８０ｍＭイミダゾールを含有する０．５ＭのＮａＣｌ／０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で２回洗浄した。緩衝液を除去し、ビーズを非還元ＰＡＧＥ緩衝液と共に１：１で混合し、５分沸騰させた。サンプルを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングし、ニトロセルロースにトランスファーし、抗ＨｉｓおよびＨＲＰＯを用いて展開させた。Ｈｉｓ−タグがおよそ４８．５ｋＤａ（Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂのサイズ）に存在することが示された場合、細胞を９６ウェルプレート中で連続希釈して、シングルコロニーを増殖させた。次いで上述した通りに免疫沈降を使用してシングルコロニーを試験し、陽性コロニーをより大きいＴ１７５フラスコで増殖させた。
細菌によって発現されたＳｂｉ＿ＩＩＩ−ＩＶタンパク質の同一性は、質量分析およびポリクローナル抗Ｓｂｉ抗体を使用するウェスタンブロッティングによって確認された。
上清のＡＫＴＡタンパク質精製
トランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの上清を、フラスコを分けたときに定期的に収集した。十分な上清が収集されたら、それを平衡緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのイミダゾール）と共に１：１で混合し、ろ過滅菌し、１ｍｌ／分の速度、４℃でコバルトカラム（ＧＥ）に通した。次いでカラムを洗浄緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのイミダゾール）で洗浄し、ＡＫＴＡ（ＧＥ）タンパク質精製システムにおいて溶出緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾール）で溶出させた。１００％溶出緩衝液までの勾配で溶出したタンパク質の画分を収集し、クーマシー色素で染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析するか、またはマウス抗ポリヒスチジン抗体を用いて展開したウェスタンブロットのためにトランスファーして、精製したＨｉｓ−タグを有するタンパク質の存在を確認した。
Burmanら、2008、J Biol Chem 283、17579〜17593に記載されているように、細菌によって発現されたタンパク質の精製のために、類似の方法を使用した。
緩衝液の交換および精製したタンパク質の濃縮
精製したＨｉｓ−タグを有するタンパク質を含有する適切な画分を合わせ、３０，０００ｋＤａのカットオフのスピンカラム（ビバスピン（Vivaspin））を使用して２．５ｍｌの最終容量に濃縮した。次いで濃縮したタンパク質の緩衝液を、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ）を使用してリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に交換した。最終的な収量をナノドロップ（nanodrop）によって測定した。
インビトロにおけるＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂによる補体活性化
ウェスタンブロットアッセイを行って、精製したＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂタンパク質がインビトロで補体系を活性化することができることを確認した。各調製物中のＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶの量が確実に等しくなるよう、新鮮なマウス血清（ＣＤ２１−／−）をＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶまたはＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂに添加した。還元サンプル緩衝液（reducing sample buffer）の添加によって０、３０、６０および１２０分で反応を止め、５分沸騰させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。これらをニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、ウサギ抗Ｃ３（１／１０００）およびヤギ抗ウサギＨＲＰＯ（１／２０００）を用いて展開した。
ワクチン調製物中のタンパク質の化学量論の確認
等しい量の抗原タンパク質の投与を確実にするために、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂで免疫化したマウスに１．３５μｇのタンパク質を与え、Ａｇ８５ｂで免疫化したマウスに１μｇを与えた。（Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶの分子量は１７ｋＤａであり、Ａｇ８５ｂの分子量は３．１５ｋＤａである）。
実験１（Ｉ．Ｐ．１）
Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂで免疫化したマウスが、Ａｇ８５ｂ単独で免疫化したマウスより、Ａｇ８５ｂに対してより高い免疫応答を有していたかどうかを決定するために、マウスを腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注射によって免疫化した。抗原Ａｇ８５ｂを単独で受けた動物に、２００μｌの１５０ｍＭのＮａＣｌ中の１μｇのＡｇ８５ｂを注射し、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂを受けた動物に、２００μｌの１５０ｍＭのＮａＣｌ中の１．３５μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂを注射した。陰性対照は、２００μｌの１５０ｍＭのＮａＣｌで免疫化したマウスであった。陽性対照は、１μｇのＡｇ８５ｂに加えて完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で免疫化したＷＴマウスであった。内部陰性対照として、Ｃ３−／−マウスを使用した。
マウスを０日目に一度免疫化し、２８日目にブーストした。血清サンプル（およそ７０μｌの血液から）をＥＬＩＳＡ分析のために４２日目まで毎週収集して、心臓穿刺によって致死させた。
実験２（Ｉ．Ｖ．）
代替の投与経路がＡｇ８５ｂに対する応答を改善するかどうかを決定するために、マウスを静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射によって免疫化した。抗原Ａｇ８５ｂ単独を受けた動物に、５０μｌの１５０ｍＭのＮａＣｌ中の１μｇのＡｇ８５ｂを注射し、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂを受けた動物に、５０μｌの１５０ｍＭのＮａＣｌ中の１．３５μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂを注射した。内部陰性対照として、Ｃ３−／−およびＣＤ２１−／−マウスを使用した。
マウスを０日目に一度免疫化し、２８日目にブーストした。血清サンプル（およそ７０μｌの血液から）をＥＬＩＳＡ分析のために５０日目まで毎週収集して、心臓穿刺によって致死させた。免疫化の経路がＩ．Ｖ．であったため、２８日目のブースト時にサンプルを採取しなかった。
実験３（Ｉ．Ｐ．２）
Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂの用量を２倍にするとＡｇ８５ｂに対する免疫応答が改善されるかどうかを決定するために、マウスを腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注射によって免疫化した。この実験では、Ａｇ８５ｂおよびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶも別個のタンパク質として一緒に投与した。
抗原Ａｇ８５ｂ単独を受けた動物に、２００μｌの１５０ｍＭのＮａＣｌ中の２μｇのＡｇ８５ｂを注射し、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂタンパク質を受けた動物に、２００μｌの１５０ｍＭのＮａＣｌ中の２．７μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂを注射した。別個のタンパク質としてのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶおよびＡｇ８５ｂで免疫化したマウスに、０．７μｇのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶおよび２μｇのＡｇ８５ｂの両方を含有する２００μｌの１５０ｍＭのＮａＣｌを注射して、Ａｇ８５ｂの量を等しくした。内部陰性対照として、Ｃ３−／−マウスを使用した。
マウスを０日目に一度免疫化し、２８日目にブーストした。血清サンプル（およそ７０μｌの血液から）をＥＬＩＳＡ分析のために５０日目まで毎週収集して、心臓穿刺によって致死させた。
Ａｇ８５ｂに対する免疫応答を試験するためのＥＬＩＳＡアッセイ
９６ウェルプレート（ヌンクマキシソルブ（NUNC Maxisorb））を、炭酸緩衝液中の１μｇ／ｍｌのＡｇ８５ｂまたは１．３５μｇ／ｍｌのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂでウェル１つ当たり５０μｌでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを０．０１％ＰＢＳ−トウィーン（Tween）で洗浄し、１％ＢＳＡブロッキング溶液を室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄した。血清サンプルを０．０１％ＰＢＳ−トウィーンで１／５０または１／１００に希釈し、ウェル１つ当たり５０μｌで添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、二次抗体（ヒツジ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰＯ）を、１／１００希釈、ウェル１つ当たり５０μｌで添加し、室温で１時間インキュベートした。ＴＭＢ基質を調製した（２００μｌのＤＭＳＯ中のＴＭＢ（１０ｍｇ／ｍｌ）、９．９ｍｌのリン酸−クエン酸緩衝液、３μｌのＨ２Ｏ２）。プレートを洗浄し、ウェル１つ当たり５０μｌのＴＭＢ基質を添加し、６分発色させた。ウェル１つ当たり５０μｌの１０％Ｈ２ＳＯ４で反応を止め、プレートを４５０ｎｍで読み取った。
毎週収集した各血清サンプルにつきこれを繰り返した。
正規化の目的のために、平均のベースラインである「０日目」の値を、マウスのグループ全体で計算し、別個の「０日目」の平均値をそれぞれ個々の処置グループにつき計算した。研究の経過中、各データポイントを、関連する処置グループの「０日目」のＯＤ４５０読み取り値で割った全てのマウスの全体の「０日目」の平均に正規化した。
Ａｇ８５ｂに対するＴｈ１応答へのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶの作用
雄マウスに、ＰＢＳで希釈したＳｂｉ（ｎ＝２）、Ａｇ８５ｂ（ｎ＝３）、Ｓｂｉ−Ａｇ８５ｂ（ｎ＝３）、ＰＢＳ単独（ｎ＝３）、または一般的に使用されるアジュバントであるアラムで希釈したＡｇ８５ｂ（ｎ＝２）のいずれかの所定モル当量を腹腔内に注射した。実験の図式化された概要に関する図９Ａを参照されたい。注射された全ての体積は２００μｌであった。実験を２つのブロックで行った。注射の５日後、マウスを安楽死さ、脾臓を取り出した。脾臓をインビトロでの脾細胞培養のために処理し、２４時間前に１μｇ／ウェルのＡｇ８５ｂがプライミングされた樹状細胞（細胞１×１０６個／ウェル；クローンＤＣ２．４）を含有する６ウェルプレートに添加した（細胞２×１０６個／ウェル）。培養物を７２時間インキュベートし、サイトカイン特異的なＥＬＩＳＡで製造元の説明書（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D systems））に従って分析するために、上清を収集した。次いで細胞を、新鮮な培地中の５０ｎｇのＰＭＡ（カルバイオケム（Calbiochem））、５００ｎｇのイオノマイシン（シグマ（Sigma））および１μｌのＢＤゴルジブロック（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences））で処置した。５時間のインキュベーション期間（３７℃、５％ＣＯ２）の後、細胞をペレット化し、ＰＢＳ中で洗浄し、２．４Ｇ２ Ｆｃブロック（ＢＤファーミンジェン（BD Pharmingen））および加熱不活性化されたマウスＩｇ（両方ともＰＢＳで１／１００）に、氷上で３０分、再懸濁した。
生きた（アクアライブデッドネガティブ（Aqua live dead negative））ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）を、標準的なフローサイトメトリー分析を使用したＣＤ３−ＰＥおよびＣＤ４−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５抗体との陽性反応（およびＣＤ８−ＡＰＣＨ７については陰性）と共に、前方および側方散乱（シングレット）を使用して同定した。すなわち抗体を、必要に応じて２５μｌのフロー緩衝液で１：２００希釈して、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。１００μｌのブロックした細胞を各ウェルに添加し、氷上、暗所で３０分インキュベートした。次いで細胞を４％ホルムアルデヒド溶液中で２０分かけて固定した。細胞内タンパク質を染色するために、細胞を１００μｌのＢＤ Ｐｅｒｍ中で透過化し（ＢＤバイオサイエンス、氷上で１５分のインキュベーション）、次いで細胞内抗体（ＩＦＮ−γ−ＰＥＣｙ７またはＩｇＧ２ｂ−ＡＰＣアイソタイプ対照）と共に氷上、暗所で３０分インキュベートした。最終的に、細胞を２５０μｌのフロー緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ ＩＩ装置（ＢＤバイオサイエンス）で読み取った。フローサイトメトリーのデータを、ＦＣＳエキスプレス６フローリサーチエディション（FCS express 6 Flow Research Edition）ソフトウェア（デノボソフトウェア（DeNovo Software））を使用して分析した。全てのデータは、ＰＢＳ対照培養物中のＴ細胞数に対するパーセンテージとして表され、統計的分析は、グラフパッドプリズム（GraphPad Prism）７．０で行われた。
ＳｂｉＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂコンジュゲートによって刺激されたＴｈ１増殖は、単独、またはアラムと組み合わせたＡｇ８５ｂによって刺激された増殖より有意に高かった（図９Ｃ）。Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ａｇ８５ｂでプライミングされた脾細胞の組織培養上清中に分泌されたＩＦＮ−γは、Ａｇ８５ｂ単独でプライミングされた細胞と比較して４倍に増加した（図９Ｄ）。
樹状細胞の活性化および機能へのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶの作用
標準的な比重遠心分離によって分離された３×１０６個の健康なドナーＰＢＭＣを、ＲＰＭＩに加えて５０％自己血清中で、ポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ／ｍｌ、インビボジェン（Invivogen））、リポ多糖（ＬＰＳ、１０ｎｇ／ｍｌ、シグマ）、ＣＬ０７５（１μｇ／ｍｌ、インビボジェン）およびＣｐＧ（ＯＤＮ２２１６、７．５μｇ、インビボジェン）の存在または非存在下で、ＳＢＩ（１０μｇ／ｍｌ；内毒素非含有であることが確認済み）有りまたは無しで培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１４時間培養し、３時間後にブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ、ｅバイオサイエンス（eBioscience））を添加した。固定および透過化（ｅバイオサイエンス）後に、細胞を、製造元のプロトコールに従って、死細胞を排除するために（通常＜３０％）ゾンビ（Zombie）アミン色素（バイオレジェンド（Biolegend））、表面マーカー、次いで細胞内サイトカインで染色した。ＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡ（商標）８．０．１ソフトウェアを試行するＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ−２０で分析を実行し、ＦｌｏｗＪｏ １０．１ｒ５（ツリースター社（Tree Star, Inc））で分析した。プリズムＶ５（グラフパッドソフトウェア社（GraphPad software Inc））を用いてグラフをプロットした。
生きたシングレット細胞中で系統−（ＣＤ３，１６，１９，２０）ＨＬＡ−ＤＲ＋集団を同定した。この画分は、ＣＤ１４＋単球に加えてＣＤ１４−樹状細胞（ＤＣ）集団を含有していた。ＣＤ１４−ＤＣを、ＣＤ１２３＋形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）およびＣＤ１２３−ＣＤ１４１＋（ｃＤＣ１）またはＣＤ２＋ＣＤ１ｃ＋ＣＤ１１ｃ＋（ｃＤＣ２）である古典的樹状細胞にさらに分割した。サイトカイン生産を、陽性細胞／親集団のパーセンテージとして定量した。
以下の抗体は、バイオレジェンド（Ｂｉｏ）またはＢＤバイオサイエンス（ＢＤ）から入手したものであり、別段の指定がない限り、抗原−蛍光色素、クローン（製造元）として表記した：ＣＤ１１ｃ−ＢＶ７１１、Ｂ−ｌｙ６（ＢＤ）；ＣＤ１２３−ＢＵＶ３９５、７Ｇ３（ＢＤ）；ＣＤ１４−ＢＶ６５０、Ｍ５Ｅ２（Ｂｉｏ）、ＣＤ１４１−ＢＶ５１０、１Ａ４（ＢＤ）；ＣＤ１９−ＡＦ７００、Ｈ１Ｂ１（Ｂｉｏ）；ＣＤ２０−ＡＦ７００、２Ｈ７（Ｂｉｏ）；ＣＤ３−ＡＦ７００、ＳＫ７（Ｂｉｏ）；ＣＤ１６−ＡＦ７００、３Ｇ８（Ｂｉｏ）；ＣＤ１ｃ−ＰＥＲＣＰ−Ｃｙ５．５、Ｌ１６１（Ｂｉｏ）；ＣＤ３０３−ＢＶ６０５、２０１Ａ（Ｂｉｏ）；ＣＤ３０４−ＢＶ６０５、Ｕ２１−１２８３（ＢＤ）；ＨＬＡ０ＤＲ−ＢＶ７８０、Ｌ２４３（Ｂｉｏ）；ＩＦＮａ−ＰＥ、ＬＴ２７：２９５（ＭＡＣＳミルテニーバイオテク（Miltenyi Biotec））；ＩＬ−１０−ＡＰＣ、ＪＥＳ３−９Ｄ７（Ｂｉｏ）；ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０−ＢＶ４２１、Ｃ８．６（ＢＤ）；ＩＬ−１ｂ−ＦＩＴＣ、ＪＫ１Ｂ−１（Ｂｉｏ）；ＩＬ−８−ＰＥ−Ｃｙ７、Ｅ８Ｎ１（Ｂｉｏ）；ＴＮＦ−ＡＰＣＣｙ７、Ｍａｂ１１（Ｂｉｏ）。
Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶのアジュバント作用を、ＴＬＲアゴニスト（ポリ（Ｉ：Ｃ）、リポ多糖、ＣＬ０７５およびＣｐＧ）のカクテルへの応答における特異的な単球および樹状細胞サブセットによる細胞内サイトカイン生産の検査によって調査した。１０μｇ／ｍｌのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶの存在下での培養は、検査された全ての細胞サブセットにおいて、ＴＬＲアゴニストカクテルの添加有りまたは無しの両方において、ＴＮＦαを生産する細胞のパーセントを増加させた。ＴＬＲアゴニストの存在下で、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶは、形質細胞様ＤＣからのＩＬ−１ｂおよびＩＦＮαの単球生産を増強した。単球からのＩＬ−１０生産は低減したことから、炎症性サイトカインの生産増加および単球からの抗炎症性ＩＬ−１０の低減によって証明されたように、ヒト一次免疫エフェクター細胞に対するＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶのアジュバント作用が実証される。ＴＬＲアゴニスト刺激とは無関係に、全ての細胞からのＴＮＦα生産および形質細胞様ＤＣからのＩＦＮα生産も増加した。
Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）−Ｐｎ６Ｂコンジュゲートの合成
病原体である肺炎連鎖球菌の外部の保護的莢膜からの抗原性の多糖Ｐｎ６Ｂは、肺炎連鎖球菌の感染を防ぐためにワクチン生産で利用された共通の抗原であることから、それをＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶタンパク質への官能化のためのリガンドとして選んだ。Ｐｎ６Ｂは、０．９〜１．５ＭＤａの炭水化物であり、（→２−α−Ｄ−ガラクトピラノース−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノース−（１→３）−α−Ｌ−ラムノピラノース−（１→４）−Ｄ−リビトール−５−リン酸→）の繰り返し単位からなる。
Ｐｎ６Ｂ（２０ｍｇ）を２ｍＬの水に添加し、炭水化物が溶解するまで（３〜６時間）室温で撹拌した。次いで溶液をイオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ４−２００、テトラブチルアンモニウムの形態）上にローディングし、３０分インキュベートし、その後溶出させた。炭水化物を含有する画分をプールし、その後凍結乾燥して、白色の固体を得た。固体を５ｍＬの無水ＤＭＳＯに添加し、３０℃、Ｎ２下で一晩撹拌して、炭水化物を溶解させた。１，１’−カルボニルジイミダゾール（１〜２ｍｇ）の無水ＤＭＳＯ溶液（１ｍＬ）を炭水化物溶液に添加し、１時間撹拌した。トリエチルアミン（０．０５ｍＬ）、続いてＮ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）−エチル）−３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド（１００ｍｇ）を添加し、反応を２時間そのまま撹拌した。溶液を透析バッグ（１２〜１４ＫＤａカットオフ）に移し、１）５リットルの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７）、２）５リットルの０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７）、３）５リットルの水に対して透析した。次いで透析バッグ中の溶液をイオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ ８−１００、Ｈ＋の形態）で処理した。樹脂を遠心分離によって除去した。上清を凍結乾燥して、２４ｍｇの白色の固体を得た。生成物の一部をＮＭＲ分光法によって分析して、炭水化物へのアルキル化試薬の負荷量を決定した。これは、マレイミドのアルケンプロトンシグナルおよびフコースのメタンプロトンシグナルの積分の比較によって決定された。
Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）（０．５ｍｇ、３．５７×１０−２ｍｍｏｌ）を、脱酸素したリン酸ナトリウム緩衝液（０．５ｍＬ、２００ｍＭ、ｐＨ＝７、１ｍＭのＥＤＴＡおよび５当量のＴＨＰＰを含有）中に溶解させた。反応液を２５℃で２４時間インキュベートした。その後、５−アジドペンタン酸（５当量）を添加して、溶液中の残存するホスフィンを酸化し、３０分インキュベートした。最終的に、Ｐｎ６Ｂ−マレイミド（０．５ｍｇ）の脱酸素した溶液（０．５ｍｌ、水）を新たに還元したタンパク質に添加し、周囲温度で最大２４時間インキュベートした。ＳＤＳ ＰＡＧＥを使用して、バイオコンジュゲーション反応を分析した。溶液のアリコート（１０μＬ）を、還元ＳＤＳ ＰＡＧＥローディング緩衝液（１０μＬ）に添加した。この溶液のサンプル（１０μＬ）を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動のための既製のゲル（インビトロジェン（Invitrogen）、ＮｕＰａｇｅ ４〜１２％ビストリス勾配ゲル、ＮｕＰａｇｅ ＭＯＰＳ ＳＤＳランニング緩衝液、バイオラッド（Bio Rad）のＰｏｗｅｒＰａｃ ＨＶ、２００Ｖ、４５〜５５分）にローディングした。その後ゲルをクーマシー染色で染色し、続いて脱色溶液（水：エタノール：酢酸、１６：３：１）に浸した。ゲルのローディングウェル中の染色物質の存在は、高い分子量の炭水化物−タンパク質コンジュゲートの陽性の指示を提供する。サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）も利用して、コンジュゲート生産を確認した。反応のサンプル（１０μＬ）を、東ソー（TOSOH）のＴＳＫｇｅｌ ＳＥＣ−カラム（Ｇ５０００ＰＷＸＬ、内径７．８ｍｍ×長さ３０．０ｃｍ）を備えたダイオネクス・アルティメット（Dionex Ultimate）３０００ＨＰＬＣ機器に注入した。サンプルを、２８０ｎｍに設定した検出器で、塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）を含有するリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７）を０．５ｍｌ／分で用いて溶出させた。コンジュゲートは、幅広なピークによって表され、１２〜２０分から溶出しているが、未反応のＳｂｉタンパク質は２３〜２４分で溶出している。
コンジュゲーション反応をシステアミン（５ｍＭ）の添加によって止め、反応混合物中の未反応のＳｂｉタンパク質をスピンフィルター遠心分離（３０ｋＤａのカットオフ膜）で除去した。
インビトロにおけるＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）−Ｐｎ６Ｂによる補体活性化
Ｓｅｅｌｅｎらによって説明されているＷｉｅｌｉｓａの総補体系スクリーニング（Wieslab）を使用して、古典（ＣＰ）、マンノース結合レクチン（ＭＢＬＰ）の、および副（ＡＰ）の補体経路のＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ、Ｐｎ６ＢおよびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）−Ｐｎ６Ｂによる枯渇を検出した。１μｌのヒト血清（陽性対照血清、キットに供給されたもの）当たり１μｇのＳｂｉまたはＳｂｉコンジュゲートを添加し、３７℃で３０分のプレインキュベーション後に補体活性に関してアッセイした。製造元の説明書に従って、ブランク、陽性対照（健康な個体からのヒト血清）、および陰性対照（熱で不活性化した血清）を包含させたアッセイを２連で完了させた。残留した補体活性阻害（すなわち枯渇後に残存する補体活性）を、４０５ｎｍでの吸光度から、方程式：（サンプル−陰性対照）／（陽性対照−陰性対照）×１００％を使用して定量した。
Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）−Ｐｎ６Ｂへの曝露によるＴ細胞活性化
健康なヒト志願者によって供与された末梢血液にシリンジ中でヘパリン（１０単位／ｍｌ）を投与し、ＲＰＭＩ１６４０培地と１：１の比率で混合した。５０ｍｌのファルコンチューブ中で１５ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ）の上に３５ｍｌの血液／ＲＰＭＩを層状化した。これらを、減速時にブレーキをかけずに１５００ＲＰＭで３０分遠心分離した。次いで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）層をパスツールピペットを使用してチューブから抽出し、ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した。ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ培地＋１０％ヒト血清中に補体と共に再懸濁した。次いでＰＢＭＣを２００μｌのＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶまたはＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）−Ｐｎ６Ｂコンジュゲートタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）で処置し、次いで３７℃（５％ＣＯ２）で２４時間インキュベートした。次いで細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、１００μｌのＰＢＳに懸濁し、次いで１０μｌの標識抗体（抗ＣＤ６９）で処理した。次いで抗体で標識された細胞を４℃で３０分間インキュベートし、次いで氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、４００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス）を使用して分析し、ＤＩＶＡソフトウェアを使用して処理した。
ＣＤ６９は、Ｔ細胞活性化の重要な指標である。Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ（Ｖ８０Ｃ）−Ｐｎ６Ｂコンジュゲートへのリンパ球の曝露は、コンジュゲートしていないＰｎ６Ｂ抗原と比較してＣＤ６９の表面発現の有意な増加をもたらしたことから、コンジュゲートしていない抗原と比較して、コンジュゲートに対するＴ細胞応答が強化されたこと（データは示されない）が示される。
上述した例示的な実施態様と共に本発明を説明したが、この開示を考慮すれば、多くの等価な改変およびバリエーションが当業者には明らかであると予想される。したがって、記載された本発明の例示的な実施態様は、例示的であり、限定するものではないとみなされる。記載された実施態様に、本発明の本質および範囲から逸脱することなく様々な変化をなすことができる。本明細書において引用された全ての文書は、参照により明示的に組み入れられる。

Claims (33)

  1. 免疫学的なアジュバントとして使用するための、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分。
  2. 標的抗原に対する対象における免疫応答を強化する方法における使用のための、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分であって、前記補体活性化部分は、前記標的抗原と共に対象に投与される、上記部分。
  3. 前記標的抗原が、ペプチド抗原である、請求項２に記載の使用のための補体活性化部分。
  4. 前記標的抗原が、炭水化物、糖、多糖、脂質またはリポ多糖を含む、請求項２に記載の使用のための補体活性化部分。
  5. 前記標的抗原が、前記補体活性化部分と混合されている、請求項２〜４のいずれか一項に記載の使用のための補体活性化部分。
  6. 前記標的抗原が、前記補体活性化部分に共有結合で連結されている、請求項２または３に記載の使用のための補体活性化部分。
  7. 前記標的抗原が、前記補体活性化部分との融合タンパク質を形成している、請求項６に記載の使用のための補体活性化部分。
  8. 前記標的抗原が、担体ペプチドに共有結合で連結されている、請求項４に記載の使用のための補体活性化部分。
  9. 標的抗原の免疫原性を強化する方法であって、インビトロまたはエクスビボで前記標的抗原を、補体およびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分と接触させて、オプソニン化された標的抗原を得ることを含む、上記方法。
  10. 前記オプソニン化された標的抗原を、他の補体成分および／または前記補体活性化部分から単離する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
  11. 対象に投与するために、前記オプソニン化された標的抗原を製剤化する工程をさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記標的抗原を対象に投与することをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
  13. 標的抗原に対する免疫応答を刺激する方法における使用のための、オプソニン化された標的抗原を含む組成物であって、前記標的抗原は、インビトロまたはエクスビボで補体およびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分と予め接触させている、上記組成物。
  14. 前記標的抗原が、感染性生物由来である、請求項２〜８のいずれか一項に記載の使用のための補体活性化部分、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法、または請求項１３に記載の使用のための組成物。
  15. 前記感染性生物が、細菌、真菌細胞、ウイルス、原生動物、蠕虫または吸虫である、請求項１４に記載の使用のための補体活性化部分、方法、または使用のための組成物。
  16. 前記細菌が、
    放線菌属（例えば、アクチノマイセス・イスラエリイ）；
    バチルス属（例えば、炭疽菌、バチルス・セレウス）；
    バクテロイデス属（例えば、バクテロイデス・フラジリス）；
    バルトネラ属（例えば、バルトネラ・ヘンセラ、バルトネラ・クインターナ）；
    ボルデテラ属（例えば、百日咳菌）；
    ボレリア属（例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・ガリニ、ボレリア・アフゼリ、回帰熱ボレリア）；
    ブルセラ属（例えば、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・カニス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス）；
    カンピロバクター属（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ）；
    クラミジア属およびクラミドフィラ属（例えば、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマティス、クラミドフィラ・シタッシ）；
    クロストリジウム属（例えば、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシレ、ウェルシュ菌、破傷風菌）；
    コリネバクテリウム属（例えば、ジフテリア菌）；
    クリプトコックス属（例えば、クリプトコックス・ネオフォルマンス）；
    エーリキア属（例えば、エーリキア・カニス、エーリキア・シャフェンシス）；
    エンテロコッカス属（例えば、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム）；
    エシェリキア属（例えば、大腸菌）；
    フランシセラ属（例えば、フランシセラ・ツラレンシス）；
    ヘモフィルス属（例えば、インフルエンザ菌）；
    ヘリコバクター属（例えば、ヘリコバクター・ピロリ）；
    クレブシエラ属（例えば、クレブシエラ・ニューモニエ）；
    レジオネラ属（例えば、レジオネラ・ニューモフィラ）；
    レプトスピラ属（例えば、レプトスピラ・インタロガンス、レプトスピラ・サンタロサイ、レプトスピラ・ウェイリイ、レプトスピラ・ノグチイ）；
    リステリア属（例えば、リステリア・モノサイトゲネス）；
    マイコバクテリウム属（例えば、マイコバクテリウム・レプラ、ヒト型結核菌、マイコバクテリウム・ウルセランス）；
    マイコプラスマ属（例えば、マイコプラズマ・ニューモニエ）；
    ナイセリア属（例えば、淋菌、髄膜炎菌）；
    ノカルジア属（例えば、ノカルジア・アステロイデス）；
    シュードモナス属（例えば、緑膿菌）；
    リケッチア属（例えば、リケッチア・リケッチイ）；
    サルモネラ属（例えば、チフス菌、ネズミチフス菌、サルモネラ・エンテリカ）；
    シゲラ属（例えば、ソンネ菌、志賀赤痢菌、シゲラ・フレックスネリ）；
    スタフィロコッカス属（例えば、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス）；
    連鎖球菌属（例えば、ストレプトコッカス・アガラクチア、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ビリダンス）；
    トレポネーマ属（例えば、トレポネーマ・パリダム）；
    ウレアプラスマ属（例えば、ウレアプラズマ・ウレアリチカム）；
    ビブリオ属（例えば、コレラ菌）；または
    エルシニア属（例えば、ペスト菌、エルシニア・エンテロコリチカ、偽結核菌）
    である、請求項１５に記載の使用のための補体活性化部分、方法、または使用のための組成物。
  17. 前記真菌細胞が、
    カンジダ属（例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・ルゴサ、カンジダ・パラシローシス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ドゥブリニエンシス）；
    アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・フラーブス）；
    クリプトコックス属（例えば、クリプトコックス・ネオフォルマンス）；
    ヒストプラスマ属（例えば、ヒストプラスマ・カプスラーツム）；
    ニューモシスチス属（例えば、ニューモシスチス・ジロベシ、ニューモシスティス・カリニ）；または
    スタキボトリス属（例えば、スタキボトリス・チャルタルム）
    である、請求項１５に記載の使用のための補体活性化部分、方法、または使用のための組成物。
  18. 前記ウイルスが、以下のタイプ：
    アデノウイルス科（例えば、アデノウイルス）；
    ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型）；
    パピローマウイルス科（例えば、ヒトパピローマウイルス）；
    ポリオーマウイルス科（例えば、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス）；
    ポックスウイルス科（例えば、天然痘）；
    ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；
    パルボウイルス科（例えば、パルボウイルスＢ１９）；
    アストロウイルス科（例えば、ヒトアストロウイルス）；
    カリチウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス）；
    ピコルナウイルス科（例えば、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス）；
    コロナウイルス科（例えば、重症急性呼吸器症候群ウイルス）；
    フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ＴＢＥウイルス）；
    トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス）；
    ヘペウイルス科（例えば、Ｅ型肝炎ウイルス）；
    レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型）；
    オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；
    アレナウイルス科（例えば、ラッサウイルス）；
    ブニヤウイルス科（例えば、クリミア−コンゴ出血性熱ウイルス、ハンターンウイルス）；
    フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス）；
    パラミクソウイルス科（例えば、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス）；
    ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス）；
    Ｄ型肝炎ウイルス；
    レオウイルス科（例えば、ロタウイルス、オルビウイルス、コルティウイルス、バンナウイルス）
    に属する、請求項１５に記載の使用のための補体活性化部分、方法、または使用のための組成物。
  19. 前記原生動物が、
    プラスモジウム属の種（マラリアに関与するもの、例えば熱帯熱マラリア原虫、プラスモジウム・ベルゲイ、プラスモディウム・ヨエリ、三日熱マラリア原虫および二日熱マラリア原虫）
    エントアメーバ属（赤痢アメーバは、アメーバ赤痢に関与する）；
    ジアルジア（ランブル鞭毛虫症に関与するもの、例えばランブル鞭毛虫）；
    トリパノソーマ属（例えば、アフリカ睡眠症の原因となるトリパノソーマ−ブルーセイ、およびトリパノソーマ・クルージ）；
    リーシュマニア属（例えば、リーシュマニア属の種
    およびメキシコリーシュマニア）；
    トキソプラズマ属（例えば、トキソプラズマ原虫）；
    アカントアメーバ属；
    バベシア属；
    バラムチア属（例えば、バラムチア・マンドリルリス）
    クリプトスポリジウム属；
    サイクロスポーラ属；
    ネグレリア属（例えば、ネグレリア・フォーレリ）
    である、請求項１５に記載の使用のための補体活性化部分、方法、または使用のための組成物。
  20. 前記標的抗原が、新生細胞上で特異的または優先的に発現されたマーカーである、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の使用のための補体活性化部分、方法、または使用のための組成物。
  21. 前記補体活性化部分が、免疫グロブリンＦｃと結合しない、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のための補体活性化部分、方法、または使用のための組成物。
  22. 前記補体活性化部分が、Ｓｂｉ−ＩまたはＳｂｉ−ＩＩを含まない、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のための補体活性化部分、方法、または使用のための組成物。
  23. 前記補体活性化部分が、野生型Ｓｂｉ−ＩＩＩ配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するＳｂｉ−ＩＩＩドメインを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のための補体活性化部分、方法、または使用のための組成物。
  24. 前記補体活性化部分が、野生型Ｓｂｉ−ＩＶ配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するＳｂｉ−ＩＶドメインを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のための補体活性化部分、方法、または使用のための組成物。
  25. 前記補体活性化部分が、野生型Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有するＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶ部分を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のための補体活性化部分、方法、または使用のための組成物。
  26. 標的抗原の免疫原性を強化する方法であって、前記標的抗原を、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分と会合させることを含む、上記方法。
  27. （ｉ）前記標的抗原を、前記補体活性化部分と混合すること；
    （ｉｉ）前記標的抗原を、前記補体活性化部分に共有結合で連結すること；または
    （ｉｉｉ）前記標的抗原を、前記補体活性化部分との融合タンパク質として発現させること
    によって、前記標的抗原を前記補体活性化部分と会合させる、請求項２２に記載の方法。
  28. 免疫学的なアジュバントとしてＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分を投与することを含む、免疫刺激方法。
  29. 標的抗原に対する対象における免疫応答を強化する方法であって、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分を、前記標的抗原と共に前記対象に投与することを含む、上記方法。
  30. 免疫学的なアジュバントとして使用するための医薬の調製における、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分の使用。
  31. 標的抗原に対する対象における免疫応答を強化する方法における使用のための医薬の調製における、Ｓｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分の使用であって、前記補体活性化部分を、前記標的抗原と共に前記対象に投与することを含む、上記方法。
  32. 標的抗原に対する免疫応答を刺激する方法であって、インビトロまたはエクスビボで補体およびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分と予め接触させた標的抗原を対象に投与することを含む、上記方法。
  33. 標的抗原に対する免疫応答を刺激するための医薬の調製における、オプソニン化された標的抗原を含む組成物の使用であって、前記標的抗原は、インビトロまたはエクスビボで補体およびＳｂｉ−ＩＩＩ−ＩＶを含む補体活性化部分と予め接触させている、上記使用。
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