TW202402327A - 由至少一β－葡聚糖或甘露多醣組成或包含其之結合物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於β-葡聚糖或甘露多醣作為α突觸核蛋白之B細胞或T細胞抗原決定基多肽之C型凝集素(CLEC)多醣佐劑之用途。

Description

由至少一β-葡聚糖或甘露多醣組成或包含其之結合物
本發明係關於屬於C型凝集素(CLEC)之種類的多醣佐劑。
疫苗接種被視為係拯救生命且減輕疾病負擔之最有力手段之一。藉助於主動免疫接種，疫苗經投予而使得宿主之免疫系統產生非特異性的先天性免疫反應以及可針對所施加之免疫原發揮作用的特異性抗體、記憶B細胞及記憶T細胞。
甘露多醣為一種源自酵母細胞壁的多醣，由主要呈β-(1,4)-連接之甘露糖骨架及少量α-(1,6)-連接之葡萄糖及半乳糖側鏈殘基組成。此外，在習知甘露多醣製劑中偵測到大約5%之蛋白質含量。作為真菌細胞壁的重要成分，甘露多醣已被廣泛用作基於碳水化合物的念珠菌疫苗的成分(Han及Rhew, Arch Pharm Res 2012, Vol 35, No 11, 2021-2027；Cassone, Nat Rev Microbiol. 2013 Dec;11(12):884-91；Johnson及Bundle, Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 4327)。此外，亦研發了基於甘露多醣載體-抗原複合體/結合物的不同疫苗實例，包括用於腫瘤治療的甘露多醣-黏蛋白1 (MUC1)融合蛋白結合物或甘露多醣與模型過敏原，如卵白蛋白(OVA)、木瓜蛋白酶或Betv1之結合物。
黏蛋白是在細胞表面表現的高度醣基化之蛋白質。MUC1為一種原型黏蛋白，已被發現在多種腫瘤細胞上過度表現。沿著此等思路，產生了一種包含5個串聯重複的人類MUC1(包含具免疫優勢的抗原決定基：APDTRPAPGSTAPPAHGVTS)及肽(Cpl3-32)的MUC1融合蛋白，並在氧化或還原條件下與甘露多醣結合，從而引起截然不同的免疫反應：氧化甘露多醣-MUC1刺激由CD8+T細胞介導的Th1型反應，引起IFN-γ的分泌，以及主要是IgG2a的抗體反應，而還原甘露多醣-MUC1則刺激Th2型反應，產生IL-4及高IgG1抗體反應。所採用的融合蛋白質代表了展示T細胞及B細胞抗原決定基的單一蛋白質。
最近亦生成了木瓜蛋白酶及OVA之蛋白質-碳水化合物/甘露多醣複合體，以分析其潛在致敏性。發現將甘露多醣偶合於蛋白質表面可減少針對木瓜蛋白酶的IgE抗體的結合及交聯。有趣的是，在此等實驗中，甘露多醣、右旋糖酐或麥芽糖糊精的偶合僅降低了木瓜蛋白酶的潛在致敏性，但沒有降低OVA的潛在致敏性，此表明碳水化合物的選擇對疫苗設計的重要性(Weinberger等人 J. Control. Release 2013; 165:101–109)。此等實驗亦表明，甘露多醣結合導致皮內免疫接種後針對OVA的IgG效價升高。
類似於用於MUC1的新糖結合疫苗，Ghochikyan等人 (DNA AND CELL BIOLOGY, 第25卷, 第10期, 2006, Pp. 571–580)及Petrushina等人 (Journal of Neuroinflammation 2008, 5:42)正在應用類澱粉β (Aβ)28，此為一種28個胺基酸殘基的肽，攜載人類Aβ42肽之組合B細胞及T細胞抗原決定基，其與甘露多醣偶合後可在小鼠中誘導低水平的抗-Aβ反應。此等反應亦證明在皮下免疫接種後減弱了APP轉基因小鼠皮質及海馬區的澱粉樣蛋白沈積。該免疫接種亦導致在經Aβ28-甘露多醣及BSA-甘露多醣處理的動物中誘導的抗甘露多醣效價增加。然而，該治療沒有進一步發展，很可能是由於接受治療的動物大腦中微出血的發生增加，此歸因於甘露多醣作為不良血管事件觸發因素的潛在有害作用，強調了碳水化合物的選擇對於設計有效治療及安全之疫苗的重要性。
迄今為止，尚未知道使用與甘露多醣或其他相關CLEC偶合的單個B細胞或T細胞抗原決定基肽之結合物。
β-葡聚糖包含一組β-D-葡萄糖多醣。此等多醣為真菌中之主要細胞壁結構成分，且亦發現於細菌、酵母、藻類、地衣及植物(如燕麥及大麥)中。視來源而定，β-葡聚糖在鍵類型、支鏈化程度、分子量及三級結構方面有所不同。
β-葡聚糖為可溶性的可發酵纖維(亦稱為益生元纖維)的來源，其為大腸內之微生物群提供受質，增加糞便體積，且產生具有廣泛生理學活性的短鏈脂肪酸作為副產物。舉例而言，在血液中膽固醇水平正常或升高的人群中，每日自燕麥中攝取至少3公克的穀物β-葡聚糖可使總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇水平降低5%至10%。
通常情況下，β-葡聚糖形成具有1-3個β-糖苷鍵的線性主鏈，但在分子量、溶解度、黏度、支鏈結構及凝膠特性方面有所不同。酵母及真菌的β-葡聚糖通常建立在β-(1,3)主鏈上，且含有β-(1,6)側支鏈，而穀物的β-葡聚糖同時含有具有或不具有側支鏈的β-(1,3)及β-(1,4)主鏈鍵。
β-葡聚糖被先天免疫系統識別為病原體相關分子模式(PAMP)。PRR dectin-1已經成為此等碳水化合物之主要受體，且β-葡聚糖與dectin-1之結合經由Syk/CARD9信號傳導途徑誘導各種細胞反應，包括吞噬作用、呼吸爆發及分泌細胞介素。此外，補體受體3 (CR3，CD11b/CD18)亦被認為係β-葡聚糖之受體。據報導，經由dectin-1之刺激引發Th1、Th17及細胞毒性T淋巴細胞之反應。
β-葡聚糖家族的成員包括：
β-葡聚糖肽(BGP)為一種自真菌，即雲芝( Trametes versicolor)中提取的高分子量(約100 kDa)支鏈化多醣。BGP係由一個高度分支之葡聚糖部分組成，其包含β-(1,4)主鏈及β-(1,3)側鏈，以及與富含天門冬胺酸、麩胺酸及其他胺基酸的多肽部分共價連接的β-(1,6)側鏈。
卡德蘭多醣(Curdlan)為一種來自農桿菌屬( Agrobacteriumspp.)的高分子量線性聚合物，其由β-(1,3)連接之葡萄糖殘基組成。
來自褐藻―掌狀海帶( Laminaria digitata)之昆布多醣(laminarin)為一種帶有β-(1,6)鍵之線性β-(1,3)-葡聚糖。昆布多醣為一種低分子量(5-7kDa)之水溶性β-葡聚糖，其可作為dectin-1之拮抗劑或促效劑。其可與dectin-1結合而不刺激下游信號傳導，且能阻斷dectin-1與微粒狀β-(1,3)-葡聚糖，如酵母聚醣(zymosan)的結合。
石耳多醣(pustulan)為一種來自地衣，即泡突疱臍衣( Lasallia pustulata)的中等分子量(20 kDa)、線性β-(1,6)連接之β-D-葡聚糖，其亦能夠與作為主要受體之dectin-1結合，且藉由dectin-1活化信號傳導。
地衣多醣(lichenan)為一種來自冰島地衣( Cetraria islandica)的高分子量(約22-245kDa)之線性β-(1,3) β-(1,4)-β-D葡聚糖，其結構類似於大麥及燕麥之β-葡聚糖。與其他兩種葡聚糖相比，地衣多醣具有更高比例之1,3-β與1,4-β-D鍵，其β-(1,4)-與β-(1,3)-β-D鍵之比率為大約2:1。
來自燕麥及大麥之Β-葡聚糖為線性β-(1,3) β-(1,4)-β-D葡聚糖，且市面上售有不同的分子量(35.6 kDa之中等分子量至至多650 kDa之高分子量)的產品。
裂褶多醣(schizophyllan；SPG)為一種來自真菌，即裂襇菌( Schizophyllum commune)之膠凝β-葡聚糖。SPG為一種高分子量(450 kDa)之β-(1,3)-D-葡聚糖，在主鏈上每三個β-(1,3)-葡萄糖基殘基中有一個β-(1,6)單葡萄糖基分支。
硬葡聚糖(scleroglucan)為一種高分子量(＞1000 kDa)多醣，其由絲狀真菌，即白絹菌( Sclerotium rolfsii)發酵產生。硬葡聚糖係由線性β-(1,3) D-葡萄糖主鏈組成，每三個主殘基有一個β-(1,6) D-葡萄糖側鏈。
全葡聚糖顆粒(WGP)為因其調節免疫反應之能力而備受關注的β-葡聚糖。WGP Dispersible (來自Biothera之WGP® Dispersible)為一種微粒狀釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) β-葡聚糖製劑，其係由中空酵母細胞壁「幽靈(ghost)」組成，該等「幽靈」主要由自釀酒酵母細胞壁進行一系列鹼及酸萃取之後獲得之β-(1,3)葡萄糖之長聚合物構成。與其他dectin-1配位體(如酵母聚醣)相比，WGP Dispersible缺乏TLR刺激活性。相比之下，可溶性WGP可在不活化此受體之情況下結合dectin-1，且其可顯著阻斷WGP Dispersible與巨噬細胞之結合及其免疫刺激作用。
酵母聚醣(zymosan)為酵母細胞之不溶性製劑且經由TLR2活化巨噬細胞。TLR2在對酵母聚醣的反應中與TLR6及CD14協作。酵母聚醣亦可被dectin-1識別，該dectin-1作為在巨噬細胞及樹突狀細胞上表現之吞噬細胞受體，與TLR2及TLR6協作以增強各受體對酵母聚醣之識別所引發的免疫反應。
作為真菌細胞壁之主要成分，不同β-葡聚糖已用作產生針對真菌感染之抗葡聚糖抗體的抗原(例如：Torosantucci等人 J Exp Med. 2005年9月5日;202(5):597-606.；Bromuro等人, Vaccine 28 (2010) 2615-2623；Liao等人, Bioconjug Chem. 2015年3月18日;26(3):466-76)。
Torosantucci等人(2005)及Bromuro等人(2010)揭示支鏈β-葡聚糖―昆布多醣及線性β-葡聚糖―卡德蘭多醣與白喉類毒素CRM197偶合的結合物。此等結合物疫苗誘導針對β-葡聚糖之高IgG效價且針對小鼠中之真菌感染賦予保護作用。另外，亦可使用此類結合物偵測針對CRM197之高效價(Donadei等人, Mol Pharm. 2015年5月4日;12(5):1662-72)。作者亦產生用人類可接受之佐劑MF59調配之β-葡聚糖-CRM197疫苗，其具有合成的線性β-(1,3)-寡醣或β-(1,6)-支鏈之β-(1,3)-寡醣。所有結合物均誘導抗β-(1,3)-葡聚糖IgG之高效價，及/或除了抗β-(1,3)-葡聚糖IgG以外，亦誘導抗β-(1,6)-葡聚糖抗體之高效價，表明不同葡聚糖與經典載體蛋白之組合之免疫原性。有趣地是，與單獨的未結合CRM相比，Torosantucci等人在使用CRM-葡聚糖結合物進行免疫接種之後未能證實更優良的抗CRM效價。
Donadei等人(2015)亦分析白喉類毒素CRM197與線性β-(1,3)葡聚糖―卡德蘭多醣或合成β-(1,3)寡糖偶合的結合物。此類結合物具有免疫原性，對CRM197產生類似抗體反應。有趣的是，作者表明，與肌肉內(i.m.)免疫接種相比，CRM卡德蘭多醣結合物在皮內遞送時產生較高抗體效價。然而，與皮下施用相比，CRM-卡德蘭多醣之皮內施用並未顯示出不同的免疫原性。此外，CRM-卡德蘭多醣與以Alum為佐劑的非卡德蘭多醣偶合之CRM之間的活體內作用相當。因此，此系統中無法偵測到CLEC偶合對總體免疫反應之附加益處。
Liao等人(2015)揭示一系列線性β-(1,3)-β-葡聚糖寡醣(六-、八-、十-及十二-β-葡聚糖)，其與KLH偶合以產生糖結合物。此等結合物被證明能引起強而有力(robust)的T細胞反應且具有高度免疫原性，可誘導高水平的抗葡聚糖抗體。使用此類疫苗進行免疫接種之小鼠亦引起對致命病原體―白色念珠菌( C. albicans)之保護性免疫反應。該文獻未進行與未經結合之KLH的抗KLH效價比較，因此在此實驗環境中無法獲得關於β-葡聚糖之潛在益處的資訊。
此等發現對於基於葡聚糖之新糖結合物作為新穎疫苗之適用性非常重要：在初始的葡聚糖結合物免疫接種後誘導的潛在抗葡聚糖抗體可能導致在隨後的追加免疫注射中快速消除相同的β-葡聚糖疫苗，或者可能減弱新穎新糖結合物疫苗針對其他適應症的免疫反應，該作用在載體疫苗中為眾所周知的。正如上述對甘露多醣及β-葡聚糖所示的高水平抗葡聚糖抗體相同(Petrushina等人 2008, Torosantucci等人 2005, Bromuro等人, 2010, Liao等人, 2015)，高水平抗葡聚糖抗體之存在或甚至(再)刺激可能因此減少或消除由結合物疫苗引起之潛在免疫反應。因此，對於使用CLEC，尤其是β-葡聚糖作為免疫接種之骨架的新穎可持續平台而言，保證所用之多醣/寡醣之葡聚糖抗體誘導能力非常低或不存在將為至關重要的。
葡聚糖顆粒(GP)為高度純化的2-4 µm中空多孔細胞壁微球體，主要由β-(1,3)-D-葡聚糖構成，含有少量β-(1,6)-D-葡聚糖及幾丁質，通常使用一系列熱鹼、酸及有機萃取自釀酒酵母分離出來。該等顆粒與其受體dectin-1及CR3相互作用(亦有證據表明與類鐸受體及CD5之相互作用為GP功能之額外因素)，且上調MHC分子之細胞表面呈遞，引起共刺激分子之表現改變，且誘導促炎性細胞介素之產生。由於其免疫調節特性，GP已被探索用於疫苗遞送。
在疫苗中應用GP之一般方法有三種：(i)作為與一或多種抗原共投予之佐劑，以增強T細胞及B細胞介導之免疫反應，(ii)與抗原化學交聯 以及最常用的(iii)作為包裹在GP空腔內之抗原的物理遞送媒劑，向APC提供靶向抗原遞送。
(i)：抗原特異性適應性免疫反應可藉由將GP與抗原一起共投予來增強。在此習知佐劑策略中，先天性免疫反應以及適應性免疫反應均被活化以發揮對抗病原體之保護性反應。例如，Williams等人(Int J Immunopharmacol. 1989;11(4):403-10)藉由共投予GP為克氏錐蟲( Trypanosoma cruzi)滅活疫苗添加佐劑。使用此調配物引起之免疫反應使得經克氏錐蟲攻擊之小鼠的存活率達85%。相比之下，單獨接受右旋糖、葡聚糖或疫苗之對照組的死亡率為100%。
(ii)：GP之碳水化合物表面亦可使用NaIO 4氧化、碳二亞胺交聯或1-氰基-4-二甲基胺基吡啶四氟硼酸鹽介導之抗原與GP殼之結合進行共價改性。使用此方法，偶合功效極低(大約20%，如Pan等人 Sci Rep 5, 10687 (2015)中所述)，與抗原封裝在GP中或本申請案中提供之平台技術相比，其大大限制了疫苗候選物之適用性及數目。此類共價連接之抗原-GP結合物被用於研究癌症免疫療法及感染性疾病。舉例而言，Pan等人(2015)使用OVA交聯至經過碘酸鹽氧化之GP，並且用此疫苗對小鼠進行皮下免疫接種。當小鼠受到表現OVA之E.G7淋巴瘤細胞攻擊時，可觀測到腫瘤尺寸顯著減小。在皮下注射後12及36小時，可在淋巴結中的DC (CD11c +MHC-II +)中偵測到GP-OVA。腫瘤保護與總抗Ova免疫球蛋白(Ig)G效價增加、MHC-II及共刺激分子(CD80、CD86)表現增強及細胞毒性淋巴細胞反應升高相關。
(iii)：將GP應用於疫苗中之最有效方法為用其將疫苗/抗原封裝於空心中。GP可以高負載效率封裝一或多種抗原/DNA/RNA/佐劑/藥物/其組合，其取決於有效負載類型及預期遞送模式。
可使用聚合物奈米複合法將抗原封裝於GP之空腔中，該等方法如使用牛或鼠類血清白蛋白及酵母RNA/tRNA對有效負載加以負載及複合或添加褐藻酸鈣或褐藻酸鈣-殼聚醣混合物。使用此等策略，例如Huang等人(Clin. Vaccine Immunol. 2013; 20:1585-91)報導，接種GP-OVA之小鼠顯示出強烈的CD4+ T細胞淋巴增殖，Th1及Th17偏向的T細胞介導之免疫反應以及針對卵白蛋白之高IgG1特異性及IgG2c特異性抗體反應。相比於與抗原共投予之GP，非共價封裝策略引起更強的免疫反應。
GP封裝之次單位疫苗之實例為包覆有新型隱球菌( Cryptococcus neoformans)無莢膜菌株(cap59)之可溶性鹼性萃取物的GP，其藉由誘導抗原特異性的CD4+ T細胞反應(IFN-γ、IL-17A呈陽性)，使真菌菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)比初始攻擊劑量減少超過100倍，從而保護受致死劑量之高毒力新型隱球菌攻擊的小鼠(60%存活率) (Specht CA等人 Mbio 2015; 6: e01905- e1915.及Specht CA等人, mBio 2017; 8: e01872- e1917.)。此外，用GP封裝之抗原給小鼠接種已被證明對莢膜組織胞漿菌( Histoplasma capsulatum) (Deepe GS等人, Vaccine 2018; 36: 3359-67)、土倫病法蘭西斯氏菌( F. tularensis) (Whelan AO等人, PLOS ONE 2018; 13: e0200213)、皮炎芽生菌( Blastomyces dermatitidis) (Wuthrich M等人, Cell Host Microbe 2015; 17: 452-65)及波薩達斯球孢子菌( C. posadasii) (Hurtgen BJ等人, Infect. Immun. 2012; 80: 3960- 74)有效。
除了癌症及感染性疾病的應用外，亦使用GP作為用於疫苗遞送之封裝劑進行了數目有限的使用自體抗原之研究。沿著此等思路，Rockenstein等人(J. Neurosci., 2018年1月24日• 38(4):1000 -1014)描述了負載有重組人類α突觸核蛋白(含有適用於誘導抗aSyn免疫反應之B細胞抗原決定基及T細胞抗原決定基兩者)及已知能誘導抗原特異性調節性T細胞(Treg)之雷帕黴素(Rapamycin)的GP在突觸核蛋白病變之鼠類模型中的應用。如使用全長α突觸核蛋白作為免疫原的先前研究所預期，施用含有aSyn之GP會誘導強而有力(robust)的抗α突觸核蛋白抗體效價，且減輕動物中α突觸核蛋白觸發的病理性改變，其程度與先前所公佈的相似。添加雷帕黴素能有效地誘導iTreg (CD25及FOXP3+)細胞之形成，因為在雷帕黴素暴露之後此類Treg細胞之數目顯著增加。負載有α突觸核蛋白抗原及雷帕黴素之GP因此在突觸核蛋白病變之小鼠模型中觸發神經保護性體液及iTreg反應，且組合疫苗(aSyn+雷帕黴素)比單獨的體液免疫接種(GP aSyn)或細胞免疫接種(GP雷帕黴素)更有效。尚未有文獻報導關於對習知的非含α突觸核蛋白之GP免疫接種之作用之可比性的資訊。
β-葡聚糖新糖結合物經由C型凝集素受體dectin-1高效靶向樹突狀細胞，增強其免疫原性。具體言之，某些β-葡聚糖亦用作使用模型抗原(如OVA(Xie等人, Biochemical and Biophysical Research Communications 391 (2010) 958-962；Korotchenko等人, Allergy. 2021;76:210-222.)或基於MUC1之融合蛋白(Wang等人, Chem. Commun., 2019, 55, 253))進行疫苗接種之潛在載體。
Xie等人及Korotchenko等人使用支鏈β-葡聚糖―昆布多醣作為OVA結合之骨架，隨後將此等新糖結合物經上表皮或經由皮下途徑施用於小鼠。Xie等人展示與單獨卵白蛋白相比，昆布多醣/OVA結合物而非化合物之非共軛混合物誘導了抗OVA CD4+ T細胞反應增加。重要的是，共注射未結合之昆布多醣阻斷了此增強，此現象支持昆布多醣介導之APC靶向之功能。正如所預期的一般，原生OVA及OVA與昆布多醣之混合物刺激低水平之抗OVA抗體產生。相反地，OVA/昆布多醣結合物顯著增強了抗體反應。同樣地，Korotchenko等人證實，昆布多醣與OVA之結合顯著增加了吸收，且誘導BMDC之活化及促炎性細胞介素之分泌。LamOVA結合物之此等特性亦使得與BMDC共培養之OVA特異性初始T-細胞之刺激增強。在預防性免疫接種實驗中，作者證實了，用LamOVA進行免疫接種降低了其致敏性，且在兩次免疫接種之後，誘導較OVA高約三倍之IgG1抗體效價。然而，在第三次免疫接種之後，所有組均顯示相似的抗體效價，此作用在所有處理組中均消失了。Lam/OVA結合物及OVA/alum結合物在過敏性哮喘之鼠類模型中顯示出相當的治療功效。因此，此等實驗無法提供基於葡聚糖之結合物與習知疫苗相比有明顯優勢。
Wang等人(2019)分析了基於β-葡聚糖之MUC1癌症疫苗候選物之作用。同樣，選擇MUC1串聯重複序列GVTSAPDTRPAPGSTPPAH (經充分研究之癌症生物標記物)作為肽抗原，在重複序列中提供T細胞及B細胞抗原決定基。利用1,1'-羰基-二咪唑(CDI)介導之條件，使用乙二醇(亦即，PEG)間隔子將β-葡聚糖及MUC1肽與酵母β-(1,3)-β-葡聚糖多醣連接起來。β-葡聚糖-MUC1奈米顆粒之大小在150 nm範圍內(實際平均值162nm)，而未經改性之β-葡聚糖形成之顆粒呈大約540 nm。β-葡聚糖-MUC1結合物引起高效價的抗MUC1 IgG抗體之高效價，與對照組相比明顯更高。所產生之抗體之同型及亞型的進一步分析顯示IgG2b為主要亞型，表明Th1型反應活化，因為IgG2b/IgG1之比率＞1。所觀測到的大量IgM抗體表明補體系統之C3成分參與其中，其常常誘發細胞毒性，且將此類骨架用於應避免產生細胞毒性之疫苗，例如用於慢性或退化性疾病之疫苗可能會成為問題。
US 2013/171187 A1揭示了一種包含葡聚糖及醫藥學上可接受之載體的免疫原性組合物，以引起保護性的抗葡聚糖抗體。Metwali等人(Am. J. Respir. Crit. Care Med. 185 (2012), A4152; poster session C31 Regulation of Lung Inflammation)研究了葡聚糖衍生物在肺炎中之免疫調節作用。WO 2021/236809 A2揭示了一種包含澱粉樣蛋白-β及tau肽之多抗原決定基疫苗，用於治療阿茲海默症(AD)。US 2017/369570 A1揭示了與針對腫瘤微環境中存在之細胞的抗體連接之β-(1,6)-葡聚糖。US 2002/077288 A1揭示了單獨或結合用於治療AD之與澱粉樣蛋白-β同源的合成免疫原性但非類澱粉樣肽。US 2013/171187 A1揭示了用作抵抗白色念珠菌之真菌感染之保護劑的抗葡聚糖抗體。WO 2004/012657 A2揭示了作為疫苗佐劑的微粒β-葡聚糖。CN 113616799 A揭示了一種由經氧化之甘露多醣及陽離子聚合物組成之疫苗載體。CN 111514286 A揭示了一種帶有葡聚糖之茲卡病毒(Zika virus) E蛋白結合物疫苗。US 4,590,181 A揭示了一種與石耳多醣或黴菌葡聚糖混合於溶液中的病毒抗原。Lang等人(Front. Chem. 8 (2020): 284)綜述了疫苗研發中的碳水化合物結合物。Larsen等人(Vaccines 8 (2020): 226)報導，石耳多醣在活體外活化了源自雞骨髓之樹突狀細胞且促進離體CD4 +T細胞對感染性支氣管炎病毒之回憶反應。US 2010/266626 A1揭示了葡聚糖，較佳昆布多醣和卡德蘭多醣，作為結合於佐劑之抗原對真菌進行免疫。Mandler等人(Alzh. Dement. 15 (2019), 1133-1148)報導了靶向澱粉樣蛋白-β蛋白及α突觸核蛋白之單一及組合免疫治療方法在類路易氏體癡呆模型中之作用。Mandler等人 (Acta Neuropathol. 127 (2014), 861-879)報導了一種針對突觸核蛋白病變之下一代主動免疫接種方法，該方法使用短的免疫原性(B細胞反應)肽，該等肽太短而無法誘導T細胞反應(自體免疫)且不攜載原生抗原決定基，而攜載模擬原始抗原決定基之序列(例如寡聚α突觸核蛋白)，以及該方法對帕金森氏症(Parkinson's disease；PD)臨床試驗之影響。Mandler等人(Mol. Neurodegen. 10 (2015), 10)報導，針對α突觸核蛋白之主動免疫接種改善多發性系統萎縮症(MSA)之模型中的退化性病變且預防脫髓鞘。Jin等人(Vaccine 36 (2018), 5235-5244)主要圍繞佐劑性、結構-活性關係及受體識別特性方面綜述了作為潛在免疫佐劑之β-葡聚糖。WO 2022/060487 A1揭示了一種用於治療神經退化性疾病之包含特異性α突觸核蛋白肽之疫苗。WO 2022/060488 A1揭示了一種用於治療AD的包含澱粉樣蛋白-β及α突觸核蛋白肽之多抗原決定基疫苗。US 2009/169549 A1揭示了α突觸核蛋白之修飾形式之構形異構體，其藉由將半胱胺酸引入α突觸核蛋白多肽且擾亂雙硫鍵以形成穩定及免疫原性的異構體而產生。WO 2009/103105 A2揭示了具有自原生α突觸核蛋白序列中之胺基酸D115延伸至胺基酸N122之α突觸核蛋白抗原決定基之模擬抗原決定基的疫苗。
到目前為止，尚未公佈有報告證明構築或使用與β-葡聚糖，尤其是對dectin-1具有高結合特異性/能力的線性β-葡聚糖及/或石耳多醣偶合的個別B細胞或T細胞抗原決定基肽，由此形成依本申請中所提出的新穎新糖結合物。
因此，本發明之一個目標為提供改良型疫苗，其為由疫苗接種抗原與基於碳水化合物之CLEC佐劑結合而製成的結合物疫苗形式，尤其是提供相較於目前先進技術之結合物疫苗，尤其是基於碳水化合物之CLEC-肽/蛋白質結合物疫苗，能在經疫苗接種之個體中提供經改善之免疫反應的疫苗。
本發明之另一目標為提供疫苗組合物，其使用CLEC骨架賦予短、易互換、高度特異性的B/T細胞抗原決定基免疫性，有習知疫苗先前所不能滿足的功效、特異性及親和力。
本發明之一特定目標為提供用於真皮區室之疫苗，其具有經改良之基於CLEC之疫苗的選擇性及/或特異性。
本發明之另一目標為提供疫苗，其儘可能專門地誘導目標特異性免疫反應，同時不誘導或僅誘導非常有限之CLEC特異性或載體蛋白特異性抗體反應。
本發明之另一目標為提供用於適當預防及治療突觸核蛋白病變的疫苗組合物，其使用CLEC骨架賦予α突觸核蛋白之短、易互換、高度特異性的B/T細胞抗原決定基免疫性，有習知疫苗先前所不能滿足的功效、特異性及親和力。
本發明之一特定目標為提供用於真皮區室之α突觸核蛋白疫苗，其具有經改良之基於CLEC之疫苗的選擇性及/或特異性。
本發明之另一目標為提供疫苗，其儘可能專門地誘導α突觸核蛋白特異性免疫反應，同時不誘導或僅誘導非常有限之CLEC特異性或載體蛋白特異性抗體反應。
本發明之另一目標為提供α突觸核蛋白(aSyn)之肽免疫原構築體及其調配物以用於治療突觸核蛋白病變。
因此，本發明提供一種由至少一β-葡聚糖或一甘露多醣及至少一個B細胞或T細胞抗原決定基多肽組成或包含其之結合物，其中該β-葡聚糖或該甘露多醣共價結合至少一個B細胞或T細胞抗原決定基多肽於以形成β-葡聚糖或甘露多醣及B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽之結合物，且其中該B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽為α-突觸蛋白多肽。替代地，根據本發明之結合物包含或由至少一β-葡聚糖或一甘露多醣及至少一個α-突觸核蛋白B細胞抗原決定基多肽組成，其中該β-葡聚糖或該甘露多醣與B細胞抗原決定基多肽共價結合以形成β-葡聚糖或甘露聚糖及B細胞抗原決定基多肽之結合物。
較佳地，該β-葡聚糖為石耳多醣、地衣多醣、昆布多醣、卡德蘭多醣、β-葡聚糖肽(BGP)、裂褶多醣、硬葡聚糖、全葡聚糖顆粒(WGP)、酵母多醣或蘑菇多醣，較佳為石耳多醣、昆布多醣、地衣多醣、蘑菇多醣、裂褶多醣或硬葡聚糖，尤其是其中該β-葡聚糖為石耳多醣。
根據本發明之一較佳實施例，β-葡聚糖用作B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽之C型凝集素(CLEC)多醣佐劑，尤其是其中該β-葡聚糖共價結合於B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽以形成β-葡聚糖與B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽之結合物，其中該β-葡聚糖為主要呈線性的β-(1,6)-葡聚糖，其β-(1,6)偶合之單醣部分與非β-(1,6)偶合之單醣部分之比率為至少1:1、較佳為至少2:1、更佳為至少5:1、尤其是至少10:1。
藉由本發明，成功地解決上文所列之一或多個目標。此對於熟習此項技術者為出人意料的，因為迄今為止，在本發明技術領域中未公佈有報告證明與根據本發明之新穎、小型、模組化新糖結合物相似之化合物的構築及適用性或功效。
出人意料地，經本發明展示，藉由將肽/蛋白質與根據本發明之所選CLEC載劑之結合(亦即，藉由共價偶合；在本文中以同義使用)，其中該結合可基於目前先進技術化學作用，獲得實現免疫反應之優良醫藥調配物。在本發明技術領域中，有大量不同偶合方法可用。在本發明之建立過程中，已鑑別出腙形成或經由異雙官能連接子之偶合係特定較佳方法。一般而言，需要在結合之前活化CLEC (例如在糖部分之鄰位OH基團上形成具反應性的醛)及所選肽/蛋白質上存在反應性基團(例如N端或C端的醯肼殘基、SH基團(例如經由N端或C端半胱胺酸))。反應可為單一步驟反應(例如混合活化之CLEC與醯肼-肽，引起腙形成)或多步驟製程(例如：活化之CLEC與來自異雙官能連接子之醯肼反應，且隨後肽/蛋白質經由各別反應性基團偶合)。
因此，本發明之結合物之各成分可彼此直接偶合，例如藉由使B細胞抗原決定基及/或T細胞抗原決定基與β-葡聚糖或甘露多醣及/或載體蛋白偶合或藉由使β-葡聚糖或甘露多醣與載體蛋白偶合(在所有可能的方向上)。本文中提及「B細胞抗原決定基多肽」或「T細胞抗原決定基多肽」默認意謂「B細胞抗原決定基多肽」或「T細胞抗原決定基多肽」之B細胞或T細胞抗原決定基，且不意謂載體蛋白(若存在)之B細胞或T細胞抗原決定基，除非其明確稱為載體蛋白之B細胞或T細胞抗原決定基。根據一較佳實施例，B細胞抗原決定基及/或T細胞抗原決定基較佳藉由連接子連接於β-葡聚糖或甘露多醣及/或載體蛋白，更佳為半胱胺酸殘基或包含半胱胺酸或甘胺酸殘基之連接子；由以下方式產生之連接子：醯肼介導之偶合、經由異雙官能連接子(如N-β-順丁烯二醯亞胺基丙酸醯肼(BMPH)、4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸醯肼(MPBH)、N-[ε-順丁烯二醯亞胺基己酸)醯肼(EMCH)或N-[κ-順丁烯二醯亞胺基十一酸]醯肼(KMUH))之偶合、咪唑介導之偶合、還原胺化、碳二亞胺偶合一-NH-NH 2連接子、一NRRA、NRRA-C或NRRA-NH-NH 2連接子、肽連接子，如二聚體、三聚體、四聚體(或更長聚體)肽群，如CG或CG、或裂解位點，如組織蛋白酶裂解位點、或其組合，尤其是藉由半胱胺酸或NRRA-NH-NH 2連接子。顯而易見地，「由(例如)醯肼介導之偶合產生之連接子」係指在結合之後結合物中所得的化學結構，亦即結合之後存在於所得結合物中的化學結構。胺基酸連接子可用肽鍵(例如含有甘胺酸之連接子)或經由胺基酸之官能基(如半胱胺酸連接子之雙硫鍵)以結合形式存在。
根據本發明之新穎類別之結合物被證明可藉由使用本發明之CLEC骨架賦予短、易互換、高度特異性的B細胞/T細胞抗原決定基免疫性，顯示出習知疫苗先前所不能滿足的功效、特異性及親和力：實際上，根據本發明之結合物為在基於CLEC之疫苗中使用短B細胞/T細胞抗原決定基之首個實例，避免了以融合蛋白形式呈遞α突觸核蛋白抗原決定基之需要，包括形成抗原決定基之串聯重複序列或不同串聯重複序列之融合，以形成穩定且有效的免疫原。
藉由本發明，亦可避免將全長蛋白質用於CLEC疫苗(亦即，葡聚糖顆粒(GP)中之有效負載)的必要性。此外，亦可避免由存在於免疫原，如自體蛋白，尤其是如α突觸核蛋白中之(不合需要之) T細胞抗原決定基所誘導的自體免疫反應之問題。
根據本發明，短抗原決定基(B細胞及/或T細胞抗原決定基，主要是肽，經修飾的肽)可使用基於公認化學作用之共價偶合首次與基於CLEC之功能性骨架結合，其中可能的結合方法可基於本領域熟知的方法適應特定抗原決定基之要求。
根據本發明之短肽之呈遞可以與個別的外來T細胞抗原決定基組合的單獨結合部分(呈短肽或長蛋白)形式，或以與較大載體分子的複合體/結合物形式進行以提供T細胞抗原決定基誘導可持續的免疫反應。根據本發明之疫苗的設計實現製備多價結合物作為藉由高效B細胞受體(BCR)交聯誘導的高效免疫反應之前提條件。
此外，藉由本發明，可提供對真皮區室具有極佳選擇性/特異性的基於CLEC之疫苗。實際上，根據本發明之結合物設計建立在CLEC作為目標特異性α突觸核蛋白抗原決定基之載體上，該等抗原決定基對真皮APC/DC上之PRR顯示出高度結合特異性，尤其是dectin-1 (或甘露多醣的MR及DC-SIGN)上，以實現皮膚選擇性/特異性及受體介導之吸收(=靶向疫苗遞送)。
用作根據本發明之載體的CLEC多醣用於將載體-肽結合物集中至較佳真皮/皮膚DC中且啟動免疫反應。此尤其歸因於表皮或真皮(非皮下)特異性。根據本發明之CLEC骨架及有效真皮免疫反應啟動亦有助於避免強制使用佐劑，該等佐劑對於習知疫苗為典型的且亦用於例示性的基於CLEC之疫苗中(例如：使用Alum、MF59、CFA、PolyI:C或其他佐劑)。根據本發明之一較佳實施例，佐劑之使用可顯著減少或省去，例如在不指示添加佐劑之情況下。
若干CLEC已被用於先前應用中，但是所提出的結合物結構中無一者可賦予皮膚選擇性(亦即，高dectin-1結合能力)，高效的真皮DC靶向，以及與所有其他途徑(亦即，皮下、肌肉內及腹膜內)相比，對於真皮施用的優良免疫原性。
已選擇根據本發明之CLEC以提供新穎的解決方案來高效靶向皮膚特異性DC及皮膚特異性免疫接種。根據本發明之結合物還在其他經典接種組織如肌肉或皮下組織中發揮有限的免疫活性，其與先前描述的基於CLEC之疫苗/候選疫苗在肌肉注射或皮下注射的應用形成對比。作為在本發明之過程中進行的實驗之結果，根據本發明之疫苗，尤其使用石耳多醣作為CLEC之疫苗被鑑別為對皮膚免疫接種具有出人意料的選擇性。
藉由本發明，就有可能在不誘導或僅誘導非常有限的CLEC或載體蛋白特異性抗體反應的同時專注於誘導α突觸核蛋白特異性免疫反應。因此，根據本發明之結合物解決了經典結合物疫苗所帶來的問題，該等經典疫苗必須依靠使用外來載體蛋白來誘導可持續的免疫反應。目前先進技術結合物疫苗研發很大程度上建立在如KLH、CRM197、破傷風類毒素或其他適合蛋白質之載體分子上，該等載體分子與目標特異性短抗原複合，針對突觸核蛋白病變，如帕金森氏症遞送針對α突觸核蛋白之免疫反應遞送受質。
根據本發明之較佳的多肽免疫原構築體含有與CLEC偶合之來自α突觸核蛋白(aSyn，αSyn)之B細胞抗原決定基及異源輔助性T細胞(Th)抗原決定基。本發明提供出人意料地優良新型結合物，其在免疫原性、針對aSyn之交叉反應性、對aSyn物種/聚集體的選擇性、親和力、親和力成熟度及抑制能力方面均超越了習知疫苗。
根據本發明之α突觸核蛋白多肽與β-葡聚糖或甘露多醣之共價結合使得此類多肽之免疫反應能夠出人意料且意想不到地增強。與傳統疫苗調配物，如由Rockenstein等人(2018)描述之疫苗調配物相比尤其令人印象深刻，亦如以下實例部分中所證實。
Rockenstein等人(2018)揭示與aSyn及雷帕黴素非共價複合的酵母全葡聚糖顆粒(GP)作為帕金森氏症免疫治療劑的應用。此等GP在一系列由釀酒酵母進行之熱鹼性、有機及水性萃取步驟之後產生，產生由不含細胞質內容物且由β-葡聚糖(主要為ß1-3 β-葡聚糖)之多孔不溶性殼體包圍之高度純化的3至4 μm直徑之酵母細胞壁製劑組成之最終產物。
重要的是，Rockenstein等人(J. Neurosci., 1月24日, 2018 • 38(4):1000 -1014)所揭示的疫苗組合物係由與卵白蛋白及小鼠血清白蛋白(MSA)、人類aSyn及MSA或人類aSyn、MSA及雷帕黴素非共價複合的GP組成。此複合方法依賴於將不同的有效負載(payload)與GP共培育，且後續在無共價連接之情況下擴散至GP空腔中，因此，其與藉由僅將成分混合而未進行共價連接來調配疫苗的本申請案中提供之實例5中所揭示之一組疫苗類似，且與根據本發明之疫苗相比被證明是較為低效且不適合的。
1) Rockenstein等人證明aSyn及GP之非共價混合引起針對aSyn之可偵測的免疫反應，因此證明GP可作為佐劑。然而，Rockenstein等人亦證明與對照組相比，需要雷帕黴素之非共價添加/共複合才能誘導此類疫苗顯著增強的功能性。自此角度看，需要各種佐劑(GP以及mTOR抑制劑雷帕黴素)之混合物來提供功能齊全的疫苗，如本發明所揭示之疫苗。
2)Rockenstein等人所揭示之疫苗在此aSyn過度表現模型中具有活性，因為其提供aSyn特異性T細胞抗原決定基(以及其他T細胞抗原決定基，如MSA衍生抗原決定基)以便發揮其完整的功能性，亦即誘導神經保護性、抗aSyn定向細胞(亦即，T細胞介導)及體液(亦即，基於抗體/B細胞)免疫反應。此與本發明之教示內容形成直接對比，在本發明中，若所選疫苗僅引發aSyn特異性B細胞反應，則已經足夠。
3)使用全長aSyn亦存在誘導/加強自體反應性Syn特異性T細胞之危險，該等T細胞具有加重PD及其他突觸核蛋白病變中之潛在神經病理學的可能性。因此，Rockenstein等人所提出的GP-aSyn-雷帕黴素疫苗就此問題而言，不適合人類使用。
4)如實例5中所示，類似於Rockenstein等人，Syn衍生肽(例如：SeqID2，亦即B細胞抗原決定基)及混雜T細胞抗原決定基(例如：SeqID7)與β-葡聚糖顆粒(例如：未經氧化之石耳多醣)之非共價混合亦能夠誘發針對aSyn之低水平抗體反應。然而，建立在此類肽與適合的葡聚糖之共價連接上的根據本發明之疫苗發揮顯著不同且更優良的免疫反應(亦參見圖5)。
此外，且亦揭示於實例6及圖7中，相比於如本發明所揭示之建立在葡聚糖顆粒及肽上的非共價混合疫苗，此類共價連接疫苗亦顯示極為有益的缺乏抗葡聚糖抗體反應。
因此，Rockenstein等人之先前技術揭示內容未表明本發明揭示之所主張的主題。包含B 細胞及/或T細胞抗原決定基的任何α-突觸核蛋白多肽均可用於本發明之情形下，包括先前技術中提出的候選多肽疫苗，例如WO 2004/041067 A2、WO 2006/045037 A2、WO 2009/103105 A2、WO 2011/020133 A1 或Mandler 等人(Mol. Neurodeg. 10 (2015), 10; Acta Neuropath. 127 (2014), 861-879)所揭示的彼等者。因此，具有原生胺基酸序列之α-突觸核蛋白多肽(根據人類α-突觸核蛋白)或包含aSyn之B細胞和/或T細胞抗原決定基的aSyn衍生多肽，如其模擬物或模擬抗原決定基，可用作根據本發明之結合物中的α-突觸核蛋白多肽成分。
本發明中待結合的特定較佳aSyn多肽係選自原生α突觸核蛋白或包含原生人類α突觸核蛋白之胺基酸序列的以下胺基酸殘基或由其組成之多肽：1至5、1至8、1至10、60至100、70至140、85至99、91至100、100至108、102至108、102至109、103至129、103至135、107至130、109至126、110至130、111至121、111至135、115至121、115至122、115至123、115至124、115至125、115至126、118至126、121至127、121至140或126至135，該胺基酸序列為： MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA (人類aSyn (1-140 aa)：UNIPROT登錄號P37840)， 較佳為包含以下胺基酸殘基或由其組成之多肽：1至8、91至100、100至108、103至135、107至130、110至130、115至121、115至122、115至123、115至124、115至125、115至126、118至126、121至127或121至140；或選自以下之群的模擬抗原決定基：DQPVLPD、DQPVLPDN、DQPVLPDNE、DQPVLPDNEA、DQPVLPDNEAY、DQPVLPDNEAYE、DSPVLPDG、DHPVHPDS、DTPVLPDS、DAPVTPDT、DAPVRPDS及YDRPVQPDR。
Weihofen等人(Neurobiology of Disease 124 (2019) 276-288)揭示作為適合aSyn抗原決定基之N端殘基aa1-10 (MDVFMKGLSK)。PRX002 (如Masliah等人, (PLoS One 6:e19338)；Games等人, (2014, J Neurosci 34:9441-9454)；Schenk等人, (Mov Disord. 2017年2月;32(2):211-218.)；Jankovic等人, (JAMA Neurol. 2018 Oct 1;75(10):1206-1214.)所揭示)係針對C端區域aa118-126 (VDPDNEAYE)。Schofield等人(Neurobiol Dis. 2019 Dec;132:104582.) MEDI 揭示aSyn特異性單株抗體 MEDI-1341，其針對aSyn 之C端區域中之類似抗原決定基(aa 103-129，NEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMP)。Nordström等人, (Neurobiology of Disease 161 (2021) 105543)揭示MEDI單株抗體 (aa121-127；DNEAYEM)。熟悉此項技術者已知之aSyn中適合作為抗體/免疫治療劑之其他適合的抗原決定基包括來自自體抗體之抗原決定基 (如Heinzel等人, (PLoS ONE 9(12): e114566.)；Rabenstein等人, (Neurosci Lett. 2019年6月21日;704:181-188)；US 2014/0377271 A1及Li等人, (Acta Neuropathologica 137, 825-836 (2019)所揭示)，包括aa60-100、aa60-95、aa73-82、aa91-100；aa74-79及aa92-97、aa121-140及aa111-121。此外，Games等人 (2014)亦揭示適合的抗原決定基aa 91-99及aa 118 -126。在US 2005/0037013 A1中，揭示能夠誘發針對殘基aa70-140內之特定抗原決定基之免疫反應的免疫原性α-突觸核蛋白片段。WO 2009/103105 A2及WO 2011/020133 A1分別揭示aa102-108及aa115-121之分子模擬物。WO 2016/062720 A1提供經修飾之VLP，其包含能夠誘導高抗肽反應之代表中間區域(aa102-109)以及N端(aa1-8)序列或C端序列(亦即，aa131-140)之Th細胞抗原決定基。中間及C端衍生之抗原決定基亦能夠誘導識別不同aSyn物種(例如：單體及寡聚)之aSyn特異性效價。有趣的是，所提供之疫苗均無法在活體內PD模型中減少aSyn負擔或行為改變。US 2015/0232524 A1揭示多肽免疫原，尤其是aa10-14及aa36-69，且抗原決定基顯示於aa85-99、aa109-126及aa126-140中。有趣的是，所有構築體均建立抗aSyn免疫反應，然而抗原決定基a109-126似乎不太有效。WO 2018/232369 A1顯示目標特異性B細胞抗原決定基(10-25aa，源自aSyn之C端，區域：aa111-135)之應用。
儘管原則上，本發明能夠改良所有提出之aSyn疫苗接種多肽，但根據其對本發明平台之適用性對所選抗原決定基進行特定評定。舉例而言，aa1-8 (SeqID12+13)被顯示優於基於KLH之疫苗。
儘管α突觸核蛋白多肽之性質對於β-葡聚糖或甘露多糖結合物產生並不重要，但存在較佳及較不佳之α突觸核蛋白抗原決定基，視結合物必須解決之目的而定(對單體或聚集體之特異性、選擇性、親和力、抗體產生等)。
對於本發明之一些實施例，B細胞抗原決定基aa91-100、aa100-108、aa107-114及aa131-140由於對α突觸核蛋白之降低的抗肽反應及反應性(aa91-100)；對α突觸核蛋白之低交叉反應性(CR)(儘管具有高抗肽效價)、對聚集體之降低的選擇性(aa100-108)；抑制聚集之效能的降低(aa107-114)；及選擇性的變化(對於單體，而非聚集體)、選擇性的降低、及對於減少α突觸核蛋白聚集體之有效性降低(aa131-140)而為較不理想的。此外，具有5個或更少胺基酸殘基(或具有6個或更少胺基酸殘基)之抗原決定基多肽通常亦為較不理想的，歸因於用此類短形式所引發之較低的免疫反應。
根據本發明之特定較佳α突觸核蛋白抗原決定基包含上述抗原決定基，其包含以下原生人類α突觸核蛋白之胺基酸序列的胺基酸殘基或由以下組成：1至5、1至8、1至10、60至100、70至140、85至99、91至100、100至108、102至108、102至109、103至129、103至135、107至130、109至126、110至130、111至121、111至135、115至121、115至122、115至123、115至124、115至125、115至126、118至126、121至127、121至140或126至135。
舉例而言，上文所提及之aa115-126及其較短序列及模擬抗原決定基在免疫原性、選擇性、聚集體抑制等方面尤其適用；一般而言，具有7個或更多個胺基酸殘基之多肽顯示良好免疫反應及與α突觸核蛋白之交叉反應性；對於aa 115-121 (以及C端延長多肽(例如直至aa126))顯示出極佳的免疫反應性及交叉選擇性(甚至與結合於抗原決定基115-122之單株LB509形成對比(Jakes等人, Neurosci Lett. 1999年7月2日;269(1):13-6))；出人意料地，相比於使用CRM197或KLH作為載體蛋白之「經典構築體」，根據本發明之結合物顯示出顯著提高的針對聚集體之選擇性(而例如基於CRM之疫苗通常缺乏針對聚集體之選擇性或甚至對單體具有選擇性，根據本發明之結合物顯示針對聚集體之顯著且明確的活性)。
鑒於LB509與α突觸核蛋白聚集體結合但不能抑制其聚集的已公佈實驗(Breydo等人 Mol Neurobiol 53, 1949-1958 (2015))，此結果甚至更出人意料，其證明並非每個來自該抗原決定基之抗體與本發明之情況一樣具有生物活性。
本領域公認，相較於健康對照組，PD患者之T細胞區室發生不同變化(例如：Bas等人, J Neuroimmunol 2001; 113:146-52或Gruden等人, J Neuroimmunol 2011; 233:221-7)。PD中之T細胞之此類表現型變化為例如：絕對淋巴細胞計數減少、總T細胞之絕對及相對計數降低、CD4+之絕對及相對計數降低且有時CD8+淋巴細胞之絕對及相對計數亦降低、Th1/Th2及Th17/Treg比率增加，以及促炎性細胞介素之表現增加。然而，在健康衰老期間亦可發現大部分此等變化，使得難以辨別諸如PD之疾病的影響，該疾病呈現極廣泛範圍之發作(約30至90年)及可變進程速率。關於絕對細胞數目，似乎一致認為CD3+CD4+ T細胞在PD中淨減少。此CD4減少由所述之CD4:CD8比率改變支持。
沿著此等思路，舉例而言，Bhatia等人(J Neuroinflammation (2021) 18:250)展示PD中與疾病嚴重程度相關的CD3+ T細胞總數之總體減少(例如使用H+Y期來量測)。此表明隨著疾病的持續，全身性T細胞功能障礙不斷進展，可能反映了持續發炎、藥物治療及生活方式改變的綜合影響。此外，Lindestam Arlehamn等人(2020)展示在前驅或早期臨床階段(＜10年持續時間及H+Y期0-2)在PD患者中可偵測到最高T細胞活性。
因此，提供用於加強或保持PD患者中之T細胞數，尤其是T效應細胞數及T細胞功能的治療為本發明之一較佳實施例。此較佳包括將檢查點抑制劑或使用抗免疫檢查點抑制劑抗原決定基之疫苗與本發明之目標特異性疫苗組合，誘導抗免疫檢查點抑制劑免疫反應，以加強或保持PD患者中之T細胞數，尤其是T效應細胞數及T細胞功能。
適合於/適用於治療之患者的特徵在於CD3+細胞的總體減少，尤其是對於處於所有疾病期之PD患者典型的CD3+CD4+細胞總體減少。針對此組合界定適合患者群的疾病之較佳階段分別為H+Y 1-4期、較佳為H+Y 1-3期、最佳為H+Y 2-3期。
此外，由於結合物中載體特異性抗原決定基之過表現，在使用載體結合物重複免疫接種後誘導之目標特異性反應之親和力成熟亦受損。如本文所用及理解，免疫學中之親和力成熟為T FH細胞活化之B細胞在免疫反應過程期間產生對抗原具有增加之親和力之抗體的過程。在重複暴露於相同抗原中的情況下，宿主將產生具有逐漸增大之親和力的抗體。次級反應可以引發比初級反應高若干倍之親和力的抗體。親和力成熟主要發生於生發中心B細胞之表面免疫球蛋白上且為體細胞超突變(SHM)及T FH細胞選擇之直接結果(亦參見：https://en.wikipedia.org/wiki/Affinity_maturation)。根據西格恩氏(Segen's)醫學辭典(https://medical-dictionary.thefreedictionary.com/affinity+maturation''＞affinity maturation＜/a＞)，親和力成熟為免疫接種之後抗體對抗原之平均親和力增加。親和力成熟係肇因於特異性及較均勻IgG抗體之增加，且緊隨於IgM分子特異性較低及較為非均質的早期反應之後。
目前先進技術之CLEC疫苗均誘發針對所用載體蛋白(例如：CRM197或OVA)之高效價。然而，載體蛋白成分之此高免疫原性以及結構複雜性及不均勻性可能導致以目標特異性反應為代價誘導高水平載體/蛋白質特異性抗體，因此相比於所誘導的載體反應，目標特異性反應可能表現不足。
此外，高抗載體反應亦造成免疫排斥及相關安全問題之風險。
因此，根據本發明之具有高免疫原性、高目標特異性及高耐受性/安全性且具有較低或不存在之載體反應性(亦即針對蛋白質載體)的有效構築體藉由創新的解決方法成功地解決此挑戰。另外，對於根據本發明之新穎疫苗，提供不誘導或僅誘導極弱的針對糖骨架之免疫反應的免疫治療劑為至關重要的。這一點尤其重要，因為免疫接種後所誘導的高抗CLEC抗體水平可能會透過疫苗中和作用而抑制或降低使用相同基於CLEC之疫苗進行重複免疫接種的功效，或亦可能對使用此類型疫苗用於針對不同目標的連續免疫接種有不利影響。
根據本發明之疫苗平台亦滿足在一種調配物中組合針對一個或若干個目標的各種抗原決定基的需求，而不引起由於如針對經典疫苗所報導之非預期抗原決定基擴散而降低功效的風險。根據本發明之平台之模組設計允許容易地交換B細胞抗原決定基及T細胞抗原決定基，而不會產生載體誘導反應之消極影響。
本發明係基於對同源受體發揮高度特異性結合之CLEC。此結合至關重要，且僅較強結合子作為疫苗載體/骨架為有效的。
根據本發明，CLEC結合能夠實現具有新穎特徵之有效免疫反應。根據本發明之結合可防止抗CLEC抗體之形成，尤其是對於石耳多醣而言，此類防止現象可在本發明的過程中令人印象深刻地顯示。此誘發抗CLEC抗體之缺乏對於用根據本發明之平台設計的個別疫苗之可重複使用性及再加強注射性非常重要-無論使用相同還是不同的抗原。
與本發明之結合實施例相比，僅混合CLEC多醣佐劑與B細胞或T細胞抗原決定基肽不會在活體內產生相當作用。然而，若將兩者結合，則肽之位向不會顯著影響根據本發明之化合物的效能；因此，CLEC結合基本上獨立於構築體中之肽位向。在本發明之過程中，可顯示CLEC結合(尤其是與石耳多醣結合)使得新穎以及現有的α-突觸核蛋白之肽免疫原/抗原得到改良：此改良由更高、更具目標特異性及更親和的抗體反應實現(如可藉由抗體選擇性及功能性展示)。此作用在石耳多醣或類似的β-葡聚糖最為明顯，其為主要呈線性的β-(1,6)-葡聚糖，其中β-(1,6)偶合之單醣部分與非β-(1,6)偶合之單醣部分之比率為至少1:1、較佳為至少2:1、更佳為至少5:1、尤其是至少10:1，其在直接比較中出人意料地表現得甚至顯著優於KLH或CRM，且甚至優於甘露多醣或地衣多醣結合物或包含大麥β-葡聚糖之結合物。
如本文所用，術語「主要呈線性的」β-(1,6)-葡聚糖係指其中不存在或僅存在少量交聯糖單體實體的β-(1,6)-D-葡聚糖，亦即其中小於1%、較佳小於0.1%、尤其是小於0.01%之單醣部分具有超過兩個共價連接之單醣部分。
如上文已陳述，石耳多醣為根據本發明之最佳CLEC。石耳多醣通常不含交聯糖部分且主要呈β-(1,6)偶合，使得用於製備根據本發明之結合物的常用石耳多醣製劑包含小於1%、較佳為小於0.1%、尤其是小於0.01%之單醣部分，並具有超過兩個共價連接之單醣部分，且該石耳多醣含有最多10%具有β-(1,3)或β-(1,4)偶合之單醣的雜質。
在本發明之過程中，石耳多醣被證明為最有效之CLEC的事實為出人意料的，因為各種參考文獻顯示，石耳多醣在dectin-1結合中應該不太有效(例如Adams等人, J Pharmacol Exp Ther. 2008年4月;325(1):115-23)；在該文獻中，已報導線性1,3及支鏈化(1,3主鏈及1,6側支鏈)為最有效的dectin-1結合子。舉例而言，Adams等人, 2008已報導鼠類重組dectin-1僅識別含有β-(1,3)連接之葡萄糖主鏈之聚合物且與之相互作用。dectin-1不與僅由β-(1,6)-葡萄糖主鏈構成之葡聚糖(石耳多醣)相互作用，其亦不與非葡聚糖碳水化合物聚合物(如甘露多醣)相互作用。
因此，根據本發明之一較佳實施例，本發明結合物之β-葡聚糖為一dectin-1結合β-葡聚糖。任何化合物，尤其是葡聚糖與dectin-1結合之能力可容易地藉由如本文所揭示之方法測定，尤其是在實例部分中的方法。為避免疑問，「dectin-1結合β-葡聚糖」為藉由競爭性ELISA所測定，以低於10 mg/ml之IC50值結合於可溶性鼠類Fc-dectin-1a受體的β-葡聚糖，例如依實例中所揭示。
相較於其他葡聚糖，例如DC-SIGN β-葡聚糖(如β-(1,2)-葡聚糖)，根據本發明之dectin-1結合β-葡聚糖(如線性β-(1,6)-葡聚糖)更具優勢，因為透過此類dectin-1結合葡聚糖，可覆蓋較寬範圍之DC (未成熟、成熟、骨髓、漿細胞樣；此外：APC)，相較於限定適用性的非dectin-1結合葡聚糖(未成熟DC、骨髓DC)，其顯著地增加活體內引發有效免疫反應之潛力。
WO 2022/060487 A1及WO 2022/060488 A1揭示使肽免疫原與免疫刺激性聚合物分子(例如β-(1,2)葡聚糖)連接之結合物。包括環狀變異體之β-(1,2)葡聚糖先前已被暗示作為潛在佐劑(Martirosyan A等人, doi:10.1371/journal.ppat.1002983)，其為主要結合於特定PRR (即DC-SIGN，Zhang H等人 doi:10.1093/glycob/cww041)並特異性結合於N-端連接之高甘露糖寡醣及支鏈化岩藻糖基化結構之一類葡聚糖。重要的是，β-1,2葡聚糖無法結合於dectin-1 (Zhang H等人, doi:10.1093/glycob/cww041)，由此限制其對DC-SIGN陽性細胞之活性。
DC-SIGN (CD209)為第一個被鑑別出的SIGN分子，且被發現僅在有限的DC子集高度表現，包括未成熟(CD83陰性) DC以及胎盤及肺臟中之特殊巨噬細胞(Soilleux EJ等人, doi: 10.1189/jlb.71.3.445)。在外周，例如皮膚中或黏膜部位處，表現及因此具有作為根據本發明之受體的生物活性的潛力僅可在未成熟的DC子集中偵測到。成熟漿細胞樣DC及其它APC，如上皮DC樣蘭格漢氏細胞(Langerhans cell)不表現DC-SIGN (Engering A等人, doi:10.4049/jimmunol.168.5.2118)。
與其相反，本發明中所提供的基於葡聚糖之免疫原的目標受體為dectin-1。Dectin-1表現於多種不同DC類型上，不僅包括未成熟DC、骨髓DC且亦包括漿細胞樣DC，該等DC在mRNA及蛋白質水平上以及皮膚中之DC樣蘭格漢氏細胞中均表現dectin-1。(Patente等人, doi: 10.3389/fimmu.2018.03176；Joo等人 doi: 10.4049/jimmunol.1402276)。
因此，DC-SIGN靶向聚合物(如β-(1,2)葡聚糖)之生物活性僅限於特定DC目標細胞群，而如應用於本發明中的dectin-1靶向聚合物可在多種不同其他DC類型中發揮其功能。因此，與其他結合物相比，此等新穎結合物可發揮顯著不同且優良的免疫反應。因此，先前技術揭示內容未表明本發明揭示之所主張的主題。
根據一特定較佳實施例，本發明之結合物包含強dectin-1結合β-葡聚糖，較佳為如下β-葡聚糖，如藉由競爭性ELISA所測定，其以低於10 mg/ml之IC50值、更佳以低於1 mg/ml之IC50值、甚至更佳以低於500 µg/ml之IC50值、尤其是以低於200 µg/ml之IC50值結合於可溶性鼠類Fc-dectin-1a受體，例如依實例所揭示。特定較佳為如下結合物，如藉由競爭性ELISA所測定，其以低於1 mg/ml之IC50值、更佳以低於500 µg/ml之IC50值、甚至更佳以低於200 µg/ml之IC50值、尤其是以低於100 µg/ml之IC50值結合於可溶性鼠類Fc-dectin-1a受體；及/或 -如下β-葡聚糖，如藉由競爭性ELISA所測定，其以低於10 mg/ml之IC50值、更佳以低於1 mg/ml之IC50值、甚至更佳以低於500 µg/ml之IC50值、尤其是以低於200 µg/ml之IC50值結合於可溶性人類Fc-dectin-1a受體；及/或 -其中如藉由競爭性ELISA所測定，結合物以低於1 mg/ml之IC50值、更佳以低於500 µg/ml之IC50值、甚至更佳以低於200 µg/ml之IC50值、尤其是以低於100 µg/ml之IC50值結合於可溶性人類Fc-dectin-1a受體，例如依實例所揭示。
此外，與不含CLEC，尤其是不含石耳多醣之疫苗相比，根據本發明之結合物亦顯示出成比例高度增加之與目標多肽反應的抗體及與載體分子反應的抗體的比例。這顯著增加了抗體免疫反應對目標而非載體之特異性聚焦，從而增加了免疫反應之功效及特異性。
根據本發明之CLEC結合，尤其是與石耳多醣結合之CLEC，亦導致對目標蛋白之親和力成熟(AM)增加(AM大幅增加，而KLH/CRM結合物在重複免疫接種後僅顯示有限的AM)。
在疫苗領域中，已經揭示了僅具有B細胞抗原決定基或僅具有T細胞抗原決定基之適合的疫苗。在特定情況下，使用僅具有T細胞抗原決定基或僅具有B細胞抗原決定基之疫苗為適合且較佳的。然而，市場上的大多數疫苗均含有兩種抗原決定基，亦即T細胞抗原決定基及B細胞抗原決定基。
舉例而言，僅包含B細胞抗原決定基之疫苗在大多數情況下不是很有效，即使它們確實會引起可偵測的抗體免疫反應。然而，在大多數情況下，與含有B細胞及T細胞抗原決定基之疫苗相比，此免疫反應通常作用要差得多。此亦與本發明之實例部分中給出的實例一致，在該等實例中可偵測到較低水平之反應。
另一方面，僅包含T細胞抗原決定基之疫苗(例如在特定T細胞反應為反應之活性組成部分之疫苗中)對某些應用而言特別有趣，尤其是對於癌症，其中癌症特異性細胞毒性T淋巴細胞及輔助性T細胞抗原決定基或僅CTL抗原決定基與根據本發明之疫苗平台組合。在此情況下，根據本發明之具有CLEC多醣佐劑的T細胞抗原決定基在僅具有T細胞抗原決定基的情況下提供。此在某些情況下為特定較佳的，例如在癌症中的體細胞突變影響蛋白質編碼基因之情況下，其可能會產生潛在的治療性新抗原決定基。此等新抗原決定基可引導過繼性細胞療法及基於肽(及基於RNA)之新抗原決定基疫苗使用患者自體的細胞毒性T細胞選擇性地靶向腫瘤細胞。就特定自體免疫疾病而言，使用僅含有T細胞抗原決定基之疫苗亦可能為較佳的。各別僅含有T細胞抗原決定基之結合物的治療作用與效應T細胞之減少及調節性T細胞(T reg細胞)群體之形成相關，從而使得各別自體免疫疾病得到抑制(例如：多發性硬化症或類似疾病)。
由於大多數常用之疫苗設計均包含B細胞抗原決定基及T細胞抗原決定基，因此根據本發明之CLEC結合物亦較佳包含各別B細胞抗原決定基及T細胞抗原決定基(至少：α-突觸核蛋白之至少一個B細胞抗原決定基及至少一個T細胞抗原決定基)以實現持續的B細胞免疫反應。然而，若需要，微弱的效應可能會證明T細胞非依賴性的免疫力。
因此，根據本發明之結合物在可能之疫苗抗原方面不受限制。因此，根據本發明之α突觸核蛋白疫苗可另外包含其他抗原以提供雙-、三-、四-、五-、六-（等）或多特異性疫苗。
疫苗抗原(亦即B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽)較佳具有6至50個胺基酸殘基、更佳為7至40個胺基酸殘基、尤其是8至30個胺基酸殘基的長度。
使用根據本發明之疫苗，B細胞受體之交聯亦為可能的。根據一特定實施例，將根據本發明之結合物用於T細胞非依賴性免疫。T細胞非依賴性反應對於多醣疫苗為眾所周知的。此等疫苗/多醣藉由直接刺激B細胞產生免疫反應，而無需T細胞的幫助。T細胞非依賴性之抗體反應較短暫。肺炎鏈球菌莢膜多醣之抗體濃度通常在3-8年內下降至基線，具體取決於血清型。通常無法透過使用額外劑量來增強疫苗反應，因為多醣疫苗不構成免疫記憶。對於兩歲以下的兒童，多醣疫苗之免疫原性很差。此處直接刺激之原因可能為B細胞表現一種稱為CR3 (3型補體受體)的分子。巨噬細胞-1抗原或CR3為在B淋巴細胞及T淋巴細胞、多形核白血球(主要是嗜中性球)、NK細胞及單核吞噬細胞(如巨噬細胞)上發現的人類細胞表面受體。當結合於外來細胞及β-葡聚糖表面時，CR3亦識別iC3b，此意謂B細胞藉由Pus-CR3相互作用直接吸收疫苗可能會引起細胞的刺激且產生低水平的TI免疫反應。
根據本發明之佐劑、結合物及疫苗可固定補體且可被調理。根據本發明之經調理之結合物可具有增加的B細胞活化能力，此可產生更高的抗體效價及抗體親和力。此類作用對於C3d結合物為已知的(Green等人, J. Virol. 77 (2003), 2046-2055)且意想不到地亦可用於本發明過程中。
本發明之另一個意想不到之優點為本發明之CLEC架構實現疫苗的模組化設計。例如，抗原決定基可隨意組合，且該平台獨立於習知載體分子。雖然本發明之主要重點為僅包含肽的疫苗，但其亦適用於蛋白質與肽之獨立偶合以及肽-蛋白質結合物與根據本發明之CLEC骨架之偶合，尤其是與石耳多醣之偶合。如使用石耳多醣之實例部分所示，根據本發明獲得了顯著高於經典疫苗的免疫反應。
如上所述，根據本發明之結合物，若以醫藥製劑形式提供(例如，作為一疫苗，其旨在向(人類)個體投予以引發對結合於CLEC骨架的特異性多肽抗原決定基之免疫反應，該抗原決定基為應引發免疫反應之抗原決定基)，在此製劑中可不需要使用(藉由共投予) (其他)佐劑來投予。根據一較佳實施例，包含根據本發明之結合物的醫藥製劑不含佐劑。
根據本發明之一類特定較佳的CLEC多醣佐劑為β-葡聚糖，尤其是石耳多醣。另一較佳的CLEC多醣佐劑為甘露多醣。與本發明相比，石耳多醣僅在先前技術中用於抗真菌疫苗(其中石耳多醣用作抗原而並非如在本發明中用作載體)。石耳多醣亦展現一條不同的主鏈，因為其僅由β-(1,6)連接之糖部分組成。
石耳多醣為一種中等大小的線性β-(1,6)葡聚糖。石耳多醣以及線性β-(1,6)葡聚糖的合成形式不同於所有其他的葡聚糖，該等其他的葡聚糖通常為由支鏈葡聚糖鏈(較佳為β-(1,3)主鏈及β-(1,6)側鏈，諸如酵母提取物、GP、昆布多醣、裂褶多醣、硬葡聚糖)組成之β-葡聚糖或僅依賴β-(1,3)葡聚糖之線性葡聚糖，如合成β-葡聚糖、卡德蘭多醣、釀酒酵母β-葡聚糖(150kDa)或線性β-(1,3:1,4)葡聚糖(如大麥及燕麥β-葡聚糖以及地衣多醣)。
如本發明首次所示，葡聚糖結合物在活體外與dectin-1受體之結合為後續活體內功效之替代物：低結合性的分子僅發揮低免疫反應，中等結合性的結合物較佳，而高效率的結合物則誘導高效率反應(燕麥/大麥BG＜地衣多醣＜石耳多醣)。
根據本發明，CLEC被偶合(例如藉由標準技術)於個別α突觸核蛋白多肽以產生具有低多分散性(流體動力學半徑(HDR)範圍：5-15 nm)的小奈米顆粒，其互不交聯，且亦不會聚集形成類似於習知CLEC疫苗的較大微粒，如文獻中所揭示之葡聚糖顆粒(2-4µm)或β-葡聚糖顆粒，該等顆粒之通常特徵為尺寸範圍＞100 nm (典型範圍) (直徑；150-500 nm)，例如Wang等人 (2019)提供直徑為160 nm (藉由DLS評定)且尺寸為約150 nm(藉由TEM評定)的顆粒；Jin等人(2018)提供尺寸為180-215 nm (分別藉由DLS及SEM評定)的β-葡聚糖顆粒(胺化β-葡聚糖-卵白蛋白之奈米顆粒)。此等結合物較佳包含至少一個T細胞抗原決定基，尤其是混雜的、線性的或載體肽的T細胞抗原決定基(例如來自CRM197或KLH)。
根據定義，DLS量測之流體動力學半徑為假定的硬球體半徑，該硬球體之擴散速度與受測顆粒相同。半徑係在假設該分子/顆粒呈球形且緩衝液具有一給定的黏度的情況下根據擴散係數計算得出的。HDR亦稱為斯托克斯(Stokes)半徑，且係使用斯托克斯-愛因斯坦(Stokes-Einstein)方程式由擴散係數計算得出的(參照https://en.wikipedia.org/wiki/Stokes_radius)。
根據本發明之奈米顆粒的較佳尺寸範圍可為先前技術中通常提供之範圍，即尺寸為1至5000 nm、較佳為1至200 nm、尤其是2至160 nm，該等尺寸係以流體動力學半徑(HDR)形式藉由動態光散射(DLS)所測定。根據本發明之一較佳實施例，顆粒尺寸較小，例如1至50 nm、較佳為1至25 nm、尤其是2至15 nm，係以HDR形式藉由DLS所測定。因此，此等較佳顆粒更小，包括僅含有肽的結合物(平均HDR約5 nm)及CRM-石耳多醣結合物(平均HDR約10-15 nm)。因此，根據本發明之較佳顆粒小於100 nm，此將本發明與Wang等人區分開來。
因此，本發明亦關於設計用於針對特定α突觸核蛋白抗原對個體進行疫苗接種之疫苗產品，其中該產品包含如下化合物，該化合物較佳包含β-葡聚糖或甘露多醣作為與特定抗原共價偶合的C型凝集素(CLEC)多醣佐劑。
較佳地，根據本發明之疫苗產品包含如本文所揭示或可由根據本發明之方法獲得或由其獲得的結合物。
根據一較佳實施例，根據本發明之疫苗產品包含一α突觸核蛋白抗原，該抗原包含至少一個α突觸核蛋白B細胞抗原決定基及至少一個T細胞抗原決定基，較佳地，其中該抗原為包含一或多個B細胞抗原決定基及T細胞抗原決定基的多肽。
根據一較佳實施例，根據本發明之疫苗產品中的共價偶合抗原及CLEC多醣佐劑以尺寸為1至5000 nm、較佳為1至200 nm、尤其是2至160 nm的顆粒存在，係以流體動力學半徑(HDR)形式藉由動態光散射(DLS)所測定。如本文中所使用，所有顆粒尺寸均為中等尺寸，其中「中等」為將具有較大尺寸的顆粒的一半與具有較小尺寸的顆粒的一半區分開的值。其為確定的尺寸，根據該尺寸，一半顆粒較小，而另一半較大。
根據一較佳實施例，根據本發明之疫苗產品中的共價偶合抗原及CLEC多醣佐劑以尺寸為1至50 nm、較佳1至25 nm、尤其是2至15 nm的顆粒存在，係以HDR形式藉由DLS所測定。
較佳地，根據本發明之疫苗產品中的共價偶合抗原及CLEC多醣佐劑以尺寸小於100 nm、較佳小於70 nm、尤其小於50 nm的顆粒存在，係以HDR形式藉由DLS所測定。
根據本發明之疫苗產品顯示出高儲存穩定性。在以液體或冷凍材料形式儲存時幾乎不會發生聚集(儲存溫度：-80℃、-20℃、2-8℃，或在室溫下歷經延長時段，至少3個月)，可透過顆粒尺寸在儲存期間不會明顯增加(即超過10%)來確定。
藉由使用根據本發明之中等分子量成分石耳多醣製造的此類小顆粒之極高功效為出人意料的：例如，根據Adams等人(J Pharmacol Exp Ther. 2008年4月;325(1):115-23)，最好的dectin-1受質為線性磷酸β(1,3)葡聚糖(約150kda)及支鏈化葡聚糖(其含有β(1,3)主鏈及β(1,6)側鏈)，如硬葡聚糖或來自白色念珠菌之葡聚糖或地衣多醣。此外，Adams等人，Palma等人 (J Biol Chem. 281(9) (2006) 5771-5779)及Willment等人(J Biol Chem. 276(47) (2001), 43818-23)之資料暗示，dectin-1不與石耳多醣相互作用或僅微弱地相互作用，亦不與非葡聚糖碳水化合物聚合物(如甘露多醣)相互作用。事實上，有多個參考文獻報導石耳多醣在與dectin-1的結合中效應較差。然而，一般而言，線性1,3及支鏈化(1,3主鏈及1,6側支鏈)為最有效之dectin-1結合物；Adams等人(2008)證明鼠類重組dectin-1僅識別含有β(1,3)連接之葡萄糖主鏈的聚合物且與之相互作用。Dectin-1不與完全由β(1,6)-葡萄糖主鏈組成的葡聚糖(如石耳多醣)相互作用，亦不與非葡聚糖碳水化合物聚合物(如甘露聚糖)相互作用。
與此等發現形成對比，在本發明之過程中顯示基於石耳多醣之結合物能夠強力地結合於dectin-1且在活體外引發細胞反應。
根據本發明之一較佳實施例，β-(1,6)-葡聚糖被使用。通常在先前技術中報導大顆粒比小的(「可溶性」)單體調配物更能有效地活化PRR，因此含有大葡聚糖的顆粒更具有優勢(因此為較佳的)，而小的可溶性葡聚糖則可用於阻斷DC之活化，從而干擾了預期中的作用。普遍認為，微粒狀β-葡聚糖(例如廣泛使用的酵母細胞壁成分酵母多醣)結合至並且活化dectin-1，從而誘導細胞反應。相較之下，可溶性β-葡聚糖與dectin-1的相互作用存在爭議。不過，普遍的共識為可溶性β-葡聚糖，如小的支鏈化葡聚糖―昆布多醣(β-(1,3)及β-(1,6)側鏈)，可與dectin-1結合，但不能在DC中啟動信號傳導並誘導細胞反應(Willment等人, J Biol Chem. 276(47) (2001), 43818-23, Goodridge等人 Nature. 2011, 472(7344): 471-475.)。
根據本發明，可顯示使用高分子量葡聚糖(石耳多醣大小之10倍；例如：燕麥/大麥229kDa/地衣多醣245kDa)之結合物之作用不如石耳多醣顆粒(20kDa)。Korotchenko等人證明OVA/Lam結合物具有約10nm的直徑，且在活體外結合dectin-1且誘導DC活化，但其為支鏈化葡聚糖，並非皮膚特異性的，且在活體內的作用並未較施用於皮膚中之OVA或皮下施用之OVA/alum出色。Wang等人提供尺寸＞100 nm (平均尺寸：160nm)的β-葡聚糖顆粒。Jin等人(2018)展示了尺寸為180-215 nm的胺化β-葡聚糖-卵白蛋白奈米顆粒。
根據本發明，顯示基於石耳多醣之顆粒為強力的dectin-1結合物，可在活體外活化DC (表面標記物表現的變化)且引發非常強的免疫反應，優於a)其他途徑及b) KLH/CRM結合物疫苗(通常亦是更大的顆粒)及C)更大的葡聚糖以及甘露多醣。這對於Pep+Padre+石耳多醣(5nm尺寸)及Pep+CRM197+石耳多醣結合物(11nm尺寸)均是成立的。
為了獲得最佳的免疫反應，CLEC之活化程度，尤其是石耳多醣之活化程度，以及由此活化程度所產生的肽/糖比為決定性的。各別CLEC之活化係藉由溫和的過碘酸鹽氧化達成。因此，氧化度係基於以限定莫耳比：即過碘酸鹽:糖次單元來添加過碘酸鹽溶液來確定；100%=每莫耳糖單體1莫耳過碘酸鹽。
根據一較佳實施例，根據本發明之結合物包含以1/5 (即20%活化)至2.6/1 (即260%活化)，較佳以60%至140%，尤其是以70%至100%之過碘酸鹽與β-葡聚糖或甘露多醣(單體)部分之比率活化的CLEC。
低/中氧化度與高氧化度之間的最佳氧化度範圍(將會與最終結合物中抗原決定基多肽之數量直接成比例)可被界定為與席夫品紅試劑(Schiff's fuchsin-reagent)之反應程度，其類似於分別以0.2-2.6 (低/中)、0.6-1.4 (最佳範圍)及1.4-2.6 (高)之莫耳比(糖單體:過碘酸鹽)用過碘酸鹽氧化等量的給定碳水化合物(例如石耳多醣)的氧化度。
較佳的葡聚糖與肽之比率，尤其耳多醣與肽之比率在10比1 (w/w)至0.1比1 (w/w)、較佳在8比1 (w/w)至2比1 (w/w)、尤其是在4比1 (w/w)範圍內，其限制條件為若結合物包含載體蛋白，則β-葡聚糖或甘露多醣與B細胞-抗原決定基-載體多肽之較佳比率為50:1(w/w)至0.1:1(w/w)，尤其是10:1至0.1:1；亦即糖單體與肽之莫耳比為24比1，其低於其他地方報導中的有效疫苗(例如Liang等人；Bromuro等人)。
使用目前先進技術方法測定氧化度及可用於糖偶合的反應性醛之量，如：1)重量分析法，可用來測定樣品之總質量；2)蒽酮法(根據Laurentin等人，2003年)，用於樣品中完整的非氧化糖之濃度測定；在此情況下，用濃H 2SO 4將葡聚糖脫水形成糠醛，糠醛與蒽酮(0.2%在H 2SO 4中)縮合形成綠色複合體，其可在波長620 nm下用比色法測得)；或3)席夫分析：使用席夫品紅亞硫酸鹽試劑評定用於結合之碳水化合物的氧化狀態。簡言之，品紅染料被二氧化硫脫色，與脂肪族醛(在葡聚糖上)反應會恢復品紅的紫色，其隨後可在波長570-600nm下測量。產生的顏色反應與碳水化合物之氧化度(醛基的數量)成正比。其他適合的分析方法亦為可能的。可使用適合的方法，包括UV分析(205nm/280nm)及胺基酸分析(aa水解、衍生化及RP-HPLC分析)來評定肽比率。
根據本發明之結合物可用於誘導目標特異性免疫反應，同時不誘導或僅誘導非常有限的 CLEC或載體蛋白特異性抗體反應。根據本發明之結合物可進一步用於誘導α突觸核蛋白特異性免疫反應，同時不誘導或僅誘導非常有限的CLEC或載體蛋白特異性抗體反應。亦如下面的實例部分所示，本發明亦能夠改善及聚焦於α突觸核蛋白特異性免疫反應，因為其使觸發的免疫反應遠離對載體蛋白或CLEC的反應(例如在習知肽-載體偶合物或非結合性的比較設置中，尤其亦適用於非氧化CLEC，如石耳多醣)。
除非另有說明，否則本文所用的「肽」係指較短的多肽鏈(2至50個胺基酸殘基)，而「蛋白質」係指較長的多肽鏈(超過50個胺基酸殘基)。兩者均被稱為「多肽」。根據本發明之與CLEC結合的B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽除了包含具有正常基因表現及蛋白質轉譯的天然胺基酸殘基的多肽外，亦包含所有其他形式之此類基於多肽之B-細胞及/或T細胞抗原決定基，尤其是其天然或人工修飾形式，如糖基多肽及其所有其他轉譯後修飾的形式(例如實施例中揭示的Aβ焦麩胺酸形式)。此外，根據本發明之CLEC特別適用於呈遞構形抗原決定基，例如作為較大原生多肽、模擬抗原決定基、環狀多肽或表面結合構築體之一部分的構形抗原決定基。
根據一較佳實施例，根據本發明之結合物包含一CLEC多醣骨架及一B細胞抗原決定基。「B細胞抗原決定基」為抗原中免疫球蛋白或抗體結合的α突觸核蛋白部分。B細胞抗原決定基可被分為兩組：構形或線性。有兩種主要抗原決定基定位方法：結構性研究或功能性研究。結構性定位抗原決定基的方法包括X射線晶體分析、核磁共振及電子顯微鏡法。功能性定位抗原決定基的方法通常使用結合分析，例如西方墨點法、圓漬點墨法及/或ELISA來測定抗體結合。競爭方法用於確定兩種單株抗體(mAb)是否可同時與抗原結合或相互競爭以在同一位點結合。另一種技術涉及高通量誘變，其為一種抗原決定基定位策略，旨在改良結構複雜蛋白質上構形抗原決定基的快速定位。誘變在個別殘基上使用隨機/定點突變來定位抗原決定基。B細胞抗原決定基定位可用於研發抗體療法、基於肽之疫苗及免疫診斷工具(Sanchez-Trincado等人, J. Immunol. Res. 2017-2680160)。對於許多抗原，B細胞抗原決定基為已知的，且可用於本發明之CLEC平台。
根據一特定較佳實施例，根據本發明之結合物包含CLEC多醣骨架及混雜T細胞抗原決定基及/或已知可與給定物種以及其他物種的數個/所有MHC等位基因一起作用的MHCII抗原決定基。
根據另一態樣，本發明亦關於使用本CLEC技術來改善已知的T細胞抗原決定基。因此，本發明亦包括用作T細胞抗原決定基多肽之C型凝集素(CLEC)多醣佐劑的β-葡聚糖或甘露多醣，其中β-葡聚糖或甘露多醣共價結合於T細胞抗原決定基多肽以形成β-葡聚糖或甘露多醣與T細胞抗原決定基多肽之結合物。
結合超過一個HLA等位基因的單個T細胞抗原決定基被稱為「混雜T細胞抗原決定基」。較佳的混雜T細胞抗原決定基結合5個或更多、較佳10個或更多，尤其15個或更多的HLA等位基因。混雜T細胞抗原決定基適用於不同物種，且最重要的是適用於給定物種以及其他物種的若干MHC/HLA單倍型(指已知與若干/所有MHCI及MHCII等位基因一起作用的MHCI及MHCII抗原決定基)。例如，MHCII抗原決定基PADRE(=非天然泛DR抗原決定基(PADRE))，如實例部分所述，在若干人類MHC等位基因及小鼠(C57/Bl6，儘管其在Balb/c中作用較差)中起作用。根據較佳實施例，本發明之結合物包含一T細胞抗原決定基、較佳為包含胺基酸序列AKFVAAWTLKAAA(“PADRE(多肽)”)或PADRE(多肽)變異體的T細胞抗原決定基。
較佳的PADRE多肽或PADRE多肽變異體包括一連接子(對於本文使用的其他多肽抗原決定基亦為較佳)，例如一半胱胺酸殘基或包含半胱胺酸殘基的一連接子(“-C”或“C-”；特別用於馬來醯亞胺偶合)，NRRA、NRRA-C或NRRA-NH-NH2連接子。較佳的PADRE多肽變異體包括先前技術中揭示的變異體(例如Alexander等人，Immunity1(1994),751-761；US9,249,187B2)或較佳為沒有C端A殘基(AKFVAAWTLKAA)的縮短變異體、其中第一個殘基丙胺酸被脂肪族胺基酸殘基(例如甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸及白胺酸)取代的變異體、其中第三個殘基苯丙胺酸被L-環己基丙胺酸取代的變異體、其中第十三(最後)個胺基酸殘基丙胺酸被脂肪族胺基酸殘基(例如甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸及白胺酸)取代的變異體、包含胺基己酸的變異體，其較佳與PADRE變異體的C端偶合，或具有胺基酸序列AX1FVAAX2 TLX3的變異體AX 4A，其中X 1選自W、F、Y、H、D、E、N、Q、I及K；X 2選自由F、N、Y及W組成之群，X 3選自由H及K組成之群，X 4選自由A、D及E組成之群(先決條件是寡肽序列不是AKFVAAWTLKAAA；US9,249,187B2)；特別地，其中T細胞抗原決定基選自AKFVAAWTLKAAANRRA-(NH-NH2)、AKFVAAWTLKAAAN-C、AKFVAAWTLKAAA-C、AKFVAAWTLKAAANRRA-C、aKXVAAWTLKAAaZC、aKXVAAWTLKAAaZCNRRA (SeqID7、8、87、88、89、90、91、92)、aKXVAAWTLKAAa、aKXVAAWTLKAAaNRRA、aA(X)AAAKTAAAAa、aA(X)AAATLKAAa、aA(X)VAAATLKAAa、aA(X)IAAATLKAAa、aK(X)VAAWTLKAAa及aKFVAAWTLKAAa (序列 760.5, 760.57, 906.09, 906.11, 965.10, 1024.03 根據Alexander等人, 1994)，其中X為L-環己基丙胺酸，Z為胺基己酸，a為選自丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸及白胺酸的脂肪族胺基酸殘基。
T細胞抗原決定基存在於抗原呈遞細胞之表面，其與主要組織相容複合體(MHC)分子在該處結合。在人類中，專用抗原呈遞細胞專門呈遞II類MHC肽，而大部分成核體細胞呈遞I類MHC肽。由I類MHC分子呈遞之T細胞抗原決定基通常為長度在8與11個胺基酸之間的肽，而II類MHC分子則呈遞較長的肽(長度為13至17個胺基酸)；且非典型MHC分子亦呈遞非肽抗原決定基，如醣脂。I類及II類MHC抗原決定基可單獨藉由計算方法可靠地預測，但並非所有電腦模擬T細胞抗原決定基預測演算法的準確性均相同。預測肽-MHC結合的方法主要有兩種：資料驅動之方法與基於結構之方法。基於結構之方法對肽-MHC結構進行建模且需要強大的計算能力。資料驅動之方法比基於結構之方法具有更高的預測性能。資料驅動之方法根據結合於MHC分子的肽序列預測肽-MHC的結合(Sanchez-Trincado等人，2017年)。藉由鑑別T細胞抗原決定基，科學家可追蹤、分型且刺激T細胞。對於許多抗原，包括α突觸核蛋白，T細胞抗原決定基為已知的，可用於本發明之CLEC平台。
有趣的是，最近的突破性研究證明，α-突觸核蛋白特異性T細胞在PD患者體內增加，可能與HLA之風險單倍型有關，且暗示T細胞在PD中涉及自體免疫[Sulzer等人, Nature 2017;546:656-661及Lindestamn Arlehamn等人, Nat Commun. 1875;2020:11]。最近一項動物模型研究亦進一步證實了α-突觸核蛋白反應性T細胞的因果作用[Williams等人, Brain. 2021；144：2047-2059)。在一項案例研究中，α-突觸核蛋白反應性T細胞的出現在運動發病數年之前數年開始增加，且在一較大橫斷面組的PD患者中，其頻率在運動發病前後不久為最高(Lindestam Arlehamn 等人，2018年)。運動發病後，T 細胞對α-突觸核蛋白的反應隨著疾病持續時間的增加而下降。因此，抗aSyn T細胞反應在診斷出運動性PD之前或之後不久為最高，然後逐漸減弱(即在診斷後不到10年可偵測到最大活性；且較佳為Hoehn及Yahr (H+Y)1及2期)( Lindestamn Arlehamn 等人，2020年)。
因此，在人類α突觸核蛋白序列中包含眾所周知的T細胞抗原決定基。Benner等人(PLoS ONE 3(1): e1376.60)；Sulzer等人, (2017)及Lindestam Arlehamn等人(2020)提供了實例。
Benner等人(Benner等人, (2008) PLoS ONE 3(1): e1376.)在PD模型中使用在含有1mg/ml結核分枝桿菌的等體積之CFA中乳化的60個aa長的硝化(在Y殘基處)多肽作為免疫原，該多肽包含aSyn之C端部分，且揭示α突觸核蛋白的T細胞抗原決定基aa71-86 (VTGVTAVAQKTVEGAGNIAAATGFVK)。
Sulzer等人(Nature 2017;546:656-661)在人類PD患者的α突觸核蛋白之N端和C端區鑑別出兩個T細胞抗原區。第一個區域位於N端附近，由MHCII抗原決定基aa31-45 (GKTKEGVLYVGSKTK)及aa32-46 (KTKEGVLYVGSKTKE)構成，亦含有9聚體多肽aa37-45 (VLYVGSKTK)作為潛在的MHCI類抗原決定基。Sulzer等人揭示的第二個抗原區靠近C端(aa116-140)且需要胺基酸殘基S129之磷酸化。三個磷酸化的aaS129抗原決定基aa116-130 (MPVDPDNEAYEMPSE)、aa121-135 (DNEAYEMPSEEGYQD)及aa126-140 (EMPSEEGYQDYEPEA)在PD患者中產生的反應明顯高於健康對照組。作者亦證明，與PD相關的對α突觸核蛋白的天然存在之免疫反應具有I類MHC及II類MHC限制成分。
此外，Lindestam Arlehamn等人(Nat Commun. 1875;2020:11)亦揭示α突觸核蛋白肽aa61-75 (EQVTNVGGAVVTGVT)作為PD患者之T細胞抗原決定基(MHCII)。
因此，根據本發明之較佳T細胞抗原決定基包括α突觸核蛋白多肽GKTKEGVLYVGSKTK      (aa31-45)、KTKEGVLYVGSKTKE     (aa32-46)、EQVTNVGGAVVTGVT    (aa61-75)、VTGVTAVAQKTVEGAGNIAAATGFVK  (aa71-86)、DPDNEAYEMPSE (aa116-130)、DNEAYEMPSEEGYQD     (aa121-135)及EMPSEEGYQDYEPEA     (aa126-140)。
調節性T細胞(「Treg細胞」或「Treg」)為調節免疫系統、維持對自體抗原的耐受性及預防自體免疫疾病的一T細胞亞群。Treg細胞具有免疫抑制作用，且通常會抑制或下調效應T細胞之誘導及增殖。由正常胸腺產生的Treg被稱為「天然」。天然Treg之選擇發生在髓質中的放射抗性造血衍生的II類MHC表現細胞或胸腺中的赫氏小體(Hassal's corpuscle)上。Treg選擇的過程取決於與自體肽MHC複合體相互作用的親和力。選擇成為Treg是一個「金髮女孩(Goldilocks)」的過程，即不會太高，亦不會太低，只要恰到好處即可，接收到非常強烈信號的T細胞將經歷凋亡性死亡；接收到微弱信號的細胞將存活下來且被選擇成為效應細胞。若T細胞接收到中等信號，則其將成為調節性細胞。由於T細胞活化過程的隨機性，具有給定TCR的所有T細胞群將最終成為Teff與Treg之混合物，兩者的相對比例由T細胞對自體肽-MHC的親和力決定。由胸腺外(即外周)或細胞培養物中的初始T細胞分化形成的Treg被稱為「應變性」或「誘導性」(即iTreg)。
天然Treg之特徵在於同時表現CD4 T細胞共受體及CD25，後者為IL-2受體之組成部分。因此Treg為CD4+ CD25+。核轉錄因子叉頭框P3 (FoxP3)之表現為決定天然Treg形成及功能的關鍵特性。Treg抑制CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之活化、增殖及細胞介素的產生，且被認為會抑制B細胞及樹突狀細胞，從而抑制自體免疫反應。
沿著此等思路，若干研究表明PD患者之Treg數量及功能減少。例如：Hutter Saunders等人(J Neuroimmune Pharmacol (2012) 7:927-938)及Chen等人(MOLECULAR MEDICINE REPORTS 12: 6105-6111, 2015)顯示PD患者之調節性T細胞(Treg)抑制效應T細胞的功能受損，且Th1及Th17細胞之比例增加，而Th2及Treg細胞減少。Thome等人(npj Parkinson's Disease (2021) 7:41)證明，PD患者的Treg功能下降與促炎性T細胞活化的增加相關，此可直接引起隨後其他免疫細胞群的促炎性信號傳導增加。Treg對T細胞增殖的抑制與外周促炎性免疫細胞表現型顯著相關。使用H&Y疾病量表時，PD Treg對T效應細胞(例如：CD4+)增殖的抑制能力隨著PD疾病負擔的增加而降低，最高活性出現在H+Y 1及2期。重要的是，Lindestam Arlehamn等人(2020)證明，抗aSyn T細胞反應在運動型PD診斷之前或之後不久為最高，且在此後即減弱(即在診斷後不到10年可偵測到最大活性；且較佳為Hoehn及Yahr (H+Y) 1及2期) (Lindestamn Arlehamn等人，2020)。
因此，根據本發明之疫苗與以下之組合 1)  含有α-突觸蛋白特異性Treg抗原決定基(例如CD4抗原決定基，如Brenner等人, Sulzer等人及Lindestam Arlehamn等人所揭示之彼等者(aa31-45 (GKTKEGVLYVGSKTK)、aa32-46 (KTKEGVLYVGSKTKE)、aa61-75 (EQVTNVGGAVVTGVT)、aa71-86 (VTGVTAVAQKTVEGAGNIAAATGFVK)、aa116-130 (MPVDPDNEAYEMPSE)、aa121-135 (DNEAYEMPSEEGYQD)及aa126-140 (EMPSEEGYQDYEPEA))的疫苗； 及/或 2) Treg誘導劑，如雷帕黴素、低劑量IL-2、TNF受體2 (TNFR2)促效劑、抗CD20抗體(例如：利妥昔單抗(rituximab))、潑尼松龍(prednisolone)、異丙肌苷(inosine pranobex)、乙酸格拉替雷、丁酸鈉 較佳在疾病的早期階段(即診斷後不到10年；且較佳為Hoehn及Yahr (H+Y) 1及2期)以增加減弱/減少的Treg數量及活性，且由此降低aSyn 特異性T效應細胞之自體免疫反應性且抑制PD患者之自體免疫反應。
此外，Treg在許多疾病中被發現減少及/或功能失調，尤其是慢性退化性或自體免疫疾病，例如(活動性)系統性紅斑性狼瘡(SLE、aSLE)、1型糖尿病(T1D)、自體免疫性糖尿病(AID)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)及阿茲海默症(AD)以及其他退化性疾病(ALS：Beers等人, JCI Insight 2, e89530 (2017)；AD：Faridar等人, Brain Commun. 2, fcaa112 (2020)；ALS：Beers等人, JAMA Neurol. 75, 656-658 (2018)；MS：Haas等人, Eur. J. Immunol. 35, 3343-3352 (2005)；T1D：Lindley等人, Diabetes 54, 92-99 (2005)；AID：Putnam等人, J. Autoimmun. 24, 55-62 (2005)；自體免疫疾病：Ryba-Stanislawowska等人, Expert Rev. Clin. Immunol. 15, 777-789 (2019)；aSLE：Valencia等人, J. Immunol. 178, 2579-2588 (2007)；MS：Viglietta等人, J. Exp. Med. 199, 971-979 (2004)；sLE：Zhang等人, Clin. Exp. Immunol. 153, 182-187 (2008)；AD+MS：Ciccocioppo等人, Sci. Rep. 9, 8788 (2019))。
因此，亦較佳提供適合在Treg群減少或功能失調的疾病中作為Treg抗原決定基或Treg誘導劑的T細胞抗原決定基，其以與根據本發明之疫苗組合的形式增加減弱/減少的Treg數量及活性，且由此減少疾病特異性T效應細胞之自體免疫反應性且抑制患者之自體免疫反應。而適合的Treg抗原決定基被定義為自體MHC抗原決定基(MHC II型)，其特徵在於能夠在T細胞的選擇過程中誘導中等信號。
根據一較佳實施例，根據本發明之結合物包含多肽，該多肽包含以下胺基酸序列或由其組成：SeqID7、8、22-29、87-131、GKTKEGVLYVGSKTK、KTKEGVLYVGSKTKE、EQVTNVGGAVVTGVT、VTGVTAVAQKTVEGAGNIAAATGFVK、MPVDPDNEAYEMPSE)、DNEAYEMPSEEGYQD、EMPSEEGYQDYEPEA或其組合。
因此較佳的T細胞抗原決定基為：
SeqID7 AKFVAAWTLKAAANRRA-(NH-NH2) PADRE
SeqID8 AKFVAAWTLKAAAN-C PADRE
SeqID22 AKFVAAWTLKAAA-(NH-NH2) PADRE – 原始
SeqID23 KAAAVKAAFWTAL-NRRA-(NH-NH2) 替代合成肽
SeqID24 DSETADNLEKTVAALSILPGHGC-(NH-NH2) 白喉毒素(TV-TT交換)
SeqID25 DSETADNLEKTVAALSILPGHGCNRRA-(NH-NH2) 白喉毒素 (TV-TT交換)
SeqID26 ISITEIKGVIVHRIETILF-(NH-NH2) MvF5 Th (UBITh®1)
SeqID27 ISITEIKGVIVHRIETILFNRRA-(NH-NH2) MvF5 Th (UBITh®1)
SeqID28 ISQAVHAAHAEINEAGR-(NH-NH2) 雞Ova (323-339)
SeqID29 ISQAVHAAHAEINEAGRNRRA-(NH-NH2) 雞Ova (323-339)
SeqID87 AKFVAAWTLKAAA-C 順丁烯二醯亞胺偶合之Padre (原始)
SeqID88 AKFVAAWTLKAAANRRA-C 順丁烯二醯亞胺偶合之Tridem' Padre (原始)
SeqID89 aKXVAAWTLKAAaZC PADRE，替代性aas
SeqID90 aKXVAAWTLKAAaZCNRRA PADRE，替代性aas
SeqID91 aKXVAAWTLKAAa PADRE，替代性aas
SeqID92 aKXVAAWTLKAAaNRRA PADRE，替代性aas
SeqID93 DSETADNLEKTTAALSILPG 白喉
SeqID94 DSETADNLEKTTAALSILPGNRRA 白喉
SeqID95 LSEIKGVIVHRLEGV MvF
SeqID96 LSEIKGVIVHRLEGVNRRA MvF
SeqID97 KLLSLIKGVIVHRLEGVE MvF
SeqID98 KLLSLIKGVIVHRLEGVENRRA MvF
SeqID99 VSIDKFRIFCKANPK P23 - TT
SeqID100 LKFIIKRYTPNNEIDS P32 - TT
SeqID101 IREDNNTLKLDRCNN P21 - TT
SeqID102 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE P30 - TT
SeqID103 QYIKANSKFIGITE P2 - TT
SeqID104 LEYIPEITLPVIAALSIAES TT
SeqID105 LINSTKIYSYFPSVISKVNQ TT
SeqID106 NYSLDKIIVDYNLQSKITLP TT
SeqID107 PHHTALRQAILCWGELMTLA HBV核衣殼
SeqID108 FFLLTRILTIPQSLD HBV表面AG
SeqID109 YSGPLKAEIAQRLEDV MT流感基質抗原決定基
SeqID110 FFLLTRILTIPQSL HBsAg
SeqID111 GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL 百日咳桿菌
SeqID112 ALNIWDRFDVFCTLGATTGYLKGNS 霍亂毒素
SeqID113 QYIKANSKFIGITEL 破傷風梭菌TT1
SeqID114 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE 破傷風梭菌TT2
SeqID115 KFIIKRYTPNNEIDSF 破傷風梭菌TT3
SeqID116 VSIDKFRIFCKALNPK 破傷風梭菌TT4
SeqID117 WVRDIIDDFTNESSQKT 破傷風梭菌2
SeqID118 AGLTLSLLVICSYLFISRG EBV BHRF1
SeqID119 PGPLRESIVCYFMVFLQTHI EBV EBNA-1
SeqID120 VPGLYSPCRAFFNKEELL EBV CP
SeqID121 TGHGARTSTEPTTDY EBV GP340
SeqID122 KELKRQYEKKLRQ EBV BPLF1
SeqID123 TVFYNIPPMPL EBV EBNA-2
SeqID124 DKREMWMACIKELH HCMV IE1
SeqID125 FVFTLTVPSER 流感MP1 - 1
SeqID126 PKYVKQNTLKLAT 流感血凝素
SeqID127 EKKIAKMEKASSVFNV 瘧疾CS:T3抗原決定基
SeqID128 FFLLTRILTI B型肝炎表面抗原
SeqID129 DQSIGDLIAEAMDKVGNEG 熱激蛋白65
SeqID130 QVHFQPLPPAVVKL 卡介苗桿菌
SeqID131 KQIINMWQEVGKAMYA HIV gp120
其中X為L-環己基丙胺酸，Z為胺基己酸且a為選自丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸及白胺酸的脂肪族胺基酸。
根據另一較佳實施例，根據本發明之結合物包含α突觸核蛋白之一B細胞抗原決定基及一T細胞抗原決定基，較佳為泛特異性/混雜T細胞抗原決定基，該B細胞及T細胞抗原決定基獨立地偶合於根據本發明之CLEC多醣骨架，尤其是偶合於石耳多醣。
根據另一較佳實施例，根據本發明之結合物包含與「經典」載體蛋白，如CRM197偶合的α突觸核蛋白之B細胞抗原決定基，其中該構築體進一步與根據本發明之CLEC載體偶合，尤其是與石耳多醣偶合。
例如，在第一步中，CRM結合物之形成可藉由GMBS或sulfo-GMBS等活化CRM來進行，然後活化CRM之順丁烯二醯亞胺基與肽(半胱胺酸)之SH基團發生反應，然後用DTT處理CRM結合物以還原雙硫鍵並在半胱胺酸上生成SH基團。隨後，可藉由混合還原的CRM-結合物與BMPH (N-β-順丁烯二醯亞胺-丙酸醯肼)及活化的石耳多醣(已被氧化)的一鍋化反應產生基於CLEC之疫苗。一鍋化反應之機制可能為(相對於石耳多醣而言)氧化的石耳多醣與BMPH (具有醯肼殘基)反應且形成BMPH-腙，還原的CRM結合物接著藉由CRM結合物上之SH基團與BMPH活化的石耳多醣的順丁烯二醯亞胺反應。
根據另一較佳實施例，根據本發明之結合物包含「經典」載體蛋白，例如CRM197，其含有多個T細胞抗原決定基。根據本發明之結合物亦包含共價偶合於多醣部分的B細胞抗原決定基。在該實施例中，兩種多肽(B細胞抗原決定基及載體分子)獨立地偶合於根據本發明之CLEC載體，尤其是偶合於石耳多醣。
根據另一較佳實施例，根據本發明之結合物亦包含「經典」載體蛋白，例如CRM197，其含有多個T細胞抗原決定基。根據本發明之結合物亦包含共價偶合於「經典」載體蛋白的B細胞抗原決定基。根據本發明之肽-載體結合物亦共價偶合於多醣部分。在該實施例中，兩種多肽(B細胞抗原決定基及載體分子)以結合物的形式偶合於根據本發明之CLEC載體，尤其是偶合於石耳多醣。載體蛋白接著作為本發明結合物中β-葡聚糖或甘露多醣與B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽之間的連接。β-葡聚糖或甘露多醣與B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽之間的共價結合隨後由載體蛋白(作為功能性連接部分)進行。
根據本發明之較佳結合物可包含偶合於CRM197的B細胞抗原決定基，其中該構築體進一步偶合於根據本發明之CLEC聚合物，尤其是β-葡聚糖，其中β-葡聚糖為石耳多醣、地衣多醣、昆布多醣、卡德蘭多醣、β-葡聚糖肽(BGP)、裂褶多醣、硬葡聚糖、全葡聚糖顆粒(WGP)、酵母多醣或蘑菇多醣、較佳為石耳多醣、昆布多醣、地衣多醣、蘑菇多醣、裂褶多醣或硬葡聚糖，尤其是石耳多醣。
根據本發明，顯示與石耳多醣偶合的新型B細胞抗原決定基-CRM197結合物為強力的dectin-1結合物並引發非常強的免疫反應，優於習知的CRM結合物疫苗。
根據本發明，顯示CLEC與新穎B細胞抗原決定基+CRM197結合物之結合，尤其是產生B細胞抗原決定基+CRM197+β-葡聚糖，更佳為B細胞抗原決定基+CRM197+線性β-(1,6)-葡聚糖或B細胞抗原決定基+CRM197+石耳多醣結合物對於誘導關於各種肽+CRM197+CLEC，尤其是肽+CRM197+β-葡聚糖，更佳為肽+CRM197+線性β-(1,6)-葡聚糖或肽+CRM197+線性石耳多醣結合物所描述的相較於有或沒有藉由與β-葡聚糖/石耳多醣混合添加佐劑的習知CRM偶合疫苗之優異免疫原性為必不可少的。
因此，提供與β-葡聚糖共價連接之B細胞抗原決定基+CRM197結合物為一較佳實施例，更佳為肽+CRM197+線性β-(1,6)-葡聚糖或肽+CRM197+線性石耳多醣結合物。
因此，本發明亦涉及藉由將載體蛋白(已包含一或多種T細胞抗原(作為其多肽序列之一部分，視情況以轉譯後修飾的形式存在))與根據本發明之CLEC多醣佐劑，即β-葡聚糖或甘露多醣，較佳為石耳多醣、地衣多醣、昆布多醣、卡德蘭多醣、β-葡聚糖肽(BGP)、裂褶多醣、硬葡聚糖、全葡聚糖顆粒(WGP)、酵母多醣或蘑菇多醣共價偶合來改良及/或最佳化載體蛋白。因此，本發明涉及用作B細胞及/或T細胞抗原決定基α突觸核蛋白多肽之C型凝集素(CLEC)多醣佐劑的β-葡聚糖或甘露多醣，其中β-葡聚糖或甘露多醣與B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽共價結合以形成β-葡聚糖或甘露多醣與B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽之結合物，其中載體蛋白共價偶合於β-葡聚糖或甘露多醣。
此類改良及/或最佳化導致B細胞對CLEC及/或載體蛋白的反應顯著減少或消除及/或增強(或至少保持)T細胞對載體蛋白之T細胞抗原決定基的反應。此能夠減少或消除對CLEC及/或載體的抗體反應(隨後僅遞送T細胞反應)，且特異性增強抗體對結合於載體及/或CLEC的實際目標多肽之反應。
因此，本發明之一特定較佳實施例為由以下組成或包含以下之結合物 (a)一β-葡聚糖或甘露多醣 (b)至少一B細胞或T細胞抗原決定基多肽，及 (c)一載體蛋白， 其中該等三種成分(a)、(b)及(c)彼此共價結合。
此三種成分之組合可以任何方向或順序，即以順序(a)-(b)-(c)、(a)-(c)-(b)或(b)-(a)-(c)提供，其中(b)及/或(c)可自N端至C端或自C端至N端共價結合，或藉由多肽內的官能基(例如藉由離胺酸、精胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、色胺酸或組胺酸殘基中之官能基，尤其是藉由離胺酸殘基的ε-銨基)結合。當然，β-葡聚糖或甘露多醣可與成分(b)及(c)中之各者的一或多者偶合，較佳藉由本文揭示的方法。較佳地，此等成分藉由連接子結合，尤其是藉由所有至少三種成分之間的連接子結合。較佳的連接子在本文中揭示，例如半胱胺酸殘基或包含半胱胺酸或甘胺酸殘基的連接子、由以下產生之連接子：醯肼介導之偶合、經由異雙官能連接子，例如BMPH、MPBH、EMCH或KMUH之偶合、咪唑介導之偶合、還原胺化、碳二亞胺偶合一-NH-NH 2連接子、一NRRA、NRRA-C或NRRA-NH-NH 2連接子；肽連接子，諸如二聚、三聚、四聚-(或更長)肽基，如CG或CG。在現有載體蛋白，尤其是CRM、CRM197及KLH的情況下，該至少三種成分的較佳順序為(a)-(c)-(b)，即其中該β-葡聚糖或甘露多醣及該至少一種B細胞或一種T細胞抗原決定基多肽與載體蛋白偶合。
根據另一較佳實施例，根據本發明之結合物包含T細胞抗原決定基且不含B細胞抗原決定基，其中該結合物較佳包含多於一個T細胞抗原決定基，尤其是兩個、三個、四個或五個T細胞抗原決定基。該構築體特別適用於癌症疫苗。該構築體亦特別適用於自體抗原，尤其是自體免疫疾病相關之自體抗原。各別結合物之治療作用與效應T細胞之減少及調節性T細胞(T reg細胞)群的形成有關，該二現象使得相應疾病，例如自體免疫疾病或過敏性疾病得到抑制，例如如多發性硬化症所示。值得注意的是，此等Treg細胞執行強烈的旁觀者免疫抑制，且因此改善由同源及非同源自體抗原誘發之疾病。
用來作為根據本發明之多醣骨架之較佳CLEC為石耳多醣或其他β-(1,6)葡聚糖(亦包括此類葡聚糖之合成形式)；所用其他者：甘露多醣，β-葡聚糖家族成員，尤其是線性β-(1,3)(釀酒酵母β-葡聚糖(例如：150kDa)、卡德蘭多醣)或含有支鏈β-(1,3)及β-(1,6)的葡聚糖，例如：昆布多醣(4,5-7kDa)，硬葡聚糖，裂褶多醣、更佳為線性葡聚糖，(例如：β(1,3)：釀酒酵母β-葡聚糖(150kd)，卡德蘭多醣(75-80kDa或更大)，β-(1,3)+β-(1,4)地衣多醣(22-250kDa)β-(1,6)石耳多醣(20kDa)。因此，根據本發明之較佳CLEC是甘露多醣及β-葡聚糖，包括線性及支鏈化β-葡聚糖，其特徵在於存在β-(1,3)-、β-(1,3)+β-(1,4)-及β(-1,6)主鏈以及帶有β-(1,6)的附加側鏈殘基，更佳為含有β-(1,3)、β-(1,3)+β-(1,4)及β-(1,6)鏈的線性β-葡聚糖，更佳為線性β-(1,6)β-葡聚糖，尤其是石耳多醣或由多聚β-(1,6)-葡聚糖單醣(例如4聚體、5聚體、6聚體、8聚體、10聚體、12聚體、15聚體、17聚體或25聚體)所組成之其片段或合成變異體。
較佳地，根據本發明之CLEC之最小長度為6聚體，因為對於更小的多醣來說，根據本發明所進行的氧化反應是有問題的(最終其他偶合機制可用於此類更小的多醣形式及/或藉由增加反應形式進行末端連接)。具有6個或更多單體單元(即6聚體及更大聚體)的CLEC顯示出良好的dectin結合性。通常，CLEC愈長，dectin結合性愈好。聚合度(即一葡聚糖整體中單個葡萄糖分子之量，DP)為20-25 (即DP20-25)可以確保良好的結合及活體內功效(例如昆布多醣為具有20-30之DP之典型實例)。
合成的CLEC之分子量亦可能更小，相應地例如低至1-2kDa，而葡聚糖及其片段的較佳分子量範圍可為1-250kDa(例如昆布多醣、地衣多醣、釀酒酵母β-葡聚糖、石耳多醣、卡德蘭多醣及大麥葡聚糖等)、較佳為4.5至80kDa(例如昆布多醣、石耳多醣、卡德蘭多醣、低分子量地衣多醣等)，尤其是4.5至30kDa(例如昆布多醣、石耳多醣、低分子量地衣多醣等)。甘露多醣是由甘露醣組成的線性聚合物多醣。植物甘露多醣具有β-(1,4)鍵，其為儲存多醣的一種形式。酵母中發現的甘露多醣細胞壁具有α-(1,6)連接之骨架及α-(1,2)及α-(1,3)連接之分支。其在血清學上與哺乳動物糖蛋白上發現的結構相似。
為了產生根據本發明之結合物，該CLEC，尤其是石耳多醣，必須被活化(例如藉由使用溫和的過碘酸鹽介導之氧化)，且氧化度對於免疫反應而言非常重要。正如上文已揭示，實際的氧化範圍，尤其是對於石耳多醣而言，為大約20%至260%氧化。在許多情況下，最佳的氧化範圍介於低/中等氧化度(即20-60%氧化)及高氧化度(即140-260%氧化)之間，即在60-140%氧化範圍內。熟悉此項技術者可容易地調整對其他CLEC的優化，例如對於地衣多醣而言，超過200%的氧化度是獲得類似量的醛基所必需的。
因此，範圍亦可替代地界定為與席夫品紅試劑之反應程度，對於石耳多醣之實例，可分別界定為如下：在0.2-0.6莫耳比(糖單體:過碘酸鹽)下的低/中等氧化度、0.6-1.4之最佳範圍、1.4-2.6之高氧化度。
無論如何，氧化度應被界定為以滿足各特定CLEC之最佳範圍。較佳地，線性β-葡聚糖，更佳為β-(1,6)-葡聚糖，尤其是石耳多醣、石耳多醣片段或由多聚β(1,6)-葡聚糖單醣(例如4聚體、5聚體、6聚體、8聚體、10聚體、12聚體、15聚體、17聚體或25聚體)組成的其合成變異體被溫和的過碘酸鹽氧化活化，引起鄰位羥基的裂解，並因此產生具反應性的醛。溫和的過碘酸鹽氧化是指使用過碘酸鈉(NaIO 4)，其為一種眾所周知的溫和試劑，可有效氧化碳水化合物糖類中的鄰位二醇，產生反應性醛基。碳-碳鍵在相鄰的羥基之間裂解。藉由改變過碘酸鹽之使用量，醛可以化學計量方式引入至給定多醣之較少或較多數量的糖部分中。
用於活化碳水化合物之其他實例性方法為此項技術中眾所周知的且包括羥基之氰基化(例如：藉由使用有機氰基化試劑，如1-氰基-4-(二甲胺基)-吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)或N-氰基三乙基四氟硼酸銨(CTEA)、碳水化合物之還原胺化或使用羧酸反應性化學基團(如碳二亞胺)進行活化及偶合。
接著，活化後的碳水化合物與多肽反應以偶合於活化的CLEC並形成CLEC與B細胞或T細胞抗原決定基多肽之結合物。
因此，本發明亦關於產生根據本發明之結合物的方法，其中β-葡聚糖或甘露多醣藉由氧化被活化且其中活化的β-葡聚糖或甘露多醣與B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽接觸，從而獲得β-葡聚糖或甘露多醣與B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽之結合物。
較佳地，β-葡聚糖或甘露多醣係藉由鄰位羥基處之過碘酸鹽氧化、還原胺化或羥基之氰基化獲得。
根據一較佳實施例，β-葡聚糖或甘露多醣被氧化至如下氧化度，該氧化度被界定為與席夫品紅試劑之反應程度，其相當於以0.2-2.6、較佳以0.6-1.4、尤其是以0.7-1之莫耳比用過碘酸鹽氧化等量的石耳多醣的氧化度。
較佳地，該結合物係藉由基於腙之偶合將醯肼結合於羰基(醛)，或藉由使用異雙官能順丁烯二醯亞胺及醯肼連接子(例如：BMPH (N-β-順丁烯二醯亞胺基丙酸醯肼、MPBH (4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基-苯基]丁酸醯肼)、EMCH (N-[ε-順丁烯二醯亞胺基己酸)醯肼)或KMUH (N-[κ-順丁烯二醯亞胺基十一酸]醯肼)的偶合將巰基(例如：半胱胺酸)與羰基(醛)結合來產生。
與根據本發明之CLEC偶合的多肽為或包含至少一個B細胞抗原決定基或至少一個T細胞抗原決定基。較佳地，與CLEC偶合之多肽包含單個B細胞或T細胞抗原決定基(即使在多於一種多肽與CLEC多醣骨架偶合的實施例中)。同樣如實例部分所示，α突觸核蛋白多肽之較佳長度為5至29個胺基酸殘基、較佳為5至25個胺基酸殘基、更佳為7至20個胺基酸殘基、甚至更佳為7至15個胺基酸殘基、尤其是7至13個胺基酸殘基。在此方面，重要的是要注意此等長度範圍僅針對抗原決定基序列，但不包括連接子，包括肽連接子，例如半胱胺酸或甘胺酸或二聚體、三聚體、四聚體(或更長聚體)肽群，如CG或CG，或裂解位點，如組織蛋白酶裂解位點；或其組合(例如-NRRAC)。實例部分已經測試了抗原決定基之實例；自此等結果可看出，根據本發明之平台不限於任何特定的多肽。因此，實際上所有可能的抗原決定基均符合本發明之條件，包括此項技術中已知的彼等抗原決定基，尤其是已被描述為可整合至展現平台中的抗原決定基(例如連同「經典」載體分子或佐劑)。
抗原決定基若能以基於目前先進技術的偶合方法偶合於活化β-葡聚糖，包括醯肼介導之偶合、藉由異雙官能連接子(例如：BMPH、MPBH、EMCH、KMUH等)之偶合、咪唑介導之偶合、還原胺化、碳化二亞胺偶合等(更多待補充)。使用的抗原決定基包含個別肽，可包含在肽或蛋白質中，或可在偶合於CLEC之前呈現為肽-蛋白質結合物。
因此，用於提供根據本發明之結合物的較佳偶合方法為醯肼偶合或使用硫酯形成之偶合(例如使用BMPH (N-β-順丁烯二醯亞胺基丙酸醯肼)、MPBH、EMCH、KMUH的順丁烯二醯亞胺偶合)，特別言之，其中石耳多醣藉由腙形成與BMPH偶合，且多肽藉由硫酯偶合。
在該實施例中，較佳提供具有兩個較佳連接子之多肽，例如用於腙偶合之醯肼多肽/抗原決定基： 多肽N端偶合：H 2N-NH-CO-CH 2-CH 2-CO-多肽-COOH；較佳與丁二酸或替代的適合連接子組合，例如其他適合的二羧酸，尤其是用作間隔子/連接子的戊二酸； C端偶合(此為根據本發明之較佳偶合方向)：NH 2-多肽-NH-NH 2。
或者，未修飾的α突觸核蛋白多肽/抗原決定基可應用於本發明，例如在C或N端含有(額外)半胱胺酸殘基或SH基團的替代來源的多肽，用於異雙官能連接子介導之偶合(尤其是BMPH、MPBH、EMCH、KMUH)：NH 2-Cys-Pep-COOH或NH 2-Pep-Cys-COOH)。
根據本發明所使用的B細胞多肽長度較佳為5至19個胺基酸殘基、更佳為6至18個胺基酸殘基、尤其是7至15個胺基酸殘基的多肽。B細胞抗原決定基較佳為短的線性多肽、糖多肽、脂多肽、其他轉譯後修飾多肽(例如：磷酸化、乙醯化、硝化、含有焦麩胺酸殘基、糖基化等)、環狀多肽等。
根據本發明所使用的T細胞多肽之長度較佳為8至30個胺基酸殘基，更佳為13至29個胺基酸殘基，尤其是13至28個胺基酸殘基。
用於本發明之T細胞抗原決定基的較佳特異性為適合或已知適合藉由MHC I及II呈遞的短線性肽(如熟悉此項技術者所知)，尤其是CD4效應T細胞及CD4 Treg細胞之MHCII抗原決定基、細胞毒性T細胞(CD8+)及CD8 Treg細胞之MHCI抗原決定基，其例如可以在人類或動物中的癌症、自體免疫或感染性疾病具有已知功效；適合藉由MHCI及II呈遞的短線性肽(如熟悉此項技術者所知)，其在N或C端附加溶酶體蛋白酶裂解位點，尤其是組織蛋白酶家族成員特異性位點，更尤其是半胱胺酸組織蛋白酶，如組織蛋白酶B、C、F、H、K、L、O、S、V、X及W，尤其是組織蛋白酶S或L位點，最佳為組織蛋白酶L裂解位點，其促進呈遞MHC的肽之有效內切/溶酶體釋放，尤其是在人類或動物中具有已知功效的MHCII。各種蛋白質中之組織蛋白酶裂解位點已被鑑別且為此項技術中眾所周知的。此包括揭示此類序列或鑑別此類序列的方法：例如：Biniossek等人, J. Proteome Res. 2011, 10, 12, 5363-5373；Adams-Cioaba等人, Nature Comm. 2011, 2:197；Ferrall-Fairbanks PROTEIN SCIENCE 2018 VOL 27:714—724；Kleine-Weber等人, Scientific Reports (2018) 8:1659, https://en.wikipedia.org/wiki/Cathepsin_S及其他。具體而言，使用如本發明所示之人工蛋白酶裂解位點對肽序列進行的調整係基於當抗原與CLEC偶合時，此等序列延伸在皮膚施用根據本發明之CLEC疫苗後引發更有效的免疫反應的意外作用。根據本發明之疫苗被DC吸收，肽抗原隨後被溶酶體處理並呈遞在MHC上。
溶酶體是在細胞內與細胞膜結合的胞器，其內部呈酸性且含有多種水解酶，包括參與細胞分解代謝的脂肪酶、蛋白酶及糖苷酶。在溶酶體所含的各種酶中，組織蛋白酶是具有廣泛功能的溶酶體蛋白酶家族。所有組織蛋白酶均屬於三個不同的蛋白酶家族：絲胺酸蛋白酶(組織蛋白酶A及G)、天門冬胺酸蛋白酶(組織蛋白酶D及E)及十一種半胱胺酸組織蛋白酶。在人類中，已知有11種半胱胺酸組織蛋白酶亦具有與木瓜蛋白酶相似的結構：組織蛋白酶B、C(J、二肽基肽酶I或DPPI)、F、H、K(O2)、L、O、S、V(L2),X(P,Y,Z)及W(淋巴蛋白酶)。
組織蛋白酶在其細胞定位及生物合成方面表現出相似性，但在其表現模式上存在一些差異。在所有溶酶體蛋白酶中，組織蛋白酶L、B及D含量最高，其溶酶體濃度相當於1mM。組織蛋白酶B、H、L、C、X、V及O在各細胞中均有表現，而組織蛋白酶K、S、E及W則顯示出細胞或組織特異性表現。組織蛋白酶K在破骨細胞及上皮細胞中表現。組織蛋白酶S、E及W則主要在免疫細胞中表現。
除了在溶酶體蛋白循環中的主要功能外，組織蛋白酶在各種生理過程中亦發揮著重要作用。組織蛋白酶S是參與MHC II Ag加工及呈遞的主要蛋白酶。組織蛋白酶S缺失的小鼠在與MHC II結合的li片段的生成及呈現方面表現出顯著差異，此是由於在組織蛋白酶S大量表現的專業APC中li降解顯著減少。此外，內吞作用將外源物質選擇性地靶向人類DC中的組織蛋白酶S。在組織蛋白酶S缺陷的小鼠的脾臟DC中亦一直注意到晚期內吞結構中MHC II分子的富集。最近的研究表明，組織蛋白酶B及D均參與其中，但對於MHC II介導的Ag呈遞亦不是必需的。組織蛋白酶L亦在多種細胞過程中發揮作用，包括抗原加工、腫瘤侵襲及轉移、骨吸收以及參與生長調節的細胞內及分泌蛋白的周轉。雖然普遍被認為為一種溶酶體蛋白酶，但組織蛋白酶L亦被分泌。此廣譜蛋白酶可有效降解多種細胞外蛋白(層黏連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白I及IV、彈性蛋白及基底膜的其他結構蛋白)以及血清蛋白及細胞質及核蛋白。
作為強化疫苗中，尤其是基於CLEC之疫苗中之T細胞抗原決定基功效的新穎手段，溶酶體蛋白酶裂解位點之N端或C端添加作為本發明之一較佳實施例提供。
根據本發明之該等裂解位點之特徵可如下： 組織蛋白酶L樣裂解位點： 既定組織蛋白酶L樣裂解位點係基於熟習此項技術者已知之蛋白酶裂解位點序列定義，特定言之，亦如Biniossek等人(J. Proteome Res. 2011, 10, 5363-5373)及Adams-Cioaba等人(Nature Comm. 2011, 2:197)中所揭示的序列。位點之定向可為N端或C端，較佳為C端。C端組織蛋白酶L位點之較佳共同序列由下式組成： X n-X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8X n：來自免疫原性肽之3-27個胺基酸 X 1：任何胺基酸 X 2：任何胺基酸 X 3：任何胺基酸 X 4：N/D/A/Q/S/R/G/L；較佳為N/D，更佳為N X 5：F/R/A/K/T/S/E；較佳為F或R，更佳為R X 6：F/R/A/K/V/S/Y；較佳為F或R，更佳為R X 7：任何胺基酸，較佳為A/G/P/F，更佳為A X 8：半胱胺酸或連接子，如NHNH 2最佳序列：X n-X 1X 2X 3NRRA-連接子 組織蛋白酶S樣裂解位點： 既定組織蛋白酶S裂解位點係基於熟習此項技術者已知之蛋白酶裂解位點序列，特定言之，亦如Biniossek等人(J. Proteome Res. 2011, 10, 5363-5373)及https://en.wikipedia.org/wiki/Cathepsin_S中所揭示的序列，且由以下共同序列表徵： X n-X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8其中X特徵在於 X n：來自免疫原性肽之3-27個胺基酸 X 1：任何胺基酸 X 2：任何胺基酸 X 3：任何胺基酸，較佳為V、L、I、F、W、Y、H，更佳為V X 4：任何胺基酸，較佳為V、L、I、F、W、Y、H，更佳為V X 5：K、R、E、D、Q、N，較佳為K、R，更佳為R X 6：任何胺基酸 X 7：任何胺基酸，較佳為A X 8：較佳為A X 8：半胱胺酸或連接子，如NHNH 2最佳序列：X n-X 1X 2VVRAA-連接子
T細胞抗原決定基包含於適合與CLEC偶合之蛋白質內，包括載體蛋白，尤其是白喉毒素之毒性交叉反應物質(CRM)，尤其是CRM197、KLH、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、流感嗜血桿菌蛋白D (HipD)及腦膜炎球菌血清群B之外膜蛋白質複合體(OMPC)、銅綠假單胞菌外毒素A之重組無毒形式( rEPA)、鞭毛蛋白、大腸桿菌熱不穩定腸毒素(LT)、霍亂毒素(CT)、突變毒素(例如LTK63及LTR72)、病毒樣顆粒、白蛋白結合蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、合成肽樹枝狀聚合物，例如，多抗原肽(MAP)或其他市售載體蛋白，較佳為CRM197及KLH，最佳為CRM197，較佳地，其中結合物中載體蛋白與β-葡聚糖或甘露多醣之比率為1/0.1至1/50、較佳為1/0.1至1/40、更佳為1/0.1至1/20，尤其是1/0.1至1/10。
根據本發明之較佳實施例，根據本發明之CLEC結合物包含(a)與個別α突觸核蛋白之B細胞抗原決定基及/或T細胞抗原決定基結合的CLEC，包括B細胞或T細胞抗原決定基的混合物，尤其是與石耳多醣偶合的此等抗原決定基；(b)與多肽-載體蛋白結合物結合的CLEC，較佳為與石耳多醣偶合的多肽-KLH或多肽CRM197結合物，最佳為與石耳多醣偶合的多肽-CRM197結合物；(c)與個別α突觸核蛋白之B細胞抗原決定基及T細胞抗原決定基結合的CLEC，最佳為與石耳多醣結合的CLEC；(d)與包含在多肽或蛋白質，例如載體蛋白、自體蛋白、來自病原體的外來蛋白、過敏原等中的B細胞抗原決定基及T細胞抗原決定基獨立偶合的CLEC (此處「獨立」指多肽鏈不以融合蛋白、串聯重複多肽或肽-蛋白質結合物存在，而是以獨立實體存在；即一獨立的含有B細胞抗原決定基的多肽及獨立的含有T細胞抗原決定基的多肽)；(e)與代表線性MHCI及MHCII抗原決定基或包含在蛋白質中，例如載體蛋白或目標蛋白中的T細胞抗原決定基獨立偶合的CLEC (「獨立」，具有與(d)相同的含義)，例如用於治療腫瘤疾病或自體免疫疾病。
鑒於本發明結合物之此等有利特性，因此根據本發明之結合物及疫苗可特定用於主動抗α突觸核蛋白疫苗，用於治療及預防突觸核蛋白病變。
根據另一態樣，本發明亦關於包含如上所定義的結合物或疫苗及醫藥學上可接受之載體的醫藥組合物。
較佳地，醫藥學上可接受之載體為緩衝液，較佳為磷酸鹽或基於TRIS之緩衝液。
根據本發明之一較佳實施例，醫藥組合物係包含在基於針之遞送系統中，較佳為注射器、微型針系統、空心針系統、實心微針系統或包含針配接器之系統；安瓿、無針注射系統，較佳為噴射注射器；貼劑、經皮貼劑、微結構經皮系統、微針陣列貼劑(MAP)(較佳為固體MAP(S-MAP)、包衣MAP(C-MAP)或溶解MAP(D-MAP))；電泳系統、離子電泳系統、基於雷射之系統，尤其是鉺YAG雷射系統；或基因槍系統。根據本發明之結合物不限於任何形式之製造、儲存或遞送狀態。因此，所有傳統及典型的形式均適用於本發明。較佳地，根據本發明之組合物可包含呈溶液或懸浮液、深度冷凍溶液或懸浮液、凍乾物、粉劑或顆粒之本發明結合物或疫苗。本發明藉由以下實例及附圖進一步說明，但不侷限於此。
實例 ： 材料及方法 1) CLEC/ 葡聚糖骨架的氧化
為了形成疫苗結合物，需要對多醣，尤其是亦對CLEC/β-葡聚糖進行化學修飾，以生成可用於連接蛋白質/肽之反應基團。多醣活化之兩種常用方法為鄰位羥基處的過碘酸鹽氧化以及羥基的氰基化。活化多醣的其他方法為可能的且為此項技術所眾所周知的。本實例部分中顯示的實例係使用溫和的過碘酸鹽氧化。
根據其溶解度，CLEC及β-葡聚糖(例如甘露多醣、地衣聚糖、石耳多醣或來自大麥的β-葡聚糖)在水溶液或DMSO中使用過碘酸鹽氧化進行氧化。
基於以1:5 (即20%氧化)至2,6:1的莫耳比(過碘酸鹽:糖次單元；100%=1莫耳過碘酸鹽/莫耳糖單體)添加過碘酸鹽溶液來預先確定氧化度(260%氧化度)。
簡言之，以1:5至2,6:1的莫耳比(過碘酸鹽:糖次單元，對應於20%及260%的氧化度)添加過碘酸鈉以打開鄰位二醇之間的β-葡聚糖的呋喃糖環，留下兩個醛基作為後續偶合反應的受質。添加10% (v/v)的2-丙醇作為自由基清除劑。將反應在黑暗中在迴轉式震盪器(1000rpm)上室溫培育4小時。隨後，使用截止值為20kDa的Slide-A-Lyzer™ (ThermoScientific)或Pur-A-Lyzer™ (Sigma Aldrich)盒將氧化葡聚糖及水透析3次，以移除(過)碘酸鈉及低分子量葡聚糖雜質。透析後的葡聚糖可直接進行肽結合反應或儲存在-20℃或凍乾且儲存在4℃以供進一步使用。 2) WISIT 疫苗之結合 2a. 藉由腙形成
多肽在N或C端包含一個醯肼基團用於醛偶合。在偶合方向意欲藉由所選肽之N端偶合至葡聚糖部分之醛基之情況下，該肽被設計為包含適合的連接子/間隔子，例如丁二酸。或者，完整蛋白質(例如：CRM197)亦已被用於葡聚糖偶合。
此類肽之典型實例：肽之N端偶合：H 2N-NH-CO-CH 2-CH 2-CO-多肽-COOH；C端偶合：NH 2-多肽-NH-NH 2。
對於偶合，將活化之葡聚糖溶液(即經氧化之石耳多醣)與溶解的醯肼修飾肽或完整蛋白質(例如：CRM197)在偶合緩衝液(取決於肽之等電點，可擇一使用pH 5.4的乙酸鈉緩衝液或中性pH (6.8)下之DMEDA)攪拌。肽中的游離醯肼基團與醛基反應形成腙鍵，形成最終的結合物。對於蛋白質來說，與活化葡聚糖的偶合係基於離胺酸殘基的胺基在氰基硼氫化鈉存在下與葡聚糖部分上的活性醛發生反應。
隨後，藉由在硼酸鹽緩衝液(pH 8.5)中加入硼氫化鈉來還原結合物。該步驟將肼鍵還原為穩定的二級胺，且將糖骨架中未反應的醛基轉化為一級醇。結合物中的碳水化合物濃度使用蒽酮法估計，肽濃度藉由UV光譜法估計或藉由胺基酸分析估計。 2b. 使用異雙官能連接子偶合
所應用的第二種結合技術依賴於異雙官能連接子(例如：BMPH (N-β-順丁烯二醯亞胺基丙酸醯肼、MPBH (4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸醯肼)、EMCH (N-[ε-順丁烯二醯亞胺基己酸)醯肼)或KMUH (N-[κ-順丁烯二醯亞胺基十一酸]醯肼)短順丁烯二醯亞胺及醯肼交聯劑，用於將巰基(半胱胺酸)與羰基(醛)結合。
多肽在N或C端包含半胱胺酸(Cys)，用於順丁烯二醯亞胺偶合。此類肽之典型實例：肽之N端偶合：Cys-肽-COOH；C端偶合：NH 2-Pept-Cys-COOH。
對於偶合，活化葡聚糖溶液(即，經氧化之石耳多醣)與BMPH經隔夜反應(比率為1:1比率(w/w)至2:1比率BMPH:石耳多醣)，隨後用PBS透析3次。然後將BMPH活化之葡聚糖與溶解的Cys修飾之多肽在偶合緩衝液(例如磷酸鹽緩衝鹽水，PBS)中混合。順丁烯二醯亞胺基與肽中的巰基反應形成穩定的硫醚鍵，且與連接子與反應性醛之間形成的腙一起產生穩定的結合物。使用蒽酮法估計結合物中的碳水化合物濃度，且藉由胺基酸分析或使用埃爾曼試劑(5,5'-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)，DTNB)進行埃爾曼分析以測定多肽濃度。DTNB與巰基反應生成有色產物，為藉由分光光度法量測溶液中還原的半胱胺酸及其他游離巰基提供了可靠的方法(λmax=412nm；ε=14,150/M·cm)。 2c) 多肽 KLH/CRM 結合
藉由使用異雙官能交聯劑GMBS或SMCC (Thermo Fisher)，將多肽(含有N或C端Cys殘基，見上文)與載體CRM-197 (例如：EcoCRM、Fina Biosolutions)或KLH(Sigma Aldrich)偶合。簡言之，CRM-197/KLH在室溫下與過量的GMBS或SMCC(根據製造商的方案)混合以進行活化，然後藉由脫鹽柱離心移除過量的GMBS，再將過量的肽添加至活化之載體中用於偶合(緩衝液：200mM磷酸鈉(pH=6.8))，隨後用PBS透析3次。藉由用於定量溶液中的游離巰基之埃爾曼測定(埃爾曼試劑：5,5'-二硫代-雙-(2-硝基苯甲酸))評定偶合功效/肽含量。多肽CRM-197/KLH結合物進一步與Alum (Alhydrogel®佐劑2%)調配且皮下施用於動物。當將CRM-197/KLH疫苗與根據本發明之其他疫苗進行比較時，每隻小鼠注射相同量的結合多肽。 2d) 使用多肽、 KLH/CRM197 及葡聚糖形成葡萄糖新結合物
如2c)所述產生的多肽-KLH及多肽-CRM197結合物亦以不同的多肽-KLH及多肽-CRM197與葡聚糖的比率(即分別為1/1 (w/w)、1/2 (w/w)、1/5 (w/w)、1/10 (w/w)及1/20 (w/w))偶合於活化葡聚糖。在形成多肽結合物後，使用二硫蘇糖醇(DTT)還原Pep-KLH或Pep-CRM結合物。在存在過量的異雙官能連接子BMPH之情況下，還原的載體結合物與活化之葡聚糖偶合。藉由BMPH的順丁烯二醯亞胺基與還原的KLH或CRM197結合物之巰基殘基形成穩定的硫醚鍵，同時聚糖中的醛基與BMPH的醯肼基團實現偶合。在室溫下2小時後，藉由與氰基硼氫化鈉進行隔夜反應，將生成的腙還原為穩定的二級胺。隨後，使用Slide-A-Lyzer™ (ThermoScientific)或Pur-A-Lyzer™ (Sigma Aldrich)盒將新糖結合物用PBS或水透析3次以移除低分子量雜質(亦參見：實例23)。 3)CLEC 結合物活體外生物活性測定
藉由如Korotchenko等人所述(2020)之使用可溶性鼠Fc-dectin-1a受體(InvivoGen)或ConA之ELISA分析甘露多醣及葡聚糖結合物之活體外生物活性。簡言之，ELISA盤塗有一參考葡聚糖(CLR-促效劑，CLEC)，例如：石耳多醣、地衣多醣或甘露多醣，且與螢光標記之ConA(對於甘露多醣)或可溶性小鼠Fc-dectin-1a受體(對於石耳多醣及其他β-D-葡聚糖)發生反應，可偵測到藉由HRP標記之二級抗體。在競爭性ELISA中測試經氧化之碳水化合物以及葡萄糖複合體(逐漸增加CLEC的濃度或結合物被添加至用於分析的可溶性受體以減少受體與塗佈的CLEC的結合)以證明其功能。IC 50值用於確定生物活性(即：與未經氧化、非偶合配位體相比對可溶性受體的結合功效)。 4) 使用骨髓 衍生之樹突狀細胞進行活化分析
骨髓衍生之樹突狀細胞(BMDC)自小鼠股骨及脛骨中採集，且與20 ng/mL小鼠GM-CSF(Immunotools)一起培育，如Korotchenko等人所述(2020)，並進行了細微改動。藉由對CD11c +MHCII +CD11b intGM-CSF衍生的DC (GM-DC)進行FACS分析，評定了各種結合物以及陽性對照組(=LPS)對CD80及MHCII表現的影響。 5) 流體動力學半徑之測定
藉由動態光散射(DLS)分析結合物之流體動力學半徑。簡言之，將樣品(即結合物)以10,000g離心15分鐘(Merck Millipore, Ultrafree-MC-VV Durapore PVDF)。所有樣品孔均用矽油密封以防止蒸發，且按順序收集資料約24小時。所有量測均在25℃下使用WYATT DynaPro PlateReader-II1536孔盤(1536W SensoPlate, Greiner Bio-One)進行。以一式三份的方式量測樣品。所有量測值均針對1.00±0.005的基線值進行過濾，因此只有返回至0.995及1.005之間的值的曲線才被考慮用於進一步分析(例如，累積半徑及正則化分析)。樣品分析根據https://www.wyatt.com/library/application-notes/by-technique/dls.html及DYNAMICS用戶指南(M1406Rev.C，版本7.6.0)，Technical Notes TN2004及TN2005(皆在：www.wyatt.com上) 6) 動物實驗
雌性BALB/c小鼠，每組n=5隻小鼠，用不同的CLEC結合物(i.d.、i.m.、s.c.)、肽-CRM-197/KLH結合物(i.d.)或吸附於Alum的肽-CRM-197/KLH結合物(s.c.)以及各別對照組(例如未結合之CLEC、CLEC及肽之混合物等)進行免疫接種。動物以每兩週一次的間隔接種3次疫苗，除非另有說明，否則在每次接種前一天及最後一次施用後兩週定期採集血液樣本。 7) 使用 ELISA 對小鼠血漿中之疫苗誘導抗體進行定量
使用肝素作為抗凝劑，自小鼠收集全血，再藉由離心獲得血漿，將血漿樣品儲存在-80℃。為了偵測抗目標特異性抗體，使用50mM碳酸鈉緩衝液在ELISA盤(Nunc Maxisorb)上塗上肽-BSA結合物或重組蛋白/片段(通常濃度為1µg/ml)，在4℃下放置隔夜。所提供的實例中使用的所有抗多肽ELISA均使用Pep-BSA結合物(例如，SeqID3 (序列：DQPVLPD)，其C端用於與順丁烯二醯亞胺活化之BSA偶合；命名法：Pep1c (DQPVLPD-C，SeqID3)用作由含有Pep1b(SeqID2；DQPVLPD-(NH-NH 2))及Pep1c的結合物疫苗所引發的抗Pep1特異性反應的誘餌)。使用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉ELISA盤，血漿樣品在盤中連續稀釋。使用生物素化的抗小鼠 IgG (Southern Biotech)進行目標特異性抗體的偵測，隨後使用鏈黴親和素-POD(Roche)及TMB進行顯色反應。使用GraphPad Prism軟體(Graph Pad Prism www.graphpad.com/scientific-software/prism/)透過非線性回歸分析(四參數邏輯擬合函數)計算EC 50值。
目標蛋白 抗體
α突觸核蛋白重組型(Anaspec) 抗α突觸核蛋白115-121 AB (LB509) (Biolegend)
α突觸核蛋白單體(Abcam) 抗α突觸核蛋白115-121 AB (LB509) (Biolegend)
α突觸核蛋白纖維(Abcam) 抗α突觸核蛋白115-121 AB (LB509) (Biolegend)
石耳多醣 (Biozol)
KLH (Sigma) 抗KLH AB (Sigma)
CRM197 (FinaBiosolution) 抗白喉AB (Abcam)
石耳多醣(Biozol)
KLH (Sigma) 抗KLH AB (Sigma)
CRM197 (FinaBiosolution) 抗白喉AB (Abcam)
8) 藉由抑制 ELISA 評估 aSyn 特異性抗體的結合偏好
ELISA盤(Nunc Maxisorb)塗有aSyn單體(Abcam)或aSyn纖維(Abcam)，且用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉。在低結合性ELISA盤中將對照組抗體及血漿樣品與連續稀釋的aSyn單體或aSyn纖維一起培育。接下來，將預培育的抗體/血漿樣品添加至單體/纖維塗佈的盤中，且使用生物素化抗小鼠 IgG (Southern Biotech)進行結合偵測，隨後使用鏈黴親和素POD(Roche)及TMB進行顯色反應。logIC 50值計算為淬滅一半ELISA信號所需的單體或絲狀aSyn的濃度，且用作所研究抗原的Ab選擇性的估計值。使用GraphPad Prism軟體(Graph Pad Prism www.graphpad.com/scientific-software/prism/)透過非線性回歸分析(四參數邏輯擬合函數)計算logIC 50值。 9)aSyn 聚合的定量
在GENIOS酶標儀(Tecan，奧地利)中以連續迴轉震盪的方式，在黑色平底96孔盤中以0.1ml的反應體積進行自動形式之蛋白質聚集分析。使用450nm激發及505nm發射濾光片，藉由每20分鐘一次的螢光強度頂部讀數來監測動力學。在不存在及存在抗體之情況下的原纖維形成(抗體/蛋白質莫耳比為自6×10 -5至3×10 -3不等)係藉由在10 mM HEPES緩衝液(pH7.5)、100 mM NaCl、5 μM ThT及25μg/ml硫酸肝素中，在37℃下在盤讀取器(Tecan，奧地利)中震盪濃度為0.3mg/ml (20.8μM)的aSyn溶液開始。
此外，不存在及存在抗體下之原纖維形成亦藉由預先形成之原纖維的存在引發。簡言之，aSyn預形成之原纖維(1µM)在存在活化aSyn單體(10µM)及10 µM ThT之情況下在100 µl PBS中聚集0-24小時。
對於資料分析，計算陰性對照組樣品的平均值，即ThT的背景螢光，且在給定的時間點自每個樣品中除去，例如，在Microsoft Excel中進行計算。為了比較聚集分析中的不同條件/抑制劑，將每個樣品標準化為測定開始時測定的螢光讀數且設置為1。(t0=1)。
為了評估動力學曲線，使用了Michaelis Menten動力學模型：使用GraphPad Prism軟體計算各條件之Km(產生半最大速度的受質濃度)及Vmax (最大速度)值，然後進行酶的動力學分析(Michaelis-Menten)。
為了比較聚集分析中的不同條件/抑制劑，使用GraphPad Prism軟體按照線性回歸計算ThT動力學指數生長期的斜率值。 10) 單一抗原結合區段與抗原的 親和力 (affinity) 及 抗體分子與抗原的親和力 (avidity) 的測定
為了測定抗體分子與抗原的親和力，使用了標準ELISA分析的變體，其中含有與抗原結合的抗體的複製孔暴露於逐漸增加濃度的離液硫氰酸根離子。對硫氰酸鹽溶離的抗性用作測量抗體分子與抗原的親和力之量度，且表示50%有效抗體結合的指數(親和力指數)用於比較不同的血清。簡言之，將血漿在PBS中稀釋1/500，然後分配到經過塗佈和封閉的ELISA盤(Nunc Maxisorb)上。培育1小時後，將濃度為0.25至3M的硫氰酸鈉(NaSCN、SIGMA；在PBS中)添加至樣品中。將ELISA盤在室溫下培育15分鐘，然後洗滌，使用鏈黴親和素-POD (Roche)及TMB進行偵測及後續顯色反應。假設不存在NaSCN時的吸光度讀數表示特定抗體的有效總結合(100%結合)，隨後在濃度逐漸增加的NaSCN存在下的吸光度讀數被轉換為總結合抗體的適當百分比。將資料擬合至NaSCN的(%結合)濃度與(log)濃度的圖表中，且藉由線性回歸分析親和力指數，表示將初始光密度降低50%所需的NaSCN濃度。若直線擬合之相關係數低於0.88，則該資料會被排除。
為了測定對aSyn纖維的k D值(結合親和力(affinity))，使用了能夠簡單測定由抗體及其競爭性配位體形成的複合體之k D值的位移ELISA。簡言之，在量測具有固定化aSyn纖維的盤上的游離抗體效價之前，等濃度的抗體與逐漸增加濃度的游離aSyn纖維共同培育。抗體的相對結合表示為每個樣品在測定中觀測到的最大結合的百分比，與aSyn纖維(5µg/ml)的競爭反應被定義為表示0%結合(非特異性結合)，沒有競爭的反應被認為是在位移曲線中表示100%(最大)結合。 使用來自GraphPad的電腦輔助曲線擬合軟體根據單點模型對競爭結合曲線進行分析。 11) 小鼠突觸核蛋白病的誘導
為了誘導突觸核蛋白病，九週大的雄性C57BL/6小鼠在右側黑質水平進行預製多晶型原纖維(PFF，即預製超聲處理τ−多晶型aSyn原纖維1B)的立體定向注射。PFF的製備及驗證如Sci. Adv. 2020, 6, eabc4364, doi:10.1126/sciadv.abc4364; DOI: 10.1126/sciadv.abc4364所述。簡言之，每隻動物接受單側注射2µL PFFs 1B溶液(濃度：2.5mg/ml)至右側黑質正上方的區域(來自前囟的座標：-2.9AP、±1.3L及-4.5DV) ，注射流速為0.4µL/min[Sci. Adv. 2020, 6, eabc4364, doi:10.1126/sciadv.abc4364; DOI: 10.1126/sciadv.abc4364]針頭在原位停留5分鐘，然後慢慢自腦部中取出。
從接種的同一天開始，動物接受三次id免疫接種，每兩週接種一次(即第0、2、4週)，並使用基於CLEC之疫苗(n=5)或非偶合CLEC(n=10))作為對照，隨後在第10週進行加強免疫接種。研究結束後(第126天)，藉由小腦延髓池穿刺術收集腦脊液(CSF)，小心取出大腦並固定在多聚甲醛(PFA；4%)中。使用低溫恆溫器以50µm的間隔收集並處理整個大腦的冠狀序列切片(自前額端大腦皮層至紋狀體到延髓-即前囟-6.72毫米)並進行免疫組織化學處理。 12) 免疫組織化學 (IHC)
如前所述，對冠狀序列切片上的磷S129aSyn(pS129aSyn)進行IHC染色[Sci. Adv. 2020, 6, eabc4364, doi:10.1126/sciadv.abc4364; DOI: 10.1126/sciadv.abc4364]。使用單株兔抗pS129aSyn抗體EP1536Y(ab51253，Abcam)，然後與標記的多聚體HRP抗兔(DakoEnVision+TM套組，K4011)一起培育。pS129aSyn染色的可視化是用DakoDAB(K3468)完成的，切片用Nissl染色劑複染。每個結構(大腦皮層、紋狀體、視丘、黑質及腦幹)的pS129aSyn聚集體的實際數量及pS129aSyn聚集體的總數係藉由Panoramic Scan II (3DHISTECH, 匈牙利)進行全切片採集，再透過專門開發的QuPath演算法對其進行進一步處理來評定。 實例 1 ：活體外測定 CLEC 結合物之生物活性
PAMP(例如：CLEC)會被APC中存在的PRR識別。需要CLEC與其同源PRR (例如：β-葡聚糖的dectin-1)的結合來控制各種水平的適應性免疫，例如，藉由誘導下游碳水化合物特異性信號傳導及細胞活化、細胞成熟及細胞遷移至引流淋巴結或藉由與其他PRR的相互干擾。因此，為了提供本申請案中提出的新型疫苗平台技術，所使用的CLEC保留其PRR結合能力至關重要，此證明了所選之CLEC以及基於CLEC之結合物之生物活性。
沿著此等思路且為了確保1) CLEC的結構在輕度過碘酸鹽氧化過程中不被破壞，以及2)多醣在偶合後保持生物活性，藉由ELISA評定與dectin-1的結合。首先，幾種不同的CLEC已被溫和的過碘酸鹽氧化作用氧化，以產生所提出疫苗的活性糖骨架。此等CLEC包括：甘露多醣、石耳多醣(20kDa)、地衣多醣(245kDa)、大麥β-葡聚糖(229kDa)、燕麥β-葡聚糖(295kDa)及燕麥β-葡聚糖(391kDa)。隨後，使用不同的B細胞抗原決定基肽(SeqID2、SeqID10、SeqID16)及SeqID7作為輔助性T抗原決定基肽進行腙偶合並產生疫苗結合物，上述所有此等抗原決定基肽均包含用於偶合之C端醯肼連接子。此外，亦使用了藉由異雙官能連接子BMPH偶合SeqID10產生的肽-石耳多醣結合物。
接著，使用基於可溶性鼠Fc-dectin-1a受體(InvivoGen)或ConA競爭性結合的競爭性ELISA系統評定了未經氧化及經氧化之CLEC以及基於CLEC之新型結合物之生物活性，如Korotchenko等人所述(2020)。 結果：
所測試的不同CLEC顯示與PRR結合的不同功效。在一系列ELISA實驗中評定了dectin-1配位體石耳多醣、地衣多醣、大麥β-葡聚糖、燕麥β-葡聚糖與dectin-1的結合功效。隨後的實驗表明，中等分子量(20kDa)且為線性β-(1,6)連接之β-D-葡聚糖石耳多醣，與更大、更高分子量的線性β-(1,3 )β-(1,4)-β-D葡聚糖地衣聚糖(約245kDa)相比，顯示出顯著更高的與dectin-1之結合功效(約3倍)(見圖1)。
當將石耳多醣與來自燕麥及大麥的其他線性β-(1,3)β-(1,4)-β-D葡聚糖(大麥β-葡聚糖(229kDa)、燕麥β-葡聚糖：265及391kd)進行比較時，此差異更加明顯，上述其他線性β-(1,3)β-(1,4)-β-D葡聚糖與石耳多醣相比僅顯示出有限的結合功效(例如：大麥β-葡聚糖(229kDa)低約30倍)。
選定之CLEC的溫和過碘酸鹽氧化會造成與dectin-1結合的減少。甘露多醣的氧化將其與凝集素ConA的結合能力降低至與經過碘酸鹽氧化後之氧化石耳多醣-dectin-1結合所描述的降低相似的程度。同樣地，葡聚糖的氧化會引起類似比率之PRR結合的減少(參見圖1A)。
重要的是，與未結合之CLEC相比，結合物形成亦導致肽-CLEC結合物之PRR結合能力降低，如含甘露多醣之結合物以及所測試的不同石耳多醣、地衣多醣或大麥及燕麥-β-葡聚糖之結合物所示(參見圖1B)。
實驗表明，儘管石耳多醣尺寸較小且不存在β-(1,3)糖苷鍵(請注意：含有葡聚糖的β-(1,3)被描述為dectin-1的最佳配位體)，但線性β-(1,6)連接之β-D-葡聚糖石耳多醣可發揮最高的結合功效，無論氧化或結合。例如，含有石耳多醣之結合物保留了比基於地衣多醣的構築體高約3倍的結合力。
關於IC50值，根據圖1的結合結果顯示各種構築體與可溶性鼠類Fc-dectin-1a受體的結合。得到的IC50值為(圖1)： - 燕麥β-葡聚糖265：860µg/ml - 燕麥β-葡聚糖391：820µg/ml - 大麥β-葡聚糖229：145µg/ml - 地衣多醣(圖1E)：13µg/ml - 地衣多醣200%結合物(圖1E)：27µg/ml (即大約一半的未結合之地衣多醣) - β-葡聚糖229的結合至少比145µg/ml強30倍) - 石耳多醣結合物(圖1D)：11、14及15µg/ml (即大約一半的未結合之石耳多醣) - 石耳多醣BMPH結合物(圖1F)：80µg/ml(肽與石耳多醣的異雙官能連接子偶合)。
圖1A及圖1B進一步證明，藉由腙形成或藉由異雙官能連接子進行的肽結合同樣適用於WISIT結合物，因為兩種類型的結合物均保留了高的dectin-1結合功效。 實例 2 ：活體外暴露於石耳多醣後 DC 活化之測定
所提出之疫苗的一個重要功能是其在PRR結合及攝取後活化DC的能力。為證明基於CLEC之結合物不僅結合至PRR，且亦在其目標細胞(即DC)中發揮生物學功能，進行了DC活化實驗。
首先，根據已發表的方案，將小鼠骨髓細胞與mGM-CSF一起培育以生成BMDC，然後將此等GM-CSFDC暴露於肽-葡聚糖結合物PSeqID2+SeqID7+石耳多醣或等量的氧化但未結合之糖。在各情況下，結合物/糖各由500µg逐漸滴定至62.5µg/mL的各別糖。為了進行比較，強活化劑LPS被用作起始濃度為2ng/ml的對照組。重要的是，用於氧化及結合物形成的石耳多醣製劑亦含有少量LPS，因此，等效劑量的LPS被用來標準化此效應。隨後使用FACS分析(包括CD80及MHCII)評定DC的DC活化及成熟標記物的表現。 結果：
用SeqId2-SeqID7-石耳多醣結合物在活體外刺激的GM-CSFDC顯示CD80及MHCII的表現顯著增加(參見圖2)。其水平明顯高於結合物製劑中包含的等效劑量之LPS所觀測到的作用。相比之下，等量的氧化但未結合之糖引起的CD80表現略微降低，正如自製劑中的LPS水平所預期的，且與石耳多醣結合物相比，MHCII的誘導顯著降低。
總之，MHC-II的上調表明DC活化。此外，CD80的上調超過了相同量的LPS的預期，此現象強烈表明石耳多醣結合物對DC的成熟及活化有顯著貢獻(超出了單獨暴露於LPS所解釋的作用)。因此，實例1及2清楚地證明了石耳多醣疫苗的生物活性。 實例 3 ：藉由 DLS 測定粒子尺寸
已經進行了分析不同葡聚糖結合物之粒子尺寸/流體動力學半徑的單獨實驗。
對於DLS分析，分析了不同的肽-葡聚糖及肽-載體-葡聚糖結合物，且分別與非結合的石耳多醣進行了比較。所有分析均使用WYATT DynaPro PlateReader-II以一式三份的方式進行。獲得的結果表明對於所有測試的結合物，在低nm光譜中具有最大值的粒子尺寸分佈。 所測結合物：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 CLEC
SeqID2 SeqID7 石耳多醣(80%)
SeqID3 CRM197 石耳多醣(80%)
na na 未經氧化之石耳多醣
結果 ：
目前的分析表明用於該測定中的肽-石耳多醣結合物SeqID2+SeqID7+石耳多醣之平均主要顆粒流體動力學半徑(HDR)為約5 nm。在約60 nm處可偵測到較小的第二個峰表示調配物中存在極少量的聚集體(參見圖3A)。然而，大多數結合物製劑似乎以單體形式存在。單體而非交聯或聚集的結合物之此普遍性亦由單體石耳多醣(約20kDa)可在約5 nm處被偵測到(如對照組樣品所示，亦參見圖3C)之事實支持，該事實亦支持單體石耳多醣結合物之普遍性(假設單體石耳多醣的HDR為約5 nm)。如超過24小時的累積半徑分析所示，結合物之HDR亦很穩定，且不會再次聚集，此支持了單體結合物之普遍性。
為了表徵基於肽-載體-葡聚糖結合物之疫苗，本案分析了額外結合於石耳多醣的SeqID6+CRM197結合物。同樣地，DLS分析顯示平均HDR為11 nm，位於約75 nm的第二個較小的峰再次表明存在少量聚集體(參見圖3B)。由於CRM197之大小約為60kDa，因此11nm的輕微增加很可能反映了所得結合物分子量的增加。並未偵測到CRM結合物之顯著聚集或交聯，且24小時的累積半徑分析亦表明，結合物之HDR為穩定的，不會發生聚集。同樣地，此替代類型的基於CLEC之疫苗的DLS分析支持單體結合物之普遍性。
對照組樣品(即未經氧化之石耳多醣)顯示出更大的HDR，平均為約600 nm，並且另具有兩個分別位於5 nm及46 nm的較小峰(參見圖3C)。石耳多醣單體的HDR為約5 nm，與假定的20kD分子量非常吻合，可很容易地偵測到較大的聚集體，且大部分葡聚糖以大的、高分子量顆粒的形式存在。重要的是，超過24小時的累積半徑分析亦表明，與石耳多醣結合物相比，非結合的石耳多醣傾向於隨著時間的推移強烈聚集，引起大顆粒的普遍形成，此與各種文獻報導一致。
圖3描繪了此兩種結合物及未經氧化之石耳多醣對照的實例圖。
與此項技術中眾所周知的實例(例如：Wang等人，2019年；Jin等人，2018年)相比，本實例中獲得的結果進一步展示了迄今為止基於CLEC之結合物迄今為止的獨特特徵，即顯示出小(即，5-11 nm)，主要是單體糖基奈米顆粒，HDR遠小於150 nm，該尺寸通常被認為是免疫治療活性結合物疫苗的較佳尺寸。此主要是由於較大顆粒(包括全葡聚糖顆粒)的PRR結合及活化特性。已知較大的顆粒(＞150 nm至2-4 µm)能與其受體更有效地相互作用，且可啟動DC信號傳遞、活化、成熟及遷移至引流淋巴結，而小型的、甚至可溶的PRR-配位體被認為能夠與其受體結合，但會阻止隨後的DC活化(Goodridge等人,2011)。然而，此等資料連同實例1、2及3中描述的資料以及下文提供的其他實例首次證明基於單體β-葡聚糖的小且可溶的肽基葡糖-新結合物，例如：線性β(1,6)-β-D葡聚糖石耳多醣，作為骨架可有效地結合PRR (dectin-1)，活化相應的APC (如GM-CSFDC)且顯示出非常高的生物活性，其皮膚特異性方式的免疫原性亦顯著超越經典結合物疫苗的作用。 實例 4 ：不同 CLEC 疫苗的活體內比較
能夠結合至其DC受體(例如：dectin-1或ConA)的基於CLEC之疫苗在n=5Balb/c小鼠/組中重複施用後，測試了其誘導強烈及特異性免疫反應的能力。典型的實驗使用每劑量5µg淨肽含量的B細胞抗原決定基肽進行。
在第一組實驗中比較了三種不同的CLEC。在本實驗中，α突觸核蛋白衍生肽SeqID2或澱粉樣蛋白β42(Aβ42)衍生肽SeqID10及混雜的輔助性T細胞抗原決定基SeqID7藉由C端醯肼連接子與經氧化之石耳多醣素(20%氧化度)、甘露多醣(20%氧化度)或大麥β-葡聚糖(229kDa，20%氧化度)偶合。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 CLEC
SeqID2 SeqID7 石耳多醣(20%)
SeqID2 SeqID7 甘露多醣(20%
SeqID2 SeqID7 大麥β-葡聚糖(229kDa，20%)
SeqID2 SeqID7 石耳多醣(80%)
SeqID2 SeqID7 地衣多醣(245kDa, 200%
SeqID10 SeqID7 石耳多醣(80%)
SeqID10 SeqID7 地衣多醣(245kDa, 200%
動物(雌性Balb/c小鼠)每兩週接種一次的間隔接種疫苗3次(途徑：i.d.)，隨後使用第三次接種後兩週採集的小鼠血漿分析針對注射肽(即分別為SeqID2及SeqID10)的免疫反應。 結果：
如圖4A所示，所有三種CLEC疫苗(SeqID2+SeqID7+甘露多醣、SeqID2+SeqID7+石耳多醣(線性β(1,6)β-葡聚糖)及大麥SeqID2+SeqID7+β-葡聚糖(229kDa)均能夠誘導可偵測的免疫反應。有趣的是，使用基於大麥高分子量β-葡聚糖之疫苗進行免疫接種僅誘導非常低的抗肽反應(OD max/2效價約為1/100)。相比之下，基於石耳多醣之結合物可誘導平均效價約為1/11000之顯著更高的反應。與基於石耳多醣之結合物相比，基於甘露多醣之結合物顯示出約降低7倍的免疫原性，因為在該實驗中免疫接種後的平均效價達到約1/1500。
圖4B顯示了第二組實驗的結果，使用突觸核蛋白衍生肽SeqID2或澱粉樣蛋白β42(Aβ42)衍生肽SeqID10作為B細胞抗原決定基及T細胞抗原決定基SeqID7比較兩種不同變異體的葡聚糖基結合物的免疫原性。第一個變異體再次使用石耳多醣作為CLEC進行結合，第二個變異體係藉由使用線性β-(1,3)β-(1,4)-β-D葡聚糖―地衣多醣(ca245kDa)所產生。如圖4B所示，兩種變異體均可誘導針對注射肽之高效價免疫反應(即SeqID2/3(SeqID3=SeqID2適用於BSA偶合)及SeqID10/11(SeqID11=SeqID10適用於BSA偶合))。然而，肽-地衣多醣結合物在此等實驗中顯示出比肽-石耳多醣結合物顯著更低的免疫原性(在5μg劑量下抗肽效價高4-8倍)，此亦與實例1中所示的較低的dectin-1結合能力一致。此表明dectin-1在活體外的結合功效可直接與疫苗的活體內免疫原性及生物活性相關聯。此導致石耳多醣或其片段(即線性β(1,6)-β-D葡聚糖)被鑑定為本申請中提出的最有效的葡聚糖變異體。疫苗對不同的肽亦有功能，證明了此疫苗類型的平台潛力。 實例 5 ：肽石耳多醣結合物與未結合的肽疫苗的活體內比較
為了評估CLEC與肽免疫原的結合是否是誘導根據本發明之疫苗的優異免疫原性所必須的，本案進行了一組實驗，將兩種結合物(SeqID2+SeqID7+石耳多醣或SeqID2+SeqID7+甘露多醣)與包含所有成分的混合(沒有結合)製劑的疫苗進行比較(即，SeqID2及SeqID7分別加上非氧化石耳多醣或甘露多醣)。同樣地，n=5隻雌性Balb/c小鼠以每兩週一次的間隔進行皮內注射免疫接種三次，並使用第三次免疫接種兩週後採集的鼠血漿分析隨後針對注射肽(即SeqID3)的免疫反應。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 CLEC 結合
SeqID2 SeqID7 石耳多醣(20%) 是
SeqID2) SeqID7 甘露多醣(20%) 是
SeqID2 SeqID7 石耳多醣(未經氧化) 非結合；混合
SeqID2 SeqID7 甘露多醣(未經氧化) 非結合；混合
結果：
圖5顯示了三次免疫接種後可偵測到的抗肽(SeqID3)特異性免疫反應的比較。在此實驗中，SeqID2+SeqID7+石耳多醣結合物(20%氧化)能夠誘導高4倍於未偶合肽SeqID2、SeqID7及非氧化石耳多醣混合物(即1/12000對1/3000)的免疫反應。類似地，SeqID2+SeqID7+甘露多醣結合物(20%氧化)亦能更有效地誘導肽特異性免疫反應，而施用此等成分的混合物則較弱(1/7000對1/4000；增加1.75倍)。此等數據表明，需要將肽免疫原與活化的CLEC結合才能在活體內誘導強烈且可持續的免疫反應。 實例 6 ： SeqID5+SeqID7++ 石耳多醣及 SeqID2+ 或 Seq-7+ 石耳多醣結合物的活體內比較
為了評估基於CLEC之疫苗是否需要B細胞及T細胞抗原決定基來在活體內誘導可持續的抗B細胞抗原決定基特異性免疫反應，本案進行了一組實驗來比較三種結合物：SeqID5+SeqID7+石耳多醣、SeqID5+石耳多醣及SeqID7+石耳多醣。n=5隻雌性Balb/c小鼠以每兩週一次的間隔進行皮內注射免疫接種三次，隨後使用第三次免疫接種後兩週採集的鼠血漿分析針對注射肽(即SeqID6)的後續免疫反應。
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 CLEC
SeqID5 SeqID7 石耳多醣(80%)
SeqID5 n.a. 石耳多醣(80%)
n.a. SeqID7 石耳多醣(80%)
結果：
如圖6所示，在此實驗中，SeqID5+SeqID7+石耳多醣結合物(80%氧化)能夠誘導針對注射之肽部分(即α突觸核蛋白衍生肽SeqID6)的高特異性免疫反應，平均效價達到1/36000。藉由腙偶合反應偶合至石耳多醣的含有單獨的SeqID5或SeqID7的肽-石耳多醣結合物以每兩週一次的間隔進行免疫接種三次(途徑：i.d.)後，在SeqID5-石耳多醣(1/3000)的情況下可誘導低12倍的免疫反應，或沒有SeqID6特異性免疫反應(對於SeqID7-石耳多醣結合物，效價＜1/100，低於偵測極限)。
此等數據表明，需要將肽免疫原與活化的CLEC結合才能在活體內誘導強烈且可持續的免疫反應。然而，其亦表明，在沒有T細胞抗原決定基(例如：單獨的SeqID5)的情況下，石耳多醣與單個短B細胞抗原決定基的結合可在活體內誘導T細胞非依賴性B細胞反應，儘管效力顯著低於報導所述之含有T細胞及B細胞抗原決定基的CLEC結合物。 實例 7 ：肽 - 石耳多醣免疫後抗石耳多醣 / 葡聚糖免疫反應的活體內分析
抗CLEC抗體的分析對於根據本發明提出的CLEC疫苗的新穎性及功效在兩個層面上是重要的： 1)β-葡聚糖為各種真菌、地衣及植物細胞壁的主要成分，賦予細胞壁抵抗細胞內滲透壓的典型強度。因此，β-葡聚糖亦被認為是典型的微生物病原體相關分子模式(PAMP)，且是健康人類受試者中高效價循環天然抗體的主要目標。PAMP是許多病原體共有的常見且相對不變的分子結構，是免疫系統的強大活化劑。(Chiani等人 Vaccine 27 (2009) 513–519, Noss等人 Int Arch Allergy Immunol 2012;157:98–108, Dong等人 J Immunol 2014; 192:1302-1312, Ishibashi等人 FEMS Immunology and Medical Microbiology 44 (2005) 99–109, Harada等人 Biol Pharm Bull. 2003 Aug;26(8):1225-8))。針對β-(1,3)-及-β-(1,6)-葡聚糖的IgG可在正常人血清中找到，且β-(1,6)-葡聚糖似乎比β-(1-3)變異體為更強效的抗體。此外，β-(1-6)-β-葡聚糖部分已被確定為典型的微生物PAMP之一，其作為識別及攻擊免疫惡性腫瘤監測以及抵禦微生物入侵的焦點。石耳多醣是根據本發明之CLEC結合物的較佳葡聚糖骨架，其由線性β-(1-6)-β-葡聚糖部分構成，且若干研究小組已經報導過抗-石耳多醣免疫反應可在未接受過石耳多醣免疫的人類受試者的血漿中偵測到。因此，研究基於CLEC之疫苗活化抗石耳多醣免疫反應性的潛力至關重要。抗β-葡聚糖抗體可在活體內特異性地與肽-石耳多醣相互作用，並可藉由形成抗原-抗體複合體複合體引起快速消除，從而排除誘導有效的免疫反應。或者，免疫接種後之誘導/增強抗石耳多醣抗體反應亦可促進免疫原性，因為抗石耳多醣特異性IgG抗體與CLEC結合物的潛在交叉呈遞及APC的攝取亦可提高所施用疫苗的功效。
在此之前尚未有正式研究調查未經處理之小鼠中抗石耳多醣抗體的存在。然而，Ishibashi等人及Harada等人 可證明在未經處理之DBA/2小鼠的血清中存在針對可溶性硬化葡聚糖/β-葡聚糖(即1,3/1,6-β-葡聚糖)的β-葡聚糖IgG。
2)如前所述(例如：Torosantucci等人、Bromuro等人、Donadei等人、Liao等人)的CLEC-蛋白質結合物，例如CRM197-偶合昆布多醣、卡德蘭多醣或合成β(1,3)-β-D葡聚糖，可作為強力免疫原，不僅誘導高抗CRM197效價，且亦誘導高抗葡聚糖效價並防止真菌感染。因此，先前使用此類結合物的嘗試一直是聚焦在使用CLEC作為真正的疾病/真菌感染特異性免疫原，而不是如本申請中提出的將其用作載體及免疫學惰性骨架。
沿著此等思路，針對免疫接種前及重複免疫接種後的抗石耳多醣抗體的存在，分別開始了針對首次免疫及肽-CLEC結合物免疫Balb/c小鼠(n=5/組)血漿樣本的廣泛分析 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 CLEC 結合
SeqID2 SeqID7 石耳多醣(20%) 是
SeqID2 SeqID7 甘露多醣(20%) 是
SeqID2 SeqID7 石耳多醣(未經氧化) 非結合；混合
SeqID2 SeqID7 甘露多醣(未經氧化) 非結合；混合
結果：
因此，分析了來自接受肽-石耳多醣(SeqID2+SeqID7+石耳多醣(20%)及肽-甘露多醣(SeqID2+SeqID7+mannan(20%)免疫接種的動物的樣本(所有疫苗：4µgaSyn靶向肽/劑量)。為了控制目的，亦使用了接受由非結合肽及非氧化CLEC組成之疫苗施用的動物(即，SeqID2+SeqID7+非氧化石耳多醣，SeqID2+SeqID7+非氧化甘露多醣)。如圖7A所示，所分析的Balb/c動物顯示出針對石耳多醣/β(1,6)-β-D葡聚糖的預先存在的低水平免疫反應。所測試的兩種CLEC疫苗(SeqID2+SeqID7+石耳多醣(20%)及SeqID2+SeqID7+甘露多醣(20%))未能在活體內誘導針對葡聚糖骨架的強烈從頭免疫反應。相比之下，重複施用對照組中存在的未結合、未經氧化之石耳多醣(包含所有三種成分的混合物)藉由將針對石耳多醣的抗體水平提高18.5倍(與免疫接種前血漿相比)，導致了強烈的抗葡聚糖免疫反應的誘導。含有甘露多醣之結合物或混合物無法誘導抗石耳多醣效價，表明偵測到的抗葡聚糖反應具有特異性。抗石耳多醣抗體效價的動力學分析顯示其會隨著時間的推移穩定增加，在使用非偶合及未經氧化之石耳多醣進行免疫接種的動物中，第三次免疫接種後該效價出現強烈增加(參見圖7B)。使用逐漸增加的天然石耳多醣的競爭型ELISA亦證明了在包含混合成分的組中可偵測到的抗體反應的特異性(圖7C)。
總之，此等分析可證明：儘管在未經處理之的Balb/c小鼠中存在針對石耳多醣(IgG)的低水平自身反應性，但在使用各種CLEC結合物進行免疫接種後，並無法誘導或僅誘導非常低之疫苗接種依賴性的抗石耳多醣免疫反應性的增加。因此，根據本發明用作肽-CLEC結合物的CLEC使用根據本發明之新型疫苗設計確實是免疫學惰性的。此與先前公佈的結果形成強烈對比，因此構成了根據本發明之碳水化合物骨架(例如，β-葡聚糖或甘露多醣，尤其是石耳多醣骨架)的令人驚訝及具創造性的新特徵。
此外，預先存在的抗石耳多醣反應似乎並不排除對WISIT疫苗肽成分的免疫反應，因為兩個實驗的注射肽反應均顯示出高抗肽效價。 實例 8 ：葡聚糖結合物與 N- 或 C 端偶合的肽免疫原的免疫原性分析
為了評估用於偶合的連接子方向是否會干擾疫苗的免疫原性，本案製造了4種不同的候選疫苗：在該實驗中，α突觸核蛋白衍生肽SeqID1/2及SeqID4/5藉由N-或C端醯肼連接子偶合於氧化型石耳多醣(80%)。此外，4種疫苗中的每一種均攜載混雜的輔助性T細胞抗原決定基SeqID7，藉由C端醯肼連接子與CLEC骨架偶合。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 CLEC
SeqID1 SeqID7 石耳多醣(80%)
SeqID2 SeqID7 石耳多醣(80%)
SeqID4 SeqID7 石耳多醣(80%)
SeqID5 SeqID7 石耳多醣(80%)
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種3次疫苗(途徑：i.d.)，隨後使用第三次免疫接種後兩週採集的小鼠血漿，對針對注射肽(即SeqID3及SeqID6)以及針對目標蛋白(即重組α突觸核蛋白)的免疫反應進行了分析。 結果：
如圖8所示，使用N或C端偶合B細胞抗原決定基的所有4種CLEC疫苗均能夠誘導針對注射的肽部分(圖8A)及目標蛋白(α突觸核蛋白，圖8B)的強烈且高度特異性的免疫反應。引起關注地有趣的是，偶合方向對免疫原性的影響不同。例如，與C端偶合的SeqID2+SeqID7+CLEC相比，N端偶合的SeqID1+SeqID7+CLEC疫苗誘導的抗注射肽反應降低了7倍，針對重組aSyn的免疫反應降低了10倍。相比之下，C端偶合的SeqID5+SeqID7+CLEC疫苗與N端偶合的SeqID4+SeqID7+CLEC疫苗相比，分別誘導了低約4倍的注射肽反應，但抗aSyn反應相同。因此，可根據肽之特異性特徵改變偶合方向，而不影響高效價免疫反應的發展。
然而，如圖8所示，藉由改變免疫原性肽之偶合方向，可顯著增加針對目標蛋白的後續反應的特異性，因此可用於產生新的及前所未有的免疫反應： 例如：與目標蛋白相比，SeqID1疫苗接種導致針對肽之反應高出4.5倍，與SeqID2疫苗誘導的蛋白相比，抗肽反應高出3.3倍。
相比之下，與蛋白質相比，SeqID4疫苗誘導對肽之反應高出1.7倍，而SeqID5疫苗可逆轉此比例，引起與可偵測的注射肽反應相比高出2.5倍的蛋白質特異性反應。
總之，此等數據清楚地表明使用任一偶合方向之疫苗均具有生物活性且適用於該施用。其亦表明，偶合方向可用於根據要解決的肽及目標選擇特別較佳及前所未有的活性疫苗。 實例 9 ：使用不同的輔助性 T 細胞抗原決定基分析 CLEC 結合物的免疫原性
在此實例中，將含有非天然泛DR抗原決定基(含有人工組織蛋白酶裂解位點的PADRE，SeqID7)的基於CLEC之疫苗的免疫原性與其他眾所周知的輔助性T細胞抗原決定基進行了比較。為此，本案選擇了若干混雜的抗原決定基，此等抗原決定基要麼使用一種新的、人工包含的組織蛋白酶L裂解位點進行改造，以便在APCs/DCs中受體介導的攝取後有效地釋放細胞內/溶酶體，要麼保持不變。選擇的抗原決定基包括：
肽 序列 抗原決定基 組織蛋白酶 L 裂解位點
SeqID7 AKFVAAWTLKAAANRRA-(NH-NH 2) PADRE +
SeqID22 AKFVAAWTLKAAA-(NH-NH 2) PADRE -
SeqID23 KAAAVKAAFWTAL-NRRA-(NH-NH 2) 人工 +
SeqID24 DSETADNLEKTVAALSILPGHGC-(NH-NH 2) 白喉 -
SeqID25 DSETADNLEKTVAALSILPGHGCNRRA-(NH-NH 2) 白喉 +
SeqID26 ISITEIKGVIVHRIETILF-(NH-NH 2) 麻疹病毒融合蛋白 -
SeqID27 ISITEIKGVIVHRIETILFNRRA-(NH-NH 2) 麻疹病毒融合蛋白 +
SeqID28 ISQAVHAAHAEINEAGR-(NH-NH 2) 雞OVA (323-339) -
SeqID29 ISQAVHAAHAEINEAGRNRRA-(NH-NH 2) 雞OVA (323-339) +
為了評估攜載此等輔助性T細胞抗原決定基肽之肽疫苗是否能在重複免疫接種後產生高免疫反應，且能誘導比傳統結合疫苗更優秀的免疫反應，本實驗測試了10種不同的候選疫苗：
在本實驗中，aSyn衍生的肽SeqID2被用作肽-CLEC疫苗(即：SeqID2，與不同的輔助性T細胞抗原決定基結合，藉由C端醯肼連接子偶合於經氧化之石耳多醣(80%;))或習知使用含有用於與GMBS活化的KLH偶合的C端半胱胺酸的SeqID3生成肽結合物。 所用疫苗：
疫苗 B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
1 SeqID2 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
2 SeqID2 SeqID22) 石耳多醣(80%) n.a i.d.
3 SeqID2 SeqID23 石耳多醣(80%) n.a i.d.
4 SeqID2 SeqID24 石耳多醣(80%) n.a i.d.
5 SeqID2 SeqID25 石耳多醣(80%) n.a i.d.
6 SeqID2 SeqID26 石耳多醣(80%) n.a i.d.
7 SeqID2 SeqID27 石耳多醣(80%) n.a i.d.
8 SeqID2 SeqID28 石耳多醣(80%) n.a i.d.
9 SeqID2 SeqID29 石耳多醣(80%) n.a i.d.
10 SeqID3 KLH n.a Alhydrogel s.c.
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種疫苗3次(所有疫苗：5μg aSyn靶向肽/劑量；途徑：基於CLEC之疫苗用i.d.，基於KLH之疫苗用s.c. (以Alhydrogel作為佐劑))，隨後使用第三次免疫接種後兩週採集的鼠血漿對針對注射肽(即SeqID3)以及針對目標蛋白(即重組人類α突觸核蛋白)的免疫反應進行了分析。 結果：
如圖9所示，所有使用不同輔助性T細胞抗原決定基的9種CLEC疫苗及KLH結合物均能夠誘導針對注射的肽部分(SeqID3，圖9A)及目標蛋白(重組α突觸核蛋白，圖9B)的強烈及特異性免疫反應。
所有輔助性T抗原決定基均可誘導與習知SeqID3+KLH結合物相似或更優秀的抗肽效價。例如，疫苗1(包含與石耳多醣偶合的SeqID2及SeqID7)可誘導比KLH對照組高60%的反應，而疫苗8(包含SeqID28，一種眾所周知的輔助性T抗原決定基，特別適用於Balb/c動物、SeqID2及石耳多醣)可誘導比對照組高5.5倍的反應。即使是混雜的輔助性T抗原決定基SeqID24(源自白喉毒素，WO2019/21355A1中揭示的Balb/c動物的弱輔助性T抗原決定基)亦能夠誘導可持續的免疫反應，儘管其較KLH對照組弱。
類似地，所有輔助性T抗原決定基均可誘導類似於或優於傳統SeqID3-KLH結合物的抗蛋白效價。重要的是，例如，疫苗1(包含與石耳多醣偶合的SeqID2及SeqID7)可誘導比KLH對照組高2.5倍的反應，而疫苗8(包含SeqID28，一種眾所周知的輔助性T抗原決定基，特別適合應用在Balb/c動物中、SeqID2及石耳多醣)可誘導比對照組高3倍的反應，再次支持了根據本發明之基於CLEC之疫苗可誘導優異的抗靶反應的事實。
該實例還表明，與習知疫苗及沒有此人工序列的基於CLEC之疫苗相比，將額外的組織蛋白酶L裂解位點引入已知的輔助性T細胞抗原決定基會引起更有效的免疫反應誘導。
例如，SeqID25是包含裂解位點的弱輔助性T抗原決定基SeqID24的修飾變異體，與未修飾的肽(疫苗5 vs. 疫苗4) 相比，SeqID25可誘導高7.5倍的抗肽反應及高3.6倍的抗蛋白反應。此外，與KLH對照相比，此改變亦引起抗蛋白效價增加40%。SeqID27是SeqID26的組織蛋白酶L裂解位點的修飾變異體(一種源自麻疹病毒融合蛋白的抗原決定基，揭示於WO2019/21355A1) ，其與SeqID26-CLEC疫苗相比亦可顯著增加效價，抗肽反應增加1.8倍，抗蛋白效價增加3.2倍(即疫苗7 vs. 疫苗6)。與KLH對照組相比，疫苗7還誘導了2.2倍高的抗肽反應及1.6倍高的抗蛋白反應。與未修飾的變異體(例如：SeqID22)相比，基於SeqID7之CLEC疫苗亦可誘導更高的抗蛋白效價(增加20%)，且與KLH對照組相比，此兩種肽分別導致大約兩倍的抗SeqID2肽及抗aSyn效價。
添加組織蛋白酶裂解位點引起具有額外N的肽變異體(例如：在裂解時釋放的C端。例如：SeqID22，PADRE，作為AKFVAAWTLKAAA釋放，而對於SeqID7而言，修飾的PADRE作為AKFVAAWTLKAAA-N釋放)的形成。此N亦可能對進一步加工及MHCII呈遞產生負面影響，從而降低相應肽之功效。此現象可在非常強的OVA衍生抗原決定基SeqID28及SeqID29的實例中看到。未修飾的肽誘導非常高的免疫反應而與未修飾的變異體相比，修飾的變異體pep17誘導之抗肽效價減少75%及抗蛋白效價減少98%。 實例 10 ：使用載體蛋白作為輔助性 T 細胞抗原決定基的 CLEC 結合物之免疫原性分析： KLH
在此實例中，將含有眾所周知的載體蛋白KLH的基於CLEC之結合物疫苗的免疫原性與習知KLH疫苗進行了比較。為此，本實驗選擇了兩個aSyn衍生抗原決定基(SeqID3及SeqID6)與GMBS活化之KLH偶合。隨後，使用BPMH交聯劑將Pep-KLH結合物偶合於氧化石耳多醣的活性醛上，形成基於CLEC之結合物疫苗，其中KLH作為輔助性T細胞抗原決定基的來源，以誘導可持續的免疫反應。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID3 KLH 石耳多醣(140%) n.a i.d.
SeqID3 KLH n.a n.a i.d
SeqID3 KLH n.a Alhydrogel s.c.
SeqID6 KLH 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID6 KLH n.a n.a i.d.
SeqID6 KLH n.a Alhydrogel s.c.
動物(雌性Balb/c小鼠) 以每兩週一次的間隔接種疫苗3次(所有疫苗：20µg aSyn靶向肽/劑量；途徑：基於CLEC之疫苗及無佐劑之基於KLH之疫苗用i.d.；用Alhydrogel作為佐劑之基於KLH疫苗用s.c.)且隨後使用第三次免疫接種後兩週採集的鼠類血漿對針對注射肽(即SeqID3及SeqID6)以及目標蛋白(即重組人類α突觸核蛋白)的免疫反應進行了分析。 結果：
如圖10A所示，使用KLH作為輔助性T抗原決定基之來源的所有6種疫苗均能夠誘導針對注射的肽部分(SeqID3及SeqID6)及目標蛋白：重組α突觸核蛋白的強烈及特異性免疫反應。
KLH結合物之CLEC修飾引起分別使用SeqID3及SeqID6兩種肽之高度優越的免疫反應。SeqID3+KLH+石耳多醣能夠誘導比Alhydrogel作為佐劑的SeqID3+KLH高2.3倍的抗肽反應，且獲得較皮內施用之不含佐劑的SeqID3+KLH高14倍的反應。類似地，抗蛋白效價亦增加了8.5倍(與Alhydrogel作為佐劑的SeqID3+KLH相比)，與無佐劑材料相比增加了17倍。SeqID6+KLH+石耳多醣的免疫反應效果亦比帶佐劑的SeqID6+KLH高2(在注射肽方面)至4.6倍(在α-突觸核蛋白方面)，而免疫原性則比無佐劑的SeqID6+KLH疫苗高8.7(在注射肽方面)及11倍(在α-突觸核蛋白方面)。
除了經CLEC修飾之疫苗的免疫原性普遍增加外，實驗結果亦表明，根據本發明之CLEC修飾會造成與目標分子(即蛋白質)結合的誘導抗體的相對量顯著增加，從而顯著增加目標特異性的隨後免疫反應。因此，對於SeqID3+KLH+石耳多醣誘導之反應，其偵測α突觸核蛋白的抗體的相對量(即總抗注射肽效價與抗α突觸核蛋白特異性效價的比率)比佐劑化的SeqID3+KLH高3.7倍，在SeqID6+KLH+石耳多醣之情況下，其較佐劑化的結合物高2.2倍。
在第二組實驗中，比較了所使用的相同疫苗(所有疫苗：5µg aSyn靶向肽/劑量；途徑：基於CLEC之疫苗用i.d.；以Alhydrogel作為佐劑的基於KLH之疫苗用s.c.)的誘導抗載體特異性抗體反應的能力。正如預期地，傳統的基於SeqID3+及SeqID6+KLH之疫苗能夠誘導高抗KLH效價(SeqID3+KLH：1/2100及SeqID6+KLH：1/7700)，而基於CLEC之SeqID3+KLH+石耳多醣及SeqID6+KLH+石耳多醣疫苗基本上無法誘導持續的抗載體抗體，所獲得的效價接近偵測極限，SeqID3+KLH+石耳多醣為1/150，而SeqID6+KLH+石耳多醣小於1/100，因此產生了一種新穎但未描述過的肽結合物疫苗之最佳化策略，以提高目標特異性效價，同時減少不需要的抗載體反應。 實例 11 ：使用載體蛋白作為輔助性 T 細胞抗原決定基的 CLEC 結合物之免疫原性分析： CRM197
在本實例中，將含有眾所周知的載體蛋白CRM197的基於CLEC之結合物疫苗的免疫原性與習知CRM197疫苗進行了比較。為此，α突觸核蛋白衍生抗原決定基SeqID6與順丁烯二醯亞胺活化之CRM197偶合，隨後，使用異雙官能連接子BPMH將SeqID6+CRM197結合物與活化之石耳多醣偶合，形成基於CLEC之結合物疫苗，其中CRM197作為輔助性T細胞抗原決定基的來源，以誘導可持續的免疫反應。或者，SeqID5-(NH-NH2；SeqID5)及CRM197獨立地與活化之石耳多醣偶合。此步驟係藉由SeqID5C端的醯肼及CRM197中存在的溶素與活化之石耳多醣上的活性醛反應來完成的。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC CLEC 偶合 佐劑 途徑
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) 呈結合物 n.a i.d.
SeqID5 CRM197 石耳多醣(80%) 獨立 n.a i.d.
SeqID6 CRM197 n.a n.a Alhydrogel s.c.
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種疫苗3次(所有疫苗：20µg α突觸核蛋白靶向肽/劑量；途徑：i.d.用於基於CLEC之疫苗，s.c.用於以Alhydrogel作為佐劑的基於CRM197之疫苗)且使用第三次免疫接種後兩週採集的鼠類血漿對針對注射肽(即SeqID6)以及目標蛋白(即重組人類α突觸核蛋白及α突觸核蛋白纖維)的後續免疫反應進行了分析。 結果：
如圖11A所示，使用CRM197作為輔助性T抗原決定基之來源的所有3種疫苗均能夠誘導針對注射的肽部分(SeqID6)及目標蛋白：重組α突觸核蛋白的強烈及特異性免疫反應。
同樣地，CRM197結合物之CLEC修飾引起了非常出色的免疫反應。SeqID6+CRM197+石耳多醣能夠誘導比Alhydrogel作為佐劑的SeqID6+CRM197高28倍的抗肽反應。類似地，針對重組aSyn的抗蛋白效價亦增加了15倍(與Alhydrogel作為佐劑的SeqID6+CRM197相比)，針對α突觸核蛋白聚集形式(α突觸核蛋白纖維)的效價增加了11倍。藉由將SeqID5及CRM197獨立偶合於石耳多醣產生之疫苗亦比習知的用Alhydrogel作為佐劑的SeqID6+CRM197誘導了1.7倍的高注射肽效價，對重組α突觸核蛋白的反應性亦增加了6.6倍，抗絲反應增加了4.25倍。
抗載體特異性抗體反應的比較表明，傳統的基於SeqID6+CRM197之疫苗能夠誘導高抗CRM197效價(1/6600)，而基於CLEC之SeqID6+CRM197+石耳多醣疫苗基本上不能誘導持續的抗載體抗體。獲得的效價接近偵測極限，SeqID6+CRM197+石耳多醣小於1/100。
因此，本實驗表明，習知肽-蛋白質結合物之CLEC修飾顯著損害了抗載體反應的發展，且造成隨後免疫反應的目標特異性大幅增強，為最佳化目前以KLH、CRM197等載體蛋白為基礎的先進技術結合物疫苗提供了前所未有的新策略。
CRM197及SeqID6與石耳多醣的獨立偶合引起針對CRM197上存在的B細胞抗原決定基的可持續反應，儘管其偵測率低於傳統的非CLEC修飾結合物(效價約1/400)。此表明根據本發明之CLEC骨架亦適合提供來自CLEC偶合免疫原性蛋白的B細胞抗原決定基以用作疫苗。 實例 12 ：活體內由基於 CLEC 之疫苗引發的免疫反應的選擇性分析
突觸前蛋白aSyn的聚集被認為是如帕金森氏症等突觸核蛋白病的主要病理元兇，而單體的、非聚集的aSyn具有重要的神經元功能。因此，咸信對於突觸核蛋白病的治療，例如藉由主動或被動免疫療法，以減少/移除聚集的aSyn而不影響存在的可用的非聚集分子庫是至關重要的。
為了進一步表徵與習知肽載體疫苗(即SeqID3+KLH及SeqID6+CRM197)相比，包含aSyn靶向肽SeqID2及SeqID3以及SeqID5及SeqID6的基於CLEC之疫苗引起的免疫反應，本實例進行了一組實驗分析隨後的免疫反應對兩種不同形式的突觸前蛋白aSyn的選擇性：非聚集的，主要是單體aSyn以及聚集的aSyn纖維。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID2 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID3 KLH 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID3 KLH n.a Alhydrogel s.c.
SeqID5 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID6 CRM197 n.a Alhydrogel s.c.
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種疫苗3次(所有疫苗：20µg aSyn靶向肽/劑量；途徑：i.d.用於基於CLEC之疫苗，s.c.用於以Alhydrogel作為佐劑的基於KLH及CRM197之疫苗)，使用第三次免疫接種後兩週採集的小鼠類血漿分析了隨後針對目標蛋白(即重組人類α突觸核蛋白及aSyn纖維)的免疫反應。對血漿樣品進行aSyn特異性抑制ELISA，且測定IC50值。 結果：
簡言之，與傳統的肽結合物疫苗(即SeqID3+KLH及SeqID6+CRM，參見圖12)相比，本實驗中使用的所有基於CLEC之結合物均表現出優異的免疫原性及α突觸核蛋白聚集特異性目標選擇性。
與單體/重組aSyn相比，習知肽結合物疫苗可誘導對aSyn聚集體(即，纖維)的選擇性略有增加的抗體反應。與重組aSyn相比，以Alhydrogel為佐劑的SeqID3+KLH對aSyn聚集體的選擇性提高了9倍。與主要為單體的重組aSyn相比，以Alhydrogel為佐劑的SeqID6+CRM197誘導選擇性較低的免疫反應，針對聚集體的選擇性結合達3.5倍。
相比之下，與KLH或CRM197結合物疫苗相比，由基於CLEC之肽結合物疫苗誘導之抗體的特徵在於選擇性結合提高了數倍。SeqID2+SeqID7+石耳多醣及SeqID5+SeqID7+石耳多醣誘導之血漿分別顯示大約高97倍(即比對照疫苗SeqID3+KLH、Alhydrogel高14倍)及高50倍(即比對照疫苗SeqID6+CRM、Alhydrogel高14倍)的聚集選擇性。SeqID3+KLH+石耳多醣及SeqID6+CRM197+石耳多醣對aSyn聚合體的選擇性分別達40倍(即比SeqID3+KLH高5倍)及50倍(即比SeqID6+CRM高14倍)。
因此，實驗表明，肽結合物以及肽-蛋白質結合物之CLEC修飾引起隨後免疫反應的目標特異性大大增強，為最佳化目前先進技術結合物疫苗提供了前所未有的新策略。 實例 13 ：由基於 CLEC 之疫苗引發的免疫反應之 抗體分子與抗原的 親和力 (avidity) 及 單一抗原結合區段與抗原的 親和力 (affinity) 分析
為了進一步表徵與習知肽載體疫苗(即SeqID3+KLH及SeqID6+CRM197)相比，包含aSyn靶向肽SeqID2、SeqID3、SeqID5及SeqID6的基於CLEC之疫苗引起的免疫反應，本實例進行了一組實驗分析抗體分子整體及單一抗原結合區段對aSyn之親和力。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID2 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID3 KLH 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID3 KLH n.a Alhydrogel s.c.
SeqID5 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID6 CRM197 n.a Alhydrogel s.c.
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種疫苗3次(所有疫苗：20µg aSyn靶向肽/劑量；途徑：i.d.用於基於CLEC之疫苗，s.c.用於以Alhydrogel作為佐劑的基於KLH及CRM197之疫苗)，且使用每次免疫後兩週採集的鼠類血漿分析了針對目標蛋白(即重組人aSyn及aSyn纖維)的免疫反應。為了確定誘導之抗體分子整體對重組aSyn之親和力，使用標準ELISA測定的變體，其中含有與抗原結合的抗體的複製孔暴露於逐漸增加濃度的離液硫氰酸根離子。對硫氰酸鹽洗脫的抗性用作抗體分子整體親和力之量度，且表示有效抗體結合的50%的一指數(抗體分子整體親和力指數)用於比較血漿樣品(處理組之間及時間點之間)。
此外，亦藉由aSyn競爭型ELISA測定最後一次免疫後2週的抗體對aSyn纖維的kD值(抗體單一抗原結合區段對aSyn纖維之親和力)。 結果：
如圖13所示，在比較第二次免疫接種(T2)後兩週或第三次免疫接種後兩週獲得的免疫樣品時(抗體分子整體之親和力成熟(AM，比較T2及T3樣品的IC 50值：1.1))，習知的SeqID3+KLH結合物(以Alhydrogel作為佐劑)與aSyn的結合僅表現出有限的親和力成熟。相比之下，基於CLEC之疫苗如SeqID2+SeqID7+石耳多醣可誘導抗aSyn反應的強烈成熟，如2.2的親和力指數(AI)所示，與T3樣品對α突觸核蛋白之親和力的強烈增加相關。與單獨使用SeqID3+KLH相比，由接受SeqID3+KLH+石耳多醣免疫接種的動物身上獲得的樣品亦顯示出顯著更高之親和力及略微增加的成熟度。
類似地，與SeqID6+CRM197基準疫苗相比，SeqID5+SeqID7+石耳多醣及SeqID6+CRM197+石耳多醣疫苗誘導的抗體分子整體對aSyn蛋白所誘導的免疫反應之親和力亦顯著增加(在T3時分析；即需要高3-3.8倍的離液鹽水平才能減少結合)，且單一抗原結合區段的親和力成熟度在分別比較T2及T3值時亦有所增加。比較T2及T3時，SeqID6+CRM197沒有引起抗體分子整體對aSyn之親和力增加，而兩種基於CLEC之疫苗則引起aSyn特異性結合的強烈增加。
由基於CLEC之疫苗以及習知基準疫苗引發的免疫反應之aSyn纖維k D值的定量實驗表明，基於CLEC之疫苗誘導之抗體對aSyn的總體親和力顯著增加(參見圖14)。SeqID2+SeqID7+石耳多醣及SeqID3+KLH+石耳多醣結合物顯示出比以Alhydrogel作為佐劑的基準疫苗SeqID3+KLH高6-9倍之親和力(即，Kd：110nM及160nM，與1mM的k D相比)。SeqID5+SeqID7+石耳多醣及SeqID6+CRM+石耳多醣結合物顯示出比以Alhydrogel作為佐劑的基準對照組SeqID6+CRM197高12-15倍的Kd值(即Kd：50nM及60nM，與750nM的k D相比為750nM)。
因此，本實驗表明肽結合物以及肽-蛋白質結合物之CLEC修飾造成隨後免疫反應的目標特異性及親和力大大增強，提供了一種前所未有的新策略來最佳化目前先進技術的結合物疫苗。 實例 14 ：由基於 CLEC 之疫苗引發的免疫反應的活體外功能分析
為了分析由基於CLEC之疫苗(包含aSyn靶向肽SeqID2/3及SeqID5/6)引發的aSyn特異性抗體是否具有生物活性，本實例進行了一組實驗，分析了抗體在活體外抑制aSyn聚集的能力。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqId2 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID3 KLH n.a Alhydrogel s.c.
SeqID5 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID6 CRM197 n.a Alhydrogel s.c.
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種疫苗3次(所有疫苗：20µg aSyn靶向肽/劑量；途徑：i.d.用於基於CLEC之疫苗，s.c.用於以Alhydrogel作為佐劑的基於KLH及CRM197之疫苗)。並對每次免疫後兩週採集的鼠類血漿樣品以及其相應的對照組樣品(例如：非aSyn結合抗體或免疫前獲得的免疫前血漿)的活體外聚集抑制能力進行分析。 結果：
如圖15A所示，免疫前自動物身上提取的對照組抗體或血漿對aSyn的聚集動力學沒有顯著影響，證實了該測定的特異性。習知的SeqID3+KLH結合物(以Alhydrogel作為佐劑)誘導之抗體能夠顯著減少aSyn聚集，如斜率值降低40%所示(僅aSyn單體：100%；KLH.60%)。SeqID2+SeqID7+石耳多醣疫苗誘導之抗體強烈地抑制aSyn聚集，如斜率值降低85%所示(僅aSyn單體：100%；CLEC：15%)，表明與經典疫苗誘導之抗體相比，其抑制能力顯著更高。
基於SeqID5-SeqID7-石耳多醣及SeqID6+CRM+石耳多醣之疫苗誘導的抗體顯示對自重組aSyn(低含量的聚集體)開始的聚集體形成有86-92%的抑制作用，以預形成之原纖維開始的聚集體(=真正的聚集體) 形成有67-82%的抑制作用，而以Alhydrogel為佐劑的基準疫苗SeqID6+CRM所誘導之抗體對上述兩聚集體形成的抑制作用分別為68%及57%(參見圖15B)。 實例 15 ：分析免疫途徑對由基於 CLEC 之疫苗引發的免疫反應的影響
本實例進行了一系列免疫接種以比較i.d.給藥與替代途徑，包括皮下(s.c.)及肌肉內(i.m.)。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID2 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID2 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a s.c.
SeqID2 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.m
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種3次疫苗(所有疫苗：1µg、5µg及20µgaSyn靶向肽/劑量)，使用第三次免疫接種後兩週採集的鼠血漿對隨後針對注射的肽及目標蛋白(即重組人類α突觸核蛋白及aSyn絲)產生的免疫反應進行了分析。 結果：
表1及表2以及圖16顯示，藉由肌肉內或皮下途徑施用的SeqID2+SeqID7+石耳多醣疫苗可誘導針對注射肽(圖16A)及抗aSyn反應(圖16B)的高免疫反應。在所有測試劑量下，所達到的最大效價明顯低於i.d.施用後的效價。s.c.施用顯示出與i.d.相似的劑量反應行為，而i.m.在5及20µg之間沒有顯示顯著差異，表明在此等劑量/施用體積達到飽和。針對單體及聚集的aSyn的反應性亦分別獲得了類似的結果。此等結果表明，不同於其他途徑/組織，本發明所呈現的CLEC骨架對於施用於皮膚具有高選擇性。
1µg 5µg 20µg
i.d. 16.000 83.000 140.000
s.c. 1000 2.000 12.000
i.m. 4.000 16.000 15.000
表1：藉由不同途徑應用WISIT疫苗後抗SeqID2/3誘導的抗體反應
1µg 5µg 20µg
i.d. 2.000 5.000 10.000
s.c. 100 1.000 4.000
i.m. 2.000 2.000 5.000
表2：藉由不同途徑應用WISIT疫苗後抗aSyn誘導的抗體反應 實例 16 ：使用載體蛋白作為輔助性 T 細胞抗原決定基的 CLEC 結合物之免疫原性分析：不同的結合物 /CLEC 比率
在此實例中，比較了基於CLEC之結合物疫苗的免疫原性，該疫苗含有眾所周知的載體蛋白CRM197，且使用不同的肽-CRM/CLEC比率。為此，aSyn衍生抗原決定基SeqID6與順丁烯二醯亞胺活化之CRM197偶合，隨後，SeqID6+CRM197結合物藉由異雙官能連接子BPMH以不同的w/w比率與活化之石耳多醣偶合，形成基於CLEC之結合物疫苗，其中CRM197作為輔助性T細胞抗原決定基的來源，以誘導可持續的免疫反應。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 比率 (w/w) 佐劑 途徑
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) 1/1 n.a i.d.
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) 1/2.5 n.a i.d.
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) 1/5 n.a i.d.
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) 1/10 n.a i.d.
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) 1/20 n.a i.d.
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種3次疫苗(所有疫苗：5μg aSyn靶向肽/劑量；途徑：基於CLEC之疫苗用i.d.)且使用第三次免疫接種後兩週採集的鼠類血漿對針對注射肽(即，SeqID6)、針對目標蛋白(即重組人類α突觸核蛋白)以及針對aSyn纖維的免疫反應進行了分析。 結果：
如圖17所示，使用CRM197作為輔助性T抗原決定基之來源的所有5種疫苗均能夠誘導針對注射的肽部分(SeqID6)及目標蛋白：重組α突觸核蛋白的強烈及特異性免疫反應。
CRM197結合物之CLEC修飾引起了高效的免疫反應，本實例測試了所有w/w結合物/CLEC比率。與測試的其他變體相比，SeqID6+CRM197+石耳多醣(w/w 1/10)提供了最高的抗-aSyn特異性免疫反應。因此，具有中/高之結合物/CLEC比率的SeqID6+CRM197結合物特別適合誘導最佳免疫反應(例如：1/5、1/10及1/20)。
因此，該實驗表明，習知肽-蛋白質結合物之CLEC修飾引起隨後的免疫反應具有很強的目標特異性，從而提供了一種前所未有的新策略來最佳化構築在載體蛋白(如KLH、CRM197或其他蛋白)上的目前先進技術結合物疫苗。 實例 17 ：使用載體蛋白作為輔助性 T 細胞抗原決定基的 CLEC 結合物及肽結合物的免疫原性分析 -aSynN 端 (aa1-10)
在該實例中，評估了與使用最先進的載體蛋白作為T細胞抗原決定基來源的相應肽結合物相比，根據本發明之基於CLEC之結合物疫苗是否能夠誘導針對aSyn聚集體的更好的免疫反應。
因此，開始了一組比較兩種結合物的實驗，此兩種結合物均含有建議適合作為aSyn靶向抗原決定基的一抗原決定基。實驗可證明針對注射的肽及aSyn蛋白所引發的免疫反應，以及隨後針對兩種不同形式的突觸前蛋白aSyn(非聚集的、主要是單體的aSyn以及聚集的aSyn細絲)引發的免疫反應的選擇性。
例如，Weihofen等人(2019，aa1-10作為Cinpanemab的抗原決定基)及WO2016/062720(aa1-8作為基於VLP的免疫治療中的抗原決定基)表明源自aa1-10位置的N端aSyn序列作為aSyn靶向免疫治療的潛在合適抗原決定基。為了評估CLEC修飾是否確實會產生更好的免疫反應，因此將含有aSyn序列aa1-8(SeqID12+SeqID7+石耳多醣)的基於CLEC之疫苗與相應的習知肽-KLH疫苗(用Alum作為佐劑之SeqID13+KLH)進行了比較。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID12 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID13 KLH na Alum i.d.
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種疫苗3次(所有疫苗：5μg aSyn靶向肽/劑量；途徑：基於CLEC之疫苗用i.d.，為以Alhydrogel作為佐劑的基於KLH之疫苗用s.c.)且藉由ELISA及EC50值測定針對注射肽及目標蛋白的隨後的免疫反應。此外，為了評估免疫反應的選擇性，對血漿樣品進行aSyn特異性抑制ELISA，並表示為最大結合百分比。 結果：
與習知肽-結合物疫苗(即，SeqID13+KLH，參見圖18A)相比，本實驗中使用的靶向基於CLEC之結合物疫苗(SeqID12+SeqID7+石耳多醣)展示了針對aSyn蛋白的優異免疫原性。作為比較組，基於CLEC之疫苗誘導抗aSyn效價增加1.8倍，並伴隨抗肽與抗蛋白質反應的比率增加3倍。此有力地支持了本發明之教示，即CLEC修飾引起與類似的習知疫苗相比更加優異的免疫反應。
此外，與聚集體(即細絲，參見圖18B)相比，習知肽KLH偶合疫苗誘導對aSyn單體的選擇性大大增加(約10倍)的抗體反應。與此發現相反且非常令人驚訝的是，基於CLEC之結合物引起完全不同的選擇性：與重組aSyn相比，SeqID12+SeqID7+石耳多醣誘導的抗體對aSyn聚集體的選擇性顯著地提高了約10倍，從而完全改變了抗體誘導的概況(參見圖18B)。
因此，本實驗表明，應用aSyn aa1-8的習知肽疫苗較不適合在活體內產生有效及具選擇性的免疫反應，表明該抗原決定基不適合聚集選擇性免疫療法。重要的是，實驗結果還表明肽結合物的CLEC修飾引起隨後免疫反應的目標特異性大大增強以及對聚集體的選擇性發生變化，因此提供了一種前所未有的靶向aSyn之結合物疫苗。 實例 18 ：使用載體蛋白作為輔助性 T 細胞抗原決定基的 CLEC 結合物及肽結合物的免疫原性分析 -aSyn aa100-108
在此，本案進行了一組比較兩種結合物的實驗，該兩種結合物均含有建議適合作為aSyn靶向抗原決定基的抗原決定基，藉由分析針對注射的肽及aSyn蛋白所引發的免疫反應以及隨後針對兩種不同形式的突觸前蛋白aSyn (非聚集的，主要是單體aSyn以及聚集的aSyn細絲)引發的免疫反應的選擇性來比較兩種結合物。
例如，WO2011/020133及WO2016/062720建議將源自aa100-108/109位置的aSyn序列(作為天然序列或模擬抗原決定基，即100-108)作為潛在適合用於aSyn靶向免疫療法的抗原決定基。為了評估CLEC修飾是否確實會使用該抗原決定基區域產生更好的免疫反應，因此將含有aSyn aa100-108(SeqID16+SeqID7+石耳多醣)的基於CLEC之疫苗與相應的習知肽-KLH疫苗(用Alum作為佐劑之SeqID17+KLH)進行了比較)。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID16 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID17 KLH na Alum i.d.
動物(雌性Balb/c小鼠)每兩週接種一次疫苗3次(所有疫苗：5μg aSyn靶向肽/劑量；途徑：基於CLEC之疫苗用i.d.，為以Alhydrogel作為佐劑的基於KLH之疫苗用s.c.)且藉由ELISA及EC50值測定針對注射肽及目標蛋白的隨後的免疫反應。此外，為了評估免疫反應的選擇性，對血漿樣品進行aSyn特異性抑制ELISA，並表示為最大結合百分比。 結果：
本實驗中使用的基於CLEC的aSyn靶向結合疫苗(SeqID16+SeqID7+石耳多醣)展示了整體非常低的抗aSyn蛋白反應，與習知肽-結合疫苗(即，SeqID17+KLH，參見圖19A)相比亦較低。與基於CLEC之疫苗相比，習知疫苗誘導以抗aSyn效價增加2.1倍為特徵的免疫反應，但同時抗肽/抗蛋白效價降低2倍。後一發現支持本發明之教示，即CLEC修飾引起更好的抗目標蛋白反應，即使在與類似的習知疫苗相比總體免疫原性較低的情況下亦是如此。
此外，兩種疫苗，即習知肽結合物及基於CLEC之疫苗，均不太適用於誘導聚集的選擇性免疫反應，參見圖19B)。因此，所提供的實驗表明，靶向aa100-108區域的基於CLEC的肽疫苗及習知肽疫苗較不適合在活體內產生有效及選擇性的免疫反應，此表明根據本發明，該抗原決定基可能不是聚合選擇性免疫療法的最佳選擇。 實例 19 ：使用載體蛋白作為輔助性 T 細胞抗原決定基的 CLEC 結合物及肽結合物的免疫原性分析 -aSyn aa91-100
在這個實例中，開始了一組實驗來比較兩種結合物，此兩種結合物均包含一個抗原決定基，該抗原決定基藉由分析針對注射的肽及aSyn蛋白引起的免疫反應被認為適合作為aSyn靶向抗原決定基。
例如，US 2014/0377271表明抗原決定基aa91-99在PD患者中作為自身抗原決定基，因此應該構成aSyn靶向免疫療法的潛在合適抗原決定基。為了評估CLEC修飾是否確實引起應用該抗原決定基的卓越免疫反應，因此將含有aSyn aa91-100(SeqID14+SeqID7+石耳多醣)的基於CLEC之疫苗與相應的習知肽-KLH疫苗(用Alum作為佐劑之SeqID15+KLH)進行了比較。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID14 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID15 KLH na Alum i.d.
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種疫苗3次(所有疫苗：5μg aSyn靶向肽/劑量；途徑：基於CLEC之疫苗用i.d.，為以Alhydrogel作為佐劑的基於KLH之疫苗用s.c.)且藉由ELISA及EC50值確定針對注射肽及目標蛋白aSyn的隨後的免疫反應。 結果：
令人驚訝的是，兩種疫苗均誘導了相關的抗肽效價，但較未能誘導了可偵測的抗aSyn蛋白效價(參見圖20)。因此，所提供的實驗表明，靶向aa91-100區域的基於CLEC的及傳統的肽疫苗較不適合在活體內產生有效及選擇性的免疫反應，此表明根據本發明，該抗原決定基可能不是聚合選擇性免疫療法的最佳選擇。 實例 20 ：使用載體蛋白作為輔助性 T 細胞抗原決定基的 CLEC 結合物及肽結合物的免疫原性 分析 -aSyn C 端區域 aa131-140
在這個實例中，開始了一組實驗來比較兩種結合物，此兩種結合物均包含一個抗原決定基，該抗原決定基藉由分析針對注射的肽及aSyn蛋白引起的免疫反應被認為適合作為aSyn靶向抗原決定基。此外，還評估了針對兩種不同形式的突觸前蛋白aSyn引發的隨後免疫反應的選擇性。
例如，US 2015/0232524及WO 2016/062720提出來自aa-126-140及131-140位置的C端aSyn序列作為aSyn靶向免疫療法的潛在合適抗原決定基。為了評估CLEC修飾是否確實會產生更好的免疫反應，因此將含有aSyn aa131-140(SeqID20+SeqID7+石耳多醣)的基於CLEC之疫苗與相應的習知肽-KLH疫苗(用Alum作為佐劑之SeqID21+KLH)進行了比較。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID20 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID21 KLH na Alum i.d.
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種疫苗3次(所有疫苗：5μg aSyn靶向肽/劑量；途徑：基於CLEC之疫苗用i.d.，為以Alhydrogel作為佐劑的基於KLH之疫苗用s.c.)且藉由ELISA及EC50值測定針對注射肽及目標蛋白的隨後的免疫反應。此外，為了評估免疫反應的選擇性，對血漿樣品進行aSyn特異性抑制ELISA，並表示為最大結合百分比。 結果：
與習知肽-結合物疫苗(即，SeqID21+KLH，參見圖21A)相比，本實驗中使用的基於CLEC的aSyn靶向結合物疫苗(SeqID20+SeqID7+石耳多醣)展示了整體較低的抗aSyn蛋白反應。與基於CLEC之疫苗相比，習知疫苗誘導的免疫反應的特徵是抗aSyn效價增加1.8倍，但抗肽/抗蛋白質效價的比率降低45%。後一發現支持本發明之教示，即CLEC修飾引起更好的抗目標蛋白反應，即使在與類似的習知疫苗相比總體免疫原性較低的情況下亦是如此。
此外，習知的肽結合物較不適合誘導聚合選擇性免疫反應(參見圖21B)。相比之下，基於CLEC之疫苗產生的抗體對單體aSyn的選擇性增加約10倍，代價是聚集的aSyn(參見圖21B)。因此，所提供的實驗表明，針對aa131-140區域的基於CLEC的及習知的肽疫苗較不適合在活體內對聚集的aSyn產生有效及選擇性的免疫反應，此表明根據本發明，該抗原決定基可能不是聚集選擇性免疫療法的最佳選擇。 實例 21 ：使用載體蛋白作為輔助性 T 細胞抗原決定基的 CLEC 結合物及肽結合物的免疫原性 -aSynC 端區域 aa103-135
在該實例中，評估了與使用最先進的載體蛋白作為T細胞抗原決定基來源的相應肽結合物相比，根據本發明之基於CLEC之結合物疫苗是否可誘導針對aSyn的更好的免疫反應。
因此，開始了一組實驗來比較若干結合物，此等結合物源自建議適合作為aSyn靶向抗原決定基的抗原決定基區域。此等實驗可證明針對注射的肽及aSyn蛋白引發的免疫反應，以及隨後針對兩種不同形式的突觸前蛋白aSyn(非聚集的、主要是單體的aSyn以及聚集的aSyn細絲)所引發的免疫反應的選擇性。
若干研究表明，源自aa103-135位置的C端aSyn序列是aSyn靶向免疫療法的潛在合適抗原決定基，無論是作為自身抗原決定基的來源，還是包含其原始序列或其模擬抗原決定基的肽。為了評估CLEC修飾是否確實會在aSyn中使用該區域產生更好的免疫反應，因此將若干基於CLEC之疫苗(使用區域107-126內的肽)與相應的習知肽-CRM疫苗(用Alum作為佐劑)進行了比較。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID56 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID58 CRM na Alum s.c.
SeqID53 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID55 CRM na Alum s.c.
SeqID51 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID52 CRM na Alum s.c.
SeqID65 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID66 CRM na Alum s.c.
SeqID67 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID68 CRM na Alum s.c.
SeqID69 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID70 CRM na Alum s.c.
SeqID71 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID72 CRM na Alum s.c.
動物(雌性Balb/c小鼠)每兩週接種一次疫苗3次(所有疫苗：5μg aSyn靶向肽/劑量；途徑：基於CLEC之疫苗用i.d.，為以Alhydrogel作為佐劑的基於KLH之疫苗用s.c.)且藉由ELISA及EC50值測定針對注射肽及目標蛋白的隨後的免疫反應。此外，為了評估免疫反應的選擇性，對血漿樣品進行aSyn特異性抑制ELISA，並表示為最大結合百分比。 結果：
疫苗 肽效價 (x1000) aSyn 纖維效價 (x1000)
SeqDI56+SeqID7+石耳多醣 0,1 0,1
SeqID58+CRM+Alum 9,781 0,1
SeqDI53+SeqID7+石耳多醣 0,1 0,1
SeqID55+CRM+Alum 17,647 0,8
SeqDI51+SeqID7+石耳多醣 19,694 1,687
SeqID52+CRM+Alum 13,115 1,594
SeqDI65+SeqID7+石耳多醣 9,04 3,256
SeqID66+CRM+Alum 7,984 1,108
SeqDI67+SeqID7+石耳多醣 12,016 7,335
SeqID68+CRM+Alum 18,126 1,864
SeqDI69+SeqID7+石耳多醣 28,125 3,523
SeqID70+CRM+Alum 37,88 1,054
SeqDI71+SeqID7+石耳多醣 7,783 5,788
SeqID72+CRM+Alum 14,603 2,429
表3：涵蓋aa107-126之疫苗引發的免疫反應
基於CLEC以及基於CRM的含有5聚體及6聚體肽之疫苗均較不適合在本實驗中誘導高抗aSyn絲效價。與習知肽結合物疫苗相比，本實驗中使用的靶向aSyn C端的基於CLEC的結合疫苗(7至12聚體肽) (參見表3及圖22A、23A及24A)均顯示出針對aSyn絲狀物的優異免疫原性(見表3，最多增加4倍)。此有力地支持了本發明之教示，即CLEC修飾引起與使用源自103-135，尤其是107-126的抗原決定基的類似習知疫苗相比更優異的免疫反應。
聚合aSyn的選擇性分析進一步支持了此教示。如圖22B及23B所示，含有源自序列aa115-126的抗原決定基的CLEC疫苗在引發高度聚集的選擇性免疫反應方面出人意料地有效。如圖22B所示，基於CLEC之疫苗SeqID51+SeqID7+石耳多醣，包含一8聚體的aSyn靶向抗原決定基，所誘導抗體對aSyn聚集體的選擇性高10倍，而相應的習知疫苗(SeqID52+CRM+Alum)則無法誘導聚集選擇性抗體。同樣地，基於CLEC之疫苗SeqID67+SeqID7+石耳多醣包含一個10聚體的aSyn靶向抗原決定基，誘導了與單體相比，高約10倍的aSyn聚集體的選擇性，而相應的習知疫苗(SeqID68+CRM+Alum)所引發的抗體則對單體更具選擇性，相較於聚集體約高3倍(參見圖23B)。
對含有抗原決定基aa107-114之疫苗(SeqID73+SeqID7+石耳多醣及SeqID74+CRM+Alum，參見圖24B)的選擇性分析令人驚訝地表明，儘管存在由基於CLEC之疫苗所引發的高抗aSyn效價(即，更優異的免疫原性)，然而無論是CLEC疫苗還是傳統疫苗均不能誘導聚集選擇性抗體，此表明只有aa103-135中高度選擇的肽序列才適合作為特異性靶向聚集aSyn的免疫療法。
如前所示(見圖18-20)，亦可注意到源自aa91-100、aa100-108及aa131-140的抗原決定基均較不適合作為特異性靶向聚集的aSyn的潛在免疫治療區域。 實例 22 ：由基於 CLEC 之疫苗引發的免疫反應的活體外功能分析
為了分析由基於CLEC之疫苗(含有來自抗原決定基區域aa103-135的aSyn靶向肽)引發的aSyn特異性抗體是否具有生物活性，本實例進行了一組實驗，分析了抗體在活體外抑制aSyn聚集的能力。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID67 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID68 CRM n.a Alhydrogel s.c.
SeqID71 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID72 CRM197 n.a Alhydrogel i.d.
SeqID73 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID74 CRM197 n.a Alhydrogel s.c.
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種疫苗3次(所有疫苗：20µg aSyn靶向肽/劑量；途徑：i.d.用於基於CLEC之疫苗，s.c.用於以Alhydrogel作為佐劑的基於CRM197之疫苗)。透過每次免疫後兩週採集的鼠血漿樣品以及各別對照組樣品(例如：aSyn結合抗體LB509、抗原決定基aa115-122或免疫前獲得的免疫前血漿)分析了活體外聚集抑制能力。 結果：
如圖25D所示，免疫前取自動物的血漿對aSyn的聚集動力學沒有顯著影響，證實了測定的特異性。
SeqID67+SeqID7+石耳多醣疫苗(包含10聚體aSyn衍生肽)誘導的抗體強烈抑制aSyn聚集，正如該測定中聚集隨時間推移減少40%所表明的那樣，而相應的CRM結合疫苗僅顯示出最小的影響，表明其與經典疫苗誘導的抗體相比具有更高的抑制能力(圖25A)。分析由SeqID71+SeqID7+石耳多醣(包含12聚體aSyn衍生肽)誘導的抗體可獲得類似的結果，其可更強烈地減少聚集(70-80%抑制)且可超過習知CRM疫苗(SeqID72+CRM+Alhydrogel)誘導的抗體的抑制能力2到2.5倍。相較之下，圖25C顯示由基於抗原決定基aa107-114(含有8聚體aSyn衍生肽)構建的基於CLEC之疫苗及習知疫苗誘導的抗體均未能抑制aSyn聚集。
如圖25D所示，aSyn特異性抗體LB509無法抑制aSyn聚集。相反地，在此分析中可偵測到聚集的輕微增加。
考慮到本發明之教示(參見實例14及圖15分析衍生自aSyn序列aa115-126，尤其是aa115-121的抗原決定基)，以及描述含有抗原決定基115-126疫苗的表1及圖22-25)，此是一個非常令人驚訝的作用。作為單株LB509(抗原決定基aa:115-122)，已知其與不同形式的aSyn結合(Jakes等人.Neurosci. Lett. 1999 Jul 2;269(1):13-6)且與根據本發明之生物有效疫苗具有相同的抗原決定基(參見圖25D)。因此，使用基於CLEC之疫苗獲得的優越的生物學效果確實令人驚訝，且表明aa115-126中包含的高度選擇的肽序列在aa103-135區域中作為特異性靶向聚集的aSyn的免疫治療劑為較佳的。 實例 23 ：肽 -CRM197-CLEC 結合物對鼠類dectin -1 受體的活體外生物活性的測定
在一系列ELISA實驗中，針對含有dectin-1配位體石耳多醣、地衣多醣及昆布多醣的結合物對鼠科動物dectin-1的結合功效進行了評估。肽+CRM197+CLEC結合物之生物活性由其PRR結合能力表示。沿著此等思路且為了確保CLEC(石耳多醣、地衣多醣、昆布多醣)的結構在偶合後仍保持生物活性，評定了與小鼠dectin-1的結合。然後使用基於可溶性鼠Fc-dectin-1a(InvivoGen)的競爭性結合的競爭性ELISA系統評定了未經氧化及經氧化之石耳多醣、地衣多醣及昆布多醣以及CRM結合物疫苗及基於肽+CRM197+CLEC的新型結合物之生物活性，如Korotchenko等人所述(2020)。 結果：
隨後的實驗表明，中等分子量(20kDa)的線性β-(1,6)連接之β-D-葡聚糖―石耳多醣及具有β(1-6)-連接的線性β(1-3)-葡聚糖―昆布多醣發揮了相較於較大的高分子量線性β-(1,3) β-(1,4)-β-D葡聚糖―地衣聚糖(約245kDa)約高10倍的與鼠類dectin-1結合的效率(參見圖26)。
如圖26A所示，藉由ELISA分析評定dectin-1配位體石耳多醣、氧化石耳多醣、SeqID6+CRM結合物(CRM結合物1)及SeqID6+CRM+石耳多醣結合物(CRM-石耳多醣結合物1)對類dectin-1的結合功效。隨後的實驗表明，肽+CRM197+石耳多醣結合物顯示出與氧化石耳多醣相似的對鼠類dectin-1的結合功效。相比之下，傳統的CRM結合物1沒有顯示出特異性的小鼠dectin-1結合能力。5種新型CRM+石耳多醣結合物(SeqID52/66/68/70/72)亦顯示出與鼠類dectin-1的高結合功效(圖26B)。隨後的實驗表明，肽-CRM197-石耳多醣與不同的B細胞抗原決定基，範圍自7聚體B細胞抗原決定基(SeqID6+CRM+石耳多醣；圖26A)至12聚體B細胞抗原決定基(SeqID71+CRM+石耳多醣；圖1B)顯示與經氧化之石耳多醣相似的小鼠dectin-1結合功效。如圖26C所示，無論是氧化或結合，高分子量(約22-245kDa) 的線性β-(1,3)β-(1,4)-β-D葡聚糖―地衣多醣均比基於線性β-(1,6)連接之β-D-葡聚糖石耳多醣的構築體發揮較低的結合功效。例如，含有CRM197肽結合物之石耳多醣保留了比基於地衣多醣的構築體高約10倍的結合力。具有β(1-6)-連接的線性β(1-3)-葡聚糖―昆布多醣亦顯示出對鼠類dectin-1的高結合功效 (圖26D)。隨後的實驗表明，無論氧化或結合，肽+CRM197+昆布多醣結合物均顯示出與基於石耳多醣的構築體相似的鼠類dectin-1。
實驗表明，肽+CRM197+CLEC結合物藉由與小鼠系統中的dectin-1結合顯示出對樹突狀細胞的生物活性。 實例 24 ：肽 -CRM197-CLEC 結合物對人類 dectin -1 受體之活體外生物活性的測定
在一系列ELISA實驗中，評定了dectin-1配位體石耳多醣、地衣多醣及昆布多醣與人類dectin-1的結合功效。肽+CRM197+CLEC結合物之生物活性由其PRR結合能力表示。沿著此等思路且為了確保CLEC(石耳多醣、地衣多醣、昆布多醣)的結構在偶合後仍保持生物活性，藉由基於可溶性人類Fc-dectin-1a受體(InvivoGen)的競爭性結合的競爭性ELISA系統評定與人類dectin-1的結合。 結果：
如圖27所示，藉由ELISA分析評定了與地衣多醣(Lich結合物)、石耳多醣(Pus結合物)或昆布多醣(Lam結合物)偶合之SeqID6+CRM結合物對人類dectin-1的結合功效。
隨後的實驗表明，肽+CRM197+石耳多醣疫苗對人類dectin-1的結合效力明顯高於與地衣多醣結合之疫苗(約30倍) (參見圖27)。相反地，肽+CRM197+昆布多醣疫苗顯示出與人類dectin-1的弱結合。 實例 25 ：不同的基於肽 +CRM197+ 石耳多醣之疫苗的活體內比較
新型CRM197-石耳多醣疫苗具有不同的B細胞抗原決定基，範圍自8聚體至11聚體，其能夠與其DC受體(例如：dectin-1)結合，並測試該疫苗經過重複施用於n=5 Balb/c小鼠/組後誘導強烈及特異性免疫反應的能力。典型的實驗係使用每劑量5µg淨肽含量的B細胞抗原決定基肽進行。
在該實驗中，aSyn衍生肽SeqID52+CRM197及SeqID66/68/70+CRM結合物與經氧化之石耳多醣偶合。動物(雌性Balb/c小鼠)每以兩週一次的間隔接種經β-葡聚糖修飾或未經修飾之肽-CRM結合物3次(途徑：i.d.)，使用第三次免疫接種後兩週採集的鼠類血漿對針對注射的肽(即分別為SeqID52/66/68/70)及針對聚集的aSyn纖維產生的隨後的免疫反應進行分析。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID52 CRM 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID66 CRM 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID68 CRM 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID70 CRM 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID52 CRM n.a. Alhydrogel s.c.
SeqID66 CRM n.a Alhydrogel s.c.
SeqID68 CRM n.a Alhydrogel s.c.
SeqID70 CRM n.a. Alhydrogel s.c.
結果：
如圖28A所示，與以Alhydrogel為佐劑的未經修飾之基於肽CRM之疫苗相比，所有4種基於CRM+石耳多醣之疫苗(SeqID52/66/68/70/72)均能夠對針對注射的肽部分(例如：SeqID52/66/68/70)及針對聚集的aSyn纖維產生顯著提高的反應。
相較於未經修飾之基於肽-CRM的結合物疫苗，基於肽+CRM+石耳多醣的結合物可誘導提高2-5倍之相對於各別肽之效價(最高效價為1/190.000)及提高3-13倍之針對aSyn纖維的效價提高3-13倍(最高效價為1/29.000)。 實例 26 ：由基於肽 +CRM+ 石耳多醣之疫苗在活體內引發的免疫反應的選擇性分析
與習知的肽+CRM197疫苗相比，為了進一步表徵由含有不同B細胞抗原決定基的肽+CRM197+石耳多醣疫苗引發的免疫反應，本實例進行了一組實驗，分析了針對聚集的aSyn纖維引發的隨後的免疫反應的選擇性。
動物(雌性Balb/c小鼠) 以每兩週一次的間隔接種疫苗3次(所有疫苗：5μg aSyn靶向肽/劑量；途徑：4種基於肽+CRM197+CLEC之疫苗(SeqID52/SeqID66/68/70-CRM197-石耳多醣)用i.d.；s.c.用於以Alhydrogel為佐劑的4種基於肽-CRM197之疫苗(SeqID52/SeqID66/68/70-CRM197))以及使用第三次免疫接種後兩週採集的鼠類血漿對針對目標蛋白(即重組人類α突觸核蛋白及aSyn纖維)產生的隨後的免疫反應進行分析。對血漿樣品進行aSyn特異性抑制ELISA，且測定IC50值。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID52 CRM 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID66 CRM 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID68 CRM 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID70 CRM 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID52 CRM n.a. Alhydrogel s.c.
SeqID66 CRM n.a Alhydrogel s.c.
SeqID68 CRM n.a Alhydrogel s.c.
SeqID70 CRM n.a. Alhydrogel s.c.
結果：
簡言之，與習知肽-CRM197結合物疫苗相比，本實驗中使用的所有基於CLEC之結合物均表現出優異的aSyn聚集體特異性目標選擇性，這是藉由針對aSyn纖維明顯更低的IC50值所確定的(參見圖36)。
在該實驗中測試的所有4種習知肽-CRM197結合物疫苗均誘導抗體，其表現出非常弱的對aSyn纖維的選擇性，係藉由400-1700 ng/ml之非常高的IC50值來顯示。
相比之下，由新型基於肽+CRM197+石耳多醣的結合物疫苗誘導之所有抗體的特徵在於具有顯著較低的aSyn纖維的IC50值，範圍為3.5-15 ng/ml。
因此，實驗表明無論使用的抗原決定基為何，CRM197結合物之CLEC修飾引起隨後免疫反應的目標特異性大大增強，提供了一種前所未有的新策略來最佳化目前先進技術結合物疫苗。 實例 27 ：由基於肽 +CRM197+ 石耳多醣之疫苗引發的免疫反應之親和力分析
為了進一步表徵與習知肽-CRM197疫苗相比，含有不同B細胞抗原決定基的基於肽-CRM197-石耳多醣之疫苗引發的免疫反應，本實例進行了一組實驗，分析了針對aSyn纖維引發的抗體之整體親和力(avidity)。
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種3次疫苗(所有疫苗：5μg aSyn靶向肽/劑量；途徑：基於CLEC之疫苗用i.d.(SeqID52/66/68/70+CRM197+石耳多醣)；s.c.用於以Alhydrogel (SeqID52/66/68/70-CRM197)為佐劑的基於CRM197之疫苗)，使用每次免疫接種後兩週採集的鼠類血漿分析了隨後針對目標蛋白(即，aSyn纖維)的免疫反應。對於針對aSyn纖維的誘導抗體，使用標準ELISA分析的變體，其中包含與抗原結合的抗體的複製孔暴露於濃度逐漸增加的離液硫氰酸根離子。對硫氰酸鹽洗脫的抗性用作抗體分子整體親和力之量度，且表示50%的有效抗體結合的一指數(抗體分子整體親和力指數)用於比較血漿樣品。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID52 CRM197 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID66 CRM197 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID68 CRM197 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID70 CRM197 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID52 CRM197 n.a. Alhydrogel s.c.
SeqID66 CRM197 n.a Alhydrogel s.c.
SeqID68 CRM197 n.a Alhydrogel s.c.
SeqID70 CRM197 n.a Alhydrogel s.c.
結果：
如圖30所示，所有測試的習知肽-CRM197結合物(以Alhydrogel作為佐劑)誘導之抗體僅顯示出對aSyn纖維的有限結合強度，如0.25至0.85範圍內的非常低之親和力指數所證明的。相比之下，所有新型的基於肽+CRM197+石耳多醣之疫苗誘導的抗體顯示出對aSyn纖維的顯著更高的結合強度，AI範圍為0.5-2.2。
因此，實驗表明，肽-CRM197結合物之CLEC修飾引起目標特異性免疫反應(效價)的強烈增強，以及，無論使用何種抗原決定基均造成誘導抗體反應的目標特異性及親和力的強烈增強提供了一種前所未有的新策略來最佳化目前最先進之蛋白質結合物疫苗，包括CRM197。 實例 28 ：不同肽 +CRM197+ 基於 CLEC 之疫苗的活體內比較
本實例對與石耳多醣、地衣多醣或昆布多醣偶合之aSyn衍生肽SeqID6+CRM197結合物進行了測試，以確定其在n=5Balb/c小鼠/組中重複施用後誘導強大及特異性免疫反應的能力。典型的實驗使用每劑量5µg淨肽含量的B細胞抗原決定基肽進行，動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種3次疫苗(途徑：i.d.)，隨後使用第三次免疫注射後兩週採集的鼠類血漿分析針對注射肽(即SeqID6)及聚集的aSyn纖維的免疫反應。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID6 CRM197 地衣多醣(200%) n.a i.d.
SeqID6 CRM197 昆布多醣 (200%) n.a i.d.
SeqID6 CRM197 n.a Alhydrogel s.c.
結果：
所測試之疫苗可誘導對注射肽(例如SeqID6)以及在小鼠中重複免疫接種後聚集的aSyn纖維的顯著免疫反應。
與傳統的基於肽-CRM之疫苗及與結合至昆布多醣或地衣多醣的基於肽-CRM之疫苗相比，基於肽-CRM-石耳多醣的結合物誘導針對各別肽及aSyn纖維的高效價(參見圖31)。
具體而言，與SeqID6+CRM197+地衣多醣相比，SeqID6+CRM197+石耳多醣誘導針對注射肽SeqID6的效價高了1.6倍，與SeqID6+CRM197+昆布多醣相比高了12倍。與SeqID6+CRM197+昆布多醣相比，SeqID6+CRM197+地衣多醣可誘導高7.5倍的效價。
同樣地，與SeqID6+CRM197+地衣多醣相比，SeqID+CRM197+石耳多醣誘導針對aSyn聚集體(細絲)的效價高了3.1倍，與SeqID6+CRM197+昆布多醣相比高了7.6倍，比以Alhydrogel作為佐劑的非CLEC修飾之SeqID6+CRM197高了6倍。與SeqID6+CRM197+昆布多醣相比，SeqID6+CRM197+地衣多醣可誘導高2.4倍的效價，與以Alum作為佐劑的非CLEC修飾之SeqID6+CRM197相比，可誘導高2倍的效價。
肽-CRM197結合物之CLEC修飾提供了一種前所未有的新策略來最佳化目前最先進之蛋白質結合物疫苗，包括CRM197。 實例 29 ：肽 +CLEC- 結合物對鼠類及人類 dectin-1 受體的活體外生物活性的測定
在一系列ELISA實驗中，評估了dectin-1配體石耳多醣、地衣多醣及昆布多醣對鼠類及人類dectin-1的結合功效。肽-CLEC結合物的生物活性由其PRR結合能力表示。沿著此等思路並為了確保CLEC(石耳多醣、地衣多醣、昆布多醣)的結構在偶合後仍保持生物活性，藉由基於可溶性鼠類及人類Fc-dectin-1a受體(InvivoGen)的競爭性結合的競爭性ELISA系統評估與鼠類及人類dectin-1的結合。 結果：
如圖32所示，已藉由ELISA分析評估了與地衣多醣(Lich結合物)、石耳多醣(Pus結合物)或昆布多醣(Lam結合物)偶合的SeqID5+SeqID7+CLEC結合物對鼠類及人類dectin-1的結合功效。
隨後的實驗表明，石耳多醣多醣疫苗對小鼠類及人類dectin-1的結合效力明顯高於與地衣多醣結合之疫苗(參見圖32A+B)。相比之下，肽-昆布多醣疫苗對鼠類dectin-1顯示出非常高的結合效力(圖32A)，但對人類dectin-1僅顯示很弱的結合效力(圖32B)。 實例 30 ：不同的基於肽 -CLEC 之疫苗的活體內比較
對能夠結合鼠類及/或人類dectin-1的基於CLEC之疫苗進行了測試，以確定其在n=5Balb/c小鼠/組中重複施用後誘導強烈及特異性免疫反應的能力。典型的實驗使用每劑量5µg及20µg淨肽含量的B細胞抗原決定基肽進行。
在該實驗中，α突觸核蛋白衍生肽SeqID5及混雜的輔助性T細胞抗原決定基SeqID7藉由C端醯肼連接子與經氧化之石耳多醣、地衣多醣或昆布多醣偶合。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 CLEC
SeqID5 SeqID7 石耳多醣
SeqID5 SeqID7 地衣多醣
SeqID5 SeqID7 昆布多醣
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種3次疫苗(劑量：5µg ( A)及20µg ( B)；途徑：id)，隨後使用第三次免疫接種兩週後採集的小鼠血漿分析針對注射肽(即SeqID6)的隨後免疫反應。 結果：
如圖33所示，所有三種CLEC疫苗(SeqID5+SeqID7+石耳多醣、SeqID5+SeqID7+地衣多醣及SeqID5+SeqID7+昆布多醣)均能夠誘導可偵測的免疫反應。有趣的是，無論所用劑量為何，使用基於昆布多醣之疫苗進行免疫接種僅能誘導非常低的抗肽及抗aSyn反應。相比之下，基於石耳多醣之結合物可誘導顯著更高的抗肽及抗aSyn反應。與基於石耳多醣之結合物相比，基於地衣多醣之結合物顯示出較低的免疫原性，但在該實驗中其可誘導比基於昆布多醣之結合物更高的效價。
此表明在活體外與dectin-1的結合功效，尤其是與人類dectin-1的結合功效，可直接與疫苗的活體內免疫原性及生物活性相關聯。此引起石耳多醣或其片段(即線性β(1,6)-β-D葡聚糖)被鑑定為本申請中提出的最有效的葡聚糖變異體。 實例 31 ：由基於 CLEC 之疫苗引發的免疫反應的活體內功能分析
為了確定由基於CLEC之疫苗引發的aSyn特異性抗體是否能夠在活體內抑制aSyn原纖維形成，本實例使用已建立的突觸核蛋白病變接種模型啟動了概念驗證實驗[Sci. Adv. 2020, 6, eabc4364, doi:10.1126/sciadv.abc4364; DOI: 10.1126/sciadv.abc4364]。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID5 SeqID7 石耳多醣(80%) n.a i.d.
na na 石耳多醣 n.a i.d.
在該模型中，C57BL/6小鼠在右側黑質水平立體定向注射α-syn預成型原纖維(PFF)，隨後引起廣泛的突觸核蛋白病變，其特徵是磷酸突觸核蛋白免疫陽性類路易氏神經突及沿著解剖連接的胞漿內聚集體。動物在第0、2、4及10週免疫接種四次，使用SeqID5+SeqID7+石耳多醣疫苗或作為對照組的非偶合CLEC進行接種，在PFF接種當天開始第一次免疫接種。PFF注射後126天，處死動物，並分析大腦中選定大腦區域(包括大腦皮層、紋狀體、丘腦、黑質及腦幹)中磷酸化S129aSyn陽性聚集體的存在。 結果：
使用處死時獲得的血漿及CSF對隨後的免疫反應進行分析。在經SeqID5+SeqID7+石耳多醣疫苗治療的動物的血漿中偵測到針對注射肽之高抗體效價。相比之下，在僅經CLEC治療的對照組中無法偵測到高於背景的信號(圖34)。CSF中抗肽效價的分析亦顯示了高水平的SeqID5+SeqID7+石耳多醣疫苗誘導抗體，而對於以載體處理的動物則沒有偵測到高於背景的信號(圖34)。腦切片的免疫組織化學顯示在載體處理組的所有分析區域中存在大量磷酸化S129aSyn陽性聚集體，表明aSyn病變的強烈傳播。相反，突觸核蛋白病變在經SeqID5+SeqID7+石耳多醣疫苗接種的小鼠中顯著減少(圖34)。值得注意的是，抗體反應的強度與疫苗接受者的突觸核蛋白病變水平之間存在強烈且顯著的相互關係(圖34)。 實例 32 ：肽 +CRM+CLEC 結合物之免疫原性分析
在此實例中，將基於CLEC之結合物疫苗的載體特異性免疫原性與習知載體疫苗進行了比較。
為此，將α突觸核蛋白衍生抗原決定基SeqID6與順丁烯二醯亞胺活化之CRM197偶合。隨後，使用異雙官能連接子BPMH將肽+CRM197結合物與活化之石耳多醣偶合，形成基於CLEC之結合物疫苗，其中CRM197作為輔助性T細胞抗原決定基的來源，以誘導可持續的免疫反應。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 / 載體 CLEC 佐劑 途徑
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) n.a i.d.
SeqID6 CRM197 n.a Alhydrogel s.c.
動物(雌性Balb/c小鼠)以每兩週一次的間隔接種3次疫苗，隨後使用第三次免疫接種後兩週採集的小鼠血漿分析針對載體蛋白CRM197的免疫反應。含有SeqID6之疫苗劑量：20µg及100µgα突觸核蛋白靶向肽/劑量；途徑：i.d.用於基於CLEC之疫苗，s.c.用於以Alhydrogel作為佐劑的基於CRM197之疫苗(圖35)。 結果：
抗載體特異性抗體反應的比較表明，傳統的基於SeqID6+CRM197之疫苗能夠劑量依賴性地誘導高抗CRM197效價。相較之下，所使用的基於CLEC之SeqID6+CRM197+石耳多醣疫苗在使用20µg及100µg劑量重複免疫接種後均誘導顯著降低的抗CRM反應(減少程度：4.5-5倍；圖35)。
因此，實驗表明，習知肽-蛋白質結合物之共價CLEC修飾顯著損害了抗載體反應的發展，提供了一種前所未有的新策略來最佳化構築在載體蛋白(如KLH、CRM197或其他蛋白)上的目前先進技術結合物疫苗。 實例 33 ： 免疫 接種 後抗石耳多醣 / 葡聚糖 之 免疫反應的活體內分析
如實例7中所論述，由基於CLEC的免疫原誘導的抗CLEC抗體的分析對於根據本發明提出的CLEC-疫苗的新穎性及功效在兩個層面上是重要的。
沿著此等思路，在免疫接種前及重複免疫接種後，對首次免疫接種及肽+CRM+CLEC結合物免疫接種的Balb/c小鼠(n=5/組)的血漿樣品中的抗石耳多醣抗體進行了廣泛分析。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 T 細胞抗原決定基 CLEC 佐劑 比率 (w/w)
n.a. n.a. 石耳多醣 n.a. n.a.
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) n.a 1/1
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) n.a 1/2,5
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) n.a 1/5
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) n.a 1/10
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) n.a 1/20
SeqID6 CRM197 地衣多醣(200%) n.a
SeqID6 CRM197 昆布多醣(200%) n.a
結果：
在此實例中分析不同類型之樣品：
圖36A顯示了從經歷重複的SeqID6+CRM+石耳多醣、SeqID6+CRM+地衣多醣或SeqID6+CRM+昆布多醣免疫接種的動物獲得的樣品的抗石耳多醣免疫反應性(所有疫苗：20μg aSyn靶向肽/劑量)。圖36B顯示來自使用含有不同w/w肽+CRM結合物/CLEC比例之疫苗(即，結合物/CLEC比例為1/1、1/2、5、1/5、1/10及1/20)進行重複SeqID6+CRM+石耳多醣免疫接種的動物的樣品的抗石耳多醣免疫反應性(所有疫苗：5µgaSyn靶向肽/劑量)。
為了對照目的，本實驗使用了來自免疫前的動物以及來自未經氧化之CLEC處理的動物獲得的樣品。
如圖36所示，分析的Balb/c動物顯示出針對葡聚糖/石耳多醣/β(1,6)-β-D葡聚糖的預先存在的低水平免疫反應。
所測試的所有CLEC疫苗未能顯著增加預先存在的抗葡聚糖反應或從頭誘導針對活體內葡聚糖骨架的高免疫反應。
相比之下，重複施用存在於對照組中的未結合、未經氧化之石耳多醣藉由提高針對石耳多醣的抗體水平＞5倍(與免疫前血漿相比)誘導強烈的抗葡聚糖免疫反應。非CLEC修飾之肽+CRM結合物及含有地衣多醣及昆布多醣的結合物無法誘導高於免疫前水平的抗石耳多醣效價，表明偵測到的抗葡聚糖反應的特異性。
總之，此等分析表明儘管在未經處理之的Balb/c小鼠中存在低水平的、預先存在的針對石耳多醣(IgG)的自身反應性，但在使用各種CLEC結合物進行免疫接種後，無法或僅能偵測到非常低之與疫苗接種有關的抗石耳多醣免疫反應性變化。此表明施用根據本發明之新型疫苗設計顯著降低了葡聚糖免疫原性。此與先前公佈的結果形成強烈對比，因此構成了根據本發明之碳水化合物骨架(例如，β-葡聚糖，尤其是石耳多醣骨架)的出人意料及具有創造性的新特徵。
此外，預先存在的抗石耳多醣反應似乎並不排除對WISIT疫苗肽成分的免疫反應，因為所有實驗的注射肽反應均顯示出高抗肽效價。 實例 34 ：葡聚糖結合對肽 - 載體疫苗免疫原性影響的活體內比較
為了評定CLEC與肽+載體免疫原的結合是否是誘導根據本發明之疫苗的優異免疫原性所必需的，本實例開始了一組實驗來比較三種疫苗製劑：一種用β-葡聚糖共價修飾之肽+載體結合物，一種包含肽+載體結合物及未偶合之β-葡聚糖之混合物的疫苗製劑，以及一種未經修飾且無Alum佐劑的肽+載體疫苗。
同樣地，n=5隻雌性Balb/c小鼠以每兩週一次的間隔免疫接種三次，隨後使用第三次免疫接種後兩週採集的鼠類血漿分析針對注射肽及aSyn纖維(即SeqID6)的後續免疫反應。 所用疫苗：
B 細胞抗原決定基 載體 CLEC CLEC 結合
SeqID6 CRM197 石耳多醣(80%) 是
SeqID6 CRM197 石耳多醣(未氧化) 否；僅混合
SeqID6 CRM197 n.a.，無佐劑 否
結果：
圖37顯示三種免疫接種後可偵測到的抗肽(SeqID6)及抗aSyn單體特異性免疫反應的比較。相較於SeqID6+CRM197及未經氧化之石耳多醣之混合物，SeqID6+CRM197+石耳多醣的結合物能夠誘導高約10倍的針對注射肽的免疫反應(圖37A)，以及高4倍的抗aSyn效價(圖37B)，相較於SeqID6+CRM197 (無佐劑)，SeqID6+CRM197+石耳多醣的結合物亦可誘導高約10倍的針對注射肽的免疫反應。有趣的是，SeqID6+CRM197及未經氧化之石耳多醣的混合不會引起與習知SeqID6+CRM197明顯不同的免疫反應。
此等資料表明，需要根據本發明將肽載體免疫原與活化之CLEC結合以在活體內誘導更好的免疫反應。
實例中所揭示之B細胞抗原決定基序列如下：
SeqID 序列 父本蛋白
SeqID1 (H2N-NH-CO-CH2-CH2-CO)-DQPVLPD aSyn, aa115-121
SeqID2 DQPVLPD-(NH-NH2) aSyn, aa115-121
SeqID3 C-DQPVLPD aSyn, aa115-121
SeqID4 (H2N-NH-CO-CH2-CH2-CO)-DMPVDPD aSyn, aa115-121
SeqID5 DMPVDPD-(NH-NH2) aSyn, aa115-121
SeqID6 C-DMPVDPD aSyn, aa115-121
SeqID10 DAEFRH-(NH-NH2) Aß, aa1-6
SeqID11 DAEFRH-C Aß, aa1-6
SeqID12 MDVFMKGL-(NH-NH2) aSyn, aa1-8
SeqID13 MDVFMKGL-C aSyn, aa1-8
SeqID14 ATGFVKKDQL-(NH-NH2) aSyn, aa91-100
SeqID15 ATGFVKKDQL-C aSyn, aa91-100
SeqID16 LGKNEEGAP-(NH-NH2) aSyn, aa100-108
SeqID20 EGYQDYEPEA-(NH-NH2) aSyn, aa131-140
SeqID21 EGYQDYEPEA-C aSyn, aa131-140
SeqID51 DMPVDPDN-NH-NH2 aSyn, aa115-122
SeqID52 CDMPVDPDN aSyn, aa115-122
SeqID53 DMPVDP-(NH-NH2) aSyn, aa115-120
SeqID55 C-DMPVDP aSyn, aa115-120
SeqID56 DMPVD-(NH-NH2) aSyn, aa115-119
SeqID58 C-DMPVD aSyn, aa115-119
SeqID65 DMPVDPDNE-(NH-NH2) aSyn, aa115-123
SeqID66 DMPVDPDNE-C aSyn, aa115-123
SeqID67 DMPVDPDNEA-(NH-NH2) aSyn, aa115-124
SeqID68 DMPVDPDNEA-C aSyn, aa115-124
SeqID69 DMPVDPDNEAY-(NH-NH2) aSyn, aa115-125
SeqID70 DMPVDPDNEAY-C aSyn, aa115-125
SeqID71 DMPVDPDNEAYE-(NH-NH2) aSyn, aa115-126
SeqID72 DMPVDPDNEAYE-C aSyn, aa115-126
SeqID73 APQEGILE-(NH-NH2) aSyn, aa107-114
SeqID74 APQEGILE-C aSyn, aa107-114
基於本發明之一般揭示內容及此等實施例，揭示本發明之以下較佳實施例： 1.  一種結合物，其由以下組成或包含以下：至少一β-葡聚糖或一甘露多醣及至少一B細胞或一T細胞抗原決定基多肽，其中該β-葡聚糖或甘露多醣與該B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽共價結合以形成一β-葡聚糖或甘露多醣與B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽之結合物，其中該B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽為α突觸核蛋白多肽；或 一種結合物，其由以下組成或包含以下：至少一β-葡聚糖或一甘露多醣及至少一α突觸核蛋白多肽B細胞抗原決定基多肽，其中該β-葡聚糖或甘露多醣與該B細胞抗原決定基多肽共價結合以形成一β-葡聚糖或甘露多醣與B細胞抗原決定基多肽之結合物。 2.  根據實施例1之結合物，其中該β-葡聚糖為主要呈線性的β-(1,6)-葡聚糖，其β-(1,6)偶合之單醣部分與非β-(1,6)偶合之單醣部分之比率為至少1:1、較佳至少為2:1、更佳至少為5:1、尤其至少為10:1。 3. 根據實施例1或2之結合物，其中β-葡聚糖為dectin-1結合β-葡聚糖，較佳為石耳多醣、地衣多醣、昆布多醣、卡德蘭多醣、β-葡聚糖肽(BGP)、裂褶多醣、硬葡聚糖、全葡聚糖顆粒(WGP)、酵母多醣或蘑菇多醣，更佳為石耳多醣、昆布多醣、地衣多醣、蘑菇多醣、裂褶多醣或硬葡聚糖，尤其是石耳多醣；及/或其中β-葡聚糖為強dectin-1結合β-葡聚糖，較佳為藉由競爭性ELISA所測定，以低於10 mg/ml之IC50值、更佳以低於1 mg/ml之IC50值、甚至更佳以低於500 µg/ml之IC50值、尤其是以低於200 µg/ml之IC50值結合於可溶性鼠類Fc-dectin-1a受體的β-葡聚糖；及/或其中如藉由競爭性ELISA所測定，結合物以低於1 mg/ml之IC50值、更佳以低於500 µg/ml之IC50值、甚至更佳以低於200 µg/ml之IC50值、尤其是以低於100 µg/ml之IC50值結合於可溶性鼠類Fc-dectin-1a受體；及/或 - 一β-葡聚糖，其以低於10 mg/ml之IC50值、更佳以低於1 mg/ml之IC50值、甚至更佳以低於500 µg/ml之IC50值、尤其是以低於200 µg/ml之IC50值結合於可溶性人類Fc-dectin-1a受體；及/或 -其中如藉由競爭性ELISA所測定，結合物以低於1 mg/ml之IC50值、更佳以低於500 µg/ml之IC50值、甚至更佳以低於200 µg/ml之IC50值、尤其是以低於100 µg/ml之IC50值結合於可溶性人類Fc-dectin-1a受體。 4. 根據實施例1至3中任一項之結合物，其中該等多肽包含α突觸核蛋白之至少一個B細胞抗原決定基及至少一個T細胞抗原決定基，較佳為一共價連接於β-葡聚糖之B細胞抗原決定基+CRM197結合物，尤其是肽+CRM197+線性β-(1,6)-葡聚糖或肽+CRM197+線性石耳多醣結合物。 5.  根據實施例1至4中任一項之結合物，其中結合物中β-葡聚糖或甘露多醣與B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽之比率，尤其是石耳多醣與肽比率在10：1(w/w)至0.1：1(w/w)、較佳為8：1(w/w)至2：1(w/w)、尤其是4：1(w/w)範圍內，其限制條件為若結合物包含載體蛋白，則β-葡聚糖或甘露多醣與B細胞抗原決定基-載體多肽之較佳比率為50:1 (w/w)至0,1:1(w/w)，尤其是10:1至0.1:1。 6.  根據實施例1至5中任一項之結合物，其中B細胞抗原決定基及泛特異性/混雜T細胞抗原決定基獨立地與該β-葡聚糖結合。 7.  根據實施例1至6中任一項之結合物，其中該B細胞抗原決定基多肽之長度為5至20個胺基酸殘基、較佳為6至19個胺基酸殘基、尤其是7至15個胺基酸殘基；及/或其中該T細胞抗原決定基多肽之長度為8至30個胺基酸殘基、較佳為13至29個胺基酸殘基、尤其是13至28個胺基酸殘基， 其中B細胞抗原決定基及/或T細胞抗原決定基較佳藉由連接子連接於β-葡聚糖或甘露多醣及/或載體蛋白，更佳為藉由半胱胺酸殘基或包含半胱胺酸或甘胺酸殘基之連接子；或由以下方法產生之連接子：醯肼介導之偶合、經由異雙官能連接子(諸如N-β-順丁烯二醯亞胺基丙酸醯肼(BMPH)、4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸醯肼(MPBH)、N-[ε-順丁烯二醯亞胺基己酸)醯肼(EMCH)或N-[κ-順丁烯二醯亞胺基十一酸]醯肼(KMUH))之偶合、咪唑介導之偶合、還原胺化、碳二亞胺偶合；-NH-NH 2連接子、NRRA、NRRA-C或NRRA-NH-NH 2連接子；肽連接子，諸如二聚體、三聚體、四聚體(或更長聚體)肽群，諸如CG或CG；或裂解位點，諸如組織蛋白酶裂解位點；或其組合，尤其是藉由半胱胺酸或NRRA-NH-NH 2連接子； 其中T細胞抗原決定基較佳為包含胺基酸序列AKFVAAWTLKAAA之多肽，其視情況連接於連接子，如半胱胺酸殘基或包含半胱胺酸殘基之連接子、NRRA、NRRA-C或NRRA-NH-NH 2連接子；或胺基酸序列AKFVAAWTLKAAA之變異體；其中該等變異體包括胺基酸序列AKFVAAWTLKAA；其中第一殘基丙胺酸經諸如甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸及白胺酸之脂肪族胺基酸殘基置換的變異體；其中第三殘基苯丙胺酸經L-環己基苯丙胺酸置換的變異體；其中第十三胺基酸殘基丙胺酸經脂肪族胺基酸殘基(例如甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸及白胺酸)置換的變異體；包含胺基己酸的變異體，較佳為與胺基酸序列AKFVAAWTLKAA之C端偶合之包含胺基己酸的變異體；具有胺基酸序列AX 1FVAAX 2TLX 3AX 4A之變異體，其中X 1係選自由W、F、Y、H、D、E、N、Q、I及K組成之群；X 2係選自由F、N、Y及W組成之群；X 3係選自由H及K組成之群，且X 4係選自由A、D及E組成之群，其限制條件為寡肽序列不為AKFVAAWTLKAAA；尤其其中T細胞抗原決定基係選自AKFVAAWTLKAAANRRA-(NH-NH 2)、AKFVAAWTLKAAAN-C、AKFVAAWTLKAAA-C、AKFVAAWTLKAAANRRA-C、aKXVAAWTLKAAaZC、aKXVAAWTLKAAaZCNRRA、aKXVAAWTLKAAa、aKXVAAWTLKAAaNRRA、aA(X)AAAKTAAAAa、aA(X)AAATLKAAa、aA(X)VAAATLKAAa、aA(X)IAAATLKAAa、aK(X)VAAWTLKAAa及aKFVAAWTLKAAa，其中X為L-環己基丙胺酸，Z為胺基己酸，且a為選自丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸及白胺酸之脂肪族胺基酸殘基；及/或 其中T細胞抗原決定基為選自以下之群之α突觸核蛋白多肽：GKTKEGVLYVGSKTK (aa31-45)、KTKEGVLYVGSKTKE     (aa32-46)、EQVTNVGGAVVTGVT    (aa61-75)、VTGVTAVAQKTVEGAGNIAAATGFVK  (aa71-86)、DPDNEAYEMPSE (aa116-130)、DNEAYEMPSEEGYQD     (aa121-135)及EMPSEEGYQDYEPEA (aa126-140)。 8.  根據實施例1至7中任一項之結合物，其中該結合物進一步包含載體蛋白，較佳尤其CRM 197之白喉毒素之無毒交叉反應物質(CRM)、KLH、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、流感嗜血桿菌蛋白D (HipD)及腦膜炎球菌血清群B之外膜蛋白質複合體(OMPC)、銅綠假單胞菌外毒素A之重組無毒形式( rEPA)、鞭毛蛋白、大腸桿菌熱不穩定腸毒素(LT)、霍亂毒素(CT)、突變毒素(例如LTK63及LTR72)、病毒樣顆粒、白蛋白結合蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、合成肽樹枝狀聚合物，例如，多抗原肽(MAP)，尤其是其中結合物中載體蛋白與β-葡聚糖或甘露多醣之比率為1/0.1至1/50、較佳為1/0.1至1/40、更佳為1/0.1至1/20，尤其是1/0.1至1/10， 其中較佳地，結合物係由以下組成或包含以下： (a) β-葡聚糖或甘露多醣 (b)作為至少一種B細胞或T細胞抗原決定基多肽之α突觸核蛋白多肽，及 (c)載體蛋白， 其中該等三種成分(a)、(b)及(c)以順序(a)-(b)-(c)、(a)-(c)-(b)或(b)-(a)-(c)，尤其是以順序(a)-(c)-(b)彼此共價結合；及 其中較佳所有此等成分(a)、(b)及(c)均藉由連接子結合。 9.  根據實施例1至8中任一項之結合物，其中該多肽為或包含至少一種α突觸核蛋白B細胞或T細胞抗原決定基多肽，且其中該結合物進一步包含非α突觸核蛋白B細胞或T細胞抗原決定基。 10. 根據實施例1至8中任一項之結合物，其中α突觸核蛋白多肽為原生α突觸核蛋白或包含原生人類α突觸核蛋白之胺基酸序列的以下胺基酸殘基或由其組成之多肽：1至5、1至8、1至10、60至100、70至140、85至99、91至100、100至108、102至108、102至109、103至129、103至135、107至130、109至126、110至130、111至121、111至135、115至121、115至122、115至123、115至124、115至125、115至126、118至126、121至127、121至140或126至135，該胺基酸序列為： MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA (人類aSyn (1-140 aa)：UNIPROT登錄號P37840)， 較佳為包含以下胺基酸殘基或由其組成之多肽：1至8、91至100、100至108、103至135、107至130、110至130、115至121、115至122、115至123、115至124、115至125、115至126、118至126、121至127或121至140；或選自以下之群的模擬抗原決定基：DQPVLPD、DQPVLPDN、DQPVLPDNE、DQPVLPDNEA、DQPVLPDNEAY、DQPVLPDNEAYE、DSPVLPDG、DHPVHPDS、DTPVLPDS、DAPVTPDT、DAPVRPDS及YDRPVQPDR。 10. 如實施例1至9中任一項之結合物，其中該結合物包含T細胞抗原決定基且不含B細胞抗原決定基，其中該結合物較佳包含多於一個T細胞抗原決定基，尤其是包含兩個、三個、四個或五個T細胞抗原決定基。 11. 根據實施例1至10中任一項之結合物，其用作活性疫苗，用於治療及預防突觸核蛋白病變，較佳為帕金森氏症(PD)、路易氏體癡呆(DLB)、多發性系統萎縮症(MSA)、帕金森氏症癡呆(PDD)、神經軸索性營養不良、伴隨杏仁核受限路易氏體之阿茲海默症(AD/ALB)。 12. 根據實施例1至11中任一項之結合物，其用於誘導目標特異性免疫反應，同時不誘導或僅誘導非常有限之CLEC特異性或載體蛋白特異性抗體反應；及/或 用於誘導目標特異性免疫反應，同時不誘導或僅誘導非常有限之CLEC特異性或載體蛋白特異性抗體反應；及/或 用於伴隨減少或功能異常之Treg群的疾病中以增強減弱/減少Treg數量及活性，且由此減少疾病特異性T效應細胞之自體免疫反應且抑制患者之自體免疫反應，其中使用適合作為Treg抗原決定基或與Treg誘導劑，如雷帕黴素、低劑量IL-2、TNF受體2 (TNFR2)促效劑、抗CD20抗體(例如利妥昔單抗)、潑尼松龍、異丙肌苷、乙酸格拉替雷或丁酸鈉之組合的T細胞抗原決定基；及/或 用於加強或保持PD患者中之T細胞數，尤其T效應細胞數及T細胞功能的治療，其較佳包括使用抗免疫檢查點抑制劑抗原決定基誘導抗免疫檢查點抑制劑免疫反應的檢查點抑制劑或疫苗之組合，以加強或保持PD患者中之T細胞數，尤其是T效應細胞數及T細胞功能，其中PD患者較佳選自CD3+細胞總體減少者，尤其是處於所有疾病期之PD患者典型的CD3+ CD4+細胞總體減少者；較佳為處於H+Y1-4期、更佳為H+Y 1-3期、最佳為H+Y 2-3期之患者。 13. 根據實施例1至12中任一項之結合物，其中β-葡聚糖或甘露多醣係用作C型凝集素(CLEC)多醣佐劑，較佳為用於增強針對給定T細胞抗原決定基多肽之T細胞反應，其中T細胞抗原決定基更佳為線性T細胞抗原決定基，尤其是其中T細胞抗原決定基為多肽，該多肽包含以下胺基酸序列或由其組成：SeqID7、8、22-29、87-131、GKTKEGVLYVGSKTK、KTKEGVLYVGSKTKE、EQVTNVGGAVVTGVT、VTGVTAVAQKTVEGAGNIAAATGFVK、MPVDPDNEAYEMPSE)、DNEAYEMPSEEGYQD、EMPSEEGYQDYEPEA或其組合。 14. 根據實施例1至13中任一項之結合物，其用於增加針對特異性α突觸核蛋白多肽抗原之親和力成熟或用於誘導相對於人類自體抗原α突觸核蛋白之增加之免疫反應。 15. 根據實施例1至14中任一項之結合物，其進一步包含含有T細胞抗原決定基之載體蛋白，以用於減少或消除B細胞對CLEC及/或載體蛋白之反應及/或增強T細胞對載體蛋白之T細胞抗原決定基的反應，其中該載體蛋白較佳為白喉毒素之無毒交叉反應物質(CRM)，尤其是CRM197、KLH、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、流感嗜血桿菌蛋白D (HipD)及腦膜炎球菌血清群B之外膜蛋白質複合體(OMPC)、銅綠假單胞菌外毒素A之重組無毒形式( rEPA)、鞭毛蛋白、大腸桿菌熱不穩定腸毒素(LT)、霍亂毒素(CT)、突變毒素(例如LTK63及LTR72)、病毒樣顆粒、白蛋白結合蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、合成肽樹枝狀聚合物，例如，多抗原肽(MAP)，尤其是其中包含線性T細胞抗原決定基之疫苗中之T細胞抗原決定基功效增強，例如藉由在N或C端添加溶酶體蛋白酶裂解位點，諸如組織蛋白酶L樣裂解位點或組織蛋白酶S樣裂解位點來增強，其中組織蛋白酶L樣裂解位點較佳由以下共同序列界定： X n-X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8X n：來自免疫原性肽之3-27個胺基酸 X 1：任何胺基酸 X 2：任何胺基酸 X 3：任何胺基酸 X 4：N/D/A/Q/S/R/G/L；較佳為N/D，更佳為N X 5：F/R/A/K/T/S/E；較佳為F或R，更佳為R X 6：F/R/A/K/V/S/Y；較佳為F或R，更佳為R X 7：任何胺基酸，較佳為A/G/P/F，更佳為A X 8：半胱胺酸或連接子，如NHNH 2， 其中最佳序列為X n-X 1X 2X 3NRRA-連接子； 且其中組織蛋白酶樣裂解位點較佳由以下共同序列界定： X n-X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8X n：來自免疫原性肽之3-27個胺基酸 X 1：任何胺基酸 X 2：任何胺基酸 X 3：任何胺基酸，較佳為V、L、I、F、W、Y、H，更佳為V X 4：任何胺基酸，較佳為V、L、I、F、W、Y、H，更佳為V X 5：K、R、E、D、Q、N，較佳為K、R，更佳為R X 6：任何胺基酸 X 7：任何胺基酸，較佳為A X 8：較佳為A X 8：半胱胺酸或連接子，如NHNH 2，其中最佳序列為X n-X 1X 2VVRAA-連接子 16. 一種用於產生如實施例1至15中任一項之結合物的方法，其中該β-葡聚糖或甘露多醣係藉由氧化活化且其中使活化β-葡聚糖或甘露多醣與該B細胞抗原決定基多肽及/或該T細胞抗原決定基多肽接觸，由此獲得該β-葡聚糖或甘露多醣與該B細胞抗原決定基多肽及/或該T細胞抗原決定基多肽之結合物。 17. 根據實施例16之方法，其中該β-葡聚糖或甘露多醣係藉由鄰位羥基處之過碘酸鹽氧化、還原胺化或羥基之氰基化獲得。 18. 根據實施例16或17之方法，該β-葡聚糖或甘露多醣被氧化至如下氧化度，該氧化度被界定為與席夫品紅試劑之反應度，其相當於以0.2-2.6、較佳以0.6-1.4、尤其是以0.7-1之莫耳比用過碘酸鹽氧化等量的石耳多醣的氧化度。 19. 根據實施例16至18中任一項之方法，其中結合物係藉由基於腙之偶合將醯肼結合於羰基(醛)，或藉由使用異雙官能順丁烯二醯亞胺及醯肼連接子(例如：BMPH (N-β-順丁烯二醯亞胺基丙酸醯肼、MPBH (4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基-苯基]丁酸醯肼)、EMCH (N-[ε-順丁烯二醯亞胺基己酸)醯肼)或KMUH (N-[κ-順丁烯二醯亞胺基十一酸]醯肼)偶合將巰基(例如：半胱胺酸)與羰基(醛)結合來產生。 20. 一種疫苗產品，其經設計用於針對特定抗原對個體進行接種，其中該產品包含如下化合物，該化合物包含β-(1,6)-葡聚糖或甘露多醣作為與特定抗原共價偶合的C型凝集素(CLEC)多醣佐劑。 21. 根據實施例20之疫苗產品，其中該產品包含根據實施例1至16中任一項或可由/已由實施例16至19中任一項之方法獲得的結合物。 22. 根據實施例20或21之疫苗產品，其中該抗原包含至少一個B細胞抗原決定基及至少一個T細胞抗原決定基，較佳地，其中該抗原為包含一或多個B細胞抗原決定基及T細胞抗原決定基的多肽。 23. 根據實施例20至22中任一項之疫苗產品，其中共價偶合抗原及CLEC多醣佐劑以尺寸為1至5000 nm、較佳為1至200 nm、尤其是2至160 nm的顆粒存在，該尺寸係以流體動力學半徑(HDR)形式藉由動態光散射(DLS)所測定。 24. 根據實施例20至23中任一項之疫苗產品，其中共價偶合抗原及CLEC多醣佐劑以尺寸為1至50 nm、較佳為1至25 nm、尤其是2至15 nm的顆粒存在，該尺寸係以HDR形式藉由DLS所測定。 25. 根據實施例20至24中任一項之疫苗產品，其中共價偶合抗原及CLEC多醣佐劑以尺寸小於100 nm、較佳小於70 nm、尤其小於50 nm的顆粒存在，該尺寸係以HDR形式藉由DLS所測定。 26. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至25中任一項中所定義之結合物或疫苗及醫藥學上可接受之載體。 27. 根據實施例26之醫藥組合物，其中醫藥學上可接受之載體為緩衝液，較佳為磷酸鹽或基於TRIS之緩衝液。 28. 根據實施例26或27之醫藥組合物，其包含在一基於針之遞送系統中，較佳為注射器、微型針系統、空心針系統、實心微針系統或包含針配接器之系統；安瓿、無針注射系統，較佳為噴射注射器；貼劑、經皮貼劑、微結構經皮系統、微針陣列貼劑(MAP)(較佳固體MAP(S-MAP)、包衣MAP(C-MAP)或溶解MAP(D-MAP))；電泳系統、離子電泳系統、基於雷射之系統，尤其是鉺YAG雷射系統；或基因槍系統。 29. 根據實施例26至28中任一項之醫藥組合物，其中結合物或疫苗以溶液或懸浮液、深度冷凍溶液或懸浮液、凍乾物、粉劑或顆粒的形式包含在內。
圖 1 顯示： CLEC 結合物對 ConA 及 DC 受體 ( 即dectin -1) 的 活體外結合活性 A)與當與地衣多醣(Lich)相比時，石耳多醣(Pus)對dectin-1被證明具有更高之結合功效；及 B)與石耳多醣相比，來自燕麥(燕麥_BG265、燕麥_BG391)及大麥(大麥_BG229)之β-葡聚糖顯示出有限的結合功效； C)不同的葡聚糖類型(即石耳多醣、甘露多醣及大麥葡聚糖(229kd))在葡聚糖氧化後保留高或中等的受體結合活性，該活性係藉由競爭性結合分析所評定。「經20%及40%氧化」表示用於結合的葡聚糖部分之氧化狀態。抑制%表示在指定濃度的測試CLEC存在下，抑制可溶性dectin-1受體(石耳多醣及大麥_BG229)或ConA (甘露多醣)與盤結合之β-葡聚糖或甘露多醣的結合抑制程度。 D)石耳多醣結合物及 E)地衣多醣結合物與未偶合之β-葡聚糖相比保持約50%的dectin-1結合能力，該結合能力係藉由競爭性結合分析所評定。 F)藉由異雙官能連接子產生的石耳多醣結合物保持高的dectin-1結合功效。數據以發光ELISA的相對光單位(RLU)顯示。Pus70結合物1-3分別指三種不同的CLEC肽結合物(SeqID2、SeqID10及SeqID16)。Pus 70%及Lich 200%係指各別氧化狀態下的石耳多醣及地衣多醣。BMP HPus係指活化之石耳多醣。BMPH結合物2係指CLEC-SeqID10結合物。 圖 2 顯示： 藉由脂多醣 (LPS) 及不同的石耳多醣製劑活化樹突狀細胞的流式細胞術分析 .
使用粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)在活體外生成未成熟的骨髓衍生之小鼠樹突狀細胞(BMDC)。GM-CSF-BMDC用LPS (經氧化之石耳多醣及石耳多醣結合物製劑中含有的等效劑量)、SeqID2+SeqID7+石耳多醣結合物或僅經氧化之石耳多醣刺激24小時。石耳多醣結合物及僅石耳多醣的使用劑量自62.5 µg/mL開始逐漸增加劑量(直至500 µg/mL)。藉由CD11c/CD11b表現來鑑別DC，且藉由流式細胞術量測根據 A)及 C)SeqID2+SeqID7+石耳多醣結合物或 B)及 D)僅經氧化之石耳多醣之CD80及II類主要組織相容複合體(MHC)的表面表現。藉由CytExpert軟體分析經由石耳多醣製劑處理的DC (=量測)及經由等量的LPS處理(=預期)的DC之活化標誌物的表現。 圖 3 顯示：藉由動態光散射 (DLS) 測定 CLEC 結合物之粒 子尺寸 .
藉由DLS量測自懸浮液或溶液散射的光之強度的隨機變化來測定粒子尺寸。分別顯示 A)SeqID5+SeqID7+石耳多醣(80%氧化狀態)結合物、 B)SeqID6+CRM+石耳多醣結合物及 C)未經修飾之石耳多醣的24小時內之正則化分析及相應的累積半徑分析。 圖 4 顯示：基於不同 CLEC 之疫苗的免疫原性比較。
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。第3次施用後2週採集樣品且分析 A)基於甘露多醣、大麥及石耳多醣之疫苗(SeqID2+SeqID7+CLEC)的抗肽反應(SeqID3)及 B)基於石耳多醣及地衣多醣之疫苗(SeqID2+SeqID7+CLEC及SeqID10+SeqID7+CLEC)的抗肽反應(SeqID3及SeqID11)。 圖 5 顯示：石耳多醣結合物及由未結合的肽及 CLEC 組成之疫苗的免疫原性比較分析 .
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。在第3次施用後2週取樣並分析抗肽反應(SeqID3)。使用之疫苗為：SeqID2+SeqID7+CLEC或未結合的SeqID2、SeqID7及CLEC的混合物。 圖 6 顯示： 含有 B 細胞及 T 細胞抗原決定基的石耳多醣結合物與僅含有各別 B 細胞或 T 細胞抗原決定基之結合物的免疫原性比較分析 .
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。使用之疫苗為：SeqID5+SeqID7+CLEC或SeqID5+CLEC，以及SeqID7+CLEC。在第3次施用後2週取樣且分析抗肽反應(SeqID6)。 圖 7 顯示：使用多肽 - 石耳多醣結合物或含有相應非偶合 成分之疫苗重複免疫接種後小鼠抗石耳多醣抗體反應的比較分析
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。前血漿及t1-t3表示在第一次(t1)、第二次(t2)或第三次(t3)免疫接種之前(血漿前)或之後可偵測到的免疫反應。在第3次施用後2週取樣且分析抗石耳多醣反應。 A)不同疫苗引起的抗石耳多醣反應的分析。 B)免疫反應的動力學。 C)抑制ELISA證明了ELISA系統的特異性。使用之疫苗：SeqID2+SeqID7+CLEC或未結合的SeqID2、SeqID7及CLEC的混合物 圖 8 顯示：使用差異肽偶合方向對基於 CLEC 之疫苗引發的免疫反應進行比較分析 .
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。測試了4種不同的基於CLEC的候選原型疫苗(兩種不同的肽藉由其C端或N端與石耳多醣偶合)。在第3次施用後2週取樣且分析 A)抗肽及 B)抗aSyn蛋白反應。使用之疫苗為：SeqID1/2/4/5+SeqID7+CLEC 圖 9 顯示：使用不同的混雜輔助性 T 細胞抗原決定基對基於 CLEC 之疫苗的免疫原性進行比較分析 .
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。以相應的肽-KLH結合物(疫苗10)分別評估了包含相同B細胞抗原決定基及不同輔助性T抗原決定基(即SeqID7、SeqID22-29)的9種不同的基於CLEC之疫苗(疫苗1-9)所引起的免疫反應。在第3次施用後2週取樣且分析 A)抗肽及 B)抗aSyn蛋白反應。 圖 10 顯示：使用載體蛋白 KLH 作為 T 輔助細胞抗原決定基之來源，基於 CLEC 之疫苗及習知肽 - 蛋白質結合物疫苗誘導之目標蛋白 及 載體蛋白特異性免疫原性的比較分析 .
8-12週齡之雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內或皮下(s.c.)疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應之動力學。相對於與Alum/Alhydrogel共同施用(s.c.，即皮下注射)或不使用額外佐劑(i.d.，即皮內注射)之習知肽-KLH結合物(即SeqID3+KLH及SeqID6+KLH)所誘導之反應，對使用KLH作為輔助性T抗原決定基之來源且結合CLEC修飾(分別為SeqID3+KLH+石耳多醣及SeqID6+KLH+石耳多醣)的2種肽-蛋白質結合物疫苗引發的免疫反應進行評估。在第3次施用後2週取樣且藉由ELISA分析 A)抗肽及抗aSyn蛋白反應及 B)抗KLH反應。 圖 11 顯示：使用載體蛋白 CRM197 作為輔助 性 T 細胞抗原決定基之來源，基於 CLEC 之疫苗及習知肽 - 蛋白質結合物疫苗誘導之目標蛋白及載體蛋白特異性免疫原性的比較分析
8-12週齡之雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內或皮下疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應之動力學。本研究使用2種不同的基於CRM之疫苗類型。SeqID6+CRM+Pus表示隨後與石耳多醣偶合之肽-CRM結合物，而SeqID5+CRM+Pus表示其中肽成分及載體分子已分別與CLEC偶合之結合物。相對於各別習知肽-CRM結合物(即SeqID6+CRM，以Alum/Alhydrogel作為佐劑且皮下施用)評估兩種類型誘導之免疫反應。在第3次施用後2週取樣且藉由ELISA分析A)抗肽及抗aSyn蛋白反應及B)抗CRM反應。 圖 12 顯示：基於 CLEC 之疫苗在活體內針對兩種不同 aSyn 形式引發的免疫反應選擇性的比較分析 .
8-12週齡之雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內或皮下疫苗接種，施用間隔時間為2週。相對於習知肽成分疫苗(SeqID3+KLH+Alum及SeqID6+CRM+Alum，皮下施用)，評估基於CLEC之疫苗(SeqID2+SeqID7+Pus及SeqID5+SeqID7+Pus；皮內施用)及基於CLEC之替代疫苗(SeqID3+KLH+Pus及SeqID6+CRM+Pus；皮內施用)。在第3次施用後2週取樣且進行aSyn選擇性分析(抑制ELISA)。黑線：用於抑制之單體aSyn；虛線：用於抑制之絲狀aSyn。 圖 13 顯示：對基於 CLEC 之疫苗引發的免疫反應中 抗體 分子與抗原的 親和力 (avidity) 的比較分析 .
8-12週齡之雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內或皮下疫苗接種，施用間隔時間為2週。相對於習知肽成分疫苗(SeqID3+KLH+Alum及SeqID6+CRM+Alum，皮下施用)評估基於CLEC之疫苗(SeqID2+SeqID7+Pus及SeqID5+SeqID7+Pus，皮內施用)及基於CLEC之替代疫苗(SeqID3+KLH+Pus及SeqID6+CRM+Pus，皮內施用)。第二次免疫接種(T2)後2週或第三次免疫接種(T3)後兩週取樣，且藉由基於ELISA之親和力分析評定對aSyn之抗體親和力。 圖 14 顯示：對基於 CLEC 之疫苗引發的免疫反應中單一抗原結合區段與抗原的親和力 (affinity) 的比較分析 .
8-12週齡之雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內或皮下疫苗接種，施用間隔時間為2週。相對於習知肽成分疫苗(SeqID3+KLH+Alum及SeqID6+CRM+Alum，皮下施用)評估基於CLEC之疫苗(SeqID2+SeqID7+Pus及SeqID5+SeqID7+Pus，皮內施用)及基於CLEC之替代疫苗(SeqID3+KLH+Pus及SeqID6+CRM+Pus，皮內施用)。在第3次施用後2週取樣，且藉由aSyn位移ELISA分析評定對aSyn的抗體平衡解離常數(Kd)。 圖 15 顯示：由基於 CLEC 之疫苗引起的免疫反應的活體外功能的比較分析 .
8-12週齡之雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內及皮下疫苗接種，施用間隔時間為2週。在第3次施用後2週取樣，且藉由ThT螢光分析評定aSyn特異性抗體存在下aSyn聚集的調節。 A) aSyn在CLEC疫苗誘導之抗體(SeqID2+SeqID7+Pus；皮內施用)、習知肽成分誘導之抗體(SeqID3+KLH+Alum，皮下施用)或鼠類血漿中聚集0-72小時。 B)aSyn或具有預形成之原纖維的aSyn在CLEC疫苗誘導之抗體(SeqID5+SeqID7+Pus及SeqID6+CRM+Pus，皮內施用)、習知肽成分誘導之抗體(SeqID6+CRM+Alum，皮下施用)或鼠類血漿之情況下聚集0-92小時。藉由在t0處對ThT螢光進行標準化來計算動力學曲線，且使用自ThT動力學指數生長期之線性回歸分析中擷取的斜率值來計算aSyn聚集之抑制百分比。 圖 16 顯示：免疫途徑對由基於 CLEC 之疫苗引發的免疫反應的影響的比較分析 .
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠以2週的間隔接受總共3次疫苗接種。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。將包括皮下(s.c.)及肌肉內(i.m.)施用在內的兩種替代途徑與基於CLEC之疫苗的真皮內(i.d.)施用進行了比較。每條途徑皆施用三劑基於CLEC之疫苗(SeqID2+SeqID7+Pus)。在第3次施用後2週取樣且分析 A)抗肽及 B)抗aSyn蛋白反應。 圖 17 顯示：使用不同肽 -CRM197/CLEC 比率的基於 CLEC 之肽 -CRM197 結合物疫苗誘導之目標蛋白特異性免疫原性的比較分析
8-12週齡之雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應之動力學。本研究使用5種不同的基於肽-CRM之疫苗，其具有不同的肽-CRM/石耳多醣比率(w/w)。所有5個組均已用SeqID6+CRM+Pus結合物免疫。1:1、1:2.5、1:5、1:10及1:20表示肽-CRM結合物/CLEC w/w比率為1/1、1/2.5、1/5、1/10及1/20之結合物。使用第3次施用後2週採集的樣本評估誘導之免疫反應，且藉由ELISA分析抗aSyn蛋白反應。效價測定係基於ODmax/2的計算。 圖 18 顯示：由含有來自 aSyn (aa1-8) 的 B 細胞抗原決定基的 CLEC 疫苗引發的免疫反應的比較分析 .
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次疫苗接種，施用間隔時間為2週(i.d.及s.c.)。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。將基於CLEC之疫苗(SeqID12+SeqID7+石耳多醣，i.d.)相對於傳統的基於肽成分結合物之疫苗(SeqID13與KLH及Alhydrogel (Alum)結合，s.c.)進行了評估。第3次施用後2週取樣且分析A)抗肽及抗aSyn蛋白反應及B)aSyn選擇性(抑制ELISA)。黑線：用於抑制之單體aSyn；虛線：用於抑制之絲狀aSyn 圖 19 顯示了由含有來自 aSyn (aa100-108) 的 B 細胞抗原決定基的 CLEC 疫苗引發的免疫反應的比較分析 .
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次疫苗接種，施用間隔時間為2週(i.d.及s.c.)。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。將基於CLEC之疫苗(SeqID16+SeqID7及石耳多醣，i.d.)相對於習知的基於肽成分結合物之疫苗(SeqID17與KLH及Alhydrogel (Alum)結合，s.c.)進行了評估。第3次施用後2週取樣且分析A)抗肽及抗aSyn蛋白反應及B)aSyn選擇性(抑制ELISA)。黑線：用於抑制之單體aSyn；虛線：用於抑制之絲狀aSyn。 圖 20 顯示了由含有來自 aSyn (aa91-97) 的 B 細胞抗原決定基的 CLEC 疫苗引發的免疫反應的比較分析 .
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次疫苗接種，施用間隔時間為2週(i.d.及s.c.)。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。基於CLEC之疫苗(SeqID14+SeqID7及石耳多醣，i.d.)針對習知的基於肽成分結合物之疫苗(SeqID15與KLH及Alhydrogel (Alum)結合，s.c.)進行了評估。在第3次施用後2週取樣且分析抗肽及抗aSyn蛋白反應。 圖 21 顯示了由含有來自 aSyn (aa130-140) 的 B 細胞抗原決定基的 CLEC 疫苗引發的免疫反應的比較分析 .
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次疫苗接種，施用間隔時間為2週(i.d.及s.c.)。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。將基於CLEC之疫苗(SeqID20+SeqID7及石耳多醣，i.d.)相對於習知的基於肽成分結合物之疫苗(SeqID21與KLH及Alhydrogel (Alum)結合，s.c.)進行了評估。第3次施用後2週取樣且分析A)抗肽及抗aSyn蛋白反應及B)aSyn選擇性(抑制ELISA)。黑線：用於抑制之單體aSyn；虛線：用於抑制之絲狀aSyn。 圖 22 顯示了由含有來自 aSyn (aa115-122) 的 B 細胞抗原決定基的 CLEC 疫苗引發的免疫反應的比較分析 .
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次疫苗接種，施用間隔時間為2週(i.d.及s.c.)。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。將基於CLEC之疫苗(SeqID51+SeqID7及石耳多醣，i.d.)相對於習知的基於肽成分結合物之疫苗(SeqID52與CRM及Alhydrogel (Alum)結合，s.c.)進行了評估。在第3次施用後2週取樣且分析A)抗肽及抗aSyn絲反應及B)aSyn選擇性(抑制ELISA)。黑線：用於抑制之單體aSyn；虛線：用於抑制之絲狀aSyn。 圖 23 顯示了由含有來自 aSyn (aa115-124) 的 B 細胞抗原決定基的 CLEC 疫苗引發的免疫反應的比較分析 .
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次疫苗接種，施用間隔時間為2週(i.d.及s.c.)。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。將基於CLEC之疫苗(SeqID67+SeqID7及石耳多醣，i.d.)相對於傳統的基於肽成分結合物之疫苗(SeqID68與CRM及Alhydrogel (Alum)結合，s.c.)進行了評估。在第3次施用後2週取樣且分析A)抗肽及抗aSyn絲反應及B)aSyn選擇性(抑制ELISA)。黑線：用於抑制之單體aSyn；虛線：用於抑制之絲狀aSyn。 圖 24 顯示了由含有來自 aSyn (aa107-113) 的 B 細胞抗原決定基的 CLEC 疫苗引發的免疫反應的比較分析 .
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次疫苗接種，施用間隔時間為2週(i.d.及s.c.)。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。將基於CLEC之疫苗(SeqID73+SeqID7及石耳多醣，i.d.)相對於傳統的基於肽成分結合物之疫苗(SeqID74與CRM及Alhydrogel (Alum)結合，s.c.)進行了評估。在第3次施用後2週取樣且分析A)抗肽及抗aSyn絲反應及B)aSyn選擇性(抑制ELISA)。黑線：用於抑制之單體aSyn；虛線：用於抑制之絲狀aSyn。 圖 25 顯示了由基於 CLEC 之疫苗引發的免疫反應的活體外功能的比較分析 .
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次疫苗接種，施用間隔時間為2週(i.d.及s.c.)。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。在第3次應用後2週採集樣品，且在AC、CLEC疫苗誘導的抗體(SeqID67/71/73+SeqID7及石耳多醣，i.d.)或習知肽成分存在的情況下評估ThT動力學測量(即aSyn的纖維狀部分)-誘導的抗體(SeqID68/72/74與CRM及Alhydrogel (Alum)結合，s.c.)，或D)aSyn特異性單株抗體LB09或未經處理的小鼠血漿。 圖 26 顯示 CRM197-CLEC 結合物在活體外對鼠 DC 受體 ( 即dectin -1) 之結合活性.
顯示藉由ELISA測定的dectin-1結合能力的比較分析。A) Pus係指未經修飾之石耳多醣，且pus oxi係指活化之石耳多醣。CRM-pus結合物1係指SeqID6+CRM197+石耳多醣結合物，且CRM結合物1係指不含β-葡聚糖修飾之CRM197+SeqID6結合物。陰性對照組係指不含抑制劑之樣品。B) SeqID52/66/68/70/72係指具有指定B細胞抗原決定基的CRM197-石耳多醣結合物；C) Lich oxi係指活化之地衣多醣，且CRM-Lich結合物1係指SeqID6+CRM197+地衣多醣結合物。D) Lam oxi係指活化之昆布多醣，且CRM-Lam結合物1係指SeqID6+CRM197+昆布多醣結合物。 圖 27 顯示 CRM197-CLEC 結合物在活體外對人類 DC 受體 ( 即dectin -1) 的結合活性 .
顯示藉由ELISA測定的dectin-1結合能力的比較分析。Lich結合物係指SeqID6+CRM197+地衣多醣結合物，Pus結合物係指SeqID6+CRM197+石耳多醣結合物，且Lam結合物係指SeqID6+CRM197+昆布多醣結合物。陰性對照組係指不含抑制劑之樣品。 圖 28 顯示不同的基於 CRM- 石耳多醣之疫苗的免疫原性比較 .
8-12週齡之雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應之動力學。在第3次施用後2週取樣且分析A)抗肽反應B)抗聚集的aSyn纖維反應。 圖 29 顯示由基於肽 +CRM+ 石耳多醣之疫苗相對於 aSyn 纖維在活體內引發的免疫反應之選擇性的比較分析 .
8-12週齡之雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內或皮下疫苗接種，施用間隔時間為2週。相對於習知CRM疫苗評估基於CRM-石耳多醣之疫苗。在第3次施用後2週取樣且進行aSyn選擇性分析(抑制ELISA)。顯示隨著aSyn纖維的劑量增加而受到抑制的抗體的IC50值。 圖 30 顯示肽 +CRM197+ 石耳多醣疫苗誘導之抗體 分子與抗原的 親和力 (a vidity ) .
顯示在用不同濃度的離液劑硫氰酸鈉(NaSCN)攻擊後由肽+CRM197+石耳多醣或肽+CRM197疫苗誘導之aSyn-抗體複合體的穩定性及測定之親和力指數。 圖 31 顯示不同的基於 CLEC 之疫苗的免疫原性比較 .
8-12週齡之雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應動力學。在第3次施用後2週取樣並分析由基於肽+載體+葡聚糖之疫苗或非CLEC修飾之以Alum作為佐劑之疫苗誘導之抗SeqID6肽反應(A)及抗aSyn纖維反應(B)；劑量：20µg肽當量/注射；石耳多醣表示SeqID6+CRM+石耳多醣，地衣多醣表示SeqID6+CRM+地衣多醣，昆布多醣表示SeqID6+CRM+昆布多醣，且s.c.+Alum表示非CLEC修飾之以Alum作為佐劑的疫苗SeqID6+CRM。 圖 32 顯示肽 -CLEC- 結合物在活體外對鼠 (A) 及人類 (B)DC 受體 ( 即dectin -1) 的結合活性。
顯示了藉由ELISA確定的dectin-1結合能力的比較分析。Lich結合物是指SeqID5+SeqID7+地衣多醣結合物，Pus結合物是指SeqID5+SeqID7+石耳多醣結合物，Lam結合物是指SeqID5+SeqID7+昆布多醣結合物。陰性對照組是指不含抑制劑的樣品。 圖 33 顯示了不同的基於 CLEC 之疫苗的免疫原性比較。
8-12週齡的雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應的動力學。在第3次施用後2週取樣且分析抗肽反應(SeqID6，表示為肽)及基於肽-葡聚糖之疫苗誘導的抗aSyn反應(表示為蛋白質)(即：SeqID5+SeqID7+CLEC，劑量：5µg ( A)及20µg/注射( B)；地衣多醣表示SeqID5+SeqID7+地衣多醣；昆布多醣表示SeqID5+SeqID7+昆布多醣；而石耳多醣表示SeqID5+SeqID7+石耳多醣) 圖 34 顯示 SeqID5+SeqID7+ 石耳多醣疫苗誘導的抗體在活體內 PFF 模型中抑制 aSyn 聚集 .
自PFF接種當天開始，將以重組aSynPFF立體定向注射到右側黑質中的C57BL/6小鼠使用SeqID5+SeqID7+石耳多醣疫苗(疫苗)或未結合的CLEC(載體)作為對照組進行免疫接種四次。第三次免疫接種後收集血漿。PFF接種後126天收穫腦、血漿及CSF。用於免疫的肽特異性抗體的血漿效價(A)在第126天進行第三次免疫接種後兩週收集。(B)在第126天時腦脊液及疫苗B細胞肽特異性抗體的血漿效價比較。(C)SeqID5+SeqID7+石耳多醣疫苗接種及CLEC處理的小鼠所有腦區的磷-S129aSyn陽性聚集體分析。(D)抗體反應與疫苗接種者突觸核蛋白病水平的相關性(r=-0.9391；CI(95%)-0.9961至-0.3318，p=0.0179，R2=0.882)。(E-H)在注射的大腦半球中代表pSer129aSyn染色在(E,F)黑質及(G,H)紋狀體的水平。(E,G)以載體處理的小鼠類及(F,H)以疫苗處理後進行PFF注射的小鼠。誤差棒表示每組n=5-9隻動物的平均值±SEM。藉由未配對的t檢驗評估統計差異；**p＜0.01；*p＜0.05。 圖 35 顯示肽 + CLEC 及肽 +CRM+CLEC 結合物之載體特異性免疫原性分析
8-12週齡之雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內/皮下疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應之動力學。相對於各別以Alum為佐劑的肽+CRM197結合物，分別評估由相應的SeqID6+CRM197+石耳多醣所引發的免疫反應。第3次施用後2週取樣且分析活體內抗CRM反應。 圖 36 顯示肽 +CRM+CLEC 結合物之 CLEC 特異性免疫原性分析
8-12週齡之雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應之動力學。評估了不同的基於CLEC之疫苗引起的免疫反應。在第3次施用後2週取樣且分析活體內抗石耳多醣反應； A)樣品：SeqID6+CRM197+石耳多醣，SeqID6+CRM197+地衣多醣；SeqID6+CRM197+昆布多醣 ； B)樣品SeqID6+CRM197+石耳多醣；以指定的結合物/石耳多醣比率(w/w)偶合的石耳多醣；前血清：免疫接種前獲得的樣品；陽性對照組：來自僅用未經氧化之石耳多醣免疫接種的動物的樣品。 圖 37 顯示：肽 + 載體 + 葡聚糖結合物及由肽 + 載體結合物及未結合之葡聚糖組成之疫苗的免疫原性分析 .
8-12週齡之雌性BALB/c小鼠接受總共3次皮內疫苗接種，施用間隔時間為2週。在基線及每次接種疫苗後收集血液樣本，以瞭解隨後的免疫反應之動力學。第3次施用後2週取樣且分析抗SeqID6肽(A)及抗aSyn單體(B)反應。所用疫苗：SeqID6-CRM197-石耳多醣：SeqID6+CRM197+石耳多醣，SeqID6-CRM197+Pus(無結合)：與未經氧化之石耳多醣混合之無佐劑之SeqID6+CRM197及SeqID6-CRM197：非CLEC修飾、無佐劑之SeqID6+CRM197。
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Claims (15)

  1. 一種結合物，其包含或由至少一β-葡聚糖或甘露多醣及至少一B細胞或T細胞抗原決定基多肽組成，其中該β-葡聚糖或甘露多醣共價結合於該B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽以形成該β-葡聚糖或甘露多醣與該B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽之結合物，且其中該B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽為α突觸核蛋白多肽。
  2. 如請求項1之結合物，其中該β-葡聚糖為dectin-1結合β-葡聚糖，較佳為石耳多醣、地衣多醣、昆布多醣、卡德蘭多醣、β-葡聚糖肽(BGP)、裂褶多醣、硬葡聚糖、全葡聚糖顆粒(WGP)、酵母多醣或蘑菇多醣，更佳為石耳多醣、昆布多醣、地衣多醣、蘑菇多醣、裂褶多醣或硬葡聚糖，尤其是其中該β-葡聚糖為石耳多醣；及/或其中該β-葡聚糖為強dectin-1結合β-葡聚糖，較佳為如下β-葡聚糖，如藉由競爭性ELISA所測定，其以低於10 mg/ml之IC50值、更佳低於1 mg/ml之IC50值、甚至更佳低於500 µg/ml之IC50值、尤其低於200 µg/ml之IC50值結合於可溶性鼠類Fc-dectin-1a受體；及/或其中如藉由競爭性ELISA所測定，該等結合物以低於1 mg/ml之IC50值、更佳以低於500 µg/ml之IC50值、甚至更佳以低於200 µg/ml之IC50值、尤其是以低於100 µg/ml之IC50值結合於可溶性鼠類Fc-dectin-1a受體。
  3. 如請求項1或2之結合物，其中該β-葡聚糖為主要呈線性的β-(1,6)-葡聚糖，其(1,6)偶合之單醣部分與非β-(1,6)偶合之單醣部分之比率為至少1:1、較佳為至少2:1、更佳為至少5:1、尤其是至少10:1。
  4. 如請求項1至3中任一項之結合物，其中α突觸核蛋白多肽包含至少一個B細胞抗原決定基。
  5. 如請求項1至4中任一項之結合物，其中B細胞抗原決定基及泛特異性/混雜T細胞抗原決定基獨立地與該β-葡聚糖或甘露多醣結合。
  6. 如請求項1至5中任一項之結合物，其中該B細胞抗原決定基多肽之長度為5至20個胺基酸殘基、較佳為6至19個胺基酸殘基、尤其是7至15個胺基酸殘基。
  7. 如請求項1至6中任一項之結合物，其中該T細胞抗原決定基多肽之長度為8至30個胺基酸殘基、較佳為13至29個胺基酸殘基、尤其是13至28個胺基酸殘基。
  8. 如請求項1至7中任一項之結合物，其中該結合物進一步包含載體蛋白，較佳係選自白喉毒素之無毒交叉反應物質(CRM)，尤其是CRM197、KLH、白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、流感嗜血桿菌( Haemophilus influenzae)蛋白D (HipD)及腦膜炎球菌血清群B之外膜蛋白質複合體(OMPC)、銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginosa)外毒素A之重組無毒形式( rEPA)、鞭毛蛋白、大腸桿菌熱不穩定腸毒素(LT)、霍亂毒素(CT)、突變毒素(例如LTK63及LTR72)、病毒樣顆粒、白蛋白結合蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、合成肽樹枝狀聚合物，例如，多抗原肽(MAP)。
  9. 如請求項1至8中任一項之結合物，其中該多肽為或包含B細胞或T細胞抗原決定基多肽，較佳其中該多肽為B細胞及T細胞抗原決定基或包含B細胞及T細胞抗原決定基。
  10. 如請求項1至8中任一項之結合物，其中該結合物包含T細胞抗原決定基，較佳為包含視情況與連接子連接之胺基酸序列AKFVAAWTLKAAA的T細胞抗原決定基，較佳為AKFVAAWTLKAAANRRA-(NH-NH2)、AKFVAAWTLKAAAN-C、AKFVAAWTLKAAA-C、AKFVAAWTLKAAANRRA-C；或其選自以下之變異體：aKXVAAWTLKAAaZC、aKXVAAWTLKAAaZCNRRA、aKXVAAWTLKAAa、aKXVAAWTLKAAaNRRA、aA(X)AAAKTAAAAa、 aA(X)AAATLKAAa、 aA(X)VAAATLKAAa、 aA(X)IAAATLKAAa、aK(X)VAAWTLKAAa，其中X為L-環己基丙胺酸，Z為胺基己酸，且a為選自丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸及白胺酸之脂肪族胺基酸殘基。
  11. 如請求項1至10中任一項之結合物，其中該結合物中的β-葡聚糖或甘露多醣與B細胞及/或T細胞抗原決定基多肽之比率為10:1 (w/w)至0.1:1 (w/w)、較佳為8:1 (w/w)至2:1 (w/w)、尤其是4:1 (w/w)。
  12. 如請求項1至11中任一項之結合物，其係用作活性抗α突觸核蛋白疫苗，用於治療及預防觸核蛋白病變，較佳為帕金森氏症(PD)、路易氏體癡呆(DLB)、多發性系統萎縮症(MSA)、帕金森氏症癡呆(PDD)、神經軸索性營養不良、伴隨杏仁核受限路易氏體之阿茲海默症(AD/ALB)。
  13. 一種用於產生如請求項1至12中任一項之結合物的方法，其中該β-葡聚糖或甘露多醣藉由氧化活化且其中使該活化β-葡聚糖或甘露多醣與該B細胞抗原決定基多肽及/或該T細胞抗原決定基多肽接觸，由此獲得該β-葡聚糖或甘露多醣與該B細胞抗原決定基多肽及/或該T細胞抗原決定基多肽之結合物。
  14. 如請求項13之方法，其中該β-葡聚糖或甘露多醣係藉由鄰位羥基處之過碘酸鹽氧化、還原胺化或羥基之氰基化獲得。
  15. 如請求項13或14之方法，其中該β-葡聚糖或甘露多醣被氧化至如下氧化度，該氧化度被界定為與席夫品紅試劑(Schiff's fuchsin-reagent)之反應度，其相當於以0.2-2.6、較佳以0.6-1.4、尤其是以0.7-1之莫耳比用過碘酸鹽氧化等量的石耳多醣的氧化度。
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