KR20220127943A - 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도 - Google Patents

제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220127943A
KR20220127943A KR1020227031129A KR20227031129A KR20220127943A KR 20220127943 A KR20220127943 A KR 20220127943A KR 1020227031129 A KR1020227031129 A KR 1020227031129A KR 20227031129 A KR20227031129 A KR 20227031129A KR 20220127943 A KR20220127943 A KR 20220127943A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polypeptide
chondroitinase
hyaluronidase
agent
antigen
Prior art date
Application number
KR1020227031129A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102624967B1 (ko
Inventor
트레버 스미스
니나 쇼머
케이트 브로데릭
브라이언 융
캐서린 슐테이스
Original Assignee
이노비오 파마수티컬즈, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이노비오 파마수티컬즈, 인크. filed Critical 이노비오 파마수티컬즈, 인크.
Priority to KR1020247000963A priority Critical patent/KR20240011868A/ko
Publication of KR20220127943A publication Critical patent/KR20220127943A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102624967B1 publication Critical patent/KR102624967B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/40—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum bacterial
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0016—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the nucleic acid is delivered as a 'naked' nucleic acid, i.e. not combined with an entity such as a cationic lipid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0002—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy
    • A61K9/0009—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy involving or responsive to electricity, magnetism or acoustic waves; Galenical aspects of sonophoresis, iontophoresis, electroporation or electroosmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1214—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2474—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01035—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02004—Chondroitin ABC lyase (4.2.2.4), i.e. chondroitinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02005—Chondroitin AC lyase (4.2.2.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Abstract

대상체에 제제의 전달 방법이 본 명세서에서 개시된다. 대상체에서 질환 또는 장애의 치료 방법이 본 명세서에서 추가로 개시된다. 상기 방법은 글리코사미노글리칸을 분해시키는데 충분한 양으로 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 대상체에 투여하는 단계, 및 제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 히알루로니다제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

Description

제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도{THE IN VIVO USE OF CHONDROITINASE AND/OR HYALURONIDASE TO ENHANCE DELIVERY OF AN AGENT}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2016년 4월 29일 출원된 미국 가출원 번호 62/329,593, 2016년 5월 13일 출원된 미국 가출원 번호 62/336,501, 및 2017년 4월 21일 출원된 미국 가출원 번호 62/488,605에 우선권을 주장하고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 통합된다.
분야
본 개시내용은 제제의 전달에 관한 것이다. 본 개시내용은 대상체에서 질환의 예방 및/또는 치료에 관한 것이다. 방법은 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
도입
글리코사미노글리칸 (GAGs)는 세포외 매트릭스 (ECM)의 복합 선형 다당류이다. GAGs는 N-치환된 헥소사민 그리고 (예를 들면, 히알루로난 (HA), 콘드로이틴 설페이트 (CS), 콘드로이틴 (C), 데르마탄 설페이트 (DS), 헤파란 설페이트 (HS), 헤파린 (H)에서) 우론산 또는 (예를 들면, 케라탄 설페이트 (KS)에서) 갈락토스의 반복 2당류 구조를 특징으로 한다. 히알루로난을 제외하고, 모두는 코어 단백질에 공유결합되어 실재한다. 그것의 코어 단백질을 가진 GAGs는 구조적으로 프로테오글리칸 (PGs)로 지칭된다.
콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (CSPGs)은 세포외 매트릭스의 주요 성분이고 다양한 기능적 역할을 갖는다. 예를 들어, CSPGs는 세포로부터 일반적으로 분비되고, 연골을 포함하는, 여러 가지의 인간 조직의 구조 성분이고, 특정 세포 공정, 예컨대 세포 접착, 세포 성장, 수용체 결합, 세포 이동, 및 다른 세포외 매트릭스 구성성분과 상호작용에서 관연된다고 공지된다. 이들 다른 세포외 매트릭스 구성성분은 라미닌, 파이브로넥틴, 테나스신, 및/또는 콜라겐일 수 있다. 히알루로난은 또한, 특히 연질 결합 조직에서, 세포외 매트릭스의 주요 성분 중 하나이다. 결합 조직에서, 히알루로난과 관련된 수화의 물은 조직 사이 공간을 창출하고, 따라서 세포 운동 및 증식에 공헌하는 환경을 창출한다. 히알루로난은 신속 발달, 재생, 회복, 배아발생, 발생학적 발달, 상처 치유, 혈관신생, 세포 조절, 세포 발달, 세포성 분화, 및 세포 이동을 포함하는 세포 운동성과 관련된 생물학적 현상에서 핵심 역할을 한다. 히알루로난 생산은 세포 증식에서 증가하고 종양형성에서 역할을 가질 수 있다.
세포외 매트릭스는, 대부분의 조직의 세포외 공간에서 치밀한, 조직화된 네트워크내 조립된, 단백질 및 다당류 분자를 포함한다. 세포외 매트릭스의 주요 성분 중 하나로서, CSPGs 및 히알루로난은 그것의 점성 용액 형성 특성에 의해 세포외 매트릭스의 특징에 영향을 발휘한다. 안전한, 비용 효과적인, 및 효율적인 방식으로 대상체에 제제를 전달하기 위해 조직 및 세포외 매트릭스를 횡단하는 수단에 대하여 기술 분야에서 요구가 남아 있다.
요약
본 발명의 양태는 대상체에 제제의 전달 방법을 포함하고, 여기서 상기 방법은 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (CSPG)를 분해시키는데 충분한 양으로 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 대상체에 투여하는 단계, 및 제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. CSPG는, 예를 들어, 아그레칸 (CSPG1), 베르시칸 (CSPG2), 뉴로칸 (CSPG3), CSPG4 (흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸, NG2), CSPG5, SMC3 (CSPG6, 염색체 3의 구조 유지), 브레비칸 (CSPG7), CD44 (CSPG8, 분화 44의 클러스터), 포스파칸, 또는 이의 조합일 수 있다. 제제는 대상체에서 면역 반응을 불법일 수 있거나 면역 반응을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 대상체에서 질환 또는 장애의 치료 방법을 포함하고, 여기서 상기 방법은 대상체에 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 단계; 및 대상체에 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 기재된 임의의 방법에서, 제제는, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 소 분자, 또는 이의 조합일 수 있다. 제제는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 단클론성 항체를 인코딩할 수 있다. 제제는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 단클론성 항체를 포함할 수 있다. 단클론성 항체는 생체내 발현될 수 있다. 제제는 전기천공을 통해 대상체에 투여될 수 있다.
콘드로이티나제 폴리펩타이드 및 단클론성 항체는 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩될 수 있다. 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 단클론성 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 또는 별개의 벡터 내에 포함될 수 있다.
임의의 본 명세서에서 기재된 방법에서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 제제의 투여에 앞서 대상체에 투여될 수 있다. 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 제제의 투여에 적어도 약 15 분 내지 약 24 시간 앞서 대상체에 투여될 수 있다. 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제는 동시에 대상체에 투여될 수 있다. 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제는 피하로 또는 근육내로 대상체에 투여될 수 있다. 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 콘드로이티나제 폴리펩타이드는 CSPG를 가수분해시키고 대상체의 세포외 매트릭스의 해체를 유발시킨다.
본 발명의 다른 양태는 글리코사미노글리칸을 분해시키는데 충분한 양으로 임의의 본 명세서에서 기재된 방법에서 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 단계를 또한 포함한다. 글리코사미노글리칸은 히알루로난을 포함할 수 있다. 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 콘드로이티나제와 동시에 투여될 수 있다. 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 제제의 투여에 앞서 대상체에 투여될 수 있다. 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 제제의 투여에 적어도 약 15 분 내지 약 24 시간 앞서 대상체에 투여될 수 있다. 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제는 동시에 대상체에 투여될 수 있다. 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제는 피하로 또는 근육내로 대상체에 투여될 수 있다.
콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제는 투여에 앞서 공-제형화될 수 있다. 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제는 투여에 앞서 공-제형화될 수 있다.
본 개시내용은 하기 상세한 설명 및 수반하는 도면의 면에서 분명할 다른 양태 및 구현예를 제공한다.
도 1은 그룹 1 내지 4 (Balb/c 마우스, 6-7 주)에서 일 0-7 사이 ELISA에 의해 측정된 hIgG의 수준 (ng/ml)을 보여준다. 그룹 1 (회색) PBS 및 pGX9214, 그룹 2 히알루로니다제 전처리 및 pGX9214 (청색), 그룹 3 콘드로이티나제 및 pGX9214 (녹색), 그룹 4 히알루로니다제/ 콘드로이티나제 전처리 및 pGX9214 (갈색).
도 2는 그룹 1 내지 4 (C57BL/6, 6-7 주)에서 일 0-7 사이 ELISA에 의해 측정된 hIgG의 수준 (ng/ml)를 보여준다. 그룹 1 (회색) PBS 및 pGX9214, 그룹 2 히알루로니다제 전처리 및 pGX9214 (청색), 그룹 3 콘드로이티나제 및 pGX9214 (녹색), 그룹 4 히알루로니다제/ 콘드로이티나제 전처리 및 pGX9214 (갈색).
도 3은 그룹 1 내지 4에서 일 0-21 사이 ELISA에 의해 측정된 hIgG의 수준 (ng/ml)를 보여준다. 그룹 1 (회색) PBS 및 pGX9214, 그룹 2 히알루로니다제 전처리 및 pGX9214 (암적색), 그룹 3 콘드로이티나제 및 pGX9214 (밝은 적색), 그룹 4 히알루로니다제/ 콘드로이티나제 전처리 및 pGX9214 (담홍색 - 하틀리 기니 피그).
도 4는 그룹 1 내지 4에서 개별 기니 피그내 일 0-21 사이 ELISA에 의해 측정된 hIgG의 수준 (ng/ml)를 보여준다. 도 4A: 그룹 1 PBS. 도 4B: 400U/ml로 그룹 2 히알루로니다제 전처리. 도 4C: 그룹 3 콘드로이티나제 (0.5U/ml). 도 4D: 그룹 4 히알루로니다제 400U/ml 및 콘드로이티나제 0.5U/ml 전처리.
도 5는 콘드로이티나제가 Balb/c 마우스에서 플라스미드-인코딩된 hlgG 발현을 향상시키는 것을 보여준다. (a) 그룹 1 및 2 (Balb/c 마우스, 6-7 주)에서 일 0-7 사이 ELISA에 의해 측정된 hIgG의 수준 [ng/ml]. 그룹 1 (회색) PBS 및 pGX9214, 그룹 2 콘드로이티나제 전처리 및 pGX9214 (흑색). (b) 일 7에서 콘드로이티나제에 의한 hIgG의 유의미한 향상. 만 휘트니 시험에 의해 수행된 통계, P = 0.0079.
도 6은 콘드로이티나제가 C57BL/6 마우스에서 플라스미드-인코딩된 hIgG 발현을 향상시킨다는 것을 보여준다. (a) 그룹 1 및 2 (Balb/c 마우스, 6-7 주)에서 일 0-7 사이 ELISA에 의해 측정된 hIgG의 수준 [ng/ml]. 그룹 1 (회색) PBS 및 pGX9214, 그룹 2 콘드로이티나제 전처리 및 pGX9214 (흑색). (b) 일 7에서 콘드로이티나제에 의한 hIgG의 유의미한 향상. 만 휘트니 시험에 의해 수행된 통계, P = 0.0079.
도 7은 DMAb 발현을 향상시키기 위한 콘드로이티나제의 상이한 버전의 능력의 조사를 보여준다. 그래프는 그룹 1-4 (Balb/c)에서 일 7에 ELISA에 의해 측정된 hIgG 수준 (ng/ ml)를 나타낸다. 마우스는 어느 한쪽 PBS (대조군 그룹 1), 콘드로이티나제 AC, 임상 등급 콘드로이티나제 ABC 또는 재조합 단백질 GALNS로 처리되었다. 모든 그룹은 pGX9203의 주사를 받았고 이어서 전기천공되었다. 크루스칼-왈리스 시험에 의해 수행된 통계, **P = 0.0026.
도 8은 증가하는 콘드로이티나제 ABC 용량이 DNA-기반 단백질 발현을 추가로 향상시키는 것을 보여준다. Balb/c 마우스는 pDNA (pGX9207) 주사 및 전기천공 30 분 앞서 콘드로이티나제 ABC의 증가 용량으로 처리되었다. hIgG의 수준은 ELISA에 의해 측정되었다. 크루스칼-왈리스 시험에 의해 수행된 통계, *P = 0.0357.
도 9는 향상된 형광성 단백질 발현에서 콘드로이티나제 투여 결과를 보여준다. (a) 골격근에 어느 한쪽 콘드로이티나제 또는 PBS로 처리된 Balb/c 마우스의 좌측 및 우측 뒷다리. 리포터 단백질 발현의 가시화는 형광 이미저 (Protein Simple)에 의해 수행되었다. (b) 임의의 유닛 형광 강도는 리포터 유전자 발현과 평행하고 AlphaView SA 소프트웨어 사용에 의해 정량화되었다. 만 휘트니 시험에 의해 수행된 통계, P = 0.0022.
도 10은 H&E 염색에 의해 수행된 쥣과 뒷다리 골격근의 대표적인 조직병리를 보여준다. 최상부 패널은 어느 한쪽 PBS 단독 (대조군) 또는 콘드로이티나제 ABC 단독으로 처리된 조직을 보여준다. pDNA 전달 전 어느 한쪽 콘드로이티나제 또는 PBS (대조군)으로 전처리된 (30 분) 근육은 최하부 도에서 제시된다. 결과는 슬라이드 스캐너 및 CaseViewer 소프트웨어 (3DHISTECH)에 의해 분석되었다. 척도 = 200 μm.
도 11은 콘드로이티나제 ABC가 뉴질랜드 래빗 (9 주)에서 플라스미드-인코딩된 hIgG 발현을 향상시키는 것을 보여준다. (a) 그룹 2 (콘드로이티나제-전처리된, 회색)에서 그리고 그룹 1 (PBS 대조군, 흑색)에서 일 0과 6 사이 ELISA에 의해 측정된 hIgG의 수준 [ng/ml]이 제시된다. (b) 그래프는 ELISA에 의해 측정된 일 6으로부터 hIgG 수준을 보여준다. 만 휘트니 시험에 의해 수행된 통계, P = 0.0043.
도 12는 마우스 (Balb/c; 14 마우스 / 그룹)에서 pDNA (pGX9207)을 가진 콘드로이티나제의 공-제형화를 보여준다. 그래프는 ELISA에 의해 측정된 일 6으로부터 hIgG 수준 [ng/ml]를 보여준다. 만 휘트니 시험에 의해 수행된 통계, ****P < 0.0001.
도 13은 향상된 형광성 단백질 발현에서 콘드로이티나제 투여 결과를 보여준다. (a) 골격근에 어느 한쪽 콘드로이티나제 또는 PBS로 처리된 Balb/c 마우스의 좌측 및 우측 뒷다리. 리포터 단백질 발현의 가시화는 형광 이미지형성 시스템에 의해 수행되었다. (b) 임의의 단위 형광 강도는 리포터 유전자 발현과 평행하고 AlphaView SA 소프트웨어 사용에 의해 정량화되었다. 만 휘트니 시험에 의해 수행된 통계, **P = 0.0004.
도 14는 래빗 (뉴질랜드 래빗; 6마리 래빗 / 그룹)에서 pDNA (pGX9207)을 가진 콘드로이티나제의 공-제형화를 보여준다. (a) 그래프는 ELISA에 의해 측정된 일 0부터 일 5까지 혈청 hIgG 수준 [ng/ml]을 보여준다. 그룹 1, 2 및 4의 비교. (b) 일 5에서 측정된 모든 그룹의 래빗 혈청 hIgG 수준. 만 휘트니 시험에 의해 수행된 통계, ****P < 0.0001.
도 15는 콘드로이티나제 (2.5 U/ ml)/ pDNA (pGX9207, 250 ng / 웰) 공제형화된 샘플의 아가로스 겔 전기영동을 보여준다. (a) 짝수가 있는 레인은 콘드로이티나제 ABC를 함유하는 pDNA 샘플을 나타내고, 홀수가 있는 레인은 PBS 음성 대조군을 지칭한다. 레인 1-2: 겔 전기영동 전 샘플의 인큐베이션 없음, 레인 3-4: 10 분 동안 RT (21℃)에서 인큐베이션, 레인 5-6: 6℃, 120 분, 레인 7-8: RT, 120 분, 레인 9-10: 6℃, 24 시간, 레인 11-12: RT, 24 시간, 레인 13-14: 6℃, 10 분. M1 = 마커. (b) 초나선 DNA용 사다리, 2-10 kb (New England Biolabs).
도 16은 24 시간 동안 콘드로이티나제/ pDNA 공제형의 저장이 Balb/c 마우스에서 향상된 유전자 발현에 영향을 주지 않는 것을 보여준다. 그래프는 일 6에서 ELISA에 의해 측정된 혈청 hIgG 수준 (ng/ ml)를 나타낸다. 마우스는 좌측 뒷다리 골격근에 공제형화로 처리되었고 전기천공은 1 분의 약물 주사 후 수행되었다. 처리에 앞서, 공제형화 샘플은 4 ℃에서 10 분, 120 분 및 24 시간에서 인큐베이션되었다. 대조군: 마우스는 pDNA 투여 및 전기천공 30 분 전 어느 한쪽 콘드로이티나제 또는 PBS로 전처리되었다. 크루스칼-왈리스 시험에 의해 수행된 통계, ****P = 0.0001.
도 17은 그룹 1, 2 및 3에서 일 0-28 사이 ELISA에 의해 측정된 hIgG의 수준 (ng/ml를 보여준다. 그룹 1은 pDVSF-1 및 히알루로니다제 전처리로 처리되었고, 그룹 2는 pDVSF 단독으로 처리되었고, 그룹 3은 PBS 단독으로 처리되었다.
도 18은 그룹 1 및 2의 항-hIgG 결합 역가를 보여준다.
도 19는 실시예 2에서 인플루엔자 NP 펩타이드 풀에 대한 그룹 1-3의 PBMCs내 평균 (+/- SEM) IFN-γ (스팟 / 백만) 반응을 보여준다.
도 20은 실시예 2에서 그룹 1-3에 대하여 항-인플루엔자 NP IgG 결합 역가를 보여준다.
도 21은 녹농균 급성 폐렴 모델을 보여준다. 항-PcrV 또는 DMAb-항체 1-2 플라스미드 DNA의 전기천공은 마우스에서 활성 IgG의 발현을 산출한다. 강력한 보호성 활성은 양쪽 항-녹농균 DMAbs 및 DMAb-항체 1-2 IgG에 대하여 관측되었다.
도 22는 혈청에서 DMAb 발현의 IgG 정량화를 보여준다. 혈청은 녹농균 감염에 앞서 DMAb 발현에 대하여 평가되었다. 유사한 생존 프로파일에도 불구하고, 항-PcrV DMAb 발현은 DMAb-항체 1-2보다 5-배 더 컸다.
도 23은 항-녹농균 DMAbs에 의한 장기 부담의 감소를 보여준다. DMAb-항체 1-2 및 IgG는 폐에서 부담을 감소시킨다. 항-PcrV 및 DMAb-항체 1-2는 박테리아의 전신 확산을 상당히 감소시킨다. 조직은 감염후 24 시간 수집되었다. LOD = 검출의 한계; * = 크루스칼-왈리스 및 던의 다중 비교 시험 대 대조군 IgG DMAb에 의한 P<0.05.
도 24는 감염후 48 시간에서 급성 폐렴의 조직학을 보여준다 (H&E). A. 대조군 IgG 폐는 중성구 및 대식세포로 구성된 중증 폐포 침윤물 그리고 출혈의 면적을 나타낸다 (10x). C. 온화한 폐렴 및 가끔의 세기관지 잔해 (10x). E. 온화한 폐포염을 가진 DMAb-항체 1-2 DNA 그룹 (10x). B, D, F. A. C. D., 각각으로부터 40x로 삽입물.
도 25는 DMAb-항체 1-2가 농도 의존적 보호성 활성을 나타내는 것을 보여준다. A. 동물은 EP에 앞서 1, 2 또는 3 부위에 DNA를 받았다. B. 혈청 IgG의 정량화. *는 로그-순위 시험을 통해 P<0.05를 나타낸다.
도 26은 DMAb-항체 1-2 및 메로페넴 (MEM)의 치료이하 투약량이 녹농균 폐렴에 대한 향상된 활성을 나타내는 것을 보여준다. 동물은 EP에 앞서 1, 2 또는 3 부위에 DNA를 받았다. B. 혈청 IgG의 정량화. *는 로그-순위 시험을 통해 P<0.05를 나타낸다.
도 27은 pGX2013 면역화 14 일 후 NP55 및 NP147 펩타이드 에피토프에 대한 비장세포내 평균 (+/- SEM) IFN-γ (백만당 점) 반응을 보여준다.
도 28은 pGX2013으로 면역화 7 및 14 일 후 그룹에 대하여 항-NP IgG 결합 역가를 보여준다.
도 29는 항-MERS-CoV 인간 IgG의 시험관내 발현을 보여준다. (a) 항-MERS-CoV 항원 DMAb 플라스미드 DNA pMERS의 도식적 실례. 푸린 및 2A 절단 부위에 의해 분리된 항체 중쇄 및 경쇄 서열의 업스트림 자리잡은 CMV 프로모터. (b & c) 293T 세포 배양물은 1 μg/ml의 pVax 또는 pMERS로 형질감염되었고 배양물 상청액은 48 시간 후 수확되었다. (b) 상청액에서 인간 IgG 수준은 ELISA에 의해 분석되었다. (c) MERS CoV 항원에 대한 IgG 결합은 ELISA에 의해 측정되었다.
도 30은 BALB/c 마우스내 DMAb의 향상된 생체내 발현을 보여준다
6.25 내지 100 μg의 pMERS는, HYA-처리된 근육 (EP + HYA)에 (a) 주사 단독으로 (EP 없음), (b) EP가 있는 주사로 (EP) 그리고 (c) EP가 있는 주사로, BALB/c 마우스 (4-8 마우스 / 그룹)의 TA 근육에 투여되었다. (a-c) 혈청 인간 IgG 수준은 pMERS 전달 후 일 6에서 ELISA에 의해 정량화되었다 (데이터 포인트는 평균+/-SEM을 표시한다). (d) pMERS 전달 후 일 0 및 일 6에서 ELISA에 의해 측정된 상호 혈청 희석액의 MERS CoV 항원. (e) BALB/c 마우스 TA 근육은 (a), (b) 또는 (c)에서 이용된 프로토콜로 pRFP (25 μg) 리포터 유전자 투여 후 또는 삽입물 1-4, 각각에서 처리 없이 72 시간 수확되었다. 이미지는 리포터 유전자 발현을 설명한다. TA 근육의 섹션의 면역형광 이미지는 EP + HYA로 전달된 pMERS 또는 pVax (100 μg)으로 처리되었고, 72 시간 후 수확되었다 (f). hIgG는 항-인간 IgG 이어서 FITC-표지된 2차 항체 (녹색)으로 검출되었다. 청색으로 DAPI 얼룩. 패널 1. 처리 없음. 패널 2. pVax. 패널 3 & 4. pMERS. 패널 1-3은 근육 섬유에 수직인 단면 이미지를 나타내고, 패널 4에서 이미지는 근육 섬유 사이이다.
도 31은 Crl:Nu-Foxn1nu 마우스에서 증가된 및 지속된 DMAb 발현을 보여준다. 6.25 내지 100 μg의 pMERS는 Crl:Nu-Foxn1nu 마우스 (8 마우스 / 그룹)의 HYA 전처리된 TA 근육에 EP로 투여되었다. 혈청 hIgG는 일 0 내지 160에서 ELISA에 의해 정량화되었다 (a). (b) 100 μg의 pMERS는 (a)에서처럼 1 (좌측 TA), 2 (우측 및 좌측 TA), 3 (우측 및 좌측 TA, 및 좌측 사두) 또는 4 (우측 및 좌측 TA, 및 좌측 및 우측 사두) 근육에 투여되었다. 혈청 hIgG는 일 21에서 ELISA에 의해 정량화되었다.
도 32는 뉴질랜드 화이트 래빗에서 생체내 DMAb 발현을 보여준다. (a) PBS- (최상부 패널) 또는 HYA- (최하부 패널) 처리된 근육에서 EP로 pGFP (0.2 mg)의 전달 72 시간 후 래빗 TA 근육 섹션에서 리포터 유전자 발현. (b&c) 2 mg의 pMERS는 래빗 (6 / 그룹)의 (PBS 또는 HYA로 전-처리된) 사두 근육에 EP로 투여되었다. 혈청 hIgG는 일 3, 5 및 6에서 정량화되었고 (a), 전달 후 일 6에서 ELISA에 의해 MERS CoV 항원 결합 측정되었다 (b). (c) 2 mg의 pMERS는 래빗 (6 / 그룹)의 (HYA로 처리된) 사두 근육에 20 내지 65 V 의 전압 셋팅에서 EP로 투여되었고, 혈청 hIgG는 전달 후 일 5에서 정량화되었다. (c & d) 값은 평균 +/- SEM (n = 6/그룹)으로서 묘사된다. ****p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, 및 ns = 비-유의미. P 값은 짝짓기되지 않은, 2-테일드 만-휘트니 시험으로부터이다.
도 33은 히말라야 원숭이에서 생체내 DMAb 발현을 보여준다. 13.5 mg의 pMERS는 히말라야 원숭이 (5 / 그룹)의 (HYA로 전-처리된) 사두 근육에 EP로 투여되었다. 혈청 hIgG는 정량화되었고 (a), 일 0 내지 35에서 ELISA에 의해 MERS CoV 항원 결합 측정되었고 (b), 각각의 히말라야 원숭이에 대하여 일 17 상호 혈청 희석되었다 (c). (d) 인간 IgG (ADA)에 대한 항체 반응은 히말라야 원숭이의 혈청에서 직접 ELISA에 의해 측정되었다. (e) 혈청에서 DMAb 수준 및 항-인간 IgG 항체 결합 수준의 상관관계는 묘사된다. 피크 hIgG (μg/ml) 값이 각각의 히말라야 원숭이에서 도달된 후 그리고 포함하여 데이터 포인트 (상응하는 ADA (OD450nm)를 가진 hIgG (μg/ml))는 플롯팅된다. P 값 및 스피어만 상관 계수는 GraphPad Prism 6 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.
도 34는 BALB/c 마우스에서 DMAb의 생체내 발현 동력학을 보여준다. (a-c) 6.25 내지 100 μg의 pMERS는, HYA-처리된 근육 (EP + HYA)에 (a) 주사 단독으로 (EP 없음), (b) EP가 있는 주사로 (EP) 및 (c) EP가 있는 주사로, BALB/c 마우스 (4-8 마우스 / 그룹)의 TA 근육에 투여되었다. (a-c) 혈청 인간 IgG 수준은 pMERS 전달 후 일 0 내지 14에서 ELISA에 의해 정량화되었다 (데이터 포인트는 평균+/-SEM을 표시한다).
도 35는 pMERS 처리된 BALB/c 마우스에서 인간 IgG에 대한 항-항체 반응을 보여준다. 인간 IgG (ADA)에 대한 항체 반응은 EP로 pMERS 전달 후 일 0 내지 14에서 BALB/c 마우스의 혈청에서 직접 ELISA에 의해 측정되었다.
도 36은 유전자 발현을 향상시킨다고 보고된 pDNA 전달 시약의 스크린을 보여준다. 100 μg의 pMERS는 BALB/c 마우스 (5 마우스 / 그룹)의 TA 근육에 투여되었다. 상기 표적 TA 근육은 그룹 1, 2, 5, 7, 8, 및 9 각각에서 PBS, HYA, 7% 수크로스, 콜라겐분해효소 D, 엘라스타제 또는 MMP7로 pMERS 전달 30 분 전 전처리되었다. pMERS는 Poly-L-글루탐산 (그룹 3) 또는 Tempol (그룹 4) 또는 (OH)3D3 (그룹 6)으로 공제형화되었고, 전처리는 없었다. 혈청 인간 IgG 수준은 pMERS 전달 후 일 6에서 ELISA에 의해 정량화되었다 (데이터 포인트는 평균+/-SEM을 표시한다).
도 37은 래빗에서 DMAb 발현을 보여준다. (a 및 b) 2 mg의 pGX9207은 뉴질랜드 화이트 래빗 (6 / 그룹)의 (HYA로 전-처리된) 사두 근육에 EP로 투여되었다. 혈청 hIgG는 (a)이었고 항-인간 IgG (ADA) 결합 (b)는 일 0 내지 10에서 ELISA에 의해 분석되었다.
도 38은 래빗에서 pDNA를 가진 HYA의 공-제형화 연구를 보여준다. 6 뉴질랜드 화이트 래빗 / 그룹. 좌측 사두 근육에서 2 mg pGX9207. 2 부위. HYA (Intropharma) 200U / 부위. 투여 5 분 전 공-제형화된 CELLECTRA®-5P pDNA/HYA. 혈액은 일 5에서 샘플링되었다. 실험 번호 INO-16-158b.
도 39는 EP 지연을 가진 래빗에서 pDNA를 가진 HYA의 공-제형화를 보여준다. 6 뉴질랜드 화이트 래빗 / 그룹. 좌측 사두 근육에서 2 mg pGX9207. 2 부위. HYA (Intropharma) 200 U / 부위. 투여 5 분 전 공-제형화된 CELLECTRA®-5P pDNA/HYA. 혈액은 일 5에서 샘플링되었다. 실험 번호 INO-16-158a.
도 40은 히말라야 원숭이에서 pDNA를 가진 HYA의 공-제형화를 보여준다. CELLECTRA®-5P로 사두 근육에 전달된 pGX9207 (pMERS). 4 부위. 1 mg pDNA / 부위. Intropharma (소 고환 정제된 HYA). 투여 5 분 전 공-제형화된 pDNA /HYA. 실험 번호 INO-16-194.
도 41은 Hylenex (인간 재조합 히알루로니다제)를 가진 EP 지연의 최적화를 보여준다. pGX9207 HYA 공-제형화. 좌측 사두에서 2개의 Tx. 일 5 hlgG 혈청 수준은 묘사된다. 실험 번호 INO-16-279.
도 42는 HYA 공-제형화의 DNA 백신 용량 절약 효과를 보여준다. BALB/c 마우스. 일 0 인플루엔자 pNP IM CELLECTRA-3P, 일 7 및 14 ELISA. 실험 번호 INO-16-218.
도 43은 DNA 백신 HYA 제형화로 종양 항원에 대한 면역 반응의 확대를 보여준다. B6 마우스. 원상태 마우스 TERT 펩타이드 풀에 대한 일 0 및 14 pmTERT IM CELLECTRA®-3P, 일 21 IFN-감마 ELISpot. 실험 번호 INO-17-018.
상세한 설명
본 발명은 대상체에 제제의 전달용 조성물 및 전달 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 CSPGs의 설페이트 기를 가수분해시키는데 충분한 양으로 제제, 및 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 콘드로이티나제는 대상체에서 CSPGs의 설페이트 기를 가수분해시킬 수 있다. 이러한 해체는 세포외 매트릭스의 해체로 이어질 수 있고 그렇게 함으로써 제제의 전달을 용이하게 할 수 있다. 방법은 추가로 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에 제제와 함께 히알루로니다제의 투여에 관한 것이다. 히알루로니다제는 폴리펩타이드로서 또는 핵산 인코딩 히알루로니다제 또는 이의 단편 또는 변이체로서 투여될 수 있다. 히알루로니다제는 대상체에 제제의 전달을 용이하게 할 수 있다. 그 결과, 히알루로니다제는 대상체에서 면역 반응을 향상시킬 수 있고/있거나 대상체에서 제제의 발현을 향상시킬 수 있다.
1) 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학적 용어들은 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 이해상충의 경우에, 정의를 포함하는, 본 문서가 제어할 것이다. 본 명세서에서 기재된 것과 유사한 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있어도, 바람직한 방법 및 물질은 아래 기재된다. 본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참조문헌은 그 전문이 참고로 편입된다. 본 명세서에서 개시된 물질, 방법, 및 예는 단지 실례가 되고 제한되도록 의도되지 않는다.
용어 "포함한다", "포함하다", "갖는", "갖는다", "할 수 있다", "함유한다", 및 이의 변이체는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 추가의 행위 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형 과도기적 어구, 용어들, 또는 단어인 것으로 의도된다. 단수 형태 "한", "하나", 및 "그"는 문맥이 분명히 달리 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 명백하게 제시되든 아니든, 본 명세서에서 제시된 구현예 또는 요소를 "포함하는", "상기로 구성되는", 및 "상기로 본질적으로 구성되는" 다른 구현예를 고려한다.
관심의 하나 이상의 값에 적용된 경우 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "약"은 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 양태에서, 용어 "약"은 (그와 같은 수가 가능한 값의 100%를 초과하지 않을 경우를 제외하고) 문맥으로부터 달리 언급되지 않는 한 또는 달리 분명하지 않는 한 언급된 참조 값의 어느 한쪽 방향 (초과 또는 미만)으로 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 보다 적게 해당하는 값의 범위를 지칭한다.
"항체"는, Fab, F(ab')2, Fd, 및 단일 사슬 항체를 포함하는, 부류 IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE의 항체, 또는 단편, 이의 단편 또는 유도체, 및 이의 유도체를 의미할 수 있다. 항체는 포유동물의 혈청 샘플로부터 단리된 항체, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 친화성 정제된 항체, 또는 원하는 에피토프 또는 그로부터 유래된 서열에 충분한 결합 특이성을 나타내는 이의 혼합물일 수 있다. 항체는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 합성 항체일 수 있다.
본 명세서에서 교환가능하게 사용된 바와 같이 "항체 단편" 또는 "항체의 단편"은 항원-결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 한 부분을 지칭한다. 그 부분은 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인 (즉, 항체 아이소타입에 의존하여, CH2, CH3, 또는 CH4)를 포함하지 않는다. 항체 단편의 예는, 비제한적으로, Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 디아바디, 단일-쇄 Fv (scFv) 분자, 단 하나의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 단일-쇄 폴리펩타이드, 경-쇄 가변 도메인의 3 CDRs를 함유하는 단일-쇄 폴리펩타이드, 단 하나의 중쇄 가변 영역을 함유하는 단일-쇄 폴리펩타이드, 및 중쇄 가변 영역의 3 CDRs를 함유하는 단일-쇄 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "단편"은 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열 또는 이의 한 부분을 의미한다. 상기 단편은 아래 제시된 단백질 단편을 인코딩하는 다양한 뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나로부터 선택된 DNA 단편일 수 있다. "단편"은 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩타이드 서열 또는 이의 한 부분을 또한 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "면역 반응"은, 항원의 도입에 반응하여, 숙주의 면역계의 활성화, 예를 들면, 포유동물의 것을 의미한다. 면역 반응은 세포성 또는 체액성 반응, 또는 양쪽의 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "작동가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 공간적으로 연결되는 프로모터의 제어 하에 있는 것을 의미한다. 프로모터는 그것의 제어 하에서 유전자의 5' (업스트림) 또는 3' (다운스트림) 배치될 수 있다. 프로모터와 유전자 사이 거리는 프로모터가 유래되는 유전자에서 제어하는 프로모터와 유전자 사이 거리와 대략 동일할 수 있다. 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 이 거리에서 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "펩타이드", "단백질", 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산의 연결된 서열을 의미할 수 있고 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 변형 또는 조합일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 함께 공유적으로 연결된 적어도 2 뉴클레오타이드를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥될 수 있거나, 양쪽 이중 가닥된 및 단일 가닥된 서열의 부분을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA, 양쪽 게놈 및 cDNA, RNA, 또는 하이브리드일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합, 그리고 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 이소시토신, 이소구아닌, 및 합성 또는 비-자연 발생 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드를 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "프로모터"는 세포에서 핵산의 발현을 부여, 활성화, 또는 향상시킬 수 있는 합성 또는 자연적으로-유래된 분자를 의미한다. 프로모터는 동일한 것의 공간적 발현 및/또는 일시적 발현을 변경시키기 위해 및/또는 발현을 추가로 향상시키기 위해 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는, 전사의 개시 부위로부터 수천 염기쌍만큼 많이 위치할 수 있는, 원위 인핸서 또는 억제인자 요소를 또한 포함할 수 있다. 프로모터는 바이러스성, 박테리아성, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 발생하는 세포, 조직, 또는 장기에 관하여, 또는 발현이 발생하는, 또는 외부 자극 예컨대 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온, 또는 유도 제제에 반응으로 발달성 시기에 관하여 구성적으로 또는 차별적으로 유전자 성분의 발현을 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예는 박테리오파아지 T7 프로모터, 박테리오파아지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터, 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "대상체"는 포유동물을 의미할 수 있다. 포유동물은 인간, 침팬지, 개, 고양이, 말, 소, 마우스, 또는 랫트일 수 있다.
"치료" 또는 "치료하는"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 질환의 억제, 억압, 진압, 또는 완전히 제거 수단을 통해 질환으로부터 동물의 보호를 의미할 수 있다. 질환의 예방은 질환의 개시에 앞서 동물에 본 발명의 조성물 투여를 포함할 수 있다. 질환 억압은 질환의 유도 후, 그러나 그것의 임상 외관 전 동물에 본 발명의 조성물 투여를 포함한다. 질환 진압은 질환의 임상 외관 후 동물에 본 발명의 조성물 투여를 포함한다.
핵산에 관하여 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "변이체"는 (i) 언급된 뉴클레오타이드 서열의 한 부분 또는 단편; (ii) 언급된 뉴클레오타이드 서열의 보체 또는 이의 부분; (iii) 언급된 핵산과 실질적으로 동일한 핵산 또는 이의 보체; 또는 (iv) 언급된 핵산, 이의 보체, 또는 거기에 실질적으로 동일한 서열에 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 핵산을 의미한다.
"변이체"는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열에서 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드로서 추가로 정의될 수 있다. "생물학적 활성"의 대표적인 예는 특이적 항체에 의해 결합되는 또는 면역 반응을 촉진시키는 능력을 포함한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 가진 언급된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉, 아미노산의 유사한 특성 (예를 들면, 충전된 영역의 친수성, 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로의 대체는 소수의 변화를 전형적으로 포함하는 것으로서 기술 분야에서 인식된다. 이들 소수의 변화는, 기술 분야 (Kyte 등, J. Mol. Biol. 1982, 157, 105-132)에서 이해되는 바와 같이, 부분적으로, 아미노산의 소수성 지수 고려에 의해 확인될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수는 그것의 소수성 및 전하의 고려에 기반된다. 유사한 소수성 지수의 아미노산이 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 보유하는 것이 기술 분야에서 공지된다. 일 양태에서, ± 2의 소수성 지수를 갖는 아미노산은 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 초래할 치환을 드러내는데 사용될 수 있다. 펩타이드의 문맥에서 아미노산의 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 상관관계가 있는 것으로 보고되고 있는 유용한 측정인, 그 펩타이드의 가장 큰 국부 평균 친수성의 계산을 허용한다. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은, 기술 분야에서 이해되는 바와 같이, 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 보유하는 펩타이드를 초래할 수 있다. 치환은 서로의 ±2 이내 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 양쪽 소수성 지수 및 친수성 값은 그 아미노산의 특정한 측쇄에 의해 영향받는다. 그 관찰과 일치하는, 생물학적 기능과 양립가능한 아미노산 치환은, 소수성, 친수성, 전하, 크기, 및 다른 특성에 의해 드러난 바와 같이, 아미노산, 및 특히, 그들 아미노산의 측쇄의 상대 유사성에 의존한다고 이해된다.
변이체는 전체 유전자 서열 또는 이의 단편의 전장에 대해 실질적으로 동일한 핵산 서열일 수 있다. 핵산 서열은 유전자 서열 또는 이의 단편의 전장에 대해 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열 또는 이의 단편의 전장에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열 또는 이의 단편의 전장에 대해 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "벡터"는 복제의 기원을 함유하는 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 바이러스성 벡터, 박테리오파아지, 박테리아성 인공 염색체, 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제 염색체외 벡터일 수 있고, 바람직하게는, DNA 플라스미드이다.
본 명세서에서 수치 범위의 인용을 위하여, 정확성의 동일한 정도로 그 사이 각각의 개입 수는 명백하게 고려된다. 예를 들어, 6-9의 범위에 대하여, 수 7 및 8은 6 및 9에 더하여 고려되고, 6.0-7.0 범위에 대하여, 수 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 및 7.0은 명백하게 고려된다.
2) 제제 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제의 용도
본 발명은 대상체에 제제와 함께 콘드로이티나제의 투여에 관한 것이다. 콘드로이티나제는 폴리펩타이드로서 또는 핵산 인코딩 콘드로이티나제 또는 이의 단편 또는 변이체로서 투여될 수 있다. 콘드로이티나제는 대상체에 제제의 전달을 용이하게 할 수 있다. 그 결과, 콘드로이티나제는 대상체에서 면역 반응을 향상시킬 수 있고/있거나 대상체에서 제제의 발현을 향상시킬 수 있다.
a) 콘드로이티나제
콘드로이티나제 또는 이의 단편은 대상체에 투여될 수 있다. 콘드로이티나제는 임의의 콘드로이티나제일 수 있다. 예를 들어, 콘드로이티나제는 N-아세틸갈락토사민-4-설파타제, N-아세틸갈락토사민-6-설파타제, 또는 콘드로이틴 ABC 분해효소일 수 있다. 콘드로이티나제는 콘드로이티나제 AC일 수 있다. 콘드로이티나제는 재조합 콘드로이티나제일 수 있다. 콘드로이티나제는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (CSPG)의 가수분해를 촉매화시킬 수 있다. 콘드로이티나제는 콘드로이틴 설페이트 및/또는 데르마탄 설페이트의 N-아세틸-D-갈락토사민 4-설페이트 유닛의 4-설페이트 기를 가수분해시킬 수 있다. 콘드로이티나제는 N-아세틸 글루코사민 4-설페이트의 4-설페이트 기를 가수분해시킬 수 있다. 콘드로이티나제는 콘드로이틴 설페이트의 N-아세틸-D-갈락토사민 6-설페이트 유닛 및 케라틴 설페이트의 D-갈락토스 6-설페이트 유닛의 6-설페이트 기를 가수분해시킬 수 있다. 콘드로이틴 ABC 분해효소는 4-데옥시-베타-D-글루크-4-에누로노실 기를 함유하는 2당류에 1,4-베타-D-헥소스아미닐 및 1,3-베타-D-글루쿠로노실 또는 1,3-알파-L-이두로노실 연결기를 함유하는 다당류의 분해를 촉매화시킬 수 있다. 콘드로이틴 ABC 분해효소는 콘드로이틴 4-설페이트, 콘드로이틴 6-설페이트, 및 데르마탄 설페이트에서 작용할 수 있다.
CSPG는 아그레칸 (CSPG1), 베르시칸 (CSPG2), 뉴로칸 (CSPG3), CSPG4 (흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸, NG2), CSPG5, SMC3 (CSPG6, 염색체 3의 구조 유지), 브레비칸 (CSPG7), CD44 (CSPG8, 분화 44의 클러스터), 포스파칸, 및 이의 조합일 수 있다.
세포외 매트릭스 (ECM)의 구성성분인, CSPGs의 가수분해 촉매화에 의해, 콘드로이티나제는 CSPGs 및 세포외 매트릭스의 점도를 저하시키고, 그렇게 함으로써 조직 투과도를 증가시킨다. 콘드로이티나제, 또는 콘드로이티나제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 투여는 CSPGs의 가수분해로 이어질 수 있고, 그렇게 함으로써 대상체의 세포외 매트릭스의 해체로 이어질 수 있다. 대상체의 세포외 매트릭스의 해체는 그렇게 함으로써 제제의 전달 또는 투여를 용이하게 할 수 있다.
콘드로이티나제는 박테리아로부터 유래된 콘드로이티나제일 수 있다. 박테리아는, 예를 들어, 플라보박테리움 헤파리눔일 수 있다. 콘드로이티나제는 박테리아에서 재조합으로 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편은 투여될 수 있다. 콘드로이티나제 폴리펩타이드는 생체내 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로부터 발현될 수 있다.
3) 히알루로니다제의 용도
방법은 또한 글리코사미노글리칸, 예컨대 히알루로난을 분해시키기 위한 양으로 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 대상체에 추가로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 콘드로이티나제 및 히알루로니다제의 투여는, 예를 들어, 대상체의 혈청에서 제제 발현, 면역 반응, 또는 제제의 농도에서 부가적 또는 상승작용 효과로 이어질 수 있다. 콘드로이티나제 및 히알루로니다제 조합 처리에 노출된 대상체의 혈청에서 검출된 제제 농도는, 예를 들어, 단일 콘드로이티나제 또는 히알루로니다제 효소로 처리된 대상체에서 제제의 혈청 수준에 비교하여 더 높을 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에 제제와 함께 히알루로니다제의 투여에 관한 것이다. 히알루로니다제는 폴리펩타이드로서 또는 핵산 인코딩 히알루로니다제 또는 이의 단편 또는 변이체로서 투여될 수 있다. 히알루로니다제는 대상체에 제제의 전달을 용이하게 할 수 있다. 그 결과, 히알루로니다제는 대상체에서 면역 반응을 향상시킬 수 있고/있거나 대상체에서 제제의 발현을 향상시킬 수 있다. 대상체에 히알루로니다제의 투여 방법은 콘드로이티나제의 투여를 포함할 수 있거나 아닐 수 있다. 제제는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 임의의 제제일 수 있다. 히알루로니다제의 용도는, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 임의의 제제, 투여의 기재된 타이밍, 투여의 방식, 처리의 방법, 또는 전달의 방법과 함께일 수 있다.
히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제는 동시에 대상체에 투여될 수 있다. 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 콘드로이티나제 폴리펩타이드, 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제와 동시에 투여될 수 있다. 전달의 방법 및 투여의 시간은, 본 명세서에서 기재된 것과, 동일할 수 있거나, 유사할 수 있다. 참고 섹션 4 b), 예를 들어.
히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제는 대상체에 연속적으로 투여될 수 있다. 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 콘드로이티나제 폴리펩타이드, 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제는 대상체에 연속적으로 투여될 수 있다. 전달의 방법 및 투여의 시간은, 본 명세서에서 기재된 것과, 동일할 수 있거나, 유사할 수 있다. 참고 섹션 4 b), 예를 들어. 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제는 투여에 앞서 공-제형화될 수 있다. 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 투여에 앞서 공-제형화될 수 있다. 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 아그코넨트의 임의의 공-제형화는, 예를 들어, 투여에 1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 45 분, 1 시간, 5 시간, 10 시간, 24 시간, 5 일, 7 일, 20 일, 30 일, 40 일, 50 일, 100 일, 200 일, 300 일, 1 년, 400 일, 1.5 년, 또는 2 년 앞서 발생할 수 있다. 콘드로이티나제 폴리펩타이드, 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제의 임의의 공-제형화는, 예를 들어, 투여에 1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 45 분, 1 시간, 5 시간, 10 시간, 24 시간, 5 일, 7 일, 20 일, 30 일, 40 일, 50 일, 100 일, 200 일, 300 일, 1 년, 400 일, 1.5 년, 또는 2 년 앞서 발생할 수 있다. 히알루로니다제 폴리펩타이드, 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제의 임의의 공-제형화는, 예를 들어, 투여에 1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 45 분, 1 시간, 5 시간, 10 시간, 24 시간, 5 일, 7 일, 20 일, 30 일, 40 일, 50 일, 100 일, 200 일, 300 일, 1 년, 400 일, 1.5 년, 또는 2 년 앞서 발생할 수 있다. 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 임의의 공-제형화는, 예를 들어, 투여에 앞서 투여 일에 1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 45 분, 1 시간, 5 시간, 10 시간, 24 시간, 5 일, 7 일, 20 일, 30 일, 40 일, 50 일, 100 일, 200 일, 300 일, 1 년, 400 일, 1.5 년, 또는 2 년 앞서 발생할 수 있다.
콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제 및/또는 제제는 전기천공을 통해 (EP), 예컨대, 이들의 내용은 본 명세서에서 참고로 편입된, 미국 특허 번호 7,664,545에서 기재된 방법에 의해 투여될 수 있다. 전기천공은 에서 기재된 방법 및/또는 장치에 의한 것일 수 있다: 미국 특허 번호　6,302,874; 5,676,646; 6,241,701; 6,233,482; 6,216,034; 6,208,893; 6,192,270; 6,181,964; 6,150,148; 6,120,493; 6,096,020; 6,068,650; 및 5,702,359, 이들의 내용은 본 명세서에서 참고로 그 전문이 편입됨. 전기천공은 최소로 침습성 디바이스를 통해 수행될 수 있다. 전기천공은, 예를 들어, 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제 및/또는 제제의 투여 전 또는 후 발생할 수 있다. 전기천공은, 예를 들어, 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제 및/또는 제제의 투여와 부수적으로 발생할 수 있다. 콘드로이티나제, 히알루로니다제, 제제, 또는 이의 임의의 공-제형, 및 EP의 투여 사이 지연이 있을 수 있다. 예를 들어, EP는 콘드로이티나제, 히알루로니다제, 제제, 항원, 또는 이의 임의의 공-제형의 투여 5 초, 10 초, 20 초, 30 초, 45 초, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 또는 5 분 후 투여될 수 있다.
히알루로니다제는 히알루론산을 분해하는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. "히알루론산" 및 "히알루로난"은 본 명세서에서 교환가능하게 사용된다. 히알루로난은 음이온성, 설페이트화되지 않은 글리코사미노글리칸이다. 히알루로난은 2당류의 폴리머이고, 각각의 2당류는, 교대 β-1,4 및 β-1,3 글리코시드 결합을 통해 연결된, D-글루쿠론산 및 D-N-아세틸글루코사민을 포함한다. 히알루로난은 길이 수 천의 2당류 반복부를 포함할 수 있다. 히알루로난은 약 1 kDa 내지 약 5,000 kDa 또는 초과의 분자량을 가질 수 있다.
히알루로니다제는 글리코사미노글리칸 엔도글루코사미니다제의 계열이고, 여기서 히알루로니다제에서 글루타메이트 잔기는 산-염기 촉매적 기전을 통해 콘드로이틴 설페이트 및 히알루로난의 β-1,4개의 연결기를 가수분해시킨다.
세포외 매트릭스 (ECM)의 구성성분인, 히알루로난의 가수분해 촉매화에 의해, 히알루로니다제는 히알루로난 및 세포외 매트릭스의 점도를 저하시키고, 그렇게 함으로써 조직 투과도를 증가시킨다. 히알루로니다제, 또는 히알루로니다제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 투여는 히알루로난의 가수분해로 이어질 수 있고, 그렇게 함으로써 대상체의 세포외 매트릭스의 해체로 이어질 수 있다. 대상체의 세포외 매트릭스의 해체는 그렇게 함으로써 제제의 전달 또는 투여를 용이하게 할 수 있다.
히알루로니다제는 포유류 기원, 파충류 또는 벌목 하이알루로네이트 글리카노가수분해효소, 거머리의 타액샘으로부터 하이알루로네이트 글리카노가수분해효소, 또는 박테리아성 기원으로부터 유래된 히알루로니다제일 수 있다. 박테리아성 히알루로니다제는, 예를 들어, 연쇄상구균, 폐렴구균, 및 클로스트리듐성 히알루로니다제를 포함할 수 있다.
4) 제제
제제는 대상체에 투여될 수 있다. 제제는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 소 분자, 항원, 또는 임의의 이의 조합을 포함할 수 있다. 제제는, 예를 들어, 본 명세서에서 참고로 편입되는, PCT/US2014/070188에서 상세한 바와 같이, 항체, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합을 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함할 수 있다. 제제는 DNA-인코딩 단클론성 항체 (DMAb)일 수 있다.
i) 폴리펩타이드
일부 구현예에서, 제제는 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드는 항체, 항원, 효소, 또는 다른 단백질, 또는 임의의 이의 조합을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 포유류, 동물, 박테리아성, 또는 바이러스성 기원으로부터 유래될 수 있다. 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드, 즉, 상이한 공급원 또는 유기체로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 다클론성 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 단클론성 항체이다.
(1) 항체
상기 기재된 바와 같이, 폴리펩타이드는 항체, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 항체는, 아래에 더 상세히 기재되는, 항원일 수 있는, 원하는 표적 분자, 수용체용 리간드를 포함하는, 리간드, 수용체에서 리간드-결합 부위를 포함하는, 수용체, 리간드-수용체 복합체, 및 암 마커를 포함하는, 마커와 결합 또는 반응할 수 있다.
항체는, CDRs에 지지를 제공하는 그리고 서로에 비해 CDRs의 공간적 관계를 한정하는 중쇄 및 경쇄 프레임워크 ("FR") 세트 사이 각각 개재된, 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 ("CDR") 세트를 포함할 수 있다. CDR 세트는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 3 초가변 영역을 함유할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단부터 진행하여, 이들 영역은 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3", 각각으로 표시된다. 항원-결합 부위는, 따라서, 각각의 중쇄 및 경쇄 V 영역으로부터 CDR 세트를 포함하는, 6 CDRs를 포함할 수 있다.
단백분해 효소 파파인은 몇 개의 단편을 산출하기 위해 IgG 분자를 우선적으로 절단시키고, 이들 (F(ab) 단편) 각각 중 2개는 온전한 항원-결합 부위를 포함하는 공유 이종이량체를 포함한다. 효소 펩신은, 양쪽 항원-결합 부위를 포함하는, F(ab')2 단편을 포함하는, 몇 개의 단편을 제공하기 위해 IgG 분자를 절단시킬 수 있다. 따라서, 항체는 Fab 또는 F(ab')2일 수 있다. Fab는 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. Fab의 중쇄 폴리펩타이드는 VH 영역 및 CH1 영역을 포함할 수 있다. Fab의 경쇄는 VL 영역 및 CL 영역을 포함할 수 있다.
항체는 면역글로불린 (Ig)일 수 있다. Ig는, 예를 들어, IgA, IgM, IgD, IgE, 및 IgG일 수 있다. 면역글로불린은 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 면역글로불린의 중쇄 폴리펩타이드는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역을 포함할 수 있다. 면역글로불린의 경쇄 폴리펩타이드는 VL 영역 및 CL 영역을 포함할 수 있다.
항체는 다클론성 또는 단클론성 항체일 수 있다. 항체는 키메라성 항체, 단일 사슬 항체, 친화성 성숙된 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 완전하게 인간 항체일 수 있다. 인간화된 항체는 비-인간 종으로부터 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDRs) 및 인간 면역글로불린 분자로부터 프레임워크 영역을 갖는 원하는 항원을 결합시키는 비-인간 종으로부터 항체일 수 있다.
항체는 이중특이적 항체, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합일 수 있다. 이중특이적 항체는 2 항원, 예를 들어, 아래 더 상세히 기재된 항원 중 2개와 결합 또는 반응할 수 있다. 이중특이적 항체는 본 명세서에서 기재된 항체 중 2개의 단편으로 구성될 수 있고, 그렇게 함으로써 아래에 더 상세히 기재되는, 항원일 수 있는, 원하는 표적 분자, 수용체용 리간드를 포함하는, 리간드, 수용체에서 리간드-결합 부위를 포함하는, 수용체, 리간드-수용체 복합체, 및 암 마커를 포함하는, 마커와 이중특이적 항체가 결합 또는 반응하게 할 수 있다.
항체는 이중특이적 항체, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합일 수 있다. 이중특이적 항체는 아래에 기재된 항원과 결합 또는 반응할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 항원의 인식 및 항원에 결합을 넘어서 항체에 추가의 기능성을 부여하도록 변형될 수 있다. 그와 같은 변형은, 비제한적으로, 인자 H 또는 이의 단편에 커플링을 포함할 수 있다. 인자 H는 보체 활성화의 가용성 조절자이고 따라서, 보체-매개된 용해 (CML)을 통해 면역 반응에 기여할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 항체는 대상체에 조성물의 투여시 대상체에서 생성될 수 있다. 항체는 대상체 내에 반감기를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 대상체 대상체 내에 그것의 반감기를 연장 또는 단축하도록 변형될 수 있다. 그와 같은 변형은 아래에 더 상세히 기재된다.
ii) 폴리뉴클레오타이드
일부 구현예에서, 제제는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는, 상기에 상세한 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드이다. 폴리뉴클레오타이드는 항체를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 단클론성 항체이다. 단클론성 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 단클론성 항체의 생체내 발현 및 형성을 용이하게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 및 단클론성 항체는 동일한 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 및 단클론성 항체는 별개의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다.
(1) 벡터
하나 이상의 벡터는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 별개의 벡터 내에 포함된다. 하나 이상의 벡터는 제제를 발현시킬 수 있다. 하나 이상의 벡터는, 표적 세포에 특이적 유전자를 도입시키는데 사용되는 일반적으로 플라스미드인, 발현 작제물일 수 있다. 발현 벡터가 세포 내부이면, 유전자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드는 세포성-전사 및 번역 기계장치 리보솜 복합체에 의해 생산된다. 플라스미드는 인핸서 및 프로모터 영역으로서 작동하는 그리고 발현 벡터에서 운반되는 유전자의 효율적인 전사로 이어지는 조절 서열을 함유하도록 빈번하게 조작된다. 구현예에서, 본 발명의 벡터는 다량의 안정한 메신저 RNA, 및 따라서 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다.
(a) 발현 벡터
벡터는 원형 플라스미드 또는 선형 핵산일 수 있다. 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적절한 대상체 세포에서 특정 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도할 수 있다. 벡터는, 종결 신호에 작동가능하게 연결될 수 있는, 항원-인코딩 뉴클레오타이드 서열, 또는 아쥬반트-인코딩 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 가질 수 있다. 벡터는 또한 뉴클레오타이드 서열의 적절한 번역을 위하여 요구된 서열을 함유할 수 있다. 관심의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터는, 그것의 성분 중 적어도 하나가 그것의 다른 성분 중 적어도 하나에 관하여 이종성인 것을 의미하는, 키메라성일 수 있다. 발현 카셋트에서 뉴클레오타이드 서열의 발현은, 숙주 세포가 일부 특정한 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는, 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 제어하일 수 있다. 다중세포 유기체의 경우에, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 장기 또는 발달의 시기에 특이적일 수 있다.
(b) 원형 및 선형 벡터
벡터는, 세포성 게놈에 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시킬 수 있거나 염색체외로 실재시킬 수 있는, 원형 플라스미드 (예를 들면, 복제의 기원을 가진 자율적 복제 플라스미드)일 수 있다.
벡터는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 제제를 인코딩하는 DNA를 발현시킬 수 있고, 제제에 서열을 세포가 번역시키게 할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
전기천공을 통해 대상체에 효율적으로 전달될 수 있는 그리고 하나 이상의 원하는 제제를 발현시킬 수 있는, 선형 핵산, 또는 선형 발현 카셋트 ("LEC")가 본 명세서에서 또한 제공된다. LEC는 임의의 포스페이트 백본이 결여된 임의의 선형 DNA일 수 있다. DNA는 하나 이상의 제제를 인코딩할 수 있다. LEC는 프로모터, 인트론, 정지 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. 제제의 발현은 프로모터에 의해 제어될 수 있다. LEC는 임의의 항생제 내성 유전자 및/또는 포스페이트 백본을 함유하지 않을 수 있다. LEC는 원하는 제제 유전자 발현에 관련없는 다른 핵산 서열을 함유하지 않을 수 있다.
LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유래될 수 있다. 플라스미드는 제제를 발현시킬 수 있다. 플라스미드는 pNP (Puerto Rico/34) 또는 pM2 (New Caledonia/99)일 수 있다. 플라스미드는 WLV009, pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 제제를 인코딩하는 DNA를 발현시킬 수 있고, 제제에 서열을 세포가 번역시키게 할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
LEC는 pcrM2일 수 있다. LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR은 pNP (Puerto Rico/34) 및 pM2 (New Caledonia/99), 각각으로부터 유래될 수 있다.
(c) 프로모터, 인트론, 정지 코돈, 및 폴리아데닐화 신호
벡터는 프로모터를 가질 수 있다. 프로모터는 유전자 발현을 구동시킬 수 있는 그리고 단리된 핵산의 발현을 조절시킬 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 그와 같은 프로모터는, 본 명세서에서 기재된 제제 서열을 전사하는, DNA 의존적 RNA 폴리머라제를 통해 전사를 위하여 요구된 시스-작용 서열 요소이다. 이종성 핵산의 직접 발현에 사용된 프로모터의 선택은 특정한 응용에 좌우된다. 프로모터는 그것의 천연 셋팅에서 전사 개시 부위로부터임에 따라 벡터에서 전사 개시로부터 약 동일한 거리 배치될 수 있다. 그러나, 이 거리에서 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
프로모터는 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 리보솜 결합 부위, 및 번역 종결을 위하여 요구된 신호 및 제제를 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 리보솜 결합 부위, 및 번역 종결을 위하여 요구된 신호 및 제제를 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
프로모터는 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥣과 유선 종양 바이러스 프로모터, 루 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서 발현에 대하여 효과적으로 보여진 또 다른 프로모터일 수 있다.
벡터는 기능적 스플라이스 공여체 및 수용체 부위를 가진 인트론 및 인핸서를 포함할 수 있다. 벡터는 효율적인 종결을 제공하기 위해 구조적 유전자의 전사 종결 영역 다운스트림을 함유할 수 있다. 종결 영역은 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 수득될 수 있거나 상이한 유전자로부터 수득될 수 있다.
iii) 소 분자
제제는 소 분자를 포함할 수 있다. 소 분자는, 예를 들어, 의약품 또는 약물, 유기 화합물, 유기금속 화합물, 항원, 호르몬, 비타민, 항생제, 보조인자, 사이토카인, 스테로이드, 탄수화물, 당, 알코올, 폴리엔, 알칼로이드, 글리코사이드, 플라보노이드, 카복실레이트, 피롤, 펜아진, 지방산, 아민, 핵염기 및 그것의 유도체 (예를 들면, 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드), 아미노산, 및 세포성 대사물을 포함할 수 있다.
iv) 항원
항원은 대상체에 투여될 수 있다. "항원"은 대상체에서 면역 반응을 생성시키는 능력을 갖는 임의의 것일 수 있다. 항원은 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 또는 이의 조합일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 링커를 인코딩하는 추가의 서열 또는 펩타이드 결합에 의해 항원에 연결되는 태그 서열을 또한 포함할 수 있다. 항원은, 상기에 상세한 바와 같이, 소 분자를 포함할 수 있다.
항원은 임의의 수의 유기체, 예를 들어, 바이러스, 기생충, 박테리아, 진균, 또는 포유동물로부터 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체, 또는 이의 조합에서 함유될 수 있다. 항원은 자가면역 질환, 알러지, 또는 천식과 관련될 수 있다. 다른 구현예에서, 항원은 암, 헤르페스, 인플루엔자, B형 간염, C형 간염, 인간 유두종 바이러스 (HPV), 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)와 관련될 수 있다.
항원은 항체에 의해 인식 및 결합될 수 있다. 일부 항원은 강한 면역 반응을 유도할 수 있다. 다른 항원은 약한 면역 반응을 유도할 수 있다. 항원은 바디 내로부터 또는 외부 환경으로부터 기원할 수 있다. 항원은 외래 항원 또는 자기-항원일 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는, 상기 기재된 바와 같이, 항원과 결합 또는 반응할 수 있다.
일부 구현예에서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제제는 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제제, 및 항원은 동일한 벡터 또는 별개의 벡터 내에 포함된다.
항원은 대상체에서 면역 반응을 유도하는 임의의 것일 수 있다. 정제된 항원은 스스로 일반적으로 강하게 면역원성이 아니고 따라서 상기 기재된 바와 같이 아쥬반트와 조합된다. 항원에 의해 유도된 면역 반응은 아쥬반트와 조합된 경우 부스팅 또는 증가될 수 있다. 그와 같은 면역 반응은 체액성 면역 반응 및/또는 세포성 면역 반응일 수 있다. 일부 구현예에서, 아쥬반트 및 항원의 조합은 대상체에서 세포성 면역 반응을 부스팅 또는 증가시킬 수 있다.
항원은 핵산 서열, 아미노산 서열, 또는 이의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 링커를 인코딩하는 추가의 서열 또는 펩타이드 결합에 의해 항원에 연결되는 태그 서열을 또한 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 단백질, 펩타이드, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합일 수 있다.
항원은 임의의 수의 유기체, 예를 들어, 바이러스, 기생충, 박테리아, 진균, 또는 포유동물로부터 단백질, 핵산, 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체, 또는 이의 조합에서 함유될 수 있다. 항원은 자가면역 질환, 알러지, 또는 천식과 관련될 수 있다. 다른 구현예에서, 항원은 암, 헤르페스, 인플루엔자, B형 간염, C형 간염, 인간 유두종 바이러스 (HPV), 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)와 관련될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 인플루엔자 또는 HIV와 관련될 수 있다.
일부 항원은 강한 면역 반응을 유도할 수 있다. 다른 항원은 약한 면역 반응을 유도할 수 있다. 항원은 아쥬반트와 조합된 경우 더 큰 면역 반응을 유도할 수 있다.
(1) 바이러스성 항원
항원은 바이러스성 항원, 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다. 바이러스성 항원은 하기 계열 중 하나로부터 바이러스로부터일 수 있다: 아데노비리다에, 아레나비리다에, 분야비리다에, 칼리시비리다에, 코로나비리다에, 필로비리다에, 헤파드나비리다에, 헤르레스비리다에, 오토믹소비리다에, 파포바비리다에, 파라믹소비리다에, 파보비리다에, 피코르나비리다에, 폭스비리다에, 레오비리다에, 레트로비리다에, 라브도비리다에, 또는 토가비리다에. 바이러스성 항원은 하기로부터일 수 있다: 유두종 바이러스, 예를 들어, 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 폴리오 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 천연두 바이러스 (대두창 및 소두창), 백시니아 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 리노바이러스, 뎅기열 바이러스, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스, 황열병 바이러스, 노워크 바이러스, A형 간염 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 (HTLV-I), 털이 많은 세포 백혈병 바이러스 (HTLV-II), 캘리포니아 뇌염 바이러스, 한타 바이러스 (출혈열), 광견병 바이러스, 에볼라 열 바이러스, 마버그 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 단순 포진 1 (구순 포진), 단순 포진 2 (성기 포진), 대상포진 (수두-대상포진, 수두라고로 알려짐), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 예를 들어 인간 CMV, 엡슈타인-바르 바이러스 (EBV), 플라비바이러스, 구제역 질환 바이러스, 치쿤군야 바이러스, 라싸 바이러스, 아레나바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 또는 암 유발 바이러스.
(a) 간염 항원
항원은 간염 바이러스 항원 (즉, 간염 항원), 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다. 간염 항원은 A형 간염 바이러스 (HAV), B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), D형 간염 바이러스 (HDV), 및/또는 E형 간염 바이러스 (HEV)로부터 항원 또는 면역원일 수 있다. 일부 구현예에서, 간염 항원은, HAV, HBV, HCV, HDV, 및 HEV로부터 항원의 하나 이상을 인코딩하는, 이종성 핵산 분자(들), 예컨대 플라스미드(들)일 수 있다. 간염 항원은 전장 단백질의 전장 또는 면역원성 단편일 수 있다.
간염 항원은 개선된 발현을 위하여 공통 서열 및/또는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 코돈 최적화, RNA 최적화, 및 작제물의 면역원성을 증가시키기 위한 고도로 효율적인 면역글로불린 리더 서열의 부가를 포함하는, 유전적 변형은 변형된 공통 서열에서 포함될 수 있다. 공통 간염 항원은 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 포함할 수 있고, 일부 구현예에서, HA 태그를 포함할 수 있다. 면역원은 상응하는 코돈 최적화된 면역원보다 더 강한 및 더 넓은 세포성 면역 반응을 유도하도록 설계될 수 있다.
간염 항원은 HAV로부터 항원일 수 있다. 간염 항원은 HAV 캡시드 단백질, HAV 비-구조 단백질, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합일 수 있다.
간염 항원은 HCV로부터 항원일 수 있다. 간염 항원은 HCV 뉴클레오캡시드 단백질 (즉, 코어 단백질), HCV 외피 단백질 (예를 들면, E1 및 E2), HCV 비-구조 단백질 (예를 들면, NS1, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합일 수 있다.
간염 항원은 HDV로부터 항원일 수 있다. 간염 항원은 HDV 델타 항원, 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다.
간염 항원은 HEV로부터 항원일 수 있다. 간염 항원은 HEV 캡시드 단백질, 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다.
간염 항원은 HBV로부터 항원일 수 있다. 간염 항원은 HBV 코어 단백질, HBV 표면 단백질, HBV DNA 폴리머라제, 유전자 X에 의해 인코딩된 HBV 단백질, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합일 수 있다. 간염 항원은 HBV 유전자형 A 코어 단백질, HBV 유전자형 B 코어 단백질, HBV 유전자형 C 코어 단백질, HBV 유전자형 D 코어 단백질, HBV 유전자형 E 코어 단백질, HBV 유전자형 F 코어 단백질, HBV 유전자형 G 코어 단백질, HBV 유전자형 H 코어 단백질, HBV 유전자형 A 표면 단백질, HBV 유전자형 B 표면 단백질, HBV 유전자형 C 표면 단백질, HBV 유전자형 D 표면 단백질, HBV 유전자형 E 표면 단백질, HBV 유전자형 F 표면 단백질, HBV 유전자형 G 표면 단백질, HBV 유전자형 H 표면 단백질, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합일 수 있다. 간염 항원은 공통 HBV 코어 단백질, 또는 공통 HBV 표면 단백질일 수 있다.
일부 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 A 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 A 코어 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 A 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 B 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 B 코어 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 B 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
더욱 다른 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 C 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 C 코어 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 C 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 D 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 D 코어 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 D 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 E 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 E 코어 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 E 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 F 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 F 코어 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 F 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 G 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 G 코어 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 G 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 H 공통 코어 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 H 코어 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 H 공통 코어 단백질 서열일 수 있다.
더욱 다른 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 A 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 A 표면 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 A 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 B 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 B 표면 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 B 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 C 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 C 표면 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 C 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
더욱 다른 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 D 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 D 표면 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 D 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 E 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 E 표면 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 E 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 F 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 F 표면 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 F 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
더욱 다른 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 G 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 G 표면 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 G 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 H 공통 표면 DNA 서열 작제물, HBV 유전자형 H 표면 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 HBV 유전자형 H 공통 표면 단백질 서열일 수 있다.
(b) 인간 유두종 바이러스 (HPV) 항원
항원은 인간 유두종 바이러스 (HPV) 항원, 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다. HPV 항원은 자궁경부 암, 직장 암, 및/또는 다른 암을 유발시키는 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 및 58로부터일 수 있다. HPV 항원은, 생식기 혹을 유발시키는, 그리고 두경부 암의 원인인 것으로 공지되는, HPV 유형 6 및 11로부터일 수 있다.
HPV 항원은 각각의 HPV 유형으로부터 HPV E6 또는 E7 도메인일 수 있다. 예를 들어, HPV 유형 16 (HPV16)에 대하여, HPV16 항원은 HPV16 E6 항원, HPV16 E7 항원, 단편, 변이체, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 유사하게, HPV 항원은 HPV 6 E6 및/또는 E7, HPV 11 E6 및/또는 E7, HPV 18 E6 및/또는 E7, HPV 31 E6 및/또는 E7, HPV 33 E6 및/또는 E7, HPV 52 E6 및/또는 E7, 또는 HPV 58 E6 및/또는 E7, 단편, 변이체, 또는 이의 조합일 수 있다.
(c) RSV 항원
항원은 RSV 항원 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다. RSV 항원은 인간 RSV 융합 단백질 (본 명세서에서 "RSV F", "RSV F 단백질" 및 "F 단백질"로서 또한 지칭됨), 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 인간 RSV 융합 단백질은 RSV 하위유형 A 및 B 사이 보존될 수 있다. RSV 항원은 RSV 긴 균주 (유전자은행 AAX23994.1)로부터 RSV F 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 RSV A2 균주 (유전자은행 AAB59858.1)로부터 RSV F 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 RSV F 단백질의 단량체, 이량체 또는 삼량체, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 최적화된 아미노산 RSV F 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
RSV F의 후융합 형태는 면역화된 동물에서 고 역가 중화 항체를 유발시키고 동물을 RSV 공격으로부터 보호한다. 본 발명은 요구된 백신에서 이러한 면역반응을 이용한다. 본 발명에 따르면, RSV F 단백질은 전융합 형태 또는 후융합 형태일 수 있다.
RSV 항원은 또한 인간 RSV 부착 당단백질 (본 명세서에서 "RSV G", "RSV G 단백질" 및 "G 단백질"로서 또한 지칭됨), 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 인간 RSV G 단백질은 RSV 하위유형 A 및 B 사이 상이하다. 항원은 RSV 긴 균주 (유전자은행 AAX23993)으로부터 RSV G 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 하기로부터 RSV G 단백질일 수 있다: RSV 하위유형 B 분리 H5601, RSV 하위유형 B 분리 H1068, RSV 하위유형 B 분리 H5598, RSV 하위유형 B 분리 H1123, 또는 이의 단편 또는 변이체. RSV 항원은 최적화된 아미노산 RSV G 아미노산 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
다른 구현예에서, RSV 항원은 인간 RSV 비-구조 단백질 1 ("NS1 단백질"), 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주 (유전자은행 AAX23987.1)로부터 RSV NS1 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원 인간은 또한 RSV 비-구조 단백질 2 ("NS2 단백질"), 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주 (유전자은행 AAX23988.1)로부터 RSV NS2 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 추가로 인간 RSV 뉴클레오캡시드 ("N") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주 (유전자은행 AAX23989.1)로부터 RSV N 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 인간 RSV 인단백질 ("P") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주 (유전자은행 AAX23990.1)로부터 RSV P 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 또한 인간 RSV 매트릭스 단백질 ("M") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주 (유전자은행 AAX23991.1)로부터 RSV M 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
더욱 다른 구현예에서, RSV 항원은 인간 RSV 작은 소수성 ("SH") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주 (유전자은행 AAX23992.1)로부터 RSV SH 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 또한 인간 RSV 매트릭스 단백질 2-1 ("M2-1") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주 (유전자은행 AAX23995.1)로부터 RSV M2-1 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원은 추가로 인간 RSV 매트릭스 단백질 2-2 ("M2-2") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주 (유전자은행 AAX23997.1)로부터 RSV M2-2 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. RSV 항원 인간은 RSV 폴리머라제 L ("L") 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들어, RSV 항원은 RSV 긴 균주 (유전자은행 AAX23996.1)로부터 RSV L 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
추가 구현예에서, RSV 항원은 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2-1, M2-2, 또는 L 단백질의 최적화된 아미노산 서열을 가질 수 있다. RSV 항원은 인간 RSV 단백질 또는 재조합 항원, 예컨대 인간 RSV 게놈에 의해 인코딩된 단백질의 어느 하나일 수 있다.
다른 구현예에서, RSV 항원은, 비제한적으로, 하기일 수 있다: RSV 긴 균주로부터 RSV F 단백질, RSV 긴 균주로부터 RSV G 단백질, 최적화된 아미노산 RSV G 아미노산 서열, RSV 긴 균주의 인간 RSV 게놈, 최적화된 아미노산 RSV F 아미노산 서열, RSV 긴 균주로부터 RSV NS1 단백질, RSV 긴 균주로부터 RSV NS2 단백질, RSV 긴 균주로부터 RSV N 단백질, RSV 긴 균주로부터 RSV P 단백질, RSV 긴 균주로부터 RSV M 단백질, RSV 긴 균주로부터 RSV SH 단백질, RSV 긴 균주로부터 RSV M2-1 단백질, RSV 긴 균주로부터 RSV M2-2 단백질, RSV 긴 균주로부터 RSV L 단백질, RSV 하위유형 B 분리 H5601로부터 RSV G 단백질, RSV 하위유형 B 분리 H1068로부터 RSV G 단백질, RSV 하위유형 B 분리 H5598로부터 RSV G 단백질, RSV 하위유형 B 분리 H1123으로부터 RSV G 단백질, 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체.
(d) 인플루엔자 항원
항원은 인플루엔자 항원 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다. 인플루엔자 항원은 하나 이상의 인플루엔자 혈청형에 대해 포유동물에서 면역 반응을 유발시킬 수 있는 것이다. 항원은 전장 번역 생성물 HA0, 서브유닛 HA1, 서브유닛 HA2, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 인플루엔자 혈구응집소 항원은 인플루엔자 A 혈청형 H1의 다중 균주로부터 유래된 공통 서열, 인플루엔자 A 혈청형 H2의 다중 균주로부터 유래된 공통 서열, 인플루엔자 A 혈청형 H1의 다중 균주의 상이한 세트로부터 유래된 2 상이한 공통 서열의 부분을 함유하는 하이브리드 서열 또는 인플루엔자 B의 다중 균주로부터 유래된 공통 서열일 수 있다. 인플루엔자 혈구응집소 항원은 인플루엔자 B로부터일 수 있다.
인플루엔자 항원은 또한 면역 반응이 유도될 수 있는 특정 인플루엔자 면역원에 대해 효과적일 수 있는 적어도 하나의 항원성 에피토프를 함유할 수 있다. 항원은 온전한 인플루엔자 바이러스에서 존재하는 면역원성 부위 및 에피토프의 전체 레퍼토리를 제공할 수 있다. 항원은 1 혈청형의 복수의 인플루엔자 A 바이러스 균주 예컨대 혈청형 H1 또는 혈청형 H2의 복수의 인플루엔자 A 바이러스 균주로부터 혈구응집소 항원 서열로부터 유래될 수 있는 공통 혈구응집소 항원 서열일 수 있다. 항원은 조합하는 2 상이한 공통 혈구응집소 항원 서열 또는 이의 부분으로부터 유래될 수 있는 하이브리드 공통 혈구응집소 항원 서열일 수 있다. 각각의 2 상이한 공통 혈구응집소 항원 서열은 1 혈청형의 복수의 인플루엔자 A 바이러스 균주 예컨대 혈청형 H1의 복수의 인플루엔자 A 바이러스 균주의 상이한 세트로부터 유래될 수 있다. 항원은 복수의 인플루엔자 B 바이러스 균주로부터 혈구응집소 항원 서열로부터 유래될 수 있는 공통 혈구응집소 항원 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 인플루엔자 항원은 H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA, 또는 BHA 항원일 수 있다. 대안적으로, 인플루엔자 항원은 공통 H1 아미노산 서열 또는 공통 H2 아미노산 서열을 포함하는 공통 혈구응집소 항원일 수 있다. 공통 혈구응집소 항원은 2 상이한 공통 H1 서열의 부분을 포함하는 합성 하이브리드 공통 H1 서열일 수 있고, 이들 각각은 서로로부터 서열의 상이한 세트로부터 유래된다. 합성 하이브리드 공통 H1 단백질인 공통 HA 항원의 예는 U2 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 공통 혈구응집소 항원은 인플루엔자 B 균주로부터 혈구응집소 서열로부터 유래된 공통 혈구응집소 단백질, 예컨대 공통 BHA 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.
공통 혈구응집소 항원은 하나 이상의 추가의 아미노산 서열 요소를 추가로 포함할 수 있다. 공통 혈구응집소 항원은 그것의 N-말단에서 IgE 또는 IgG 리더 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 공통 혈구응집소 항원은 쉽게 이용가능한 항체에 의해 검출될 수 있는 특유의 면역원성 에피토프인 면역원성 태그를 추가로 포함할 수 있다. 그와 같은 면역원성 태그의 예는 공통 혈구응집소 C 말단에서 연결될 수 있는 9 아미노산 인플루엔자 HA 태그이다. 일부 구현예에서, 공통 혈구응집소 항원은 그것의 N-말단에서 IgE 또는 IgG 리더 아미노산 서열 그리고 그것의 C 말단에서 HA 태그를 추가로 포함할 수 있다.
공통 혈구응집소 항원은 공통 인플루엔자 아미노산 서열 또는 이의 단편 및 변이체로 구성되는 공통 혈구응집소 단백질일 수 있다. 공통 혈구응집소 항원은 비-인플루엔자 단백질 서열 및 인플루엔자 단백질 서열 또는 이의 단편 및 변이체를 포함하는 공통 혈구응집소 단백질일 수 있다.
공통 H1 단백질의 예는 공통 H1 아미노산 서열로 구성될 수 있는 것 또는 추가의 요소 예컨대 IgE 리더 서열, 또는 HA 태그 또는 양쪽 IgE 리더 서열 및 HA 태그를 추가로 포함하는 것을 포함한다.
공통 H2 단백질의 예는 공통 H2 아미노산 서열로 구성될 수 있는 것 또는 IgE 리더 서열, 또는 HA 태그, 또는 양쪽 IgE 리더 서열 및 HA 태그를 추가로 포함하는 것을 포함한다.
하이브리드 공통 H1 단백질의 예는 공통 U2 아미노산 서열로 구성될 수 있는 것 또는 IgE 리더 서열, 또는 HA 태그, 또는 양쪽 IgE 리더 서열 및 HA 태그를 추가로 포함하는 것을 포함한다.
하이브리드 공통 인플루엔자 B 혈구응집소 단백질의 예는 공통 BHA 아미노산 서열로 구성될 수 있는 것을 포함하거나 IgE 리더 서열, 또는 HA 태그, 또는 양쪽 IgE 리더 서열 및 HA 태그를 포함할 수 있다.
공통 혈구응집소 단백질은 공통 혈구응집소 핵산, 이의 변이체 또는 이의 단편에 의해 인코딩될 수 있다. 상이한 균주 및 변이체로부터 복수의 상이한 혈구응집소 서열로부터 유래된 공통 서열일 수 있는 공통 혈구응집소 단백질과 달리, 공통 혈구응집소 핵산은 공통 단백질 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 지칭하고 사용된 코딩 서열은 공통 혈구응집소 단백질 서열이 유래되는 복수의 상이한 혈구응집소 서열에서 특정한 아미노산 서열을 인코딩하는데 사용된 것과 상이할 수 있다. 공통 핵산 서열은 코돈 최적화 및/또는 RNA 최적화될 수 있다. 공통 혈구응집소 핵산 서열은 5' 미번역된 영역에서 코작 서열을 포함할 수 있다. 공통 혈구응집소 핵산 서열은 리더 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. N 말단 리더 서열의 코딩 서열은 혈구응집소 코딩 서열의 5'이다. N-말단 리더는 분비를 용이하게 할 수 있다. N-말단 리더는 IgE 리더 또는 IgG 리더일 수 있다. 공통 혈구응집소 핵산 서열은 면역원성 태그를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 면역원성 태그는 단백질의 C 말단에서일 수 있고 그것을 인코딩하는 서열은 HA 코딩 서열의 3'이다. 면역원성 태그는 그와 같은 항체가 단백질의 발현을 검출 및 확인하기 위한 검정에서 사용될 수 있도록 쉽게 이용가능한 항체가 있는 특유의 에피토프를 제공한다. 면역원성 태그는 단백질의 C-말단에서 HA 태그일 수 있다.
(e) 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 항원
항원은 HIV 항원 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다. HIV 항원은 면역원용 변형된 공통 서열을 포함할 수 있다. 작제물의 면역원성을 증가시키기 위해 코돈 최적화, RNA 최적화, 및 고 효율 면역글로빈 리더 서열의 부가를 포함하는 유전적 변형은 변형된 공통 서열에서 포함될 수 있다. 신규한 면역원은 상응하는 코돈 최적화된 면역원보다 더 강한 및 더 넓은 세포성 면역 반응을 유도하도록 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, HIV 항원은 하위유형 A 공통 외피 DNA 서열 작제물, 하위유형 A 외피 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 하위유형 A 공통 외피 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에서, HIV 항원은 하위유형 B 공통 외피 DNA 서열 작제물, 하위유형 B 외피 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 하위유형 B 공통 외피 단백질 서열일 수 있다.
더욱 다른 구현예에서, HIV 항원은 하위유형 C 공통 외피 DNA 서열 작제물, 하위유형 C 외피 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 하위유형 C 공통 외피 단백질 서열일 수 있다.
추가 구현예에서, HIV 항원은 하위유형 D 공통 외피 DNA 서열 작제물, 하위유형 D 외피 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 하위유형 D 공통 외피 단백질 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, HIV 항원은 하위유형 B Nef-Rev 공통 외피 DNA 서열 작제물, 하위유형 B Nef-Rev 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 하위유형 B Nef-Rev 공통 단백질 서열일 수 있다.
다른 구현예에서, HIV 항원은 하위유형 A, B, C 및 D DNA 서열 작제물의 Gag 공통 DNA 서열, Gag 공통 하위유형 A, B, C 및 D 단백질용 공통 서열에 연결된 IgE 리더 서열, 또는 공통 Gag 하위유형 A, B, C 및 D 단백질 서열일 수 있다.
더욱 다른 구현예에서, HIV 항원은 MPol DNA 서열 또는 MPol 단백질 서열일 수 있다. HIV 항원은 Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag, 또는 임의의 이의 조합의 핵산 또는 아미노산 서열일 수 있다.
(f) 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV) 항원
항원은 LCMV 항원 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다. LCMV 항원은 개선된 발현을 위하여 공통 서열 및/또는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 작제물의 면역원성을 증가시키기 위해 코돈 최적화, RNA 최적화, 및 고도로 효율적인 면역글로불린 리더 서열의 부가를 포함하는, 유전적 변형은 변형된 서열에서 포함될 수 있다. LCMV 항원은 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드 (예를 들면, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드)를 포함할 수 있고, 일부 구현예에서, HA 태그를 포함할 수 있다. 면역원은 상응하는 코돈 최적화된 면역원보다 더 강한 및 더 넓은 세포성 면역 반응을 유도하도록 설계될 수 있다.
LCMV 항원은 LCMV Armstrong으로부터 항원일 수 있다. LCMV 항원은 LCMV 클론 13으로부터 항원일 수 있다. LCMV 항원은 LCMV로부터 핵단백질 (NP), LCMV로부터 당단백질 (GP; 예를 들면, GP-1, GP-2, 및 GP-C), LCMV로부터 L 단백질, LCMV로부터 Z 폴리펩타이드, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합일 수 있다.
(2) 기생충 항원
항원은 기생충 항원 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 기생충은 원생동물, 연충, 또는 체외기생충일 수 있다. 연충 (즉, 벌레)는 편형충 (예를 들면, 흡충 및 촌충), 구두충, 또는 회충 (예를 들면, 요충)일 수 있다. 체외기생충은 이, 벼룩, 진드기, 및 진드기일 수 있다.
기생충은 하기 질환을 야기시키는 임의의 기생충일 수 있다: 가시아메바 각막염, 아메바증, 회충증, 바베스열원충증, 대장섬모충증, 너구리회충증, 샤가스 질환, 간흡충증, 코클리오마이아, 작은와포자충, 열두조충증, 드라쿤쿨루스증, 포충증, 코끼리피부병, 요충증, 간질증, 비대흡충증, 사상충증, 람블편모충증, 악구충증, 막양조충증, 이소스포라증, 카타야마열, 라이쉬마니증, 라임병, 말라리아, 흡충증, 구더기증, 사상충증, 이감염증, 옴, 주혈협충병, 수면병, 간충증, 조충증, 톡소카라증, 톡소플라스마증, 선모충증, 및 편충증.
기생충은 하기일 수 있다: 가시아메바, 아니사키스, 아스카리스 룸브리코이데스, 쇠파리, 발란티듐 콜리, 빈대, 조충 (촌충), 양충, 코클리오마이아 호미니보락스, 이질아메바, 파스시올라 헤파티카, 람플편모충, 구충, 라이쉬마니아, 린구아툴라 세라타, 간 흡충, 로아사상충, 파라고니무스 - 폐 흡충, 요충, 플라스모디엄 팔시파럼, 주혈흡충, 분선충속 스테르코랄리스, 진드기, 촌충, 톡소플라스마 곤디이, 트라이파노소마, 편충, 또는 반크롭트 사상충.
(a) 말라리아 항원
항원은 말라리아 항원 (즉, PF 항원 또는 PF 면역원), 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다. 항원은 말라리아를 야기시키는 기생충으로부터일 수 있다. 말라리아 야기 기생충은 플라스모디엄 팔시파럼일 수 있다. 플라스모디엄 팔시파럼 항원은 시르쿰스포로조이테 (CS) 항원을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 말라리아 항원은 P. 팔시파룸 면역원 CS, LSA1, TRAP, CelTOS, 및 Ama1의 하나 이상을 인코딩하는 핵산 분자 예컨대 플라스미드일 수 있다. 면역원은 전장 단백질의 전장 또는 면역원성 단편일 수 있다. 면역원은 개선된 발현을 위하여 공통 서열 및/또는 변형을 포함한다.
다른 구현예에서, 말라리아 항원은, 유전자은행 데이터베이스 (총 28 서열)에서 모든 전장 플라스모디엄 팔시파럼 TRAP/SSP2 서열의 편집으로부터 설계된, SSP2로서 또한 지칭되는, TRAP의 공통 서열일 수 있다. 공통 TRAP 면역원 (즉, ConTRAP 면역원)은 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 포함할 수 있고 일부 구현예에서, HA 태그를 포함할 수 있다.
더욱 다른 구현예에서, 말라리아 항원은, Ag2로서 또한 지칭되고 고도로 보존된 열원충 항원인, CelTOS일 수 있다. 공통 CelTOS 항원 (즉, ConCelTOS 면역원)은 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 포함할 수 있고 일부 구현예에서, HA 태그를 포함할 수 있다.
추가 구현예에서, 말라리아 항원은, 고도로 보존된 열원충 항원인, Ama1일 수 있다. 말라리아 항원은 또한 일부 경우에서, 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 포함하는 Ama1 (즉, ConAmaI 면역원)의 공통 서열일 수 있고 일부 구현예에서, HA 태그를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 말라리아 항원은 일부 경우에서, 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 포함하는 공통 CS 항원 (즉, 공통 CS 면역원)일 수 있고 일부 구현예에서, HA 태그를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 말라리아 항원은 본 명세서에서 제시된 PF 단백질의 2 이상의 조합을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 서로에 직접적으로 인접하여 연결된 또는 그 사이 스페이서 또는 하나 이상의 아미노산으로 연결된 공통 CS 면역원, ConLSA1 면역원, ConTRAP 면역원, ConCelTOS 면역원 및 ConAma1 면역원의 2 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 2 PF 면역원을 포함하고; 일부 구현예에서 융합 단백질은 3 PF 면역원을 포함하고; 일부 구현예에서 융합 단백질은 4 PF 면역원을 포함하고; 일부 구현예에서 융합 단백질은 5 PF 면역원을 포함한다. 2 공통 PF 면역원을 가진 융합 단백질은 하기를 포함할 수 있다: CS 및 LSA1; CS 및 TRAP; CS 및 CelTOS; CS 및 Ama1; LSA1 및 TRAP; LSA1 및 CelTOS; LSA1 및 Ama1; TRAP 및 CelTOS; TRAP 및 Ama1; 또는 CelTOS 및 Ama1. 3 공통 PF 면역원을 가진 융합 단백질은 하기를 포함할 수 있다: CS, LSA1 및 TRAP; CS, LSA1 및 CelTOS; CS, LSA1 및 Ama1; LSA1, TRAP 및 CelTOS; LSA1, TRAP 및 Ama1; 또는 TRAP, CelTOS 및 Ama1. 4 공통 PF 면역원을 가진 융합 단백질은 하기를 포함할 수 있다: CS, LSA1, TRAP 및 CelTOS; CS, LSA1, TRAP 및 Ama1; CS, LSA1, CelTOS 및 Ama1; CS, TRAP, CelTOS 및 Ama1; 또는 LSA1, TRAP, CelTOS 및 Ama1. 5 공통 PF 면역원을 가진 융합 단백질은 CS 또는 CS-alt, LSA1, TRAP, CelTOS 및 Ama1을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 N 말단에 연결된 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 각각의 공통 PF 면역원의 N 말단에 연결된 다중 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 융합 단백질의 PF 면역원 사이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 PF 면역원 사이 스페이서는 단백분해성 절단 부위일 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 백신이 투여되고/되거나 흡수되는 세포에서 발견된 프로테아제에 의해 인식된 단백분해성 절단 부위일 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 융합 단백질의 PF 면역원 사이 포함될 수 있고, 여기서 상기 스페이서는 백신이 투여되고/되거나 흡수되는 세포에서 발견된 프로테아제에 의해 인식된 단백분해성 절단 부위이고 융합 단백질은 각각의 공통 PF 면역원의 N 말단에 연결된 다중 신호 펩타이드를 포함하여 이로써 절단시, 각각의 공통 PF 면역원의 신호 펩타이드는 세포 외부에 공통 PF 면역원을 전위시킨다.
(3) 박테리아성 항원
항원은 박테리아성 항원 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 박테리아는 하기 종족의 어느 하나로부터일 수 있다: 아시도박테리아, 악티노박테리아, 아퀴피카애, 박테로이데테스, 칼디세리카, 클라마이디애, 클로로비, 클로로플렉시, 크리시오게네테스, 시아노박테리아, 데페리박테레스, 데이노코쿠스-테르무스, 딕티오글로미, 엘루시미크로비아, 파이브로박터레스, 피르미쿠테스, 푸소박테리아, 겜마티모나데테스, 렌티스파에라애, 니트로스피라, 플랑토미세테스, 프로테오박테리아, 스피로카에테스, 시네르기스테테스, 테네리쿠테스, 서모데설포박테리아, 써모토가애, 및 베루코미크로비아.
박테리아는 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 박테리아는 호기성 박테리아 또는 혐기성 박테리아일 수 있다. 박테리아는 자가영양 박테리아 또는 종속영양 박테리아일 수 있다. 박테리아는 호중온균, 호중구, 극한미생물, 호산성균, 호알칼리성균, 호고온균, 호냉균, 호염균, 또는 호삼투압균일 수 있다.
박테리아는 탄저병 박테리아, 항생제 저항성 박테리아, 질환 야기 박테리아, 식중독 박테리아, 감염성 박테리아, 살모넬라 박테리아, 스타필로코쿠스 박테리아, 연쇄상구균 박테리아, 또는 테타누스독소증 박테리아일 수 있다. 박테리아는 마이코박테리아, 클로스트리듐 테타니, 예르시니아 페스티스, 바실러스 안트라시스, 메티실린-저항성 스타필로코쿠스 아우레스 (MRSA), 또는 클로스트리듐 디피실레일 수 있다. 박테리아는 마이코박테리움 투베르쿨로시스일 수 있다.
(a) 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원
항원은 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원 (즉, TB 항원 또는 TB 면역원), 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체일 수 있다. TB 항원은 TB 항원의 Ag85 계열, 예를 들어, Ag85A 및 Ag85B로부터일 수 있다. TB 항원은 TB 항원의 Esx 계열, 예를 들어, EsxA, EsxB, EsxC, EsxD, EsxE, EsxF, EsxH, EsxO, EsxQ, EsxR, EsxS, EsxT, EsxU, EsxV, 및 EsxW로부터일 수 있다.
일부 구현예에서, TB 항원은 Ag85 계열 및 Esx 계열로부터 마이코박테리움 투베르쿨로시스 면역원의 하나 이상을 인코딩하는 핵산 분자 예컨대 플라스미드일 수 있다. 면역원은 전장 단백질의 전장 또는 면역원성 단편일 수 있다. 면역원은 개선된 발현을 위하여 공통 서열 및/또는 변형을 포함할 수 있다. 공통 면역원은 신호 펩타이드 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 포함할 수 있고 일부 구현예에서, HA 태그를 포함할 수 있다.
(4) 진균 항원
항원은 진균 항원 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 진균은 아스페르길루스 종, 블라스토마이세스 더마티티디스, 칸디다 효모 (예를 들면, 칸디다 알비칸스), 콕시디오이데스, 크립토코쿠스 네오포르만스, 크립토코쿠스 가티이, 피부사상균, 푸사리움 종, 히스토플라즈마 캅술라툼, 뮤코로마이코티나, 뉴모사이스티스 지로베시, 스포로트릭스 쉔크키, 엑세로힐룸, 또는 클라도스포리움일 수 있다.
b) 투여
콘드로이티나제 및 제제는 약제학적 기술에서 숙련된 이들에 잘 알려진 표준 기술을 따라 제형화될 수 있다. 콘드로이티나제 및 제제는 동일한 또는 별개의 조성물에서 포함될 수 있다. 히알루로니다제 및 제제는 약제학적 기술에서 숙련된 이들에 잘 알려진 표준 기술을 따라 제형화될 수 있다. 히알루로니다제 및 제제는 동일한 또는 별개의 조성물에서 포함될 수 있다. 그와 같은 조성물은 연령, 성별, 중량, 및 특정한 대상체의 상태, 그리고 투여의 경로를 고려하여 의술에서 숙련된 이들에 잘 알려진 기술로 그리고 투약량으로 투여될 수 있다.
콘드로이티나제 및 제제는 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 예방적 투여에서, 콘드로이티나제 및 제제는 면역 반응을 유도하는데 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료 적용에서, 콘드로이티나제 및 제제는 치료 효과를 유도하는데 충분한 양으로 필요로 하는 대상체에 투여된다. 히알루로니다제 및 제제는 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 예방적 투여에서, 히알루로니다제 및 제제는 면역 반응을 유도하는데 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료 적용에서, 히알루로니다제 및 제제는 치료 효과를 유도하는데 충분한 양으로 필요로 하는 대상체에 투여된다. 이것을 달성하는데 적절한 양은 "치료적으로 유효 용량"으로서 정의된다. 이 용도에 효과적인 양은, 예를 들면, 투여된 백신 레지멘의 특정한 조성물, 투여의 방식, 질환의 병기 및 중증도, 환자의 건강의 일반적인 상태, 및 처방의의 판단에 좌우될 것이다.
콘드로이티나제 및 제제, 또는 히알루로니다제 및 제제는, 예를 들어, 하기에서 기재된 바와 같이 당해 분야에서 잘 알려진 방법에 의해 투여될 수 있다: Donnelly 등 (Ann. Rev. Immunol. 1997, 15, 617-648); 미국 특허 번호 5,580,859; 미국 특허 번호 5,703,055; 및 미국 특허 번호 5,679,647, 이들 모두의 내용은 본 명세서에서 참고로 그 전문이 편입된다. 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 백신 건을 사용하여, 개체에 투여될 수 있는 입자 또는 비드로 복합체화될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는, 생리적으로 허용가능한 화합물을 포함하는, 약제학적으로 허용가능한 캐리어의 선택이, 예를 들어, 발현 벡터의 투여의 경로에 좌우되는 것을 알 것이다.
콘드로이티나제 및 제제는 여러 가지의 경로를 통해 전달될 수 있다. 히알루로니다제 및 제제는 여러 가지의 경로를 통해 전달될 수 있다. 전형적인 전달 경로는 비경구 투여, 예를 들면, 진피내, 근육내, 지방질 조직 전달, 또는 피하 전달을 포함한다. 다른 경로는 경구 투여, 비강내, 및 질내 경로를 포함한다. 특히 폴리뉴클레오타이드에 대하여, 콘드로이티나제 및 제제, 또는 히알루로니다제 및 제제는 개체의 조직의 틈새 공간에 전달될 수 있다 (미국 특허 번호 5,580,859 및 5,703,055, 이들 모두의 내용은 본 명세서에서 참고로 그 전문이 편입된다). 콘드로이티나제 및 제제, 또는 히알루로니다제 및 제제는 또한 근육에 투여될 수 있거나, 진피내 또는 피하 주사를 통해, 또는 경피로, 예컨대 이온침투요법에 의해 투여될 수 있다. 표피 투여는 또한 이용될 수 있다. 표피 투여는 자극제에 면역 반응을 자극시키기 위해 표피의 최외층을 기계적으로 또는 화학적으로 성나게 하는 것을 포함할 수 있다 (미국 특허 번호 5,679,647, 이들의 내용은 본 명세서에서 참고로 그 전문이 편입된다).
콘드로이티나제 및 제제는 액상 제제 예컨대 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르일 수 있다. 콘드로이티나제 및 제제는 또한 비경구, 피하, 지방질 조직, 진피내, 근육내 또는 정맥내 투여 (예를 들면, 주사가능 투여)용 제제, 예컨대 멸균된 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 히알루로니다제 및 제제는 액상 제제 예컨대 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르일 수 있다. 히알루로니다제 및 제제는 또한 비경구, 피하, 지방질 조직, 진피내, 근육내 또는 정맥내 투여 (예를 들면, 주사가능 투여)용 제제, 예컨대 멸균된 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다.
콘드로이티나제 및 제제, 또는 히알루로니다제 및 제제는 리포좀, 마이크로구형체 또는 다른 폴리머 매트릭스에 편입될 수 있다 (미국 특허 번호 5,703,055; Gregoriadis, Liposome Technology, 제2판, I 내지 III권, 1993), 이들의 내용은 본 명세서에서 참고로 그 전문이 편입된다). 리포좀은 인지질 또는 다른 지질로 구성될 수 있고, 제조 및 투여하기 위해 상대적으로 단순한 비독성, 생리적으로 허용가능한 및 대사가능 캐리어일 수 있다.
콘드로이티나제 및 제제, 또는 히알루로니다제 및 제제는 전기천공을 통해, 예컨대, 하기에서 기재된 방법에 의해 투여될 수 있다: 미국 특허 번호 7,664,545, 이들의 내용은 본 명세서에서 참고로 편입된다. 전기천공은 하기에서 기재된 방법 및/또는 장치에 의한 것일 수 있다: 미국 특허 번호　6,302,874; 5,676,646; 6,241,701; 6,233,482; 6,216,034; 6,208,893; 6,192,270; 6,181,964; 6,150,148; 6,120,493; 6,096,020; 6,068,650; 및 5,702,359, 이들의 내용은 본 명세서에서 참고로 그 전문이 편입된다. 전기천공은 최소로 침습성 디바이스를 통해 수행될 수 있다.
최소로 침습성 전기천공 디바이스 ("MID")는 바디 조직에 상기 기재된 콘드로이티나제 및 제제 그리고 관련된 유체 주사용 장치일 수 있다. 디바이스는 중공 바늘, DNA 카셋트, 및 유체 전달 수단을 포함할 수 있고, 여기서 상기 디바이스는 상기 바디 조직에 바늘의 삽입 동안 바디 조직에 동시에 (예를 들어, 자동으로) DNA를 주사하기 위해 사용시 유체 전달 수단을 작동시키도록 적응된다. 이것은 바늘이 삽입되는 동안 서서히 DNA 및 관련된 유체를 주사하는 능력이 바디 조직을 통해 유체의 더욱 고른 분배를 유발시킨다는 장점을 갖는다. 주사 동안 경험하였던 통증은 더 큰 영역에 걸쳐 주사되는 DNA의 분포로 인해 감소될 수 있다.
MID는 바늘의 사용 없이 조직에 콘드로이티나제 및 제제를 주사할 수 있다. MID는 백신이 조직의 표면을 관통하는 그리고 내부 조직 및/또는 근육을 진입하는 그와 같은 힘으로 작은 스트림 또는 젯트로서 백신을 주사할 수 있다. 작은 스트림 또는 젯트 배후의 힘은 몇분의 1초 내에 마이크로-오리피스를 통해 압축된 가스, 예컨대 이산화탄소의 팽창에 의해 제공될 수 있다. 최소로 침습성 전기천공 디바이스, 및 이들의 사용 방법의 예는 하기에서 기재된다: 공개된 미국 특허 출원 번호 20080234655; 미국 특허 번호 6,520,950; 미국 특허 번호 7,171,264; 미국 특허 번호 6,208,893; 미국 특허 번호 6,009,347; 미국 특허 번호 6,120,493; 미국 특허 번호 7,245,963; 미국 특허 번호 7,328,064; 및 미국 특허 번호 6,763,264, 이들 각각의 내용은 본 명세서에서 참고로 편입된다.
MID는 무통증으로 조직을 관통하는 액체의 고속 젯트를 창출하는 주사기를 포함할 수 있다. 그와 같은 무바늘 주사기는 상업적으로 입수가능하다. 본 명세서에서 이용될 수 있는 무바늘 주사기의 예는 하기에서 기재된 것을 포함한다: 미국 특허 번호 3,805,783; 4,447,223; 5,505,697; 및 4,342,310, 이들 각각의 내용은 본 명세서에서 참고로 편입된다.
직접적인 또는 간접적인 전자수송에 적합한 형태로 원하는 콘드로이티나제 및 제제, 히알루로니다제 및 제제는, 조직에 침투를 야기시키기 위한 충분한 힘으로, 제제의 젯트의 전달을 작동시키기 위해 주사기와 조직 표면 접촉에 의해 일반적으로, 처리되어야 하는 조직에 무바늘 주사기를 사용하여 도입될 수 있다 (예를 들면, 주사될 수 있다). 예를 들어, 처리되어야 하는 조직이 점막, 피부 또는 근육이면, 제제는 각질층을 통해 그리고 진피 층에, 또는 내부 조직 및 근육, 각각에 제제가 침투하도록 야기시키기 위해 충분한 힘으로 점막 또는 피부 표면을 향해 사출된다.
무바늘 주사기는 조직의 모든 유형에, 특히 피부 및 점막에 전달하도록 양호하게 맞춤화된다. 일부 구현예에서, 무바늘 주사기는 콘드로이티나제 및 제제를 함유하는 액체를 표면에 그리고 대상체의 피부 또는 점막 속에 추진하는데 사용될 수 있다. 본 발명 방법을 사용하여 처리될 수 있는 조직의 다양한 유형의 대표적인 예는 췌장, 후두, 비인두, 하인두, 구인두, 입술, 목, 폐, 심장, 신장, 근육, 유방, 결장, 전립선, 가슴샘, 고환, 피부, 점막 조직, 난소, 혈관, 또는 임의의 이의 조합을 포함한다.
MID는 조직을 전기천공하는 바늘 전극을 가질 수 있다. 예를 들어 직사각형 또는 정사각형 패턴으로 설정된, 다중 전극 어레이에서 전극의 다중 쌍 사이 펄스화에 의해, 한 쌍의 전극 사이 펄스화의 것보다 개선된 결과를 제공한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,702,359 명칭 "Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes"에서 개시된 것은 복수의 쌍의 바늘이 치료적 처치 동안 펄스화될 수 있는 다수의 바늘이다. 완전하게 제시된 바와 같이 본 명세서에서 참고로 편입되는, 그 출원에서, 바늘은 원형 어레이로 배치되었지만, 바늘 전극의 대향 쌍 사이 펄스화를 가능하게 하는 스위칭 장치 및 커넥터를 갖는다. 세포에 재조합 발현 벡터 전달용 한 쌍의 바늘 전극은 사용될 수 있다. 그와 같은 디바이스 및 시스템은 하기에서 기재된다: 미국 특허 번호 6,763,264, 이들의 내용은 본 명세서에서 참고로 편입된다. 대안적으로, 정상 주사 바늘을 닮은 단일 바늘로 DNA의 주사 및 전기천공을 허용하고 현재 사용된 디바이스에 의해 전달된 것보다 더 낮은 전압의 펄스를 인가하는, 따라서 환자에 의해 경험하였던 전기 감각을 감소시키는 단일 바늘 디바이스는 사용될 수 있다.
MID는 하나 이상의 전극 어레이를 포함할 수 있다. 어레이는 동일한 직경 또는 상이한 직경의 2 이상의 바늘을 포함할 수 있다. 바늘은 고르게 또는 고르지 않게 떨어져서 이격될 수 있다. 바늘은 0.005 인치 내지 0.03 인치, 0.01 인치 내지 0.025 인치; 또는 0.015 인치 내지 0.020 인치일 수 있다. 바늘은 직경 0.0175 인치일 수 있다. 바늘은 0.5 mm, 1.0 mm, 1.5 mm, 2.0 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm, 4.0 mm, 또는 초과 떨어져서 이격될 수 있다.
MID는 펄스 발생제 그리고 단일 단계에서 백신 및 전기천공 펄스를 전달하는 2 이상-바늘 백신 주사기로 구성될 수 있다. 펄스 발생제는 플래시 카드 작동된 퍼스널 컴퓨터를 통해 펄스 및 주사 파라미터의 가요성 프로그래밍, 뿐만 아니라 전기천공 및 환자 데이터의 포괄적인 기록 및 저장을 허용할 수 있다. 펄스 발생제는 짧은 기간 동안 여러 가지의 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 예를 들어, 펄스 발생제는 지속기간으로 100 ms의 15 볼트 펄스 3개를 전달할 수 있다. 그와 같은 MID의 예는 Inovio Biomedical Corporation에 의한 Elgen 1000 시스템이고, 이는 하기에서 기재된다: 미국 특허 번호 7,328,064, 이들의 내용은 본 명세서에서 참고로 편입된다.
MID는, 바디 또는 식물에서 선택된 조직의 세포에, 거대분자, 예컨대 DNA의 도입을 용이하게 하는, 모듈러 전극 시스템인, CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) 디바이스 및 시스템일 수 있다. 모듈러 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 바늘; 프로그래밍가능한 정전류 펄스 컨트롤러부터 복수의 바늘 전극까지 전도성 연결을 제공하는 전기 커넥터; 및 전원을 포함할 수 있다. 오퍼레이터는 지지 구조에서 실장되는 복수의 바늘 전극을 꼭 잡을 수 있고 이들을 바디 또는 식물에서 선택된 조직 속에 확실하게 삽입시킬 수 있다. 거대분자는 그 다음 피하 바늘을 통해 선택된 조직에 전달된다. 프로그래밍가능한 정전류 펄스 컨트롤러는 활성화되고 정전류 전기 펄스는 복수의 바늘 전극에 인가된다. 인가된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이 세포 속에 거대분자의 도입을 용이하게 한다. 세포의 과열로 인한 세포 사망은 정전류 펄스의 덕택에 조직에서 전력 손실 제한에 의해 최소화된다. CELLECTRA 디바이스 및 시스템은 미국 특허 번호 7,245,963에서 기재되고, 이들의 내용은 본 명세서에서 참고로 편입된다.
MID는 Elgen 1000 시스템 (Inovio Pharmaceuticals)일 수 있다. Elgen 1000 시스템은 중공 바늘을 제공하는 디바이스; 및 유체 전달 수단을 포함할 수 있고, 여기서 장치는, 상기 바디 조직에 바늘의 삽입 동안 바디 조직에, 본 명세서에서 기재된 백신인, 유체를 동시에 (예를 들어 자동으로) 주사하기 위해 사용시 유체 전달 수단을 작동시키도록 적응된다. 장점은 바늘이 삽입되는 동안 바디 조직을 통해 유체의 더욱 고른 분배로 이어지는 서서히 유체를 주사하는 능력이다. 주사 동안 경험하였던 통증이 더 큰 영역에 걸쳐 주사되는 유체의 용적의 분포로 인해 감소되는 것이 또한 믿어진다.
또한, 유체의 자동 주사는 주사된 유체의 실제의 용량의 등록 및 자동 모니터링을 용이하게 한다. 이러한 데이터는 원한다면 문서화 목적으로 제어 장치에 의해 저장될 수 있다.
주사의 속도가 어느 한쪽 선형 또는 비-선형일 수 있다는 것 그리고 바늘이 처리되어야 하는 대상체의 피부를 통해 삽입된 후 및 이들이 바디 조직에 추가로 삽입되는 동안 주사가 수행될 수 있음이 인정될 것이다.
유체가 주사될 수 있는 적합한 조직은 종양 조직, 피부 또는 간 조직을 포함하지만 근육 조직일 수 있다.
투여용 장치는 바디 조직에 바늘의 가이딩 삽입용 바늘 삽입 수단을 추가로 포함할 수 있다. 유체 주사의 속도는 바늘 삽입의 속도에 의해 제어된다. 이것은 유체의 양쪽 바늘 삽입 및 주사가 제어될 수 있어서 이로써 삽입의 속도가 원하는 대로 주사의 속도에 일치될 수 있다는 장점을 갖는다. 또한 사용자가 조작하기 더욱 쉽게 장치를 만든다. 원한다면 바디 조직에 바늘을 자동으로 삽입하기 위한 수단은 제공될 수 있다.
사용자는 유체의 주사를 언제 착수할지를 선택할 수 있다. 이상적으로 그러나, 주사는 바늘의 끝이 근육 조직에 도달한 경우 착수되고 장치는 유체의 주사가 착수하기에 충분한 깊이로 바늘이 삽입된 경우 감지용 수단을 포함할 수 있다. 이것은 유체의 주사가 (근육 조직이 시작하는 깊이가 정상적으로 될) 원하는 깊이에 바늘이 도달한 경우 자동으로 착수하도록 유발될 수 있다는 것을 의미한다. 근육 조직이 시작하는 깊이는 예를 들어 사전설정 바늘 삽입 깊이 예컨대 바늘이 피부층을 침투하기에 충분한 것으로 간주될 4 mm의 값으로 여겨질 수 있다.
감지 수단은 초음파 탐침을 포함할 수 있다. 감지 수단은 임피던스 또는 저항에서 변화 감지용 수단을 포함할 수 있다. 이 경우에, 수단은 자체로 바디 조직에서 바늘의 깊이를 기록할 수 없지만 바늘이 바디 조직의 상이한 유형부터 근육 속으로 움직임에 따라 임피던스 또는 저항에서 변화를 감지하도록 다소 적응될 것이다. 이들 대안의 어느 한쪽은 주사가 착수할 수 있는 감지의 수단을 작동시키도록 상대적으로 정확한 및 단순한 것을 제공한다. 바늘의 삽입의 깊이는 원한다면 추가로 기록될 수 있고 바늘 삽입의 깊이가 기록됨에 따라 주사되기 위한 유체의 용적이 결정되도록 유체의 주사를 제어하는데 사용될 수 있다.
투여 장치는 추가로 하기를 포함할 수 있고: 바늘 지지용 베이스; 및 거기에서 베이스를 받기 위한 하우징, 여기서 상기 베이스는 하우징에 비해 이동성이어서 이로써 베이스가 하우징에 비해 제1 뒷쪽 위치인 경우 바늘은 하우징 내에 수축하고 베이스가 하우징 내에 제2 앞쪽 위치인 경우 바늘은 하우징 밖으로 확장한다. 이것은 하우징이 환자의 피부에 라이닝될 수 있음에 따라 사용자에 유리하고, 바늘은 그 다음 베이스에 비해 하우징을 움직임으로써 환자의 피부에 삽입될 수 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, 피부에 삽입됨에 따라 유체가 바늘의 길이에 대해 고르게 분포되도록 유체 주사의 제어된 속도를 달성하는 것이 바람직하다. 유체 전달 수단은 제어된 속도에서 유체를 주사하도록 적응된 피스톤 구동 수단을 포함할 수 있다. 피스톤 구동 수단은 예를 들어 서보 모터에 의해 활성화돨 수 있다. 그러나, 피스톤 구동 수단은 하우징에 비해 축상 방향에서 움직이고 있는 베이스에 의해 작동될 수 있다. 유체 전달용 대안적인 수단이 제공될 수 있음이 인정될 것이다. 따라서, 예를 들어, 제어된 또는 비-제어된 속도로 유체 전달을 위하여 압박될 수 있는 폐쇄된 컨테이너는 주사기 및 피스톤 시스템 대신에 제공될 수 있다.
주사의 임의의 유형은 사용될 수 있다. 그러나 전기천공의 분야에서 특히 유용한 것이 예상되고 그래서 바늘에 전압 인가용 수단을 추가로 포함할 수 있다. 이것은 주사용으로 뿐만 아니라 전기천공 동안 전극으로서 바늘이 사용되는 것을 허용한다. 이것은 전기장이 주사된 유체와 동일한 면적에 인가되는 것을 의미함에 따라 특히 유리하다. 이전에 주사된 유체와 전극을 정확하게 정렬하는 것이 매우 어렵다는 점에서 전기천공을 가진 문제가 종래에 있어 왔고 그래서 사용자는 더 큰 면적에 대하여 요구되는 것보다 유체의 더 큰 용적을 주사하는 경향을 가졌고 주사된 서브스턴스와 전기장 사이 중첩을 보장하기 위한 시도로 더 많은 면적에 대해 전기장을 인가하는 경향을 가졌다. 본 발명을 사용하여, 양쪽 주사된 유체의 용적 및 인가된 전기장의 크기는 전기장과 유체 사이 양호한 적합을 달성하는 동안 감소될 수 있다.
콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제의 투여는 동시 또는 연속일 수 있다.
i) 동시 투여
콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제는 동시에 대상체에 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "동시에(concurrently)" 및 "동시에(simultaneously)"는 교환가능하게 사용된다. 예를 들어, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제는 공-제형화될 수 있다. 공-제형화된 경우, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제는 단일 단계에서 대상체에 투여될 수 있다. 공-제형화된 경우, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제는, 예를 들어, 단일 주사 단계에서 대상체에 투여될 수 있다.
히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제는 동시에 대상체에 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "동시에" 및 "동시에"는 교환가능하게 사용된다. 예를 들어, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제는 공-제형화될 수 있다. 공-제형화된 경우, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제는 단일 단계에서 대상체에 투여될 수 있다. 공-제형화된 경우, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제는, 예를 들어, 단일 주사 단계에서 대상체에 투여될 수 있다.
ii) 연속 투여
콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제는 연속적으로 대상체에 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "연속적으로" 및 "경시적으로 엇갈려서"는 교환가능하게 사용된다. 일부 구현예에서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 제제의 투여에 앞서 대상체에 투여된다. 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 제제는 연속적으로 대상체에 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "연속적으로" 및 "경시적으로 엇갈려서"는 교환가능하게 사용된다. 일부 구현예에서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 제제의 투여에 앞서 대상체에 투여된다. 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 제제의 투여에 적어도 약 3 분, 5 분, 15 분, 적어도 약 20 분, 적어도 약 25 분, 적어도 약 30 분, 적어도 약 35 분, 적어도 약 40 분, 적어도 약 45 분, 적어도 약 50 분, 적어도 약 55 분, 적어도 약 1 시간, 적어도 약 1.5 시간, 적어도 약 2 시간, 적어도 약 2.5 시간, 적어도 약 3 시간, 적어도 약 3.5 시간, 적어도 약 4 시간, 적어도 약 4.5 시간, 적어도 약 5 시간, 적어도 약 5.5 시간, 적어도 약 6 시간, 적어도 약 7 시간, 적어도 약 8 시간, 적어도 약 9 시간, 적어도 약 10 시간, 적어도 약 11 시간, 적어도 약 12 시간, 적어도 약 15 시간, 적어도 약 18 시간, 적어도 약 21 시간, 또는 적어도 약 24 시간 앞서 대상체에 투여될 수 있다. 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 제제의 투여에 약 24 시간 미만, 약 21 시간 미만, 약 18 시간 미만, 약 15 시간 미만, 약 12 시간 미만, 약 11 시간 미만, 약 10 시간 미만, 약 9 시간 미만, 약 8 시간 미만, 약 7 시간 미만, 약 6 시간 미만, 약 5.5 시간 미만, 약 5 시간 미만, 약 4.5 시간 미만, 약 4 시간 미만, 약 3.5 시간 미만, 약 3 시간 미만, 약 2.5 시간 미만, 약 2 시간 미만, 약 1.5 시간 미만, 약 1 시간 미만, 약 55 분 미만, 약 50 분 미만, 약 45 분 미만, 약 40 분 미만, 약 35 분 미만, 약 30 분 미만, 약 25 분 미만, 약 20 분 미만, 약 10 분 미만, 약 5 분 미만, 또는 약 15 분 미만 앞서 대상체에 투여될 수 있다. 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 제제의 투여에 적어도 약 5 분 내지 약 24 시간 앞서 대상체에 투여될 수 있다.
c) 방법
i) 제제의 전달 방법
본 발명은 또한 대상체에 제제의 전달 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 글리코사미노글리칸을 분해시키는데 충분한 양으로 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 대상체에 투여하는 단계, 및 대상체에 제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 대상체에 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에 제제의 전달 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 글리코사미노글리칸을 분해시키는데 충분한 양으로 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 대상체에 투여하는 단계, 및 대상체에 제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 대상체에 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
ii) 질환 또는 장애의 치료 방법
본 발명은 또한 대상체에서 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 대상체에 투여하는 단계, 및 대상체에 제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 대상체에 투여하는 단계, 및 대상체에 제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
질환은, 비제한적으로, 하기를 포함할 수 있다: 심혈관 질환 예컨대 관상동맥 심장병, 죽상경화증, 고혈압, 심장 비대증, 심근경색증, 심실 또는 심방세동, 및 심근병증; 신경적 질환 예컨대 신경병증 또는 신경퇴행성 질환; 대사성 질환 예컨대 당뇨병; 염증성 장 질환 예컨대 크론병 및 궤양성 대장염; 피부과 장애를 포함하는 염증성 장애; 자가면역 질환 예컨대 알츠하이머병, 다중 경화증, 건선, 전신 피부근염, 항원에 대한 면역 반응의 악화, 죽상경화증, 류마티스성 관절염, 및 홍반성 낭창; 골다공증; 골관절염; 바이러스성, 박테리아성, 기생충, 또는 진균 감염에 의해 야기된 질환; 및 암. 바이러스성 질환은, 예를 들어, 중동 호흡기 증후군일 수 있다. 제제 및 콘드로이티나제 투여된 대상체는 제제 투여된 대상체와 비교하여 증가된 또는 부스팅된 면역 반응을 가질 수 있다. 증가된 면역 반응은 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다.
질환은 암, 예를 들어, HPV-관련된 암, HBV-관련된 암, 난소 암, 전립선 암, 유방 암, 뇌암, 두경부 암, 목 암, 폐 암, 간 암, 췌장의 암, 신장 암, 골 암, 흑색종, 전이성 암, hTERT-관련된 암, FAP-항원 관련된 암, 비-소 세포 폐 암, 혈액 암, 식도 편평상피 세포 암종, 자궁경부 암, 방광 암, 결장직장 암, 위 암, 항문 암, 활막 암종, 고환 암, 재발성 호흡 유두종증, 피부 암, 교모세포종, 간암종, 위 암, 급성 골수 백혈병, 삼중-음성 유방 암, 및 1차 피부 T 세포 림프종일 수 있다.
방법은 대상체에서 확립된 종양 또는 병변의 크기 감소를 추가로 포함할 수 있다. 종양은, 예를 들어, 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제 없이 제제의 투여와 비교하여, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 또는 약 80% 내지 약 90%만큼 크기가 감소될 수 있다. 종양은, 예를 들어, 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제 없이 제제의 투여와 비교하여, 약 80%만큼, 약 81%만큼, 약 82%만큼, 약 83%만큼, 약 84%만큼, 약 85%만큼, 약 86%만큼, 약 87%만큼, 약 88%만큼, 약 89%만큼, 약 90%만큼, 약 91%만큼, 약 92%만큼, 약 93%만큼, 약 94%만큼, 약 95%만큼, 약 96%만큼, 약 97%, 약 98%만큼, 약 99%만큼, 또는 약 100%만큼 크기가 감소될 수 있다.
방법은 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제 없이 제제 투여된 대상체와 비교하여 대상체에서 종양 퇴행 증가를 추가로 포함할 수 있다. 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제를 가진 제제의 투여는, 예를 들어, 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제 없이 제제의 투여와 비교하여, 약 40% 내지 약 60%, 약 45% 내지 약 55%, 또는 약 50%만큼 종양 퇴행을 증가시킬 수 있다. 콘드로이티나제 및/또는 히알루리다제를 가진 제제의 투여는 종양 퇴행의 속도를 또한 증가시킬 수 있다. 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제를 가진 제제의 투여는, 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제 없이 제제의 투여와 비교하여, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 85% 내지 약 90%의 대상체에서 종양 퇴행을 추가로 달성할 수 있다. 종양 퇴행은, 제제 단독의 투여와 비교하여, 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제를 가진 제제 투여된 대상체에서 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%일 수 있다. 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제를 가진 제제 투여된 대상체에서 종양 퇴행은 추가로 약 90% 또는 약 100%일 수 있다.
방법은 콘드로이티나제를 가진 제제 투여된 대상체 투여된 대상체에서 암 또는 종양 성장의 예방을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 예방은 콘드로이티나제를 가진 제제 투여된 대상체가 미래의 암을 극복하게 할 수 있다. 환언하면, 콘드로이티나제를 가진 제제는 콘드로이티나제를 가진 제제 투여된 대상체에 암에 대한 보호를 제공한다. 콘드로이티나제를 가진 제제 투여된 대상체는, 제제 단독의 투여와 비교하여, 암의 약 90% 내지 약 100% 생존을 가질 수 있다. 콘드로이티나제를 가진 제제 투여된 대상체는, 제제 단독의 투여와 비교하여, 암의 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100% 생존을 가질 수 있다.
본 발명은, 하기 비-제한 실시예에 의해 설명된, 다중 양태를 갖는다.
5) 실시예
실시예 1
실시예 2 및 3에 대한 방법
어느 한쪽 연구 INO-16-056 (Balb/c) 또는 INO-16-057 (C57BL/6)에 대하여 총 20 마우스는 5 암컷 마우스 (6-7 주령)의 4 그룹으로 분할되었고, 녹농균에 DNA 플라스미드 인코딩 인간 항체 (DMAb) 반응성인, pGX9214로 면역화되었다.
실험 그룹 2 (참고 표 1)에서 각각의 마우스의 좌측 TA 근육은 pGX9214 전달 30 분 전 30 μl 히알루로니다제 (400 유닛/ml; 소 고환으로부터 정제됨)으로 전처리되었다. 그룹 3의 마우스는 플라비박테리움 헤파리눔으로부터 30 μl 콘드로이티나제 AC로 전처리를 받았고 그룹 4의 마우스는 그것의 좌측 TA 근육에 동일한 농도에서 히알루로니다제 및 콘드로이티나제의 조합을 함유하는 전처리가 주어졌고 이어서 30 분 후 pGX9214 플러스 EP 되었다. 대조군 그룹 (그룹 1)의 마우스는 DNA 전달 및 EP 전 PBS로 주사되었다.
플라스미드 DNA는 효소 전처리를 받았던 부위 (그룹 2, 3 및 4) 또는 비-전처리된 부위 (그룹 1)에서 근육내로 30 μl SSC내 0.1 mg의 농도에서 투여되었고, 전기천공은 주사 직후 수행되었다. 전기천공은 CELLECTRA®-3P (2 mm 전극) 디바이스 (Inovio Pharmaceuticals, Inc.)를 사용하여 주사의 부위에 적용되었다. 파라미터는 하기이었다:
· 펄스의 수 = 2 세트의 2 펄스 (2x2),
· 전류 세기 = 0.1 Amp,
· 최대 전압 = 200V,
· 전기천공 펄스 지속기간 = 52 밀리초,
· 간격 분리 펄스 = 펄스 사이 0.2 초, 및 각각의 세트의 펄스 사이 3 초.
일 0, 3, 7에서 마우스는 채혈되었고 (50 μl) 인간 IgG 카파 (DMAb PseudoV2L2MD)의 수준은 ELISA에 의해 혈청에서 측정되었다.
hIgG에 대한 체액성 반응의 분석을 위하여, hIgG 카파 표준 단백질에 대한 ELISA는 수행되었다.
실시예 2
pMAb 백신 전달에 앞서 근육의 콘드로이티나제 치료 - Balb/c
pGX9214 (Pseudo V2L2MD)로 처리된 Balb/c 마우스의 혈청에서 DNA-인코딩된 단클론성 항체의 발현의 수준은 결정되었다. 소 고환으로부터 유래된 히알루로니다제와 유사한, 플라보박테리움 헤파리눔으로부터 콘드로이티나제 AC로 근육 전달 부위의 전처리는 검출된 hIgG의 전신 혈청 수준을 상당히 향상시킨다.
Figure pat00001
효소의 처리는 DMAb 전달 30 분 전 수행되었다.
Figure pat00002
실시예 3
pDNA 백신 전달에 앞서 근육의 콘드로이티나제 치료 - C57BL/6
Balb/c 마우스와 유사한, 콘드로이티나제 및 pGX9214로 처리된 C57BL/6 마우스는 pGX9214 플러스 PBS만을 받았던 마우스와 비교하여 그것의 혈청에서 DNA-인코딩된 단클론성 항체의 발현의 증가된 수준을 보여준다. hIgG 수준은 DNA 주사 및 EP 전 히알루로니다제로 전처리된 마우스와 비교할만하였고, 따라서 콘드로이티나제로 마우스 TA 근육 전달 부위의 전처리가 hIgG의 전신 혈청 수준을 상당히 향상시킨다는 것을 보여주었다. 참고 도 2.
Figure pat00003
효소의 처리는 DMAb 전달 30 분 전 수행되었다.
Figure pat00004
실시예 2 및 3의 요약 - 이들 연구는, DMAb 플러스 EP의 전달에 앞서, Balb/c 마우스, 뿐만 아니라 C57BL/6 마우스의 TA 근육에 콘드로이티나제의 투여가 혈청에서 hIgG의 발현을 향상시킨다는 것을 입증한다. 도 1은 그룹 1 (214.86 ng/ ml의 평균)에 비교하여 콘드로이티나제 (2904.53 ng/ml의 평균)으로 전처리된 그룹 3에서 피크 시점 (일 7)에 Balb/c 마우스내 hIgG 혈청 발현에서 13.5 배 증가가 있었음을 보여준다. 동일한 처리 (연구 INO-16-057)를 받았던 C57BL/6은 대조군 그룹 1 (618.21 ng/ml의 평균)과 비교하여 콘드로이티나제 (5428.49 ng/ml의 평균)으로 전처리된 그룹 3에서 일 7에 hIgG 혈청 발현에서 8.8 배 증가를 보여주었다. 콘드로이티나제로 전처리된 그룹의 hIgG 혈청 발현 수준은 양쪽 쥣과 균주에서 히알루로니다제로 전처리된 그룹에서 보여진 hIgG 혈청 발현 수준에 비교할만하였다.
근육의 콘드로이티나제 전처리는 마우스 혈청에서 DMAb 발현을 향상시키는데 사용될 수 있다.
실시예 4
실시예 5에 대한 방법
5 동물 각각을 함유하는 암컷 기니 피그의 4 그룹은 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (MERS-coV)에 DNA 플라스미드 인코딩 인간 항체 (DMAb) 반응성인, pGX9207이 투여되었다. DNA 주사 이어서 전기천공은 모든 그룹에서 양쪽 사두근 근육에서 수행되었다.
그룹 3의 기니 피그는 DMAb 전달 90 분 전 각각의 근육에 200 μl 콘드로이티나제 AC (0.5 유닛/ml)로 처리되었다. 대조군 그룹은 PBS (그룹 1) 또는 히알루로니다제 (그룹 2; 400 유닛/ml; 소 고환으로부터 정제됨)로 어느 한쪽 전처리되었다. 콘드로이티나제가 히알루로니다제로 전달시 사두근 근육의 기니피그 세포외 매트릭스 분해에 부가적 효과를 보여주는지를 시험하기 위해, 동물은 그룹 4에서 DMAb 전달 및 EP 90 분 전 양쪽 효소, 히알루로니다제 및 콘드로이티나제로 전처리되었다.
PGX 9207은 효소 전처리를 받았던 부위 (그룹 2, 3 및 4) 또는 비-전처리된 부위 (그룹 1)에서 근육내로 200 μl SSC내 0.45 mg의 농도에서 주사되었고, EP는 주사 직후 수행되었다. 전기천공은 CELLECTRA®-3P (8 mm 전극) 디바이스 (Inovio Pharmaceuticals, Inc.)를 사용하여 주사의 부위에 적용되었다.
파라미터는 하기이었다:
펄스의 수: 2 세트의 2 펄스 (2x2);
전류 세기: 0.2 Amp;
최대 전압: 200V;
전기천공 펄스 지속기간: 52 밀리초;
간격 분리 펄스: 펄스 사이 0.2 초, 및 각각의 세트의 펄스 사이 3 초.
일 0, 3, 7, 10, 14, 17, 및 21에서, 기니 피그는 채혈되었고 (200 μl) 인간 IgG 카파 (DMAb MERS-hIgG)의 수준은 ELISA에 의해 혈청에서 측정되었다.
Figure pat00005
효소의 처리는 DMAb 전달 90 분 전 수행되었다.
Figure pat00006
실시예 5
콘드로이티나제로 처리는 전신 DNA-기반 항체 발현을 향상시킨다
박테리아 플라보박테리움 헤파리눔으로부터 유래된 콘드로이티나제 AC의 작용은 주사 및 전기천공 (EP)에 의한 pGX9207의 투여 후 기니 피그내 hIgG의 전신 혈청 수준을 향상시킨다.
하틀리 기니 피그내 혈청 hIgG 수준의 동력학은 도 3에서 표시된다. 각각의 그룹에서, 피크 발현은 일 7에서 관측된다. DMAb 전달 및 EP 90 분 전 양쪽 사두근 근육에 200 μl내 0.5 유닛/ml 콘드로이티나제 AC로 처리된 하틀리 기니 피그는 대조군 시약 PBS (98.79 ng/ml의 일 7 평균; 참고 도 3)으로 전처리된 기니 피그보다 그것의 혈청 (485.39 ng/ml의 일 7 평균)에서 hIgG의 8.6-배 더 높은 수준을 가졌다. 콘드로이티나제로 전처리는 양성 대조군으로서 사용된 히알루로니다제 (278.41 ng/ml의 일 7 평균)으로 전처리보다 hIgG의 1.74-배 더 높은 수준을 유발시켰다. DMAb 전달 및 EP 90 분 전 양쪽 효소 (849.57 ng/ml의 평균)의 동시 적용은 부가적 효과 (히알루로니다제에 비교하여 3-배 증가 및 콘드로이티나제에 비교하여 1.75-배 증가)를 시사한다.
히알루로니다제 및 콘드로이티나제 효소의 조합에 노출된 동물의 기니 피그 혈청에서 검출된 IgG 농도는 단일 효소로 전처리된 기니 피그에서 수준에 비교된 경우 더 높았다. pGX9207의 예 발현 동력학은 도 4에서 묘사된다.
실시예 6
콘드로이티나제는 마우스 (INO-16-056 및 INO-16-057)에서 플라스미드-인코딩된 단백질 발현을 향상시킨다
어느 한쪽 INO-16-056 (Balb/c) 또는 INO-16-057 (C57BL/6)에 대하여 총 10 마우스는 5 암컷 마우스 (6-7 주령)의 2 그룹으로 분할되었고, 녹농균에 DNA 플라스미드 인코딩 인간 항체 (DMAb) 반응성인, pGX9214 (PseudoV2L2MD (Lot # D150827))의 주사를 받았다.
실험 그룹 2 (표 6)에서 각각의 마우스의 좌측 골격근은 pGX9214 전달 30 분 전 (플라비박테리움 헤파리눔으로부터 정제된; Sigma Aldrich) 30 μl 콘드로이티나제 AC로 전처리되었다. 대조군 그룹 (그룹 1)의 마우스는 DNA 전달 및 EP 전 PBS로 주사되었다.
Figure pat00007
Figure pat00008
플라스미드 DNA는 효소 전처리를 받았던 부위 (그룹 2) 또는 비-전처리된 부위 (그룹 1)에서 근육내로 30 μl SSC내 0.1 mg의 농도에서 투여되었고, 전기천공은 주사 직후 수행되었다. 전기천공은 CELLECTRA®-3P (2 mm 전극) 디바이스 (Inovio Pharmaceuticals, Inc.)를 사용하여 주사의 부위에 적용되었다.
이 보고서에서 모든 실험에 대하여 마우스내 파라미터는 하기이었다:
펄스의 수 = 2 세트의 2 펄스 (2x2),
전류 세기 = 0.1 Amp,
최대 전압 = 200V,
전기천공 펄스 지속기간 = 52 밀리초,
간격 분리 펄스 = 펄스 사이 0.2 초, 및 각각의 세트의 펄스 사이 3 초.
일 0, 3, 7에서 마우스는 채혈되었고 (50 μl) 인간 IgG 카파 (DMAb PseudoV2L2MD)의 수준은 ELISA에 의해 혈청에서 측정되었다.
결과 INO-16-056:
*pGX9214 (PseudoV2L2MD)로 처리된 Balb/c 마우스의 혈청에서 DNA-인코딩된 단클론성 항체의 발현의 수준은 여기에서 보고된다. 플라보박테리움 헤파리눔으로부터 콘드로이티나제 AC로 근육 전달 부위의 전처리는 검출된 hIgG의 전신 혈청 수준을 상당히 향상시킨다 (도 5).
결과 INO-16-057:
Balb/c 마우스에 유사한, 콘드로이티나제 및 pGX9214로 처리된 C57BL/6 마우스는 pGX9214 플러스 PBS만을 받았던 마우스에 비교하여 그것의 혈청에서 DNA-인코딩된 단클론성 항체의 발현의 증가된 수준을 보여준다 (도 6).
연구 INO-16-056 및 INO-16-057에 대한 결론:
이들 연구는 DMAb 플러스 EP의 전달에 앞서 Balb/c 마우스 뿐만 아니라 C57BL/6 마우스의 골격근에 콘드로이티나제의 투여가 혈청에서 hIgG의 발현을 향상시킨다는 것을 입증한다. 도 5는 그룹 1 (214.86 ng/ ml의 평균)에 비교된 콘드로이티나제로 전처리된 그룹 2 (2904.53 ng/ml의 평균)에서 피크 시점 (일 7)에 Balb/c 마우스내 hIgG 혈청 발현에서 13.5 배 증가가 있었다는 것을 보여준다. 동일한 처리를 받았던 C57BL/6 (연구 INO-16-057)은 대조군 그룹 1 (618.21 ng/ml의 평균)에 비교된 콘드로이티나제로 전처리된 그룹 2 (5428.49 ng/ml의 평균)에서 일 7에 hIgG 혈청 발현에서 8.8 배 증가를 보여주었다.
전술의 관점에서, 근육의 콘드로이티나제 전처리는 pDNA 발현을 향상시키는데 사용될 수 있다.
실시예 7
임상 등급 Cho-ABC는 플라스미드-인코딩된 단백질 (INO-16-083B 및 INO-16-097)의 증가된 수준을 유발시킨다
콘드로이티나제의 기본적 전임상 연구를 임상으로 결국 이동시키기 위해, 임상 등급 콘드로이티나제 ABC는 시험되었다. 제조자에 따르면, 이러한 생성물은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 프로테우스 불가리스로부터 정제되고, 낮은 내독소 수준을 갖고 오염물질 예컨대 콘드로설파타제, 프로테아제, 헤파리나제 및 헤파리티나제를 보여주지 않는다. 효소는 Seikagaku로부터 콘드로이티나제 ABC (콘돌리아제)에 유사한 활성을 보여준다. 게다가, 우리는 우리의 검정에 인간 재조합 콘드로이티나제 (R&D 시스템)인, GALNS를 첨가하였다. 리소좀 N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 (GalNAc6S)으로서 또한 공지된, 이러한 효소는 콘드로이틴 설페이트의 N-아세틸-D-갈락토사민 6-설페이트 유닛 및 케라탄 설페이트의 D-갈락토스 6-설페이트 유닛의 6-설페이트 기를 가수분해시킨다. 임상에서, 이러한 효소는 리소좀 축적 장애인, 모르키오 A 증후군 또는 점액다당류증 4A의 치료에 적용된다. 상기 질환은 GalNAc6S의 부족으로 인해 케라탄 설페이트 및 콘드로이틴-6-설페이트의 세포내 축적을 특징으로 한다. 이러한 단백질의 공급원은 N-말단 6-His 태그를 가진, 스포도프테라 프루지페르다, Sf 21 (배큘로바이러스)-유래된 Ala27-His522이다.
목표는 pDNA 발현을 향상시키기 위해 콘드로이티나제 AC (F. 헤파리눔, Sigma Aldrich) 임상 등급 콘드로이티나제 ABC (P. 불가리스, Amsbio) 및 GALNS (인간 재조합 콘드로이티나제, R&D 시스템)의 능력을 결정하는 것이었다. 후속적으로, 콘드로이티나제 ABC의 다양한 용량의 효과는 검사되었다.
INO-16-083B: 콘드로이티나제의 3 상이한 유형의 유효성을 평가하기 위해, Balb/c 마우스는 5 마우스 / 그룹으로 4 그룹으로 분할되었다. 각각의 마우스는 좌측 골격근에 뎅기열 바이러스-특이적 단클론성 항체 hIgG-DVSF-1 (Lot # D160222A)에 대하여 인코딩하는 0.1 mg의 플라스미드 DNA pGX9203의 주사 이어서 전기천공을 받았다. 절차의 파라미터는 연구 1에 대하여 기재된 바와 같이 수행되었다. 마우스는 표 2.1에서 나타낸 바와 같이 DNA 투여 30 분 전 대조군으로서 각각의 효소 또는 PBS로 처리되었다. 혈액 샘플은 일 0, 3 및 7에서 수집되었고 혈청 인간 IgG 람다 수준은 ELISA에 의해 측정되었다.
데이터는, 양쪽 콘드로이티나제 AC 및 콘드로이티나제 ABC 효소가 유전자 발현을 향상시킨다는 것을 시사한다 (도 7). 그러나, 재조합 단백질 GALNS는 그렇지 않다.
INO-16-097: 하기 실험에 대하여 최적의 농도에 관해 결정하기 위해, 임상 등급 콘드로이티나제 ABC의 다양한 용량의 효과는 시험되었다. 상세한 실험적 전략은 표 2.3에서 기재된다. 0.1 U/ml 내지 5 U/ml 범위의 콘드로이티나제 ABC의 4 상이한 용량은 좌측 골격근에 pGX9207의 유전자 전달에 앞서 Balb/c 마우스 (그룹 2-5)에 적용되었고 PBS 대조군 그룹 1에 비교되었다.
증가하는 콘드로이티나제 ABC 농도는 우리의 동물 모델에 대하여 최적의 용량으로서 2.5 U/ml로 이식유전자의 발현을 추가로 향상시켰다 (도 8).
연구 INO-16-083B 및 INO-16-097에 대하여: 동물이 각각의 콘드로이티나제로 전처리된 경우, 임상 등급 효소는 이전의 실험에서 성공적으로 보여졌던 콘드로이티나제 AC로서 유전자 발현의 유사한 증가를 초래하였다. pGX9207의 주사 전 2.5 U/ml의 농도 적용에 의해, 우리는 PBS 대조군 그룹에 비교하여 인간 혈청 IgG 수준에서 4-배 증가를 알아내었다. 이러한 관찰은 콘드로이티나제 ABC가 플라스미드-인코딩된 단백질 수준의 상당한 상승을 유발시킨다는 것을 확인하였고 추가 시험에 대하여 탁월한 개시점을 제공하였다.
Figure pat00009
프로토콜 INO-16-083B. *콘드로이티나제 AC (F. 헤파리눔); Sigma Aldrich; 카탈로그 # C2780; 0.5U/ml; **콘드로이티나제 ABC (P. 불가리스); Amsbio, 카탈로그 # AMS.E1028-10; 0.5U/ml, 재조합 인간 GALNS 단백질, R&D 시스템, 카탈로그 #8269-SU-050; 20μg/ml. 효소 처리는 pDNA 전달 30분 전 수행되었다; 마우스 균주: Balb/c.
Figure pat00010
프로토콜 INO-16-097 콘드로이티나제 ABC (P. 불가리스); Amsbio, 카탈로그 # AMS.E1028-10; 효소 처리는 pDNA 전달 30분 전 수행되었다; 마우스 균주: Balb/c. pGX9207 (MERS IgG) - Lot # 63682.
실시예 8
Cho-ABC 투여는 향상된 단백질 발현 (INO-16-188)을 초래한다
이전의 실험은 임상 등급 콘드로이티나제 ABC가 마우스에서 플라스미드-의존적 유전자 발현 향상에 적용가능하다는 것을 나타냈다. 이러한 발견을 추가로 확인하기 위해, 다음 단계는 콘드로이티나제-처리된 골격 마우스 근육에서 이러한 향상된 유전자 발현의 시각적 이미지를 제공하는 것이었다. 따라서, 리포터 유전자 및 형광에 기반하여 측정된 단백질 발현.
리포터 유전자 발현 효소 (2.5 U/ ml; 30 분 표준 전처리)의 정량화를 위하여, PBS (대조군) 및 pDNA (; pGX9902, 50 μg 용량 / 다리)는 전기천공에 의해 좌측 및 우측 쥣과 골격근에 전달되었다 (표 10). 72 시간 후 쥣과 뒷다리는 해부되었고 피부는 제거되었다. 처리된 마우스 근육에서 형광 강도는 형광 이미지형성 시스템 (ProteinSimple)에 의해 측정되었고 AlphaView SA에 의해 정량화되었다.
데이터는 콘드로이티나제 ABC로 처리시 (30 분) 마우스 근육에서 리포터 유전자 발현이 향상되었다는 것을 드러낸다 (도 9).
처리의 72 시간 후 단백질의 가시화에 의해 콘드로이티나제가 유전자 발현을 상당히 향상시켰다는 것을 보여주는 입증은 생성되었다. 우리는 우리의 대조군 그룹에 비교하여 리포터 pDNA로 처리 전 효소 적용에 의해 6.7-배 개선을 달성하였다. 전임상 마우스 실험의 이러한 발견은 콘드로이티나제 ABC가 DNA-기반 면역요법을 잠재적으로 진전시킬 수 있다는 것을 추가로 확신시켰다.
Figure pat00011
프로토콜 INO-16-188. 마우스는 pDNA (pGX9902) 주사 30 분 전 좌측 및 우측에서 골격근에 콘드로이티나제 ABC (2.5 U/ ml) 또는 PBS (대조군)으로 전처리되었다. 마우스 균주: Balb/c.
실시예 9
콘드로이티나제 ABC 처리된 근육 (INO-16-195)의 조직학적 분석
콘드로이티나제 ABC가 쥣과 근육 조직에서 형태적 변화를 유발시키는지를 시험하기 위해, 주사의 부위에서 처리된 뒷다리의 조직병리는 검사되었다.
마우스의 4 그룹은 뒷다리의 그것의 좌측 및 우측 골격근에 콘드로이티나제로 (그룹 2 및 그룹 3) 또는 PBS로 (그룹 1 및 그룹 4) 어느 한쪽 처리를 받았다 (표 11). 플라스미드 DNA (pGX9207 - MERS IgG (Lot# 163682))는 그룹 1 및 2에 속하는 마우스의 근육에 전기천공에 의해 전달되었다. 72 시간 후 쥣과 뒷다리는 해부되었고 골격근은 Haemotoxylin and Eosin (H&E) 염색을 위하여 단리되었다. 슬라이드의 H&E 염색 뿐만 아니라 스캐닝은 계약 연구 조직화 (Reveal Biosciences)에 의해 수행되었다. 전체의 근육의 이미지 수득 후, 근육 조직병리의 대표적인 예는 소프트웨어 CaseViewer를 사용함으로써 선택되었다.
실험적 동물은 그것의 거동에서 변화의 임의의 징후를 보여주지 못했고 실험적 처리 절차 동안 및 후 건강해 보였다. 분석 완료 후, 자발적인 염증의 입증은 관측되지 않았고 조직 손상 또는 다른 분명한 조직학적 변화는 마우스 근육이 PBS 대조군에 비교된 콘드로이티나제만으로 처리된 경우 관측될 수 없었다 (도 10). pDNA가 양쪽에서 침윤 면역 세포 전기천공에 의해 추가로 전달된 경우, 콘드로이티나제 및 PBS 전처리된 마우스는 관측되었다.
이들 데이터는, 효소가 아닌, 전기천공이 조직 형태에서 가역적으로 변화를 야기시키는 것을 보여주어, 효소의 투여가 심각한 유해 사례 (SAE)가 매개되지 않는다는 것을 나타낸다.
콘드로이티나제 플러스 pDNA/EP 그룹에서 침윤 세포의 약간 더 많은 수가 더 높은 pDNA 형질감염 효율로 인해 될 것 같다.
Figure pat00012
실시예 10
Cho-ABC는 뉴질랜드 래빗 (INO-16-157)에서 플라스미드-인코딩된 단백질 발현을 향상시킨다
DNA-기반 면역요법에서 콘드로이티나제의 효과를 추가로 연구하기 위해, 조사는 콘드로이티나제 ABC로 근육내 전처리가 래빗에서 단백질 발현 향상에 강력하였는지에 대해 수행되었다.
2 mg의 pGX9207 (MERS IgG (Lot# 63682))는 12 뉴질랜드 래빗 (그룹 1 및 그룹 2, 동물 연령: 9 주, 표 12)에 투여되었다. 전기천공은 CELLECTRA®-디바이스를 사용하여 골격근에서 주사의 부위에 적용되었다.
래빗내 파라미터는 이 보고서에서 모든 실험에 대한 것이었다:
· 펄스의 수 = 3 펄스
· 전류 세기 = 0.5 Amp,
· 전기천공 펄스 지속기간 = 52 밀리초,
· 간격 분리 펄스 = 펄스 사이 1 초
그룹 2의 동물은 pDNA 전달과 동일한 부위에 콘드로이티나제로 전처리되었고 그룹 1의 동물은 PBS 대조군으로서 기능되었다. 채혈은 일 0, 3, 5 및 6에서 수행되었다. 인간 IgG 수준은 ELISA에 의해 측정되었다.
데이터는 근육이 PBS 처리에 비교하여 효소로 전처리된 그룹에서 hIgG 혈청 수준의 유의미한 향상을 실증하였다.
매트릭스-분해 효소 주사에 의해 래빗에서 DNA-기반 유전자 발현의 상당한 개선 (대조군에 비교하여 4.9-배)는 마우스 데이터와 일치하고 플라스미드 DNA-기반 유전자 요법에서 콘드로이티나제 ABC의 사용의 효력을 추가로 통합시킨다.
Figure pat00013
실시예 11
마우스 (INO-16-99B, INO-16-201, INO-16-188)내 pDNA 와 Cho ABC의 공-제형화
이전의 실험은 콘드로이티나제의 정확한 전처리 타이밍이 최적의 유전자 발현에 비필수적임을 보여주었다. 우리가 이들을 pDNA 전달 및 EP 5 분, 15 분, 30 분, 2 시간, 24 시간 또는 48 시간 전 전처리하였던 경우 마우스에서 유의차는 보여지지 않았다. 이것은 유전자 발현의 부정적으로 영향화 없이 pDNA와 콘드로이티나제 ABC를 공-제형화하는 것이 가능한지 여부의 질문을 제기하였다.
이러한 목적을 위하여 14 마우스는 단 하나의 주사에서 효소 (2.5 U/ ml) 및 pDNA (pGX9702, MERS IgG (Lot #s: 63682 및 72883))으로 처리되었다 (그룹 3). EP는 콘드로이티나제의 필요한 반응 시간으로 인해 주사 1 분 후 수행되었다. 2 대조군 그룹은 이 실험에 포함되었다: 그룹 1의 마우스는 PBS로 전처리되었고 그룹의 마우스는 효소의 주사를 받았다 (그룹 2). 전기천공에 의한 pDNA의 전달은 30 분 후 양쪽 그룹에서 수행되었다.
이 보고서에서 모든 공-제형화 실험에 대하여 마우스내 파라미터는 하기이었다:
· 펄스의 수 = 2 세트의 2 펄스 (2x2),
· 전류 세기 = 0.1 Amp,
· 최대 전압 = 200V,
· 전기천공 펄스 지속기간 = 52 밀리초,
· 간격 분리 펄스 = 펄스 사이 0.2 초, 및 각각의 세트의 펄스 사이 3 초.
일 0, 3, 6에서 마우스는 채혈되었고 (50 μl) 인간 IgG 카파 (DMAb PseudoV2L2MD)의 수준은 ELISA에 의해 혈청에서 측정되었다.
공-제형화된 약물을 받았던 동물은 PBS 대조군 그룹 (그룹 1)에 비교하여 그것의 혈청에서 hIgG의 높은 유의미한 증가를 보여주었다. 현저히, 표준 절차를 거친 동물 (30 분 전처리; 그룹 2)와 신규한 유전자 전달 절차를 받았던 동물 (그룹 3) 사이 단백질 생산에서 유의차는 없었다.
결과는 pDNA와 콘드로이티나제의 공-제형화가 실행가능하다는 것을 보여준다. 단일 주사 (효소/ pDNA)를 받았던 동물내 유전자 발현은 PBS 대조군 그룹에서 발현 수준보다 5.6-배 더 높았다. 향상된 단백질 발현 수준은 최초 조직 전처리 절차와 동등하였다. 공-제형화 기술 및 방법은 덜 복잡할 수 있고, 덜 기술적으로 도전적일 수 있고 시간-절감형일 수 있다.
Figure pat00014
실시예 12
pDNA와 콘드로이티나제의 공-제형화는 향상된 형광성 단백질 발현 (INO-16-188)을 초래한다
다음 후속적인 단계는 형광 리포터 플라스미드로 관찰을 인증하는 것이었다.
리포터 유전자 발현을 시각화하기 위해, 콘드로이티나제 (2.5 U/ml), PBS (대조군) 및 pDNA (pGX9902)는 전기천공에 의해 좌측 및 우측 쥣과 골격근에 단일 주사로서 전달되었다 (표 14). 뒷다리의 절개는 처리 72 시간 후 수행되었다. 처리된 마우스 근육에서 형광 강도는 이미저 (FluorChem M 시스템, ProteinSimple)에 의해 측정되었고 AlphaView SA에 의해 정량화되었다.
이전의 데이터와 일관되게, 콘드로이티나제 ABC 및 pDNA의 공제형화는 PBS 대조군에 비교하여 향상된 유전자 발현을 유발시킨다. 유전자 발현에서 유의차는 그룹 3 (공제형화)와 그룹 2 (30 분 표준 전처리) 사이 보여질 수 없다.
리포터 플라스미드 사용에 의해 유전자 발현의 가시화는 단일 주사에서 효소 및 pDNA의 공제형화가 마우스 모델에서 유익하다는 것을 확인한다.
Figure pat00015
프로토콜 INO-16-188. 그룹 3의 마우스는 EP 1 분 전 좌측 및 우측에서 골격근에 콘드로이티나제 ABC (2.5 U/ml) 및 pDNA (pGX9902)의 단일 주사를 받았다. 대조군 그룹의 마우스는 표준 프로토콜 후 처리되었다: 이들 어느 한쪽은 pDNA 전달 및 EP 30 분 전 콘드로이티나제 또는 PBS로 전처리되었다. 마우스 균주: Balb/c. CoF = 공제형화.
실시예 13
래빗 (INO-16-180)에서 pDNA와 Cho ABC의 공-제형화
큰 근육의 유전자 발현에서 공제형화된 콘드로이티나제 ABC/ pDNA의 효과를 평가하기 위해, 실험은 래빗 골격근에서 수행되었다. 또한, 전기천공의 지연이 이러한 모델에서 유리한지 여부는 시험되었다. 마지막으로, pDNA로 효소의 1 시간 인큐베이션이 생체내 유전자 발현에서 영향을 갖는지 여부는 연구되었다.
이 목적을 위하여 래빗 (뉴질랜드 래빗, 6 동물 / 그룹, 12 주령)의 3 그룹은 좌측 골격근에 효소/ pDNA (pGX9207) 공제형으로 주사되었다 (2 주사; 표 15). EP는 그룹 3에서 효소/ pDNA 전달 후 즉시 수행되었다. 그룹 4 및 5에서 전기천공은 지연되었고 효소/ pDNA 투여 1 분 후 수행되었다. 그룹 5의 동물은 처리에 1 시간 앞서 얼음에서 인큐베이션된 콘드로이티나제 및 pDNA의 혼합물을 받았다. 그룹 1의 동물은 PBS 대조군으로서 기능하였고 그룹 2의 동물은 우리의 30 분 표준 프로토콜에 따라 전처리되었다. 전기천공은 CELLECTRA®-디바이스를 사용하여 골격근에서 주사의 부위에 적용되었다. 채혈은 일 0, 4 및 5에서 수행되었다. 인간 IgG 수준은 ELISA에 의해 측정되었다.
래빗 혈청에서 인간 IgG 수준 측정에 의해, 단백질 생산은 대조군에 비교하여 공제형으로 투여된 래빗에서 상당히 증가되었다 (도 14). 게다가, 1 분 EP 지연은 향상된 인간 IgG 혈청 수준과 관련되었고, 전달 수 분 전 공제형화와 전달 1 시간 전 공제형화시 동등한 발현은 보여졌다.
결과는 유전자 발현을 향상시키기 위해 pDNA와 콘드로이티나제를 공-제형화하는 능력을 입증한다. 1 분의 EP 지연 첨가에 의해 이러한 신규한 프로토콜의 추가 진전은 대조군에 비교하여 발현의 6.41-배 증가를 유발시켰다. 1 시간 동안 효소/ pDNA 공제형의 인큐베이션 후, 제형화 후 즉각적인 주사에 비교하여 동등한 유전자 발현 수준은 달성되었다.
효소 및 pDNA 공제형화는 이러한 전임상 연구에서 단백질 생산을 개선하였다.
Figure pat00016
실시예 14
pDNA와 Cho ABC의 공-제형화 - 시험관내 pDNA 안정성 시험 (INO-16-252A)
한번에 콘드로이티나제 및 pDNA 조합의 가능성을 추가로 시험하기 위해, 상이한 조건 하에서 공제형화시 pDNA 안정성은 평가되었다. 안정성 시험의 목적은 생성물의 품질이 환경 인자, 예컨대 온도의 영향 하에서 경시적으로 가변하는 방법에에 관한 입증을 제공하는 것, 그리고 미래의 약물 생성물 및 권고된 보관 조건에 대하여 유통 기한을 확립하는 것이다.
콘드로이티나제로 인큐베이션된 경우 pDNA의 안정성 및 품질을 시험하기 위해, pDNA의 분자량 및 형태는 아가로스 겔 전기영동에 의해 검사되었다. 7 샘플은 pDNA (pGX9207, 250 ng)를 콘드로이티나제 ABC (2.5 U/ ml, 표 9.1)와 함유하였다. 7 추가 샘플은 대조군으로서 기능하였고 pDNA 및 PBS로 구성되었다. 그룹 1-2의 샘플은 제형화 후 겔 전기영동 (TAE, 1 % 아가로스, EmbiTec)에 의해 시험되었고, 그룹 3-4는 10 분 동안 실온 (RT, 21℃로서 정의됨)에서 인큐베이션되었다. RT에서 인큐베이션은 PCR 사이클에서 수행되었다. 추가 인큐베이션은 하기와 같이 수행되었다: 5-6: 6℃, 120 분, 7-8: RT, 120 분, 9-10: 6℃, 24 시간, 11-12: RT, 24 시간, 및 13-14: 6℃, 10 분. 겔 전기영동 후 겔은 Gene Sys 소프트웨어 (결합 없음, EDR, 120 ms 노출)에 의해 분석되었다.
작제물 pGX9207은 초나선 형태 그리고 5171 bp의 분자량을 갖는다. 최초 중량을 가진 최초 형태에서 모든 DNA 샘플 (효소-함유 및 대조군 샘플). 차이는 밴드와 샘플 사이, 각각 보여질 수 없었다 (도 15).
모든 샘플용 밴드가 최초 분자량을 가진 초나선 DNA를 나타냄에 따라 이러한 초기 pDNA 안정성 접근법은 콘드로이티나제가 플라스미드 구조 및 약물 품질 각각에서 영향이 없다는 것을 나타낸다.
Figure pat00017
실시예 15
pDNA와 Cho ABC의 공-제형 - 생체내 pDNA 안정성 연구 (INO-16-237)
pDNA와 콘드로이티나제 공제형화가 생체내 전달에 최대 24 시간 앞서 제조될 수 있는지 여부는 조사되었다. 따라서, 전달이 마우스에서 유전자 발현에서 가졌던 10, 120 분 또는 24 시간 전 제조된 공-제형의 효과는 시험되었다.
효소 (2.5 U/ ml) 및 pDNA (pGX9207, 0.1 mg)의 공제형은 약물 주사 (근육내) 및 전기천공 (1 분 지연된, 표 10.1) 10 분, 120 분, 및 24 시간 앞서 제조되었다. 대조군으로서 마우스의 2 그룹은 어느 한쪽 콘드로이티나제 (그룹 2) 또는 PBS (그룹 1) 30 분 전처리를 받았다. 혈액은 일 0, 3, 6에서 수집되었고 혈청 hIgG 수준은 ELISA에 의해 결정되었다.
마우스에서 유전자 발현의 쇠퇴는 효소/ pDNA 공제형이 24 시간 동안 저장된 경우 발생하지 않았다.
이러한 데이터는 양쪽, 콘드로이티나제 ABC 및 pDNA를 함유하는 우리의 시약이 적어도 24 시간 동안 저장될 수 있다는 것을 입증한다. 참고 도 16.
Figure pat00018
실시예 16
실시예 17 및 18에 대한 방법
전신 단클론성 항체 발현에서 히알루로니다제 처리
9 기니 피그는 3 암컷 하틀리 기니 피그 (6 주령)의 2 그룹으로 분할되었고, 뎅기열 바이러스에 DNA 플라스미드 인코딩 인간 항체 ((DMAb) 반응성인, pGX9203으로 면역화되었고, 한편 대조군 그룹은 PBS만을 받았다.
실험 그룹 I (참고 아래 표)의 다리 근육은 pGX9203 전달 3 시간 전 6 별개의 부위에서 0.2 ml 히알루로니다제 ((0.4 유나이트/ml) 소 고환으로부터 정제됨)으로 전처리되었다. pGX 9203 전달은 히알루로니다제 전처리를 받았던 부위 (그룹 1) 또는 비-전처리된 부위 (그룹 2)에서 근육내로 200 μl SSC내 0.33 mg의 플라스미드의 주사에 의해 수행되었고, 전기천공은 주사 직후 수행되었다. 전기천공은 CELLECTRA®-3P (5 mm 전극) 디바이스 (Inovio Pharmaceuticals, Inc.)를 사용하여 주사의 부위화된에 적용되었다. 파라미터는 하기이었다:
· 펄스의 수 = 2 세트의 2 펄스 (2x2),
· 전류 세기 = 0.1 Amp,
· 최대 전압 = 200V,
· 전기천공 펄스 지속기간 = 52 밀리초, 및
· 간격 분리 펄스 = 펄스 사이 0.2 초, 및 각각의 세트의 펄스 사이 3 초.
일 0, 7, 10, 14, 17, 21, 및 24에서, 기니 피그는 채혈되었고 (250 μl) 인간 IgG 람다 (DMAb DVSF-1)의 수준은 ELISA에 의해 혈청에서 측정되었다.
hIgG에 대한 체액성 반응의 분석을 위하여, hIgG 카파 표준 단백질에 대한 ELISA는 수행되었다.
Figure pat00019
Figure pat00020
pGX9203 (pDVSF-1)로 처리된 기니 피그의 혈청에서 DNA-인코딩된 단클론성 항체의 발현의 수준은 보고된다. 히알루로니다제로 근육 전달 부위의 전처리는 검출된 hIgG의 전신 혈청 수준을 상당히 향상시킨다. 참고 도 17 및 18. dNAb 플러스 EP 면역화 레지멘에 기니 피그의 다리 근육의 히알루로니다제 (HYA) 전처리의 첨가는 혈청에서 hIgG의 발현을 향상시킨다. 도 17은 그룹 2 (92 ng/ml의 평균)에 비교하여 HYA로 전처리된 그룹 1 (1.700 ng/ml의 평균)에서 피크 시점 (일 14)에 hIgG 혈청 발현에서 18 배 증가가 있었다는 것을 보여준다. hIgG 람다에 대해 상승된 숙주 체액성 반응은 일 28에서 검출된 양쪽 그룹 1 (16.66 결합 역가) 및 2 (216.66 결합 역가에서 최소이었다. 근육의 히알루로니다제 전처리는 혈청에서 DMAb 발현을 향상시키는데 이용될 수 있다.
실시예 17
pDNA 백신 전달에 앞서 근육의 히알루로니다제 처리
4 암컷 하틀리 기니 피그 (10 주령)의 2 그룹은, DNA 플라스미드 인코딩 인플루엔자 NP PR8인, pGX2013으로 면역화되었고, 한편 대조군 그룹은 PBS만을 받았다. 실험 그룹 1 (참고 표 3 아래)의 좌측 TA 근육은 백신 전달 약 2 시간 전 대략 0.2 ml 히알루로니다제 ((약 0.4 유닛/ml) 소 고환으로부터 정제됨)으로 전처리되었다. 면역화는 일 1 및 15에서 수행되었다. 백신 전달은 TA에서 근육내로 대략 200 μl SSC내 플라스미드의 약 20 μg의 주사에 의해 수행되었고, 전기천공은 주사 직후 수행되었다. 전기천공은 CELLECTRA®-3P (5 mm 전극) 디바이스 (Inovio Pharmaceuticals, Inc.)를 사용하여 주사의 부위에 적용되었다. 파라미터는 하기이었다:
- 펄스의 수 = 2 세트의 2 펄스 (2x2),
- 전류 세기 = 0.1 Amp,
- 최대 전압 = 200 V,
- 전기천공 펄스 지속기간 = 52 밀리초, 및
- 간격 분리 펄스 = 펄스 사이 0.2 초, 및 각각의 세트의 펄스 사이 3 초.
제1 면역화 14 일 후 그리고 제2 면역화 7 일 후 기니 피그는 채혈되었고 (약 3 mls), 항원 특이적 세포성 반응은, 인플루엔자 NP PR8 항원에 걸치는 중첩 펩타이드를 사용하였던, IFNγ ELISpot에 의해 수확된 PBMC 모집단에서 측정되었다. 검정은 변형된 ELISpot 프로토콜에 따라 수행되었다.
간단히, 사용된 ELISpot 프로토콜은 아래와 같다: 3 mls의 주변 혈액은 인출되었고 얼음에서 EDTA+ (라벤다 캡) 튜브에 즉시 전달되었다. 혈액은 평형 염액으로 1:1 희석되었다. 혈액은 15 ml 튜브에서 4.5 ml 피콜 밀도 구배로 느리게 층상화되었다. 세포는 2000 rpm, 30 분, 실온에서, 쉼 없이 회전되었다. 버피 코트는 수확되었고 R10에서 15 mls로 희석되었다. 세포는 그 다음 4 ℃에서 5 분 동안 1500 rpm으로 원심분리를 통해 펠릿화되었다. 세포는 2회 세정되었고 또 다른 70 μm 스크린을 거쳐 통과되었고, 카운트되었고 10% (v/v) FBS 및 2×항생제-항진균제를 가진 RPMI 배지내 1 × 106 생존가능한 세포 / mL로 희석되었다. 생존력은 트리판 블루 염색에 의해 결정되었다. 2 × 96-웰 밀리포어 IP 플레이트 (밀리포어, Billerica, MA)의 웰들은 4 ℃에서 24 시간 동안 100 μl 1차 항-IFN-γ 항체 용액 (PBS내 5 μg/ml, pH 7.4, X-D11 (1.78 mg/ml에서 스톡)으로 코팅되었다. 비-특이적 결합은 실온에서 2 시간 200 μl의 차단 완충액으로 차단되었다. 차단 및 세정 후, 100 μl의 RPMI내 1 × 105 비장세포는 50 μl 자극제와 3중으로 혼합되었다. 18 시간 동안 37 ℃에 가습된 5% CO2에서 인큐베이션 후, 세포는 세정에 의해 제거되었고 차단 완충액내 100 μl의 바이오티닐화된 2차 항-IFN-γ 항체 (2 μg/ml, N-G3)은 각 웰에 첨가되었다. 2 시간 인큐베이션 및 세정 이후, 알칼리성 포스파타제-접합된 스트렙타비딘 (SEL002, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)은 차단 완충액에서 1:100 희석되었고 웰들은 실온에서 1 시간 동안 100 μl로 인큐베이션되었다. 세정 이후, 웰들은 100 μl의 BCIP/NBT 검출 시약 (SEL002, R & D Systems)으로 실온에서 20 분 동안 인큐베이션되었다. 사용된 NP 펩타이드 풀은, 대략 40 15-량체의 풀로 분할된, 인플루엔자 뉴클레오캡시드 단백질 (인플루엔자 A 바이러스 (A/Puerto Rico/8.34(H1N1))이다. 각각의 NP 펩타이드 풀 (1-3)은 기니 피그 R10내 66, 2 ml에서 30 ul로 1 희석되었다. 스팟-형성 단위 (SFU's)는 카운트되었고 ImmunoSpot Analyzers (Cellular Technology Ltd. (Shaker Heights, OH 소재))에 의해 분석되었다.
각각의 개별 기니 피그에 대하여 SFU's / 백만 비장세포 및 마우스의 각각의 그룹의 평균 +/- SEM은 계산되었다. 한 쌍의 면역화된 그룹 사이 통계 차이는 특이적 P-값을 생성하였던 2-테일드 페어링되지 않은 t 시험을 사용하여 평가되었다. P-값 <0.05는 통계적으로 상이하고, 따라서 유의미한 것으로 간주되었다.
체액성 반응의 분석을 위하여 혈장 분획은 전체의 혈액 제제로부터 수집되었다. 인플루엔자 NP 항원에 대한 ELISA는 수행되었고 결합 역가는 결정되었다.
Figure pat00021
Figure pat00022
도 19는, 제1 면역화 (프라임) 14 일 후 또는 제2 면역화 (부스트) 7 일 후 ELISpot 분석에 의해 검출된 바와 같이, 인플루엔자 NP PR8 항원의 길이에 걸쳐 중첩하는 펩타이드 풀로 자극 후 PBMCs에서 IFN-γ 반응을 보여준다. 인플루엔자 NP (IMR-274) 항원에 대한 혈장 IgG 결합 역가는 ELISA에 의해 결정되었고 도 20에서 보여진다.
이 실시예는 pDNA 플러스 EP 면역화 레지멘에 TA 근육의 히알루로니다제 (HYA) 전처리의 첨가가 유발된 숙주 면역 반응을 향상시킨다는 것을 입증한다. 도 19는 전처리되지 않은 pNP 백신 그룹 (약 258 SFU/백만)에 비교하여 HYA로 전처리된 pNP 백신 그룹 (약 922 SFU/백만)에서 IFN-γ 스팟 / 백만에서 약 3.5-배 증가가 있었고; 이들 반응이 프라임 면역화 14 일 후 측정되었다는 것을 보여준다. 이러한 증가는 부스트 7 일 후 대략 3-배 (약 3012 대 약 1032 SFU/백만)이었다. 도 20은 체액성 반응이 HYA로 전처리되지 않은 pNP 백신 그룹에 비교하여 pNP 백신 HYA 전처리된 그룹에서 또한 증가되었다는 것을 입증한다.
실시예 18
녹농균 을 표적하는 단일특이적 및 이중특이적 단클론성 항체의 DNA-전달은 치명적인 폐렴으로부터 마우스를 보호한다
기회감염성 박테리아성 병원체 녹농균은 종종 다중-약물 저항성이고 열악한 임상 결과와 관련된다. 성장하는 약물 저항 및 개발 중인 신규한 기전 항생제의 부족은 병원체-특이적 단클론성 항체 (mAbs)를 포함하는 대안적인 항미생물 전략을 요구한다. 전임상 감염 모델에서 강력한 개별 및 상승작용 조합된 보호성 활성을 각각 부여하는, 녹농균 유형 III 분비 단백질 PcrV (V2L2-MD) 및 Psl 세포외다당류 (EPS)를 표적하는 MAbs는 이중특이적 임상 후보 항체 1-1의 성분이다. 그와 같은 mAbs의 DNA 전달은 임상 적용에서 상당한 이점을 가질 수 있다. 이들 mAb DNA 서열의 용도는, 생체내 전장 인간 IgG1의 양쪽 항체 중쇄 및 경쇄 발현을 위하여 조작된, 전기천공을 통해 플라스미드 DNA 전달 (DMAb)에 의해 대안적인 mAb 전달 전략의 실행성을 결정하기 위해 탐구되었다.
근육내 주사 (IM) 부위는 양쪽 전경골근 및 우측 이두근 근육으로 구성되었다. 주사는 근육조직에 나란히 투여되었다. 전기천공에 1 시간 앞서, 히알루로니다제는, 30μL / 부위내 8U에서, IM 주사에 의해 전달되었다. 30μL의 각각의 DMAb내 100 μg은 히알루로니다제로 이전에 주사된 모두 3 정확한 부위에 IM 주사에 의해 전달되었고, 그 다음 즉시 전기천공되었다. 마우스는 전기천공 절차 5 일 후 녹농균으로 비강내로 공격받았다. DMAb 생체내 IgG 발현 수준은 감염에 앞서 평가되었다.
항-PcrV 단일특이적 V2L2-MD 및 이중특이적 항체 1-1 중쇄 및 경쇄 서열은 플라스미드 pGX001에 클로닝되어, DMAb-V2L2-MD 및 DMAb-항체 1-2를 초래하였다. 각각의 후보는 BALB/c 마우스에서 근육내 주사 이어서 전기천공 (IM-EP) 전 HEK293T 세포내 발현에 대하여 확인되었다. 생체내 항체 발현은 발현된 mAbs의 기능적 활성 (항-PcrV 항-세포독성 활성)이 그랬듯이 IM-EP 최대 7 일 이후 모니터링되었다. DMAb-V2L2MD 및 DMAb-항체 1-2는 녹농균 급성 폐렴 모델에서 또한 평가되었다.
IM-EP 이후 일 7에서 양쪽 DMAb-V2L2-MD 및 DMAb-항체 1-2 처리된 동물로부터 혈청 항체 농도는 측정된 생체외 항-세포독성 활성과 상관관계가 있어서, 양쪽 V2L2-MD 및 항체 1-1이 발현되었고 기능적이었음을 나타냈다. 또한, 급성 쥣과 녹농균 폐 감염 모델에서, 양쪽 DMAb-V2L2MD 및 DMAb-항체 1-2는 대조군 IgG DMAb에 비교하여 상당한 생체내 보호성 활성을 나타냈다 (90% 및 100% 생존 대 0%, 각각; P<0.0001).
DMAb-V2L2-MD 및 DMAb-항체 1-2는 쥣과 폐 감염 모델에서 치사를 예방하기 위해 생체내 보여진다. 또한, 우리의 결과는 전장 IgG mAbs의 DNA 전달이 심각한 박테리아성 감염 예방용, 그리고 가능하게는 적응할 수 있게 고도로 강력한 mAbs가 확인되었고 특성규명된 다른 감염성 제제에 대한 예방용 실행가능한 플랫폼 전략일 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 19
백신 제형에서 히알루로니다제의 편입과 관련된 용량 절약 효과
히알루로니다제와 pDNA 백신의 공-제형화가 유발된 숙주 면역 반응에서 용량 절약 효과를 갖는지 여부를 결정하기 위해, BALB/c 마우스의 총 12 그룹 (6 / 그룹)은 pGX2013 (인플루엔자 핵단백질 (NP)에 대하여 인코딩하는 pDNA)의 10과 0.125 ug 사이 용량으로 처리되었다. 그룹 1-6은 히알루로니다제 (200U/ml)로 공-제형화된 pGX2013을 받았고, 그룹 7-12는 SSC 완충액만으로 받았다. 그룹 13은 SSC 만을 받았다 (무 백신). 세부사항은 표 1에서 제시된다. 면역화는 일 0에서 수행되었다. 백신 전달은 근육내로 (TA 다리 근육) 30 μl 제형의 주사에 의해 수행되었고, 전기천공은 HYA 없는 및 HYA 있는 그룹, 각각에서 주사 직후 또는 60 초 후 수행되었다. 전기천공은 CELLECTRA®-3P (3 mm 전극) 디바이스 (Inovio Pharmaceuticals, Inc.)를 사용하여 주사의 부위에 적용되었다. 파라미터는 하기이었다:
펄스의 수 = 2 세트의 2 펄스 (2x2),
전류 세기 = 0.1 Amp,
최대 전압 = 200V,
전기천공 펄스 지속기간 = 52 밀리초,
간격 분리 펄스 = 펄스 사이 0.2 초, 및 각각의 세트의 펄스 사이 3 초.
일 7 및 14에서 마우스는 채혈되었고 혈청은 수확되었다. 체액성 반응은 A/PR8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스 핵단백질 재조합 항원에 대해 ELISA를 사용하여 검출되었다. 종점 결합 역가는 플롯팅되었다.
일 14에서 마우스는 희생되었고 비장은 수확되었다. A/PR8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스 핵단백질 H2d-제한된 에피토프 NP55-69 (부류 II) 및 NP147-155 (부류 I)에 항원 특이적 세포성 반응은 IFNγ ELISpot에 의해 측정되었다. 스팟-형성 단위 (SFU's)는 카운트되었고 ImmunoSpot Analyzers (Cellular Technology Ltd. in Shaker Heights, OH)에 의해 분석되었다. 각각의 개별 마우스에 대하여 SFU's / 백만 비장세포 및 마우스의 각각의 그룹의 평균 +/- SEM은 계산되었고 그래프화되었다. 한 쌍의 면역화된 그룹 사이 통계 차이는 특이적 P-값을 생성하였던 2-테일드 미페어링된 t 시험을 사용하여 평가되었다. P-값 <0.05는 통계적으로 상이하고, 따라서 유의미한 것으로 간주되었다.
Figure pat00023
Figure pat00024
비장세포 모집단에서 ELISpot IFN-γ 반응은 PR8 핵단백질 NP55 (CD4+ T 세포) 및 NP147 (CD8+ T 세포) 펩타이드 에피토프로 자극 후 열거되었다 (도 27). PR8 핵단백질 재조합 항원에 대한 혈청 IgG 결합 역가는 ELISA에 의해 결정되었다 (도 28).
히알루로니다제와 pDNA 백신의 공-제형화에 의해 BALB/c 마우스에서 유발된 숙주 면역 반응에서 부가적 효과는 보여진다. 이러한 전달 전략의 용량 절약 효과는 여기에서 실증된다. BALB/c 마우스의 그룹은 히알루로니다제와 함께 또는 상기 없이 전달된 0.125 내지 10 μg pNP 백신으로 면역화되었다. 도 27은 0.5 μg 초과 pNP 용량으로 면역화된 그룹에서 동등한 세포성 면역 반응을 보여주지만, 더 낮은 용량에서 0.25 및 0.125 ug 용량으로 NP147에 CD8+ T 세포 반응에서 그리고 히알루로니다제 없이 면역화된 그룹에서 0.125 ug로 NP55에 CD4+ T 세포 반응에서 상당한 감소가 있었다. 히알루로니다제 공-제형화의 용량 절약 효과는 일 14에서 pNP 백신에 체액성 반응에 대하여 또한 관측되었다 (도 28). 게다가 면역화 후 일 7에서 우리는, 히알루로니다제 없는 마우스가 아닌, 히알루로니다제 있는 pNP의 더 높은 용량으로 처리된 마우스의 혈청에서 상당한 항-NP 항원 결합 역가를 검출할 수 있었다.
용량 절약 효과는 pDNA 백신 제형에서 히알루로니다제의 편입과 관련된다. 게다가, 이러한 공-제형화는 더 높은 용량에서 가속화된 면역 반응과 관련될 수 있다. 참고 또한 도 42.
실시예 20
실시예 21 - 24용 물질 및 방법
DNA-인코딩된 단클론성 항체 작제 및 시험관내 발현. 플라스미드 DNA-인코딩된 단클론성 항체 (DMAb) 작제물은 이전에 기재된 바와 같이 조작되었다14, 15. pMERS는 전장 항-MERS 외피 당단백질 단클론성 항체용 경 (VL) 및 중 (VH) 쇄를 인코딩하는 몇 개의 변형을 가진 합성 올리고뉴클레오타이드의 사용에 의해 생성되었고, 최종 서열은 인간 CMV 유도된 프로모터 발현 시스템에 클로닝되었다. 수득한 변형된 및 향상된 면역원은 코돈 및 RNA 최적화되었고, 이어서 이들 작제물의 후속적인 대규모 생산과 GenScript (Picastaway, NJ)에 의해 pVax1 발현 벡터에 클로닝되었다. VH 및 VL 유전자는 BamH1과 Xho1 제한 부위 사이 삽입되었다. 시험관내 DMAb 발현을 확인하기 위해, 인간 배아 신장 293T 세포 (ATCC)는 Lipofectamine® 3000 형질감염 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 pMERS의 1 x 106 세포당 3 μg으로 형질감염되었다. 48 시간 후 배양 상청액은 수확되었고 MERS-CoV 결합 항체 및 hIgG 수준은 (아래 기재된) ELISA에 의해 측정되었다.
동물. 암컷 BALB/c 및 Crl:Nu-Foxn1nu 마우스 (7-8 주령)는 Charles River Laboratories (Wilmington, MA)로부터 구매되었다. 암컷 뉴질랜드 화이트 래빗 (10-12 주령, 2 내지 2.5 kg)은 Charles River Laboratories로부터 구매되었다. 히말라야 원숭이 2.35 내지 4.20 kg은 WWP, Inc. (Miami, FL)로부터 구매되었고, 연구 시작 전 33 일 동안 격리하여 배치되었다. 마우스는 그룹 하우징되었고, 래빗 및 히말라야 원숭이는 음식 및 물에 선택적으로 접근하면서 개별적으로 하우징되었다. 모든 동물은 하우징되었고 실험동물 운영위원회 (IACUC)의 표준에 따라 BTS 연구 (San Diego, CA)에서 취급되었다.
근육내 pDNA 전달. 정제된 플라스미드 DNA는 동물에 후속적인 투여를 위하여 염수-시트르산나트륨 (SSC)에서 제형화되었다. 전처리를 위하여, 동물은 1xDPBS (Thermofisher, MA)내 소 고환 (Sigma)로부터 정제된 200U/ml 히알루로니다제의 근육내 사전-주사를 받았다. 마우스는 TA 근육에 30 μl를 받았고, 래빗 및 히말라야 원숭이는 사두 근육에 1 ml를 받았다. 30 분 후 플라스미드 DNA는 동일한 부위에서 주사되었고 이어서 즉각적인 IM 전기천공 처리되었다. 마우스 TA 근육에 pDNA 전달은 CELLECTRA® 3P로 일조되었고, CELLECTRA® 5P는 래빗 및 히말라야 원숭이의 처리에 사용되었다.
인간 IgG 정량화 ELISA. 96-웰 검정 플레이트 (Thermo Scientific™ Nunc™)은 4℃에서 밤새 1x DPBS (Thermofischer, MA)내 100 μl/웰 10 μg/ml 염소 항-huIgG Fc 단편 항체 (Bethyl, TX)로 코팅되었다. 다음 날 플레이트는 1xPBS 세정 완충액내 0.2% (v/v)TWEEN으로 세정되었고 실온에서 1시간 동안 1xDPBS내 10%(v/v)FBS로 차단되었다. 혈청 샘플은 0.2% (v/v) TWEEN-1xPBS내 1% (v/v) FBS에서 희석되었고 이 믹스의 100 μl는 또 다른 세정 단계 후 검정 플레이트에 첨가되었다. 추가로 정제된 인간 카파 경쇄 (Bethyl, TX)의 표준 희석액은 희석 완충액내 500 ng/ml에서 시작하는 1:2 연속 희석액이 제조됨에 따라 제조되었고 각각의 검정 플레이트에 반복하여 첨가되었다. 샘플 및 표준은 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 세정 후, 플레이트는 실온에서 1시간 동안 염소 항-인간 IgG 카파 경쇄 HRP (Bethyl, TX)의 1:10,000 희석액으로 인큐베이션되었다. 검출을 위하여 100 μl/웰 SureBlue Substrate 용액 (KPL, MD)는 세정된 플레이트에 첨가되었다. 반응은 검정 플레이트에 6분 후 TMB 정지 용액 (KPL, MD)의 100 μl/웰 첨가에 의해 중단되었다. O.D.는 450nm에서 판독되었다. 혈청-수준 발현은 농도의 로그에 대하여 에스자형 4 파라미터 로지스틱 곡선 적합을 사용하여 표준 곡선으로부터 보간되었다.
항원 결합 ELISA. 검정 플레이트는 4℃에서 밤새 1xDPBS (Thermofisher, MA)내 100 μl/웰 1 μg/ml MERS-CoV Spike 단백질 S1 (SinoBiological, China)로 코팅되었다. 플레이트는 0.05% TWEEN을 가진 1xPBS 완충액으로 세정되었다. 0.05% TWEEN을 가진 1xPBS내 3% (w/v) BSA의 250ul/웰은 첨가되었고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 혈청 샘플은 0.05% TWEEN을 가진 1xPBS내 1% (w/v) BSA에서 희석되었다. 세정 후 검정 플레이트는 100 μl/웰 1%BSA PBS/TWEEN 완충액으로 채워졌다. 상호 혈청 희석액의 항원 결합을 위하여 1:3 50 μl 연속 희석은 검정 플레이트에서 사전-희석된 혈청 샘플로 수행되었다. 플레이트는 실온에서 1시간 인큐베이션되었다. 세정 후 100 μl의 1:10000 희석된 염소 항-인간 IgG 중쇄 및 경쇄 원숭이-흡착된 항체 (bethyl, TX)는 첨가되었고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 현상을 위하여 SureBlue/TMB 정지 용액 (KPL, MD)는 사용되었고 O.D.는 450nm에서 기록되었다.
ADA ELISA. 검정 플레이트는 시험관내 형질감염된 세포 배양 상청액으로부터 정제된 100 μl/웰 0.3 μg/ml MERS DMAb로 4℃에서 밤새 코팅되었다. 플레이트는 1xPBS 0.05% TWEEN 세정 완충액으로 세정되었고 250μl/웰 3%BSA/PBS/TWEEN 차단 완충액은 첨가되었고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 혈청 샘플은 1%BSA/PBS/TWEEN 희석 완충액에서 1:25 사전-희석되었다. 검정 플레이트 세정 후, 100ul/웰의 사전-희석된 샘플은 첨가되었고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. 히말라야 원숭이에서 ADA 반응의 검출을 위하여 100 μl/웰 1:10000 염소-항 인간 람다 경쇄 HRP 항체 (Bethyl, TX)는 첨가되었고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 히말라야 원숭이 IgG에 대한 이러한 검출 항체의 충분한 교차-반응성 및 코팅 단백질 pMERS에 대한 낮은 교차-반응성은 전에 확인되었다 (데이터 도시되지 않음). 마우스 샘플 염소 항- 마우스 IgG 페록시다아제 (Sigma)에서 ADA 검출을 위하여, 래빗에 대해 염소 항-래빗 IgG (Sigma)는 1:10000 희석되었다. SureBlue/TMB 정지 용액은 플레이트 현상에 사용되었고 O.D. 값은 450nm에서 기록되었다.
실시예 21
DMAbs의 설계, 시험관내, 및 생체내 특성규명 그리고 전달 향상 전략
DMAbs는 단클론성 항체의 경 및 중 면역글로불린 (Ig) 쇄를 인코딩하는 DNA 플라스미드로서 정의된다. 구체적으로, DNA 카셋트는 발현을 위하여 최적화된 그리고 pVax1 포유류 발현 벡터에 클로닝된 전장 mAbs의 가변 경 (VL) 및 중 (VH) Ig 쇄의 코딩 서열용 cDNAs를 함유한다. 단일 오픈-리딩 프레임으로부터 전장 항체의 형성을 허용하기 위해 중쇄 및 경쇄의 효율적인 분리를 위하여, 푸린 절단 부위 및 2A 자기-가공 펩타이드는 설계에서 포함되었다 (도 29a).
이들 전달 최적화 연구를 위하여 인간 항-중동 호흡 증후군 (MERS)-코로나바이러스 (CoV) mAb를 인코딩하는 플라스미드 DNA 작제물 (pMERS)는 선택되었다. pMERS는 전장 항-MERS 외피 당단백질 단클론성 항체에 대하여 경 (VL) 및 중 (VH) 쇄를 인코딩하는 몇 개의 변형을 가진 합성 올리고뉴클레오타이드의 사용에 의해 생성되었고, 최종 서열은 인간 CMV 유도된 프로모터 발현 시스템에 클로닝되었다. 임뮤노글로우불린 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 발현을 개선하기 위해 편입되었다. 수득한 변형된 및 향상된 면역원은 코돈- 및 RNA 최적화되었고, pVax1 발현 벡터에 클로닝되었다 (도 29a).
pMERS 형질감염된 세포로부터 mAbs의 생산은 시험관내 초기에 확인되었다. 인간 293T 세포는 pMERS 또는 비어있는 pVax 플라스미드로 형질감염되었다. 분비된 항체의 수준은 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 형질감염 48 시간 후 상청액에서 정량화되었다, 도 29b. 기능적 항체의 생산을 확인하기 위해, 항-MERS 항체 결합 수준은 수확된 상청액에서 ELISA에 의해 MERS-CoV 항원에 대해 측정되었다 (도 29c). 요약하면, 데이터는 기능적 MERS-CoV 항원 결합 항체가 시험관내 형질감염된 세포로부터 분비되었음을 실증하였다.
BALB/c 마우스에서 근육내 전달 이후 항-MERS DMAb의 생체내 발현은 조사되었다. 전경골 (TA) 근육에 6.25와 100 μg 사이 네이키드 pDNA 용량의 전달은 바탕을 넘어 혈청 인간 IgG (hIgG) 수준을 생산하는데 실패하였다 (도 30a). 혈청에서 전신 hIgG 수준을 증가시키기 위한 목표로, 생체내 유전자 전달을 향상시키기 위해 실증된 유전자 전달 전략은 연구되었다. 이전의 DMAb 연구는 전달 보좌관으로서 생체내 EP의 이용으로 향상된 발현을 실증하였다. 전기천공 (EP)는, 네이키드 pDNA 전달 단독에 100 배 넘게 유전자 발현을 증가시키는, pDNA에 대하여 확립된 생체내 전달 보좌관이다. EP 밑에서 이론은 세포에 큰 분자 (예를 들면 pDNA)의 효율적인 통로를 허용하기 위해 세포 막의 투과도를 증가시킨다는 것이다. 이용된 저 전기 파라미터에서, 세포에서 EP 효과는 일과성이고, 에 대한 세포는 완전하게 기능적으로 남는다. 여기에서, CELLECTRA®-3P EP는 BALB/c 마우스의 TA 근육을 표적하는데 사용되었다. DMAb 주사 직후 TA 근육 전달 부위에서 EP의 적용은 증가된 혈청 hIgG 수준을 유발시켰다 (전달 후 일 6에서 50 μg pMERS 용량에 대하여 평균 670 ng/ml, 도 30b). 혈청 hIgG 수준의 약동학적 분석은 처리후 일 6에서 피크 발현을 드러냈다 (도 34). hIgG 수준은 일 6 후 빠르게 감소하였고, 이는 외래 인간 IgG 단백질에 대해 지향된 숙주 면역 반응의 유발과 일치하였다 (도 35).
생체내 pDNA + EP 전달 프로토콜에서 히알루로니다제 (HYA)의 용도는 유전자 발현을 향상시키기 위해 이전에 실증되었다. HYA는 ECM에서 히알루로난의 가수분해를 촉매화시켜, 조직 투과도에서 일과성 증가를 허용한다. 이것은 근육 조직을 거쳐 주사된 pDNA의 더 큰 분산, 그리고 형질감염에 접근가능한 근세포의 수에서 증가를 허용한다. HYA는 따라서 hIgG 혈청 농도의 추가 증가의 목표로 전달 프로토콜에 첨가되었다. 전기천공과 유전자 전달 30 분 전 200U/ml의 HYA로 TA 근육의 전처리는 혈청 hIgG의 상당히 더 높은 수준 (평균 2160 ng/ml (전달 후 일 6에서 100 μg 용량의 pMERS))를 수득하였다 (도 30c). EP의 부재 하에서 HYA 전처리를 사용하는 pMERS의 전달은 향상된 혈청 hIgG 농도와 관련되지 않았다 (데이터 도시되지 않음). ELISA에 의한 기능적 항체 (MERS CoV 항원에 결합하는 혈청)의 생체내 생산은 수행되었다. 상호 혈청 희석 결합은 pMERS 전달 후 일 6에서 플롯팅되었다 (도 30d). 추가로, 다른 시약은 이들이 세포내 유전자 전달 예컨대 비타민 D, 수크로스 및 폴리머를 향상시켰는지 여부, 또는 ECM 구조 변형 능력 예컨대 엘라스타제 및 콜라겐분해효소를 소유하는지를 결정하기 위해 연구되었고, DMAb 전달 프로토콜에서 그것의 포함이 hIgG 수준을 상당히 향상시킬 수 있는지를 결정하였다. EP + pMERS 전달 프로토콜에 이들 시약의 첨가는 혈청 hIgG 수준을 상당히 향상시키는데 실패하였다 (도 36). 게다가, EP + HYA pMERS 전달 프로토콜에 임의의 이들 시약의 첨가시 혈청 hIgG 수준에서 증가는 없었다 (데이터 도시되지 않음).
유전자 발현에서 전달 근육의 HYA 전처리의 놀라운 효과는 마우스 TA 근육에 리포터 유전자 (pRFP)의 전달시 시각적으로 관측되었다 (도 30e). 추가로, 처리의 부위에서 근세포내 hIgG 발현용 검정시 강한 면역형광 신호 (도 30f)는 관측되어, pMERS 전달의 부위에서 근육 세포에 의해 항체의 생산을 확인하였다. 요약하면, 상기 제시된 데이터는 BALB/c 마우스 모델에서 기능적 hIgG의 발현을 향상시키기 위해 채택될 수 있는 EP 및 HYA를 포함하는 DMAb 전달 프로토콜을 기술한다.
실시예 22
면역결핍된 마우스에서 지속된 DMAb 발현
BALB/c 또는 B6 마우스에서 연구는 조직 형질감염 및 결과적으로 전신 hIgG 수준 향상에서 전달 보좌관의 중요성 및 DMAb의 생체내 발현을 성공적으로 실증하였다. 그러나, 외래 hIgG 단백질에 대한 숙주 면역계의 반응은 발현 동력학에 부정적으로 영향을 미쳤다 (도 34 및 35). DMAb 발현에서 숙주 면역 반응의 부정적 효과를 회피하기 위해, 우리는 면역결핍된 BALB/c 누드 마우스에서 혈청 hIgG 수준의 PK를 조사하였다. 기능적 적응성 면역계의 부재 하에서 hIgG 혈청 수준은 일 6 후 폭락하지 않았지만, 계속 상승하고 일 21 및 35 사이 안정되었다 (도 31a). 이것은 BALB/c 마우스보다 누드 마우스에서 관측된 혈청 hIgG의 더 높은 농도를 초래하였다 (100 μg pMERS 용량에서 12.5 μg/ml 대 2.2 μg/ml 평균 피크). DMAb 발현은 또한 지속되었다. 발현 분석의 지속기간은 전달 후 160 일에서 0.77 μg/ml (12.5 μg 용량 그룹) 및 3.84 μg/ml (100 μg 용량 그룹) 사이의 hIgG 혈청 수준을 드러냈다 (도 31a).
형질감염된 근세포의 수 증가가 더 높은 전신 hIgG 수준을 초래할 것이라는 가설을 제기했다. 따라서 다중 근육 부위 표적화는 유리할 것이다. pMERS의 부위당 100 μg은 1, 2, 3 또는 4 근육에 전달되었다. 도 31b는 표적화된 근육 조직 부위의 수 증가가 유리함을 입증한다. 좌측 및 우측 TA 및 사두 근육 (총 4 부위)에 pMERS 전달은 일 21에 혈청에서 검출된 hIgG의 28.8 μg/ml를 초래하였다. 단일 TA 근육에 100 μg 초과 용량 전달은 혈청 hIgG 수준을 추가로 증가시키는데 실패하였다. 요약으로 이 섹션에서 데이터는 항-hIgG 반응의 부재 하를 나타내고, 전신 수준 DNA-인코딩된 단클론성 항체는 증가되고 지속된다. 게다가, 다중 전달 부위 표적화는 국부 용량 증가에 비해 유리하다.
실시예 23
면역결핍된 마우스에서 지속된 DMAb 발현
규모확대 공정에서 제1 단계는, 설치류보다 영장류에 계통발생적으로 더 가까운 종인, 마우스 (2 ml의 주변 혈액 총 용적과 중량 대략 20 g)부터 래빗 (140 ml의 주변 혈액 총 용적과 중량 대략 2.5 kg)까지이었다. 게다가 래빗 사두근 근육의 큰 크기는 CELLECTRA®-5P와 양립가능하고, 인간 근육내 EP 디바이스는 현재 임상시험에서 사용중이다.
pMERS 발현 동력학은 뉴질랜드 화이트 래빗에서 혈청 인간 IgG에 관하여 결정되었다. 래빗은 HYA-전처리된 사두근 근육에 CELLECTRA®-5P EP와 함께 전달된 총 2 mg pMERS로 처리되었다. 강력한 혈청 hIgG 수준은 일 6에서 정점이었고 (도 37a), 그 다음 일 7에서 바탕으로 빠르게 떨어졌다. 혈청 hIgG의 이러한 신속한 손실은 일 6 및 7 사이 발달하는 강한 항-약물 항체 (ADA)와 일치하였다 (도 37b). 그러나, CELLECTRA® 5P 전달 시스템을 사용하는 이러한 모델에서 이렇게 빠른 시점 (일 6)에 강력한 및 일관된 전신 발현은 수득되었다. hIgG 발현에서 근육 전달 부위의 히알루로니다제 전처리의 효과는 그 다음 실증되었다. 혈청 hIgG의 향상된 수준은 PBS 전처리에 비교하여 근육의 HYA 전처리와 관련되었다 (도 32a), 일 6에서 770 대 122 ng/ml (p < 0.0001), 각각 (도 32b). 게다가, 수득한 hIgG는 MERS CoV 항원 결합에 의해 결정된 바와 같이 기능적이었다 (도 32c).
CELLECTRA® 5P IM EP 디바이스에 대하여 전기 설정은, DMAb 플라스미드가 아닌, DNA 백신의 전달 및 면역원성을 위하여 이전에 최적화되었다. HYA 전처리의 문맥에서 DMAb 전달용 전압에 관하여 최적의 EP 전기 파라미터는 조사되었다. 20, 35, 50 및 65 볼트에서 pMERS IM 전달과 관련된 hIgG 혈청 수준은 분석되었다. 이러한 전압 과정을 수행하기 위해 5P 어레이 및 펄스 패턴 설정은 BTS-12 박스 - 광범위한 전압을 전달할 수 있는 디바이스에 전달되었다. 65 볼트 셋팅은 래빗 사두 근육에서 CELLECTRA®-5P 디바이스에 의해 전달된 전압에 비교할만하였다. 결과는 전압에서 감소와 관련된 hIgG 혈청 수준에서 상당한 손실을 분명히 실증하였다 (도 32d). 조직 손상에서 증가 및 처리 내성에서 감소에 대하여 잠재력으로 인해, 더 높은 전압은 조사되지 않았다.
결론적으로, 우리의 최적화된 전달 프로토콜로 pMERS 전달 후 이른 시점 (일 6)에서 기능적 hIgG의 강력한 혈청 수준의 존재는 더 큰 동물에 DMAb 플랫폼의 진전을 지지하였다.
실시예 24
비인간 영장류에 DMAb 전달 최적화의 적용
인간에 비교할만한 생리학 및 면역계로, 비인간 영장류는 임상에 항체 약물 후보의 번역 잠재력을 연구하기 위해 예외적인 모델을 제공한다. DMAb 전달 최적화 적용은 더 작은 동물 모델에서 기술하였고, 히말라야 원숭이 (Maccaca mulatto)의 혈청에서 hIgG의 수준은 평가되었다. pMERS는 5 히말라야 원숭이의 HYA-전처리된 사두 근육에 CELLECTRA® 5P EP로 전달되었다. hIgG의 전신 수준은 모든 NHPs의 혈청에서 검출되었다 (도 33a). 혈청 hIgG 수준은 1.30 내지 4.97 μg/ml의 범위로 일 11 및 21 사이 정점이었다. 기능적 항체의 생산을 확인하기 위해, MERS CoV 항원에 혈청 항체 결합은 ELISA에 의해 확인되었다. MERS 항원 결합 값은 혈청에서 hIgG 수준에 비교할만한 동력학 프로파일을 표시하였고 (도 33b), 각각의 히말라야 원숭이에 대하여 상호 혈청 희석 결합은 일 17에서 플롯팅되었다 (도 33c). 함께 이들 결과는 NHPs에서 인간 항-MERS-CoV 항체의 강력한 수준의 생산을 확인하였다.
외래 hIgG에 ADA 반응의 유발이 NHPs에서 DMAb 발현의 약동학에 영향을 미쳤는지 여부를 결정하기 위해, ELISA에 의해 pMERS 인코딩된 정제된 단백질 hIgG에 혈청 항체 결합은 분석되었다. 다른 실험 동물 모델에서 hIgG에 ADA 반응은 검출되었다 (도 35 및 37b). 모든 NHPs에서 우리는 DMAb에 대해 항체의 유발을 검출하였지만 (도 33d), 5 NHPs 중 4개에서 이들 ADA는 다른 동물에서 이전의 관찰에 비교하여 지연되었다. ADA의 규모는 hIgG 혈청 수준과 역으로 상관관계가 있었다 (스피어만 r = -0.5811 (p = 0.0072), 도 33e). 이것은 "비-자가" 인간 IgG에 대한 숙주 면역 반응이 히말라야 원숭이에서 DMAb 발현 수준에 부정적으로 영향을 미쳤음을 강하게 제안하였다.
요약하면, 작은 및 큰 전임상 동물 모델의 근육에 전달된 DNA-기반 단클론성 항체의 전신 발현을 상당히 향상시키기 위해 적용될 수 있는 전달 프로토콜의 개발은 기술된다. 여기에서 보여진 바와 같이, 전달의 부위에서 EP 및 히알루로니다제의 조합된 용도는 비인간 영장류에서 μg/ml 범위에서 전신 혈청 hIgG 수준을 달성하게 한다.
실시예 25
래빗 및 히말라야 원숭이에서 pDNA와 히알루로니다제의 공-제형
데이터는 pDNA/히알루로니다제 (HYA) 공-제형이 표준 HYA 전처리 프로토콜에 비교하여 발현의 손실 없이 래빗 근육에 전달될 수 있음을 보여준다. 참고 도 38. pDNA/HYA의 주사 후 60 초의 EP 지연은 증가된 DMAb 발현과 관련된다. 참고 도 39.
데이터는 또한 pDNA /HYA 공-제형이 표준 HYA 전처리 프로토콜에 비교하여 발현의 손실 없이 NHP 근육에 전달될 수 있음을 보여준다. pDNA/HYA의 주사 후 60 초의 EP 지연은 증가된 DMAb 발현과 관련된다. 참고 도 40.
실시예 26
EP 지연의 최적화
실험은 공-제형화 후 EP 지연을 최적화하기 위해 수행되었다. 데이터는 공-제형 주사 후 20-초 EP 지연이 최적일 수 있음을 보여준다. 참고 도 41. 따라서, HYA 프로토콜로 조직 전처리에 비교하여 약물 전달과 EP 사이 시간 지연의 편입시 상당히 향상된 유전자 발현. 유전자 발현의 동등한 수준은 HYA 프로토콜과 조직 전처리에 비교된 경우 시간 지연 없이 관측되었다.
실시예 27
DNA 백신 HYA 제형으로 종양 항원에 면역 반응의 확대
백신 제형에 HYA의 포함이 종양 관련된 자기-항원을 인코딩하는 백신에 유발된 숙주 면역 반응을 향상시킬 것이라는 가설을 제기했다. 실험 결과는 도 43에서 보여진다.
개시된 구현예에 다양한 변화 및 변형은 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이다. 본 발명의 화학적 구조, 치환체, 유도체, 중간체, 합성, 조성물, 제형, 또는 사용 방법에 관한 것을 비제한적으로 포함하는, 그와 같은 변화 및 변형은 이의 사상 및 범위로부터 이탈 없이 실시될 수 있다.
완성도의 이유로, 본 발명의 다양한 양태는 하기 넘버링된 조항에서 설명된다:
조항 1: 하기 단계를 포함하는, 대상체에 제제의 전달 방법:
콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (CSPG)을 분해시키는데 충분한 양으로 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 상기 대상체에 투여하는 단계; 및
상기 제제를 상기 대상체에 투여하는 단계.
조항 2: 조항 1에 있어서, CSPG가 아그레칸 (CSPG1), 베르시칸 (CSPG2), 뉴로칸 (CSPG3), CSPG4 (흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸, NG2), CSPG5, SMC3 (CSPG6, 염색체 3의 구조 유지), 브레비칸 (CSPG7), CD44 (CSPG8, 분화 44의 클러스터), 포스파칸, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
조항 3: 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애의 치료 방법:
콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 상기 대상체에 투여하는 단계; 및
제제를 상기 대상체에 투여하는 단계.
조항 4: 조항 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 제제가 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 및 소 분자로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
조항 5: 조항 4에 있어서, 제제가 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
조항 6: 조항 5에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 단클론성 항체를 인코딩하는, 방법.
조항 7: 조항 4에 있어서, 제제가 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
조항 8: 조항 7에 있어서, 폴리펩타이드가 단클론성 항체를 포함하는, 방법.
조항 9: 조항 6에 있어서, 단클론성 항체가 생체내 발현되는, 방법.
조항 10: 조항 6에 있어서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 및 단클론성 항체가 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는, 방법.
조항 11: 조항 6에 있어서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 단클론성 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 동일한 벡터 또는 별개의 벡터 내에 포함되는, 방법.
조항 12: 조항 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제제의 투여에 앞서 대상체에 투여되는, 방법.
조항 13: 조항 12에 있어서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제제의 투여에 적어도 약 15 분 내지 약 24 시간 앞서 대상체에 투여되는, 방법.
조항 14: 조항 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제가 동시에 대상체에 투여되는, 방법.
조항 15: 조항 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제가 피하로 또는 근육내로 대상체에 투여되는, 방법.
조항 16: 조항 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 콘드로이티나제 폴리펩타이드가 CSPG를 가수분해시키고 대상체의 세포외 매트릭스의 해체를 초래하는, 방법.
원인 17: 조항 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 글리코사미노글리칸을 분해시키는데 충분한 양으로 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 방법.
조항 18: 조항 17에 있어서, 글리코사미노글리칸이 히알루로난을 포함하는, 방법.
조항 19: 조항 17에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제제의 투여에 앞서 대상체에 투여되는, 방법.
조항 20: 조항 19에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제제의 투여에 적어도 약 15 분 내지 약 24 시간 앞서 대상체에 투여되는, 방법.
조항 21: 조항 17에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제가 동시에 대상체에 투여되는, 방법.
조항 22: 조항 17에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제가 피하로 또는 근육내로 대상체에 투여되는, 방법.
조항 23: 조항 17에 있어서, 히알루로니다제가 콘드로이티나제와 동시에 투여되는, 방법.
조항 24: 조항 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 제제가 전기천공을 통해 대상체에 투여되는, 방법.
조항 25: 조항 14에 있어서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제가 투여에 앞서 공-제형화되는, 방법.
조항 26: 조항 17에 있어서, 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제가 투여에 앞서 공-제형화되는, 방법.
조항 27: 조항 17에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 투여에 앞서 공-제형화되는, 방법.
조항 28: 하기 단계를 포함하는, 대상체에 제제의 전달 방법:
글리코사미노글리칸을 분해시키는데 충분한 양으로 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 상기 대상체에 투여하는 단계; 및
상기 제제를 상기 대상체에 투여하는 단계.
조항 29: 조항 29에 있어서, 글리코사미노글리칸이 히알루로난을 포함하는, 방법.
조항 30: 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애의 치료 방법:
히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 상기 대상체에 투여하는 단계; 및
제제를 상기 대상체에 투여하는 단계.
조항 31: 조항 28 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 제제가 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 및 소 분자로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
조항 32: 조항 31에 있어서, 제제가 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
조항 33: 조항 32에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 단클론성 항체를 포함하는, 방법.
조항 34: 조항 31에 있어서, 제제가 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
조항 35: 조항 36에 있어서, 폴리펩타이드가 단클론성 항체를 포함하는, 방법.
조항 36: 조항 33에 있어서, 단클론성 항체가 생체내 발현되는, 방법.
조항 37: 조항 33에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 및 단클론성 항체가 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는, 방법.
조항 38: 조항 33에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 단클론성 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 동일한 벡터 또는 별개의 벡터 내에 포함되는, 방법.
조항 39: 조항 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제제의 투여에 앞서 대상체에 투여되는, 방법.
조항 40: 조항 39에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제제의 투여에 적어도 약 15 분 내지 약 24 시간 앞서 대상체에 투여되는, 방법.
조항 41: 조항 39에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제제의 투여에 1 시간 앞서 대상체에 투여되는, 방법.
조항 42: 조항 28 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제가 동시에 대상체에 투여되는, 방법.
조항 43: 조항 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 피하로 또는 근육내로 대상체에 투여되는, 방법.
조항 44: 조항 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 히알루로니다제 폴리펩타이드가 히알루로난을 가수분해시키고 대상체의 세포외 매트릭스의 해체를 초래하는, 방법.
조항 45: 조항 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 제제가 전기천공을 통해 대상체에 투여되는, 방법.
조항 46: 조항 28 또는 조항 30에 있어서, 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제제가 투여에 앞서 공-제형화되는, 방법.
조항 47: 조항 1 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 전기천공을 추가로 포함하는, 방법.
상기 상세한 설명 및 동반하는 예가 단지 예시적이고 본 발명의 범위에서 제한으로서 취급되지 않고, 첨부된 청구항 및 이들의 등가물에 의해 유일하게 한정되는 것이 이해된다.

Claims (17)

  1. 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 대상체에 제제의 전달용 조성물로서,
    (a) 상기 폴리펩타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드는 하기로부터 선택되는 것이고:
    (i) 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (CSPG)을 분해시키는데 충분한 양으로 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (ii) 글리코사미노글리칸을 분해시키기에 충분한 양으로 히알루로니다제 폴리펩티드 또는 히알루로니다제 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (b) 상기 폴리펩타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 대상체에 투여되고,
    (c) 상기 제제가 상기 대상체에 투여되는 것인,
    조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 CSPG가 아그레칸 (CSPG1), 베르시칸 (CSPG2), 뉴로칸 (CSPG3), CSPG4 (흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸, NG2), CSPG5, SMC3 (CSPG6, 염색체 3의 구조 유지), 브레비칸 (CSPG7), CD44 (CSPG8, 분화 44의 클러스터), 포스파칸, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 글리코사미노글리칸은 히알루로난을 함유하는 것인, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 함께 제제화되어 상기 제제 및 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드가 상기 대상체에게 동시에 투여되는 것인, 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 제제가 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 및 소 분자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 제제가 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 제제 중 상기 폴리뉴클레오타이드가 단클론성 항체를 인코딩하는 것인, 조성물.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 제제가 폴리펩타이드를 포함하는 것인, 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 제제 중 상기 폴리펩타이드가 단클론성 항체를 포함하는 것인, 조성물.
  10. 청구항 7 또는 9에 있어서, 상기 단클론성 항체가 생체내 발현되도록 구성되는 것인, 조성물.
  11. 청구항 7에 있어서, 상기 콘드로이티나제 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드 및 상기 단클론성 항체가 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 것인, 조성물.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 단클론성 항체를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 및 상기 콘드로이티나제 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드가 동일한 벡터 내에 포함되는 것인, 조성물.
  13. 청구항 7에 있어서, 상기 단클론성 항체를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 및 상기 콘드로이티나제 또는 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드가 별개의 벡터 내에 포함되는 것인, 조성물.
  14. 청구항 1 내지 9 및 청구항 11 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘드로이티나제 폴리펩타이드, 상기 콘드로이티나제 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 폴리펩타이드, 상기 히알루로니다제 폴리펩타이드 또는 상기 히알루로니다제 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 제제가 피하로 또는 근육내로 상기 대상체에 투여되도록 구성되는 것인, 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 제제는 전기천공을 통해 상기 대상체의 세포 내로 전달되도록 추가로 구성되는 것인, 조성물.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 콘드로이티나제 폴리펩타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 상기 콘드로이티나제 폴리펩타이드가 CSPG를 가수분해시켜 상기 대상체의 세포외 매트릭스의 해체를 초래하는 것인, 조성물.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 히알루로니다제 폴리펩티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 상기 히알루로니다제 폴리펩티드는 히알루로난을 가수분해하여 상기 대상체의 세포외 매트릭스의 해체를 초래하는 것인, 조성물.
KR1020227031129A 2016-04-29 2017-05-01 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도 KR102624967B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020247000963A KR20240011868A (ko) 2016-04-29 2017-05-01 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662329593P 2016-04-29 2016-04-29
US62/329,593 2016-04-29
US201662336501P 2016-05-13 2016-05-13
US62/336,501 2016-05-13
US201762488605P 2017-04-21 2017-04-21
US62/488,605 2017-04-21
KR1020187034693A KR102443064B1 (ko) 2016-04-29 2017-05-01 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도
PCT/US2017/030447 WO2017190147A1 (en) 2016-04-29 2017-05-01 The in vivo use of chondroitinase and/or hyaluronidase to enhance delivery of an agent

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187034693A Division KR102443064B1 (ko) 2016-04-29 2017-05-01 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247000963A Division KR20240011868A (ko) 2016-04-29 2017-05-01 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220127943A true KR20220127943A (ko) 2022-09-20
KR102624967B1 KR102624967B1 (ko) 2024-01-16

Family

ID=60161168

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247000963A KR20240011868A (ko) 2016-04-29 2017-05-01 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도
KR1020187034693A KR102443064B1 (ko) 2016-04-29 2017-05-01 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도
KR1020227031129A KR102624967B1 (ko) 2016-04-29 2017-05-01 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247000963A KR20240011868A (ko) 2016-04-29 2017-05-01 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도
KR1020187034693A KR102443064B1 (ko) 2016-04-29 2017-05-01 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20190284263A1 (ko)
EP (1) EP3448993A4 (ko)
KR (3) KR20240011868A (ko)
CN (1) CN109415714A (ko)
AU (2) AU2017257191B2 (ko)
CA (1) CA3025146A1 (ko)
WO (1) WO2017190147A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108828224A (zh) * 2018-04-24 2018-11-16 上海市第十人民医院 肝癌血清肿瘤标志物acan
WO2019222277A1 (en) * 2018-05-15 2019-11-21 Translate Bio, Inc. Subcutaneous delivery of messenger rna
JPWO2021065768A1 (ko) * 2019-09-30 2021-04-08
WO2024141952A1 (en) * 2022-12-29 2024-07-04 Novocure Gmbh A cancer associated fibroblast (caf) inhibitor for use with an alternating electric field in a method of treating diseases such as cancer

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3805783A (en) 1971-02-12 1974-04-23 A Ismach Hand powered hypodermic jet injector gun
US4342310A (en) 1980-07-08 1982-08-03 Istvan Lindmayer Hydro-pneumatic jet injector
US4447223A (en) 1982-04-16 1984-05-08 Cct Associates Medicament implant applicator
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5545130A (en) 1992-04-08 1996-08-13 Genetronics, Inc. Flow through electroporation method
US5702359A (en) 1995-06-06 1997-12-30 Genetronics, Inc. Needle electrodes for mediated delivery of drugs and genes
US5993434A (en) 1993-04-01 1999-11-30 Genetronics, Inc. Method of treatment using electroporation mediated delivery of drugs and genes
US5679647A (en) 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US5505697A (en) 1994-01-14 1996-04-09 Mckinnon, Jr.; Charles N. Electrically powered jet injector
US5869326A (en) 1996-09-09 1999-02-09 Genetronics, Inc. Electroporation employing user-configured pulsing scheme
US6216034B1 (en) 1997-08-01 2001-04-10 Genetronics, Inc. Method of programming an array of needle electrodes for electroporation therapy of tissue
US6241701B1 (en) 1997-08-01 2001-06-05 Genetronics, Inc. Apparatus for electroporation mediated delivery of drugs and genes
US6055453A (en) 1997-08-01 2000-04-25 Genetronics, Inc. Apparatus for addressing needle array electrodes for electroporation therapy
US6120493A (en) 1998-01-27 2000-09-19 Genetronics, Inc. Method for the introduction of therapeutic agents utilizing an electroporation apparatus
US6208893B1 (en) 1998-01-27 2001-03-27 Genetronics, Inc. Electroporation apparatus with connective electrode template
US6009347A (en) 1998-01-27 1999-12-28 Genetronics, Inc. Electroporation apparatus with connective electrode template
JP2002520101A (ja) 1998-07-13 2002-07-09 ジェネトロニクス、インコーポレーテッド 電気的に補助される化粧用薬剤の局部送達法および装置
US6192270B1 (en) 1998-08-14 2001-02-20 Genetronics, Inc. Apparatus and method for the delivery of drugs and genes into tissue
US6150148A (en) 1998-10-21 2000-11-21 Genetronics, Inc. Electroporation apparatus for control of temperature during the process
AU4996300A (en) 1999-05-10 2000-11-21 Gentronics, Inc. Method of electroporation-enhanced delivery of active agents
US7171264B1 (en) 1999-05-10 2007-01-30 Genetronics, Inc. Intradermal delivery of active agents by needle-free injection and electroporation
US7245963B2 (en) 2002-03-07 2007-07-17 Advisys, Inc. Electrode assembly for constant-current electroporation and use
US7328064B2 (en) 2002-07-04 2008-02-05 Inovio As Electroporation device and injection apparatus
CN100408101C (zh) * 2002-08-16 2008-08-06 舍林股份公司 以野生型或突变型eNOS对重症肢体缺血的基因治疗
CA2508948A1 (en) * 2002-12-16 2004-07-15 Halozyme, Inc. Human chondroitinase glycoprotein (chasegp), process for preparing the same, and pharmaceutical compositions comprising thereof
US20100003238A1 (en) * 2008-04-14 2010-01-07 Frost Gregory I Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
ES2385251B1 (es) * 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.
MX2012003282A (es) * 2009-09-17 2012-04-30 Baxter Healthcare Sa Co-formulacion estable de hialuronidasa e inmunoglobulina, y metodos de su uso.
US20110142949A1 (en) * 2009-10-16 2011-06-16 The Research Foundation Of State University Of New York Chondroitinase treatment method for demyelination-related conditions and diseases
PL2653168T3 (pl) * 2010-12-13 2015-07-31 Seikagaku Kogyo Co Ltd Chondroitynaza ABC do leczenia przepukliny dysku

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
European Journal of Neuroscience, Vol. 38, pp. 2946~2961, 2013* *
Xia 등, Neuroscience Letters 590 (2015) 74~79* *

Also Published As

Publication number Publication date
US20190284263A1 (en) 2019-09-19
KR20190013794A (ko) 2019-02-11
CN109415714A (zh) 2019-03-01
KR102624967B1 (ko) 2024-01-16
KR20240011868A (ko) 2024-01-26
WO2017190147A1 (en) 2017-11-02
EP3448993A1 (en) 2019-03-06
AU2023226760A1 (en) 2023-09-28
EP3448993A4 (en) 2020-04-22
AU2017257191A9 (en) 2023-08-03
AU2017257191B2 (en) 2023-08-10
KR102443064B1 (ko) 2022-09-14
AU2017257191A1 (en) 2018-12-13
CA3025146A1 (en) 2017-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102443064B1 (ko) 제제의 전달을 향상시키기 위한 콘드로이티나제 및/또는 히알루로니다제의 생체내 용도
JP6707590B2 (ja) 片頭痛の治療または予防法
Ruffini et al. Human chemokine MIP1α increases efficiency of targeted DNA fusion vaccines
KR20190033047A (ko) 관문 분자를 표적으로 하는 dna 단클론성 항체
AU2020380288B2 (en) Combination therapy to treat brain cancer
AU2023282283A1 (en) Combination of novel vaccines against Zika virus and DNA antibody constructs for use against Zika virus
US20190153076A1 (en) DNA Antibody Constructs for Use against Pseudomonas Aeuruginosa
KR20230154048A (ko) Sbi 어쥬번트를 포함하는 조성물 및 이들의 이용 방법
US20230092556A1 (en) In vivo use of chondroitinase and/or hyaluronidase to enhance delivery of an agent
CA2937970A1 (en) Immunotherapeutic composition, method of treatment, and method of diagnosis
IL263416B1 (en) Modification of transgenic influenza hemagglutinin polypeptides
EA043111B1 (ru) In vivo использование хондроитиназы и/или гиалуронидазы для улучшения доставки агента
KR20210021008A (ko) 생체내 번역후 변형을 위한 조성물 및 방법
US20230070723A1 (en) Combination therapy to treat brain cancer
US20190290750A1 (en) Dna antibody constructs for use against ebola virus
US20230210981A1 (en) Coronavirus disease 2019 (covid-19) combination vaccine
US12110342B2 (en) Nucleic acid monoclonal antibodies targeting PCSK9 and methods of use
RU2813829C2 (ru) Конструкции днк-антител для применения против болезни лайма
US20200216519A1 (en) Dna antibody constructs for use against ebola virus
CN116744966A (zh) Dna编码的用于抵抗sars-cov-2的抗体

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant