CN108828224A

CN108828224A - 肝癌血清肿瘤标志物acan

Info

Publication number: CN108828224A
Application number: CN201810373589.8A
Authority: CN
Inventors: 张骁; 王佳谊; 杨月月; 郭素素; 孙奋勇; 陈岩; 潘秋辉; 乔永霞
Original assignee: Shanghai Tenth Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai Tenth Peoples Hospital
Priority date: 2018-04-24
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2018-11-16

Abstract

本发明涉及ACAN的一种新用途，即作为肝癌血清标志物。其优点表现在：本发明发现，ACAN在肝癌患者血清中表达上调，并具有一定特异性，血清中ACAN表达水平和经典肝功能指标(AFP、ALT、AST)具有一定相关性。ACAN是相比于AFP更好的肝癌血清学标志物，ACAN的ROC曲线下面积为0.978，而AFP的ROC曲线下面积为0.661，ACAN的最佳诊阈值为66ng/ml，此时，检测的敏感度为96.4％，特异度为98.2％。

Description

肝癌血清肿瘤标志物ACAN

技术领域

本发明涉及检验医学技术领域，具体地说，是肝癌血清肿瘤标志物ACAN。

背景技术

Hippo/YAP信号通路是通过控制细胞增殖和凋亡来控制器官大小的一条高度保守的信号通路。该信号通路包括MST1/2(Mammalian STE20-like proteinkinase)和LATS1/2(Large Tumor Suppressor 1/2)等核心激酶。这些核心激酶形成级联反应，由LATS1/2对下游的YAP产生磷酸化修饰，对YAP产生抑制作用。一旦上游的核心激酶对YAP的抑制作用减弱，YAP将与多种转录因子相结合，促进下游基因的转录，起到促肝癌作用。

在肝癌中，肝细胞肝癌患者的组织中可见到YAP表达明显升高，并且高表达的YAP预示着不良预后；此外，肝特异性高表达YAP的转基因小鼠很快出现了肝损伤的症状，并最终形成了肝癌。总而言之，YAP在肝癌的发生发展过程中发挥了至关重要的作用。YAP调控膜蛋白在肝癌中高表达并可释放入血，已有部分研究探索YAP调控膜蛋白是否可作为肝癌肿瘤标志物。本研究发现ACAN是一种可被Hippo/YAP信号通路调控蛋白，诊断性能一定程度上优于经典肝癌标志物AFP。

软骨蛋白聚糖(Aggrecan,ACAN)主要由软骨细胞分泌产生，是组成软骨组织胞外基质的主要成分。ACAN基因定位于15q25→q26.2，由19个外显子和18个内含子组成，编码区含39.4kb。其中18个内含子均由GT起始至AG终止，严格遵循GT/AG法则，19个外显子中，除第一个外显子不编码蛋白外，2～19个外显子均与软骨蛋白多糖核心蛋白的特定结构域存在着一定的对应关系，编码核心蛋白的2454个氨基酸。ACAN结构是由带负电荷的糖胺聚糖共价连接于核心蛋白所组成的糖复合物。正常状态下，ACAN代谢过程相当保守，合成与分解维持着动态平衡。ACAN合成与代谢受TNF-a,IL-1a,IL-1b等细胞因子的影响。ACAN的功能主要是维持软骨的机械性能和参与控制骨的钙化，同时具有细胞间信息传递，维持细胞表型，介导与其他基质间相互作用，保持组织整体功能等重要作用。

中国专利文献CN105349627A公开了ACAN基因用于中国儿童矮小症易感基因SNP分型用试剂盒。中国专利文献CN104792894A公开了ACAN蛋白表达上调用于诊断儿童活动性结核病。中国专利文献CN105586389A公开了ACAN基因用于检测遗传性骨病。中国专利文献CN105624796A公开了ACAN基因用于检测遗传性耳聋。但是关于ACAN作为肝癌血清肿瘤标志物目前还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供ACAN的一种新用途。

本发明的第二个目的是，提供一种诊断肝癌的试剂盒。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：ACAN蛋白作为肝癌的诊断标志物的应用。

血清ACAN蛋白作为肝癌的诊断标志物的应用。

ACAN蛋白作为标志物在制备诊断肝癌的检测产品中的应用。

ACAN蛋白作为血清标志物。

所述的检测产品检测血清。

ACAN蛋白作为唯一的标志物。

所述的检测产品为诊断试剂盒。

所述的诊断试剂盒的诊断阈值为66ng/ml。

所述的检测产品用于区分肝癌患者和健康人、乙肝患者、丙肝患者、肝硬化患者、胃癌患者、结肠癌患者、乳腺癌患者、肺癌患者。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种诊断肝癌的试剂盒，所述的试剂盒包含特异性检测血清ACAN蛋白的试剂。

本发明优点在于：

1、本发明发现，ACAN在肝癌患者血清中表达上调，并具有一定特异性，血清中ACAN表达水平和经典肝功能指标(AFP、ALT、AST)具有一定相关性。

2、本发明发现，ACAN是相比于AFP更好的肝癌血清学标志物，ACAN的ROC曲线下面积为0.978，而AFP的ROC曲线下面积为0.661，ACAN的最佳诊阈值为66ng/ml，此时，检测的敏感度为96.4％，特异度为98.2％。

附图说明

附图1：CREB和YAP可调控ACAN表达。

附图2：CREB和YAP可调控ACAN表达。

附图3：CREB和YAP可调控ACAN表达。

附图4：CREB和YAP可调控ACAN表达。

附图5：ACAN含量在肝癌中特异性上升。

附图6：ACAN表达水平和AFP，ALT以及AST存在相关性。

附图7：ACAN诊断性能一定程度上优于AFP。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

1标本收集

所有标本收集于上海市瑞金医院2015年5月至2016年12月期间。肝癌患者平均年龄为50.22±11.52岁，男女比例2.44:1，乙型肝炎患者平均年龄，39.12±5.93岁；男女比例1.26:1，丙型肝炎患者平均年龄，59.07±8.92岁；男女比例1.41:1，肝硬化患者平均年龄50.02±11.14岁；男女比例为2.59:1，结肠癌患者平均年龄51.17±12.04岁，男女比例4.02:1，肺癌患者平均年龄51.14±6.91岁，男女比例3.74:1，胃癌患者平均51.99±9.16岁，男女比例4.02:1，乳腺癌患者平均年龄41.41±11.12岁；均为女性患者。健康志愿者平均年龄为51.06±12.74岁，男女比例为1.27:1。通过计算机断层扫描和磁共振成像确认肝癌诊断结果。通过组织学分析确诊其他癌症患者。乙型肝炎和丙型肝炎患者确诊通过荧光定量PCR检测其DNA。转氨酶(AST和ALT)检测由自动生化分析仪测定。根据1975年赫尔辛基宣言伦理准则进行研究。

2细胞购买

细胞系购买自中科院细胞库。

3qPCR实验

RNA抽提后经PrimeScript试剂盒(Perfect Real Time)(TaKaRa，大连，中国)反转录获取cDNA。SYBRpremix Ex Taq(TaKaRa)试剂盒进行定量PCR分析。

引物序列为：

ACAN-qPCR-F:ACCAGTGGATCGGCCTGAACGACAG(SEQ ID NO:1)；

ACAN-qPCR-R:AATTGCAGGGAACATCATTCCACTC(SEQ ID NO:2)；

GAPDH-qPCR-F:ATTATTCTCTGATTTGGTCGTAT(SEQ ID NO:3)；

GAPDH-qPCR-R:CTTCCCGTTCTCAGCCTTGACGG(SEQ ID NO:4)。

4双荧光报告实验

Promega公司Dual-Luciferase检测试剂盒进行分析，荧光报告载体通过重叠PCR方法，采用pGL4.21载体构建，引物序列为：

WT-ACAN-Promoter-F:

ATGCGGTACCCAATTTGTTCTCCCACAAGGCAT(SEQ ID NO:5)；

WT-ACAN-Promoter-R:

ATGCGATATCGGCGGGCGGGCGGGCATGGCGCGCT(SEQ ID NO:6)；

Mut-ACAN-Promoter-F:

TTACCTCCCCCTCTCCACCATCCCC(SEQ ID NO:7)；

Mut-ACAN-Promoter-R:

GAGAGGGGGAGGTAAGAGGCTCACGGGGAGCTGCGAGTCT(SEQ ID NO:8)。

5酶联免疫吸附试验(ELISA)

试剂盒购自上海颖心实验设备有限公司，操作步骤严格按照厂家提供说明书执行，吸光度450nm处获得各样品吸光度值，计算浓度。

6统计分析

统计学方法包括t检验，Bonferroni多重比较分析，Spearman等级相关检验，ROC曲线下面积等。P<0.05被认为具有统计学意义。

实施例1：ACAN表达受CREB以及YAP调控

我们首先检测ACAN的表达是否受YAP调控。在常用恶性肝癌细胞7402以及7721细胞系中，我们发现过表达YAP后，ACAN的mRNA表达显著上升，而YAP敲减后ACAN的表达水平显著下降。YAP并不能直接结合在靶基因的启动子上，而是通过其他转录因子间接促进目的基因的转录，我们在肝癌细胞7402以及7721细胞系中过表达几种常见和YAP结合的转录因子CREB，TEAD，TFCP2以及RUNX2等，发现仅有CREB过表达可促进ACAN的mRNA表达，而TEAD，TFCP2以及RUNX2对ACAN表达影响并不明显。此外，共转染CREB和YAP可更为显著促进ACAN的mRNA表达。我们在ACAN的启动子序列-610～-599nt部分寻找到了CREB的结合基序，并构建了野生型以及该结合基序缺失突变的启动子荧光报告载体。我们发现野生型ACAN启动子荧光强度可受YAP和CREB所调控，然而，当该结合基序突变后，ACAN启动子的荧光强度不再受CREB和YAP所调控。以上结果表明ACAN表达受CREB以及YAP共同调控。

实施例2：血清中ACAN表达水平在肝癌中特异性升高

在156例肝癌患者血清标本中，与正常人群相比，我们发现ACAN表达水平明显升高，而且在乙型肝炎，丙型肝炎等肝脏良型疾病以及胃癌，肠癌，乳腺癌以及肺癌患者血清中并未见到ACAN表达水平上升。所以ACAN在肝癌患者血清中表达上调，并具有一定特异性。

实施例3：血清中ACAN表达水平和经典肝功能指标存在统计学相关性

AFP为当前临床常用的经典肝癌血清标志物，我们发现ACAN表达和AFP存在一定正相关关系(R＝0.722，p＝0.000)，而且ACAN的表达和谷丙转氨酶ALT(R＝0.517，p＝0.000)以及谷草转氨酶AST(R＝0.443，p＝0.000)均存在有统计学意义的正相关关系。

实施例4：血清ACAN诊断效能一定程度优于AFP

经ROC曲线下面积分析，我们认为ACAN可能是相比于AFP更好的肝癌血清学标志物，ACAN的ROC曲线下面积为0.978，而AFP的ROC曲线下面积为0.661，ACAN的最佳诊阈值为66ng/ml，此时，检测的敏感度为96.4％，特异度为98.2％。以上结果表明，ACAN作为肝癌血清标志物的诊断效能一定程度上优于AFP。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市第十人民医院

<120> 肝癌血清肿瘤标志物ACAN

<130> /

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

accagtggat cggcctgaac gacag 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aattgcaggg aacatcattc cactc 25

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attattctct gatttggtcg tat 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attattctct gatttggtcg tat 23

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgcggtacc caatttgttc tcccacaagg cat 33

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgcgatatc ggcgggcggg cgggcatggc gcgct 35

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttacctcccc ctctccacca tcccc 25

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gagaggggga ggtaagaggc tcacggggag ctgcgagtct 40

Claims

1.ACAN蛋白作为肝癌的诊断标志物的应用。

2.血清ACAN蛋白作为肝癌的诊断标志物的应用。

3.ACAN蛋白作为标志物在制备诊断肝癌的检测产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，ACAN蛋白作为血清标志物。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测产品检测血清。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，ACAN蛋白作为唯一的标志物。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测产品为诊断试剂盒。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的诊断试剂盒的诊断阈值为66ng/ml。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测产品用于区分肝癌患者和健康人、乙肝患者、丙肝患者、肝硬化患者、胃癌患者、结肠癌患者、乳腺癌患者、肺癌患者。

10.一种诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含特异性检测血清ACAN蛋白的试剂。