CN110229898A

CN110229898A - 一种检测鼻咽癌的标志物及应用

Info

Publication number: CN110229898A
Application number: CN201910516429.9A
Authority: CN
Inventors: 潘建基; 陈毅歆; 林可焴; 卢天柱; 陈梦媛; 陈鸿霖; 苏颖; 林城; 林少俊; 宗井凤; 郭巧娟
Original assignee: Fujian Cancer Hospital (fujian Cancer Institute Fujian Cancer Prevention And Treatment Center)
Current assignee: Fujian Cancer Hospital (fujian Cancer Institute Fujian Cancer Prevention And Treatment Center)
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2019-09-13

Abstract

本发明涉及基因治疗和医学诊断技术领域，本发明提供了一种生物学标志物EBV‑miR‑BART7在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用，本发明进一步提供了一种针对EBV‑miR‑BART7检测来进行鼻咽癌诊断的试剂盒，包括：（1）血浆中总RNA的提取；（2）血浆中EBV‑miR‑BART7的cDNA合成；（3）探针法检测EBV‑miR‑BART7表达。本发明生物学标志物EBV‑miR‑BART7可作为早期诊断和预测预后的生物学标志物，该试剂盒诊断鼻咽癌的敏感度高，特异性强。

Description

一种检测鼻咽癌的标志物及应用

技术领域

本发明涉及基因治疗和医学诊断技术领域，具体涉及一种生物学标志物EBV-miR-BART7在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用。

背景技术

鼻咽癌是我国南方的恶性肿瘤之一,好发于青壮年（35-55岁）,年标化发病率可高达15-30/100000。早期鼻咽癌5年生存率可达90%,但晚期患者仅50%左右。由于解剖部位特殊，早期症状隐匿, 70%以上的患者就诊时已是中晚期。因此,研究鼻咽癌的发病机制,发现简单、有效的肿瘤标志物,以提高鼻咽癌早期诊断率和预测预后能力,是鼻咽癌未来防治的重点工作。

EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV) 感染是鼻咽癌的最主要致病因素之一。研究发现：几乎100%的非角化型鼻咽癌具有EBV感染，因此,通过检测EBV基因产物可协助鼻咽癌的诊断。关于鼻咽癌外周血标志物的探讨显示,在EBV EBNA-IgA和VCA-IgA持续升高人群中,鼻咽癌的发病风险呈逐年升高,但作为NPC早期筛查和诊断指标,其敏感性及特异性很低,例如EBV VCA-IgA阳性人群中NPC的检出率仅为3.19%。血浆EBV DNA是目前研究最多的鼻咽癌肿瘤标志物,在NPC的筛查、早期诊断、治疗和预后检测方面均有临床价值。利用血浆中的EBV DNA筛查早期无症状NPC患者,其敏感性及特异性分别为97.1%、98.6%，且数据显示NPC患者确诊时间明显提前,预后更佳。但是,由于各个实验室EBV DNA检测技术、检测平台、阈值等不一致,目前没有标准化的流程，导致其诊断鼻咽癌的实用性、可重复性、推广性存在很大的困难。因此,血浆EBV DNA是否能作为理想的鼻咽癌肿瘤标志物有待进一步研究。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一类长度约为20～23个核苷酸的小分子非编码RNA,它通过与靶基因完全或不完全的互补配对,降解靶基因或阻遏其转录或翻译。miRNA可通过扮演癌基因或抑癌基因角色,从而参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭转移、免疫逃逸等过程,是近几年肿瘤标志物的研究热点。目前研究发现，EBV共编码 22个EBV-miR-BARTs前体,形成 44个成熟的miRNA,且EBV-miR-BARTs大量表达于鼻咽癌组织中，而在健康者或非鼻咽癌癌症患者中低表达或不表达。因此,筛选鼻咽癌中特异表达的EBV-miR-BARTs,作为潜在的鼻咽癌早期筛查、早期诊断、最佳治疗方案决策、预测预后、检测复发等方面的肿瘤生物学标志,具有极其重要的临床意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物学标志物EBV-miR-BART7在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种生物学标志物EBV-miR-BART7在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用，所述EBV-miR-BART7的序列如SEQ ID No.1所示：CAUCAUAGUCCAGUGUCCAGGG。

该试剂盒是通过PCR技术检测生物样品中EBV-miR-BART7的表达量。

所述试剂盒包括对EBV-miR-BART7具有检测特异性的引物序列和探针，其序列如下：

上游引物为miR-BART7-F：5’- AGCGCATCATAGTCCAGTGT-3’;

下游引物为miR-BART7-R：5’- GCAGGGTCCGAGGTATT -3’;

探针为：5’-FAM- ACTGGATACGACCCCTGG -BHQX-3’，5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQX。

所述试剂盒包括：

（1）血浆中总RNA的提取；

（2）血浆中EBV-miR-BART7的cDNA合成；

（3）探针法检测EBV-miR-BART7表达。

本发明的优点在于：本发明通过筛选鼻咽癌中特异表达的EBV-miR-BART7，作为潜在的鼻咽癌早期筛查、早期诊断、最佳治疗方案决策、预测预后、检测复发等方面的肿瘤生物学标志，具有极其重要的临床意义。

附图说明

图1为鼻咽癌患者与健康人群EBV-miR-BART7表达量测定结果。

图2为鼻咽癌患者放疗前后EBV-miR-BART7表达量的测定结果。

图3为血浆中EBV-miR-BART7表达量与肿瘤负荷的关系；其中3a为T1-T4阶段；3b为N0-N3阶段；3c为临床病理Ⅰ-Ⅳ期。

图4为预后价值分析图，其中A为总生存率图，B为无进展生存率图。

具体实施方式

实施例1

1、血浆中总RNA的提取

（1）准备血浆,吸480ul血浆装入2ml 的AXYGEN的RNA酶free/Clear EP管中；

（2）每管避光加入1ml TRAZOL plus，涡旋15秒，裂解静止30分钟；

（3）每管避光加入200ul的氯仿，涡旋30秒，静置30分钟，分层一半为较理想的状态；

（4）离心 15000g，25分钟，4℃，可见到标本分层3层，收集最上层澄清液（500-800ul）放在RNA酶free的1.5ml-2.0ml EP管中。

（5）按照1:1体积加入异丙醇,涡旋15s，-20℃冰箱静置过夜；

（6）从-20℃冰箱中取出，4℃离心20000g，30分钟，可见沉淀；

（7）弃上清液,倒置在滤纸上，晾干,加入1.4ml-1.8ml(看管子的大小,装接近满,1:1的量)新鲜配置的75%酒精，涡旋15s，离心 20000g，30分钟，4℃。

（8）弃上清液,倒置在滤纸上，晾干5-10分钟，没有晾干的，可用枪尖吸取管壁预留酒精，或用滤纸将EP管上半部的酒精吸干，防止酒精残留影响后面的实验。晾干的30分钟，保证酒精已经挥发干净。

（9）枪尖深入管壁底部，加入15uL的无酶水，涡旋15s，用手甩下管壁上的液体，低速（<2000g）离心数秒，可继续冰上放置10分钟左右，让RNA充分溶解，后置-80℃冰箱保存待用。

2、血浆中EBV-miR-BART7的cDNA合成

利用TaqMan® Small RNA Assays 将RNA逆转录为cDNA。

（1）Mix 反应液配置（按顺序加样）

表1 Mix 反应液表

mir-BART7-RT引物序列为：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCTGG -3’。

（2）设置反应条件

在PCR仪中按表2的反应条件进行逆转录反应。

表2 反应条件

3、探针法检测EBV-miR-BART7表达

利用TaqMan® Universal Master Mix II 检测EBV-miR-BART7表达量，按表3组分进行反应液配制。

表3 探针法检测试剂表

实施例2 检测结果分析

利用实施例1的方法检测207例健康体志愿者，12例良性疾病病人，24例非鼻咽癌病人和479例NPC患者。患者基本资料如表4所示。

表4 NPC患者基本资料表

由图1可知，在NPC的血浆中可检测到EBV-miR-BART7-3p高表达, 而健康志愿者、良性疾病者及其他肿瘤病人中无法检测到。其中以230copie/ml为血浆中EBV-miR-BART7-3p作为鼻咽癌诊断的临界值，其AUC为0.977，灵敏度为93.76%，特异度为99.59%(表5及图1B)。进行放疗治疗后，患者血浆中的EBV-miR-BART7-3p表达量基本降低至正常水平（图2）。说明EBV-miR-BART7-3p表达量可作为NPC早期筛查和诊断指标，可协助鼻咽癌的诊断。

表5. 血浆循环miR-BART7-3p的诊断性试验

分别检测NPC患者肿瘤T1-T4阶段、N0-N3阶段以及临床病理分期TNMⅠ-Ⅳ阶段的血浆中EBV-miR-BART7-3p表达量，结果如图3所示，血浆中EBV-miR-BART7-3p的表达量与鼻咽癌的肿瘤负荷相关。

实施例3 EBV-miR-BART7的预后价值

检测497例NPC患者的EBV-miR-BART7-3p表达量，以中位数3669copies/ml为临界值，生存分析发现血浆中高表达量患者的总生存（OS）和无转移生存率（DMFS）均显著低于血浆中EBV-miR-BART7-3p低表达的患者，结果见图4。

由图4可知，血浆中EBV-miR-BART7-3p高表达（>3669copies/ml）的患者，其总生存（OS）和无远处转移生存率（DMFS）显著低于低表达组（≤3669copies/ml），说明EBV-miR-BART7-3p高表达提示更差的预后，差异有统计统计学意义（p分别为0.007和<0.001 ），表明EBV-miR-BART7-3p的表达量可作为鼻咽癌诊断预后的标志物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省肿瘤医院

<120> 一种检测鼻咽癌的标志物及应用

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caucauaguc caguguccag gg 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcgcatcat agtccagtgt 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcagggtccg aggtatt 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actggatacg acccctgg 18

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacccctgg 50

Claims

1.一种生物学标志物EBV-miR-BART7在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述EBV-miR-BART7的序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种生物学标志物EBV-miR-BART7在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，该试剂盒是通过PCR技术检测生物样品中EBV-miR-BART7的表达量。

3.根据权利要求2所述的一种生物学标志物EBV-miR-BART7在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括对EBV-miR-BART7具有检测特异性的引物序列和探针，其序列如下：

上游引物为miR-BART7-F：5’- AGCGCATCATAGTCCAGTGT-3’;

下游引物为miR-BART7-R：5’- GCAGGGTCCGAGGTATT -3’;

4.根据权利要求1所述的一种生物学标志物EBV-miR-BART7在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：

（1）血浆中总RNA的提取；

（2）血浆中EBV-miR-BART7的cDNA合成；

（3）探针法检测EBV-miR-BART7表达。