CN114058705A - Mettl3作为鼻咽癌预后预测标志物及检测引物与试剂盒 - Google Patents
Mettl3作为鼻咽癌预后预测标志物及检测引物与试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开METTL3作为鼻咽癌预后预测标志物及检测引物与试剂盒，涉及鼻咽癌分子生物技术领域。本发明以METTL3作为复发鼻咽癌预后预测标志物，开发检测METTL3表达的分子引物，通过METTL3表达的分子引物检测复发鼻咽癌的METTL3表达情况，预测该类的预后情况，加强预后不良的复发NPC患者治疗后的管理或加强治疗，有望将预后不佳的复发NPC患者的2年生存期分别提高65％与55％；本发明针对复发NPC这一预后相对较差的人群，通过本试剂盒对其预后的预测，有望较大幅度的提高该类患者的2年甚至是5年生存率。
Description
技术领域
本发明涉及METTL3作为鼻咽癌预后预测标志物及检测引物与试剂盒，涉及鼻咽癌分子生物技术领域。
背景技术
鼻咽癌(NPC)是一种头颈鳞癌，在世界上具有极大的地理分布与种族异质性，以东南亚地区人类发病为主，其中中国南方发病率最高。放射治疗被推荐为初发NPC的主要治疗手段，随着放疗技术结合化疗、靶向治疗等综合治疗技术的发展，NPC的5年OS率可达50-64％，但仍有25％的患者在第一次治疗和病情好转后出现复发。对于可切除的复发NPC，抢救性鼻咽切除术的2年和5年整体生存率(OS)分别为48.6％-100.0％，38.3％-88.9％。如果实施再次放射治疗，2年和5年生存率为44.3-77.7％，27.5％-57.2％。可见相比于原发NPC，复发的患者不论接受哪种治疗模式，其预后都是欠佳的。
复发NPC的患者均接受过多次治疗(手术或放疗)，对其预后的监测其实是非常重要的。对于预后可能不良的复发NPC患者，应遵循早预防早诊断早治疗的原则，争取延长这部分患者的生存期，而目前尚未有很好的办法预测复发NPC的预后。
综上所述，针对复发NPC患者的预后的预测，现有技术中没有成熟的方法，如何及早预测出预后较差的复发NPC患者，并及早给予他们相应的检查或者治疗以提高他们的2年或5年OS，是本领域亟需解决的技术问题；本发明通过开发试剂盒，在复发NPC患者的早期治疗后进行预后预测，对预后可能较差的患者给予更频繁的复查，或者加强他们的治疗，从而较好的提高他们的2年获5年OS。
发明内容
本发明的目的在于提供以METTL3作为鼻咽癌预后预测标志物，开发METTL3分子引物序列的试剂盒，检测METTL3在复发NPC患者中的表达，对复发NPC预后预测，并作为复发NPC治疗后的管理及加强治疗的依据，提高此类患者的生存率。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
METTL3作为复发鼻咽癌预后预测标志物的应用。
进一步的，所述应用为检测复发鼻咽癌患者METTL3的表达，预判患者的预后好坏，利用qRT-PCR检测技术对复发NPC的活检样本中METTL3的表达进行定量检测，高METTL3表达者预后较低表达的患者明显更差。
本发明的另一目的在于，提供一种检测METTL3表达的分子引物在制备预测复发鼻咽癌预后产品中的应用。
进一步的，所述检测METTL3表达的分子引物为：
METTL3上游引物：5’-CGTACTACAGGATGATGGCTTTC-3’；下游引物：5’-TTTCATCTACCCGTTCATACCC-3’。
进一步的，所述预测复发鼻咽癌预后产品为METTL3检测试剂盒。
本发明的另一目的在于，提供一种预测复发鼻咽癌预后的试剂盒，所述试剂盒为上述检测METTL3表达的分子引物试剂盒。
本发明的有益效果：
本发明以METTL3作为复发鼻咽癌预后预测标志物，开发检测METTL3表达的分子引物，通过检测METTL3表达的分子引物检测复发鼻咽癌的METTL3表达情况，以预判患者的预后好坏，原理即为qrt-PCR的基本原理，检测出患者样本中MRTTL3的表达量与已建立数据库中METTL3表达量的中位数进行比较，较高者即可判定为预后可能相对欠佳者，反之则可判定为预后可能相对良好者；对于预后可能欠佳的患者，给予强度更高的治疗方案与更为严格的复查原则，以尽可能延长他们的生存期。本发明操作简单易于推广，检测利用患者活检或手术样本，无需患者受二次有创伤害；
本发明通过检测METTL3在复发NPC患者中的表达，预测该类的预后情况，加强预后不良的复发NPC患者治疗后的管理或加强治疗，有望将预后不佳的复发NPC患者的2年生存期提高65％；
本发明针对复发NPC这一预后相对较差的人群，通过本试剂盒对其预后的预测，有望较大幅度的提高该类患者的2年甚至是5年生存率。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
图1为本发明实施例所述METTL3分子引物检测复发NPC患者活检组织中表达量与患者治疗后生存期分子的K-M曲线图；
图2为本发明实施例所述siRNA沉默NPC细胞中METTLL3表达量的效果验证；
图3为本发明实施例所述用control组细胞与siRNA调低了METTL3表达量的细胞行划痕实验，24小时后的愈合情况示意图；
图4为本发明实施例所述划痕实验的统计图；
图5为本发明实施例所述Transwell侵袭实验，24小时后对比图；
图6为本发明实施例所述Transwell侵袭实验统计图；
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将结合附图对实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本发明的目的基因引物的设计是通过NCBI Blast网站在线设计，并通过电子邮件发送给生工生物工程股份有限公司合成。
检测METTL3表达的分子引物设计：
METTL3上游引物：5’-CGTACTACAGGATGATGGCTTTC-3’；下游引物：5’-TTTCATCTACCCGTTCATACCC-3’；
通过上述引物开发为试剂盒产品，在检测复发鼻咽癌患者METTL3的表达中应用。
实施例2
METTL3分子引物检测复发NPC患者活检组织中表达量，并与患者治疗后生存期分子做分析；
于中南大学湘雅医院采集24名只接受了手术治疗的复发NPC患者的样本并跟踪随访，中位生存期为16月，至目前随访生存时间最短2月最长为40月。以上患者均提取样本RNA并逆转录成cDNA，并通过实时荧光定量PCR检测基因表达量；
具体操作如下：
1)采集患者新鲜组织样本后，立即放入液氮罐中保存,随后搜集所有病人的相关临床资料所有实验用组织样本采集均获得中南大学湘雅医院伦理委员会授权和病人同意。
2)对所有患者的组织进行RNA的提取，操作均在冰上进行；①往1.5ml EP管中加入绿豆大小的组织以及100ul的Trizol,利用电动研磨杵将组织研磨至肉色匀浆后再加入900ul Trizol，并静置5分钟；②往每个样本中加入200ul的氯仿后，混合震荡30s至溶液乳化呈白色，冰上静置5分钟后，于4℃低温高速离心机中以12000g离心15分钟。③取出离心管后，匀浆已分为三层，取上层无色液体置于新的1.5mlEP管中，每管中约可加入400-500ul的无色液体。往所有样品中加入等量的400-500ul的异丙醇，上下颠倒混匀后在冰上静置10分钟，再于4℃低温高速离心机中以12000g离心10分钟。④此时离心管侧壁可见白色沉淀，弃上清后，加入现配现用的75％酒精1ml，慢慢吹起沉淀，并上下轻摇15秒后，于4℃低温高速离心机中以7500g离心5分钟。⑤弃上清后重复第④步，再弃上清，在冰上晾干。⑥分别往每个样本中加入10-30ul的无酶水溶解RNA。⑦利用NanoDrop 2000的平台分别测每份样品RNA的浓度,并做好记录。
3)用US EVERBRIGHT INC公司的RTmix with DNase的试剂盒进行RNA逆转录，配置如下体系：
逆转录PCR机上反应程序如下：37℃孵育2分钟，去除基因组污染；55℃孵育10分钟；85℃，10秒。反应结束后，-20℃保存产物备用。
4)实时荧光定量PCR测定各样本中METTL3的表达量；依据US EVERBRIGHT INC公司的Universal SYBR Green qPCR Supermix试剂盒的实验说明册操作。配置如下体系：
实时荧光定量PCR机上反应程序如下：
Bio-RadIQ5实时荧光定量PCR仪上进行上述反应完成后，与内参基因GAPDH标化，以2-△△CT值显示目标基因的相对表达量，判定METTL3的表达差异。采用unpaired t-test检验计算P值。
如图1所示，以METTL3分子引物检测复发NPC患者活检组织中表达量，并与患者治疗后生存期分子做K-M曲线图：
以METTL3分子引物检测复发NPC患者活检组织中表达量与患者治疗后生存期，利用IBM SPSS版本25.0软件做Kaplan–Meier曲线图，两组数据的差异具有统计学意义(P＝0.024)；24位复发NPC患者MRTTL3的表达情况、生存结局及随访期见下表：
实施例3
复发NPC的发生，目前更多的认为与肿瘤细胞本身的迁移与侵袭能力的提高，对治疗的抵抗有很大的关系，故我们设计了一系列的体外实验来探究METTL3对NPC细胞的影响。
1)在NPC细胞系中沉默METTL3表达效果验证；根据拼接位点设计了METTL3的SI序列，siRNA即为一类长度为21-25个核苷酸，能与同源RNA互补结合，特异性降解目的RNA，从而抑制其表达的RNA分子，其已发展成为基因功能研究的重要工具。为了研究METTL3在NPC肿瘤发生发展中的作用，我们设计了siRNA,利用invitrogen公司的LipofectamineRNAiMAX试剂将siRNA与siNC(空白对照)顺势转染到S18、HK1细胞系中沉迷METTL3的表达水平，并检测siRNA的转染效率，确认此次转染效率降低到50％以下，结果见图2(图2：用siRNA调低了NPC细胞中METTLL3的表达)；
2)体外实验沉默METTL3的表达抑制了NPC细胞的迁移；①将1000ul/200ul Tip头、直尺、移液枪、maker笔等置入超净工作台内紫外线照射消毒至少30分钟。取细胞融合度已至50％-70％的6孔细胞板转染siRNA和control-siRNA。②待细胞铺满培养皿底后第二天进行划痕，将200ul Tip头比齐直尺垂直于6孔板底干脆快速进行划痕，力度保持一致以尽可能确保划痕宽度一样。③吸除培养皿中原本的培养液，用PBS水轻轻洗涤3次，以尽可能去除细胞碎片，再加入1％双抗以及无血清的1640培基。④显微镜下拍照，并记为各组0h的划痕宽度，后将6孔板重新放入细胞培养箱中，间隔12小时取出并进行拍照。再过12小时即划痕后24小时拿出来拍照并做好记录。⑤整理所有图片，分别测量各时段划痕间距，并用Graphpad 8.4.3软件进行统计做图分析。具体结果见图3与图4，在相同时间段，划痕间距越小，即代表该组细胞的迁移能力更强。
3)体外细胞transwell侵袭实验；①提前一天将冻存于-20℃的BD Matrigel胶置于4℃冰室内融化过夜，同时将制备基质胶的Tip头与EP管等置于4℃环境预冷。②对基质胶行1：7的比例进行稀释，即20ul基质胶加入140ul 1640培基配制。将稀释好的基质胶加入已经水化好的孔径为8um的transwell小室中，每个小室加入50ul的基质胶。③将铺好基质胶的小室置入37℃恒温细胞培养箱中孵育3小时，当基质胶层为白色时表明胶体已经凝固。④将消化好并用无血清培基重悬后计数的转然后实验细胞，按每小室25000个细胞/200ul无血清或者低浓度血清培基种入。后向下室中添加800ul含10％胎牛血清的1640培基，并将上小室小心放入下室中，以免两者之间产生气泡。⑤将24孔细胞板重新放入细胞培养箱中，根据细胞的状态与侵袭速度，孵育24-48小时。⑥36小时后取出24孔板，用PBS水稍洗2遍，而后用4％多聚甲醛固定细胞15分钟，再用清水轻洗3遍。⑦将以固定的细胞的transwell小室置入装有0.1％结晶紫染剂的24孔板中，室温静置染色10分钟，再用PBS水清洗2-3遍，并用医用棉签轻轻的去除上室底部的基质胶。⑧分别往上室中加入200ul的蒸馏水，24孔板中加入800ul的蒸馏水，置于倒置显微镜下取对个视野进行拍照。⑨用image J软件对镜下照片进行计数，用Graphpad软件进行统计及做图分析。具体结果如图5及图6所示。
本发明以METTL3作为复发鼻咽癌预后预测标志物，开发检测METTL3表达的分子引物，通过检测METTL3表达的分子引物检测复发鼻咽癌的METTL3表达情况，预测该类的预后情况，加强预后不良的复发NPC患者治疗后的管理或加强治疗，有望将预后不佳的复发NPC患者的2年生存期提高65％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (6)
1.METTL3作为复发鼻咽癌预后预测标志物的应用。
2.如权利要求1所述的METTL3作为复发鼻咽癌预后预测标志物的应用，其特征在于：所述应用为检测复发鼻咽癌患者METTL3的表达，预判患者的预后好坏，利用qRT-PCR检测技术对复发NPC的活检样本中METTL3的表达进行定量检测，高METTL3表达者预后较低表达的患者明显更差。
3.一种检测METTL3表达的分子引物在制备预测复发鼻咽癌预后产品中的应用。
4.如权利要求3所述的检测METTL3表达的分子引物在制备预测复发鼻咽癌预后产品中的应用，其特征在于：所述检测METTL3表达的分子引物为：
METTL3上游引物：5’-CGTACTACAGGATGATGGCTTTC-3’；下游引物：5’-TTTCATCTACCCGTTCATACCC-3’。
5.如权利要求4所述的检测METTL3表达的分子引物在制备预测复发鼻咽癌预后产品中的应用，其特征在于：所述预测复发鼻咽癌预后产品为METTL3检测试剂盒。
6.一种预测复发鼻咽癌预后的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为上述权利要求5所述检测METTL3表达的分子引物试剂盒。
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2021
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| Title |
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| LU S等: "Gene Signatures and Prognostic Values of m6A Genes in Nasopharyngeal Carcinoma", FRONT ONCOL, vol. 10, pages 8 * |
| MENG QZ等: "METTL3 promotes the progression of nasopharyngeal carcinoma through mediating M6A modification of EZH2", EUR REV MED PHARMACOL SCI, vol. 24 * |
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