CN113755594A - 一种预测小细胞肺癌辅助化疗获益和识别化疗耐药治疗靶点的系统和应用 - Google Patents
一种预测小细胞肺癌辅助化疗获益和识别化疗耐药治疗靶点的系统和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种预测小细胞肺癌辅助化疗获益和识别化疗耐药治疗靶点的系统和应用。本发明提供了ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因作为标志物在制备预测小细胞肺癌患者预后的产品中的应用。本发明证明了m6A修饰在SCLC中的重要性，建立了预测化疗获益的预测模型，并识别出小细胞肺癌化疗耐药潜在的治疗靶点，且这些治疗靶点与耐药密切相关。对m6A调节元件抑制肿瘤生长和肿瘤化疗耐药的进一步前瞻性验证，将有助于提高临床小细胞肺癌的治疗疗效。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种预测小细胞肺癌辅助化疗获益和识别化疗耐药治疗靶点的系统和应用。
背景技术
小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)是高致死性的高级别神经内分泌肿瘤，其特点是倍增时间短、生长迅速和早期转移扩散。SCLC约占肺癌的15％，五年生存率不足7％。尽管分子靶向药物、免疫检查点抑制剂等新的治疗措施不断发展，小细胞肺癌患者的治疗策略近几十年仍未有明显的突破，化疗仍然是小细胞肺癌患者不可替代的一线治疗方案。然而，大多数小细胞肺癌患者即使对化疗敏感，但治疗后快速产生耐药。且患者病情进展迅速，极易发生转移，治疗手段有限。因此，临床亟需精准筛选适合并获益的小细胞肺癌患者的标志物，找到特定的耐药靶点，以便提高患者治疗效果，提高患者的预后。
N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)是真核生物RNA中最丰富和最普遍的RNA修饰，是癌症生物学的重要组成部分。m6A相关的生物学过程是动态、多层面、可逆的过程，主要由甲基化酶、甲基转移酶和结合蛋白介导功能的发挥。该修饰方式可以调控多种RNA相关的生物学进程，包括RNA降解、稳定、翻译、剪切和运输，最终调节靶基因的表达。m6A调节元件的异常，与转移和预后异常密切相关，但其在小细胞肺癌，尤其是化疗耐药中的调节机制和作用，目前研究尚不明确。
鉴于小细胞肺癌的高度恶性、有限的治疗措施和极高的耐药性，识别并建立小细胞肺癌的耐药治疗靶点和预后标志物意义重大。
发明内容
本发明的一个目的是提供ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因作为标志物的用途。
本发明提供了ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因作为标志物的应用，为(b1)-(b4)中的任一种：
(b1)制备预测小细胞肺癌患者预后的产品；
(b2)预测小细胞肺癌患者预后；
(b3)制备预测小细胞肺癌患者化疗获益程度的产品；
(b4)预测小细胞肺癌患者化疗获益程度。
本发明还提供了检测ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因表达量的物质的应用，为(b1)-(b4)中的任一种：
(b1)制备预测小细胞肺癌患者预后的产品；
(b2)预测小细胞肺癌患者预后；
(b3)制备预测小细胞肺癌患者化疗获益程度的产品；
(b4)预测小细胞肺癌患者化疗获益程度。
本发明还提供了检测ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因表达量的物质和数据处理装置的应用，为(b1)-(b4)中的任一种：
(b1)制备预测小细胞肺癌患者预后的产品；
(b2)预测小细胞肺癌患者预后；
(b3)制备预测小细胞肺癌患者化疗获益程度的产品；
(b4)预测小细胞肺癌患者化疗获益程度；
所述数据处理装置内设模块；所述模块具有如下(a1)和(a2)所示的功能：
(a1)以小细胞肺癌患者组成的待测群体的离体小细胞肺癌组织为标本，测定每份标本中所述ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因的表达量，然后根据7种基因表达量按照如下公式计算风险值：风险值＝(ZCCHC4表达量×0.7942)+(IGF2BP3表达量×-0.2645)+(ALKBH5表达量×-0.4484)+(YTHDF3表达量×-0.6853)+(METTL5表达量×0.4749)+(G3BP1表达量×0.246)+(RBMX表达量×0.0911)，并根据所述风险值将所述待测群体分为低风险组和高风险组；
(a2)按照如下标准确定来自于所述待测群体的待测患者的预后：
所述低风险组中的待测患者的预后高于或候选高于所述高风险组中的待测患者；
或，所述低风险组中的待测患者的预后总生存期长于或候选长于所述高风险组中的待测患者；
或，所述低风险组中的待测患者的预后总生存率高于或候选高于所述高风险组中的待测患者；
或，所述低风险组中的待测患者的预后无复发生存期长于或候选长于所述高风险组中的待测患者；
或，所述低风险组中的待测患者的预后无复发生存率高于或候选高于所述高风险组中的待测患者；
或，所述低风险组中的待测患者的化疗获益程度高于或候选高于所述高风险组中的待测患者。
上述应用中，所述检测ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因表达量的物质包括如下c1或c2：
(c1)能够分别与所述ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX蛋白或基因特异性结合的物质；在本发明的实施例，可以为ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX蛋白的抗体。
(c2)能够分别用于特异性扩增所述ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因的引物对，在本发明的实施例，可以为表5对应的引物。
本发明另一个目的是提供用于预测小细胞肺癌患者治疗疗效或预后的系统。
本发明提供的系统，包括检测ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因表达量的系统；
所述检测ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因表达量的系统包括上述检测ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因表达量的物质。
上述系统还包含上述数据处理装置。
上述系统或上述数据处理装置的应用也是本发明保护的范围，为(b1)-(b4)中的任一种：
(b1)制备预测小细胞肺癌患者预后的产品；
(b2)预测小细胞肺癌患者预后；
(b3)制备预测小细胞肺癌患者化疗获益程度的产品；
(b4)预测小细胞肺癌患者化疗获益程度。
ZCCHC4、G3BP1和/或RBMX蛋白作为靶点在开发、筛选和/或制备治疗或辅助治疗小细胞肺癌的试剂中的应用也是本发明保护的范围。
抑制或者干扰ZCCHC4、G3BP1和/或RBMX蛋白表达的物质在如下至少一种或制备具有如下至少一种功能的产品中的应用也是本发明保护的范围：
1)治疗或辅助治疗小细胞肺癌；
2)促进化疗药物治疗小细胞肺癌；
3)联合化疗药物治疗小细胞肺癌。
抑制或者干扰ZCCHC4、G3BP1和/或RBMX蛋白表达的物质和化疗药物在制备治疗或辅助治疗小细胞肺癌产品中的应用也是本发明保护的范围。
在本发明的实施例中，化疗药物以铂类药物为例，具体为顺铂。
上述应用中，所述抑制或者干扰ZCCHC4、G3BP1和/或RBMX蛋白表达的物质为抑制或者干扰ZCCHC4、G3BP1和/或RBMX蛋白表达的siRNA，或，ZCCHC4、METTL5、G3BP1和/或RBMX的抑制剂。
在本发明的实施例中，抑制或者干扰ZCCHC4蛋白表达的siRNA为表10中的ZCCHC4(human)siRNA 1或ZCCHC4(human)siRNA 2；
抑制或者干扰G3BP1蛋白表达的siRNA为表10中的G3BP1(human)siRNA_1或G3BP1(human)siRNA_2；
抑制或者干扰RBMX蛋白表达的siRNA为表10中的RBMX(human)siRNA_1或RBMX(human)siRNA_2。
本发明还有一个目的是提供一种具有治疗或辅助治疗小细胞肺癌功能的产品。
本发明提供的产品，其为如下a)或b)：
a)抑制或者干扰ZCCHC4、G3BP1和/或RBMX蛋白表达的物质；
b)抑制或者干扰ZCCHC4、G3BP1和/或RBMX蛋白表达的物质和化疗药物。
本发明证明了m6A修饰在SCLC中的重要性，建立了预测化疗获益的预测模型，并识别出小细胞肺癌化疗耐药潜在的治疗靶点，且这些治疗靶点与耐药密切相关。对m6A调节元件抑制肿瘤生长和肿瘤化疗耐药的进一步前瞻性验证，将有助于提高临床小细胞肺癌的治疗疗效。
附图说明
图1为训练队列中m6A调节元件的表达在小细胞肺癌中的Kaplan-Meier生存分析，包括(a)ZCCHC4(高表达＝29，低表达＝21)；(b)IGF2BP3(高表达＝18，低表达＝32)；(c)METTL14(高表达＝22，低表达＝28)；(d)HNRNPA2B1(高表达＝8，低表达＝42)；(e)ALKBH5(高表达＝22，低表达)表达＝28)；(f)G3BP2(高表达＝37，低表达＝13)；(g)YTHDF3(高表达＝24，低表达＝26)；(h)METTL5(高表达＝26，低表达＝24)；(i)G3BP1(高表达＝35,低表达＝15)；(j)IGF2BP1(高表达＝26,低表达＝24)；(k)PRRC2A(高表达＝37,低表达＝13)；(l)RBMX(高表达＝36,低表达＝14)；(m)METTL16(高表达＝7,低表达＝43)；(n)RBM15B(高表达＝28,低表达＝22)；(o)FMR1(高表达＝37，低表达＝13)；(p)YTHDC2(高表达＝27，低表达＝23)；(q)ZC3H13(高表达)离子＝18，低表达＝32)；(r)HNRNPC(高表达＝36，低表达＝14)；(s)KIAA1429(高表达＝24，低表达＝26)；(t)YTHDC1(高表达＝41，低表达＝9)；(u)IGF2BP2(高表达＝15，低表达＝35)；(v)YTHDF2(高表达＝9，低表达＝41)；(w)WTAP(高表达＝31，低表达＝19)；(x)EIF3A(高表达＝47、低表达＝3)；(y)RBM15(高表达＝31、低表达＝19)；(z)ELAVL1(高表达＝16、低表达＝34)；(aa)METTL3(高表达＝38、低表达＝12)；(ab)CBLL1；(ac)YTHDF1(高表达＝23、低表达＝27)和(ad)FTO(高表达＝11、低表达＝39)。
图2为训练队列中辅助化疗的SCLC患者m6A调节元件生存分析的森林图。
图3为LASSO模型来计算不同数量变量的偏似然偏差，并选择100倍交叉验证。
图4为训练队列中，预测模型相应的m6A风险值以及生存状况。
图5为训练队列中OS生存曲线。
图6为a为训练队列中预测模型的时间依赖的ROC曲线，分别为1、3和5年总生存期的的ROC曲线；b为m6A风险值和其他临床病理参数(性别、年龄、是否吸烟和分期)的C指数。
图7为训练队列中预测模型的风险值和其他临床病理参数的ROC曲线。M6A风险值：AUC＝0.935，95％CI(0.859-1.011)；性别AUC＝0.697，95％CI(0.52-0.874)、年龄AUC＝0.541，95％CI(0.345-0.729)、是否吸烟AUC＝0.54，95％CI(0.433-0.648)和分期AUC＝0.619，95％CI(0.427-0.811)。
图8为多队列的Cox分析。A为对多个队列的患者的临床病理因素和OS的m6A风险值的单因素Cox回归分析。B为对多个队列的患者的临床病理因素和OS的m6A风险值的多因素Cox回归分析。
图9为验证队列中，预测模型相应的m6A风险值以及生存状况。
图10为验证队列中OS生存曲线。
图11为验证队列中RFS生存曲线。
图12为验证队列的ROC曲线和C指数分析。a为验证队列中1、3和5年OS的ROC曲线。1年：AUC＝0.724；3年：AUC＝0.662；5年：AUC＝0.739。b为验证队列中1、3和5年OS的ROC曲线。1年：AUC＝0.5560；3年：AUC＝0.689；5年：AUC＝0.746；c为m6A风险值和其他临床病理参数(性别、年龄、是否吸烟和分期)的C指数分析。d为m6A风险值和其他临床病理参数(性别、年龄、是否吸烟和分期)的OS的ROC曲线。m6A风险值：AUC＝0.746，95％CI(0.623-0.869)；性别AUC＝0.498，95％CI(0.378-0.619)、年龄AUC＝0.562，95％CI(0.428-0.695)、是否吸烟AUC＝0.503，95％CI(0.363-0.643)和分期AUC＝0.502，95％CI(0.351-0.654)。e为验证队列5年OS的m6A风险值和其他临床病理参数(性别、年龄、是否吸烟和分期)的C指数。
图13为图8为多队列的Cox分析。A为对多个队列的患者的临床病理因素和RFS的m6A风险值的单因素Cox回归分析。B为对多个队列的患者的临床病理因素和RFS的m6A风险值的多因素Cox回归分析。
图14为独立队列中，预测模型相应的m6A风险值以及生存状况。
图15为独立队列中OS生存曲线。
图16为独立队列中RFS生存曲线。
图17为验证队列的ROC曲线和C指数分析。a为验证队列中1、3和5年OS的ROC曲线。1年：AUC＝0.721；3年：AUC＝0.630；5年：AUC＝0.766。b为验证队列中1、3和5年RFS的ROC曲线。1年：AUC＝0.729；3年：AUC＝0.682；5年：AUC＝0.754；c为m6A风险值和其他临床病理参数(性别、年龄、是否吸烟和分期)的5年OS的C-指数分析。d为m6A风险值和其他临床病理参数(性别、年龄、是否吸烟和分期)的OS的ROC曲线。年龄(AUC＝0.683,95％可信区间为0.559-0.807)、性别(AUC＝0.586,95％可信区间为0.451-0.721)、是否吸烟(AUC＝0.652,95％可信区间为0.511-0.793和肿瘤分期(AUC＝0.561,95％可信区间为0.414-0.709)，m6A风险值(AUC＝0.748,95％可信区间为0.621-0.875)。e为m6A风险值和其他临床病理参数(性别、年龄、是否吸烟和分期)的5年RFS的C-指数分析。
图18为GSE40275中的4种选定调节元件在正常肺和SCLC组织中的分布。
图19为qPCR结果显示ZCCHC4(a)、METTL5(a)、G3BP1(b)和RBMX(b)的敲低效率。
图20为G3BP1(A)、ZCCHC4(B)、METTL5(C)和RBMX(D)在顺铂作用下的细胞增殖。
图21为G3BP1(A)、ZCCHC4(B)、METTL5(C)和RBMX(D)在顺铂作用下的克隆形成。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的总生存期(Overall Survival，OS)定义为从入组至任何原因导致的死亡或末次随访时间。
下述实施例中无复发生存期(Relapse-free Survival，RFS)定义为从手术后当天开始至复发、转移或末次随访时间。
下述实施例中的总生存率定义为患者从某一特定时点开始随访，到某一特定时间尚能生存的概率。
下述实施例中的预后是指患者治疗效果，具体体现为OS和RFS的长短。
实施例1、小细胞肺癌辅助化疗疗效预测和耐药治疗靶点的应用
从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载GSE40275队列作为训练队列，用于构建小细胞肺癌预测模型；并国家癌症中心收集小细胞肺癌患者福尔马林固定石蜡包埋的FFPE组织作为验证队列和独立队列，用于模型验证。所有患者的临床特征如表1所示。
表1小细胞肺癌患者的临床特征
注：NA表示不可用
验证队列和独立队列中，小细胞肺癌患者的入选标准均如下：1)患者经过国家癌症中心诊断为小细胞肺癌；2)患者诊疗信息完善；3)患者术前未接受新辅助治疗；4)患者病理组织经过2位临床病理医师的独立评估，均确认为小细胞肺癌；5)患者预后信息完善。
辅助化疗以铂类药物为基础。
一、小细胞肺癌患者辅助化疗预后标志物的建立
1、m6A各调节元件对小细胞肺癌接受辅助化疗患者的预后汇总
(1)m6A各调节元件汇总
用已发表文献中((1).Li Y,Xiao J,Bai J,Tian Y,Qu Y,Chen X,Wang Q,Li X,Zhang Y,and Xu J,Molecular characterization and clinical relevance of m(6)Aregulators across 33 cancer types.Mol Cancer,2019.18(1):137.(2).Liu J,HaradaBT,and He C,Regulation of Gene Expression by N(6)-methyladenosine inCancer.Trends Cell Biol,2019.29(6):487-499.(3).Huang H,Weng H,and Chen J,m(6)A Modification in Coding and Non-coding RNAs:Roles and TherapeuticImplications in Cancer.Cancer Cell,2020.37(3):270-288.(4).Nombela P,Miguel-López B,and Blanco S,The role of m(6)A,m(5)CandΨRNA modifications in cancer:Novel therapeutic opportunities.Mol Cancer,2021.20(1):18.)，总结了30个m6A的调节元件，包括11个Writer调节元件(METTL3,METTL14,METTL16,METTL5,WTAP,VIRMA,RBM15,RBM15B,ZC3H13,CBLL1,和ZCCHC4),2个Eraser调节元件(FTO和ALKBH5),以及17各Reader调节元件(YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3,YTHDC1,YTHDC2,HNRNPA2B1,HNRNPC,FMR1,EIF3A,IGF2BP1,IGF2BP2,IGF2BP3,ELAVL1,G3BP1,G3BP2,PRRC2A和RBMX)。
(2)各调节元件对患者预后的作用
通过R语言软件的“survminer”软件包的“surv_cutpoint”确定各调节元件的阈值，具体方法如下：将待预测m6A调节元件的表达值与匹配的预后信息，输入至R语言软件中，在“survminer”软件包的“surv_cutpoint”的算法下，软件会自动计算出P值最小的分割点，该分割点即为高风险组和低风险组的阈值(最优cutoff点)(详见表2)。
表2训练集中30个m6A调节元件的阈值
将30个m6A调节元件分别对接受辅助化疗的SCLC患者预后进行生存分析，结果显示，一半的调节元件(15/30)与患者预后明显相关，提示m6A调节元件与化疗患者预后关系密切(详见图1，图2)。
(3)为了建立小细胞肺癌患者m6A分子的治疗疗效及预后预测模型，采用单因素Cox比例回归模型，研究m6A相关基因对总生存期(OS)预后指标的影响
为了使预后模型更加优化和实用，采用逐步Cox比例风险回归模型，最终构建出一个包括如下7个基因的预测预后模型：ZCCHC4的Gene Bank号为NM_001318148.2(Update:24-JAN-2020)、IGF2BP3的Gene Bank号为NM_006547.3(Update:5-Sep-2021)、ALKBH5的Gene Bank号为NM_017758.4(Update:22-Aug-2021)、YTHDF3的Gene Bank号为NM_001277813.2(Update:5-Sep-2021)、METTL5的Gene Bank号为NM_001293186.2(Update:11-Sep-2021)、G3BP1的Gene Bank号为NM_005754.3(Update:19-Sep-2021)和RBMX的GeneBank号为NM_001164803.2(Update:5-Sep-2021)。
(4)根据每个患者目的基因的表达量，通过LASSO分析，得出如下公式用于计算每个患者的风险值(图3，下图中曲线从上到下与旁边基因从上到下的顺序一致)：
m6A风险值＝(ZCCHC4表达量×0.7942)+(IGF2BP3表达量×-0.2645)+(ALKBH5表达量×-0.4484)+(YTHDF3表达量×-0.6853)+(METTL5表达量×0.4749)+(G3BP1表达量×0.246)+(RBMX表达量×0.0911)。
2、小细胞肺癌m6A预测模型的预后效用验证
(1)通过R语言软件的“survminer”软件包的“surv_cutpoint”确定阈值，具体方法如下：将待预测小细胞肺癌患者的风险值与匹配的预后信息，输入至R语言软件中，在“survminer”软件包的“surv_cutpoint”的算法下，软件会自动计算出P值最小的分割点，该分割点即为高风险组和低风险组的阈值(最优cutoff点)。
结果显示，训练队列中，计算出的阈值为-0.3661，患者风险值大于等于-0.3661的为高风险组(n＝31)，患者风险值小于-0.3661的为低风险组(n＝19)(图4)。
(2)采用Kaplan-Meier生存分析法分析训练队列的高风险组和低风险组患者的总生存率OS差异
利用Kaplan-Meier分析上述(1)得到的高风险组和低风险组的风险值和生存数据。Kaplan-Meier生存分析结果显示，训练队列中高风险组患者的OS比低分患者短(P<0.001)(图5)。
(3)预测模型的ROC分析
将训练队列患者的1年、3年和5年预后与预测模型进行ROC检验，结果显示，该预测模型对患者多时间段的预后均具有很好的预测价值，具体的，1年：AUC＝0.728；2年：AUC＝0.917；5年：AUC＝0.935(图6a)。
(4)不同临床亚组中预测模型的应用
在训练队列不同的临床亚组(性别、是否吸烟)中，预测模型效用也得到了很好的验证。
对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行OS的多因素Cox分析，结果显示预测模型对OS的预测能力最好(图6b)。ROC曲线结果也证实，与患者年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期等比较，预测模型预测能力最好(图7)。具体的，m6A风险值：AUC＝0.935，95％CI(0.859-1.011)；性别AUC＝0.697，95％CI(0.52-0.874)、年龄AUC＝0.541，95％CI(0.345-0.729)、是否吸烟AUC＝0.54，95％CI(0.433-0.648)和分期AUC＝0.619，95％CI(0.427-0.811)。
(7)预测模型对不同临床亚组的Cox分析
1)OS单因素Cox分析
对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行OS的单因素Cox分析，结果显示，相比于性别(P＝0.049)、年龄(P＝0.929)、是否吸烟(P＝0.939)和肿瘤分期(P＝0.006)，预测模型对OS的预测能力最好(P<0.001)。(图8A)
2)OS多因素Cox分析
对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行OS的多因素Cox分析，结果显示，相比于性别(P＝0.168)、年龄(P＝0.595)、是否吸烟(P＝0.222)和肿瘤分期(P＝0.024)，预测模型对OS的预测能力最好(P<0.001)。(图8B)
因此，可以采用m6A风险值对小细胞肺癌预后预测，具体如下：
检测术前小细胞肺癌患者基线肿瘤组织中ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX的表达量，根据下面公式计算每个患者的m6A风险值：
m6A风险值＝(ZCCHC4表达量×0.7942)+(IGF2BP3表达量×-0.2645)+(ALKBH5表达量×-0.4484)+(YTHDF3表达量×-0.6853)+(METTL5表达量×0.4749)+(G3BP1表达量×0.246)+(RBMX表达量×0.0911)。
再进行如下判断：
m6A风险值低的患者的预后好于或候选好于m6A风险值高的患者。
或，m6A风险值低的患者的总生存期长于或候选长于m6A风险值高的患者。
或，在相同随访时间内，m6A风险值低的患者的总生存率大于或候选大于m6A风险值高的患者。
二、对小细胞肺癌患者辅助化疗预后标志物的验证
为了验证预测模型的可重复性和效果，用验证队列和独立队列对预测模型的有效性进行验证
1、验证队列对预测模型进行验证
收集70例接受辅助化疗的患者的FFPE组织作为验证队列，提取组织样本的RNA，通过PCR检测基因的表达量。
具体检测方法如下：
1)组织样本处理
a.取新鲜的术前小细胞肺癌患者肿瘤组织，各100mg，放入2mL无酶EP管中，加入1mL RNAiso Plus(中国大连宝生物(TaKaRa)公司)；
b.加4粒灭菌后的钢珠，放入高速低温组织研磨仪，参数设置为50Hz，匀浆处理5min，去除组织匀浆液；
c.用4℃离心机，用12000rpm/min离心10min，吸取上清液加入新的EP管中，置于冰上。
2)RNA浓度测定
a.打开NanoDrop，选择RNA检测模式，用1μL无酶水清洗探头3次，吸水纸擦干；
b.用1μL无酶水，校准仪器，调零；
c.加1μL待测样品至探头，检测RNA浓度，检测完毕后，用吸水纸擦干；
d.重复上一步骤，至所有样品检测完成；
e.用无酶水清洗探头3次。
3)RNA质控
通过NanoDrop检测的RNA浓度，同时观察以下两个值：
a.A260/A280比值：为RNA浓度与蛋白浓度的比值，1.8-2.0间表示质控合格；
b.A260/A230比值：为RNA浓度与共提取污染的比值，1.8-2.2间表示质控合格。
4)反转录
用cDNA反转录试剂盒(中国大连宝生物(TaKaRa)公司)，具体如下：
a.去除基因组DNA：体系详见表3.
表3去除基因组DNA体系
在冰上进行配置反应体系，混匀并短暂离心，42℃反应2min。
b.反转录反应：体系详见表4。
表4反转录体系
将反应体系短暂离心并放置于PCR仪中，程序为37℃，15min，85℃反应5s，获得cDNA。
4)PCR扩增
采用SYBR Green试剂(中国大连宝生物(TaKaRa)公司)，通过循环阈值(Cyclethreshold valve,Ct)和标准曲线对起始模板进行定量分析。所需要的基因特异性引物均由捷瑞科技有限公司合成，检测各个目的基因和GAPDH基因的引物序列如表5所示。
以cDNA为模板，每个基因表达的检测需要设置三个复孔，其反应体系如下(表6)：
表5目的基因引物序列
上表从左到右从上到下序列依次为序列1-序列16。
表6 PCR扩增体系
按照上述体系进行配置，并在冰上避光加入到PCR仪器专用的八联排离心管中，涡旋混匀。注意轻弹无气泡后离心。
在ABI 7900HT荧光定量PCR仪中，设置反应条件如下：95℃ 10min；95℃ 10s，60℃10s，72℃ 10s，共40个循环，溶解曲线。以GAPDH作为内参，按公式ΔCt＝Ct目的基因-CtGAPDH进行数据分析，Folds＝2-ΔΔCt公式计算目的基因的相对表达量。
(2)按照步骤一中1(4)的方法分别对验证队列的患者的7个基因的相对表达量，计算风险值。
(3)预测模型对验证队列OS的预后预测
1)按照步骤一中的2(1)方法，确定OS阈值。结果确定阈值为-2.3895，根据阈值，将患者分为高风险组和低风险组，患者风险值大于等于-2.3895的为高风险组(n＝41)，患者风险值小于-2.3895的为低风险组(n＝30)(图9)。
2)采用Kaplan-Meier生存分析法分析高风险组和低风险组患者的总生存率OS差异
利用Kaplan-Meier分析上述(1)得到的高风险组和低风险组的风险值和生存数据。Kaplan-Meier生存分析OS,结果显示，验证队列中高风险组患者的OS比低分患者短(P<0.001)(图10)。
(4)预测模型对验证队列RFS的预后预测
1)按照步骤一中的2(1)方法，确定RFS阈值。结果确定阈值为-2.3895，根据阈值，将患者分为高风险组和低风险组，患者风险值大于等于-2.3895的为高风险组(n＝41)，患者风险值小于-2.3895的为低风险组(n＝30)。
2)采用Kaplan-Meier生存分析法分析高风险组和低风险组患者的总生存率RFS差异
利用Kaplan-Meier分析上述(1)得到的高风险组和低风险组的风险值和生存数据。Kaplan-Meier生存分析RFS,结果显示，验证队列中高风险组患者的RFS比低分患者短(P<0.001)(图11)。
(5)预测模型的ROC分析
1)OS的ROC分析
将验证队列患者的1年、3年和5年OS与预测模型进行ROC检验，结果显示，该预测模型对患者多时间段的预后均具有很好的预测价值，具体的，1年：AUC＝0.724；3年：AUC＝0.662；5年：AUC＝0.739(图12a)。
2)RFS的ROC分析
将验证队列患者的1年、3年和5年RFS与预测模型进行ROC检验，结果显示，该预测模型对患者多时间段的预后均具有很好的预测价值，具体的，1年：AUC＝0.5560；3年：AUC＝0.689；5年：AUC＝0.746(图12b)。
(6)不同临床亚组中预测模型的应用
在不同的临床亚组(性别、是否吸烟)中，预测模型效用也得到了很好的验证。
1)、对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行OS的C-指数分析，结果显示预测模型对OS的预测能力最好(图12c)。
2)将验证队列5年OS的预测模型与常用临床参数进行ROC检验，结果显示，与年龄(AUC＝0.562,95％可信区间为0.428-0.695)、性别(AUC＝0.498,95％可信区间为0.378-0.619)、是否吸烟(AUC＝0.503,95％可信区间为0.363-0.643)和肿瘤分期(AUC＝0.502,95％可信区间为0.351-0.654)相比，预测模型的风险值效果最好(AUC＝0.746,95％可信区间为0.623-0.869)(图12d)。
3)对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行5年OS的C-指数分析，结果显示预测模型对OS的预测能力最好(P<0.001)(图12e)。
(7)预测模型对不同临床亚组的Cox分析
1)OS单因素Cox分析
对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行OS的单因素Cox分析，结果显示，相比于性别(P＝0.243)、年龄(P＝0.865)、是否吸烟(P＝0.240)和肿瘤分期(P＝0.123)，预测模型对OS的预测能力最好(P<0.001)(图8A)。
2)OS多因素Cox分析
对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行OS的多因素Cox分析，结果显示，相比于性别(P＝0.685)、年龄(P＝0.930)、是否吸烟(P＝0.214)和肿瘤分期(P＝0.557)，预测模型对OS的预测能力最好(P<0.001)(图8B)。
3)RFS单因素Cox分析
对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行OS的单因素Cox分析，结果显示，相比于性别(P＝0.828)、年龄(P＝0.464)、是否吸烟(P＝0.795)和肿瘤分期(P＝0.084)，预测模型对RFS的预测能力最好(P＝P<0.001)(图13A)。
4)RFS多因素Cox分析
对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行OS的多因素Cox分析，结果显示，相比于性别(P＝0.842)、年龄(P＝0.843)、是否吸烟(P＝0.794)和肿瘤分期(P＝0.267)，预测模型对RFS的预测能力最好(P<0.001)(图13B)。
因此，上述可以看出，m6A风险值低的患者的预后好于或候选好于m6A风险值高的患者。
或，m6A风险值低的患者的总生存期长于或候选长于m6A风险值高的患者。
或，在相同随访时间内，m6A风险值低的患者的总生存率大于或候选大于m6A风险值高的患者。
或，m6A风险值低的患者的无复发生存期长于或候选长于m6A风险值高的患者。
或，在相同随访时间内，m6A风险值低的患者的无复发生存率大于或候选大于m6A风险值高的患者。
2、独立队列对预测模型进行验证
收集79例接受辅助化疗的患者的FFPE组织作为验证队列，切取样本切片，通过免疫组化检测基因的蛋白表达量。
(1)免疫组化
研究免疫组化使用的DAB染色液购买自中杉金桥公司，实验步骤参考DAB染色液说明书，具体如下：
1)石蜡切片脱蜡和水化：石蜡切片染色前置于60℃烘烤2小时，取出冷却至室温。按照如下顺序进行脱蜡和水化处理。(见表7)
表7石蜡切片脱蜡和水化顺序
| 顺序 | 实验内容 | 时长 | 重复次数 |
| 1 | 二甲苯浸泡脱蜡 | 10min | 3 |
| 2 | 无水乙醇浸泡 | 1min | 3 |
| 3 | 95％乙醇浸泡 | 1min | 1 |
| 4 | 85％乙醇浸泡 | 1min | 1 |
| 5 | 75％乙醇浸泡 | 1min | 1 |
| 6 | 去离子水浸泡 | 1min | 3 |
2)抗原修复：将枸橼酸钠缓冲液放入微波炉中高火加热6min，后将切片放入缓冲液中，在放入微波炉中加热90s，拿出冷却至室温。在摇床上，用PBS浸洗3次，每次3分钟。
3)阻断内源性过氧化物酶：待玻片表面干燥后，向组织上滴加3％H2O2，室温避光孵育10-15min。PBS浸洗3次，每次2min。
4)血清封闭：用免疫组化笔圈出组织区域，在圈内滴加山羊血清，37℃孵育30min。
5)孵育一抗：去除血请，滴加稀释好的一抗(详见表8)，37℃孵育2小时。后PBS浸洗3次，每次2min。
表8各一抗详细情况
| 名称 | 公司 | 货号 | 稀释倍数 |
| ZCCHC4 | Abcam | ab154002 | 1:100 |
| IGF2BP3 | Abcam | ab273131 | 1:100 |
| ALKBH5 | Abcam | ab195377 | 1:2000 |
| YTHDF3 | Abcam | ab220161 | 1:200 |
| METTL5 | Novus | NBP1-56640 | 1:300 |
| G3BP1 | Abcam | ab181150 | 1:200 |
| RBMX | Abcam | ab190352 | 1:500 |
6)滴加适量反应增强剂，室温下孵育20min，后PBS浸洗3次，每次3min。
7)滴加适量辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室温孵育20～30min，后PBS浸洗3次，每次2min。
8)显色：滴加适量配置好的DAB显色剂，室温显色反应30s-5min。显微镜下观察染色情况，染色满意后，自来水冲洗停止染色。
9)复染：用苏木精染液复染10-30s，后用1％盐酸分化15s，最后用自来水冲洗返蓝。
10)脱水：按照如下顺序使用不同浓度乙醇溶液对肿瘤组织进行脱水处理：(见表9)表9脱水顺序
| 顺序 | 乙醇溶液浓度 | 时长 |
| 1 | 80％的乙醇 | 2min |
| 2 | 95％的乙醇 | 2min |
| 5 | 无水乙醇 | 2min |
| 6 | 更换新的无水乙醇 | 2min |
11)透明:将脱水后的切片浸入到二甲苯中，室温静置5分钟。
12)封片：染色好的玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免产生气泡，完成染色的封片，接在显微镜下读片。
(2)风险值评分
将上步所得结果进行H-score评分，该H-score评分代表基因的表达量。
具体为：使用PANNORAMIC全景切片扫描仪将组织切片上机后切片会在扫描仪的镜头下逐步移动，一边移动一边成像进而将组织切片上所有的组织信息都扫描成像出来形成一个文件夹，该文件夹包含了组织切片上所有的组织信息。文件夹用CaseViewer2.4软件打开后可以1-400倍任意倍数放大后进行观察。使用Quant Center2.1分析软件中TMA插件设置好芯片组织点直径大小和行列数，软件会自动生成编号。使用Quant Center2.1分析软件中Densito quant模块分别定量每张芯片每个点的目的区域的H-Score(H-SCORE＝∑(PI×I)＝(弱阳性细胞百分比×1)+(中等阳性细胞百分比×2)+(强阳性细胞百分比×3)。公式中PI表示阳性信号像素面积占比；I代表着色强度。
按照步骤一中1(4)方法分别根据独立队列患者7个基因的表达量计算风险值。
(3)预测模型对独立队列OS的预后预测
1)按照步骤一中的2(1)方法，确定OS阈值。结果确定阈值为-0.0373，根据阈值，将患者分为高风险组和低风险组，患者风险值大于等于-0.0373的为高风险组(n＝44)，患者风险值小于-0.0373的为低风险组(n＝35)(图14)。
2)采用Kaplan-Meier生存分析法分析高风险组和低风险组患者的总生存率OS差异
利用Kaplan-Meier分析上述(1)得到的高风险组和低风险组的风险值和生存数据。Kaplan-Meier生存分析OS,结果显示，独立队列中高风险组患者的OS比低分患者短(P<0.001)(图15)。
(4)预测模型对验证队列RFS的预后预测
1)按照步骤一中的2(1)方法，确定RFS阈值。结果确定阈值为-0.0373，根据阈值，将患者分为高风险组和低风险组，患者风险值大于等于-0.0373的为高风险组(n＝44)，患者风险值小于-0.0373的为低风险组(n＝35)。
2)采用Kaplan-Meier生存分析法分析高风险组和低风险组患者的总生存率RFS差异
利用Kaplan-Meier分析上述(1)得到的高风险组和低风险组的风险值和生存数据。Kaplan-Meier生存分析RFS,结果显示，验证队列中高风险组患者的RFS比低分患者短(P<0.001)(图16)。
(5)预测模型的ROC分析
1)OS的ROC分析
将独立队列患者的1年、3年和5年OS与预测模型进行ROC检验，结果显示，该预测模型对患者多时间段的预后均具有很好的预测价值，具体的，1年：AUC＝0.721；3年：AUC＝0.630；5年：AUC＝0.766(图17a)。
2)RFS的ROC分析
将独立队列患者的1年、3年和5年RFS与预测模型进行ROC检验，结果显示，该预测模型对患者多时间段的预后均具有很好的预测价值，具体的，1年：AUC＝0.729；3年：AUC＝0.682；5年：AUC＝0.754(图17b)。
(6)不同临床亚组中预测模型的应用
在不同的临床亚组(性别、是否吸烟)中，预测模型效用也得到了很好的验证。
1)将验证队列5年OS的预测模型与常用临床参数进行ROC检验，结果显示，与年龄(AUC＝0.683,95％可信区间为0.559-0.807)、性别(AUC＝0.586,95％可信区间为0.451-0.721)、是否吸烟(AUC＝0.652,95％可信区间为0.511-0.793)和肿瘤分期(AUC＝0.561,95％可信区间为0.414-0.709)相比，预测模型的风险值效果最好(AUC＝0.748,95％可信区间为0.621-0.875)(图17d)。
2)对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行5年OS的C-指数分析，结果显示预测模型对OS的预测能力最好。(图17c)
3)对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行5年RFS的C-指数分析，结果显示预测模型对RFS的预测能力最好(图17e)。
(7)预测模型对不同临床亚组的Cox分析
1)OS单因素Cox分析
对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行OS的单因素Cox分析，结果显示，相比于性别(P＝0.553)、年龄(P＝0.004)、是否吸烟(P＝0.050)和肿瘤分期(P＝0.807)，预测模型对OS的预测能力最好(P＝0.002)(图8A)。
2)OS多因素Cox分析
对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行OS的多因素Cox分析，结果显示，相比于性别(P＝0.092)、年龄(P<0.001)、是否吸烟(P＝0.055)和肿瘤分期(P＝0.964)，预测模型对OS的预测能力最好(P<0.001)(图8B)。
3)RFS单因素Cox分析
对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行OS的单因素Cox分析，结果显示，相比于性别(P＝0.230)、年龄(P＝0.031)、是否吸烟(P＝0.010)和肿瘤分期(P＝0.618)，预测模型对OS的预测能力最好(P＝P<0.001)(图13A)。
4)RFS多因素Cox分析
对临床常用的病理参数，年龄、性别、是否吸烟和肿瘤分期与预测模型同时进行OS的多因素Cox分析，结果显示，相比于性别(P＝0.129)、年龄(P＝0.017)、是否吸烟(P＝0.020)和肿瘤分期(P＝0.309)，预测模型对OS的预测能力最好(P<0.001)(图13B)。
实施例2、小细胞肺癌患者辅助化疗耐药靶点的识别
选取实施例1中预测模型中系数>1的基因—ZCCHC4,METTL5,G3BP1和RBMX—探究其在化疗耐药中的作用机制，并识别其中化疗耐药的靶点基因。
1、候选基因在小细胞肺癌中的表达
将候选基因在小细胞肺癌组织和正常组织中的表达进行比较，结果显示，所有候选基因在肿瘤组织中均呈现高表达(P<0.001)。(图18)
2、对候选基因表达进行敲降
用细胞瞬时转染技术对候选基因进行敲降，具体如下：
siRNA转染试剂采用life technologiesTM的Lipofectamine RNAiMAX试剂。靶向ZCCHC4,METTL5,G3BP1和RBMX基因的siRNA分别为siZCCHC4,siMETTL5,siG3BP1和siRBMX基因的siRNA。具体如表10所示。
表10、siRNA序列
上表从上到下的序列依次为序列17-序列34。
具体操作步骤如下，以1孔为例：
(1)细胞准备：将待转染的细胞NCIH446(购自ATCC细胞库)，提前铺到六孔板中，待细胞汇合度达70％-80％，此时细胞处于对数生长期，进行转染；
(2)配制转染体系：
a.稀释Lipofectamine RNAi MAX Reagent：150μL Opti-MEM培养基中加入9μLLipofectamine RNAi MAX Reagent，轻柔吹打混匀，静置5min；
b.稀释siRNA：150μL Opti-MEM培养基中加入6μg siRNA(由合生基因公司合成，合成序列见表10)，轻柔吹打混匀；
c.将稀释好的siRNA与稀释Lipofectamine RNAi MAX Reagent以1：1混合成转染体系，静置15min；
d.将配制好的转染体系加入6孔板中，用完全培养基补至2mL/孔。轻柔混匀培养基，放入37℃孵箱中培养；
(3)转染效率验证
培养24h后提取RNA，用qPCR进行siRNA转染效率的验证。检测引物为表11所示。
结果如图19，各个基因si_1表示siRNA_1敲除，各个基因si_2表示siRNA_2敲除，各个基因si_NC表示NC敲除，结果显示候选基因都被成功敲降。
3、检测候选基因敲降细胞系在顺铂作用下的增殖
供试细胞：步骤2获得的瞬转细胞系(均以siRNA1敲除得到的细胞为例)。
本实验采用同仁化学研究CCK8检测试剂盒，具体步骤如下：
(1)在细胞融合度达到80％时，进行消化、重悬和细胞计数。将细胞铺于96孔板中，每孔1000个细胞。每个处理组设置六个复孔。
(2)待细胞贴壁后每孔加入顺铂(10uM)作用24h，按照0、24、48、72和96h时间点进行测定。0h即顺铂去除后换正常培养基开始，依次类推，每个时间点单独铺一个96孔板；
(3)在每个时间点检测细胞的增殖活性，换含10％CCK8试剂的培养基，37℃孵育2h，使用酶标仪在波长450nm处检测OD值；
(3)根据样品的吸光度进行统计分析并绘制增殖曲线，吸光度值可反应细胞的增殖活性。
结果显示，ZCCHC4,G3BP1和RBMX敲降后细胞，在顺铂作用下，细胞的增殖效率明显降低(P<0.001)，但METTL5敲降后，顺铂作用下，细胞的增殖效率改变无统计学意义(P>0.05)(图20)，表明抑制ZCCHC4,G3BP1和RBMX的表达可以促进顺铂抑制小细胞肺癌的增殖。
4、检测候选基因敲降细胞系在顺铂作用下的克隆形成
供试细胞：步骤2获得的瞬转细胞系(均以siRNA1敲除得到的细胞为例)。
(1)将细胞接种于培养皿内，过夜培养使其贴壁；
(2)待细胞贴壁后每孔加入顺铂(10uM)作用24h，后换成正常培养基，继续培养24h。
(3)24h后，将细胞进行消化、离心、重悬，每孔加入500个细胞，充分混匀后放入培养箱，培养7-10天。待细胞形成明显的单克隆后，弃上清，用PBS洗后，后用4％多聚甲醛固定，结晶紫染色，PBS洗净。晾干，进行计数和观察。
结果显示，ZCCHC4,G3BP1和RBMX敲降后，顺铂作用下，细胞的克隆形成数量效率明显减少(P<0.001)，但METTL5敲降后，顺铂作用下，细胞的克隆形成数量改变无统计学意义(P>0.05)(图21)，表明抑制ZCCHC4,G3BP1,和RBMX的表达可以促进顺铂抑制小细胞肺癌细胞的克隆形成。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院肿瘤医院
<120> 一种预测小细胞肺癌辅助化疗获益和识别化疗耐药治疗靶点的系统和应用
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (10)
1.ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因作为标志物的应用，为(b1)-(b4)中的任一种：
(b1)制备预测小细胞肺癌患者预后的产品；
(b2)预测小细胞肺癌患者预后；
(b3)制备预测小细胞肺癌患者化疗获益程度的产品；
(b4)预测小细胞肺癌患者化疗获益程度。
2.检测ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因表达量的物质的应用，为(b1)-(b4)中的任一种：
(b1)制备预测小细胞肺癌患者预后的产品；
(b2)预测小细胞肺癌患者预后；
(b3)制备预测小细胞肺癌患者化疗获益程度的产品；
(b4)预测小细胞肺癌患者化疗获益程度。
3.检测ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因表达量的物质和数据处理装置的应用，为(b1)-(b4)中的任一种：
(b1)制备预测小细胞肺癌患者预后的产品；
(b2)预测小细胞肺癌患者预后；
(b3)制备预测小细胞肺癌患者化疗获益程度的产品；
(b4)预测小细胞肺癌患者化疗获益程度；
所述数据处理装置内设模块；所述模块具有如下(a1)和(a2)所示的功能：
(a1)以小细胞肺癌患者组成的待测群体的离体小细胞肺癌组织为标本，测定每份标本中所述ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因的表达量，然后根据7种基因表达量按照如下公式计算风险值：风险值＝(ZCCHC4表达量×0.7942)+(IGF2BP3表达量×-0.2645)+(ALKBH5表达量×-0.4484)+(YTHDF3表达量×-0.6853)+(METTL5表达量×0.4749)+(G3BP1表达量×0.246)+(RBMX表达量×0.0911)，并根据所述风险值将所述待测群体分为低风险组和高风险组；
(a2)按照如下标准确定来自于所述待测群体的待测患者的预后：
所述低风险组中的待测患者的预后高于或候选高于所述高风险组中的待测患者；
或，所述低风险组中的待测患者的预后总生存期长于或候选长于所述高风险组中的待测患者；
或，所述低风险组中的待测患者的预后总生存率高于或候选高于所述高风险组中的待测患者；
或，所述低风险组中的待测患者的预后无复发生存期长于或候选长于所述高风险组中的待测患者；
或，所述低风险组中的待测患者的预后无复发生存率高于或候选高于所述高风险组中的待测患者；
或，所述低风险组中的待测患者的化疗获益程度高于或候选高于所述高风险组中的待测患者。
4.用于预测小细胞肺癌患者治疗疗效或预后的系统，包括检测ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因表达量的系统；
所述检测ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因表达量的系统包括权利要求1-3中任一所述的应用中的检测ZCCHC4、IGF2BP3、ALKBH5、YTHDF3、METTL5、G3BP1和RBMX基因表达量的物质。
5.如权利要求4所述的系统，其特征在于：所述系统还包含权利要求3所述的应用中所述数据处理装置。
6.权利要求4或5所述的系统或权利要求3-5任一中的所述数据处理装置的应用，为(b1)-(b4)中的任一种：
(b1)制备预测小细胞肺癌患者预后的产品；
(b2)预测小细胞肺癌患者预后；
(b3)制备预测小细胞肺癌患者化疗获益程度的产品；
(b4)预测小细胞肺癌患者化疗获益程度。
7.ZCCHC4、G3BP1和/或RBMX蛋白作为靶点在开发、筛选和/或制备治疗或辅助治疗小细胞肺癌的试剂中的应用。
8.抑制或者干扰ZCCHC4、G3BP1和/或RBMX蛋白表达的物质在如下至少一种或制备具有如下至少一种功能的产品中的应用：
1)治疗或辅助治疗小细胞肺癌；
2)促进化疗药物治疗小细胞肺癌；
3)联合化疗药物治疗小细胞肺癌。
9.抑制或者干扰ZCCHC4、G3BP1和/或RBMX蛋白表达的物质和化疗药物在制备治疗或辅助治疗小细胞肺癌产品中的应用。
10.一种具有治疗或辅助治疗小细胞肺癌功能的产品，其为如下a)或b)：
a)抑制或者干扰ZCCHC4、G3BP1和/或RBMX蛋白表达的物质；
b)抑制或者干扰ZCCHC4、G3BP1和/或RBMX蛋白表达的物质和化疗药物。
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