CN113599524A

CN113599524A - Hnrnpc和rbmx作为靶点在制备治疗小细胞肺癌的产品中的应用

Info

Publication number: CN113599524A
Application number: CN202111026143.6A
Authority: CN
Inventors: 赫捷; 孙楠; 张志慧; 张超奇; 张国超
Original assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date: 2021-09-02
Filing date: 2021-09-02
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2041-09-02
Also published as: CN113599524B

Abstract

本发明公开了HNRNPC和RBMX作为靶点在制备治疗小细胞肺癌的产品中的应用。本发明提供了HNRNPC和RBMX作为靶点在治疗小细胞肺癌、抑制小细胞肺癌细胞增殖和/或迁移、促进小细胞肺癌细胞凋亡、抑制小细胞肺癌转移中的应用。本发明有助于推进小细胞肺癌患者转移和治疗的精准预测和个体化综合治疗。本发明具有重要的应用价值。

Description

HNRNPC和RBMX作为靶点在制备治疗小细胞肺癌的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及HNRNPC和RBMX作为靶点在制备治疗小细胞肺癌的产品中的应用。

背景技术

小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)是高致死性的高级别神经内分泌肿瘤，其特点是倍增时间短、生长迅速和早期转移扩散。SCLC约占肺癌的15％，五年生存率不足7％。尽管分子靶向药物、免疫检查点抑制剂等新的治疗措施不断发展，小细胞肺癌患者的治疗策略近几十年仍未有明显的突破。大多数小细胞肺癌患者即使对化疗敏感，但治疗后快速产生耐药。且患者病情进展迅速，极易发生转移，治疗手段有限。因此，临床亟需精准筛选适合并获益的小细胞肺癌患者的标志物，找特定治疗靶点，以便为小细胞肺癌患者的不同亚群设计最合适的管理方案，提高患者的预后。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)是真核生物RNA中最丰富和最普遍的RNA修饰，是癌症生物学的重要组成部分。m6A相关的生物学过程是动态、多层面、可逆的过程，主要由甲基化酶、甲基转移酶和结合蛋白介导功能的发挥。该修饰方式可以调控多种RNA相关的生物学进程，包括RNA降解、稳定、翻译、剪切和运输，最终调节靶基因的表达。m6A调节元件的异常，与转移和预后异常密切相关，但其在小细胞肺癌中的调节机制和作用，目前研究寥寥无几。

鉴于小细胞肺癌的高度恶性、有限的治疗措施，识别并建立小细胞肺癌治疗靶点意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种HNRNPC和RBMX作为靶点在制备治疗小细胞肺癌的产品中的应用。

第一方面，本发明要求保护HNRNPC和RBMX作为靶点在如下任一中的应用：

(A1)制备用于治疗小细胞肺癌的产品，或治疗小细胞肺癌；

(A2)制备用于抑制小细胞肺癌细胞增殖和/或迁移的产品，或抑制小细胞肺癌细胞增殖和/或迁移；

(A3)制备用于促进小细胞肺癌细胞凋亡的产品，或促进小细胞肺癌细胞凋亡；

(A4)制备用于抑制小细胞肺癌转移的产品，或抑制小细胞肺癌转移。

第二方面，本发明要求保护用于降低HNRNPC和RBMX表达量的物质在如下任一中的应用：

(A1)制备用于治疗小细胞肺癌的产品，或治疗小细胞肺癌；

在第一方面和第二方面中，所述HNRNPC为HNRNPC蛋白或HNRNPC基因；所述RBMX为RBMX蛋白或RBMX基因。

所述HNRNPC蛋白和所述HNRNPC基因的GenBank号为NM_031314.3(Update：PRI 01-JUL-2021)，所述RBMX蛋白和所述RBMX基因的GenBank号为NM_002139.4(Update：PRI 26-JUN-2021)。

其中，所述用于降低HNRNPC和RBMX表达量的物质可为用于干扰所述HNRNPC基因和所述RBMX基因表达的shRNA后siRNA。

在本发明的具体实施方式中，用于干扰所述HNRNPC基因表达的shRNA为将SEQ IDNo.1中的T替换为U后所得的shRNA；用于干扰所述RBMX基因表达的shRNA为将SEQ ID No.3中的T替换为U后所得的shRNA。

在本发明的具体实施方式中，用于干扰所述HNRNPC基因表达的siRNA由SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5组成，或由SEQ ID No.6和SEQ ID No.7组成；用于干扰所述RBMX基因表达的siRNA由SEQ ID No.10和SEQ ID No.11组成，或由SEQ ID No.12和SEQ ID No.13组成。

第三方面，本发明要求保护用于检测HNRNPC基因和RBMX基因表达量的物质在如下任一中的应用：

(B1)制备用于评估小细胞肺癌靶向治疗疗效的产品，或评估小细胞肺癌靶向治疗疗效；

(B2)制备用于评估小细胞肺癌细胞增殖和/或迁移情况的产品，或评估小细胞肺癌细胞增殖和/或迁移情况；

(B3)制备用于评估小细胞肺癌细胞凋亡情况的产品，或评估小细胞肺癌细胞凋亡情况；

(B4)制备用于评估小细胞肺癌转移情况的产品，或评估小细胞肺癌转移情况。

进一步地，所述用于检测HNRNPC和RBMX表达量的物质可包括：能够特异性扩增所述HNRNPC基因的引物对，以及能够特异性扩增所述RBMX基因的引物对。

更进一步地，能够特异性扩增所述HNRNPC基因的引物对可为由SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示两条单链DNA组成的引物对；能够特异性扩增所述RBMX基因的引物对可为由SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示两条单链DNA组成的引物对。

根据需要，所述用于检测HNRNPC和RBMX表达量的物质还可同时包括用于检测内参基因(如GAPDH基因)的引物对，具体可为由SEQ ID No.18和SEQ ID No.19所示两条单链DNA组成的引物对。

当然，所述用于检测HNRNPC和RBMX表达量的物质还可以包括进行荧光定量PCR法检测所需的常规试剂和/或仪器。

在本发明的具体实施方式中，所述小细胞肺癌细胞为NCIH446或NCIH196细胞。

本发明共分为2个部分：(1)把癌细胞系百科全书(Cancer Cell LineEncyclopedia，CCLE)中不同来源的小细胞肺癌细胞系(原位组织来源或转移灶来源的)中m6A调控因子的表达情况进行T test差异分析，筛选出了差异表达的分子。同时对这些分子是否能够影响肿瘤细胞的生存能力进行了fitness基因和DepMap数据库的预测，筛选出HNRNPC和RBMX两个潜在的靶点；(2)在细胞层面和动物层面对于筛选的治疗靶点进行有效性验证。这是一个可靠的m6A治疗靶点的预测模型，可作为小细胞肺癌治疗靶点并抑制小细胞肺癌增殖、转移，这可能成为临床有用的工具，有助于推进小细胞肺癌患者转移和治疗的精准预测和个体化综合治疗。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为m6A调节元件在小细胞肺癌中的遗传变异、表达模式和治疗潜力的全景图。a，为目前关于m6A修饰在癌症进展中的动态可逆过程的知识总结；b，为来自国际队列的110名小细胞肺癌患者中30个m6A调节元件的突变频率。每列对应一个单独的案例。TMB显示为上部条形图。右侧面板显示了每个调节器的每个变体类型的突变频率和比例。底部的堆积条形图显示每位患者的转化率。c，为CCLE中53个SCLC细胞系中30个m6A调节元件的拷贝数变异频率。蓝点，删除频率；红点，放大频率。d，为CCLE的数据中，23条染色体上m6A调节元件的CNV改变的位置。e，为用于区分GSE40275队列中小细胞肺癌样本和正常肺样本的30个m6A调节因子表达谱的主成分分析。两个亚组之间没有交集，表明基于m6A调节因子的表达谱可以很好地区分小细胞肺癌样本和正常肺样本。SCLC样本用红色标记，正常肺样本用蓝色标记。f，为GSE40275队列的正常肺组织和小细胞肺癌组织之间30个m6A调节元件的表达细节。g，为小细胞肺癌细胞(NCIH446和NCIH196)在对照组或敲降组中迁移能力的Transwell迁移分析。*、**和***分别代表P<0.05、P<0.01和P<0.001。

图2为m6A调节元件基因改变在小细胞肺癌中的共同发生。

图3为CCLE的18种原发性和32种转移来源的小细胞肺癌细胞系之间30个m6A调节元件的表达模式。

图4为泛癌细胞系中METTL3(a)、HNRNPA2B1(b)、HNRNPC(c)和RBMX(d)的必需基因比例。BRCA，乳腺癌；COREAD，结直肠癌；ECa，子宫内膜癌；ECA，食管腺癌；ES，尤因氏肉瘤；ESCC，食管鳞状细胞癌；GBM，胶质母细胞瘤；GC，胃癌；HNC，头颈癌；KIC，肾癌；LGG，低级别胶质瘤；LUAD，肺腺癌；LUSC，鳞状细胞肺癌；NB，神经母细胞瘤；OCC，口腔癌；OS,骨肉瘤；OV，卵巢癌；PAAD，胰腺癌；PRAD，前列腺癌；SKCM，黑色素瘤。

图5为DepMap门户的(a)HNRNPC和(b)RBMX在泛癌细胞系中的治疗潜力景观。GeneEffect值均小于0，说明HNRNPC和RBMX是泛癌细胞的促肿瘤因子。

图6为HNRNPC基因沉默慢病毒质粒示意图。

图7为RBMX基因沉默慢病毒质粒示意图。

图8为HNRNPC在小细胞肺癌中上调并促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。a，为与正常肺细胞相比，HNRNPC在小细胞肺癌细胞中上调(细胞系数据，GSE4824)。b，为qPCR结果表明HNRNPC的敲降(knockdown，KD)效率。c，为在HNRNPC-KD和对照细胞中评估细胞生长速率。d，为在HNRNPC-KD和对照细胞中测定细胞凋亡。*、**和***分别代表P<0.05、P<0.01和P<0.001。

图9为RBMX在小细胞肺癌中上调并促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。a，为与正常肺细胞相比，RBMX在小细胞肺癌细胞中上调(细胞系数据，GSE4824)。b，为qPCR的结果证实了RBMX的敲降(knockdown，KD)效率。c，为在RBMX-KD和对照细胞中评估细胞生长速率。d，为在RBMX-KD和对照细胞中测定细胞凋亡。*、**和***分别代表P<0.05、P<0.01和P<0.001。

图10为HNRNPC和RBMX在体内促进SCLC细胞转移。a，为HNRNPC_NC组和HNRNPC_Sh组的分离肺组织的代表性图像。b，为HNRNPC_NC组的肺切片的苏木精-伊红染色的代表性图像。黑框表示肿瘤结节区域，黑色箭头表示转移细胞簇(左上图，×1；其他，×40)。c，为HNRNPC_SH组肺切片苏木精-伊红染色的代表性图像。黑框表示肿瘤结节区域，黑色箭头表示转移细胞簇(左图，×1；右图，×40)。d，为RBMX_NC组和RBMX_Sh组的分离肺组织的代表性图像。e，为RBMX_NC组肺切片苏木精-伊红染色的代表性图像。黑框表示肿瘤结节区域，黑色箭头表示转移细胞簇(左上图，×1；其他，×40)。f，为RBMX_SH组肺切片苏木精-伊红染色的代表性图像。黑框表示肿瘤结节区域，黑色箭头表示转移细胞簇(左图，×1；右图，×40)。g，为不同组的肺中转移性结节的数量。**代表P<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、HNRNPC和RBMX在小细胞肺癌转移预测中的应用

一、HNRNPC和RBMX是潜在的m6A治疗靶点

1、m6A各调节元件作用汇总

我们用已发表文献中((1).Li Y,Xiao J,Bai J,Tian Y,Qu Y,Chen X,Wang Q,LiX,Zhang Y,and Xu J,Molecular characterization and clinical relevance of m(6)Aregulators across 33cancer types.Mol Cancer,2019.18(1):137.(2).Liu J,HaradaBT,and He C,Regulation of Gene Expression by N(6)-methyladenosine inCancer.Trends Cell Biol,2019.29(6):487-499.(3).Huang H,Weng H,and Chen J,m(6)A Modification in Coding and Non-coding RNAs:Roles and TherapeuticImplications in Cancer.Cancer Cell,2020.37(3):270-288.(4).Nombela P,Miguel-López B,and Blanco S,The role of m(6)A,m(5)CandΨRNAmodifications in cancer:Novel therapeutic opportunities.Mol Cancer,2021.20(1):18.)，总结了30个m6A的调节元件，包括11个Writer调节元件(METTL3,METTL14,METTL16,METTL5,WTAP,VIRMA,RBM15,RBM15B,ZC3H13,CBLL1,和ZCCHC4),2个Eraser调节元件(FTO和ALKBH5),以及17各Reader调节元件(YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3,YTHDC1,YTHDC2,HNRNPA2B1,HNRNPC,FMR1,EIF3A,IGF2BP1,IGF2BP2,IGF2BP3,ELAVL1,G3BP1,G3BP2,PRRC2A和RBMX)，m6A修饰在癌症中的多种功能总结在图1中。具体地，在GEO公共数据库的GSE40275数据集中，对110个SCLC样本中对30个m6A 调节元件(表1)的体细胞突变进行探究，发现28个样本表现出m6A调节因子的突变，突变频率为25.5％。在所有调节元件中，Reader调节元件显示出相对较高的突变频率，而FMR1显示出最高的突变频率。相比之下，没有Eraser调节元件表现出突变。同时，结果显示METTL3和YTHDC2之间以及IGF2BP2和YTHDC2之间的共存突变(图2)。

表1、小细胞肺癌m6A调节元件分类

2、CCLE中m6A调节元件突变验证

在癌细胞系百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE)数据库网站，对53个SCLC细胞系中进行上述调节因子拷贝数变异(copy number variations，CNV)分析，发现SCLC中m6A调节因子的CNV改变是普遍的。大多数Reader调节元件(11/17)表现出广泛的CNV升高，而所有Eraser调节元件的缺失频率更高。结果提示染色体也存在CNV改变突变(图1)。

由于m6A调节元件的基因改变在SCLC中很常见，我们进一步确定了这些变化是否影响肿瘤细胞表达模式。在GEO数据库的GSE4824数据集中，通过主成分分析评估了正常肺和SCLC样本中m6A调节因子表达的全景图，如图1显示出显著不同的分布模式。正常样本和SCLC样本之间调节因子的表达细节如图1所示。几乎所有的Writer调节元件和Reader调节元件在SCLC中都显着上调；尽管如此，Eraser调节元件的表达趋于下降，表明SCLC与大量的m6A修饰有关。既往研究结果显示，在多个实体瘤中发现IGF2BP3水平显着升高，我们这项研究首次在SCLC中发现这种现象。将CNV结果与m6A调节元件的表达模式相结合，我们推断CNV改变可能导致m6A调节元件表达的改变。

3、m6A治疗靶点与肿瘤转移密切相关

为了进一步研究m6A表达谱与SCLC转移之间的关系，我们比较了CCLE中来自不同病理起源的50个SCLC细胞系中30个调节元件的分布。与原代衍生细胞系相比，大多Writer调节元件和Reader调节元件在转移衍生的细胞系呈向上分布趋势(图3)，表明m6A修饰可能有助于促进SCLC转移。值得注意的是，四种调节因子——METTL3、HNRNPA2B1、HNRNPC和RBMX——在转移来源的细胞系中显着上调。

为了进一步证明这些分子与肿瘤转移之间的相关性，我们首先试图确定四种调节因子中的哪一种充当泛癌适应性基因(图4)。我们发现HNRNPC和RBMX是几乎所有不同癌症类型的必需基因。此外，DepMap数据还提醒泛癌细胞中HNRNPC和RBMX表达升高(图5)。因此，HNRNPC和RBMX可影响SCLC的恶性生物学行为，是潜在的m6A治疗靶点。

二、HNRNPC和RBMX是潜在的m6A治疗靶点的探索

为验证HNRNPC和RBMX影响SCLC的恶性生物学行为的机制，我们使用两种转移来源的细胞系，即NCIH446和NCIH196(美国模式菌种收集中心产品，ATCC，细胞库)，进行了体外和体内实验，发现HNRNPC和RBMX敲低显著抑制SCLC增殖和迁移并促进细胞凋亡。具体如下：

(一)、HNRNPC和RBMX敲低稳转细胞系的构建

将靶向HNRNPC和RBMX的shRNA分别构建到Plko.1-puro载体(合生基因公司)上，载体构建由合生基因公司完成。

1、靶向HNRNPC和RBMX的shRNA基因沉默慢病毒质粒载体构建和验证

(1)根据目的基因序列，针对HNRNPC和RBMX基因分别设计shRNA，其序列信息如表2和表3所示。

表2、HNRNPC基因沉默慢病毒载体信息

表3、RBMX基因沉默慢病毒载体信息

(2)将2条shRNA分别进行引物合成，并插入慢病毒表达骨架质粒中，完成慢病毒基因沉默质粒构建(详见图6、图7)。

(3)基因沉默慢病毒质粒载体构建和验证

完成基因沉默慢病毒质粒构建后，对插入的shRNA序列进行了测序比对鉴定，并获得了构建正确的质粒。验证通过后，获得携带有目的质粒的甘油菌。

2、质粒DNA的转化

(1)制备LB培养基，高压灭菌后，自然冷却；

(2)将50μl甘油菌，加入25ml的LB培养基中，37℃摇床上，摇菌15h。

3、质粒提取

使用全式金公司的

HiPure Plasmid MiniPrep Kit试剂盒。使用前将RNaseA加入Resuspension Buffer中，将40ml无水乙醇加入Wash Buffer中。具体步骤如下：

(1)将摇好的菌液10000g离心1min，弃上清；

(2)加入1000μl无色的Resuspension Buffer，剧烈震荡至无明显菌块；

(3)加入1000μl Lysis Buffer，轻柔颠倒混匀数次，待颜色由半透亮蓝色转为透亮蓝色时，表示菌体完全裂解。5min之内，加入1400μl中和Buffer，轻柔混匀，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min。

(4)12000g离心5min，将上清加入离心柱中，12000g离心1min，弃滤液；

(5)向离心柱中加入250μl Toxin Out Buffer，室温静置10min，12000g离心1min，弃滤液；

(6)向离心柱中加入750μl Wash Buffer，12000g离心1min，弃滤液。12000g离心2min，彻底去除Wash Buffer；

(7)向离心柱中加入30μl Elution Buffer,室温孵育1min，将离心柱放入新的1.5mL离心管中，10000g离心1min，溶解洗脱质粒；

(8)使用Nanodrop测定浓度，在-20℃保存备用，获得目的质粒。

4、慢病毒包装

使用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)，操作及试剂计量按照说明书，具体如下：

(1)293T细胞准备：复苏293T细胞，传代，用10％的DMEM培养基(Corning)培养，待细胞状态好时，将细胞转移至10cm培养皿中培养。待细胞汇合度达80％左右，准备进行转染。转染前一天对细胞进行换液；

(2)293T转染：制备质粒和转染试剂混合物，A：将250μl的opti-MEM培养基和10μl的Lipofectamine3000混匀，孵育5min；B：将250μl的opti-MEM培养基和质粒(P1，P2，P3(合生基因公司)和步骤3获得的目的质粒各6μg)及10μl的P3000混匀；将A、B两种混合物混匀，室温孵育15min。孵育期间对293T细胞进行换液，孵育完成后，将制备好的质粒混合液均匀滴加到培养皿中，轻柔摇晃混合均匀，然后放回培养箱中培养；

(3)换液：转染8h后，对293T细胞进行换液；

(4)收集病毒液：换液48h后，将培养基转移到15ml离心管，2500rpm离心10min，将上清小心转移至新的离心管中，切勿带入细胞碎片，放入-80℃中备用。

5、慢病毒感染细胞系

(1)目的细胞准备：将待构建细胞系NCIH446传代至六孔板中培养，待细胞汇合度到30-40％，准备慢病毒感染；

(2)慢病毒感染：将慢病毒液恢复至室温，弃去原有的培养基，加入1mL新的培养基和1mL病毒液，再加入2μl的polybrene(5μg/mL)，轻轻混匀。在培养箱中继续培养，24h后换液；

(3)阳性细胞的筛选：继续培养48h后，在培养基中加入含嘌呤霉素，定时观察细胞状态，根据细胞情况每2-3天换液；

(4)基因敲除验证：嘌呤霉素筛选1周后，换成正常培养基。提取细胞RNA和总蛋白，PCR验证敲除效率(采用引物见表6)。

(二)、细胞瞬时转染

siRNA转染试剂采用life technologies^TM的Lipofectamine RNAiMAX试剂。靶向HNRNPC和RBMX基因的siRNA分别为siHNRNPC和siRNMX。具体如表4和表5所示。

表4、siHNRNPC序列

表5、siRBMX序列

具体操作步骤如下，以1孔为例：

(1)细胞准备：将待转染的细胞NCIH446和NCIH196，提前铺到六孔板中，待细胞汇合度达70％-80％，此时细胞处于对数生长期，进行转染；

(2)配制转染体系：

a.稀释Lipofectamine RNAi MAX Reagent：150μL Opti-MEM培养基中加入9μLLipofectamine RNAi MAX Reagent，轻柔吹打混匀，静置5min；

b.稀释siRNA：150μL Opti-MEM培养基中加入6μg siRNA，轻柔吹打混匀；

c.将稀释好的siRNA与稀释Lipofectamine RNAi MAX Reagent以1：1混合成转染体系，静置15min；

d.将配制好的转染体系加入6孔板中，用完全培养基补至2mL/孔。轻柔混匀培养基，放入37℃孵箱中培养；

e.培养24h后提取RNA，用qPCR进行siRNA转染效率的验证。检测引物为表6所示。

表6、检测HNRNPC和RBMX基因的qPCR引物序列

(三)、细胞增殖检测

供试细胞：步骤(二)获得的瞬转细胞系。

本实验采用同仁化学研究CCK8检测试剂盒，具体步骤如下：

(1)在细胞融合度达到80％时，进行消化、重悬和细胞计数。将细胞铺于96孔板中，每孔1000个细胞。每个处理组设置六个复孔，按照0、24、48和72h时间点进行测定。0h即处理细胞贴壁后，依次类推，每个时间点单独铺一个96孔板；

(2)在每个时间点检测细胞的增殖活性，换含10％CCK8试剂的培养基，37℃孵育2h，使用酶标仪在波长450nm处检测OD值；

(3)根据样品的吸光度进行统计分析并绘制增殖曲线，吸光度值可反应细胞的增殖活性。

(四)、Transwell检测迁移

供试细胞：步骤(二)获得的瞬转细胞系。

1、准备小室：准备好Corning 3422小室用于迁移实验；

2、先将Corning 3422小室取出，在小室内加入200μL无血清培养基，在下室加入600μL预热的无血清培养基，避免气泡产生，放入37℃细胞培养箱内水化1至2小时；

3、调整细胞浓度：弃去培养皿中的培养基，用1mL PBS冲洗2次后，加入1mL胰酶，消化细胞后，终止消化，1000rpm/min离心5min。弃上清，加入1mL无血清培养基，重悬细胞后，进行细胞计数，并用无血清培养基调节至最终所需浓度(NCIH446细胞系，每孔5*10⁵个细胞；NCIH196细胞系，每孔4*10⁵个细胞)；

4、取出水化后的小室，吸净培养基。在下室加入750μL含20％FBS的完全培养基，上室加入200μL无血清培养基稀释好的细胞悬液，放入细胞培养箱中培养；

5、细胞侵袭：放入37℃培养箱中静置24h；

6、固定：取出transwell小室，吸净上层培养基，用棉签小心将小室上层基质胶和细胞轻柔擦拭干净，放入组织固定液中，固定15min；

7、染色：将固定后的小室，用PBS清洗3次，用棉签擦干，放入结晶紫中，染色30min，用流水轻柔冲洗干净，空气干燥；

8、封片：用手术刀片沿边缘将小室聚碳酸脂膜小心切下，细胞面朝上，用中性树胶封片，盖上盖玻片，防止气泡进入；

9、细胞计数：在显微镜下，观察拍照，分别取小室上、下、左、右、中固定的5个视野拍照并计数。

(五)、流式细胞术检测细胞凋亡

供试细胞：步骤(二)获得的瞬转细胞系。

本实验采用Annexin-V/PI染色法检测细胞的凋亡，具体步骤如下：

(1)消化、重悬、计数对数生长期的细胞，每孔5×10⁵个细胞铺于六孔板中，培养24h；

(2)收集细胞：每孔用PBS洗涤后，胰酶消化后，1200rpm离心5min，使用PBS洗涤细胞一次，离心弃上清；

(3)细胞染色和检测：向细胞沉淀中加入200μL Annexin-V binding buffer进行重悬，避光加入1μL APC标记的Annexin-V抗体，涡旋震荡混匀，4℃避光孵育15min，上机检测前加入PI。检测细胞的凋亡。

(六)、小鼠尾静脉肺定植实验

供试细胞：步骤(一)获得的稳转细胞系。

本研究使用的NOD-SCID小鼠，为北京华阜康公司产品。研究纳入小鼠，5-6周龄，体重在17-24g之间。裸鼠由中国医学科学院肿瘤医院动物实验中心负责饲养，饲养条件为除尘除菌的无特定病原菌饲养室，温度控制在25-27℃，湿度在45-50％，新鲜过滤空气。

(1)小鼠分组标记：先让裸鼠在新的环境中适应数日，使用耳钉对小鼠进行编号，做好分组记录，每组10只；

(2)目的细胞准备：本研究采用步骤(一)获得的NCIH446 shRNA稳转细胞系和NC对照细胞系，每只小鼠注射1*10⁶个细胞。提前准备细胞，在细胞汇合度在70％-80％时，常规消化、计数细胞，最后用PBS缓冲液将细胞浓度调至10⁷个/ml，混匀置于冰上备用。

(3)接种细胞：接种细胞前，再次混匀细胞，用1ml注射器，在每只小鼠尾静脉注射100μl细胞悬液。

(4)结果观察：8周后处死小鼠，取出肺组织，进行拍照，用组织固定液进行固定、石蜡包埋、切片、HE染色，最后显微镜下观察和比较各组肿瘤细胞肺定植情况。

(七)、结果与分析

体外实验结果显示，在RBMX和HNRNPC的敲降细胞中，相比于对应的对照细胞，敲降细胞的细胞生长速率明显降低，同时迁移受到抑制，并且促进细胞凋亡。体内实验结果显示，用RBMX和HNRNPC的敲降细胞和其相对应的对照细胞分别进行肺定植，敲降细胞的肺转移数量明显少于对照。详见图1，图8、图9、图10。

综上所述，本发明证明了m6A修饰在SCLC中的重要性，并识别出小细胞肺癌潜在的治疗靶点，且这些治疗靶点与转移密切相关。对m6A调节元件抑制肿瘤生长和肿瘤转移能力的进一步前瞻性验证，将有助于提高临床小细胞肺癌的治疗疗效。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国医学科学院肿瘤医院

<120> HNRNPC和RBMX作为靶点在制备治疗小细胞肺癌的产品中的应用

<130> GNCLN212496

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gccttcccag gtgattgaga acgaattctc aatcacctgg gaaggc 46

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

aaacgtgaca cgttcggaga acgaattctc cgaacgtgtc acgttt 46

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gccagagaca tgaatggaaa gcggactttc cattcatgtc tctggc 46

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ugaagaaaga ugagacuaat t 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

uuagucucau cuuucuucat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

aggaaaagca ggugugaaat t 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

uuucacaccu gcuuuuccut t 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

ccagagacau gaauggaaat t 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

uuuccauuca ugucucuggt t 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

ggauauagcg auagagaugt t 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

caucucuauc gcuauaucct t 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

gttaccaaca agacagatcc tcg 23

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

aggcaaagcc cttatgaaca g 21

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

tcaagcagag attacccaag tt 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

ccacgaccat aatgagcaaa at 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

ggagccaaaa gggtcatcat ctc 23

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

gaggggccat ccacagtctt ct 22

Claims

1.HNRNPC和RBMX作为靶点在如下任一中的应用：

(A1)制备用于治疗小细胞肺癌的产品，或治疗小细胞肺癌；

2.用于降低HNRNPC和RBMX表达量的物质在如下任一中的应用：

(A1)制备用于治疗小细胞肺癌的产品，或治疗小细胞肺癌；

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述HNRNPC为HNRNPC蛋白或HNRNPC基因；所述RBMX为RBMX蛋白或RBMX基因。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述用于降低HNRNPC和RBMX表达量的物质为用于干扰所述HNRNPC基因和所述RBMX基因表达的shRNA或siRNA。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：用于干扰所述HNRNPC基因表达的shRNA为将SEQ ID No.1中的T替换为U后所得的shRNA；

用于干扰所述RBMX基因表达的shRNA为将SEQ ID No.3中的T替换为U后所得的shRNA。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：用于干扰所述HNRNPC基因表达的siRNA由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5组成，或由SEQ ID No.6和SEQ ID No.7组成；

用于干扰所述RBMX基因表达的siRNA由SEQ ID No.10和SEQ ID No.11组成，或由SEQID No.12和SEQ ID No.13组成。

7.用于检测HNRNPC基因和RBMX基因表达量的物质在如下任一中的应用：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述用于检测HNRNPC基因和RBMX基因表达量的物质包括：能够特异性扩增所述HNRNPC基因的引物对，以及能够特异性扩增所述RBMX基因的引物对。

9.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：能够特异性扩增所述HNRNPC基因的引物对为由SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示两条单链DNA组成的引物对；

能够特异性扩增所述RBMX基因的引物对为由SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示两条单链DNA组成的引物对。