CN110302197A - 一种与恩杂鲁胺治疗敏感性相关的lncRNA及其在恩杂鲁胺治疗前列腺癌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种与恩杂鲁胺治疗敏感性相关的lncRNA及其在恩杂鲁胺治疗前列腺癌中的应用。涉及生物基因技术领域。所述与恩杂鲁胺治疗敏感性相关的lncRNA为lnc‑OPHN1‑5，lnc‑OPHN1‑5，可通过降低ARmRNA翻译和AR蛋白质合成来增加前列腺癌(PCa)对恩杂鲁胺(Enz)的敏感性。本发明克服了现有技术的不足，并且通过lnc‑OPHN1‑5在恩杂鲁胺治疗前列腺癌中的应用为治疗去势抵抗性前列腺癌(CRPC)提供一种新的医学思路和策略，提升患者的存活周期。

Description

一种与恩杂鲁胺治疗敏感性相关的lncRNA及其在恩杂鲁胺治 疗前列腺癌中的应用
技术领域
本发明涉及生物基因技术领域，具体涉及一种与恩杂鲁胺治疗敏感性相关的lncRNA及其在恩杂鲁胺治疗前列腺癌中的应用。
背景技术
前列腺癌(PCa)是西方国家男性最常见的癌症。虽然最近开发的恩杂鲁胺雄激素剥夺疗法(ADT)可以延长患者的生存期4.8个月 2-4，但大多数患者仍发展为ADT抵抗。ADT抵抗的一个重要分子机制为AR蛋白的持续激活，研究这种AR异常激活的新生物学机制有助于改善去势抵抗性PCa(CRPC)患者的治疗。
研究表明，在CRPC发展过程中，常见AR基因突变，基因组扩增和基因缺失，最终导致AR持续激活和活性增强。最新研究表明，位于线性序列上更远位置的增强子可能通过染色质环化激活AR转录，推动转移性CRPC的进展。同时，AR基因座周围染色质的改变也可能改变lncRNAs等驻留基因的表达。
LncRNA是长度大于200nt但几乎没有编码蛋白质的能力的RNA 转录物。近年来，大量lncRNA得到注释，并且其在生物学过程中的调节作用开始被揭示。LncRNAs可能与染色质修饰蛋白相关，如调节染色质状态的多梳抑制复合体(PRC2)。此外，越来越多的证据表明lncRNAs可通过翻译后机制决定细胞过程，还可通过与RNA结合蛋白(RBPs)相互作用影响mRNA翻译，从而影响靶基因编码的蛋白水平和生物学功能。基于这些调节机制，lncRNA在人类癌症发展中发挥关键作用。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供一种与恩杂鲁胺治疗敏感性相关的lncRNA及其在恩杂鲁胺治疗前列腺癌中的应用，通过 lnc-OPHN1-5减少AR mRNA翻译，降低AR蛋白水平和转录活性，从而影响Enz敏感性，更好地抑制CRPC进展。
为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
一种与恩杂鲁胺治疗敏感性相关的lncRNA，所述与恩杂鲁胺治疗敏感性相关的lncRNA为lnc-OPHN1-5。
所述lnc-OPHN1-5为位于X染色体上AR基因3'端1MB处。
lnc-OPHN1-5在恩杂鲁胺治疗前列腺癌中的应用，所述 lnc-OPHN1-5通过影响AR蛋白表达和蛋白活性来影响前列腺癌对恩杂鲁胺的敏感性。
优选的，通过小分子sh-hnRNPA1靶向 lnc-OPHN1-5/AR/hnRNPA1复合物降低雄激素受体AR mRNA翻译和 AR蛋白质合成，增加恩杂鲁胺敏感性。
优选的，通过增加lnc-OPHN1-5抑制hnRNPA1-AR mRNA相互作用，来减少AR mRNA翻译，减少AR蛋白，增加恩杂鲁胺敏感性。
优选的，通过敲除hnRNPA1阻断sh-lnc-OPHN1-5增加相关的 AR蛋白表达，以重新敏化恩杂鲁胺治疗。
本发明提供一种与恩杂鲁胺治疗敏感性相关的lncRNA及其在恩杂鲁胺治疗前列腺癌中的应用，与现有技术相比优点在于：
本发明提供了一种新的lncRNA lnc-OPHN1-5，其可通过降低AR mRNA翻译和蛋白质合成来影响恩杂鲁胺敏感性，并且通过 lnc-OPHN1-5在恩杂鲁胺治疗前列腺癌中的应用为治疗去势抵抗性前列腺癌(CRPC)提供一种新的医学思路和策略，提升患者的存活周期。
附图说明：
图1：不同前列腺癌队列中的异常AR分布柱状图：其中从左到右依次为：SU2C队列：总改变频率62％，突变10％，融合1％，扩增43％，其他多种改变8％；MICH队列：总改变频率52％，突变9％，融合1％，扩增42％；FHCRC队列：总改变频率51％，突变2％，融合1％，扩增45％，删除1％，其他多种改变2％；NEPC队列：总改变频率47％，突变2％，融合1％，扩增41％，其他多种改变3％； MSK-IMPACT队列：总改变频率19％，突变4％，融合1％，扩增12％，删除1％，其他多种改变1％；PRAD队列：总改变频率17％，突变 4％，融合1％，扩增11％，其他多种改变1％；MSKCC队列：总改变频率9％，突变1％，融合1％，扩增7％；Broad/Comell队列：总改变频率2％，突变2％；TCGAPanCan队列：总改变频率2％，突变 1％，扩增1％
图2：MTT测定显示lnc-OPHN1-5影响Enz敏感性图：其中A 为该模型显示X染色体上AR周围的lncRNA位点；B中条形图从左到右为pLKO.1，shlnc-OPHN1-5，纵坐标为lnc-OPHN1-5的相对表达， EnzS1-C4-2细胞中lnc-OPHN1-5#2的敲除效率；C中横坐标为天数，纵坐标为细胞相对生存能力，pLKO.1和shlnc-OPHN1-5中2条曲线从上到下为DMSO组细胞相对生存能力和Enz组细胞相对生存能力，敲除lnc-OPHN1-5表达显着降低EnzS1-C4-2细胞对Enz的敏感性； D中条形图从左到右为pWPI，oelnc-OPHN1-5，纵坐标为lnc-OPHN1-5 的相对mRNA，EnzR1-C4-2细胞中的异位lnc-OPHN1-5表达效率；E 中横坐标为天数，纵坐标为细胞相对生存能力，pWPI和 oelnc-OPHN1-5中2条曲线从上到下为DMSO组细胞相对生存能力和Enz组细胞相对生存能力，异位lnc-OPHN1-5表达显着增加 EnzR1-C4-2细胞的Enz敏感性；F中条形图从左到右为pLKO.1， shlnc-OPHN1-5-1，shlnc-OPHN1-5-2，纵坐标为lnc-OPHN1-5的相对mRNA，EnzS2-C4-2B细胞中lnc-OPHN1-5的敲除效率；G中横坐标为天数，纵坐标为细胞相对生存能力，pLKO.1，shlnc-OPHN1-5-1， shlnc-OPHN1-5-2中2条曲线从上到下为DMSO组细胞相对生存能力和Enz组细胞相对生存能力，敲除lnc-OPHN1-5表达显着降低 EnzS2-C4-2B细胞的Enz敏感性；H中条形图从左到右为pWPI， oelnc-OPHN1-5，纵坐标为lnc-OPHN1-5的相对mRNA，EnzR2-C4-2B 细胞中的异位lnc-OPHN1-5表达效率；I中异位lnc-OPHN1-5表达显着增加EnzR2-C4-2B细胞的Enz敏感性；
图3：lnc-OPHN1-5的功能作用及其亚细胞定位图；A中条形图从左到右为pLKO.1+Enz，shlnc5#1+Enz，shlnc5#2+Enz，纵坐标为相对的BrDU染色阳性率，较pLKO.1+Enz组，shlnc5#1+Enz组和 shlnc5#2+Enz组BrDU染色阳性率分别减少30.0％，37.5％；B中条形图从左到右为pLKO.1+Enz，shlnc5+Enz，纵坐标为相对的BrDU染色阳性率，较pLKO.1+Enz组，shlnc5+Enz组BrDU染色阳性率减少 25％，A-B.Enz预处理5天后，敲除lnc-OPHN1-5表达，使EnzS1-C4-2 和EnzS2-C4-2B细胞中的BrDU染色阳性细胞群减少；C中条形图从左到右为pWPI+Enz，oelnc5+Enz，纵坐标为相对的BrDU染色阳性率，较pWPI+Enz组，oelnc5+Enz组BrDU染色阳性率增多26.5％， Enz预处理5天后，过表达lnc-OPHN1-5，使EnzS1-C4-2和EnzS2-C4-2B细胞中的BrDU染色阳性细胞群增加；
图4：BrDU染色测定显示lnc-OPHN1-5影响Enz敏感性条形图：其中A.条形图从左到右为pLKO.1，shlnc-OPHN1-5#1，纵坐标为相对的mRNA表达，EnzS1-C4-2细胞中lnc-OPHN1-5#1的敲除效率；B. 条形图从左到右为pLKO.1，shlnc-OPHN1-5#1，纵坐标为细胞相对生存能力，敲除lnc-OPHN1-5表达显着降低EnzS1-C4-2细胞的Enz敏感性；C.条形图从左到右为lnc-OPHN1-5，Malat1，Tubulin，纵坐标为总RNA的百分比，EnzS1-C4-2细胞中lnc-OPHN1-5的分布，实心为细胞核RNA所占百分比，条纹为细胞质RNA所占百分比。
图5：lnc-OPHN1-5影响AR蛋白表达和转录活性分析图：A.横坐标为浓度，纵坐标为细胞相对生存能力，EnzS1-C4-2中2条曲线从上到下为oeAR组和pWPI组，异位AR表达降低EnzS1-C4-2细胞的Enz敏感性；B.改变EnzS1-C4-2细胞中lnc-OPHN1-5表达后影响 AR蛋白表达；C.敲除EnzS1-C4-2细胞中lnc-OPHN1-5表达后改变 AR蛋白稳定性；D.横坐标为时间，纵坐标为蛋白相对稳定性， EnzS1-C4-2中2条曲线从上到下为pLKO.1，shlnc-OPHN1-5，定量数据显示AR蛋白稳定性变化；E.条形图从左到右为pLKO.1， shlnc-OPHN1-5，纵坐标为MMTV相对荧光素酶率；F.条形图从左到右为pWPI，oelnc-OPHN1-5，纵坐标为MMTV相对荧光素酶率； E-F.MMTV-荧光素酶测定法显示，敲除lnc-OPHN1-5表达增加AR转录活性，其可被EnzS1-C4-2细胞中的异位lncRNA表达抑制；G.条形图从左到右为pWPI,oelnc-OPHN1-5，纵坐标为相对的AR mRNA 表达；H.条形图从左到右为pWPI，oelnc-OPHN1-5，纵坐标为相对的AR mRNA表达；G-H.敲除和异位lnc-OPHN1-5表达不影响 EnzS1-C4-2细胞中的AR mRNA表达；
图6：lnc-OPHN1-5影响AR mRNA翻译条形图：A.纵坐标为 18S相对结合率；B.纵坐标为18S相对结合率，A-B敲除lnc-OPHN1-5 表达可增加AR mRNA和18S之间的相互作用，其相互作用可被 EnzS1-C4-2细胞中的异位lnCc-OPHN1-5表达抑制；C.纵坐标为核糖体中ARmRNA的相对富集，敲除lnc-OPHN1-5表达可增加 EnzS1-C4-2细胞核糖体中AR mRNA的富集；D.纵坐标为AR mRNA 的相对富集，异位lnc-OPHN1-5表达可降低EnzS1-C4-2细胞核糖体中ARmRNA的富集；
图7：lnc-OPHN1-5影响AR mRNA与RNA结合蛋白hnRNPA1 及核糖体18S RNA的相互作用图：其中A.纵坐标为相对结合率，通过RIP测定，使用特异性生物素下调AR mRNA显示，AR可与EnzS1-C4-2细胞中的lnc-OPHN1-5直接相互作用；B.RIP测定显示 AR mRNA可直接与RBP相互作用，包括hnRNPA1，HUR，hnRNPK 和hnRNPA/B；C.纵坐标为AR相对结合率；D.纵坐标为AR相对结合率；C-D.通过RIP测定，使用特异性生物素下调hnRNPA1显示，敲除lnc-OPHN1-5可增加AR mRNA和hnRNPA1间的相互作用，而其相互作用可被EnzS1-C4-2细胞中的异位lnc-OPHN1-5表达抑制； E-F.通过RIP测定，使用特异性生物素下调AR mRNA显示，敲除lnc-OPHN1-5可增加AR mRNA和hnRNPA1间的相互作用，而其相互作用可被EnzS1-C4-2细胞中的异位lnc-OPHN1-5表达抑制。
图8：敲除或异位lnc-OPHN1-5表达后下调效率图：其中A.纵坐标为lnc-OPHN1-5的相对结合；B.条形图由左向右分别为Biotin组 pWPI,oelnc-OPHN1-5，AR组pWPI,oelnc-OPHN1-5，纵坐标为 lnc-OPHN1-5的相对结合；A-B.敲除或异位lnc-OPHN1-5表达后影响ARmRNA和lnc-OPHN1-5间的相互作用率；C-D.敲除或异位 lnc-OPHN1-5表达后下调hnRNPA1效率；E.条形图由左向右分别为 pWPI，oelnc-OPHN1-5-wild，oelnc-OPHN1-5-mutant,纵坐标为相对的 lnc-OPHN1-5mRNA，EnzS1-C4-2细胞中的异位野生/突变体 lnc-OPHN1-5表达水平；
图9：lnc-OPHN1-5特异性区域与AR mRNA相互作用，以影响其翻译，蛋白质表达和Enz敏感性标志图：其中A.动画展示了突变体lnc-OPHN1-5的构建；B.纵坐标为核糖体上相对的AR mRNA富集，异位野生/突变体lnc-OPHN1-5表达对EnzS1-C4-2细胞核糖体中AR mRNA富集的影响；C.条形图由左向右分别为Biotin组 pWPI,lnc-OPHN1-5-wild,lnc-OPHN1-5-mutant，AR biotin组pWPI， lnc-OPHN1-5-wild，lnc-OPHN1-5-mutant，异位野生/突变体lnc-OPHN1-5表达对EnzS1-C4-2细胞中AR mRNA和18S之间相互作用的影响；D.异位野生/突变体lnc-OPHN1-5表达对EnzS1-C4-2细胞中AR mRNA和hnRNPA1间相互作用的影响；E.异位野生/突变体 lnc-OPHN1-5表达对EnzS1-C4-2细胞中AR蛋白水平的影响；F.横坐标为浓度，纵坐标为细胞相对生存能力，EnzS1-C4-2中3条曲线从上到下为pWPI组oelnc5-mutant组，oelnc5-wild组，异位野生/突变体lnc-OPHN1-5表达对EnzS1-C4-2细胞中Enz敏感性的影响；
图10：人类临床样本调查和小鼠体内模型证实通过小分子 sh-hnRNPA1靶向lnc-OPHN1-5/AR/hnRNPA1复合物可增加Enz敏感性图：其种A.纵坐标为lnc-OPHN1-5的相对表达，长时间Enz处理后的PDX模型与阴性对照lnc-OPHN1-5表达的相关性；B.纵坐标为 lnc-OPHN1-5的相对表达，EnzS1-C4-2细胞与EnzR1-C4-2中 lnc-OPHN1-5表达的相关性；C.条形图由左向右分别为P1组 (Pre-ADT＝0)，Post-ADT，P2组Pre-ADT，(Post-ADT＝0)，P3组Pre-ADT，Post-ADT，P4组Pre-ADT，Post-ADT，P5组Pre-ADT， Post-ADT，P6组Pre-ADT，Post-ADT，P7组Pre-ADT，Post-ADT，列腺癌患者ADT前后lnc-OPHN1-5表达的相关性；D.敲除hnRNPA1 表达可以逆转敲除EnzS1-C4-2细胞中lnc-OPHN1-5增加的AR蛋白表达；E.条形图由左向右分别为Enz处理0天pLKO.1，shlnc5， shA1+shlnc5；Enz处理2天pLKO.1，shlnc5，shA1+shlnc5；Enz处理4天pLKO.1，shlnc5，shA1+shlnc5；Enz处理6天pLKO.1，shlnc5， shA1+shlnc5，纵坐标为细胞相对生存能力；
图11：Lnc-OPHN1-5与AR mRNA相互作用机制图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
对Lnc-OPHN1-5调节CRPC Enz敏感性的检测：
检测材料：(1)细胞系，抑制剂和抗体：包括EnzR1-C4-2和 EnzR2-C4-2B细胞，细胞分别在加入10μM和20μM Enz的RPMI培养基中培养；GAPDH(sc-47724)，AR(N-20)，hnRNPA1(sc-32301)， hnRNPA/B(sc-376411)，hnRNPK(sc-28380)和HUR(sc-5261) 抗体购自SantaCruz Biotechnology(Dallas,Tx,USA)；Lnc-OPHN1-5 和AR特异性生物素购自IntegratedDNATechnologies Company(IDT， Skokie，Illinois，USA)；
(2)质粒和慢病毒包装：使用的质粒见表1，并将其与psAX2 包装质粒和pMD2G包膜质粒一起包装，并分别通过标准氯化钙转染方法共转染到293T细胞中，48小时后，收集慢病毒上清液并保存在 -80℃冰箱中备用，通过嘌呤霉素(1.5μg/mL)(CAS№58-58-2， Cayman，MI，USA)筛选稳定表达pLKO.1质粒载体产生病毒的细胞，备用；
(3)蛋白质印迹(WB)：使用细胞裂解缓冲液裂解收集的细胞，在定量和样品煮沸后，在10％SDS/PAGE凝胶上分离等分子量蛋白质，然后转移到PVDF膜上(Millipore，Billerica，MA，USA)，使用5％牛奶封闭膜一小时，然后与特异性一抗孵育过夜，洗涤后，将印迹与HRP标记的二抗孵育，最后使用ECL系统(Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY，USA)显影。
检测方法：(1)MTT测定和BrDU染色：将细胞与RPMI培养基混合，并将含有5000个细胞的500μl培养基加入到24孔板中，在收集之前，向每个孔中加入50μL MTT试剂(PBS，Amresco Inc.， Solon，OH，USA的5mg/mL MTT)，并在37℃下孵育2小时。抽吸后，加入1mLDMSO(Amresco Inc.，USA)溶解晶体，在酶标仪570nm 波长下测定光密度(OD)；通过免疫荧光显微镜分析(Olympus，Tokyo，Japan)测定染色密度。
(2)RNA免疫沉淀：向细胞板中加入1mL无RNase的细胞裂解缓冲液及1μLRNase抑制剂(M0307S，NEB；Ipswich，MA，USA)。在-80℃冰箱中放置30分钟后，将细胞裂解液14,000rpm离心15分钟后收集上清液，然后将细胞裂解液与链霉抗生物素蛋白偶联的 Dynabeads混合，在4℃旋转孵育2小时，然后，将裂解液分成三部分，包括输入对照和实验组。每个部分均加入抗体或生物素，孵育 12小时后，向每个管中加入20μl链霉抗生物素蛋白偶联的Dynabeads，震荡1小时，用RIP缓冲液洗涤磁珠10次，并重悬于 500μlTrizol中进行RNA提取，此外，RNA提取和qPCR实验方法参考先前工作。
(3)正交异种移植模型和患者衍生的异种移植物：从Jakson实验室购买8周龄雄性裸鼠，通过稳定的克隆选择程序获得表达 pLKO.1，sh-lnc-OPHN1-5，sh-lnc-OPHN1-5&sh-hnRNPA1的 EnzS1-C4-2细胞。将与基质胶(1∶1，v/v)混合的细胞(1X106) 原位注射到8周龄裸鼠的前前列腺中，当植入2个月后肿瘤可触及时，用浓缩Enz喂养小鼠，在治疗的四周间通过体内成像系统(IVIS)每周监测小鼠体重，并在处死后测量肿瘤重量，此外，患者衍生的异种移植物来自University ofMD Anderson。
(4)免疫组织化学(IHC)染色：将小鼠组织固定于10％PBS (v/v)甲醛溶液，固定并石蜡包埋，将样品切成5μm厚的切片，二甲苯脱水，用于AR特异性一抗的IHC染色，为增强抗原暴露，切片行1×EDTA98℃处理10分钟进行抗原修复，将切片与内源性过氧化物酶封闭溶液一起孵育，然后与AR一抗和hnRNPA14℃孵育过夜， Tris缓冲盐水冲洗后，将切片与生物素二抗在室温下孵育1小时，冲洗，与酶联辣根过氧化物酶(HRP)-链霉抗生物素蛋白一起孵育，以新鲜制备的DAB(Zymed，South San Francisco，CA)为底物检测HRP，最后，用苏木精对载玻片进行复染，并用水性封固剂固定。阳性细胞计算为免疫阳性细胞数×100％除以(细胞总数/400倍镜下任意 10个视野细胞数)。
表1：质粒信息
结果：通过实验表明，PCa患者中常出现AR异常(包括突变，缺失和扩增)(如图1)。AR基因座外的染色质元件能通过AR基因的长距离转录调节促进PCa进展。这些改变影响基因表达，特别是 AR基因座附近的lncRNA表达，可能推动PCa进展，特别是对抗雄激素Enz的抗性。
实施例2：
检测是否存在可能影响Enz敏感性的lncRNA：
基于LNCipedia数据库发现了4个lncRNA，lnc-AR-1，lnc-AR-2， lnc-OPHN1-1和lnc-OPHN1-5，它们位于X染色体上AR 5'端和3'端 1MB处(图2A)，本实验敲除四种相应lncRNA的shRNA来测试是否存在可能影响Enz敏感性的lncRNA，结果显示，lnc-OPHN1-5沉默可显着降低EnzS1-C4-2细胞Enz敏感性(图2B-C，图3A-B)，与此相反，增加lnc-OPHN1-5表达可以显着增加EnzR1-C4-2细胞Enz 敏感性(图2D-E)。在EnzS2/R2-C4-2B细胞中获得了类似结果(图 2F-I)。此外，使用BrDU染色法进行MTT数据双重确认，结果一致 (图4)。
基于对lnc-OPHN1-5潜在蛋白质编码能力的分析，本实验发现其无编码蛋白质的能力，与此一致，细胞核和细胞质分级分离表明 lnc-OPHN1-5可位于细胞核和细胞质中(图4C)。综合图2A-I和图3、图4，数据表明增加lnc-OPHN1-5的表达可增强多个PCa细胞Enz 敏感性。
实施例3：
Lnc-OPHN1-5可改变AR蛋白表达和转录活性的检测：
由于AR和AR信号本身对Enz敏感性有很大影响，并且在X染色体上lnc-OPHN1-5位置接近AR，本实验探索lnc-OPHN1-5是否可通过改变AR表达或活性来调节Enz敏感性。
与先前的研究结果一致，AR表达能直接影响Enz敏感性(图 5A)，本研究发现敲除lnc-OPHN1-5可增加AR蛋白表达(图5B)，但未能提高蛋白稳定性(图5C-D)，而异位lnc-OPHN1-5表达抑制 AR蛋白表达(图5B)。此外，通过MMTV-ARE-荧光素酶测定，发现敲除lnc-OPHN1-5可增强AR反式激活，增加lnc-OPHN1-5可抑制 AR反式激活(图5E-F)。在分子水平，qRT-PCR测定表明lnc-OPHN1-5 不影响AR mRNA水平(图5G-H)。综合图5A-H，结果显示lnc-OPHN1-5可改变AR反式激活及AR蛋白表达，而不影响AR蛋白稳定性和AR mRNA表达。
实施例4：
Lnc-OPHN1-5通过减少AR翻译降低AR蛋白表达的机制解剖：
由于sh-lnc-OPHN1-5增加AR蛋白表达，但未能改变AR蛋白稳定性或mRNA表达，本研究测试AR mRNA翻译是否增强。通过生物素标记的反义AR寡核苷酸(oligo)纯化AR mRNA来确定AR mRNA与核糖体的关联，由此确定lnc-OPHN1-5对翻译的影响。通过测量18S核糖体RNA水平检测相关核糖体。结果显示，敲除 lnc-OPHN1-5导致AR mRNA相关核糖体显著增加，而增加 lnc-OPHN1-5抑制其相互作用(图6A-B)。
此外，在细胞器分离后的核糖体部分中发现敲除lnc-OPHN1-5 导致AR mRNA显著增加，而增加lnc-OPHN1-5降低核糖体部分中的 AR mRNA(图6C-D)，其与AR mRNA下调结果一致。综合图6A-D，结果表明lnc-OPHN1-5可能通过减少AR翻译降低AR蛋白表达。
实施例5：
Lnc-OPHN1-5通过抑制AR mRNA-HnRNPA1相互作用减少AR mRNA翻译的机制解剖：
近期研究表明，mRNA的翻译可能受mRNA与lncRNAs及RNA 结合蛋白(RBPs)的相互作用的影响。基于已发表的文献，选择四种常见的与PCa相关的RBP，包括hnRNPA1，hnRNPA/B，hnRNPK 和HUR。通过RIP测定和生物素标记的AR反义寡核苷酸发现AR mRNA及这四种RBP可(图7A，图8A-B)与lnc-OPHN1-5相互作用(图7B)。既往研究表明hnRNPA1能影响Enz敏感性，本研究选择hnRNPA1作为进一步研究的对象。
使用特异性抗体下调hnRNPA1后，进行RIP测定检测敲除或增加lnc-OPHN1-5表达是否可以影响hnRNPA1和AR mRNA之间的相互作用(图8C-D)。结果表明，敲除lnc-OPHN1-5可增加AR mRNA 和hnRNPA1之间的相互作用，而异位lncRNA表达降低其相互作用在后(图7C-D)。用生物素标记的反义AR mRNA替换hnRNPA1抗体时也获得了类似的结果(图7E-F)。
综合图7A-F，数据表明lnc-OPHN1-5抑制hnRNPA1-AR mRNA 相互作用，从而减少ARmRNA翻译，减少AR蛋白，因此可增加 Enz敏感性。
实施例6：
Lnc-OPHN1-5与hnRNPA1竞争性结合AR mRNA的3'UTR，减少AR mRNA翻译的检测：
通过删除假定的AR-mRNA相互作用区域构建了突变体 lnc-OPHN1-5(图9A)。在野生型和突变型lnc-OPHN1-5异位表达后，突变体lncRNA未能显着降低核糖体中AR mRNA的富集，野生型 lnc-OPHN1-5也未能显著降低AR mRNA和18S之间的相互作用(图 9B-C)。此外，RIP和WB测定显示只有野生型lnc-OPHN1-5才能有效抑制AR mRNA-hnRNPA1相互作用和AR蛋白表达(图9D-E，图 8E)，显着增加Enz敏感性，而突变型lncRNA该能力较低(图9F)。
实施例7：
人类临床样本调查显示ADT可能会增加或减少Lnc-OPHN1-5表达验证：
为进一步在体内证实上述体外细胞系数据。EnzS1/EnzR1-C4-2 细胞中研究发现，与EnzS1-C4-2相比，长期维持Enz治疗可以降低 EnzR1-C4-2细胞中的lnc-OPHN1-5表达(图10B)。本研究测定PDX 人类PCa样品中的lnc-OPHN1-5表达，在长时间Enz治疗后，发现该lncRNA的表达显着降低(图10A)，这与EnzS1/EnzR1-C4-2细胞中的发现一致。
本研究通过GEO数据库分析进一步应用人类临床样本调查，结果显示，更高等级和更高Gleason评分的PCa患者，ADn1-OPHN1-5 表达在ADT后下降(七名患者中有三名减少，图10C，表2)，与之相反，较低级别或较低Gleason评分的PCa患者，lnc-OPHN1-5表达在ADT后增加，表明ADT可能对这些患者的疗效较差(7名患者中有4名增加，图10C)。
人类临床样本调查表明，ADT可能会降低或增加某些选择性PCa 患者的lnc-OPHN1-5表达，对于那些发展为Enz耐药的PCa患者，可能是由于这种ADT降低了lnc-OPHN1-5表达。
表2患者临床信息表
实施例8：
为将上述研究与临床联系起来，本研究应用小分子靶向这种新发现的lnc-OPHN1-5/AR-hnRNPA1复合物以增加Enz敏感性，更好地抑制PCa进展。首先应用sh-hnRNPA1逆转/阻断lnc-OPHN1-5增加相关的AR蛋白表达(图10D)。结果显示，增加sh-hnRNPA1可以增加EnzS1-C4-2细胞和EnzS2-C4-2B细胞Enz敏感性(图10E)。
本研究进一步在小鼠体内模型中证实，sh-hnRNPA1增加的Enz 敏感性。首先用荧光素酶报告基因[用于体内成像系统(IVIS)]转染 Enz-S1-C4-2细胞，以检测小鼠体内的肿瘤进展。将EnzS1-C4-2细胞分成三组并接受不同的病毒感染，包括pLKO.1，sh-lnc-OPHN1-5和 sh-lnc-OPHN1-5&sh-hnRNPA1。然后，将细胞(5x106)与基质胶(1： 1，v/v)混合，并在8周龄时原位异种移植到裸鼠的前前列腺中。当植入2个月后肿瘤可触及时，小鼠全部用Enz喂养。一个月后，使用IVIS系统检测这些原发性肿瘤的荧光素酶信号，并通过前列腺的解剖学分析进一步证实。结果显示，与sh-lnc-OPHN1-5组相比，Enz 在sh-hnRNPA1&sh-lnc-OPHN1-5组共转染的细胞中具有更好的效果。此外，通过WB和IHC检测三组中AR蛋白的表达，发现sh-hnRNPA1&sh-lnc-OPHN1-5组较h-lnc-OPHN1-5组AR蛋白表达更低。
综合图10A-E，数据显示lnc-OPHN1-5可与ARmRNA3'UTR的特定区域相互作用，减少ARmRNA与RBP-hnRNPA1的相互作用，从而降低ARmRNA翻译和蛋白表达。小分子sh-hnRNPA1靶向新发现的lnc-OPHN1-5/AR-hnRNPA1复合物可增加Enz敏感性，更好地抑制PCa进展(图11)。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种与恩杂鲁胺治疗敏感性相关的lncRNA，其特征在于，所述与恩杂鲁胺治疗敏感性相关的lncRNA为lnc-OPHN1-5。
2.根据权利要求1所述的一种与恩杂鲁胺治疗敏感性相关的lncRNA，其特征在于：所述lnc-OPHN1-5为位于X染色体上AR基因3'端1MB处。
3.lnc-OPHN1-5在恩杂鲁胺治疗前列腺癌中的应用，其特征在于：所述lnc-OPHN1-5通过影响AR mRNA翻译和AR蛋白质合成来影响前列腺癌对恩杂鲁胺的敏感性。
4.根据权利要求3所述的lnc-OPHN1-5在恩杂鲁胺治疗前列腺癌中的应用，其特征在于：通过小分子sh-hnRNPA1靶向lnc-OPHN1-5/AR/hnRNPA1复合物降低雄激素受体AR mRNA翻译和AR蛋白质合成，增加恩杂鲁胺敏感性。
5.根据权利要求3所述的lnc-OPHN1-5在恩杂鲁胺治疗前列腺癌中的应用，其特征在于：通过增加lnc-OPHN1-5抑制hnRNPA1-AR mRNA相互作用，来减少AR mRNA翻译，减少AR蛋白，增加恩杂鲁胺敏感性。
6.根据权利要求3所述的lnc-OPHN1-5在恩杂鲁胺治疗前列腺癌中的应用，其特征在于：通过敲除hnRNPA1阻断sh-lnc-OPHN1-5增加相关的AR蛋白表达，以重新敏化恩杂鲁胺治疗。
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