CN107619865A - 一种预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的靶点及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的靶点及应用。本发明对筛选出的小细胞肺癌细胞耐药相关的长链非编码RNA,然后RT‑qPCR法进行验证,筛出了由HOTTIP和TUG1组成的分子标记物。裸鼠动物实验证实HOTTIP和TUG1能促进SCLC生长和增加细胞对SCLC化疗药物的敏感性。本发明通过ROC曲线分析,发现HOTTIP和TUG1标志物对于预测小细胞肺癌患者化疗药物敏感性具有较高的灵敏度和特异性。利用本发明来预测小细胞肺癌化疗药物敏感性,方法简单、时间短、效率高,可对SCLC患者进行分层,为小细胞肺癌的精准治疗提供依据。
Description
技术领域
本发明属于医学预测、诊断技术领域,本发明涉及一种预测小细胞肺癌化疗药物敏感性的试剂盒,具体涉及包含长链非编码RNA HOTTIP和TUG1的组合试剂盒及其在预测小细胞肺癌一线化疗药物敏感性中的应用。
背景技术
长链非编码RNA(long noncodingRNA,lncRNA)为一类长度大于200个核苷酸的新型基因表达调控因子,近年来的研究表明,lncRNA以RNA的形式在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调控基因的表达,广泛参与调控个体的生长发育以及细胞凋亡、增殖、分化等生命活动,还参与了人类癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等病理进程,lncRNA的研究已成为现代分子生物学领域研究的重要热点。
目前,lncRNA在肿瘤领域的研究主要集中其对肿瘤发生发展中的作用,而lncRNA与肿瘤耐药关系的研究报道尚很少,CUDR(cancer up-regulated drug resistant)是第一个发现的与肿瘤耐药相关的lncRNA,CUDR基因长约2.2kb,位于染色体19p13.1上,缺乏完整的开放阅读框,在阿霉素诱导耐药的鳞癌细胞株中显著高表达,将CUDR表达质粒转染至结肠癌细胞A431和肝癌细胞HepG2后,细胞表现出对阿霉素和足叶乙苷产生耐药性,细胞凋亡明显减少,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase3)的表达显著降低,表明CUDR可通过抑制caspase3 表达而降低癌细胞对化疗药物的敏感性。HOTAIR是另一个除与肿瘤侵袭转移有关,还与化疗药物敏感性关系密切的lncRNA,采用RNA干扰技术沉默肝癌细胞中HOTAIR的表达,细胞易被TNF-α诱发凋亡,对顺铂和阿霉素的化疗敏感性增加。结果表明某些lncRNAs可能参与了肿瘤耐药的产生。
如何较好地预测小细胞肺癌患者对化疗药物的敏感性,为临床医生快速准确了解小细胞肺癌患者对化疗药物的疗效,及时采取更具个体化的防治方案提供支持,目前尚未存在有效的解决方法。
发明内容
为了解决上述存在的问题,本发明通过多方面研究发现长链非编码RNA HOTTIP和TUG1可以有效预测小细胞肺癌患者对化疗药物的敏感性,可在早期准确地预测SCLC患者对化疗药物的敏感性,帮助临床医生及时调整治疗,避免治疗不当或过度,达到较理想治疗效果;本发明可对肺癌患者进行分层,为小细胞肺癌的精准治疗提供依据。
本发明的目的在于提供一种可应用于临床预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的分子标记物和试剂盒。
本发明所采取的技术方案是:
长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1作为预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的靶点的应用。
定量检测长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的试剂在制备预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的试剂中的应用。
进一步的,所述化疗药物选自顺铂、足叶乙甙、阿霉素。
一种预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的试剂盒,该试剂盒含有定量检测长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的实时荧光定量PCR引物。
降低或去除长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1含量的试剂在制备提高小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的试剂中的应用。
进一步的,上述降低或去除长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1含量的试剂为长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的干涉序列。
进一步的,上述长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的干涉序列选自SEQ ID NO: 1~2、SEQ ID NO:3~4、SEQ ID NO:5~6、SEQ ID NO:7~8、SEQ ID NO:9~ 10、SEQ ID NO:11~12。
一种提高小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的试剂盒,该试剂盒含有降低或去除长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1存在量的试剂为长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1 的干涉序列。
进一步的,所述长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的干涉序列选自SEQ ID NO: 1~2、SEQ ID NO:3~4、SEQ ID NO:5~6、SEQ ID NO:7~8、SEQ ID NO:9~ 10、SEQ ID NO:11~12。
一种预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的方法,定量检测长链非编码RNAHOTTIP和/或TUG1的表达量,该方法用于非疾病的诊断和治疗。
本发明的有益效果是:
(1)本发明HOTTIP和TUG1作为组合分子标记物,经过临床样本验证,能较好预测小细胞肺癌患者对化疗药物的敏感性,二个分子标记物首次应用于小细胞肺癌患者化疗药物的敏感性检测试剂盒开发,可为临床医生快速准确地了解小细胞肺癌患者对化疗药物的疗效,及时采取更具个体化的防治方案提供支持。
(2)本发明提供了相应的试剂盒运用实时荧光定量PCR方法,检测快速方便、检测灵敏度、成本低。
附图说明
图1是基因芯片检测结果图,A是激光扫描仪扫描芯片采集杂交图象;B是差异基因的分布图;
图2是体内动物实验降低HOTTIP表达对肿瘤生长和药物敏感性的影响,A为各组肿瘤的外形,B为各组小鼠体内肿瘤的生长情况,C为各组肿瘤的重量统计,D为各组肿瘤的体积统计;
图3是体内动物实验降低TUG1表达对H69AR细胞生长和药物敏感性的影响,A为各组肿瘤的外形大小,B为各组肿瘤的重量统计,C为各组肿瘤的体积统计,D为各组动物体内TUG1的表达情况;
图4是采用本发明的试剂盒检测样本的HOTTIP及内参GAPDH的熔解曲线图;
图5是采用本发明的试剂盒检测样本的TUG1及内参GAPDH的熔解曲线图;
图6是采用本发明的试剂盒分别进行HOTTIP和TUG1单指标检测及联合检测化疗药物敏感性的ROC曲线图。
具体实施方式
长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1作为预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的靶点的应用。
优选的,所述化疗药物选自顺铂、足叶乙甙、阿霉素。
定量检测长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的试剂在制备预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的试剂中的应用。
优选的,定量检测长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的试剂为定量检测长链非编码 RNA HOTTIP和/或TUG1的实时荧光定量PCR引物。
优选的,实时荧光定量PCR引物为SEQ ID NO:13~14和/或SEQ ID NO:15~16。
优选的,所述化疗药物选自顺铂、足叶乙甙、阿霉素。
一种预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的试剂盒,该试剂盒含有定量检测长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的实时荧光定量PCR引物。
优选的,实时荧光定量PCR引物为SEQ ID NO:13~14和/或SEQ ID NO:15~16。
优选的,所述化疗药物选自顺铂、足叶乙甙、阿霉素。
优选的,该试剂盒还含有逆转录酶、Random primers、Oligo dT Primer、缓冲液、Taq酶、 dNTPs、SYBR Green I、RNAsin、无核酸酶纯水。
降低或去除长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1含量的试剂在制备提高小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的试剂中的应用。
优选的,上述降低或去除长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1含量的试剂为长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的干涉序列。
优选的,所述长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的干涉序列选自SEQ ID NO:1~2、SEQ ID NO:3~4、SEQ ID NO:5~6、SEQ ID NO:7~8、SEQ ID NO:9~10、SEQ ID NO:11~12。
一种提高小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的试剂盒,该试剂盒含有降低或去除长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1存在量的试剂为长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的干涉序列。
优选的,所述长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的干涉序列选自SEQ ID NO:1~2、SEQ ID NO:3~4、SEQ ID NO:5~6、SEQ ID NO:7~8、SEQ ID NO:9~10、SEQ ID NO:11~12。
一种预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的方法,定量检测长链非编码RNAHOTTIP 和/或TUG1的表达量,该方法用于非疾病的诊断和治疗。
优选的,所述化疗药物选自顺铂、足叶乙甙、阿霉素。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明采用Arraystar公司的lncRNA芯片,比较分析人小细胞肺癌多药耐药细胞株 (H69AR)与非耐药细胞株(H69)的lncRNA表达谱的差异,经过对原始数据进行预处理、均一化后,筛选出差异表达长链非编码RNA,结果发现相对于非耐药细胞株(H69),多药耐药细胞株H69AR中HOTTIP和TUG1的表达显著增加,其上调倍数分别是14.91和3.29。
进一步,本发明采用RNA干扰技术沉默H69AR细胞中HOTTIP和TUG1的表达,H69AR细胞的凋亡率明显升高,对小细胞肺癌一线化疗药物顺铂、阿霉素、依托泊甙的敏感性显著增加。
同时,本发明体内实验显示HOTTIP和TUG1与SCLC生长和药物敏感性有关。依据前期研究结果,本发明进一步发现SCLC组织中HOTTIP和TUG1表达水平与SCLC患者的预后及对一线化疗药物的敏感性有关,可作为预测预后和化疗药物敏感性的分子标记物。
本发明实现了准确和早期预测SCLC患者对化疗药物的敏感性,能够帮助临床医生及时调整治疗,避免治疗不当或过度,达到较理想治疗效果;本发明可对肺癌患者进行分层,为小细胞肺癌的精准治疗提供依据。
实施例1
1、利用基因芯片筛选小细胞肺癌细胞耐药相关的长链非编码RNA
方法:
(1)细胞培养小细胞肺癌细胞H69和耐药细胞H69AR购自美国The American TypeCulture Collection(ATCC),使用RPMI-1640培养液,细胞置于37℃,5%CO2的培养箱中培养。
(2)RNA抽提按Trizol说明抽提总RNA,主要步骤如下:取H69和H69AR细胞(1X107),加入1mlTrizol,以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒;将上层水相移于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,离心10分钟(12000g/分钟)。弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下离心5分钟(7500g/分钟)。
(3)RNA分离及标记取2-5μg总RNA样品,通过YM-100(Millipore)微离心过滤柱得到片段小于300nt的小RNA。Poly(A)聚合酶在分离到的小RNA 3'端加上poly(A)尾巴,再将一个寡聚核苷酸标记与这个poly(A)尾巴连接(ligation)用于后续的荧光标记。
(4)芯片杂交lncRNA芯片为美国Arraystar公司产品,为保证结果的重复性和可靠性,每个样本用两张芯片重复进行实验。杂交反应通过微循环泵杂交仪器在μParafloTM微流体芯片上过夜(Atactic Technologies)。杂交使用含有25%的甲酰胺的100μL 6xSSPE缓冲液(0.90M NaCl,60mM Na2HPO4,6mM EDTA,pH 6.8),杂交温度34℃。
(5)芯片扫描及数据处理杂交检测使用Cy3和Cy5特异性荧光标记,激光扫描仪(GenePix 4000B,Molecular Device)扫描芯片采集杂交图象、Array-Pro(MediaCybernetics)软件对杂交图像进行数字化转换。数据处理和分析首先是扣除背景,计算重复点平均值和标准偏差,然后通过LOWESS(Locally-Weighted Regresshon)过滤,进行标准化。对于双色标记实验,将计算两种检测信号的比值(log2)和t-test的P值。以P值<0.01定义显著差异性表达。
结果:基因芯片检测检测结果如图1所示,从中可以看出耐药细胞H69AR中长链非编码 RNA HOTTIP和TUG1的表达水平明显高于非耐药细胞H69(P<0.01)。
2、实时定量PCR验证基因芯片结果
方法:RNA提取方法同上,将0.5mg的RNA反转录为cDNA,以cDNA为模板进行PCR 扩增:
逆转录(从RAN-cDNA)
逆转录体系(10μl)
逆转录反应条件:将以上试剂混匀后(注意混匀过程一定不要出现气泡)于37℃反应 15min,后再85℃5sec,即得到所需的cDNA。
PCR反应体系(25ul)
反应条件:预变性(1个循环)95℃,30sec;PCR反应(95℃5sec,60℃34sec,95℃5sec) x40cycles。
结果分析:待PCR反应全部结束后,观察所得的PCR扩增曲线及融解曲线,进行PCR定量时制作标准曲线等。用基因的表达量计算公式F=2-△△Ct来计算基因的表达数值。每组进行3次重复试验,记录3次可用的数值。△△ct=(待测样品的目的基因的Ct值的平均值-待测样本的管家基因的Ct值的平均值)-(对照样品的目的基因的Ct值的平均值一对照样本的看家基因的Ct值的平均值)。
结果:实时定量PCR分析显示耐药细胞H69AR中HOTTIP和TUG1的表达水平明显高于敏感细胞H69,结论与芯片检测结果一致。
3、细胞转染
方法:
根据人HOTTIP设计并合成相应的三对shRNA(以下统称为shHOTTIP),干扰序列分别是:
sh-HOTTIP-1:(Sense 5'-3')GCUGCUUUAGAGCCACAUA dTdT(SEQ IDNO:1),
(Antisense,3'-5')dTdT CGACGAAAUCUCGGUGUAU(SEQ IDNO:2),
sh-HOTTIP-2:(Sense 5'-3')CCAGCUGCGAAUUCUUAAU dTdT(SEQ IDNO:3),
(Antisense,3’-5’)dTdT GGUCGACGCUUAAGAAUUA(SEQ IDNO:4),
sh-HOTTIP-3:(Sense 5'-3')CCUUGAUAUGCACGCAUAU dTdT(SEQ IDNO:5),
(Antisense,3’-5’)dTdT GGAACUAUACGUGCGUAUA(SEQ IDNO:6)。
根据人TUG1设计并合成相应的的三对shRNA(以下统称为shTUG1),干扰序列分别是:
shTUG1-1:(Sense 5'-3')CCCUCCAUGAAUACCUGAATT(SEQ IDNO:7),
(Antisense,3’-5’)UUCAGGUAUUCAUGGAGGGTT(SEQ IDNO:8),
shTUG1-2:(Sense 5'-3')GGCUGAUGCAUAUGGUACATT(SEQ IDNO:9),
(Antisense,3’-5’)UGUACCAUAUGCAUCAGCCTT(SEQ IDNO:10),
shTUG1-3:(Sense 5'-3')CUGGAACUCAAAGCUUGAATT(SEQ IDNO:11),
(Antisense,3’-5’)UUCAAGCUUUGAGUUCCAGTT(SEQ IDNO:12)。
1)转染前一天,将适当细胞浓度的H69AR细胞悬液2ml接种于无RNA酶的6孔培养板中,培养24h,使细胞生长密度达到50%;
2)a:稀释转染试剂lipofectamine2000使用前,将lipofectamine2000转染试剂轻轻摇匀,按下表所示取相应的量,用不含血清的优化培基(Opti-MEMI)稀释,轻轻混合,室温孵育 5min(稀释好的lipofectamine2000如果长时间放置会导致转染试剂活性降低,应尽量在30min 内与稀释好的sh-HOTTIP或sh-TUG1-混合);b:稀释sh-HOTTIP或sh-TUG1:用不含血清的Opti-MEMI稀释sh-HOTTIP或sh-TUG1,轻轻混合;c:稀释好的lipofectamine2000室温放置5min后,与稀释好的sh-HOTTIP或sh-TUG1轻轻混合,室温培养20min,以形成 sh-HOTTIP或sh-TUG1-lipofectamine2000混合物。
3)将sh-HOTTIP或sh-TUG1-lipofectamine2000混合液加入含有细胞及培养液的培养板中,轻轻摇晃,使之混合。采用qRT-PCR技术检测sh-HOTTIP或sh-TUG1对HOTTIP或TUG1 表达的抑制效率,选择干扰效果最好的sh-HOTTIP-1和sh-TUG1-1继续药物敏感实验。
4、药物敏感实验(CCK8)验证HOTTIP和TUG1影响细胞对化疗药物敏感性
将上述已分别转染sh-HOTTIP-1或sh-TUG1对数生长期H69AR细胞按5×103个/孔接种于96孔培养板中,设空白对照孔。培养24h后,将化疗药物顺铂(DDP)、足叶乙甙(VP-16)及阿霉素(ADM)分别加入培养基中并进行倍比稀释,按不同浓度分别加入指定的孔中,并设不加药物的阳性对照孔,每个药物浓度设三个副孔。细胞在含药培养基中培养24h后,加入CCK8反应液,在37℃,CO2环境下培养1-4h后在酶标仪上测560nm吸光度。测得的每个药物浓度的OD值的平均值-空白孔平均值/不含药物的阳性对照组平均值即为每个药物浓度下细胞的存活率。根据各个药物浓度细胞存活率,作对数曲线,求得细胞50%生存率时的药物浓度(IC50)。并计算耐药指数,耐药倍数=IC50(H69AR转染组)/IC50(H69AR对照组)。
结果:
检测结果如表1~4所示,每个数值与其所在行的第一个数值比较。多组间表达的比较采用one-way ANOVA(方差齐同时)或Welch法(方差不齐时),而组间多重比较采用Dunnett T法(方差齐同时)或Dunnett’T3法(方差不齐时),*P<0.05。从表1~4中可以看出耐药细胞H446DDP和H69AR转染sh-HOTTIP-1和sh-TUG1-1后,细胞对化疗药物顺铂的敏感性均明显增加。
表1 HOTTIP沉默前后耐药细胞H446DDP对化疗药物的IC50值
注:H446DDP/NC表示H446DDP细胞转染对照shRNA;H446DDP/sh-HOTTIP表示H446DDP细胞转染sh-HOTTIP;▲表示P<0.05。
表2 HOTTIP沉默前后耐药细胞H69AR对化疗药物的IC50值
注:H69AR/NC表示H69AR细胞转染对照shRNA;H69AR/sh-HOTTIP表示H69AR细胞转染sh-HOTTIP;▲表示P<0.05。
表3 TUG1沉默前后H446DDP细胞对化疗药物的IC50值
注:NC表示用对照shRNA转染细胞;*表示P<0.05。
表4 TUG1沉默前后H69AR细胞对化疗药物的IC50值
注:NC表示用对照shRNA转染细胞;*表示P<0.05。
5、体内动物实验证实长链非编码RNA HOTTIP和TUG1与SCLC生长和药物敏感性关系密切
方法:
基于上述sh-HOTTIP或sh-TUG1干扰序列的沉默效果,将其分别应用慢病毒LV3载体包装,感染H69AR细胞后,分别建立稳定低表达HOTTIP(H69AR/shHOTTIP)和TUG1 (H69AR/shTUG1)细胞,不含任何基因干扰序列的慢病毒感染H69AR细胞,构建阴性对照 H69AR/shControl。取生长状态良好、对数生长期的稳定低表达HOTTIP(H69AR/shHOTTIP) 和TUG1(H69AR/shTUG1)细胞以及对照组细胞H69AR/shControl,以0.25%的胰酶消化, PBS洗涤三遍后,用生理盐水重悬细胞,调整其浓度为2.5×107/ml。置于冰上备用;医用碘伏消毒局部皮肤后,用lml注射器,每组接种108/ml细胞悬液于裸鼠皮下。为保证具有可比性,在裸鼠上、下肢侧随机接种,每隔3天用游标卡尺测量肿瘤大小,按公式计算出肿瘤体积=(a2×b)/2,观察并分析各组细胞成瘤情况的差异;待肿瘤体积长至100-300mm3时,根据肿瘤体积随机分组后,用顺铂(DDP)联合足叶乙甙(VP-16)进行腹腔注射,检测各组实验中瘤体体积和重量。
实验分组情况如下:
H69AR/shControl+PBS:不含任何基因干扰序列的慢病毒感染H69AR细胞,构建阴性对照组,不注射化疗药物。
H69AR/shHOTTIP+PBS:低表达HOTTIP的H69AR细胞,不注射化疗药物。
H69AR/shControl+DDP+VP-16:不含任何基因干扰序列的慢病毒感染H69AR细胞,注射化疗药物DDP和VP-16。
H69AR/shHOTTIP+DDP+VP-16:低表达HOTTIP的H69AR细胞,注射化疗药物DDP 和VP-16。
H69AR/shTUG1+PBS:低表达TUG1的H69AR细胞,不注射化疗药物。
H69AR/sh TUG1+DDP+VP-16:低表达TUG1的H69AR细胞,注射化疗药物DDP和 VP-16。
结果:
图2是体内动物实验降低HOTTIP表达对肿瘤生长和药物敏感性的影响,其中A为各组肿瘤的外形,B为各组小鼠体内肿瘤的生长情况,C为各组肿瘤的重量统计,D为各组肿瘤的体积统计。
图3是体内动物实验降低TUG1表达对H69AR细胞生长和药物敏感性的影响,其中A为各组肿瘤的外形大小,B为各组肿瘤的重量统计,C为各组肿瘤的体积统计,D为各组动物体内TUG1的表达情况。
从图2和图3中可以看出,自第17d开始,HOTTIP和TUG1沉默组给药后瘤体体积和重量增长缓慢,结果说明下调HOTTIP或TUG1明显地降低了肿瘤细胞对药物的敏感性 (P<0.001,差异有统计学意义)。
6、一种预测小细胞肺癌预后和化疗药物敏感性的方法,具体实施步骤如下:
上述实施例表明,HOTTIP和TUG1与小细胞肺癌预后和对化疗药物敏感性关系密切,因此,可制作用于预测小细胞肺癌预后和化疗药物敏感性的试剂盒。
方法:
(1)临床样本采集
我们共收集了31例SCLC(小细胞肺癌)病人的石蜡组织标本,标本来自南方医科大学珠江医院和河北北方学院附属第一医院,收集于2009.1-2013.12,病人之前都经历过支气管镜或手术。所有病人都签订了知情同意书,并通过了医院的伦理委员会的批准。临床数据收集包括病人的性别、年龄、吸烟史、临床分期和随访时间。
(2)石蜡组织中总RNA的提取
RNA的抽提采用Qiagen公司产品石蜡样本RNA提取试剂盒(miRNeasy FFPE Kit)进行操作。取石蜡组织切片一片(厚度为4μm),用手术刀剪下多余蜡并剪碎组织放入RNase-free EP管;向管内加入1ml二甲苯,充分振荡10s,室温孵育5min,14000rpm离心2min;弃上清,加入1ml无水乙醇,室温14000rpm离心2min;弃上清,打开EP管盖子,37℃干燥 10min,加入150μl Buffer PKD,混匀;10000rpm离心1min,加入10μl Proteinase K至下层清澈液相,上下摇匀;56℃孵育15min,80℃孵育15min;将下层液相转移至新EP管,置冰上3min,然后13500rpm离心15min;将上清转移至新EP管,室温孵育15min,加入320μl Buffer RBC,彻底混匀,加入720μl无水乙醇,混匀后转移700μl样品到柱子中,14000 rpm离心15s,重复进行直到全部过柱,丢弃废液,加500μl Buffer RPE到柱子,14000rpm 离心15s,弃废液,加500μl Buffer RPE到柱子,14000rpm离心2min,弃EP管,取下柱子放入新EP管,打开柱盖,全速离心5min,弃EP管,将柱子放入1.5ml新EP管中,加入 14~30μl RNase-free水直接加到柱膜上,轻轻盖紧,全速离心1min以洗脱RNA,孵育10min,分装并测RNA浓度,于-80℃冰箱保存。
(3)实时荧光定量PCR检测HOTTIP和TUG1水平。
方法:RNA提取方法同上,将0.5mg的RNA反转录为cDNA,以cDNA为模板进行PCR 扩增:
逆转录(从RAN-cDNA)
逆转录体系(10μl)
逆转录反应条件:将以上试剂混匀后(注意混匀过程一定不要出现气泡)于37℃反应 15min,后再85℃5sec,即得到所需的cDNA。
PCR反应体系(25ul)
反应条件:预变性(1个循环)95℃,30sec;PCR反应(95℃5sec,60℃34sec,95℃5sec) x40cycles。上述前引物中包括HOTTIP-F和TUG1-F,后引物包括HOTTIP-R和TUG1-R。
HOTTIP-F:5’-CCTAAAGCCACGCTTCTTTG-3’(SEQ ID NO:13)
HOTTIP-R:5’-TGCAGGCTGGAGATCCTACT-3’(SEQ ID NO:14)
TUG1-F:5’-TAGCAGTTCCCCAATCCTTG-3’(SEQ ID NO:15)
TUG1-R:5’-CACAAATTCCCATCATTCCC-3’(SEQ ID NO:16)
实时荧光定量PCR检测样本的熔解曲线图如图4和图5所示。
采用Kaplan-Meier法分析HOTTIP和TUG1表达与患者化疗敏感性的关系,共31例SCLC 患者,19例耐药,敏感12例,HOTTIP或TUG1表达阳性患者临床化疗效果出现抗药性的比率比HOTTIP或TUG1阴性表达者增加,差异具有统计学意义(P<0.001),以HOTTIP和TUG1的mRNA表达量为标准,绘制ROC曲线来评估这2种基因对SCLC化疗敏感的判断能力。
结果:
就单个基因而言HOTTIP以86.5%的AUC将化疗药物敏感组和非敏感组分开;TUG1以 85.9%的AUC将药物敏感组和非敏感组分开。对2个标志物的联合分析发现,这2种基因组合以95.2%的AUC将药物敏感组和非敏感组分开,各个变量预测药物敏感性的ROC曲线下面积(见表5、图6)。因此,本发明证明了采用HOTTIP和TUG1的组合能够很好地预测小细胞肺癌患者对一线化疗药物的敏感性。
表5 HOTTIP和TUG1预测化疗药物敏感性的ROC曲线下面积
AUC | SE | 95%CI | |
HOTTIP | 0.865 | 0.050 | 0.767-0.963 |
TUG1 | 0.859 | 0.054 | 0.754-0.964 |
HOTTIP+TUG1 | 0.952 | 0.027 | 0.806-1.000 |
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学珠江医院
<120> 一种预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的靶点及应用
<130>
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcugcuuuag agccacauat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
uauguggcuc uaaagcagct t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccagcugcga auucuuaaut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
auuaagaauu cgcagcuggt t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccuugauaug cacgcauaut t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
auaugcgugc auaucaaggt t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cccuccauga auaccugaat t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttgggaggua cuuauggacu u 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggcugaugca uaugguacat t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttccgacuac guauaccaug u 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cuggaacuca aagcuugaat t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttgaccuuga guuucgaacu u 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cctaaagcca cgcttctttg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgcaggctgg agatcctact 20
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<212> DNA
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tagcagttcc ccaatccttg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cacaaattcc catcattccc 20
Claims (10)
1.长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1作为预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的靶点的应用。
2.定量检测长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的试剂在制备预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述化疗药物选自顺铂、足叶乙甙、阿霉素。
4.一种预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的试剂盒,其特征在于,该试剂盒含有定量检测长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的实时荧光定量PCR引物。
5.降低或去除长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1含量的试剂在制备提高小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,降低或去除长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1含量的试剂为长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的干涉序列。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的干涉序列选自SEQ ID NO:1~2、SEQ ID NO:3~4、SEQ ID NO:5~6、SEQ ID NO:7~8、SEQID NO:9~10、SEQ ID NO:11~12。
8.一种提高小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的试剂盒,其特征在于,该试剂盒含有降低或去除长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1存在量的试剂为长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的干涉序列。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的干涉序列选自SEQ ID NO:1~2、SEQ ID NO:3~4、SEQ ID NO:5~6、SEQ ID NO:7~8、SEQID NO:9~10、SEQ ID NO:11~12。
10.一种预测小细胞肺癌患者对化疗药物敏感性的方法,其特征在于,定量检测长链非编码RNA HOTTIP和/或TUG1的表达量,该方法用于非疾病的诊断和治疗。
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