CN111334579A - 一种血浆EBV miR-BART8-3p的检测引物和探针及应用 - Google Patents
一种血浆EBV miR-BART8-3p的检测引物和探针及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种血浆EBV miR‑BART8‑3p的检测引物和探针及应用，属于基因治疗和医学诊断技术领域，具体提供引物和探针序列如SEQ ID NO.2‑4所示，本发明通过所述引物和探针建立了针对血浆中EBV miR‑BART8‑3p的检测方法，可以有效区分正常人和鼻咽癌患者血浆的表达，由此快速做出对鼻咽癌的诊断，本发明对于鼻咽癌的诊断、鼻咽癌患者的放疗疗效均有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因治疗和医学诊断技术领域，具体涉及一种血浆生物学标志物EBVmiR-BART8-3p在鼻咽癌患者早期诊断、放疗疗效监测和预后预测的检测方法和应用。
背景技术
鼻咽癌是中国南方癌症相关死亡的重要原因。鼻咽癌对放疗非常敏感，早期鼻咽癌患者可通过调强放射治疗获得超过90％的5年生存率。 然而，超过70％的患者最初被诊断为局部晚期鼻咽癌，且仍有15％至30％的患者因远处转移导致治疗失败。因此，发现简单、有效的肿瘤标志物,以提高鼻咽癌早期诊断率和预测预后能力,是鼻咽癌未来防治的重点工作。鼻咽癌与EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染密切相关。因此，可通过检测EBV基因产物来协助鼻咽癌的诊疗。最早传统检测的是EBV抗体，尤其是VCA/IgA，然而VCA/IgA抗体的敏感性和特异性相对较低，而且在接受放疗后，患者体内的VCA/IgA抗体长时间内仍维持在高水平，价值有限。
目前，EBV-DNA是临床实践中常用的生物标志物。然而15%的鼻咽癌患者在确诊时EBV-DNA阴性；其次，各个实验室EBV-DNA检测技术和方法不同、EBV-DNA的定量和截值缺乏标准化，限制了其广泛应用。因此，研究鼻咽癌中的新型生物标志物具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类高度保守的长度约为20～23个核苷酸的内源性小分子非编码RNA，可参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭转移、免疫逃逸等过程。人鼻咽癌细胞产生两类miRNA：一类是人基因组产生的miRNA；另一类是 EBV基因组产生的miRNA（EBV miR）。EBV编码miRNA 的基因组位于BHRF1和 BART两个基因簇。目前研究发现EBV共编码 22个EBV-miR-BARTs前体，形成 44个成熟的miRNA，并且EBV-miR-BARTs大量表达于鼻咽癌组织中，而在正常人鼻咽组织几乎检测不到。然而，鉴于鼻咽癌患者的活检组织少，不易取得，副作用及风险较大，而血浆检测比较简单、方便且易于实施、普及，因此，如果能够通过检测血浆中EBV BARTs microRNA，并应用于鼻咽癌的早期诊断、放疗疗效预测及预后判断具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血浆EBV miR-BART8-3p的检测引物和探针，通过检测血浆中EBV BARTs microRNA，并应用于鼻咽癌的早期诊断、放疗疗效预测及预后判断具有重要意义。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明所述的EBV miR-BART8-3p的序列如SEQ ID No.1所示，具体为GUCACAAUCUAUGGGGUCGUAGA。
还提供了一种血浆EBV miR-BART8-3p的检测引物和探针，其序列如下：
上游引物为miR-BART8-3p-F：5’- ATCGTCACAATCTATGGGGT-3’，
下游引物为miR-BART8-3p-R：5’- GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’，
探针为：5’- CGCACTGGATACGACTCTACG - 3’，5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是MGB。
通过所述引物和探针制备获得血浆EBV miR-BART8-3p检测试剂盒。
该试剂盒的检测方法是通过PCR技术检测生物样品中EBV miR-BART8-3p的表达量。
本发明的优点在于：
虽然目前现有技术中已有关于EBV miR-BART8-3p作为鼻咽癌标志物的报道，但是其方法无法检测出正常人和鼻咽癌患者血浆中EBV miR-BART8-3p的表达量区别，同时现有技术中并没有在鼻咽癌患者的放疗前后去检测EBV miR-BART8-3p的表达。本发明所提供的引物、探针、检测方法更有效，更有针对性，对于鼻咽癌的诊断、鼻咽癌患者的放疗疗效均有预测意义，这些均未见报道。同时本发明只需要患者200ul的血样本，即可完成检测，简单方便。
附图说明
图1为健康人群与鼻咽癌患者EBV miR-BART8-3p表达量。
图2为血浆中EBV miR-BART8-3p诊断鼻咽癌的ROC曲线。
图3为鼻咽癌患者放疗前后EBV miR-BART8-3p表达量的变化。
图4a为预后总生存率图。
图4b为预后无远处转移生存率图。
图4c为预后无进展生存率图。
具体实施方式
实施例1
1、前期设计了EBV miR-BART8-3p F端引物序列共3条，EBV miR-BART8-3p R端引物序列共4条，EBV miR-BART8-3p 探针P共 5条，具体见下表，F、R和P共组合成反应体系60种，随后试验进行筛选。
2、以miR-BART8-3p mimic作为RNA，进行cDNA合成，利用TaqMan® Small RNAAssays 将RNA逆转录为cDNA。设置RT阴性组，将miR-BART8-3p mimic替换成等量PCR级别的水，其余成分一样。
表1. 具体反应体系如下表：
反应条件和参数：16℃ 30分钟，42℃ 30分钟，85℃ 5分钟，∞ 4℃，cDNA样本-80℃保存备用。
3、探针法检测EBV miR-BART8-3p表达
利用TaqMan® Universal Master Mix II 检测EBV miR-BART8-3p表达量，按下表组分进行反应液配制。设置PCR阴性组（cDNA替换成等量PCR级别的水，其余成分一样），RT阴性组（cDNA为逆转录RT阴性组的产物）。设置EBV miR-BART8-3p浓度梯度，从3*108拷贝数至3*101拷贝数，作为标准曲线。
表2. 具体反应体系如下：
反应条件和参数: 40个循环数，每个循环：95℃10分钟预变性，95℃ 15秒变性，60℃退火/延伸。
5. 根据PCR溶解曲线、RT阴性组值、PCR阴性组值、EBV miR-BART8-3p标准曲线等筛选最佳的EBV miR-BART8-3p F端引物、R端引物和探针组合，要求：PCR溶解曲线良好，RT阴性、PCR阴性检测不出或PCR的CT值≥40，标准曲线重复性佳、浓度分布合理。最终经过筛选获得最佳引物和探针组合为如下：
上游引物为miR-BART8-3p-F：5’- ATCGTCACAATCTATGGGGT-3’，
下游引物为miR-BART8-3p-R：5’- GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’，
探针为：5’- CGCACTGGATACGACTCTACG - 3’，5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是MGB。
6.筛选最佳的EBV miR-BART8-3p F端引物、R端引物和探针在小样本的鼻咽癌和健康志愿者的血浆中进行预实验，进一步确定引物和探针的有效性。
7．利用前述获得最佳的EBV miR-BART8-3p F端引物、R端引物和探针组合进行正式扩大样本检测。检测96例健康体志愿者和205例鼻咽癌患者，其中以1668copie/ml为血浆中EBV miR-BART8-3p作为鼻咽癌诊断的临界值，其AUC为0.92，灵敏度为87.8%， 特异度为89.58%(图1)。
实施例2
1、血浆中总RNA的提取
采用（miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit，QIAGEN）提取总miRNA。步骤如下：
1）解冻：冰上融化血浆。
2）加样：抽取200ul血浆于2ml离心管。
3）裂解：加 60 buffer RPL，螺旋震荡10s，室温 3min。
4）加入内参：加5ul miR-39 mimics，混匀。
5）裂解：加 20 buffer RPP，螺旋震荡30s，室温 3min。
6）蛋白沉淀：12000g离心室温3min，上清干净。
7）转移上清：-约230ul到新的EP管。
8）加异丙醇：加等量体积异丙醇；螺旋震荡10s混匀。
9）挂柱：加样到柱中，11000g离心室温15s，弃废液。
10）挂柱：加700ul buffer RWT，盖上盖子，11000g离心室温15s，弃废液。
11）挂柱：加500ul buffer RPE，盖上盖子，11000g离心室温15s，弃废液。
12）洗膜：加500ul 80%乙醇，盖上盖子，11000g离心室温2min洗膜；弃废液。
13）干燥膜：将柱子放在2ml管子中，管子之间间隔，打开盖子，盖子方向与离心方向相反，最高速离心室温5min干燥膜，弃废液和弃收集管。
14）洗涤：将柱子放在1.5ml管子，加21ul无RNA水到柱子中，浸泡1min，盖上盖子，最高速离心1min。
15）储存：标注，并将RNA保存于-80度冰箱备用。
2、血浆中EBV miR-BART8-3p的cDNA合成
利用TaqMan® Small RNA Assays 将RNA逆转录为cDNA。
表3. 具体反应体系如下：
反应条件和参数：16℃ 30分钟，42℃ 30分钟，85℃ 5分钟，∞ 4℃，cDNA样本-80℃保存备用。
3、探针法检测EBV miR-BART8-3p表达
利用TaqMan® Universal Master Mix II 检测EBV miR-BART8-3p表达量，按表2组分进行反应液配制。
表4. 具体反应体系如下：
反应条件和参数: 40个循环数，每个循环：95℃10分钟预变性，95℃ 15秒变性，60℃退火/延伸。
实施例3 检测结果分析
利用实施例2的方法检测96例健康体志愿者和205例鼻咽癌患者。与健康志愿者对比，鼻咽癌患者的血浆中EBV miR-BART8-3p-3p显著高表达（图2）。进行放疗治疗后，大部分患者血浆中的EBV miR-BART8-3p-3p表达量基本降低至正常水平，少部分患者因复发或者转移EBV miR-BART8-3p-3p表达量下降不明显或者升高（图3）。说明EBV miR-BART8-3p-3p表达量可作为鼻咽癌早期筛查、预后预测的血浆分子生物学指标，可协助鼻咽癌的临床诊疗。
实施例4 EBV miR-BART8-3p的预后价值
检测205例鼻咽癌患者的EBV miR-BART8-3p-3p表达量，以中位数1668copies/ml为临界值，分为高表达组和低表达组，并探讨EBV miR-BART8-3p-3p表达量对于鼻咽癌患者总生存时间（Overall Survival，OS）、无远处转移生存时间（Distant Metastasis-FreeSurvival，DMFS）、无进展生存时间（Progression-Free Survival，PFS）的影响，结果见图4a-c。
由图4a-c可知，血浆中EBV miR-BART8-3p-3p高表达组（>1668copies/ml）的患者，其OS、DMFS、PFS显著低于低表达组（≤1668copies/ml），说明EBV miR-BART8-3p高表达提示更差的预后，差异有统计统计学意义，p值分别为0.021，0.01，0.002，表明EBV miR-BART8-3p-3p的表达量可作为鼻咽癌诊断预后的标志物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省肿瘤医院（福建省肿瘤研究所、福建省癌症防治中心）
<120> 一种血浆EBV miR-BART8-3p的检测引物和探针及应用
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<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcgtcacaa tctatggggt 20
<210> 3
<400> 3
000
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcactggat acgactctac g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tctatgtcac aatctatggg g 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caatggtcac aatctatggg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 20
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<213> 人工序列
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cactggatac gactctacga 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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cactggatac gactctacga c 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgcactggat acgactctac 20
Claims (4)
1.一种血浆EBV miR-BART8-3p的检测引物和探针，其特征在于：其序列如下：
上游引物为miR-BART8-3p-F：5’- ATCGTCACAATCTATGGGGT-3’，
下游引物为miR-BART8-3p-R：5’- GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’，
探针为：5’- CGCACTGGATACGACTCTACG - 3’，5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是MGB。
2.如权利要求1所述的引物和探针在制备血浆EBV miR-BART8-3p检测试剂盒的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：该试剂盒是通过PCR技术检测生物样品中EBV-miR-BART13的表达量。
4.如权利要求1所述的引物和探针在制备鼻咽癌早期诊断和预后预测的诊断试剂盒中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202010279421.8A CN111334579A (zh) | 2020-04-10 | 2020-04-10 | 一种血浆EBV miR-BART8-3p的检测引物和探针及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111334579A true CN111334579A (zh) | 2020-06-26 |
Family
ID=71182676
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111334579A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113215318A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-06 | 南方医科大学第三附属医院（广东省骨科研究院） | 用于检测EBV-miRNA-BART10-3P的引物、试剂盒及检测方法 |
Citations (4)
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| US20090156535A1 (en) * | 2007-09-27 | 2009-06-18 | The Trustees Of Princeton University | MicroRNAs for Modulating Herpes Virus Gene Expression |
| WO2013187612A1 (ko) * | 2012-06-14 | 2013-12-19 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 엡스타인바 바이러스 마이크로 알엔에이를 포함하는 세포사멸 억제 또는 세포생장 촉진을 위한 조성물 |
| CN107245516A (zh) * | 2017-05-25 | 2017-10-13 | 南方医科大学 | 用于鼻咽癌诊断的miRNA |
| CN110079604A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-08-02 | 福建省肿瘤医院（福建省肿瘤研究所、福建省癌症防治中心） | 一种用于检测鼻咽癌的标志物及其应用 |
-
2020
- 2020-04-10 CN CN202010279421.8A patent/CN111334579A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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